DE69132795T2

DE69132795T2 - Gereinigtes gp120, in dem seine natürliche konformation erhalten bleibt

Info

Publication number: DE69132795T2
Application number: DE69132795T
Authority: DE
Inventors: L. Haigwood; J. Scandella
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1990-03-09
Filing date: 1991-03-08
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2011-03-09
Also published as: JP2624894B2; EP0519001B2; CA2077753A1; EP0519001A1; WO1991013906A1; DE69132795D1; EP0519001B1; CA2077753C; PT96994A; PT96994B; IE910779A1; JPH09227588A; DE69132795T3; JPH05505616A; ATE207930T1

Description

Technischer Bereich

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf den Bereich der Proteinreinigung und im Besonderen auf die Reinigung von HIV-1 abgeleiteten Antigenen, die bei der Herstellung von Impfstoffen von Nutzen sind.

Hintergrund

Versuche, Impfstoffe gegen HIV-1 herzustellen, trafen auf begrenzten Erfolg, wie durch das Kriterium gemessen wurde, bei Tieren eine Immunantwort zu erzielen, die der von Menschen, welche serumpositiv auf HIV-1 sind, ähnlich oder gleich ist. Das Hauptziel, welches bis jetzt nicht erreicht wurde, ist die Erzeugung von Antikörpern, die in vitro bei Titern virusneutralisierend wirken, welche sowohl den Wert als auch die Komplexität (d. h. die Fähigkeit, mehr als ein Isolat zu neutralisieren) erreichen, die bei menschlichen Seren von infizierten Individuen gefunden wird. Alle neutralisierenden Antikörper beim Menschen wurden zu dem Hüllprotein gp160 oder einem seiner es zusammensetzenden Teile (gp120 oder gp41) kartiert, und demnach haben sich die meisten Bemühungen um Impfstoffe auf die Entwicklung von auf Hüllproteine bezogene Antigene konzentriert.
Fünf Typen solcher Antigene wurden entwickelt: (1) gereinigtes gp120, abgeleitet von HIV-infizierten Gewebekulturzellen (hierin als "virenabgeleitetes gp120 bezeichnet"); (2) gp120, welches in Zellen hergestellt wurde, die mit rekombinanten Viren infiziert sind, wie Vaccinia oder Baculovirus ("Lebendvirus-Vektor abgeleitetes gp120 und gp160"); (3) rekombinantes gp120, hergestellt in Säugerzellen ("rekombinantes Säuger-gp120", manchmal fälschlicherweise bezeichnet als natives rekombinantes gp120); (4) rekombinante denaturierte Polypeptide, die alle oder verschiedene Abschnitte von gp120 und gp41 darstellen ("rekombinante denaturierte Antigene"); und (5) Peptide, die kleine Segmente von gp120 und gp41 darstellen ("Peptide").
Immunogenitätsversuche wurden mit all diesen Antigentypen durchgeführt, und zwar mit recht einförmigen Ergebnissen. Im Allgemeinen sind die Antigene stark immunogen, wenn sie verschiedenen Arten als Adjuvans zugesetzt werden. Sie haben Antikörper erzeugt, die in der Lage sind, das homologe Isolat von HIV-1 zu neutralisieren, aber sie neutralisieren nicht-homologe Isolate schlecht oder gar nicht. Die Neutralisationswerte haben ebenfalls (im Allgemeinen) nicht den Wert an neutralisierendem Titer erreicht, der in infizierten Menschen gefunden wurde.
Zum Beispiel können sowohl vollständig glycosyliertes gp120, das auf natürliche Weise von Viren gereinigt oder durch gentechnisch veränderte Säugerzellen hergestellt wurde, nicht-glycosyliertes gp120, hergestellt in Hefe, als auch ein Fragment von gp120, hergestellt in E. coli, HIV-1-neutralisierende Antikörper in Versuchstieren hervorbringen. Meistens sind die Antworten von Tieren, die mit Virion- oder rekombinanten gp120- Antigenen immunisiert wurden, nur bei der Neutralisation des Virusisolats, von dem das gp120-Antigen stammt, wirksam. Eine Ausnahme ist die Arbeit von Berman et al. (Referenz 1, nachstehend), die zeigt, dass gereinigtes rekombinantes HIV-1-gp120, sekretiert von gentechnisch veränderten Zellen des Eierstocks beim Chinesischen Hamster, gruppenspezifische neutralisierende Antikörper bei Schimpansen hervorbrachte.
Ein anderer Faktor, der bei der Herstellung von HIV-1-Impfstoffen besonders schwer zu überwinden war, ist die Sequenzdiversität. HIV-1 und HIV-2 sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ein sehr hohes Ausmaß an Sequenzdiversität besitzen, die im gp120- Abschnitt der Hülle am stärksten ausgeprägt ist. Diese Sequenzdiversität ist in Regionen angehäuft, die als hypervariable Regionen bekannt sind. Viele Gruppen haben die Verwendung eines Impfcocktails vorgeschlagen, welcher antigene Stoffe, die von verschiedenen HIV-Isolaten abgeleitet sind, umfasst, um einen Schutz gegen weite Bereiche von infektiösen Quellen zu gewähren.
Entsprechend bleibt ein Bedarf nach einem antigenen Stoff, der immunologische und andere Protein/Protein bindende Eigenschaften bei gp120, so wie es auf einem HIV-1- Viruspartikel präsentiert wird, besitzt. Insbesondere sind antigene Stoffe, die in der Lage sind, neutralisierende Antikörper zu induzieren, vorzugsweise unter Verwendung eines einzigen Quellenmaterials, das neutralisierende Antikörper gegen verschiedene Feldisolate induziert, äußerst wünschenswert.

Relevante Literatur

Die folgenden Veröffentlichungen beziehen sich alle auf die fünf Typen von Impfstoffkandidaten, die vorstehend beschrieben wurden:
(1) Berman et al., "Human Immunodeficiency Virus Type I Challenge of Chimpanzees Immunized with Recombinant Envelope Glycoprotein gp120," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 5200-5204;
(2) Berman et al., "Expression and Immunogenicity of the Extracellular Domain of the Human Immunodeficiency Virus Type I Envelope Glycoprotein gp160," Journal of Virology (1989) 63: 3489-3498;
(3) Nara et al, "Purified Envelope Glycoproteins from Human Immunodeficiency Virus Type I Variance Induced Individual, Type-Specific Neutralizing Antibodies", Journal of Virology (1988) 62: 2622: 2628;
(4) Arthur et al., "Serological Responses in Chimpanzees Inoculated with Human Immunodeficiency Virus Glycoprotein (gp120) Subunit Vaccine," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 8583-8587;
(5) Evans et al., "An Engineered Polio Virus Chimaera Elicits Broadly Reactive HIV- 1 Neutralizing Antibodies," Nature (1989) 339: 385-388;
(6) Barrett et al., "Large-Scale Production and Purification of a Vaccinia Recombinant-Derived HIV-1 gp160 and Analysis of its Immunogenicity," AIDS Research and Human Retroviruses (1989) 5: 159-171;
(7) Earl et al., "Isolate- and Group-Specific Immune Response to the Envelope Protein of Human Immunodeficiency Virus Induced by a Live Recombinant Vaccinia Virus in Macaques," AIDS Research and Human Retroviruses (1989) 5: 23-32;
(8) Putney et al., "HTLV-III/LAV-Neutralizing Antibodies to an E. coli-produced Fragment of the Virus Envelope," Science (1986) 234: 1392-1395;
(9) Steimer et al., "Genetically Engineered Human Immunodeficiency Envelope Glycoprotein gp120 Produced in Yeast is the Target of Neutralizing Antibodies," Vaccines 87 (1987) 236-241;
(10) Steimer et al., "Recombinant env and gag Polypeptides in Characterizing HIV-1- Neutralizing Antibodies," Vaccines 88 (1988) 347-355;
(11) Ho et al., "Human Immunodeficiency Virus Neutralizing Antibodies Recognize Several Conserved Domains on the Envelope Glycoproteins," Journal of Virology (1987) 61: 2024-2028; und
(12) Palker et al., "Type-Specific Neutralization of the Human Immunodeficiency Virus with Antibodies to env-Encoded Synthetic Peptides," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 1932-1936.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung von HIV- gp120 bereitzustellen, um ein Glycopeptid bereitzustellen, das Protein/Protein-bindende Eigenschaften hat, die im Wesentlichen identisch sind mit natürlichem viralen HIV-gp120.
Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung, die durch das Verfahren von Anspruch 1 erhältlich ist und die gereinigtes HIV-gp120- Glycoprotein in voller Länge (ohne Fusion, wenn rekombinant) umfasst, bereitzustellen, wobei die Mehrzahl der Moleküle davon Protein/Protein-Interaktionseigenschaften besitzt, die im Wesentlichen mit gp120, wie es auf einem HIV-Virus präsentiert wird, identisch sind.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Stimulierung der Erzeugung von Antikörpern, die in der Lage sind, Infektion durch multiple HIV-Virusisolate zu neutralisieren, bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Impfstoffzusammensetzung bereitzustellen, die bei Verabreichung an ein Säugerindividuum, die Empfänglichkeit dieses Individuums für eine Infektion durch HIV-Viren aus verschiedenen Quellen reduziert.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Impfstoffzusammensetzung bereitzustellen, die bei Verabreichung an ein Säugerindividuum, das mit HIV-1 infiziert ist, eine therapeutische Wirkung hat.
Diese und andere Ziele der Erfindung wurden, wie im Folgenden noch deutlicher werden wird, durch Bereitstellung des Verfahrens von Anspruch 1 in einer Ausführungsform, erreicht.
Durch Vermeidung von Affinitätschromatographie und Umkehrphasen-HPLC ist es möglich, ein gereinigtes gp120-Molekül zu gewinnen, das nie denaturiert wurde oder rauen Lösungsmittelbedingungen ausgesetzt wurde, wie sie in einer Affinitätschromatographie- Säule unter Verwendung von Antikörpern oder anderen bindenden Molekülen, die eine hohe Affinität für gp120 haben, auftreten würden. Das gp120 der vorliegenden Erfindung, bezeichnet als gp120, das die Konformation bewahrt hat, bewahrt die Bindungseigenschaften zum CD4-Rezeptor, die denen von natürlichem gp120, wie es auf viralen Partikeln präsentiert wird, viel mehr ähneln, als es bis vor kurzem der Fall war. Deshalb ist eine andere Ausführungsform der Erfindung eine Zusammensetzung, die durch Verwendung des Verfahrens von Anspruch 1 erhältlich ist. Zusätzliche Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Verwendung derartiger verbesserter gp120-Zusammensetzungen in immunologischen Verfahren, wie Immuntests für anti-HIV-Antikörper, bei der Herstellung von anti-HIV-Antiserum und bei Impfstoffen.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgende Beschreibung spezifischer Ausführungsformen in Kombination mit den Zeichnungen, die Teil der vorliegenden Beschreibung sind, besser zu verstehen sein, worin:
Fig. 1 ein schematisches Diagramm eines beispielhaften Expressionsplasmids für die Herstellung von rekombinantem HIV-1-gp120 (rgp120) ist.
Fig. 2 eine Tabelle ausgerichteter Aminosäuresequenzen für verschiedene HIV-1- Isolate mit den angezeigten konstanten (C) und variablen (D) Domänen ist. Mögliche N- gekoppelte Glycosylierungsorte nur für die HXB2-Sequenz sind durch angezeigt; Cysteinreste haben * über sich in dieser Figur. Diese Sequenzdaten wurden in Human Retroviruses and AIDS 1988, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, herausgegeben durch Gerald Myers et al., veröffentlicht durch die Theoretical Biology and Biophysics Group, T-10, Poststelle K710, Los Alamos National Laboratories, Los Alamos, New Mexico, 87545, veröffentlicht. Es gibt auch eine Version von 1989, die von derselben Quelle herausgegeben und veröffentlicht wurde.
Fig. 3A eine Graphik ist, die Produktfraktionen, wie sie in einem Reinigungsschritt unter Verwendung einer Phenyl-HIC-Säule gewonnen werden, zeigt.
Fig. 3B eine Graphik ist, die Produktfraktionen, wie sie in einem Reinigungsschritt unter Verwendung einer Ether-HIC-Säule gewonnen werden, zeigt.
Fig. 3C eine Graphik ist, die Produktfraktionen, wie sie in einem Reinigungsschritt unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie gewonnen werden, zeigt.
Fig. 4 eine Graphik ist, die die Erzeugung eines CD4-gp120-Komplexes unter Verwendung von Gelfiltrations-HPLC zeigt.
Fig. 5 eine Graphik ist, die die HIV-ZR6-Neutralisationsdaten von Seren vom Pavian 2964, analysiert nach 0, 5, 6, 7, 8 und 9 Immunisierungen mit pg120, zeigt.
Fig. 6 eine Reihe von Graphiken ist, die Neutralisationstiter aller Serumproben vom immunisierten Pavian 2958 und vom mit gp120 immunisierten Pavian 2964 aus Beispiel 6 zeigen.
Fig. 7 ein schematisches Diagramm vom unterbrochenen Immunisierungsschema am Primaten ist.

BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Allgemeine Prinzipien der Reinigung

