DE3789400T2 - Für ein Glykoprotein des AIDS-Virus kodierende Virus-Vektoren, Vakzin und Antikörper. - Google Patents
Für ein Glykoprotein des AIDS-Virus kodierende Virus-Vektoren, Vakzin und Antikörper.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf einen Impfstoff zur Verhinderung von AIDS.
- Bei dem erworbenen Immundefekt-Syndrom (AIDS) handelt es sich um eine Virus-Infektion, die eine große Rolle spielt in Nordamerika, in Europa und in Zentralafrika.
- Die jüngsten Schätzungen lassen vermuten, daß etwa eine Million Amerikaner mit dem AIDS-Virus infiziert sind. Die erkrankten Individuen weisen eine schwere Immundepression auf und die Krankheit ist im allgemeinen tödlich.
- Die Übertragung der Krankheit erfolgt meistens durch Sexualkontakt, obgleich auch Personen, die Rauschgifte auf intravenösem Wege einnehmen, eine Gruppe mit hohem Risiko darstellen; andererseits wurde eine große Anzahl von Individuen mit diesem Virus infiziert durch Verabreichung von kontaminiertem Blut oder Blutprodukten.
- Das Agens, das diese Erkrankung hervorruft, ist ein Retrovirus. Es wurden bereits zahlreiche tierische Erkrankungen den Retroviren zugeschrieben, aber erst seit kurzem konnten Retroviren beschrieben werden, die Erkrankungen bei Menschen hervorrufen.
- Während Retroviren der Human-T-Zellen (HTLV:Human-T- Leukämie-Virus) der Typen I und II als Agens erkannt wurden, das bestimmte Leukämien der T-Zellen bei Erwachsenen hervorruft, wird das Retrovirus, das mit Lymphadenopathien in Verbindung gebracht wird (das LAV-Virus), das auch als Virus HTLV III oder AIDS-verwandtes Virus (ARV) bezeichnet wird, derzeit allgemein als Agens angesehen, das für AIDS verantwortlich ist.
- Das Genom des Retrovirus LAV wurde bereits sehr vollständig charakterisiert (Wain-Hobson et al., 1985; Ratner et al., 1985; Muesing et al., 1985; Sanchez-Pescador et al., 1985) und Informationen über die Sequenz weisen auf eine enge Beziehung zu der Gruppe der Lentiviren hin. Die Lentiviren, deren Prototyp das Schaf-Virus Visna ist, sind Krankheitserreger die sich nur sehr langsam entwickeln und die in der Regel eine lange Inkubationszeit aufweisen. Das LAV und das Visna-Virus weisen zahlreiche Ähnlichkeiten auf, insbesondere in ihrem Tropismus für das Neuralgewebe.
- Analog zu anderen bekannten Retroviren werden die drei wichtigsten Abschnitte des Genoms des LAV bezeichnet als qaq, pol und env. Die Sequenz des Gens env, das die Sequenz von gp120 und gp41 umfaßt, hat Eigenschaften, die für ein Transmembran-Hüllenglycoprotein erwartet worden waren, und die Identität des Vorläufers des Proteins env, gp160, das besteht aus gp120 und gp41, wurde durch eine direkte Sequenzierung der Aminosäuren bestätigt.
- Nachstehend wird das gp41 gelegentlich als gp40 oder gp42 bezeichnet.
- Antikörper, die gegen das env-Protein gp160 und seine Spaltungsprodukte gp120 und gp41 gerichtet sind, sind gemeinsam nachzuweisen in dem Serum von Patienten, die AIDS haben, und das Glycoprotein env repräsentiert das Antigen der Hauptoberfläche des AIDS-Virus.
- Das Protein env ist daher der vielversprechendste Kandidat für die Entwicklung einer Impfstrategie, weshalb sich die Aufmerksamkeit auf dieses Protein und auf seine codierende Sequenz konzentriert hat.
- Eine große Anzahl von Gruppen berichtet über die Expression des Proteins env in Bakterien. Das Fehlen einer Glycosylierung und einer Posttranslations-Strukturierung können jedoch das Immunogenisierungs-Vermögen von durch solche Mikroorganismen synthetisierten Materialien beeinträchtigen.
- Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen, als Expressionsvektor für das Protein env einen Virus-Vektor zu verwenden, der die Expression des Proteins in eine Umgebung erlaubt, die seine Glycosylierung und seine posttranslatorische Restrukturierung erlaubt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft daher einen Virus- Vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er einen Teil oder das gesamte Gen env des für AIDS verantwortlichen Virus enthält.
- Unter den verwendbaren Virus-Vektoren müssen insbesondere genannt werden die Pockenviren (Poxviren) und speziell das Vakzine-Virus (Kuhpocken-Virus) (VV).
- Das Vakzine-Virus ist ein Virus mit Doppelstrang-DNA, das in sehr großem Umfange auf der gesamten Welt eingesetzt wird zur Bekämpfung und Ausrottung der Pocken. Jüngere technische Entwicklungen erlaubten die Entwicklung dieses Virus als Klonierungs-Vektor und lebende rekombinante Viren erlaubten die Expression von fremden Antigenen und sogar die Erzielung von Immunisierungen gegen verschiedene Virus- und Parasiten-Erkrankungen.
- So haben vor kurzem mehrere Gruppen die Verwendung von Rekombinanten dieses Typs zur Expression des Influenza-Antigens, des Hepatitis B-Antigens und des Tollwuterreger-Glycoproteins vorgeschlagen, um eine Immunisierung gegen diese Erkrankungen zu erzielen (Smith et al., 1983; Panicali et al., 1983; Kieny et al., 1984).