Die vorliegende Erfindung ergab sich teilweise aus Untersuchungen im Labor der vorliegenden Erfinder, die zeigten, dass die eliminierende Affinitätschromatographie von vorherigen Reinigungsverfahren eine gp120-Glycopeptid-Zusammensetzung mit besseren CD4-Bindungseigenschaften herstellte. Zuvor dachte man, die Affinitäts-Reinigung sei bei der Reinigung von gp120 zur Verwendung bei Impfstoffen, wo hohe Reinheitsgrade benötigt werden, essenziell.
Affinitätschromatographie und andere Typen von Verfahren zur Affinitätstrennung basieren auf der starken und spezifischen Bindungs-Interaktion zwischen einem Antikörper und einem Protein (oder zwischen einem Lectin und einem Glycoprotein), um das Protein von anderen Molekülen, die im Medium, in dem das Protein gefunden wird, vorhanden sind, zu trennen. Geeignete Verfahren, wie das Verändern der Ionenstärke oder des pH-Werts des Elutionsmediums werden daraufhin verwendet, um den Antikörper vom Protein zu dissoziieren, so dass das gereinigte Protein gewonnen werden kann, nachdem andere, kontaminierende Proteine von der Säule oder dem anderen Trägermaterial, an das der Antikörper angeheftet ist, abgewaschen worden sind. Affinitätschromatographie wird seit mehr als zwanzig Jahre auf dem Gebiet der Biochemie verwendet, aber seine Verwendung stieg mit dem Aufkommen monoclonaler Antikörper hoher Spezifität in den frühen 1970er Jahren rapide an. Für einen Überblick über die Technologie vgl. Freifelder, Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 2. Ausgabe, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1982, S. 257-262.
Die vorliegenden Erfinder haben jedoch nachgewiesen, dass eine auffällige Veränderung der Konformation in diesem 2-stufigen Bindungs/Entfernungsverfahren stattfindet, wenn Affinitätschromatographie dazu verwendet wird, das gp120-Molekül zu reinigen, so dass das entstandene gp120-Protein, obwohl gereinigt, nicht die gleichen Epitope wie die viralen gp120-Moleküle aufweist, um die Antikörpererzeugung zu induzieren oder um Protein/Protein bindende Interaktionen, wie die Bindung an das CD4-Molekül, einzugehen. Demnach ähnelt Affinitäts-gereinigtes gp120 nicht gp120, wie es von einem Viruspartikel präsentiert wird, in ausreichendem Maße, um zuzulassen, dass derart gereinigte Proteine bei der Induktion neutralisierender Antikörper in dem Maße verwendet werden können, wie es zum Beispiel für einen wirksamen Impfstoff erwünscht wäre.
Es wird erkannt werden, dass die Diskussion einer bestimmten Zusammensetzung von gp120 hinsichtlich einer spezifischen Eigenschaft, wie der Fähigkeit beziehungsweise der Unfähigkeit, CD4 zu binden, sich auf die Zusammensetzung als Ganzes bezieht, und nicht die Eigenschaften von wirklich jedem gp120-Molekül in der Zusammensetzung auf molekularer Ebene repräsentieren soll. Zum Beispiel kann eine Zusammensetzung von gp120, gereinigt unter Verwendung von veröffentlichten Verfahren, sich auf eine Zusammensetzung von gp120 beziehen, die zum Beispiel 10% der Bindungskapazität für CD4 von natürlichem gp120, wie es auf einem HIV-1-Virus präsentiert wird, hat. Dies könnte bedeuten, dass die Bindungsaffinität von wirklich jedem Molekül um 90% reduziert wurde; es ist jedoch wahrscheinlicher, dass einige Moleküle ihre ursprüngliche Konformation und Bindungsfähigkeit beibehalten, wohingegen eine Mehrzahl der Moleküle irgendwie modifiziert wurde (z. B. eine veränderte Konformation haben), so dass sie ihre gesamte oder einen Teil ihrer Bindungsaffinität verloren haben. Entsprechend ist es wahrscheinlich, dass eine Vielzahl von gp120-Molekülen, die verschiedene Eigenschaften haben, in jeder gp120-Zusammensetzung vorhanden sind, und die Wirksamkeit eines Reinigungsverfahrens bei der Erhaltung von natürlichen Bindungseigenschaften wird am besten an den Bindungseigenschaften der Zusammensetzung als Ganzes gemessen.
Die vorliegenden Erfinder haben entdeckt, dass es möglich ist, HIV-gp120 zu reinigen, um eine Glycopeptid-Zusammensetzung bereitzustellen, die Protein/Protein- bindende Eigenschaften (insbesondere die CD4-Bindung) hat und die im Wesentlichen identisch ist mit natürlichem viralen HIV-gp120. In einer Zusammensetzung der Erfindung sind 50% oder mehr, bevorzugt 80% oder mehr und am stärksten bevorzugt 90% oder mehr der Moleküle in einer Konformation, die die Bindung an ein CD4-Molekül erlaubt, im Gegensatz zu etwa 10% oder weniger gp120-Molekülen, sogar in ungereinigten Zusammensetzungen, die durch einige veröffentlichte Verfahren hergestellt wurden.
Das Verfahren der Erfindung beginnt mit einer gp120-Quelle, wie einem Zellmedium, in das ein gp120-Molekül sekretiert wurde, oder ein Zell- oder virales Lysat. Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich für die Bereitstellung und für die Reinigung eines nichtfusionierten, glycosylierten rekombinanten gp120-Proteins in voller Länge in reiner Form, das seine natürliche Konformation bewahrt hat und das in das Zellmedium sekretiert wurde. Hier bezieht sich ein "rekombinantes gp120-Protein" auf ein Protein, das durch eine nicht mit HIV infizierte Zelle hergestellt wurde, egal ob diese Zelle das geeignete gp120-Gen als Ergebnis einer Transfektion, chromosomalen Insertion, Beibehaltung eines Plasmids oder anderer Verfahren, das Protein zu exprimieren, enthält. Gp120 von viralen Quellen kann jedoch auch verwendet werden. Die Herstellung der ursprünglichen Rohzusammensetzung, die gp120 enthält, ist nicht Teil der umfassenderen Aspekte der vorliegenden Erfindung, da gp120 kürzlich sowohl aus rekombinanten als auch viralen Quellen hergestellt wurde. Die Diskussion von gp120-Quellen wird demnach auf einen späteren Abschnitt der Beschreibung verschoben, in dem bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung diskutiert werden.
Es ist notwendig, die Affinitätschromatographie (und die Umkehrphasen-HPLC oder andere Verfahren, die organische Lösungsmittel verwenden) durch ein Trennungsverfahren zu ersetzen, das die gewünschte Konformation des gp120-Moleküls nicht stört. Überraschenderweise wurde entdeckt, dass hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) die gewünschte Reinigung bei Verwendung in Kombination mit Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationschromatographie bereitstellt. Dieses Ergebnis war unerwartet, da gp120 ein Glycoprotein mit 22 bekannten Glycosylierungsstellen ist, und deshalb erwartet wird, dass es stark hydrophil (eher denn hydrohob) ist. Es wurde entdeckt, dass gp120 mindestens eine Region mit ausreichender Hydrophobizität besitzt, um eine gute Trennung von Verunreinigungen unter Verwendung eines HIC-Reinigungsschritts zu gewährleisten. Zum Beispiel wurde eine fast 10-fache Reinigung auf einer Phenyl-HIC- Säule erzielt. Fig. 3A zeigt, dass gp120 die letzte Fraktion war, die von dieser Säule eluierte. Obwohl bis vor kurzem bekannt war, dass hydrophobe Regionen in der Aminosäuresequenz existieren (durch Hydrophobizitäts-Plots), war nicht bekannt oder wurde vermutet, dass eine ausreichende Hydrophobizität nach der Glycosylierung beibehalten wurde, um die Trennung von gp120 von anderen Proteinen unter Verwendung von HIC zu gewährleisten.
Jeder Schritt des Reinigungsverfahrens wird nachstehend detailliert diskutiert. Im allgemeinen umfasst das Reinigungsverfahren die Konzentration des Zellmediums oder einer anderen gp120-Quelle, um die Konzentration von gp120 zu erhöhen, typischerweise durch Entfernen von Wasser und anderen kleinen Molekülen; Fraktionierung des konzentrierten Zellmediums unter Verwendung eines Ionenaustauschermaterials und Auffangen einer Fraktion, die spezifische Bindungsaffinität für das CD4-Peptid zeigt; Fraktionierung dieser ersten Fraktion unter Verwendung von hydrophober Interaktionschromatographie (unter Verwendung von zwei HIC-Schritten), um eine zweite Fraktion bereitzustellen, die gute CD4- Bindungsaffinität zeigt; und Fraktionierung der zweiten Fraktion durch Größenausschlussfiltration oder -chromatographie, um das gewünschte gereinigte Protein bereitzustellen. Diese Diskussion wird sich allgemein auf die gp120-Quelle als Zellkulturmedium beziehen, da dies die üblichste Quelle ist. Es können jedoch auch andere Quellen für gp120 austauschbar mit einem Zellkulturmedium verwendet werden.
Der Konzentrationsschritt ist ein herkömmlicher erster Schritt, der bei der Reinigung vieler Proteine von verschiedenen Quellen verwendet wird, nämlich bei der Entfernung von Wasser oder anderer kleiner Moleküle vom Zellmedium, so dass nachfolgende Reinigungsschritte auf einem relativ kleinen Materialvolumen ausgeführt werden können. Deshalb kann jede von verschiedenen nach Größen fraktionierenden Verfahren verwendet werden. Dialyse und Ultrafiltration sind bevorzugte Verfahren. Der anfängliche Konzentrationsschritt kann Wasser und andere kleine Moleküle wie solche, die Molekulargewichte von 1.000 oder weniger haben, kaum entfernen, deshalb können Verfahren, die einige oder im Wesentlichen alle Moleküle, die ein geringeres Molekulargewicht haben als das gp120-Molekül, verwendet werden. Zum Beispiel kann Ultrafiltration ausgeführt werden unter Verwendung von Membranen, die verschiedene Cut- off-Werte haben, wie Molekulargewichte von 10.000, 20.000, 30.000, 50.000 oder 100.000. Molekulargewichts-Cut-offs im Bereich von 10.000 bis 50.000 werden bevorzugt, vorzugsweise von etwa 30.000.
Nach Konzentration des Zellkulturmediums zur Eliminierung kleiner Moleküle wird das konzentrierte Zellmedium, das Moleküle enthält, welche größer sind als die Cut-off- Größe, unter Verwendung eines Ionenaustauschermaterials fraktioniert. Peptide verschiedener Quellen können sich bei Ionenaustauschfraktionierung auf Grund unterschiedlicher Ladungen verschieden verhalten. Zum Beispiel wird gp120, welches unter Verwendung von genetischem Material gewonnen wird, das ursprünglich von dem HIV-SF2-Isolat isoliert wurde, bei einem pH-Wert von 8 in 0,1 M NaCl nicht auf einer DEAE-Sephadex-Säule zurückgehalten werden, wohingegen gp120 von dem Isolat HIV-HTLV-IIIB unter den selben Bedingungen an die Säule bindet und mit einem Salzgradienten von 0,1 bis 0,5 M NaCl eluiert werden kann. Ob das bestimmte gp120-Molekül an der Säule haften bleibt, ist jedoch nebensächlich, da der Ionenaustauschprozess, einschließlich der Elution, augenscheinlich die immunologischen oder andere Protein/Protein bindende Eigenschaften nachteilig beeinflusst.
Der Ionenaustauschschritt verwendet DEAE-SEPHADEX, das ist Diethylaminoethyl substituiertes Dextran. Für den anionischen Austauschschritt wird typischerweise ein Puffer mit dem pH-Wert im Bereich von 7-9, vorzugsweise mit etwa pH 8, verwendet. Ein typischer Beispielpuffer ist Tris, 0,02 M. Ionenstärken befinden sich normalerweise im Bereich von etwa 0,05 bis 0,2 M (ausgedrückt als NaCl), vorzugsweise etwa 0,1 M. Andere Bedingungen, die kontrolliert werden sollten, umfassen Temperatur (z. B. etwa 0º bis 25ºC), Gesamtleitfähigkeit des Materials, das an die Säule aufgebracht wird (z. B. etwa 15 mS/cm) und das Verhältnis zwischen Proteinladung und Harzvolumen (z. B. etwa 15 bis 20 g/l). Diese Werte sind bevorzugte Werte für eine DEAE-SEPHADEX-Säule und können für andere Säulenmaterialien in Übereinstimmung mit den Leitlinien des Herstellers variiert werden.
Fraktionen, die die gewünschten gp120-Moleküle enthalten, können durch jede der zahlreichen, bekannten Verfahren zur Identifizierung von gp120 identifiziert werden, wie die Erkennung durch Antikörper, die Bindung durch CD4 = Peptide, oder die SDS- Gelelektrophorese. Fraktionen, die die gp120-Moleküle enthalten, können durch die Durchführung von Analysen bei Aliquots, die von jeder Fraktion genommen werden, identifiziert werden. Nach Einrichten eines Fraktionierungsmusters sind die Ionenaustauschverfahren ausreichend wiederholbar, so dass Fraktionen ohne Testen gesammelt werden können. Die CD4-Bindung wurde für jeden neuen Schritt der vorliegenden Erfindung, der in das Verfahren eingeschlossen wurde, überprüft, und die CD4-Bindung kann verwendet werden, um zu verifizieren, ob irgendeine Modifikation der spezifischen, hierin beschriebenen bevorzugten Bedingungen (wie die Veränderung der Säulenträgermaterialien, der Temperatur, der Puffer, etc.) eine gp120-Zusammensetzung bereitstellt, die innerhalb des Bereichs der Erfindung ist. Zusätzliche Details über die Messung der Bindung zwischen CD4 und gp120 werden in einem späteren Abschnitt dieser Beschreibung dargelegt.
Der maßgeblichste Test für gp120 ist die Bindung des CD4-Peptids. Die Bindung an das CD4-Peptid wird typischerweise durch Radio-Immunpräzipitation oder Gelfiltrations- HPLC durchgeführt, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Alle Fraktionen, die das gp120-Material enthalten, können individuell oder nach Kombination der Fraktionen gereinigt werden, um vereinigtes Material für die Verwendung in einem weiteren Reinigungsschritt bereitzustellen.
Obwohl sich hierin im Allgemeinen auf die Fähigkeit eines gp120-Moleküls in einer bestimmten Fraktion, an das CD4-Peptid zu binden, bezogen wird, bedeutet die Verwendung derartiger Ausdrücke nicht, dass tatsächlich ein Bindungstest für das CD4-Peptid bei jedem Schritt durchgeführt wird. Vielmehr wird die Ausdrucksweise verwendet, um anzuzeigen, dass für diesen oder für einen anderen Schritt die Bedingungen aufrechterhalten werden, so dass die Fähigkeit von gp120, das CD4-Peptid zu binden, an keinem Schritt des Trennungsverfahrens verloren geht.
Bei dem nächsten Reinigungsschritt ist die hydrophobe Interaktionschromatographie beteiligt, bei der die Passage von Molekülen durch eine Säule durch hydrophobe Interaktionen zwischen dem Trägermaterial der Säule (oder einem Stoff, der an das Trägermaterial gebunden ist) und den Molekülen, die fraktioniert werden, verzögert wird. Typisch für solche Fraktionierungsverfahren sind Hochleistungs- Flüssigchromatographieverfahren, die eine hydrophobe Säule verwenden. Das Verfahren verwendet eine Ether-HIC- und eine Phenyl-HIC-Säule. Eine Ether-HIC-Säule enthält aliphatische Gruppen, die durch eine Etherbindung an ein Säulen-Trägermaterial gebunden sind, wohingegen eine Phenyl-HIC-Säule Phenylgruppen enthält, die an das Trägermaterial gebunden sind. Wie vom Fachmann auf dem Gebiet der HIC-Verfahren verstanden wird, werden Zusetzen der Probe zu der Säule und Elution unter Verwendung von Lösungen, die ausreichende Ionenstärke (die bei manchen Molekülen null sein kann) besitzen, um das Material, das getrennt wird, zu veranlassen, an die Oberflächen des Harzes, das in der Säule verwendet wird, zu "kleben". Herabsetzen der Ionenstärke des Elutionsmittels (d. h. Verringerung der Konzentration an Salzen im Elutionsmittel) reduziert die Tendenz, dass hydrophobe Materialien durch die Säule zurückgehalten werden.
Bei einer typischen gp120-Reinigung werden Fraktionen, die durch Ionenaustauschchromatographie gewonnen werden, in Ammoniumsulfat auf 40% Sättigung eingestellt, und jedes unlösliche Material wird durch Zentrifugation entfernt, bevor der Überstand an die HIC-Säule aufgebracht wird. Die Behandlung der Ionenaustauschchromatographie-Fraktion mit 40% gesättigtem Ammoniumsulfat ist für die Präzipitation einiger kontaminierender Proteine an diesem Punkt im Verfahren nützlich, obwohl sie nicht erforderlich ist. Nicht alle Stämme und Mutationsvarianten von Isolaten des gp120-Moleküls, die bis jetzt getestet wurden, fallen von selbst in 40% gesättigtem Ammoniumsulfat aus. Sollte gp120 von anderen Isolaten bei 40% Ammoniumsulfat ausfallen, so kann eine Konzentration ausgewählt werden, die unter der Benötigten liegt, um gp120 auszufällen, die jedoch hoch genug ist, um eine Ionenstärke bereitzustellen, die die Bindung von gp120 an die HIC-Säule verursacht. Wie bei der Ionenaustauschchromatographie, scheint die Trennung, die auf hydrophoben Interaktionen basiert, die Konformation des Proteins nicht nachteilig zu beeinflussen.
Bedingungen, unter welchen diese Säulen verwendet werden, variieren mit den spezifischen Säulen, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Typische Bedingungen umfassen einen pH-Wert von etwa 5 bis etwa 7 (z. B. 0,02 M Natriumacetat, pH 5,0); eine Ionenstärke von etwa 0,05 bis 2,0 M (ausgedrückt als NaCl), vorzugsweise etwa 0,1 M; und Elution unter Verwendung eines Gradienten von 40% Ammoniumsulfat (oder einer anderen anfänglichen Konzentration, wie vorstehend beschrieben), der sich auf 0% Ammoniumsulfat verringert.
Zwei HIC-Unterschritte werden unter Verwendung verschiedener HIC-Träger verwendet (Trennung auf einer Phenyl-HIC-Säule, gefolgt von Trennung auf einer Ether- HIC-Säule). Die Bedingungen können unter Verwendung bekannter Verfahren angeglichen werden, um die Trennung von Protein-Peaks, die die gewünschte Aktivität haben, von anderen Protein-enthaltenden Peaks zu gewährleisten, die auch in der Fraktion, die durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt wurde, vorhanden sind. Wie zuvor werden Fraktionen, die die gewünschte Aktivität haben, gesammelt und von Fraktionen, die diese Aktivität nicht haben, getrennt.
Fraktionen, die durch hydrophobe Interaktionschromatographie erhalten wurden und die gewünschte Aktivität enthalten, werden einer Gelfiltration (ebenfalls bekannt als Gelpermeationschromatographie, einschließlich Gelfiltrations-HPLC-Verfahren) unterzogen. Ist die Reinheit nach HIC ausreichend, so kann das Elutionsmittel von der letzten HIC-Säule direkt auf die Gelfiltrationssäule aufgebracht werden. Die Reinheit wird durch Gelelektrophorese und Coomassie-Blaufärbung gemessen und sollte mindestens 5%, bevorzugt mindestens 50% (nach dem Gewicht der vorhandenen Proteine) betragen. Wenn jedoch der gewünschte Reinheitswert in diesem Stadium nicht erreicht wird, kann das Verfahren der Erfindung noch durchgeführt werden, indem das HIC-Elutionsmittel vor der Gelfiltration einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen wird. Geringere Reinheit wird in diesem Stadium manchmal gefunden, wenn ein ineffizientes Expressionssystem verwendet wird, so dass das anfängliche Zellmedium eine relativ kleine Menge an gp120 verglichen mit anderen Proteinen enthält. HPLC-Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines Trägermaterials mit anhängenden quartären Ammoniumionen wird besonders bevorzugt, wenn Ionenaustausch- oder Mitteldruckchromatographie mit einem hocheffizienten Anionenaustauscherharz wie Pharmacia's Q-Sepharose High Performance in diesem Stadium notwendig ist.
An diesem Punkt im Reinigungsverfahren (d. h. nach HIC und gegebenenfalls dem zweiten Ionenaustauschschritt) sind die entfernten Verunreinigungen hauptsächlich Verunreinigungen mit geringem Molekulargewicht. Wieder sind die spezifischen Materialien und Bedingungen, die verwendet werden, nicht besonders eingeschränkt. Dextran-, Polyacrylamid- oder Agarosegele können alle verwendet werden.
Fraktionierungsbereiche des Molekulargewichts von 10K bis 500K, bevorzugt von 50K bis 200K werden typischerweise ausgewählt. Eine besonders bevorzugte Säule zur Verwendung bei der HPLC ist SUPERDEX 200 (Pharmacia). Bedingungen für eine solche Verwendung sind typischerweise 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,7. Gelausschlusschromatographie scheint die Präsentation der Epitope, die für die Induktion der Erzeugung neutralisierender Antikörper notwendig sind, nicht negativ zu beeinflussen.
Eine Protein-G-Affinitätsreinigung kann in jedem Stadium des Verfahrens durchgeführt werden, zum Beispiel nach der Ionenaustauschchromatographie und vor der hydrophoben Interaktionschromatographie, um die Kontamination mit IgG zu reduzieren oder zu eliminieren, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Geeignete Verfahren zur Durchführung von Protein-G-Affinitätsreinigung sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen die Verwendung von Affinitätssäulen, wie Protein-G-Sepharose-Fast Flow, Pharmacia und Ähnliche. Durch nicht limitierende Beispiele kann ein 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 verwendet werden, obwohl jeder herkömmliche Puffer verwendet werden kann.
In allen Reinigungsschritten, die vorstehend diskutiert wurden, sollten die Bedingungen aufrechterhalten werden, um die Denaturierung auch während des Auffangens und der Behandlung von Fraktionen, die durch die Trennungsschritte hergestellt wurden, zu minimieren. Der pH-Wert aller Lösungen sollte deshalb im Bereich zwischen etwa 4 und etwa 9 liegen, bevorzugt zwischen 5 und 8. Ionenstärken sollten zwischen 0,02 und 0,5 M (NaCl- Äquivalente) liegen, bevorzugt zwischen 0,05 und 0,3 M, mit Ausnahme von Ammoniumsulfat, welches eine höhere Ionenstärke aufweisen kann, wie schon früher dargelegt. Temperaturen sollten zwischen 0º und 25ºC liegen, vorzugsweise zwischen 2º und 8ºC. Detergentien und organische Lösungsmittel sollten vollständig vermieden werden.
Fraktionen, die durch jeden der oben angegebenen Schritte gewonnen werden, können, sofern dies erwünscht ist, durch Ultrafiltration oder andere Konzentrationsverfahren zur Entfernung von Lösungsmittel und anderen kleinen Molekülen konzentriert werden. Eine solche Ultrafiltration ist allgemein nicht erforderlich, außer das Fraktionierungsverfahren hat die Fraktionen, die gp120 enthalten, verdünnt, wie es geschehen könnte, wenn der gp120- Peak sich über mehrere Fraktionen erstreckt.
Zusammenfassend gelangte man zu dem vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren, durch Analyse nach jedem neuen Schritt, um sicherzustellen, dass die CD4-Bindung nicht zurückgegangen war. Schritte, die das Protein denaturierenden Bedingungen aussetzen könnten, wie Umkehrphasen- und Immunaffinitätschromatographie wurden vermieden. Ein großer Teil der Reinigung wurde durch Ausnutzen der starken Bindung von gp120 an zwei verschiedene hydrophobe Harze in Gegenwart von Ammoniumsulfat erreicht. Zusätzlich band das gereinigte Protein auf hydrophobe Weise bei neutralem pH-Wert in 0,1 M NaCl an Superose®12, ein Gelfiltrationsharz. Dieses Verhalten war einigermaßen überraschend angesichts des hydrophilen Charakters der Kohlenhydrate und der Tatsache, dass gp120 zu mehr als 50 Gewichtsprozent aus Kohlenhydraten besteht.
Das Herstellungsverfahren wurde wiederholt im 40 l-Maßstab (beginnend mit 40 l Zellkulturüberstand), wie hier beschrieben, durchgeführt. Das Verfahren wurde auch in einem kleineren und größeren Maßstab mit Säulen geeigneter Größe, im Bereich von 0,4 l bis mindestens 200 l Zellkulturüberstand verwendet. Ertrag und Reinheit des Produkts waren in diesem Maßstabsbereich nahezu konstant. Kürzlich wurde die zelluläre Produktion in kontinuierlicher Suspensionskultur ausgeführt. Diese Modifikation erleichtert die gp120- Herstellung im großen Maßstab. Im Verhalten des Produktes wurden von einer Charge zur anderen keine signifikanten Unterschiede nachgewiesen; dabei wurden Überstände von rotierenden Flaschen oder kontinuierlichen Kulturen als Startermaterial verwendet.
Eine detaillierte Beschreibung eines konkreten Reinigungsverfahrens wird in den folgenden Beispielen gegeben. Obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf dieses bestimmte Beispiel beschränkt ist, stellt das Beispiel durch die Indikation spezifischer Parameter für eine vollständige Trennung zusätzliche Hinweise bereit, die sich innerhalb der Reichweite der vorliegenden Erfindung befinden.