- Die Expression einer für ein fremdes Protein codierenden Sequenz durch das Vakzine-Virus (VV) umfaßt notwendigerweise zwei Stufen:
- 1) die codierende Sequenz muß ausgerichtet sein (angepaßt sein) auf einen Promotor von VV und in ein nicht-essentielles Segment der DNA von VV inseriert sein, die in einem geeigneten Bakterien-Plasmid kloniert ist;
- 2) die DNA-Sequenzen von VV, die beiderseits der codierenden Sequenz angeordnet sind, müssen homologe Rekombinationen in vivo zwischen dem Plasmid und dem Virus-Genom erlauben; eine reziproke doppelte Rekombination führt zu einer Übertragung des DNA-Inserts des Plasmids in das Virus-Genom, in dem es verbreitet und exprimiert wird (Panicali und Paoletti, 1982; Mackett et al., 1982; Smith et al., 1983; Panicali et al., 1983).
- Die Verwendung dieses Vektor-Typs bringt selbstverständlich häufig eine partielle Deletion des Genoms des Virus-Vektors mit sich.
- Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen Virus-Vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er mindestens umfaßt:
- - einen Teil des Genoms eines Virus-Vektors,
- - ein Gen, das für eines der Glycoproteine (gp) der Hülle des für AIDS verantwortlichen Virus codiert,
- - sowie die Elemente, welche die Expression dieses Glycoproteins in Zellen gewährleisten.
- Die Erfindung betrifft außerdem die rekombinanten DNA, die den genannten Virus-Vektoren entsprechen.
- Es sei darauf hingewiesen, daß die Glycoproteine (gp) der Hülle des für AIDS verantwortlichen Virus drei an der Zahl sind, die durch ihre Masse in kDA bezeichnet werden, d. h. es handelt sich dabei um das gp160, das gp120 und das gp41; das erste, das gp160, ist nämlich der Vorläufer der beiden zuletzt genannten Proteine. Diese Bezeichnungen sind noch nicht allgemein anerkannt und das gp41 wird manchmal als gp40 oder gp42 bezeichnet, die unterschiedlichen Massen machen diese drei Glycoproteine jedoch vollständig identifizierbar, unabhängig von ihrer Bezeichnung.
- Unter dem für AIDS verantwortlichen Virus ist insbesondere zu verstehen das Virus LAV, das Virus HTLV III oder ARV sowie eventuelle punktuelle Mutanten oder partielle Deletionen dieser Viren und die damit verwandten Viren.
- Die Virus-Vektoren in dem entsprechenden Abschnitt des Genoms des Virus-Vektors (der von dem für AIDS verantwortlichen Virus verschieden ist), können hergestellt werden aus dem Genom eines Virus beliebigen Ursprungs. Man bevorzugt jedoch die Verwendung eines Teils des Genoms eines Pockenvirus und insbesondere eines Teils des Vakzine- Genoms.
- Die Bedingungen, die erforderlich sind für die Expression eines heterologen Proteins in dem Vakzine-Virus sind vorstehend angegeben.
- Allgemein muß das fragliche Gen, beispielsweise das Gen env, um exprimiert werden zu können, unter der Abhängigkeit eines Promotors eines Vakzine-Gens stehen, wobei dieser Promotor im allgemeinen der Promotor des Proteins 7,5 K des Vakzins ist. Außerdem muß die codierende Sequenz in ein nicht-essentielles Gen des Vakzins kloniert sein, das gegebenenfalls als Marker-Gen dienen kann. In den meisten Fällen handelt es sich dabei um das Gen T.
- Unter den Glycoproteinen der Hülle, die man exprimiert haben möchte, können die drei obengenannten Proteine erwähnt werden, d. h. das gp160, das gp41 und das gp120.
- Allgemein ist es bevorzugt, daß man das vollständige Hüllengen, d. h. das Gen env, das die Signal-Sequenz und die Transmembran-Sequenz dieses Gens aufweist, sich exprimieren läßt.
- Die ersten Versuche, die mit einem Virus-Vektor durchgeführt wurden, in dem das für das Gesamtprotein env codierende Gen geklont worden war, führten dazu, Modifikationen dieses Gens vorzuschlagen, um die Immunogenizität der Expressionsprodukte zu verbessern.
- Es wurde eine beträchtliche Ausscheidung (Aussalzung) des Proteins env in den überstehenden Flüssigkeiten der Kultur festgestellt (eine Ausscheidung, die wahrscheinlich in vivo in den zirkulierenden Flüssigkeiten entsteht).
- Dies ist möglicherweise zurückzuführen auf eine schlechte Haftung des Proteins an der Zellmembran; man weiß außerdem, daß die Anwesenheit von Antigenen an der Oberfläche der Zellen sehr wichtig ist für die Induktion einer Immunantwort bei dem Vakzine-System. Es wird daher vorgeschlagen, das Gen env zu modifizieren, um die Verankerung des Glycoproteins in der Zellmembran zu verbessern.
- Um dies zu erreichen, kann das Gen env im Bereich seines für die Transmembran-Zone codierenden Abschnitts modifiziert werden, um den Codon, der einem Arginin entspricht, durch einen Codon, der einem Isoleucin entspricht, zu ersetzen.
- Es besteht auch die Möglichkeit, die Verankerung zu verbessern durch Ersatz und/oder Hinzufügung der Transmembran-Zone eines heterologen Virus, beispielsweise die Transmembran-Zone des gp des Tollwut-Virus, zu der Transmembran-Zone des Proteins env.
- Darüber hinaus kann es sein, daß das Protein nicht gut zusammengefügt ist als Folge seiner Expression. Das Signal-Peptid ist nämlich ziemlich atypisch und könnte dem vollständigen Export des Proteins schaden. Deshalb wird vorgeschlagen, zu ersetzen und/oder hinzuzufügen eine Signal-Sequenz, die aus einem heterologen Virus stammt, beispielsweise die Signal-Sequenz des gp des Tollwut-Virus.
- Schließlich scheint es, daß das gp120 eher als das gp160 durch die Zellen ausgeschieden wird. Es kann einerseits einen Köder für das Immunsystem ergeben, andererseits in Übereinstimmung mit früheren Angaben an den T4- Zellen fixiert werden, was zur Folge haben kann, daß die T4-Zellen inaktiviert werden oder daß sie gegenüber den anderen T-Zellen wie Fremdzellen erscheinen.