Charakteristika von gp120, hergestellt durch das Reinigungsverfahren

Das gp120-Glycoprotein, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist nach der Beurteilung mit SDS-Gelelektrophorese mit Coomassie- Blaufärbung rein und behält in CD4-Bindungsanalysen volle Aktivität bei. Reinheitswerte von annähernd 95% werden geschätzt. Hier bezieht sich Reinheit auf die Abwesenheit anderer Proteine, da reines gp120 auf Grund der Unterschiede im Kohlenhydratgehalt verschiedener gp120-Moleküle eine heterogene Zusammensetzung ist. Das Produkt des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung scheint von der natürlichen Konformation von gp120, das von viralen Quellen gewonnen wird, nicht unterscheidbar zu sein. Spezielle Versuchsbeispiele, die zur Bestimmung verwendet werden können, ob gereinigtes gp120 die Konformation des in der vorliegenden Erfindung gewonnenen Materials hat, werden in den folgenden Beispielen gezeigt. Allgemein umfassen diese Tests die CD4- Bindung, Gelfiltrations-HPLC (sowohl unter oxidierenden als auch reduzierenden Bedingungen) und die Reaktion mit gp120-spezifischen Antiseren.
Andere Forscher haben berichtet, dass rekombinantes gp120, das durch verschiedene andere Verfahren als das hier spezifizierte, gereinigt wurde, reduzierte Bindungsaffinität für den CD4-Rezeptor zeigt. Obwohl der Grund für diesen Rückgang der Bindungsaffinität nicht mit Sicherheit bekannt ist, wird angenommen, dass dies eine Konformationsänderung des Moleküls während der Reinigung darstellt. Zum Beispiel verwendete ein Reinigungsschema, das anfänglich von den Erfindern für gp120 ausprobiert wurde, Affinitätschromatographie und Umkehrphasen-HPLC. Das Material, das durch dieses Verfahren gereinigt wurde, war zu annähernd 80% rein und zeigte den erwarteten Wert an Reaktivität in einem ELISA-Test unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der für gp120 spezifisch ist. Die Bindungsaktivität, die in vitro an den CD4-Rezeptor gemessen wurde, wurde jedoch etwa 10fach unterdrückt. Das vorliegende System stellt gp120 bereit, das von gleich großer oder höherer Reinheit ist als zuvor erhältliches gp120, wobei es die volle CD4-Bindungsaktivität beibehält. Des Weiteren stellt das Reinigungsverfahren einen angemessenen Produktertrag bereit und ist geeignet für die Herstellung von gp120 im großen Maßstab (im Bereich von mehreren hundert Milligramm oder mehr). Es werden weder Affinitätschromatographie noch Umkehrphasen-HPLC benötigt, wodurch Konformationsänderungen, die mit diesen Reinigungsverfahren in Verbindung stehen (verursacht durch hohe Ionenstärken und Kontakt mit organischen Lösungsmitteln), eliminiert werden. Volle Aktivität wurde in ELISA- und CD4-Rezeptorbindungs-Tests beobachtet. Das gereinigte Material, hierin als "gp120, das die Konformation bewahrt hat, in seiner natürlichen Konformation" bezeichnet, scheint von gp120, das auf einem Viruspartikel präsentiert wird, nicht unterscheidbar zu sein.
Zum Beispiel war das rekombinante gp120, das die Konformation bewahrt hat und von HIV-SF2 abgeleitet war, von viralem HIV-SF2-gp120 nicht unterscheidbar. Die Proteine hatten auf SDS-Gelen sehr ähnliche Mobilitäten. Sie zeigten äquivalente Immunreaktivitäten in Immunpräzipitationen, Western Blots und Festphasen-Einfangtests mit allen getesteten Seren.
Das gereinigte Protein zeigt ein Molekulargewicht von 120 K in reduzierten oder nicht-reduzierten SDS-Gelen; demnach ist die Polypeptid-Kette intakt. Gelfiltrations-HPLC in einem nicht-denaturierenden Puffer bei neutralem pH-Wert ergab ein geschätztes Molekulargewicht von 130 K, was zeigt, dass das gereinigte Protein unter diesen Bedingungen eine geringe Tendenz zur Aggregation hat. Das Protein hatte, wie durch sein Verhalten an verschiedenen Säulen gezeigt, einen überraschenden hydrophoben Charakter.
Die Bindung von rekombinantem gp120 an CD4 wurde in einem Gelfiltrations-HPLC- Test direkt untersucht. Wie das virale gp120 band rgp120 mit hoher Affinität und einer Stöchiometrie von 1 : 1 an CD4. Mindestens 90% der gereinigten gp120-Moleküle waren, wie in diesem Versuch gemessen wurde, in der Lage, an CD4 zu binden. Schließlich hat das gereinigte Protein für CD4 einen Kd-Wert von H6,9 nM. Dieser Wert liegt im Bereich von Affinitäten, die für die Bindung von viralem gp120 und anderen gereinigten Herstellungen an den CD4-Rezeptor gemessen wurden (siehe Smith et al., Science (1987) 238: 1704 und Lasky et al., Cell (1987)50: 975).

Quellen von gp120 für die Reinigung

Die breiten Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen nicht den Schritt der Herstellung des Quellenmediums, das die gp120-Moleküle enthält. Die Herstellung von gp120 durch rekombinante Verfahren wird anderswo beschrieben, zum Beispiel in den Veröffentlichungen, die zuvor im Abschnitt Hintergrund dieser Beschreibung zitiert wurden und den darin zitierten Veröffentlichungen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung wurden durch die hier genannten Erfinder an gp120-konditionierten Medien verschiedener Zelllinien angewendet, welche genetisches Material von verschiedenen HIV-Isolaten, die verschiedene gp120-Moleküle herstellen, enthalten. Gp120 von nicht-rekombinanten Quellen kann ebenfalls verwendet werden (z. B. virusinfizierte Zelllinien). Spezifische Quellen für gp120 werden in den Beispielen, welche folgen, genannt, und eine allgemeine Diskussion der Zellkultur für die Expression von gp120 folgt, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf solche Quellen beschränkt.
SF2-gp120 diente als Modell zur Entwicklung des vorliegenden Reinigungsprozesses. Verschiedene andere clonierte gp120-Gene sind für andere Iosolate von HIV-1 verfügbar, sowie mehrere veränderte Formen, die durch in vitro-Mutagenese von gp120-Genen geschaffen wurden. Zum Beispiel wird von vollständigen Sequenzen von Aminosäuren, die von clonierten Genen aus 15 verschiedenen HIV-1-Isolaten codiert werden (SF2, HXB2, BRU, MN, SC, NYS, CDC4, WMJ2, RF, MAL, ELI, Z96, Z3, Z321 und JY1) in Myers et al., Human Retroviruses and Aids, 1990 (1990), Los Alamos, New Mexico: Los Alamos National Laboratory berichtet, das hier vollständig durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Sieben Sequenzen (von welchen sich sechs von den in 90/02568 unterscheiden) sind in Modrow et al J. Virol. (1987) 61: 570-578 gezeigt. Srinivasan et al., Gener (1987) 52: 71-82, berichtet von einer zusätzlichen HIV-1-Isolat-Sequenz, die in Zaire isoliert wurde. Beide Publikationen sind ebenfalls durch Bezugnahme eingeschlossen. Die Erfahrung der Erfinder hat bis jetzt gezeigt, dass die hier beschriebenen Verfahren sowohl für gp120-Proteine von anderen Isolaten verwendet werden können, als auch für mutierte Formen des Gens, obwohl sich diese Proteine in Sequenz und Aminosäurezusammensetzung beträchtlich von SF2-gp120 unterscheiden können.
Zusätzlich zu rekombinanten Quellen können natürliche virale Quellen von gp120 verwendet werden. Zelllinien, die HIV enthalten, sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC CRL 8543) erhältlich. Auf diese Zelllinie wird im U.S.-Patent Nr. 4, 520, 113 Bezug genommen. Andere virale Isolate sind in Tersmette et al., J. Virol. (1988) 62: 2026-2032 und Popovic et al., Science (1984) 224: 497-500 beschrieben.
Rekombinante Quellen werden sowohl auf Grund der Leichtigkeit der Herstellung bevorzugt, als auch, um die Infektionsgefahr durch aktiven HIV-1-Virus zu vermeiden. Rekombinantes gp120 in voller Länge kann unter Verwendung einer Anzahl bekannter Expressionssysteme hergestellt werden. Alle derartigen Systeme enthalten Instruktionen zur Codierung von Isolaten mit allen Aminosäuren von reifem gp120 (z. B., Aminosäuren 30 oder 31 bis 509 des env-Gens im SF2).
HIV-gp120-Nucleinsäuresequenzen können durch rekombinante DNA-Verfahren wie das Absuchen von reversen Transkripten von mRNA oder durch das Absuchen von genomischen DNA-Banken von irgendeiner Zelle gewonnen werden. Die DNA kann auch durch Synthethisieren der DNA von veröffentlichten Sequenzen unter Verwendung von allgemein verfügbaren Verfahren und DNA-synthetisierenden Geräten gewonnen werden. Die Synthese mag vorteilhaft sein, da zum Zeitpunkt der Herstellung der DNA einmalige Restriktionsstellen eingebracht werden können, wodurch die Verwendung des Gens in Vektoren, die Restriktionsstellen enthalten, die sonst in der natürlichen Quelle nicht vorhanden sind, erleichtert wird. Des Weiteren kann jede gewünschte örtliche Modifikation in der DNA durch Synthese eingeführt werden, ohne die Notwendigkeit, die DNA durch Mutagenese weiter zu modifizieren.
Im Allgemeinen kann DNA, die das HIV-gp120-Polypeptid von neuen Stämmen codiert, durch Konstruktion einer cDNA-Bank aus mRNA, welche aus Feld- oder Laborisolaten gewonnen wurde, und (1) durch Sreenen mit markierten DNA-Sonden, die Abschnitte des Hüllproteins codieren, um Clone in der cDNA-Bank nachzuweisen, die homologe Sequenzen enthalten, oder (2) durch Amplifikation der cDNA unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Subclonieren und Absuchen mit markierten DNA- Sonden gewonnen werden. Die Clone werden dann durch Restriktionsenzymanalyse und Nucleinsäuresequenzierung analysiert, um Clone voller Länge zu identifizieren und, wenn Clone voller Länge nicht in der Bank vorhanden sind, um geeignete Fragmente von den verschiedenen Clonen zu gewinnen und sie an Restriktionsstellen, die den Clonen gemeinsam sind, zu ligieren, um einen Clon zusammenzusetzen, der ein Molekül voller Länge codiert. DNA-Sonden können aus dem genetischen Material hergestellt werden, wie es in den begleitenden Beispielen dargestellt ist. Alle Sequenzen, die am 5'-Ende der HIV-gp120- cDNA fehlen, können durch die 3'-Extension der synthetischen Oligonucleotide, die zu den HIV-gp120-Sequenzen komplementär sind, unter Verwendung von mRNA als Matrize (sogenannte Primer-Extension) gewonnen werden, oder homologe Sequenzen können von bekannten cDNAs bezogen werden.
Die Herstellung von rgp120 zur Reinigung durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, wenn nicht anders angezeigt, herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie, der Mikrobiologie sowie rekombinante DNA-Verfahren innerhalb der Kenntnisse auf dem Fachgebiet. Solche Verfahren sind vollständig in der Literatur erklärt. Siehe, z. B. Maniatis, Fritsch & Sambrook "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2. Ausgabe (1989); "DNA Cloning: A Practical Approach," Bände I und II (D. N. Glover Hrsg. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait Hrsg. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1985); "Transcription and Translation" (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney Hrsg. 1986); Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press 1986); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Bei der Beschreibung des genetischen Materials, das für die Herstellung von rekominantem gp120 zur Reinigung durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird die folgende Terminologie in Übereinstimmung mit den unten dargelegten Definitionen verwendet.
Ein "Replicon" ist jedes genetische Element (z. B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo fungiert; d. h. replikationsfähig ist unter seiner eigenen Kontrolle.
Ein "Vektor" ist ein Replicon wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment angeheftet werden kann, um die Replikation des angehefteten Segments zu bewirken.
Ein "DNA-Molekül" bezieht sich auf die polymere Form von Desoxyribonucleotiden (Adenin, Guanin, Thymin und/oder Cytosin), entweder in seiner einzelsträngigen Form oder in der doppelsträngigen Helix. Dieser Begriff bezieht sich nur auf die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und begrenzt sie nicht auf irgendwelche bestimmten tertiären Formen. Demnach umfasst dieser Begriff doppelsträngige DNA, die roter alia in linearen DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Bei der Diskussion der Struktur von bestimmten doppelsträngigen DNA- Molekülen können Sequenzen hierin gemäß der üblichen Konvention beschrieben werden, bei der nur die Sequenz in der 5' zu 3'-Richtung entlang des nicht-transkribierten DNA-Strangs (d. h., des Strangs, der eine Sequenz hat, die der mRNA homolog ist) angegeben wird.
Eine DNA-"Codierungssequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der Codierungssequenz sind durch ein Startcodon am 5' (Amino)-Ende und ein Translationsstopcodon am 3' (Carboxy)- Ende bestimmt. Eine Codierungssequenz kann prokaryontische Sequenzen, cDNA von eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryontischer (z. B. Säuger) DNA, virale DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen enthalten, ist jedoch nicht auf sie beschränkt. Ein Polyadenylierungssignal und die Transkriptions-Terminierungssequenz wird sich üblicherweise 3' zur Codierungssequenz befinden.
Transkriptions- und Translations-Kontrollsequenzen sind regulatorische DNA- Sequenzen wie Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminatoren und Ähnliche, die die Expression einer Codierungssequenz in einer Wirtszelle ermöglichen. Eine "Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, die in der Lage ist, die RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts (in 3'- Richtung) liegenden Codierungssequenz zu initiieren. Zum Zweck der Definition der vorliegenden Erfindung wird die Promotorsequenz an der Transkriptions-Startstelle (einschließlich) an ihrem 3'-Terminus gebunden, und sie erstreckt sich stromaufwärts (5'- Richtung), um eine minimale Anzahl an Basen beziehungsweise Elementen zu umfassen, die notwendig sind, um die Transkription in vor dem Hintergrund nachweisbaren Mengen zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz wird sich sowohl eine Transkriptions-Startstelle (herkömmlich definiert durch Kartieren mit Nuclease S1) als auch Protein bindende Domänen (Consensus-Sequenzen), die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind, befinden. Eukaryontische Promotoren werden oft, jedoch nicht immer, "TATA"-Boxen und "CAT"-Boxen enthalten.
Eine Codierungssequenz befindet sich "unter der Kontrolle" von transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die Codierungssequenz in mRNA transkribiert, die dann in das Protein translatiert wird, das durch die Codierungssequenz codiert wird.
Eine "Signalsequenz" kann vor der Codierungssequenz eingeschlossen werden. Diese Sequenz codiert ein Signalpeptid, N-terminal zum Polypeptid, das mit der Wirtszelle kommuniziert, um das Polypeptid an die Zelloberfläche zu dirigieren oder um das Polypeptid in die Medien zu sekretieren, und dieses Signalpeptid wird durch die Wirtszelle abgeschnitten, bevor das Protein die Zelle verlässt. Signalsequenzen können mit verschiedenen, für Prokaryonten und Eukaryonten nativen Proteinen assoziiert gefunden werden. Zum Beispiel wird Alpha-Faktor, ein natives Hefeprotein, von Hefe sekretiert, und seine Signalsequenz kann an heterologe Proteine, die in die Medien sekretiert werden sollen, angeheftet werden (siehe U.S.-Patent 4.546.082, EPO 0 116 201, Datum der Veröffentlichung: 12. Januar 1983. Des Weiteren wurde gefunden, dass der Alpha-Faktor und seine Analoga heterologe Proteine von verschiedenen Hefen, wie zum Beispiel Saccharomyces und Kluyveromyces sekretieren (EPO 88312306.9, eingereicht am 23. Dezember 1988; die Veröffentlichung EPO 0 324 274 und die Veröff. EPO Nr. 0 301 669, Datum der Veröffentlichung: 1. Februar 1989). Ein Beispiel für die Verwendung in Säugerzellen ist das tPA-Signal, das für die Expression der leichten Kette des Faktors VIIIc verwendet wird.
Eine Zelle wurde durch exogene oder heterologe DNA "transformiert", wenn eine solche Zelle in die Zelle eingeführt wurde. Die transformierte DNA kann in die chromosomale DNA, die das Genom der Zelle bildet, integriert (kovalent gebunden) sein oder nicht. In Prokaryonten kann sich die transformierende DNA zum Beispiel auf einem episomalen Element wie einem Plasmid oder einem viralen Vektor befinden. BPV- transformierte Zellen sind stabil und bleiben episomal. Im Hinblick auf eukaryontische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine, in der die transformierende DNA in ein Chromosom integriert worden ist, so dass sie durch Tochterzellen durch Chromosomen- Replikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukarontischen Zelle gezeigt, Zelllinien oder Clone zu etablieren, die sich aus einer Population von Tochterzellen, die die transformierende DNA enthalten, zusammensetzen. Ein "Clon" ist eine Zellpopulation, die durch Mitose von einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorfahren abgeleitet ist.
Eine "Zelllinie" ist ein Clon von Primärzellen, der in vitro zu stabilem Wachstum über viele Generationen in der Lage ist.
Zwei DNA-Sequenzen sind "im Wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 85% (vorzugsweise mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95%) der Nucleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen hinweg übereinstimmen.
Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können in einem Southern- Hybridisierungsversuch unter zum Beispiel stringenten Bedingungen, wie sie für dieses bestimmte System definiert sind, genannt werden. Die Definition von geeigneten Hybridisierungsbedingungen liegt innerhalb der Kenntnisse auf dem Fachgebiet. Siehe, z. B. Maniatis et al., vorstehend; DNA Cloning, Bände I & II, vorstehend; Nucleic Acid Hybridization, vorstehend.
Eine "heterologe" Region des DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, das in der Natur nicht assoziiert mit dem größeren Molekül gefunden wird. Demnach wird, wenn die heterologe Region ein Säugergen codiert, das Gen üblicherweise von DNA umgeben sein, die im Genom des Quellenorganismus die genomische Säuger-DNA nicht umgibt. Ein anderes Beispiel für eine heterologe Codierungssequenz ist ein Konstrukt, in dem die Codierungssequenz selbst nicht in der Natur gefunden wird (z. B. eine cDNA, bei der die genomische Codierungssequenz Introns enthält oder synthetische Sequenzen, die Codons haben, die sich von denen des nativen Gens unterscheiden). Allelische Variationen oder natürlich vorkommende Mutationsereignisse lassen keine heterologe DNA-Region, wie hierin definiert, entstehen.
Eine Zusammensetzung, die "A" umfasst (wobei "A" ein einzelnes Protein, DNA- Molekül, Vektor, etc. ist), ist im Wesentlichen frei von "B" (wobei "B" ein oder mehrere kontaminierende Proteine, DNA-Moleküle, Vektoren, etc. umfasst), wenn mindestens etwa 75 Gewichts-% der Proteine, DNA, Vektoren (abhängig von der Artenkategorie, zu der A und B gehören) in der Zusammensetzung "A" sind. Vorzugsweise umfasst "A" mindestens etwa 90 Gewichts-% der A + B-Spezies in der Zusammensetzung, am meisten bevorzugt mindestens etwa 99 Gewichts-%. Es ist außerdem bevorzugt, dass eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen kontaminationsfrei ist, nur eine einzige Molekulargewichtsart (hinsichtlich des Polypeptidanteils eines Glycoproteins wie gp120) enthält, das die Aktivität oder das Charakteristikum der Art des Interesses hat.
Ein "Antikörper" ist jedes Immunglobulin einschließlich Antikörper und Fragmente davon, die ein spezifisches Epitop binden. Der Begriff umfasst inter alia polyclonale, monoclonale und chimäre Antikörper. Mehr über chimäre Antikörper siehe U.S. Patente Nr. 4.816.397 und 4.816.567.
Vektoren werden verwendet, um die Manipulation der DNA, die das HIV-gp120- Polypeptid codiert, zu vereinfachen, entweder zur Herstellung großer Mengen an DNA für weitere Verfahren (Clonierungsvektoren) oder zur Expression des HIV-gp120-nPolypeptids (Expressionsvektoren). Vektoren umfassen Plasmide, Viren (einschließlich Phagen) und integrierbare DNA-Fragmente, d. h. Fragmente, die durch Rekombination in das Wirtsgenom integrierbar sind. Clonierungsvektoren müssen keine Expressions-Kontrollsequenzen enthalten. Kontrollsequenzen in einem Expressionsvektor umfassen jedoch transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen, wie einen transkriptionalen Promotor, eine Sequenz, die geeignete Ribosomen-Bindungsstellen codiert, und Sequenzen, die die Termination von Transkription und Translation kontrollieren. Der Expressionsvektor sollte vorzugsweise ein Selektionsgen umfassen, um die stabile Expression des HIV-gp120-Gens zu erleichtern und/oder Transformanten zu identifizieren. Das Selektionsgen zur Aufrechterhaltung der Expression kann jedoch durch einen getrennten Vektor in Co-Transformationssystemen unter Verwendung von eukaryontischen Wirtszellen bereitgestellt werden.
Geeignete Vektoren werden im Allgemeinen ein Replicon (Replikationsursprünge zu Verwendung in nicht-integrativen Vektoren) und Kontrollsequenzen enthalten, die von Arten abgeleitet werden, die mit dem beabsichtigten Expressionswirt kompatibel sind. Durch den Begriff "replizierbarer" Vektor, wie hierin verwendet, wird beabsichtigt, Vektoren zu umfassen, die sowohl solche Replicons enthalten als auch Vektoren, die durch Integration in das Wirtsgenom repliziert werden. Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Vektoren transformiert oder transfiziert wurden, die HIV-gp120 codierende DNA enthalten. Das exprimierte HIV-gp120 wird unter der Kontrolle geeigneter Prozessierungs-Signale im exprimierten Peptid, z. B. homologen oder heterologen Signalsequenzen, in den Kulturüberstand sekretiert. Nur sekretierte Proteine sind vollständig glycosyliert und vollständig in der Lage, CD4 zu binden. Siehe Fennie et al., J. Virol. (1989) 63: 639-646.
Expressionsvektoren für Wirtszellen umfassen normalerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor, der sich von der HIV-gp120-codierenden Sequenz stromaufwärts befindet, zusammen mit einem Ribosomen-Bindungsort, einem Polyadenylierungsort und einer Transkriptions-Terminationssequenz. Der Fachmann ist sich bewusst, dass bestimmte dieser Sequenzen nicht für die Expression in bestimmten Wirten benötigt werden. Ein Expressionsvektor für die Verwendung bei Mikroben muss nur einen Replikationsursprung haben, der vom Wirt erkannt wird, einen Promotor, der im Wirt funktionieren wird, und ein Selektionsgen.
Üblicherweise verwendete Promotoren stammen vom Polyom-Virus, Rinder- Papillomvirus, CMV (Cytomegalievirus, entweder murin oder menschlich), Raus- Sarcomvirus, Adenovirus und Affenvirus 40 (SV40). Andere Kontrollsequenzen (z. B. Terminator-, PolyA-, Enhancer- oder Amplifizierungssequenzen) können ebenfalls verwendet werden.
Ein Expressionsvektor ist so konstruiert, dass die HIV-gp120-Gencodierungssequenz sich in dem Vektor mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen befindet, wobei Positionierung und Orientierung der Codierungssequenz im Hinblick auf die Kontrollsequenz, so ist, dass die Codierungssequenz unter der "Kontrolle" der Kontrollsequenzen transkribiert und translatiert wird (d. h. RNA-Polymerase, die an das DNA- Molekül an den Kontrollsequenzen bindet, transkribiert die Codierungssequenz). Die Kontrollsequenzen können vor der Insertion in einen Vektor, wie die vorstehend beschriebenen Clonierungsvektoren, an die Codierungssequenz ligiert werden. Alternativ kann die Codierungssequenz direkt in einen Expressionsvektor, der bereits die Kontrollsequenzen und einen geeigneten Restriktionsort enthält, cloniert werden. Wenn die selektierte Wirtszelle eine Säugerzelle ist, so können die Kontrollsequenzen zur HIV-gp120- Gencodierungssequenz heterolog oder homolog sein, und die Codierungssequenz kann entweder genomische DNA, welche Introns enthält, oder cDNA sein.
Höhere eukaryontische Zellkulturen können verwendet werden, ob von Vertebraten- oder Invertebratenzellen, einschließlich Insekten, und die Verfahren der Vermehrung davon sind bekannt. Siehe zum Beispiel Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg. (1973).
Geeignete Wirtszellen zur Expression des HIV-gp120-Gens in höheren Eukaryonten umfassen: Affennieren-CVI-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); Nierenzellen vom Baby-Hamster (BHK, ATCC CRL 10); DHFR-Eierstockzellen vom Chinesischen Hamster (beschrieben von Urlaub und Chasin, PNAS (USA) 77: 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, J. P., Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980), Affen-Nierenzellen (CVI ATCC CCL 70); Nierenzellen von der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VER076, ATCC CRL-1587); menschliche Cervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde- Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060652, ATCC CCL 51); Ratten-Hepatomzellen (HTC, MI, 54, Baumann, M. et al., J. Cell Biol. 85: 1-8 (1980)) und TRI-Zellen (Mather, J. P. et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)).
Man ist sich bewusst, dass das rekombinante HIV-gp120-Genprodukt auf Grund der Glycosylierung ein höheres Molekulargewicht haben kann, wenn es in Säugergewebe exprimiert wird. Es wird deshalb beabsichtigt, dass teilweise oder vollständig glycosylierte Formen von HIV-gp120, die Molekulargewichte haben, die sich etwas von 120 kD unterscheiden, innerhalb des Reichweite der Erfindung liegen.
Andere bevorzugte Expressionsvektoren sind die zur Verwendung in eukaryontischen Zellen. Ein beispielhaftes eukaryontisches Expressionssystem ist jenes, welches Vaccinia- Virus verwendet, welches auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist. Siehe z. B. Macket et al. (1984) J. Virol. 49: 857; "DNA Cloning," Bd. 11, S. 191-211, vorstehend; PCT-Veröff. Nr. WO 86/07593. Hefe-Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. U.S.- Patent Nr. 4.446.235; 4.443.539; 4.430.428; siehe auch Europäische Veröff. Nr. 103.409; 100.561; 96.491. Ein anderes bevorzugte Expressionssystem ist der Vektor pHSI, der Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters transformiert. Siehe PCT-Veröff. Nr. WO 87/02062. Säugergewebe kann zusammen mit DNA, das einen selektierbaren Marker wie Dihydrofolat-Reductase (DHFR) oder Thymidin-Kinase codiert, und DNA, codierend HIV- gp120, transformiert werden. Wird DHFR vom Wildtyp verwendet, so wird bevorzugt, eine Wirtszelle, der es an DHFR mangelt, ausgewählt, wodurch die Verwendung der DHFR- Codierungssequenz als Marker für die erfolgreiche Transfektion in hgt-Medium ermöglicht wird, dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt. In diesem Fall ist die Eierstockzelllinie des Chinesischen Hamsters (CHO), der es an DHFR-Aktivität mangelt, hergestellt und vermehrt, wie von Urlaub und Chasin 1980, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 77: 4216 beschrieben, eine geeignete Wirtszelle.
Abhängig vom selektierten Expressionssystem und Wirt, wird HIV-gp120 durch Züchtung von Wirtszellen, die durch ein exogenes oder heterologes DNA-Konstrukt wie einen Expressionsvektor transformiert wurden, wie vorstehend beschrieben unter Bedingungen hergestellt, bei welchen das HIV-gp120-Protein exprimiert wird. Das HIV- gp120 wird dann aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Wenn das Expressionssystem HIV-gp120 in das Wachstumsmedium sekretiert, kann das Protein direkt von zellfreien Medien, wie beschrieben, gereinigt werden. Die Selektion der geeigneten Wachstumsbedingungen und anfängliche Rohgewinnungsverfahren liegen innerhalb der Kenntnisse auf dem Fachbereich.
Ist eine Codierungssequenz für HIV-gp120 einmal hergestellt oder isoliert, kann sie in jeden geeigneten Vektor cloniert werden und dabei in einer Zellzusammensetzung, die im Wesentlichen frei ist von Zellen, die keine HIV-gp120-Gen codierende Sequenz enthalten (z. B. frei von anderen Clonen der Bank), aufrechterhalten werden. Zahlreiche Clonierungsvektoren sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für rekombinante DNA- Vektoren für die Clonierung und Wirtszellen, die sie transformieren können, umfassen die verschiedenen Vektoren des Bakteriophagen Lambda (E. coli, pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (Gram-negative Bakterien), pGV1106 (Gram-negative Bakterien), pLAFRI (Gram-negative Bakterien), pME290 (Gram-negative Bakterien außer E. coli), pHV14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces) Actinophage, fC31 (Streptomyces) YIpS (Saccharomyces), YCpI9 (Saccharomyces) und Rinder-Papillomvirus (Säugerzellen). Siehe im Allgemeinen, DNA Cloning: Bände I&11, vorstehend; T. Maniatis et al., vorstehend; B. Perbal, vorstehend.
Ortsspezifische Mutagenese für die Insertion von Spaltstellen (wenn erwünscht) wird unter Verwendung eines Primers durchgeführt, der ein synthetisches Oligonucleotid umfasst, welches zu einer einzelsträngigen Phagen-DNA, die mutagenisiert werden soll, bis auf eine begrenzte Fehlpaarung, die die gewünschte Mutation darstellt, komplementär ist. Kurz, das synthetische Oligonucleotid wird als Primer verwendet, um die Synthese eines zu dem Phagen komplementären Strangs zu dirigieren, und die entstehende doppelsträngige DNA wird in ein Phagen-unterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden auf Top-Agar platiert, wobei sie eine Plaque-Erzeugung aus einzelnen Zellen, die den Phagen beinhalten, erlauben.
Theoretisch werden 50% der neuen Plaques den Phagen enthalten, der als Einzelstrang die mutierte Form hat; 50% werden die Ursprungssequenz haben. Die entstandenen Plaques werden mit einem synthetischem, mit Kinase behandeltem Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die die Hybridisierung bei exakter Übereinstimmung erlaubt, aber bei der die Fehlpaarungen mit dem Ursprungsstrang ausreichen, um die Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann aufgenommen, kultiviert und die DNA gewonnen.
Ein allgemeines Verfahren für den ortsspezifischen Einbau nicht natürlicher Aminosäuren in Proteine wird in Christopher J. Noren, Spencet-J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz (April 1989), Science, Band 244, S. 182-188 beschrieben. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Analoga mit nicht natürlichen Aminosäuren zu erzeugen.
Obwohl der Aspekt der Reinigung der Erfindung auf einem Zellmedium durchgeführt werden kann, das fötales Kälberserum enthält, welches typischerweise für die Züchtung von Säugerzellen verwendet wird, wird die Verwendung eines Kulturmediums, das relativ geringe Mengen an FCS enthält, vorgezogen. Zum Beispiel können COS-Zellen, die mit einem Plasmid-Konstrukt transfiziert wurden, das das gp120-Gen enthält, als Quelle für gp120 verwendet werden. Derartige Zellen, die gp120 transient exprimieren, können in Dulbecco's modifiziertem Essentialmedium (DMEM) mit oder ohne Antibiotika, Natriumpyruvat, Glutamin und 1% (an Stelle der normalen 5-6%) fötalem Kälberserum gezüchtet werden. Vereinigte Zellkulturmedien von verschiedenen Zeitintervallen nach der Transfektion können dem Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen werden.
Das Expressionssystem, das von den Erfindern zur Expression von gp120 experimentell verwendet wurde, wird vollständig in der U.S.-Patentanmeldung Nr. 138.894, eingereicht am 24. Dezember 1987 (hierin durch Bezugnahme eingeschlossen) beschrieben. Die spezifischen Vektoren, die verwendet wurden, werden als pCMV6a120-SF2 (bezeichnet als pCMV6ARV120tpa in USSN 138.894) und Ad-dhfr bezeichnet. Die Vektoren wurden verwendet, um eine CHO-Zelllinie zu transfizieren, um den gp120-Hersteller zu ergeben, der als CHO-A-6a120-145-0.1-22 bezeichnet wurde. Bei der Verwendung dieser Zelllinie wird kein Vorteil gegenüber anderen gp120-Herstellern, die durch andere Verfahren hergestellt wurden, gesehen.
Es sollte erkannt werden, dass kein spezifisches Verfahren, keine spezifische Zelllinie oder kein spezifisches genetisches Virusisolat, das oder die zur Herstellung von gp120 in seiner rohen Form verwendet wurde, von den Erfindern gegenüber irgendeinem anderen Verfahren bevorzugt wird. Es wird in Betracht gezogen, dass das vorliegende Reinigungsverfahren Konformation bewahrendes gp120 von jeder Quelle, die glycosyliertes, nicht fusioniertes gp120 voller Länge enthält, herstellt. Die spezifischen Beispiele, die sich auf die gp120-Herstellung im folgenden Abschnitt Beispiele beziehen, resultieren aus Beschlüssen, die in vielen Fällen nur auf Grund von Zweckmäßigkeit gemacht wurden.
Spezifisches genetisches Material, spezifische genetische Zelllinien, Wachstumsbedingungen und Ähnliches wurden von jenen selektiert, die für die Erfinder am bekanntesten und leicht erhältlich waren, und die Erfinder glauben, dass jede der gp120-Quellen, die in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben sind oder später entwickelt wurden, in der Praxis des vorliegenden Reinigungsverfahrens gleich gut verwendet werden können.