- Es kann daher interessant (vorteilhaft) sein, ein Protein env gp120 herzustellen, das nicht ausgeschieden werden kann. Dies wird dadurch bewirkt, daß man das Gen env zwischen den codierenden Sequenzen des gp120 und des gp41 modifiziert, um die Schnittstellen durch die Proteasen, die zwischen dem gp120 und dem gp41 angeordnet sind, zu unterdrücken, insbesondere durch die Unterdrückung der Stelle REKR.
- In den erfindungsgemäßen Plasmiden wird auch mindestens eine zusätzliche Mutation bewirkt an einer Stelle, die einer KRR-Sequenz entspricht, die 8 Aminosäuren stromabwärts von der REKR-Sequenz angeordnet ist. Das so erhaltene gp160 wird nicht mehr gespalten (geschnitten).
- Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten auch eine Sequenz, die für das gp41 codiert, das frei von der Sequenz ist, das seinem N-terminalen hydrophoben Peptid entspricht, von dem man annimmt, daß es verantwortlich sein könnte für das Syncitial-Vermögen des Proteins env, d. h. für die Fähigkeit des Virus, die Zellen miteinander zu fusionieren und eine Riesenzelle oder ein Syncitium her zustellen.
- Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Virus- Vektoren, in denen die Extracytoplasma-Bereiche und die Intracytoplasma-Bereiche des gp160 in Phase fusioniert werden nach der Deletion des hydrophoben C-terminalen Peptids, was die Erzielung einer Sekretion des Glycoproteins erlaubt.
- Allgemein enthalten die erfindungsgemäßen Virus-Vektoren eine Sequenz, die codiert für eines der folgenden Proteine:
- - S - gp120/J/gp40 - (tm) -
- worin bedeuten:
- - S ein Signal-Peptid,
- - gp120 das Glycoprotein 120,
- - J eine schematische Darstellung des Teils der Verbindung zwischen dem gp120 und dem gp40, der frei von einer Schnittstelle durch die Proteasen ist,
- - gp40 das Glycoprotein 40,
- - tm ein Transmembran-Peptid,
- oder auch für ein Protein mit der folgenden Struktur:
- oder - S - gp40 - S- gp120 - Das Signal-Peptid und die Transmembran-Sequenz können diejenigen des für AIDS verantwortlichen Virus sein oder sie können Heterologe sein, insbesondere aus dem Tollwut- Virus oder dem VSV-Virus oder irgendeinem beliebigen Virus mit Hülle stammen.
- Das gp40 kann gegebenenfalls frei von seinem hydrophoben N-terminalen Ende sein.
- Die erste Erfindung betrifft hauptsächlich die Verwendung von Virus-Vektoren zur Herstellung von Glycoproteinen, die durch das Gen env des LAV-Virus in Zellkulturen codiert sind. Es handelt sich dabei in erster Linie um Säugetierzellen, die mit einem erfindungsgemäßen Virus- Vektor infiziert worden sind, oder auch um solche, welche die entsprechende rekombinante DNA enthalten können; unter diesen Zellen können insbesondere genannt werden die menschlichen diploiden Zellen, Primärkulturen sowie die Vero- Zellen. Selbstverständlich ist es möglich, auch andere Zell-Typen zu verwenden, wie dies im übrigen aus den nachfolgenden Beispielen hervorgeht.
- Die so erhaltenen Glycoproteine können nach der Reinigung zur Herstellung von Impfstoffen verwendet werden.
- Es ist auch möglich, die direkte Verwendung der erfindungsgemäßen Virus-Vektoren vorzusehen, um eine Impfung durchzuführen, wobei die Glycoproteine dann in situ und in vivo gebildet werden.
- Es ist interessant (vorteilhaft), die kombinierte Verwendung mehrerer Impfagentien vorzusehen, die gemeinsam oder getrennt verabreicht werden, insbesondere die Impfagentien, die den Vektoren entsprechen, die getrennt das gp120 und das gp40 exprimieren, die der vorstehend beschriebenen Modifikation unterworfen worden sind. So kann es beispielsweise interessant (vorteilhaft) sein, gemeinsam die Impfagentien zu verwenden, die aus den Vektoren 1136 und 1138 stammen, die nachstehend beschrieben werden.
- Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch Antikörper, die gegen die obengenannten Glycoproteine gerichtet sind, die erhalten werden durch Infektion eines lebenden Organismus mit einem Virus-Vektor, wie er vorstehend beschrieben worden ist, und Abtrennung der induzierten Antikörper nach einer festgelegten Zeit.
- Die zur Herstellung von Glycoproteinen angewendeten Methoden, die Zellkulturen und die Impfmethoden sind identisch mit denjenigen, die derzeit mit den bekannten Impfstoffen in der Praxis angewendet werden, und sie werden nicht im Detail beschrieben.
- Die Erfindung ist nach dem Lesen der folgenden Verfahren und Beispiele besser verständlich.
- Fünf Figuren erläutern die Beispiele:
- - Die Fig. 1 zeigt die Wirkung des endo-F auf die durch die Rekombinanten VVTGeLAV9-1 und VVTGeLAV1132 synthetisierten Proteine und Immunopräzipitate aufgrund eines Anti-LAV-Serums. In dieser Figur sind die Molekulargewichte in Kilodalton angegeben und darin bedeuten:
- - P den Zellen-Bodensatz,
- - S die überstehende Flüssigkeit,
- - u die ohne Behandlung erhaltenen Produkte
- - e die nach Behandlung mit endo-F erhaltenen Produkte.
- - Die Fig. 2 zeigt das Wiedererkennen der Proteine des LAV-Virus durch die Seren von Mäusen, die mit der Rekombinanten VVTGeLAV9-1 geimpft worden sind. In dieser Figur steht T für die Fälle, in denen das verwendete Serum dasjenige eines von AIDS befallenen Patienten ist. Die Molekulargewichte sind in kDalton angegeben.