Quellen von CD4-Peptid zur Verwendung als gp120/CD4-Bindungsstandards

CD4-Moleküle, die nützlich sind zum Testen, ob gp120-Zusammensetzungen die hierin beschriebenen Eigenschaften haben, können auf verschiedene Arten hergestellt werden, einschließlich der Isolierung von natürlichen Ressourcen und durch Verfahren der Gentechnologie. Ein lösliches menschliches CD4-Fragment, das in der Lage ist, an das gp120-Molekül zu binden, wird in der PCT-Anmeldung Nr. 8903222, veröffentlicht am 20. April 1989 und eingereicht am 5. Oktober 1988 beschrieben. Modifizierte CD4-Moleküle, die gp120-Bindung zeigen, werden in der PCT-Anmeldung Nr. 8902922, veröffentlich am 6. April 1989 und eingereicht am 3. Oktober 1988 beschrieben. Eine CD4 sekretierende Zelllinie, die der als Quelle zur Herstellung des CD4 verwendeten ähnlich ist, welche in den folgenden Beispielen verwendet wurde, kann von der ERC BioServices Corporation, 649A Lofstrand Lane, Rockeville, MD 20850, USA bezogen werden und ist als Zelllinie CHO ST4.2 in der Ausgabe vom Januar 1990 des AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog, veröffentlicht durch die National Institutes of Health des U.S. D. H. H. S. aufgelistet. Andere Quellen für CD4 und Reinigungsverfahren werden zum Beispiel in Smith et al., Science (1987) 238: 1704-1707; Lasky et al., Cell (1987) 50: 975-985; Maddon et al., Cell (1985) 42: 93-104; und Littman et al., Nature (1987) 325: 453-455 beschrieben. Die Reinigung von CD4 aus Zellmedien beteiligt typischerweise die Bindung von CD4 (und anderen kohlenhydrathaltigen Molekülen) an Conconvalin A, das an einen festen Träger wie Sepharose 4B gekoppelt ist, gefolgt von Ionenaustauschchromatographie. Weitere Reinigung kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der für das CD4-Molekül spezifisch ist, stattfinden, wenn erwünscht. Anders als bei gp120 sind bei der Verwendung der Affinitätschromatographie zur Reinigung von CD4 keine Probleme offensichtlich.

Verwendung des gp120 der Erfindung

Obwohl eine wichtige Verwendungsweise des gp120 der vorliegenden Erfindung, das die Konformation bewahrt hat, ein Impfstoff ist, gibt es auch eine Vielzahl anderer Verwendungsmöglichkeiten. Zum Beispiel ist das gp120, das die Konformation bewahrt hat, besonders nützlich bei der Herstellung von anti-id-Antikörpern, die zur Bindungsstelle auf dem gp120-Molekül für das CD4-Molekül passen. Andere Verwendungsmöglichkeiten umfassen die Verwendung als Standards bei kompetitiven Bindungstests auf die Präsenz von HIV-1-Viruspartikeln. In der Tat kann das gp120-Glycoprotein der vorliegenden Erfindung in jeder Weise verwendet werden, in der die gp120-Moleküle, die zuvor erhältlich waren, verwendet wurden, obwohl es gp120 in der Form stärker ähnelt, in der es natürlicherweise in Viruspartikeln gefunden wird.
Eine offensichtliche Verwendungsmöglichkeit der gp120-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist der Immuntest, entweder für anti-HIV-Antikörper oder für HIV- Polypeptide, besonders anti-gp120-Antikörper und virales gp120. Der Aufbau der Immuntests ist unterliegt vielen Variationsmöglichkeiten auf dem Fachgebiet. Demnach ist die folgende Diskussion nur veranschaulichend, nicht beschränkend. Siehe allgemein jedoch U.S.-Patent Nr. 4.743.678, 4.661.445 und 4.753.873 und EPO-Veröffentlichung Nr. 181.150 und 216.191.
Ein Immuntest für virales gp120 kann zum Beispiel einen monoclonalen Antikörper, der auf ein virales Epitop gerichtet ist, eine Kombination von monoclonalen Antikörpern, die auf Epitope von viralem gp120 gerichtet sind, polyclonale Antikörper, die auf das virale gp120 gerichtet sind, oder eine Kombination von monoclonalen und polyclonalen Antikörpern verwenden.
Immuntest-Protokolle können zum Beispiel auf Zusammensetzung, direkter Reaktion oder Tests vom Sandwich-Typ basieren. Protokolle können zum Beispiel auch heterogen sein und feste Träger verwenden oder homogen sein und Immunreaktionen in Lösung beteiligen. Bei den meisten Tests war die Verwendung von markierten Antikörpern oder Polypeptiden beteiligt. Die Marker können zum Beispiel fluoreszierend, chemilumineszierend, radioaktiv oder Farbstoff-Moleküle sein. Tests, die die Signale von der Sonde amplifizieren, sind ebenfalls bekannt. Beispiele für derartige Tests sind die, die Biotin und Avidin verwenden, sowie enzymmarkierte und -vermittelte Immuntests, wie ELISA-Tests.
Typischerweise ist bei einem Immuntest für anti-HIV-Antikörper die Selektion und Herstellung der Testprobe beteiligt, wie bei einer biologischen Probe, und dann ihre Inkubation mit einer gp120-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Erzeugung von Antigen-Antikörper-Komplexen erlauben. Derartige Bedingungen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. In einem heterogenen Format wird das gp120 zum Beispiel an einen festen Träger gebunden, um die Trennung der Probe von dem Polypeptid nach der Inkubation zu erleichtern. Beispiele für feste Träger, die verwendet werden können, sind Nitrocellulose in Form von Membranen oder Mikrotiterplatten- Vertiefungen, Polyvinylchlorid in Platten oder Mikrotiterplattin-Vertiefungen, Polystyrol- Latex als Kügelchen oder Mikrotiterplatten-Vertiefungen, Polyvinylidin-Fluorid, bekannt als Immobulon®, diazotisiertes Papier, Nylonmembranen, aktivierte Kügelchen und Protein A- Kügelchen. Am meisten bevorzugt werden Dynatech, Immobulon® 1-Mikrotiterplatten oder 0,25 Inch-Polystyrol-Kügelchen, Spec, hergestellt von Precision Plastic Ball im heterogenen Format verwendet. Der feste Träger wird typischerweise nach Trennung von der Testprobe gewaschen. Beim homogenen Format wird andererseits die Testprobe mit dem gp120- Antigen in Lösung unter Bedingungen inkubiert, die jegliche Antigen-Antikörper-Komplexe, die gebildet werden, präzipitieren, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Die präzipitierten Komplexe werden dann von der Testprobe getrennt, zum Beispiel durch Zentrifugation. Die erzeugten Komplexe, die anti-HIV-Antikörper umfassen, werden dann durch eine Anzahl von Verfahren nachgewiesen. Abhängig vom Format können die Komplexe mit markiertem antixenogenem Ig oder, wenn ein kompetitives Format verwendet wird, durch Messen der Menge an gebundenen, kompetierenden markierten Antikörpern nachgewiesen werden.
In Immuntests, in denen die viralen gp120-Polypeptide der Analyt sind, wird die Testprobe, typischerweise eine biologische Probe, mit anti-gp120-Antikörpern wiederum unter Bedingungen inkubiert, die die Erzeugung von Antigen-Antikörper-Komplexen erlauben. Verschiedene Formate können verwendet werden, wie der "Sandwich"-Test, bei dem an einen festen Träger gebundene Antikörper mit der Testprobe inkubiert, gewaschen, mit einem zweiten, markierten Antikörper gegen den Analyt inkubiert werden und der Träger wiederum gewaschen wird. Analyt wird durch Bestimmung, ob der zweite Antikörper an den Träger gebunden ist, nachgewiesen. In einem kompetitiven Format, das entweder heterogen oder homogen sein kann, wird eine Testprobe normalerweise mit einem Antikörper und einem kompetierenden markierten Antikörper, entweder sequenziell oder simultan inkubiert. Diese und andere Formate sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Bei der Verwendung in einem Impfstoff wird das gp120-Glycoprotein der vorliegenden Erfindung manchmal als "Untereinheit"-Impfstoff bezeichnet, da gp120 eine Untereinheit des HIV-Virus ist. Als solches bietet es signifikante Vorteile gegenüber traditionellen Impfstoffen in Bezug auf Sicherheit und Produktionskosten; Untereinheit- Impfstoffe sind jedoch häufig weniger immunogen als Gesamtvirus-Impfstoffe, und es wird erwartet, dass Adjuvantien mit signifikanten immunstimulatorischen Fähigkeiten benötigt werden, um ihr volles Potenzial bei der Vorbeugung von Krankheiten zu erreichen. Alle Adjuvantien, die bis jetzt getestet wurden, zeigten jedoch die Fähigkeit, die Erzeugung von multi-isolaten, neutralisierenden Antikörpern zu induzieren, wenn sie mit dem gp120 der Erfindung, das die Konformation bewahrt hat, verwendet wurden, so dass spezifische Adjuvantien nicht Teil der breiteren Aspekte der vorliegenden Erfindung sind. Bestimmte Adjuvantien werden jedoch auf Grund ihrer eigenen vorteilhaften Eigenschaften bevorzugt.
Zur Zeit sind die einzigen Adjuvantien, die in den Vereinigten Staaten für die Verwendung am Menschen zugelassen sind, Aluminiumsalze (Alaun). Diese Adjuvantien waren bei einigen Impfstoffen, einschließlich Hepatits B, Diphterie, Polio, Tollwut und Influenza von Nutzen.
Vollständiges Freundsches Adjuvans (CFA) ist ein starkes immunstimulatorisches Agens, das mit vielen Antigenen auf einer experimentellen Basis erfolgreich verwendet wurde. CFA setzt sich aus einem Mineralöl, einem emulgierenden Agens wie Arlacel A und abgetöteten Mycobakterien wie Mycobacterium tuberculosis zusammen. Wässrige Antigen- Lösungen werden mit diesen Komponenten vermischt, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion zu erzeugen. CFA verursacht jedoch schwere Nebenwirkungen, einschließlich Schmerzen, Abszessbildung und Fieber, was seine Verwendung sowohl bei menschlichen als auch tiermedizinischen Impfstoffen verhindert. Die Nebenwirkungen sind primär den Reaktionen des Patienten auf die mycobakterielle Komponente von CFA zuzuschreiben.
Unvollständiges Freundsches Adjuvans (IFA) ähnelt CFA, besitzt jedoch nicht die bakterielle Komponente. Während es in den Vereinigten Staaten nicht zur Verwendung zugelassen ist, war IFA bei verschiedenen Typrn von Impfstoffen in anderen Ländern von Nutzen. IFA wurde erfolgreich am Menschen mit Influenza- und Polio-Impfstoffen und mit verschiedenen Tier-Impfstoffen, einschließlich Tollwut, Hundestaupe und Maul-und- Klauenseuche verwendet. Experimente haben gezeigt, dass sowohl das Öl als auch der Emulgator, der in IFA verwendet wurde, bei Mäusen Tumore verursachen kann, was indiziert, dass ein alternatives Adjuvans eine bessere Wahl für die Verwendung am Menschen wäre.
Muramyl-Dipeptid (MDP) repräsentiert die Minimaleinheit des mycobakteriellen Zellwandkomplexes, der die Adjuvantien-Aktivität erzeugt, die bei CFA beobachtet wurde (siehe Ellouz et al. (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm., 59: 1317). Viele synthetische Analoga von MDP wurden erzeugt, die einen großen Bereich an Adjuvantien-Potenzial und Nebenwirkungen zeigen (zusammengefasst in Chedid et al. (1978) Prog. Allergy, 25: 63). Drei Analoga, die als Impfstoff-Adjuvantien besonders nützlich sWn können, sind Threonyl- Derivate von MDP (siehe Byars et al. (1987) Vaccine, 5: 223), n-Butyl-Derivative von MDP (siehe Chedid et al. (1982) Infect. and Immun., 35: 417) und lipophile Derivate von Muramyl- Tripeptid (siehe Gisler et al. (1981) Immunomodulations of Microbial Products and Related Synthetic Compounds, Y. Yamamura und S. Kotani, Hrsg., Excerpta Medica, Amsterdam, S. 167). Diese Verbindungen stimulieren effektiv die humorale und zellvermittelte Immunität und zeigen geringe Toxizitätswerte.
Ein vielversprechendes lipophiles Derivat von MDP ist N-acetylmuramyl-L-alanyl-D- isoglutamyl-L-alanin-2-[1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-(hydroxyphosphoryloxy)]ethylamid (MTP-PE). Dieses Muramylpeptid hat Phopholipidschwänze, die die Assoziation des hydrophoben Abschnitts des Moleküls mit einer lipiden Umgebung erlauben, während der Muramyl-Peptid-Abschnitt mit der wässrigen Umgebung assoziiert. Demnach kann das MTP- PE selbst als emulgierendes Mittel zur Erzeugung stabiler Öl-in-Wasser-Emulsionen wirken.
Bei Experimenten mit Mäusen wurde gezeigt, dass MTP-PE effektiv ist als Adjuvans bei der Stimulierung von anti-HSV-gD-Antikörpertitern gegen das gD-Antigen des Herpes simplex-Virus und dass die Effektivität stark verbessert wurde, wenn das MTP-PE und gD in Öl (IFA) statt in wässriger Lösung verabreicht wurden. Da IFA für die Verwendung am Menschen nicht zugelassen ist, wurden andere Öl-Verabreichungs-Systeme für MTP-PE und Antigen untersucht. Eine Emulsion von 4% Squalen mit 0,008% Tween 80 und HSV-gD ergab sehr gute Ergebnisse bei Meerschweinchen. Diese Formulierung, MTP-PE-LO (niedriger Ölgehalt), wurde beim Durchtritt durch eine Nadel zur subkutanen Injektion emulgiert und war relativ instabil. Trotzdem ergab MTP-PE-LO hohe Antikörpertiter beim Meerschweinchen und guten Schutz in einem HSV-Challenge bei immunisierten Meerschweinchen (siehe Sanchez-Pescador et al. (1988) J. Immunology, 141: 1720-1727 und Technological Advances in Vaccine Development (1988), Lasky et al., Hrsg., Alan R. Liss, Inc., S. 445-469). Die MTP-PE-LO-Formulierung war auch bei der Stimulierung der Immunantwort auf das von Hefe produzierte HIV-Hüllprotein bei Meerschweinchen effektiv. Sowohl ELISA-Antikörpertiter als auch virusneutralisierende Antikörpertiter wurden mit der MTP-PE-Formulierung auf hohe Werte stimuliert. Wenn jedoch dieselbe Formulierung bei großen Tieren getestet wurde, wie Ziegen oder Pavianen, waren die Zusammensetzungen nicht so effektiv. Trotzdem repräsentiert dieses System ein potenzielles Adjuvantiensystem zur Verwendung mit dem gp120-Antigen.
Experimente haben auch gezeigt, dass eine Adjuvantien-Zusammensetzung, die ein metabolisierbares Öl und ein Emulgiermittel umfasst, worin das Öl und das Emulgiermittel in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion vorhanden sind und die Öl-Tröpfchen hat, die alle im Wesentlichen weniger als 1 Micron Durchmesser besitzen, eine effektive Adjuvantien- Zusammensetzung zur Erhöhung der Effizienz von Impfstoffen ist. Untersuchungen haben eine überraschende Überlegenheit derartiger Adjuvantien-Zusammensetzungen gegenüber Adjuvantien-Zusammensetzungen, die Öl und Emulgiermittel enthalten, gezeigt, in denen die Öltröpfchen signifikant größer sind. Diese überlegenen Adjuvantien-Zusammensetzungen sind der Gegenstand einer getrennten Patentanmeldung EPO 0 399 843, wobei die Veröffentlichung der Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die Adjuvantien-Formulierungen werden im Allgemeinen aus den oben beschriebenen Bestandteilen vor Kombination des Adjuvans mit dem gp120-Antigen hergestellt. Das gp120- Antigen stimuliert die Erzeugung spezifischer Antikörper dadurch, dass es sich Zutritt zum Gewebe eines Tieres verschafft, und reagiert in vivo oder in vitro spezifisch mit solch einem Antikörper. Darüber hinaus stimuliert das Antigen die Vermehrung von T-Lymphocyten mit Rezeptoren für das Antigen und kann mit den Lymphocyten reagieren, um die Reihe von Antworten zu initiieren, die zellvermittelte Immunität genannt wird.
Die Formulierung eines Impfstoffs der Erfindung verwendet eine effektive Menge des gp120-Antigens. Dies bedeutet, dass eine Menge an Antigen eingeschlosssen wird, die in Kombination mit dem Adjuvans das Individuum veranlassen wird, eine spezifische und ausreichende Immunantwort zu produzieren, um dem Individuum einen Schutz vor nachfolgendem Kontakt mit einem HIV-Virus zu gewähren.
Eine bevorzugte Adjuvantien-Formulierung, genannt MF-59, umfasst 0,5% Tween-80, 0,5% Span, 5,0% Squalen in einer MTP-PE-Lösung, die 0,40 Mikrogramm/ml MTP-PE enthält. Die Emulsionszusammensetzung wird 10-Mal bei 10.000 Psi bei 0ºC durch einen Mikrofluidizer geschickt. Das entstandene Material wird durch einen Filter von 0,2 Micron geschickt und unter Argon bei 4ºC gelagert.
Keine einzige Angabe einer Dosis kann angegeben werden, die eine spezifische Anleitung für tatsächlich jede gp120-Formulierung gibt, die als Impfstoff verwendet werden kann. Die effektive Menge eines Antigens ist eine Funktion seiner inhärenten Aktivität und Reinheit, die von Isolat zu Isolat variiert. Anleitung für anfängliche Anteile von Komponenten der Impfstoffformulierungen können vom Abschnitt Beispiele erhalten werden, welcher verschiedene Formulierungen zeigt, die sich bei der Stimulierung neutralisierender Antikörper als effektiv erwiesen haben. Diese Anteile werden für individuelle Herstellungen von natürlichem gp120, das die Konformation bewahrt hat, angeglichen, wie innerhalb des Fachgebiets wohl verstanden wird.
Die Impfstoff-Zusammensetzungen der Erfindung sind sowohl für die Vorbeugung einer HIV-1-Infektion nützlich. Während alle Tiere, die von HIV-1 heimgesucht werden können, auf diese Weise behandelt werden können, ist die Erfindung natürlich besonders auf die vorbeugende und therapeutische Verwendung der Impfstoffe der Erfindung beim Menschen gerichtet. Oft kann mehr als eine Verabreichung benötigt werden, um die erwünschte prophylaktische oder therapeutische Wirkung zu erzielen; das genaue Protokoll (Dosierung und Häufigkeit) kann durch klinische Standardverfahren erstellt werden. Die Impfstoff-Zusammensetzungen werden auf jegliche konventionelle Weise verabreicht, die den Impfstoff in das Tier einbringt, in der Regel durch Injektion. Für die orale Verabreichung kann die Impfstoffzusammensetzung in einer Form verabreicht werden, die jener ähnlich ist, die für die orale Verabreichung anderer proteinartiger Materialien wie Insulin verwendet wird. Wie vorstehend diskutiert können die genauen Mengen und Formulierungen sowohl für die Verwendung bei der Vorbeugung als auch der Therapie variieren, in Abhängigkeit von der inhärenten Reinheit und Aktivität des Antigens, irgendwelchen zusätzlichen Bestandteilen oder Trägern, der Verabreichungsmethode und Ähnlichem. Zur Veranschaulichung, jedoch nicht beschränkend betragen die verabreichten Impfstoff-Dosierungen hinsichtlich des gp120- Antigens ein Minimum von etwa 0,1 mg/Dosis, typischerweise ein Minimum von etwa 1 mg/Dosis und häufig ein Minimum von etwa 10 mg/Dosis. Die Maximaldosen sind typischerweise nicht so kritisch. Normalerweise wird die Dosierung jedoch nicht mehr als etwa 1 mg/Dosis, typischerweise nicht mehr als 500 mg/Dosis, oft nicht mehr als 250 mg/Dosis sein. Diese Dosierungen können in jedem geeigneten pharmazeutischen Vehikel oder Träger in ausreichendem Volumen, um die Dosierung zu tragen, suspendiert werden. Im allgemeinen wird das Endvolumen, einschließlich der Träger, Adjuvantien und Ähnlichem typischerweise mindestens 0,1 ml, noch typischer mindestens etwa 0,2 ml betragen. Die Obergrenze wird durch die Praktikabilität der zu verabreichenden Menge bestimmt, allgemein nicht mehr als etwa 0,5 ml bis etwa 1,0 ml.
In Anbetracht des Vorstehenden umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Verwendung der Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung für die Vorbeugung einer HIV- 1-Infektion beim Tier und ein Verfahren der Verwendung der Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung für die therapeutische Behandlung von Tieren, die bereits mit HIV-1 infiziert sind. Tiere umfassen Säuger wie Primaten, zum Beispiel Schimpansen, Paviane und Menschen.
Da die Erfindung nun im Allgemeinen beschrieben ist, würde dasselbe besser durch Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beschreibungen verstanden werde, die nur zum Zweck der Veranschaulichung gezeigt werden und nicht als beschränkend für die Erfindung betrachtet werden sollen, wenn nicht so spezifiziert.

Beispiel 1

Mutagenese und Expression von HIV-gp120 in Säugerzellen

Das Hüllgen, das gp160 von HIV-SF2 codiert, wurde durch Einführung eines Stop- Codons nach Arg509 an der natürlichen gp41-Prozessierungsstelle von gp120 zur Expression von gp120-Sequenzen hergestellt. Das 5'-Ende des Gens wurde modifiziert, um einen Nhel- Endonuclease-Restriktionsstelle 5' zu der Sequenz, die Glu31 codiert, zu inserieren, so dass die natürliche Signalsequenz durch andere Signalsequenzen ersetzt werden konnte, um auf verbesserte Sekretion aus Säugerzellen zu testen. Um gp120 als sekretiertes Glycoprotein in Säugerzellen herzustellen, wurden die HIV-Signalsequenz und untranslatierte 5'-Sequenzen durch solche aus menschlichem t-PA ersetzt und mutagenisiert, um einen Nhel-Ort in die Nähe des 3'-Endes der tPA-Signal-DNA zu platzieren, um Ala Ser zu codieren. Das entstandene Genkonstrukt wurde mit einer Reihe von Promotoren fusioniert. Die transiente gp120-Expression wurde nach Transfektion der Expressionsvektoren in COS-7-Zellen und Vergleich der Mengen an sekretiertem gp120 durch Ziegen-Einfang-ELISA (nachstehend beschrieben) und Western Blot bestimmt. Die höchsten Expressionsmengen wurden bei Verwendung des CMV IE-1-Promotors gesehen und waren mindestens 50-Mal höher als mit dem frühen SV40-Promotor. Für die Konstruktion permanenter Zelllinien wurde das Expressionsplasmid pCMV6aSF2-120 (Fig. 1) zusammen mit einem dhfr- Expressionsplasmid unter Verwendung von Calciumphosphat-Copräzipitation in CHP-dhfr-Zellen (dg44; siehe unten) transfiziert. Die entstandenen Zelllinien wurden durch Absuchen von Clonen mit dem gp120-Ziegen-Einfang-ELISA charakterisiert. Die am stärksten exprimierenden Zelllinien wurden in Pools in Methotrexat amplifiziert. Clone wurden bei einer Menge von 0,1 mM isoliert. Unter Verwendung von gereinigtem Protein als Standard wurde gezeigt, dass Zelllinien im Bereich von 5 mg pro Liter bezogen auf T- Flaschen gp120 sekretieren.
Die Zellen, die für die Expression des gp120-Gens verwendet wurden, wurden ursprünglich von Dr. Leslie Rall der Chiron Corporation im September 1985 bei etwa 100 Passagen gewonnen. Diese Zellen wurden ursprünglich von Dr. Gail Urlaub und Dr. Lawrence Chasin an der Columbia University, New York isoliert und sind in Urlaub et al., Cell (1983) 33: 45 beschrieben. Die Zellen wurden als DG44 bezeichnet. Sie stammen von Eierstock-(CHO)K-1-Zellen vom Chinesischen Hamster und wurden durch doppelte Deletion defizient in Dihydrofolatreduktase (dhfr&supmin;) gemacht.
Die CHO-dhfr&supmin;-Zellen wurden kontinuierlich in dem folgenden Medium kultiviert: Hams-F-12-Medium, supplementiert mit 10% dialysiertem fötalen Kälberserum, 200 mg/ml Streptomycin. Medium und Serum wurden von der University of California, San Francisco Cell Culture Facility, San Francisco, CA erhalten. Alle anderen Bestandteile wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO geliefert. Die Zellen wurden durch Passage mit einer 1 : 10-Spaltung in T-75-Flaschen zweimal pro Woche aufrechterhalten.
Für die Lagerung wurden Zell-Aliquots in fötalem Kälberserum (FCS), 10% Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) eingefroren und bei -80ºC in der Gasphase flüssigen Stickstoffs gelagert. Zu diesem Zweck wurden in T-75-Flaschen Zellen zur Konfluenz (etwa 10&sup7; Zellen pro T-75-Flasche) gezüchtet. Die Zellen wurden mit Trypsin versetzt, zentrifugiert und in einer Konzentration von etwa 5 · 10&sup6; Zellen/ml in eiskaltem 10% DMSO in FCS resuspendiert. 1 ml Aliquots wurden in kryokonservierende Fläschchen überführt. Wenn Zellen benötigt wurden, wurde ein Aliquot in einem 37ºC-Wasserbad aufgetaut, und die Zellen wurden in T-75-Flaschen zur kontinuierlichen Kultur und Passage gesät.
Die zwei Tests, die, wie vorstehend beschrieben, zum Nachweis von HIV-1- Antigenen, die mit der Hülle in Beziehung stehen, verwendet wurden, wurden auf die folgende Weise durchgeführt. Für beide Tests wurde gereinigtes, von CHO abgeleitetes gp120 als Standard unter Verwendung von zweifachen Verdünnungen von 200 ng/ml bis 0,195 ng/ml verwendet.
(a) Ziege-Einfang-ELISA: Das Einfang-Reagens für diesen Test war durch Protein-A-Sepharose-Affinität gereinigtes Immunglobulin einer Ziege, die mit gereinigtem env-2-3 (SF2), welches nachstehend beschrieben ist und das ein nicht-glycosyliertes, in Hefe hergestelltes Polypeptid ist, das der Aminosäuresequenz von gp120 des HIV-SF2-Virusisolats entspricht, hyperimmunisiert worden war. Das Reagens, das zum Nachweis des eingefangenen Antigens verwendet wurde, war ein polyclonales Antiserum, das in Kaninchen gegen dasselbe Antigen hervorgerufen worden war. Platten wurden mit 5 mg/ml Ziegen- Immunglobulin gegen env-2-3 (SF2) beschichtet, mit Verdünnungen von viralem Lysat oder Säuger-abgeleiteten gp120-Antigenen inkubiert und dann wurde das eingefangene Antigen durch das polyclonale Kaninchenantiserum gegen env-2-3 (SF2), das 1/100 verdünnt worden war, nachgewiesen, gefolgt von Konjugat und ABTS-Substrat.
(b) Menschlicher Einfan-ELISA: Dieser Test ist mit dem vorstehend beschriebenen "Ziege-Einfang-ELISA" identisch, mit der Ausnahme, dass das Einfang-Reagens Protein-A- Sepharose-gereinigtes Immunglobulin von menschlichen Seren, gewonnen von HIV-1- seropositiven Blutspendern war.