- - Die Fig. 3 zeigt die Immunopräzipitation von Proteinen, die durch die rekombinanten Vakzine-Viren, die das Gen env tragen, synthetisiert worden sind. In dieser Figur sind die Molekulargewichte in kDalton angegeben.
- - Die Fig. 4 zeigt eine Immunopräzipitation der Proteine, die durch die rekombinanten Viren VV.TG.eLAV1135, 1136, 1137 und 1138 synthetisiert worden sind.
- Das Virus 1135 synthetisiert ein gp160, das in der überstehenden Kulturflüssigkeit nicht erscheint.
- Was die Viren 1136 und 1138 angeht, so bilden sie Proteine gp120 bzw. gp40, die mit dem Zellen-Bodensatz kombiniert sind.
- Das Virus 1137 bildet ein etwas kleineres Protein als das Virus 1135 mit einem Molekulargewicht, das dem erwarteten entspricht.
- - Die Fig. 5 zeigt die Struktur der Proteine env, die durch die rekombinanten Viren synthetisiert wurden, wobei bedeuten:
- S das Signal-Peptid
- H die interne hydrophobe Zone
- TM die Transmembran-Verankerungszone
- ↑ die Schnittstelle gp120/gp40
- die Sequenz, die aus dem Tollwut-Glycoprotein stammt.
- Klonierungen: Maniatis et al, 1982.
- Enzyme: sie werden verwendet entsprechend den Vorschriften des Herstellers.
- Lokalisierte Mutagenese: Ein Verfahren, das von Zoller und Smith, 1983, stammt.
- Überführung in das Vakzin: Kieny et al., 1984 einziger Unterschied: die Human-Zellen 143B ersetzen die Zellen LMTK&supmin;.
- Die Primärzellen eines "keimfreien" Hühnchens werden 4 Tage lang bei einer Temperatur von 37ºC (in einem Medium MEM + 5% NCS) mit 0,01 pfu/Zelle infiziert.
- Man zentrifugiert das obengenannte Virus-Ausgangsmaterial 15 min lang mit 2500 UpM (Rotor GSA Sorvall). Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt. Man nimmt den Bodensatz in einem RSB-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM KCl, 1 mM MgCl&sub2;) 15 min lang bei 4ºC wieder auf. Man mahlt in einem Potter, dann zentrifugiert man 15 min lang mit 2500 UpM. Die überstehende Flüssigkeit wird der obengenannten hinzugefügt, dann führt man ein zweites Mahlen auf die gleiche Weise durch.
- Alle überstehenden Flüssigkeiten werden auf 10 ml eines 36%igen (p/v)-Saccharose-Kissens (10 mM Tris pH 8) abgeschieden. Man führt eine 2minütige Zentrifgugierung mit 14 000 UpM durch (Rotor SW28, Beckman).
- Der Bodensatz wird wieder aufgenommen, erneut dissoziiert und auf ein zweites identisches Polster aufgebracht. Der zweite Bodensatz wird in 5 ml PBS wieder aufgenommen und auf einen zweiten 20-40% Saccharose-Gradienten (10 mM Tris pH 8) aufgegeben (gleicher Rotor). Man führt eine 45minütige Zentrifugierung bei 12000 UpM durch.
- Man trennt den Streifen des Virus ab - er wird durch 1stündiges Zentrifugieren mit 20 000 UpM gesammelt. Der Bodensatz wird in 10 mM Tris, pH 8 wieder aufgenommen. Immunopräzipitationen Man führt eine Infektion von BHK-21-Zellen (Schalen mit einem Durchmesser von 3 cm, 106 Zellen pro dose, kultiviert in G-MEM + 10% FCS) mit 0,2 pfu/Zelle 18 h lang durch. Das Medium wird dekantiert und durch 1 ml Medium ohne Methionin und 10 ul Methionin³&sup5; S (Amersham) pro Schale ersetzt.
- Nach 2 h gibt man einen Überschuß von nicht-radioaktivem Methionin zu.
- Am Ende des Markierens werden die infizierten Zellen gekratzt, es wird 1 min lang in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifuiert, die überstehenden Fraktionen und der Bodensatz werden voneinander getrennt, der Bodensatz wird einmal mit dem PBS-Tampon gewaschen, dann erfolgt eine Immunopräzipitation und man erhält ein Elektrophorese-Gel (gemäß Lathe et al., 1980).
- Nach der Immunpräzipitation der Proteine, die mit einem Serum eines an AIDS erkrankten Patienten markiert worden sind, wird die Protein-A-Sepharose-Fraktion wieder aufgenommen in:
- 0,2 M Na-Phosphat, pH 6,1
- 0,05% SDS
- 0,1% Nonidet P40
- 0,1% β-Mercaptoethanol
- 0,1% EDTA pH 8
- und 5 min lang gekocht, um die Proteine zu denaturieren.
- Man führt eine 20stündige Inkubation bei 37ºC mit 4 Einheiten endo-F pro ml, dann eine 2minütige Präzipitation in Eis mit 1/5 Volumen TCA 100% durch. Man wäscht den Bodensatz 3 mal mit 80%igem Aceton, dann gibt man den Proben-Puffer zu und läßt über ein SDS-Gel laufen.
- Anwendung des ELAVIA-Tests (Pasteur-Diagnostikum) mit einem zweiten Schaf-Antimaus-Antikörper, der an die Peroxidase gebunden ist.
- 96 Loch-Platten (NUNC) mit ebenem Boden werden 18 h lang bei 37ºC mit 10&sup7; pfu des Vakzine-Virus vom Wild-Typ in einem Carbonatpuffer inkubiert. Die Platten werden anschließend mit 0,01% Gelatine gesättigt. Die Maus-Seren werden dann an den Platten adsorbiert und der Rest der Versuchsanordnung wird durchgeführt wie für ELISA-LAV. Die Ablesungen erfolgen bei 492 nM.
- Die vereinigten Größen der verschiedenen Elemente, die für den Transfer der für das Gen env codierenden Sequenz in das Genom von VV und seine anschließende Expression erforderlich sind, liegen in der Größenordnung von mehreren Kb. Es wurde als notwendig angesehen, die Größe des Replikations-Plasmids in E. coli minimal zu halten, das für die Konstruktion verwendet wurde, um die erforderlichen Manipulationen zu erleichtern.
- Das Fragment HindIII (Hin-J) des Genoms von VV enthält das vollständige Gen der Thymidin-Kinase (TK), die bereits vorher verwendet worden war, um den Austausch und die Rekombination der in das Genom von VV inserierten DNA zu erlauben (Mackett et al., 1982). Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß der Transfer eines Inserts in das Gen TK des Genoms von VV ein Defizit-Virus TK erzeugt, das selektioniert werden kann. Es war zunächst erforderlich, ein Plasmid mit einer geringen Größe herzustellen, das eine einzelne Stelle HindIII trägt, die für die Integration des Fragments Hin-J VV verwendet werden kann. Außerdem war es erforderlich, die für das Plasmid nicht erforderlichen Restruktionssequenzen zu eliminieren, um so die folgenden Manipulationen zu ermöglichen.
- Die Konstruktion wurde eingeleitet beginnend mit dem Plasmid pML2 (Lusky und Botchan, 1981), bei dem es sich um einen Vektor handelt, der von dem Plasmid pBR322 abgeleitet ist durch spontane Deletion, in dem das Segment zwischen den Nucleotiden 1089 und 2489 verloren gegangen ist. Zunächst wurde die Sequenz von PstI eliminiert durch Insertion des Fragments AhaIII-AhaIII von pUC8 (Vieira und Messing, 1982) zwischen zwei Stellen AhaIII von pML2 unter Eliminierung von 19 Basenpaaren. Es wurde die "Linker-Tailing"-Methode (Lathe et al., 1984) angewendet für die Insertion eines Linkers HindII zwischen den Stellen NruI und EcoRI, die mit S1 dieses Plasmids behandelt worden sind unter Eliminierung der Stelle BamHI. Dies führt zu einem Plasmid von 2049 Basenpaaren, welches das funktionelle β- Lactamase-Gen trägt (das Resistanz gegenüber Ampicillin verleiht) und außerdem einen aktiven Replikationsursprung in E. coli und eine einzelne Restriktionsstelle HindIII enthält.
- Diese Konstruktion wurde als pTG1H bezeichnet.
- Das Fragment Hin-J der DNA von VV, welches das Gen TK trägt, wurde vorher in einem aus pBR327 stammenden Vektor kloniert, (Drillien und Spehner, 1983). Dieses Fragment von 4,6 Kb wurde in die Stelle HindIII von pTG1H rückkloniert. Es wurde ein Klon selektioniert, in dem das Gen TK distal angeordnet ist, bezogen auf das Gen, das für die Ampicillin-Resistanz codiert.
- Diese Konstruktion pTG1H-TK wurde als Vektor in dem folgenden Versuch verwendet.
- Die folgende Stufe bestand darin, einen Promotor von VV zu isolieren, der zur Steuerung der Expression der für das zu exprimierende Gen codierenden Sequenz verwendbar war. Der Promotor eines Vor-Gens, das für ein Protein von 7500 Dalton (7,5 K) codiert, wurde bereits mit Erfolg für ein identisches Ziel verwendet (Smith et al., 1983) und dieses Segment ist bereits isoliert worden.
- Das Gen 7,5 K ist auf einem der kleineren Fragmente SalI (Fragment Sal-S) des Genoms von VV vom WR-Typ angeordnet (Venkatasan et al., 1981). Da die kleinen Fragmente bevorzugt kloniert werden, trägt ein großer Anteil der Klone, die erhalten werden durch direkte Klonierung der DNA von VV vom WR-Typ, die durch SalI in dem Plasmid pBR322 geschnitten worden ist, das Fragment Sal-S. Dieses Fragment wird auf den Bacteriophagen-Vektor M13mp701 transferiert (vgl. Kieny et al., 1983) durch Digestion von SalI und Religation, was auf diese Weise zu dem Phagen M13TGSal-S führt.
- In diesem Klon befindet sich eine Stelle ScaI unmittelbar in der Nähe der Ausgangs-ATG des Gens 7,5 K. Stromabwärts von dem Gen 7,5 K sind einzelne Stellen BamHI und EcoRI angeordnet, die aus dem Vektor stammen. Die Stellen BamHI und ScaI werden fusioniert durch Vermittlung eines Linkers BglII 5'-CAGATCTG-3', nachdem die durch Digestion von BamHI mit dem Klenow-Fragment der Polymerase von E. coli erzeugten Enden vervollständigt worden sind. Durch dieses Verfahren wird die Stelle ScaI eliminiert, die Stelle BamHI wird jedoch wieder hergestellt und die einzelne Stelle EcoRI wird stromabwärts verschoben. Gleichzeitig wird die Stelle SalI (AccI) stromabwärts eliminiert, die Stelle SalI stromaufwärts wird dann zu einer einzelnen Stelle.
- Diese Konstruktion wird als M13TG 7,5 K bezeichnet.
- Im Innern des Fragments Hind-J der DNA von VV sind Stellen ClaI und EcoRI angeordnet, die durch etwa 30 Basenpaare voneinander getrennt sind (Weir und Moss, 1983). Das Promotor-Fragment von 7,5 K, das in M13TG7, 5K vorhanden ist, wird durch AccI und EcoRI herausgeschnitten und zwischen den Stellen ClaI und EcoRI von pTG1H-TK kloniert unter Bildung von pTG1H-TK-P7,5K.