Beispiel 2

Zelluläre Produktion

Eine Zelllinie, CHO-A-6a120-145-0.1-22, gewonnen wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde für die Herstellung in Rollflaschen in Medien mit reduziertem Serum und ohne Methotrexat ausgewählt. Kulturen in Rollflaschen (850 cm²) wurden etabliert und in Medium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium und Ham-F-12, 1 : 1), welches mit 6% fötalem Kälberserum (FCS) supplementiert war, zur Konfluenz expandiert. Für die Herstellung wurde die Supplementierung auf 1% FCS mit 0,03% HB-CHO (Hana Biologics, Alameda, CA.) umgestellt. Konditioniertes Medium (200 ml) wurde alle 24-48 Stunden gesammelt, bei 2-8ºC gelagert, vereinigt und durch Filtration durch Kapselfilter von 0,45 Micron (Gelman) geklärt. Die Zellen wurden mehr als zwei Monate in jedem von zwei Produktionsdurchgängen ohne offensichtlichen Produktionsverlust an gp120 aufrechterhalten. Die Expressionswerte lagen im Bereich von 5 bis 20 mg/l.

Beispiel 3

Reinigung

(1) Konzentration. Die Konzentration des Zellkulturüberstands aus Beispiel 2 (40 l) wurde unter Verwendung von Dead-end-Filtration (0,45 Micron-Kapselfilter, Gelman) und Querstrom-Ultrafiltration unter Verwendung eines abgeschnittenen Hohlfaser-Ultrafilters mit einem Aufschluss von 30 K (AG Technology #UFP-30-C-6; 6 ft² und 0,5 mm i.D. der Faser), angetrieben durch eine positive Verdrängerpumpe (Waukesha #18), durchgeführt. Die Permeationsrate lag bei etwa 150 ml/min bei einer Rezirkulationsrate von etwa 12 l/min und einem Druck von 26 Psi. Die Filtration dauerte an, bis das Filterrückstandsvolumen 1-2 l erreichte. Die Filtrationsschritte wurden in einem kalten Raum bei 2-8ºC durchgeführt. Das Ultrafiltrationskonzentrat war eine braune, klare Flüssigkeit.
(2) DEAE-Chromatographie. Das Konzentrat wurde auf eine Ionenaustauschersäule (11,4 cm Durchm. · 15 cm), gepackt mit DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia), äquilibriert in Puffer (0,02 M Tris-Cl, pH 8,0, 0,1 M NaCl) bei einer Durchflussrate von 35 ml/min bei Raumtemperatur aufgebracht. Das Ultrafiltrationskonzentrat wurde durch Zusetzen von Natriumchlorid (4 M Stammlösung) auf ein Volumen von 2 l und eine Leitfähigkeit von 1,4 mS eingestellt. Die nicht-adsorbierte Fraktion, die das Produkt enthält, wurde in Fraktionen von 250 ml unter Verwendung eines Iso-Foxy®-Fraktionensammlers gesammelt. Serumalbumin, andere Proteine und die Masse des braun gefärbten Materials banden an die Säule und wurden mit Stufengradienten von 1 M NaCl eluiert. Diese Fraktionen enthielten eine kleine, aber variable Menge des Produkts; kein Versuch wurde gemacht, das Produkt von der gebundenen Fraktion zu gewinnen. Das DEAE-Sephadex-A-50-Harz wurde nach jeder Verwendung verworfen. Es wurde durch den ELISA-Test gezeigt, dass die durchgelaufene Fraktion die Masse des Produkts enthielt. Bei diesem Reinheitsstadium war es schwierig, die diffuse gp120-Bande auf einem SDS-Gel zu lokalisieren.
(3) Hydrophobe Phenyl-Interaktionschromatographie. Die DEAE-Fraktion wurde in Ammoniumsulfat durch Zusetzen von festem Ammoniumsulfat auf 40% Sättigung gebracht. Nach gründlicher Vermischung wurde eine geringe Menge Präzipitat durch Zentrifugation entfernt. Eine TSK-Phenyl-5PW-HIC-Säule (5,5 cm Durchm. · 20 cm) wurde mit mindestens zwei Volumina Wasser unter Verwendung einer präparativen Gilson-HPLC gewaschen. Dann wurde die Säule mit zwei oder mehr Volumina Puffer A (0,02 M Natriumacetat, pH 5,0, 40% gesättigtes Ammoniumsulfat) äquilibriert. Die Äquilibrierung der Säule wurde durch Messung der Leitfähigkeit des ausfließenden Materials überprüft. Die Überstandsfraktion nach Zusetzen von Ammoniumsulfat wurde durch Pumpen durch Pumpe A bei 30 ml/min auf die Säule aufgebracht, dann wurde die Säule mit Puffer A gewaschen, bis die Grundlinie sich stabilisierte (normalerweise etwa 15-20 min). Ein Gradient von 0,02 M Natriumacetat, pH 5,0 wurde 40 min laufen gelassen, um das Produkt zu eluieren. Fraktionen unter dem OD-Peak wurden durch SDS-Gelelektrophorese unter Verwendung eines Pharmacia Phast®- Systems getestet, um das Produkt zu lokalisieren. Bei diesem Stadium an Reinheit war die gp120-Bande klar zu unterscheiden. Produkt-enthaltende Fraktionen wurden für das nächste Chromatographie-Stadium vereinigt (siehe Fig. 3A).
(d) Hydrophobe Ether-Interaktionschromatographie. Ein zweiter HIC-Schritt wurde auf einer TSK-Ether-5PW-HPLC-Säule (5,5 cm Durchm. · 20 cm) nach demselben Verfahren wie für die Phenyl-HIC-Säule durchgeführt. Die Säule wurde mit mindestens zwei Säulenvolumina Wasser gewaschen, dann in Puffer A äquilibriert (zu 40% gesättigtes Ammoniumsulfat, 0,02 M Natriumacetat, pH 5,0). Der Produkt-Pool von der Phenyl-Säule wurde durch Zusetzen von Ammoniumsulfat auf eine Leitfähigkeit von 165 5/cm eingestellt, gefolgt von 10 minütiger Zentrifugation bei 12.000 UpM. Die Probe wurde aufgetragen und unter Verwendung eines 40 min-Gradienten von 100% Puffer A auf 100% Puffer B, wie vorstehend beschrieben, eluiert. Produkt-enthaltende Fraktionen (siehe Fig. 3B) wurden durch SDS-Gelelektrophorese auf einem Phast®-System lokalisiert, dann für die Gelfiltrationschromatographie vereinigt. Der gp120-Peak der Ether-Säule war hauptsächlich gp120 mit kleineren Mengen an Verunreinigungen von niedrigerem Molekulargewicht. Diese Verunreinigungen wurden durch Gelfiltrationschromatographie (nachstehend) aufgelöst.
(5) Gelfiltrationschromatographie. Die HIC-Etherfraktion wurde auf einer Ultrafiltrationsmembran (Amico YM-30) auf eine Proteinkonzentration von etwa 10 mg/ml, wie bei A-280 gemessen, unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 0,6 = 1 mg/ml konzentriert, dann gegen mindestens fünf Volumina 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,9 dialfiltriert. Die Probe wurde auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex®200, Pharmacia, 1,6 cm Durchm. · 60 cm) bei einer Gesamtproteinkonzentration von nicht mehr als 10 mg/ml in einem Volumen von nicht mehr als 4% des Säulenvolumens aufgebracht und mit 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,9 eluiert. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt, einer SDS- Gelelektrophorese mit Coomassie Brilliantblau R350-Färbung auf einem Phast-System unterzogen, und dann, um Filtrations-HPLC auf einer DuPont GF-450-Säule (Laufpuffer: 0,2 M Natriumphosphat, pH 6,7, 1 ml/min) zu erhalten, um Dimer-enthaltende Fraktionen zu lokalisieren, vereinigt. Die führende Kante des gp120-Peaks enthielt reines gp120, wohingegen die Hinterkante erneut auf der Gelfiltrationssäule chromatographiert wurde. Der Produkt-Pool wurde auf einer Amicon YM-30-Membran konzentriert, gegen 5 Volumina destilliertes Wasser diafiltriert und mindestens zwei Tage bei einem Druck von weniger als 10 Micron lyophilisiert.
(6) Zusammenfassung der Reinigungsergebnisse. Tabelle 1 fasst die Ergebnisse einer typischen Reinigung, die mit 40 Litern Zellkulturüberstand beginnt, zusammen. Diese Daten zeigen, dass eine 250-fache Reinigung mit einem Ertrag von 20-25% erreicht wird. Das Produkt erschien als eine breite Bande, die bei H120 kD in einem SDS-Gel wanderte. Die Dichtemessung ergab, dass 80-90% der Färbeintensität unterhalb der gp120-Bande lag. Dies repräsentiert wahrscheinlich eine Minimalschätzung der Reinheit dieser Herstellung, da gp120 schlecht Färbemittel bindet. Ungefähr 7-mal weniger Coomassie Brilliantblau wurde, verglichen mit BSA, pro Microgramm Protein gebunden. Die Erscheinung der Gelbande wurde durch vorherige Behandlung der Probe mit 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreit nicht verändert, was zeigt, dass das Protein intern nicht gespalten ist. Umkehrphasen-HPLC- Analyse bei erhöhter Temperatur ließ den Schluss zu, dass die Reinheit des Produkts 90% überstieg. Tabelle 1 SF2-rgp120-Reinigungstabelle

Beispiel 4

(1) Vergleich von gereinigtem SF-2-rgp120 mit viralem gp120. Gereinigtes gp120 wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um Größe und Reinheit festzustellen. Das Protein wanderte an der vorausgesagten Stelle für ein 120 K-Protein mit einer breit gefärbten Bande, die charakteristisch ist für Glycoproteine. Diese breite Bande ist mit der erwarteten Kohlenhydratheterogenität an den 22 vorhergesagten N-verbundenen Glycosylierungsstellen, wie sie für andere Isolate beschrieben worden war, konsistent. Um das rekombinante gp120 mit dem in Viruspartikeln gefundenen zu vergleichen, wurden Lysate von HIV-SF2-infizierten HUT-78-Zellen hergestellt und in einem Western-Blot mit HIV-positiven menschlichen und gp120-spezifischen Tierseren untersucht. Die beobachteten Muster waren mit der konservierten Konformation konsistent.
(2) N-terminale Sequenzierung. Die aminoterminale Aminosäuresequenz wurde durch automatisierten Edman-Abbau bestimmt. Die beobachteten und erwarteten Sequenzen waren:
beobachtet EKLWVTVYYGVPVWK ...
erwartet TEKLWVTVYYGVPVWK ...
Diese Sequenz bestätigt, dass das heterologe Signal durch die Signalpeptidase nach dem Serin des Signals korrekt prozessiert wurde und dass das Protein nicht mit irgendwelchen zusätzlichen Aminosäuren fusioniert ist. Dieser Sequenz fehlt das N-terminale Threonin, das auf viralem gp120 vom HTLVIIIB-Isolat (Robey et al., PNAS (1986) 83: 7023-7027) gefunden wurde. Die N-terminale Aminosäuresequenz stimmt mit der HIV-SF1-Hüllsequenz überein, die von der DNA-Sequenz dieses Isolats für mindestens die ersten 15 Aminosäuren vorhergesagt war.
(3) Aminosäurenzusammensetzung. Aminosäureanalysen wurden an fünf Chargen von gp120, die wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt waren, durchgeführt. Der Durchschnitt dieser Werte stimmte mit der auf Grund der DNA-Sequenz erwarteten Zusammensetzung innerhalb des experimentellen Fehlers für alle Aminosäuren, mit Ausnahme von Ile (33,5 beobachtet gegen 39 erwartet) und Ser (32,7 beobachtet gegen 24 erwartet) überein. Der Wert für Ser war innerhalb der fünf Chargen variabel und repräsentiert wahrscheinlich eine serinreiche Verunreinigung.
(4) Native Gelelektrophorese und IEF. Die Heterogenität der Ladung von gp120 war bei isoelektrischen Fokussierungsversuchen und bei der nativen Gelelektrophorese offensichtlich. Isoelektrische Fokussierung zeigte die Gegenwart von multiplen Banden innerhalb der Hülle bei pH 5 bis 7 an. Das Protein wanderte als einzelne breite Bande in einem nichtdenaturierenden Polyacrylamid-Gel.
(5) Gelfiltrations-HPLC. Das Molekulargewicht von rekombinantem gp120 war in Gegenwart von SDS 120 K; das Molekulargewicht in Abwesenheit von SDS wurde durch Gelfiltrations-HPLC gemessen. Bei neutralem pH-Wert in Puffern mit mittlerer Ionenstärke eluierte gereinigtes gp120 als einzelner Haupt-Peak mit einem Retentionsvolumen, das einem Molekulargewicht von H130 K entsprach. Eine kleine Menge an Dimer war ebenfalls vorhanden; die Dimer-Fraktion erhöhte sich auf 10-20 des gesamten gp120 bei Lagerung in Lösung. Die Dimer-Fraktion wurde am Gelfiltrations-Schritt isoliert und getrennt analysiert. Diese Fraktion wanderte bei Analyse durch SDS-Gelelektrophorese in Gegenwart eines Reduktionsmittels als Monomer, jedoch in Abwesenheit von Reduktionsmitteln (2- Mercaptoethanol oder Dithiothreit) als Dimer; demnach war es wahrscheinlich durch Disulfidbrücken verbunden. Die Aminosäurezusammensetzung der Dimerfraktion war nicht zu unterscheiden von der der Monomerfraktion. Die Dimerfraktion band auch beim Radioimmunpräzipitationstest CD4. Der Gelfiltrations-HPLC-Peak von gp120 war breiter, als man bei einem Protein mit diesem Molekulargewicht erwarten würde. Die Breite des für gp120 erhaltenen Extra-Peaks kann der Heterogenität der Kohlenhydrateinheit zugeschrieben werden. Das im Hinblick auf die vorhandenen Verunreinigungen hohe Molekulargewicht von gp120 machte es möglich, Gelfiltrations-HPLC als Reinigungstest nach dem Phenyl-HIC- Schritt zu verwenden. Er wurde routinemäßig als Test beim Gelfiltrationsschritt verwendet, um die Fraktionen, die gp120-Dimere enthielten, aus dem Produkt-Pool zu eliminieren.
(6) CD4-Bindung. Das CD4, das in diesem Beispiel verwendet wurde, war rekombinantes, lösliches CD4, das von einer CHO-Zelllinie abstammte, welche mit einem Expressionsplasmid transfiziert war, das die gesamte externe Domäne codierte. Details über die CD4-Herstellung zur Verwendung als Bindungsstandard sind in Beispiel 5 gezeigt. Bindungsversuche wurden durch Radio-Immunpräzipitation durch Gelfiltrations-HPLC durchgeführt.
(a) Allgemeine Verfahren von Radio-Immunpräzipitationen. Konfluente einzellige Schichten von Zellen, die (zum Beispiel) gp120 herstellen, wurden in Dulbecco- modifiziertem Eagle-Medium ohne Cystein und Methionin (cys-met-DME) markiert. Fünf ml cys-met-DME mit je 100 mCi/ml ³&sup5;S-Met und Cys wurden jeweils einer T75-Flasche 6-8 Stunden lang zugesetzt. Die markierten Proben wurden geerntet, zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und bis zur Verwendung bei -80ºC gelagert. Die zu präzipitierenden Proben wurden auf 1X Lysepuffer [0,1 M NaCl, 0,02 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 17 mg/ml Aprotinin] eingestellt. Die Proben wurden mit einem Zehntel Volumen normales Ziegenserum 30 Minuten lang bei 4ºC vorgeklärt, gefolgt von 30 Minuten Präzipitation mit Protein A-Sepharose (PAS) (1/2 Volumen 20% Suspension) bei 4ºC. Immunglobulin von hyperimmunisierten Tieren oder HIV-positive menschliche Serumproben wurden unter Verwendung von PAS durch Standardverfahren affinitätsgereinigt. Die Seren wurden auf das beste Verhältnis von Signal zu Geräusch titriert; die meisten Immunglobulinfraktionen wurden bei 5-10 mg pro Probe verwendet. Immun- Präzipitationen wurden 1-12 Stunden bei 4ºC in Abhängigkeit vom Volumen der Probe durchgeführt, gefolgt von 1 Stunde mit PAS. Alle Proben innerhalb eines Versuchs wurden auf dasselbe Volumen angeglichen. Das PAS wurde mit Lysepuffer ohne BSA gewaschen, gefolgt von 0,12 M Tris pH 7, und die Pellets wurden in 1 Laemmli-Probenpuffer solubilisiert, gekocht und auf Gele aufgetragen. Die Gele wurden mit En³Hance®, behandelt, getrocknet und fluorographiert.
(b) CD4-Bindung durch Radio-Immunpräzipitation. CD4 wurde mit 35S, wie vorstehend beschrieben, markiert, und die CD4-Konzentration wurde unter Verwendung eines Einfang-ELISAs unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers und von polyclonalem Kaninchenserum, das gegen CD4 hervorgerufen worden war, bestimmt. Für Copräzipitationsversuche wurde CD4 in steigenden Mengen einer festgesetzten Menge an gp120 (1 mg) zugesetzt, um die Sättigungsmenge festzustellen, und dann mit anti-gp120- Antiseren copräzipitiert. Diese Menge an CD4 wurde für gp120-Titrationsversuche verwendet. Markiertes CD4 wurde mit normalem Serum vorgeklärt, wie vorstehend beschrieben. Nach Vorklärung der markierten Komponente wurden CD4 und gp120 eine Stunde bei 4ºC komplexiert, dann wurde eine Stunde bei 4ºC Antikörper gegen die unmarkierte Komponente zugesetzt (10 mg pro Probe). OKT4 wurde von Ortho Diagnostics erworben. PAS wurde eine Stunde bei 4ºC zugesetzt, und die Komplexe wurden gewaschen und, wie vorstehend beschrieben, für die Elektrophorese vorbereitet.
Gp120 war vor und nach Reinigung bei der Bindung an CD4 in diesem Versuch effektiv, wie durch gleiche Bandenintensitäten für gleiche Mengen an zugesetztem gp120 gezeigt. Ein nicht-glycosyliertes Analogon für in Hefe hergestelltes gp120 (env 2-3, siehe U.S.-Patentanmeldung Nr. 138.894, eingereicht am 24. Dezember 1987) war in diesem Versuch nicht in der Lage, an CD4 zu binden. Die dimere Form von gp120, isoliert von der Superdex®200-Säule, band in diesem Versuch ebenfalls CD4. Die Bindungssättigung wurde graphisch bestimmt. Von den Mengen bei halber Sättigung wurde ein Kd-Wert von 6,9 nM gemessen.
(c) CD4-Bindung durch Gelfiltrations-HPLC. Gereinigtes gp120 und unmarkiertes CD4 wurden in einem Volumen von 60 ml vermischt, wobei 0,3 M Kaliumphosphat, pH 6,8, enthalten waren. Nach Vermischen wurde ein Anteil der Probe (45 ml) auf eine DuPont GF- 450-Gelfiltrations-HPLC-Säule mit einem Waters WISP 712-Probeninjektor injiziert und in 0,4 M Kaliumphosphat, pH-Wert 6,8, bei 1 ml/min laufen gelassen. Die optische Dichte wurde bei 215 nm überwacht, und die Daten wurden unter Verwendung von Waters Maxima 820®Chromatographie-Software aufgenommen.
Wurden CD4 und gp120 getrennt auf eine Gelfiltrations-HPLC-Säule aufgetragen, zeigte jede Komponente an der erwarteten Elutionszeit einen einzelnen Peak (siehe Fig. 4; Spur A ist nur CD4, Spur B ist nur gp120). Wurden die Komponenten vor der Chromatographie miteinander vermischt, erschien ein neuer Peak bei einer Elutionszeit, die 160 K entsprach, und die Peaks bei 120 K und 40 K verkleinerten sich (Fig. 4; Spur C). Dieses Ergebnis liefert den direkten physikalischen Nachweis der Bildung eines 1 : 1 Komplexes zwischen CD4 und gp120. Zusätzliche Versuche wurden mit variierenden Verhältnissen von CD4 und gp120 und bei verschiedenen Konzentrationen der Reaktionspartner durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Versuche unterstützten die Existenz eines Hochaffinitätskomplexes zwischen einem Molekül CD4 und einem Molekül gp120.