- Diese Konstruktion führt zum Transfer der einzelnen Stellen BamHI und EcoRI des Vektors M13 unmittelbar stromabwärts von der Promotorsequenz 7,5 K. Diese einzelnen Stellen BamHI und EcoRI werden in der folgenden Konstruktion verwendet.
- Das Polylinker-Segment des Bacteriophagen M13TG131 (Kieny et al., 1983) wird durch EcoRI und BglII herausgeschnitten und zwischen die Stellen EcoRI und BamHI des Plasmids pTGlH-TK-P7,5K inseriert unter Bildung von PolypTG186. Bei dieser Konstruktion sind 10 Restriktionsstellen für die Klonierung eines fremden Gens unter der Kontrolle von P7,5K verfügbar.
- Zur Herstellung einer Sequenz, die für env codiert, vereinigt man zunächst zwei provirale Segmente, die in den Plasmiden PJ19-6 und PJ19-13 geklont sind.
- Um eine geeignete Translation von mARN von env zu gewährleisten, wird die Nucleotidsequenz um die Initiierungsstelle der angenommenen Translation herum des Gens env modifiziert, um sie an die Consensus-Sequenz der Eucarioten-Gene anzupassen und um eine gerichtete Mutagenese mit einem Oligonucleotid in der Nähe der Position 5767 zu erzielen.
- Die Plasmide PJ19-13 und PH 19-E enthalten Fragmente HindIII des proviralen Genoms von LAV, das die Nucleotide 1258 bis 1698 bzw. 1698 bis 9173 umfaßt.
- Ein Fragment EcoRI-Kpn1 von PJI9-13 (welches die Initiierungs-ATG von env enthält) wird in den Phagen M13TG130 inseriert und man führt eine gerichtete Mutagenese mit einem Oligonucleotid durch (Sequenz 5 ' CTCTCATTGTCACTGCAGTCTCCTCTTTC), um eine Stelle PstI stromaufwärts von dem Initiierungs-Codon der Translation von env (Poition 5767) einzuführen und um das G in der Position -3 durch ein A zu ersetzen. Das mutierte Fragment wird anschließend zwischen die Stellen EcoRI und KpnI des Plasmids POLY-pTG1 eingeführt (das ein Mini-Plasmid von 2,1 kb ist ähnlich dem pTG1H, das jedoch ein Polylinker-Segment von M13TG131 enthält).
- Das Fragment KpnI-HindIII, das aus PJ 19-13 stammt, wird anschließend in ds gleiche Plasmid kloniert (zwischen KpnI und HindIII), woran sich ein Fragment HindIII-XhoI von PJ 19-6 (zwischen HindIII und SalI) anschließt, um eine vollständige codierende Sequenz env zu erzeugen, die von zwei Stellen PstI flankiert ist (Plasmid pTG1124).
- Die Einführung dieser beiden Restriktionsstellen PstI erlaubt eine leichteren Manipulation der DNA des Gens env beim Ablauf der Konstruktion. Wie weiter oben angegeben, macht es die Expression eines heterologen Proteins in das Vakzine-Virus erforderlich, daß die codierende Sequenz ausgerichtet ist auf eine Promotor-Sequenz des Vakzins und inseriert ist in ein nicht-essentielles Segment der Vakzine-DNA. Diese beiderseits angeordnete DNA erlaubt die Rekombination mit dem Genom des Vakzins in vivo durch eine doppelte reziproke Rekombination, welche die codierende Sequenz und den begleitenden Promotor in das Vakzine-Genom transferiert.
- Um dies zu erreichen, wird das obengenannte Fragment PstI-PstI in die Stelle PstI von Poly-pTG186 kloniert. Man erhält so ein Plasmid, das als pTG1125 bezeichnet wird.
- Das Plasmid Poly-pTG186 kann erzeugt werden aus dem durch PstI digestierten Plasmid pTG188 und es kann durch die Ligase T4 wieder ligiert werden.
- Das Plasmid pTG188 wurde am 20. Juni 1985 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de 1'Institut Pasteur, 28, rue de Docteur Roux, 75015 Paris, unter der folgenden Nr. hinterlegt:
- E. Coli 5K pTG188 = Nr. I 458.
- Der Transfer der codierenden Sequenz des Gens env und des begleitenden Promotors in das Genom des Vakzins wird wie folgt durchgeführt.
- Die von Smith et al. (1983) beschriebene Strategie beruht auf dem in vivo-Austausch zwischen einem Plasmid, das ein Insert in dem Gen VV TK trägt, und dem Virus-Genom vom Wild-Typ, um auf diese Weise das Gen TK, das von dem Virus getragen wird, zu inaktivieren. Die Viren TK können durch Ausbreitung auf einer Zell-Linie (TK-negativ) in Gegenwart von 5-Bromodioxyuridin (5BUDR) (Mackett et al., 1982) selektioniert werden. Die Thymidin-Kinase phosphoryliert das 5BUDR zum 5'-Monophosphat, das anschließend in das Triphosphat umgewandelt wird. Diese Verbindung ist ein Analogon von dTTP und ihre Einarbeitung in die DNA blockiert die korrekte Entwicklung des Virus. Ein Virus GK kann dennoch seine DNA normal replizieren und es führt zu Virus-Streifen, die in einer Zellinie sichtbar sind, die ebenfalls TK sind.
- Der Vakzine-Virus vermehrt sich in dem Zytoplasma der infizierten Stellen eher als in ihrem Kern. Deshalb ist es nicht möglich, Vorteil zu ziehen aus dem Mechanismus der Replikation und der Transkription der Wirts-DNA und es ist erforderlich, daß das Virion die Bestandteile aufweist für die Expression seines Genoms. Die gereinigte DNA von VV ist nicht infektiös.