Beispiel 5

CHO-Zellen wurden zusammen mit AD-dhfr und einem Expressionsplasmid, das lösliches rekombinantes menschliches CD4 (vollständige externe Domäne) codiert, transfiziert. Der Expressionsvektor wurde durch Clonieren einer CD4-codierenden Sequenz, einer Gabe von Dr. D. Littman von UCSF, in den Vektor pCMV6a (pCMV6a120-SF2 minus der codierenden gp120-Sequenz), konstruiert. Eine Zelllinie, die lösliches CD4 sekretiert, wurde isoliert. Die resultierende Zelllinie, identifiziert als CHO ST4.2 ist, wie vorstehend beschrieben, öffentlich erhältlich. Das clonierte Gen ST4.2 codiert 380 Aminosäuren, die den vier extrazellulären Domänen bis zur Transmembrangrenze entsprechen. Das Reinigungsverfahren für dieses Protein beteiligt zwei Säulen. Zuerst wurde der CHO- Zellüberstand auf eine S. Sepharose-Kationenaustauschersäule geladen und von ihr eluiert. Ein Liter CHO-Überstand wurde mit doppelt destilliertem Wasser auf 15 l verdünnt und auf 300 ml aufgequollenes Harz, das in 0,2X PBS/2,5 mM EDTA, pH 7,0 (Leitfähigkeit 3,6 ohm&supmin; ¹cm&supmin;¹) äquilibriert worden war, bei einer Beschickungsrate von 3,6 l/Std. bei Raumtemperatur geladen. Die Säule wurde mit 500 ml 0,2X PBS/2,5 mM EDTA und 200 ml 50 mM NaCl, 0,2X PBS, 12,5 mM EDTA gespült. Die Elution erfolgte mit 1 l 200 mM NaCl, 10,2X PBS, 12,5 mM EDTA. Das Eluat von dieser S. Sepharose-Säule ließ man dann über eine Affinitätssäule mit monoclonalen Antikörpern laufen. Der monoclonale Antikörper (25-10- F5.5C1, im Folgenden als 25-10-F5 bezeichnet), der für diese Reinigung verwendet wurde, erkennt in der Amino-terminalen Hälfte (innerhalb der ersten zwei immunglobulin-ähnlichen Domänen) der extrazellulären Region von CD4 ein Konformations- Epitop. Andere Antikörper mit Spezifität für irgendein Epitop innerhalb derselben Domänen sollten ebenso effektiv sein. Das S. Sepharose-Elutionsmittel wurde gefiltert (0,45 Micron) und mit 1 ml/min oder weniger auf die Affinitätssäule geladen. Die beladene Säule wurde mit destilliertem Wasser gespült (25 · Harzvolumen) und mit 5 mM Triethylaminformiat, 10 ml Elutionspuffer pro 4 ml Gelharz eluiert. Der pH-Wert des mAb-Elutionsmittels wurde mit 1 M Tris (pH 8,0) auf pH 7 angeglichen. Die von der Affinitätssäule eluierten Fraktionen wurden dialysiert und konzentriert. Tabelle 1 zeigt den Ertrag jedes Schritts des Reinigungsverfahrens. TABELLE 1 Reinigungstabelle für ST4.2-CD4, produziert in gentechnisch hergestellten CHO-Zellen
a. N.D. = nicht bestimmt
Die Werte von aktivem CD4 in den verschiedenen Fraktionen wurden unter Verwendung eines Einfang-ELISAs, wobei der monoclonale Antikörper 25-10-F5 als Einfang-Reagens verwendet wurde und von einem polyclonalen Kaninchenantiserum, das gegen gereinigtes ST4.2 hervorgerufen worden war, als Nachweisreagens bestimmt. Fraktionen und Durchfluss jeder Säule wurden mit dem anfänglichen Überstand und einem bekannten CD4-Standard verglichen. Dies ermöglichte die Quantifizierung, wie viel aktives CD4 bei jedem Schritt gewonnen wurde. Es versetzte einen ebenfalls in die Lage, die Zunahme an Reinheit nach jedem Reinigungsschritt zu schätzen. Dies wurde durch Vergleichen der Gesamtmenge (Milligramm) an aktivem CD4, wie durch den ELISA bestimmt, mit den gesamten Milligramms an Protein, wie durch einen Pierce-Protein- Mikrotest bestimmt, durchgeführt. Bei Verwendung dieser Verfahren zeigte es sich, dass der Ertrag bei der S. Sepharose-Säule 76% und bei der Affinitätssäule 74% betrug, Was einen Gesamtertrag von 56% ergibt. Es ist zu bemerken, dass die S. Sepharose-Säule allein eine 31- fache Reinigung ergab und eine Lösung erzielte, die nach nur dem ersten Schritt aus 93% CD4 bestand. Die Affinitätssäule steigerte die Reinheit des S. Sepharose-Eluats im Wesentlichen bis zur Homogenität.
Die Reinheit dieser Endfraktionen wurde auf zwei Wege analysiert. Zuerst ließ man das Protein auf einem 12% SDS-Gel laufen und färbte es mit Coomassie-Brilliantblau. Diese visuelle Analyse indizierte, dass das Protein in hohem Maße gereinigt war; mindestens 95% des Endprodukts waren CD4. Eine Aminosäureanalyse wurde an ST4.2-Proben durchgeführt, die gemäß diesem Protokoll gereinigt waren, und indizierte ebenfalls, dass das Material in hohem Maße gereinigt war.
Die gp120-Bindungsfähigkeit von gereinigtem ST4.2 wurde sowohl durch ELISA als auch unter Verwendung einer gp120-Säule analysiert. ST4.2 konnte auf Mikrotiterplatten beschichtet werden und behielt die gp120-Bindungsaktivität bei. Um die gp120-Bindung der verschiedenen Chargen von CD4 zu testen, wurden Mikrotiterplatten mit verschiedenen Konzentrationen an CD4 von jeder Charge inkubiert, und dann wurde jeder Vertiefung eine einzige gp120-Konzentration zugesetzt.
Gebundenes gp120 wurde mit einem polyclonalen Kaninchenantiserum gegen gp120 (Rb-anti-env2-3-Serum) nachgewiesen. Ein starkes Signal wurde gesehen, wobei einer Austitrierung erfolgte, als die Menge an auf die Platte beschichtetem ST4.2 zurückging. Die Bindung von gp120 wurde auch für zwei der Chargen dadurch festgestellt, dass man das gereinigte ST4.2 über eine Affinitätssäule mit gp120 laufen ließ. Eine Anfangslösung von 10 mg/ml ST4.2 wurde auf die Säule geladen. Der CD4-Gehalt jeder Fraktion wurde durch Immunblot-Analyse der verschiedenen Fraktionen unter Verwendung des polyclonalen Kaninchenantiserums gegen ST4.2, wie vorstehend diskutiert, bestimmt. Diese Ergebnisse zeigten, dass nahezu 100% des immunreaktiven CD4-Materials an das gp120 auf der Säulenmatrix absorbiert wurde und als spezifischer Peak eluierte.
Natives und denaturiertes ST4.2 wurden auf Mikrotiterplatten beschichtet, und die Fähigkeit verschiedener, CD4 spezifischer, immunologischer Reagenzien zur Erkennung der zwei Formen des Proteins wurde verglichen. Ein polyclonales Kaninchen-Serum, hergestellt durch Immunisierung mit gereinigtem ST4.2, erkannte sowohl native als auch denaturierte Formen von CD4; OKT4A, von dem bekannt ist, dass es ein Konformations-Epitop erkennt, reagierte deutlich mit nativem CD4, reagierte jedoch nicht mit dem Protein, das denaturiert worden war. Der monoclonale Antikörper 25-10-F5 zeigte ein Reaktionsmuster, welches dem von OKT4A ähnlich war.
Herstellungen von gereinigtem ST4.2 wurden bei -80ºC und 4ºC gelagert und periodisch auf (1) Immunreaktivität mit dem polyclonalen Kaninchen-Antiserum, das sowohl natives als auch denaturiertes CD4 erkennt, (2) Erkennung durch OKT4A und 25-10-F5, welche nur mit nativem CD4 reagieren, sowie (3) gp120-Bindung getestet. Ein signifikanter Aktivitätsverlust, der durch die monoclonalen Antikörper OKT4A und 25-10-F5 sowie die gp120-Bindung festgestellt wurde, wurde bei Lagerung bei 4ºC beobachtet. Das Material, das bei -80ºC gelagert wurde, behielt jedoch seine volle Aktivität. Zusätzlich wurde auch bemerkt, dass gereinigtes ST4.2 bei wiederholtem Einfrieren und Auftauen an Aktivität verliert.

Beispiel 6

Ein Immunisierungsversuch wurde durchgeführt, um die Herstellung neutralisierender Antikörper unter Verwendung einer gp120-Zusammensetzung der Erfindung, die die Konformation bewahrt hat, mit anderen gp120-Molekülen zu vergleichen, von welchen bekannt ist, dass ihre Konformation modifiziert wurde. Ein gp120-Analogon (env 2-3), hergestellt in Hefe, welches denaturiert und nicht-glycosyliert ist, wurde als Vergleichsantigen verwendet. Beide gp120-Substanzen wurden von derselben Genquelle, dem HIV-1 SF-2-Isolat, abgleitet. Die Antikörperherstellung wurde bei Pavianen unter Verwendung des in Tabelle 2 gezeigten Immunisierungsschemas gemessen. TABELLE 2
Immunogene wurden auf die folgende Weise hergestellt:
(1) Gruppe 1 und 2: Setze einem Teil Antigen (gp120 oder env 2-3) zwei Teile unvollständiges Freundsches Adjuvans (ICFA) zu, mische mit einer Spritze und injiziere 500 ml pro Tier.
(2) Gruppe 3 und 4: Erwärme ein Fläschchen mit Antigen/MTP-PE-Adjuvans auf Raumtemperatur, verwirble es eine Minute lang und injiziere 500 ml pro Tier innerhalb von 30 Minuten (mische erneut bei Bedarf).
(3) Gruppe 5 und 6: Erwärme ein Fläschchen mit Antigen/Alaun auf Raumtemperatur, verwirble es eine Minute lang und injiziere 500 ml pro Tier innerhalb von 30 Minuten (mische erneut bei Bedarf).
Die Immunisierung erfolgte zu Anfang des Versuchs und in der 4., 8., 12. und 20. Woche nach Versuchsbeginn. Blutproben wurden am Versuchsbeginn (Prä-Blutprobe) genommen sowie zu den Zeiten, die in den Tabellen (nachstehend) beschrieben sind, welche die Ergebnisse darstellen.
Die Ergebnisse sind in den beigefügten Tabellen 3 und 4 zusammengefasst. Die mit env 2-3 immunisierten Tiere zeigen neutralisierende Aktivität gegen das homologe Isolat HIV-SF-2 in allen Adjuvans-erhaltenden Gruppen und in einer Adjuvans-erhaltenden Gruppe (IFA-MTP) Neutralisation gegen HIV-MN (3 von 7 Tieren insgesamt). Es gibt ein Tier, das nachweisbare Neutralisation gegen HIV-HTLV-IIIB mit diesem Antigen zeigt.
Dagegen zeigen alle der mit gp120 immunisierten Tiere in allen drei Adjuvans- erhaltenden Gruppen gegen HIV-SF2 und HIV-MN neutralisierende Aktivität, sowohl nach vier als auch nach fünf Immunisierungen. Sechs von acht mit gp120 immunisierten Tieren haben auch signifikante neutralisierende Aktivität gegen HIV-HTLBIIIB, und die Tiere sind aus allen drei Adjuvans-erhaltenden Gruppen. TABELLE 3 Neutralisationstiter von Pavianen, die mit Env 2-3 (SF2) immunisiert sind
a. Neutralisationsversuche wurden wie folgt durchgeführt: Virusstammlösungen wurden auf Syncytien-erzeugende Einheiten (SFU) auf CEM- SS-Zellen titriert. Zu testende Seren wurden Hitze-inaktiviert, 2-fach in Reihe verdünnt und mit 200 SFU eine Stunde bei 37ºC vermischt, und dann 1 Stunde auf CEM-SS-Zellen, die mit Poly-L-Lysin an Mikro-Vertiefungen angeheftet waren, pipettiert. Virus-Serum-Gemische wurden dann entfernt und die Zellen mit Medium versetzt. Die Syncytien-Erzeugung wurde 5 Tage nach der Infektion bewertet. Die Neutralisation wurde durch Berechnung von Vn (# der in den Testvertiefungen erzeugten Syncytien), dividiert durch Vo (# der Syncytien in Vertiefungen nur mit Viren), für jede Verdünnung von Testseren bewertet, und Vn/Vo wurde als eine Funktion der Serumverdünnung dargestellt. Die berichteten Titef sind die Umkehrzahl zu der Verdünnung, die Vn/Vo < 0,1 ergab (> 90% Neutralisation)
b. Blutprobe 5 ist bei 10 Wochen, zwei Wochen nach der dritten Immunisierung
c. Blutprobe 7 ist bei 14 Wochen, zwei Wochen nach der vierten Immunisierung
d. Blutprobe 12 ist bei 23 Wochen, drei Wachen nach der fünften Immunisierung
e. nt, nicht getestet
f. Adjuvans 1 = IFA (unvollständiges Freundsches Adjuvans) + 250 mg MTP-PE
Adjuvans 2 = MF101 (250 mg MTP-PE)
Adjuvans 3 = Alaun TABELLE 4 Neutralisationstiter von Pavianen, die mit gp120 (SF2) immunisiert sind
a. Neutralisationsversuche wurden wie in Tabelle 1 beschrieben durchgeführt
b. Blut 5 ist bei 10 Wochen, zwei Wochen nach der dritten Immunisierung
c. Blut 7 ist bei 14 Wochen, zwei Wochen nach der vierten Immunisierung
d. Blut 12 ist bei 23 Wochen, drei Wochen nach der fünften Immunisierung.
e. Adjuvantien waren wie in Tabelle 1 beschrieben
Junge adulte (männliche/weibliche) Paviane (Papio) wurden mit 55 mg gp120, das in einem von zwei Adjuvantien formuliert war, immunisiert: Aluminiumhydroxid (Alaun, 0,8 mg pro Dosis); oder unvollständiges Freundsches Adjuvans plus 250 mg Muramyltripeptid (IFA-MTP). Die Tiere wurden etwa alle vier Wochen immunisiert, und die Seren wurden auf den Verlust von hüll-spezifischem Titer überwacht. Die Zusammenfassung der Daten für die antigenspezifische Antwort ist in den Tabellen 5 und 6 für jedes Tier in der Studie gezeigt. Hüll-spezifische Titer zeigten nach jeder Auffrischung einen Peak und gingen dann zurück. Es ist zu bemerken, dass die Alaun- und IFA-MTP-Titer etwa um das zehnfache voneinander abweichen. Basis-Titer wurden nach sechs Monaten Pause erreicht, und die Tiere erhielten dann in monatlichen Abständen erneut eine Auffrischung. Um die Effektivität der Hüll-Antikörper bei der Virusneutralisation zu messen, wurden die Seren in Neutralisationstests in vitro sowohl gegen homologes HIV-SF2 als auch gegen heterologe Virusisolate getestet. Die Seren wurden zu Zeitpunkten mit bekannten hohen Hüll-Titern auf Virusneutralisation in der Woche 10 (nach 3 Immunisierungen), 23 (nach 5 Immunisierungen) vor der Pause und in der Woche 57 (nach 6 Immunisierungen) nach der Auffrischung, die der Pause folgte, getestet. Zwei Virusneutralisationstests wurden verwendet, ein p24gag- Inhibierungstest, beschrieben in Haigwood et al AIDS Res. Hum. Retrov. (1990) 6; 855-869 und Steimer et al., Vaccine (1988), H. Gimsberg et al., Herausgeber, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 347-355, und ein Infektionszentrum-Inhibierungstest von Nara et al., AIDS Res. Hum. Retrov. (1987) 3: 283-302. Wie in Tabelle 5 veranschaulicht, wurden neutralisierende Antikörper, die gegen HIV-SF2 und HIV-MN effektiv sind, in beiden Adjuvans-erhaltenden Gruppen nach nur drei Immunisierungen erzeugt, und die Titer wurden mit weiteren Auffrischungen aufrechterhalten oder vermehrt. In Tabelle 6 wurden HIV-BRU- und HIV-HTLVIIIB-spezifische neutralisierende Antikörper nach fünf und sechs Immunisierungen reproduzierbar beobachtet; nach sechs Immunisierungen wurden keine Titer gegen HIV-ZR6 beobachtet. Insgesamt waren sowohl die homologen SF2- als auch die heterologen neutralisierenden Titer in den Tieren mit IFA-MTP höher als in der Tieren mit Alaun. TABELLE 5 Neutralisationstiter von immunisierten Pavianen
a. Test wurde durch das Verfahren von Steimer et al., 1988 durchgeführt. Die Titer sind der reziproke Wert der stärksten Verdünnung, um > 50% Hemmung der p25gag-Herstellung zu erhalten.
b. Test wurde durch das Verfahren von Nara et al., 1987 durchgeführt. Die Titer sind der reziproke Wert der stärksten Verdünnung, um > 90% Hemmung der Infektionszentren zu erhalten.
c. Blutprobe 5 ist bei 10 Wochen, zwei Wochen nach der dritten Immunisierung
d. Blutprobe 12 ist bei 23 Wochen, zwei Wochen nach der fünften Immunisierung
e. Blutprobe 22 ist bei 57 Wochen, zwei Wochen nach, der sechsten Immunisierung
f. nt = nicht getestet
f. Adjuvans 1 = IFA (unvollständiges Freundsches Adjuvans) + 250 mg MTP-PE Adjuvans 2 = Alaun
h. - zeigt < 10 für Test A; < 4 für Test B an TABELLE 6 Neutralisationstiter von Pavianen, die mit gp120 immunisiert waren
a. Test wurde durch das Verfahren von Steimer et al., 1988 durchgeführt. Die Titer sind der reziproke Wert der stärksten Verdünnung um > 50% Hemmung der p25gag-Herstellung zu erhalten.
b. Test wurde durch das Verfahren von Nara et al., 1987 durchgeführt. Die Toter sind der reziproke Wert der stärksten Verdünnung um > 90% Hemmung der Infektionszentren zu erhalten.
c. -- zeigt < 10 für Test A; < 4 für Test B an
d. Blutprobe 5 ist bei 10 Wochen, zwei Wochen nach der dritten Immunisierung
e. Blutprobe 12 ist bei 23 Wochen, zwei Wochen nach der fünften Immunisierung
f. Blutprobe 22 ist bei 57 Wochen, zwei Wochen nach der sechsten Immunisierung
g. Adjuvantien waren, wie in Tabelle 5 beschrieben.
Serum, das von dem nach sechs Immunisierungen am stärksten antwortenden, mit gp120 immunisierten Pavian gewonnen wurde, wurde weiter auf die Fähigkeit getestet, die zusätzlichen Virus-Isolate HIV-SF2, HIV-MN, HIV-RF, HIV-CC, HIV-ZR6 und HIV-NDK (Tabelle 7a) zu neutralisieren. Es ist zu bemerken, dass die HIV- SF2-Neutralisationstiter durch den p24gag-Inhibierungstest bestimmt wurden, wohingegen die HIV-MN-Neutralisation durch das Infektions-Zentrum-Protokoll von Nara et al. getestet wurde. Deshalb kann der beträchtliche Unterschied in der Neutralisation dieser beiden Isolate teilweise den zwei verschiedenen Tests, die verwendet wurden, zugeschrieben werden.
Diese Daten zeigen, dass das gp120-Protein, das eine stoffliche Konformation beibehält, bei der Herstellung von kreuzneutralisierenden Antikörpern erfolgreicher ist als Formen, die ihre natürliche Konformation nicht beibehalten.