- Zur Erzeugung der Rekombinanten, ist es erforderlich, gleichzeitig eine Zellinfektion mit dem Virion VV und eine rransfektion mit dem klonierten DNA-Segment durchzuführen, das Vorteile bietet. Die Erzeugung von Rekombinanten ist jedoch beschränkt auf den kleinen Anteil von Zellen, die für die Transfektion für DNA competent sind. Aus diesem -runde war es bisher erforderlich, eine indirekte "Kongruenz"-Strategie zur Herabsetzung des Hintergrundrauschens der nicht-rekombinanten Stamm-Viren anzuwenden. Dies wurde durchgeführt, indem man als lebendes infektiöses Virus eine wärmeempfindliche Mutante (ts) des Vakzins verwendete, die nicht in der Lage ist, sich bei einer unzulässigen Temperatur von 39,5ºC zu vermehren (Drillien und Spehner, 1983). Wenn die Zellen durch eine Mutante ts unter unzulässigen Bedingungen infiziert werden und mit der DNA eines Virus vom Wild-Typ transfektiert werden, tritt eine Virus-Multiplikation nur in den Zellen auf, die für die Transfektion kompetent sind und in denen eine Rekombination zwischen der Wild-Virus-DNA und dem Genom des Virus ts stattfindet; kein Virus multipliziert sich in den Zellen trotz der Tatsache, daß sie infiziert worden sind. Wenn ein rekombinantes Plasmid, das ein Fragment der Vakzine-DNA enthält, wie pTG1125, in der Transfektions-Mischung in einer geeigneten Konzentration zusammen mit der DNA vom Wild-Typ enthalten ist, ist es auch möglich zu erreichen, daß es an der homologen Rekombination mit der Vakzine-DNA in den kompetenten Zellen teilnimmt.
- Monoschichten von primären Fibroblast-Zellen von Hühnchenembryonen (CEF) werden bei 33ºC mit VV-Kopenhagen ts 7 (0,1 pfu/Zelle) infiziert und mit einem Copräzipitat mit Calciumphosphat der DNA des Virus vom Wild-Typ VV-Kopenhagen (50 ng/10&sup6; Zellen) und dem rekombinanten Plasmid (50 ng/10&sup6; Zellen) transfektiert.
- Nach 2stündiger Inkubation bei einer Temperatur, welche die Entwicklung des Virus ts nicht erlaubt (39,5ºC), werden die Zellen erneut 48 h lang bei 39,5ºC inkubiert. Verdünnungen des Virus ts+ werden für die erneute Infektion einer Monoschicht von Human-Zellen 143 B bei 37ºC verwendet, die anschließend in Gegenwart von 5BUDR (150 Mg/ml) inkubiert werden. Es werden verschiedene Virus-Plaques TK&supmin; aus diesen Zellen erhalten, die das rekombinante Plasmid empfangen haben, während die Kontroll- Kulturen ohne Plasmid keine sichtbaren Plaques zeigen. Die Viren TK&supmin; werden anschließend subkloniert durch eine zweite Selektion in Gegenwart von 5BUDR.
- Eine korrekte doppelte reziproke Rekombination zwischen dem Hybrid-Plasmid pTG1125 und dem Genom von VV führt zum Austausch des Gens TK, welches das Insert trägt, mit dem Gen TK des Virus, wobei die Rekombinanten so zu TK&supmin; werden.
- Die gereinigten DNA aus verschiedenen rekombinanten Viren TK&supmin; werden mit HindIII digestiert und einer Elektrophorese an einem Agarose-Gel unterworfen. Die DNA-Fragmente werden auf ein Nitrocellulose-Filter nach dem von Southern (1975) beschriebenen Verfahren transferiert. Das Filter wird anschließend hybridisiert mit dem mit ³²P Nick-übersetzten Plasmid pTG1125. Nach dem Waschen des Filters wird letzteres einer Fluorographie unterworfen und bei der Autoradiographie sind Banden von 3,85, 2,9, 0,9 Kb sichtbar, wenn das Vakzine-Virus dem Gen env von LAV einverleibt wurde. Eine dieser Rekombinanten VV.TG. eLAV 9-1 wurde für die folgenden Untersuchungen selektioniert.
- Um die Expression des Gens env von LAV aus dem Hybrid-Vakzine-Virus nachzuweisen, infiziert man Freßzellen BHK21, die in einem Medium G-MEM + 10% fötales Kalbsserum kultiviert worden sind, mit der genannten Rekombinanten VV.TG. eLAV 9-1.
- Eine semi-konfluente frische Monoschicht (106 Zellen) wird mit 0,2 pfu/Zelle infiziert und 18 h lang inkubiert.
- Das Medium wird anschließend eliminiert und man gibt ein Medium mit geringem Methioningehalt (1 ml auf 106 Zellen) zu, das mit 10 uml/ml Methionin 35 S ergänzt ist. Die Zellen werden bei 37ºC inkubiert und die markierten Proteine werden durch Zentrifugieren gesammelt. Nach der Auftrennung in einen Bodensatz und in eine überstehende Flüssigkeit werden die Proteine mit einem Serum inkubiert, das von einem Patienten stammt, der AIDS hat. Die mit dem Serum reagierenden Proteine werden durch Adsorption an einem Protein A-Sepharose-Harz gewonnen und durch Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel ausgebreitet und nach einer Methode, wie sie von Lathe et al., 1980, beschrieben worden ist, einer Autoradiographie unterzogen. Die Autoradiographien zeigen, daß das Serum des Patienten, der AIDS hat, drei Proteine der infizierten Zellextrakte spezifisch miteinander verbindet (das Ergebnis ist identisch oder ähnlich demjenigen, das mit anderen Seren von Patienten erhalten wird). Die scheinbaren Molekulargewichte von 160, 120 und 41 Kd lassen eine Äquivalenz mit den Banden gp 160, gp 120 und gp 41 vermuten, die mit Seren von an AIDS Erkrankten bei einer authentischen Herstellung des Glycoproteins env und in Extrakten von mit dem Virus LAV infizierten Zellen identifiziert wurden. Diese Beobachtung, wonach drei Proteine exprimiert werden, ausgehend von dem rekombinanten Vektor, der nur die für das Gen env des LAV codierende Sequenz trägt, stützt die Hypothese, daß das gp 120 und das gp 41 durch proteolytische Spaltung (Schneiden) des primären Übersetzungsprodukts gp 160 erzeugt worden sind.