Beispiel 7

Wiederholte Immunisierung der IFA-MTP-Gruppe von Pavianen wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob zusätzliches wiederholtes Aussetzen von rekombinantem, nativem, glycosyliertem gp120 Antikörper ergeben könnte, die bei der Neutralisation eines noch breiteren Kreises von Isolaten effektiv sein könnten. Wiederholte Immunisierung veränderte die Titer neutralisierender Antikörper gegen HIV-SF2, HIV-MN, HIV-RF oder HIV-CC nicht drastisch. Wiederholte Immunisierung resultierte jedoch im Auftreten von niedrigen Titern von neutralisierenden Antikörpern gegen Afrikanische Isolate, HIV-ZR6 und HIV-NDK (Tabelle 7b). Die temporäre Entwicklung der HIV-ZR6-Neutralisation wurde durch Auftragen der Daten der Virusneutralisation (Fig. 5) von Serum vom Pavian 2ß64, das nach 0, 5, 6, 7, 8, und 9 Immunisierungen mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem gp120 analysiert worden war, untersucht.
Die Neutralisation wurde durch Bestimmen der Anzahl an Syncytien-erzeugenden Einheiten pro ml (sfu/ml) in Vertiefungen, die Versuchsseren enthielten (Vn, Durchschnitt an doppelten Vertiefungen), und Dividieren dieser Zahl durch den sfu/ml-Virus allein (Vo, Durchschnitt von 8 Replica-Vertiefungen) bewertet. Diese Fraktion, Vn/Vo, wurde gegen die Verdünnung der Serumprobe aufgetragen, und die Neutralisation wurde durch Notieren der Serumverdünnung, die eine 90% Reduktion an Vn erlaubte, bewertet, d. h. Vn/Vo = 0,1. Die Proben werden durch den Schlüssel auf der rechten Seite angezeigt, wobei die Nummern Blutproben entsprechen. Blutprobe 0 ist die Prä-Blutprobe, die keine Virusneutralisation zeigt. Blutprobe 12 folgt auf 5 Immunisierungen; Blutprobe 22 folgt auf 6 Immunisierungen; Blutprobe 24 folgt auf 7 Immunisierungen; Blutprobe 27 folgt auf 8 Immunisierungen; Blutprobe 22 folgt auf 9 Immunisierungen.
Wie aus Fig. 5 hervorgeht, verschoben wiederholte Auffrischungen den Verlauf der Neutralisationskurve, so dass die Neutralisation in Blutprobe 32 nach 9 Immunisierungen nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse zeigten, dass wiederholte Auffrischungen auf Antikörper produzierende Clone selektierte, die eine breitere Spezifität haben. Tabelle 7a
a. Die Blutproben 22 und 24 wurden an anderen Tagen als die Blutproben 27 und 32 getestet.
b. Die Blutproben 24, 27, und 32 wurden gleichzeitig getestet; Blutprobe 22 wurde an einem anderen Tag getestet.
c. -- zeigt < 10 für Test A; < 4 für Test B an.
d. nt = nicht getestet.
e. Blutprobe 22 ist bei 57 Wochen, zwei Wochen nach der sechsten Immunisierung.
f. Blutprobe 24 ist bei 61 Wochen, zwei Wochen nach der siebten Immunisierung.
g. Blutprobe 27 ist bei 67 Wochen, zwei Wochen nach der achten Immunisierung.
h. Blutprobe 32 ist bei 84 Wochen, zwei Wochen nach der neunten Immunisierung.

Beispiel 8

Die Analyse aller Serumproben von zwei einzelnen Pavianen, 2964 und 2958, skizzierte weitere Unterschiede bei Tieren, die mit rekombinantem, denaturiertem, nicht- glycosyliertem Protein und mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem (rpg120) immunisiert wurden (Fig. 6). Pavian 2964 wurde mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem Protein geimpft, und Pavian 2958 wurde mit rekombinantem, denaturiertem, nicht-glycosyliertem Protein geimpft. Die HIV-SF2-Neutralisation wurde durch den p25gag- Inhibierungstest, beschrieben in Haigwood et al AIDS: Res. And Hum. Retrov. (1990) 6: 855-869 getestet. Alle anderen Isolate wurden durch den Infektions-Zentrum- Inhibierungstest getestet. Serum von jeder Blutprobe wurde gegen HIV-SF2, HIV-MN und HIV-HTLVIIIB auf Virusneutralisationsaktivität getestet. Weitere Auffrischungen mit denaturiertem, nicht-glycosyliertem Protein ließ die Antikörper- oder Neutralisationstiter nicht über die Werte, die in der 10. Woche gemessen wurden, ansteigen, und es gab keine nachweisbare Neutralisation von HIV-HTLVIIIB. Bei dem Tier, das mit rgp120 immunisiert war, stiegen die HIV-SF2, HIV-MN und HIV-HTLVIIIB-Titer nach jeder Auffrischung an, wobei die stärkste Zunahme nach der Pause beobachtet wurde. Die Muster der Neutralisationsaktivität waren für alle drei Viren ähnlich, obwohl die Stärke der Antwort unterschiedlich war. Das Auftreten der HIV-HTLVIIIB-Neutralisation war im Vergleich mit den anderen beiden Isolaten verspätet. In zusätzlichen Versuchen an Pavianen, die nachstehend im Beispiel 9 diskutiert werden, haben wir gezeigt, dass rekombinantes, denaturiertes, nicht-glycosyliertes Protein, formuliert in MF59, nicht in der Lage war, eine Neutralisation von HIV-MN oder HIV-BRU-neutralisierender Aktivität zu induzieren (Daten nicht gezeigt); gp120-Seren neutralisierten diese drei Isolate genauso gut wie HIV-ZR6 nach wiederholten Auffrischungen (Tabelle 8).
Fig. 6 ist eine Reihe von Graphiken, die Neutralisationstiter aller Serumproben von Pavian 2958, immunisiert mit denaturiertem, nicht-glycosyliertem gp120 und Pavian 2964, immunisiert mit nativem, glycosyliertem gp120, zeigen. Die Immunisierung dieser Tiere ist in Beispiel 6 beschrieben.

Beispiel 9

Die Paviane wurden mit 55 mg gp120 immunisiert, das entweder mit mikrofluidisierter Emulsion, die Muramyltripeptid-Phosphatidyl-Ethanolamin, 100 mg (MF59), enthielt, oder unvollständigem Freundschem Adjuvans (IFA) formuliert war. Die Formulierung von MF59 war 5% Squalen, 0,5% Tween-80, 0,5% Span-85 mit endogenem MTP-PE zu 0,4 mg/ml in Wasser, die mit einem Mikrofluidizer emulgiert war und unter Argon bis zur Verwendung gelagert wurde. Dann wurde es mit Antigen unter Schütteln vermischt und injiziert. Daten, die die antigenspezifischen Antworten für die Paviane zusammenfassen, sind in Tabelle 8 gezeigt.
Gp 120-spezifische Titer zeigten nach jeder Auffrischung in dieser Untersuchung ebenfalls einen Peak und gingen dann zurück. Höhere Titer wurden mit MF59 und nicht mit IFA erreicht. Virusneutralisation wurde gegen homologe und heterologe Isolate getestet und wurde in den Wochen 10, 24 und 38 nach drei, vier beziehungsweise 5 Immunisierungen bestimmt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 8 zusammengefasst. In dieser Studie hatten Tiere in der MF59-Gruppe höhere Titer und einen höheren Anteil an positiven Tieren in der Gruppe als die IFA-Gruppe. Neutralisierende Titer, die gegen HIV-SF2 und HIV-MN effektiv waren, wurden nach drei Immunisierungen und gegen HIV-HTLVIIIB und HIV-ZR6 nach fünf Immunisierungen beobachtet. Die Tiere, die mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem gp120 in MF59 immunisiert waren, reagierten mit Antikörpern, die nach nur fünf Immunisierungen bei der Neutralisation von HIV-BRU und HIV-ZR6 effektiv waren. In einer vorherigen Studie wurde die Neutralisation von afrikanischen Isolaten nach nur acht (HIV-NDK) oder neun (HIV-ZRC) Immunisierungen erreicht. Zusätzlich waren die Titer höher, die in Beispiel 9 mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem gp120 mit MF59 als Adjuvans gegen HIV-ZR6 erreicht wurden. Auch war das Auftreten von neutralisierenden Antikörpern, die gegen HIV-BRU und HIV-ZR6 effektiv waren, in dieser Studie simultan, im Gegensatz zu Beispiel 6, das vorstehend beschrieben ist. Dieses Ergebnis könnte dem Adjuvans oder dem Dosierungszeitplan der Immunisierungen zugeschrieben werden, die im Beispiel 9 zwei kürzere Pausenzeiträume zuließ, verglichen mit einem einzigen langen Pausenzeitraum in Beispiel 6. Tabelle 8 Neutralisationstiter immunisierter Paviane
a. Test wurde durch das Verfahren von Steimer et al., 1988 durchgeführt. Die Titer sind der reziproke Wert der stärksten Verdünnung, um > 50% Hemmung der p25gag-Herstellung zu erhalten.
b. Test wurde durch das Verfahren von Nara et al., 1987 durchgeführt. Die Titer sind der reziproke Wert der stärksten Verdünnung, um > 90% Hemmung der Infektionszentren zu erhalten.
c. nt = nicht getestet
d. -- zeigt < 10 für Test A; < 4 für Test B an.
e. Blutprobe 5 ist bei 10 Wochen, zwei Wochen nach der dritten Immunisierung
f. Blutprobe 12 ist bei 24 Wochen, zwei Wochen nach der vierten Immunisierung
g. Blutprobe 14 ist bei 38 Wochen, drei Wochen nach der fünften Immunisierung
h. Adjuvans 1 = IFA (Unvollständiges Freundsches Adjuvans) + 250 mg MTP-PE Adjuvans 2 = MF59 (100 mg MTP-PE)

Beispiel 10

In den folgenden Verfahren, die den vorstehend beschriebenen für Paviane ähneln, wurden vier Schimpansen (Pan troglodytes) mit 55 mg gp120 mit 2XMF59 als Adjuvans (2 Tiere), Adjuvans allein (1 Tier) immunisiert oder wurden nicht immunisiert (1 Tier), um die Immunogenität des Proteins bei dieser Primatenart, dem nächsten lebenden Verwandten des Menschen, zu bestimmen. Der experimentelle Dosierungszeitplan wird in Fig. 7 gezeigt. In Fig. 7 stellen die schattierten Balken Zeitlinien (Immunisierungsschemata) für jede der drei Studien dar: Paviane von Beispiel 6 (oberste Linie), Paviane von Beispiel 9 (mittlere Linie) und Schimpansen von Beispiel 10 (untere Linie). Eine Zeitskala in Wochen ist am unteren Ende der Figur gezeigt. Immunisierungen werden durch vertikale Balken, die oberhalb nummeriert sind, um die Immunisierungsnummer an der Stelle in der Zeitlinie der Auffrischung anzuzeigen, angezeigt. Die Paviane in Beispiel 6 wurden in den Wochen 0, 4, 8, 12, 21, 55, 59, 65 und 80 immunisiert, mit der Ausnähme von Pavian. 2964, der in Woche 82 an Stelle von Woche 80 immunisiert wurde. Die Paviane in Beispiel 9 wurden in den Wochen 0, 4, 8, 22 und 36 immunisiert. Die Schimpansen wurden in den Wochen 0, 4, 8 und 28 immunisiert. Die Formulierung von 2XMF59 war 10% Squalen, 1% Tween-80, 1% Span-85 mit endogenem MTP-PE zu 0,4 mg/ml in Wasser, welche mit einem Mikrofluidizer emulgiert wurde und unter Argon bis zur Verwendung gelagert wurde; es wurde dann mit Antigen durch Schütteln vermischt und injiziert. Die Tiere wurden in monatlichen Intervallen dreimal intramuskulär immunisiert, und die Seren wurden auf hüll-spezifische Titer und auf virusneutralisierende Antikörper bei den Blutproben, die jeder Immunisierung folgten, analysiert. Die Daten sind in Tabelle 9 für die beiden Schimpansen, die mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem Protein immunisiert wurden, zusammengefasst. Keiner der anderen Kontroll-Schimpansen entwickelte gp120-spezifische Antikörper oder neutralisierende Antikörper (Daten nicht gezeigt). Beide Tiere, die mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem Protein immunisiert wurden, entwickelten gute Antworten auf das immunisierende Antigen, und beide Tiere besitzen virusneutralisierende Antikörper, die gegen HIV-SF2 und HIV-MN effektiv sind. Serum von einem der Schimpansen neutralisierte ebenfalls HIV-HTLVIIIB nach drei Immunisierungen. Die Schimpansen erhielten nach einer Pausenzeit von sechs Monaten Auffrischungsimpfungen, und die Seren würden nach dieser Immunisierung analysiert. Sind die Virusneutralisationstiter gegen HIV-SF2 ausreichend hoch, so erhalten die Tiere eine Challenge aus einer titrierten Stammlösung von HIV-SF2 von Schimpansen. Die Schimpansen werden zwei Wochen vor der Challenge erneut immunisiert.
Im Falle der Existenz neutralisierender Antikörper, die gegen heterologe Isolate effektiv sind, existiert auch die Möglichkeit einer heterologen Viruschallenge in denselben Tieren. Tabelle 9 Neulralisationstiter von Schimpansen, die mit 2X MF-59 immunisiert wurden
a. Test A wurde durch das Verfahren von Steimer et al., 1988 durchgeführt.
b. Test B wurde durch das Verfahren von Nara et al., 1987 durchgeführt.
c. -- zeigt < 10 für Test A; < 2 für Test B an.
d. nt = nicht getestet
Da die Erfindung nun vollständig beschrieben ist, wird es für den Fachmann offenkundig sein, dass dazu viele Veränderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne dass man von dem Geist oder dem Umfang der angehängten Ansprüche abkommt.

Hinterlegung Biologischen Materials

Die folgenden beispielhaften Materialien wurden am 7. November 1990 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, hinterlegt, und, wie angezeigt, bezeichnet. Diese Hinterlegungen werden unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren aufrechterhalten.
Diese Hinterlegungen werden nur zum Vorteil des Fachmannes bereitgestellt und sind kein Zugeständnis dafür, dass eine Hinterlegung unter 35 U.S.C. 112 erforderlich ist. Die Nucleinsäuresequenzen dieser Plasmide sowie die Aminosäuresequenzen der davon codierten Polypeptide sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen und dienen im Fall eines Konflikts mit der Beschreibung hierin als Kontrolle. Es kann eine Lizenz verlangt werden, die hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, aber eine solche Lizenz wird dadurch nicht gewährleistet.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung des HIV-Glycoproteins gp120 aus einem gp120 enthaltenden Medienüberstand, bestehend aus den Schritten:

(1) Konzentrieren des Medienüberstands unter Verwendung einer "Dead end"-Filtration und Querstrom-Ultrafiltration bei 2 bis 8ºC;

(2) Einstellen der Leitfähigkeit des Ultrafiltration-Konzentrats auf 1,4 mS durch Zugabe von Natriumchlorid;

(3) Aufbringen des Konzentrats auf eine äquilibrierte DEAE-Sephadex A-50-Ionenaustauschersäule bei Raumtemperatur;

(4) Einstellen der nicht adsorbierten Fraktion auf 40% Sättigung mit Ammoniumsulfat;

(5) Entfernen des Präzipitats durch Zentrifugation;

(6) Aufbringen des Überstandes auf eine äquilibrierte TSK-Phenyl-5PW- HIC-Säule;

(7) Eluieren der Säule;

(8) Einstellen der gp120 enthaltenden Fraktionen auf eine Leitfähigkeit von 1655/cm durch Zugabe von Ammoniumsulfat, gefolgt von Zentrifugation;

(9) Aufbringen des Überstandes auf eine äquilibrierte TSK-Ether-5PW- HIC-Säule;

(10) Eluieren der Säule;

(11) Konzentrieren durch Ultrafiltration;

(12) Diafiltration gegen mindestens 5 Volumina 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,9;

(13) Aufbringen auf eine Superdex 200-Geffiltrationsäule bei einer Gesamtproteinkonzentration von nicht mehr als 10 mg/ml in einem Volumen von nicht mehr als 4% des Säulenvolumens;

(14) Eluieren mit 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,9;

(15) Konzentrieren durch Ultrafiltration; und

(16) Diafiltration gegen 5 Volumina destilliertes Wasser.

2. gp120-Zusammensetzung, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 1.

3. gp120-Zusammensetzung nach Anspruch 2 zur Verwendung in der Therapie, Diagnose oder Chirurgie.

4. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung oder Vorbeugung einer HIV-Infektion.