- Die für env codierende Sequenz führt zu einem primären Translationsprodukt von etwa 90 kDA, während der Vorläufer von env, der nach dem vorhergehenden Verfahren erhalten wurde, ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 160 kDA aufweist. Diese Differenz ist zurückzuführen auf eine sehr starke Glycosylierung. Durch Digestion mit der Endoglycosidase F, welche die Glycosyl-Gruppen eliminiert, konnte eine gute Korrelation zwischen den durch die vorliegende Erfindung erhaltenen und den erwarteten Produkten nachgewiesen werden (Fig. 1).
- 5 Wochen alte männliche Balb/c-Mäuse werden durch subkutane Injektion von 5·10&sup7; pfu des Virus VV.TG.e LAV 9-1 pro Tier geimpft. Nach zwei Wochen wird ihnen eine Auffrischungs-Injektion mit der gleichen Dosis verabreicht und es wird eine Blutprobe entnommen 1, 2 und 4 Wochen nach der Auffrischung. Die Anwesenheit von gegen Determinanten des Virus LAV gerichteten Antikörpern und des Vakzine-Virus in ihren Seren wird untersucht.
- Alle geimpften Tiere ergeben Seren, die mit dem Vakzine-Virus in einem ELISA-Test reagieren können. Dagegen ist die Ansprechempfindlichkeit in dem ELISA-Test gegen den Virus LAV gering und schlecht reproduzierbar. Um die Empfindlichkeit der Tests zu verbessern, wird eine "Western-Transfer"-Methode angewendet. Diese Methode erlaubt den Nachweis der Antikörper, die mit den Proteinen des Virus LAV reagieren können, nachdem sie mit SDS in einem Elektrophoresegel denaturiert und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen worden sind. Bei diesem Versuch handelt es sich bei den verwendeten Nitrocellulosemembranen um diejenigen des von der Firma Diagnostic Pasteur verkauften Kits LAV-BLOT, auf denen die Proteine des Virus LAV bereits fixiert sind. Diese Membranen werden zu Streifen zerschnitten und jeder Streifen wird mit dem Serum der geimpften Mäuse (Verdünnung 1/20) inkubiert. Ein an die Peroxide gebundener zweiter Antikörper (Schaf-Anti-Maus) erlaubt die Sichtbarmachung der Proteine des Virus LAV, an denen Maus-Antikörper fixiert sind.
- Mehrere Seren (12/27) ergeben eine spezifische Reaktion mit einem Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 160 kDA entsprechend dem gp 160 von env (Fig. 2). Bei einer bestimmten Anzahl von Seren beobachtet man auch eine Reaktion mit dem Protein gp 41. Es sei darauf hingewiesen, daß die Seren einiger Mäuse beim Western-Transfer Signale ergeben, die nicht-identifizierten Proteinen des Präparats des Virus LAV entsprechen, das an den Membranen fixiert ist.
- Dieses Plasmid pTG1128 ist identisch mit dem Plasmid 1125 bis auf die Tatsache, daß die für die Transmembran- Zone codierende Sequenz ausgetauscht worden ist, um das Arginin durch ein Isoleucin zu ersetzen, um dadurch die Haftung des Proteins an der Zellmembran zu verbessern.
- Das Fragment HindIII-BamHI von pTG1124, das die Transmembran-Zone von env enthält, wie in Beispiel 2 beschrieben, wird nach einer Digestion HindIII-BamHI in den Phagen M13 TG131 inseriert. Man erhält so einen Phagen M13 TG154.
- Anschließend führt man mit diesem Phagen M13 TG154 eine lokalisierte Mutagenese durch, die dazu bestimmt ist, den für das Arginin codierenden Codon durch einen für das Isoleucin codierenden Codon zu ersetzen. Zu diesem Zweck verwendet man das folgende Oligonucleotid:
- Man erhält so den Phagen M13 TG155, dessen Sequenzen wie folgt modifiziert worden sind: Original-Sequenz: Mutierte Sequenz:
- Das auf diese Weise mutierte Fragment BamHI-HindIII wird transferiert von M13 TG155 in das Plasmid pTG1124 in äquivalente Stellen, um das Plasmid pTG1127 zu ergeben, welches das Gen env wie oben angegeben wiederherstellt mit Ausnahme dessen, daß der Arginin-Codon durch einen Isoleucin-Codon ersetzt ist.
- Wie bereits in Beispiel 1 beschrieben, wird das Fragment PstI-PstI von pTG1127 in die Stelle PstI des Plasmids Poly-pTG186 kloniert, um das Plasmid pTG1128 zu ergeben.
- In diesem Plasmid ist die für die Transmembran-Zone des Tollwuterreger-Glycoproteins codierende Sequenz fusioniert mit dem Beginn der für den hydrophoben Abschnitt des Glycoproteins env codierenden Sequenz.
- Die Transmembran-Zone des Tollwuterreger-Glycoproteins stammt aus einem BamHI-PstI-Fragment des Phagen M13 TGRG151.
- Dieses Fragment wird in dem Phagen M13 TG154 zwischen den Stellen BamHI und PstI kloniert (vgl. das vorhergehende Beispiel). Man erhält so den Phagen M13 TG156.
- Anschließend führt man eine lokalisierte Mutagenese bei M13 TG156 durch, um die env- und Tollwut-Sequenzen mit einem Oligonucleotid zu fusionieren unter Bildung einer Schleife 5' GCTCTGGTATATGTATGTATTACTGAGTC 3'
- Man erhält so den Phagen M13 TG157.
- Die Transmembran-Zone (tm) des Tollwut-Glycoproteins, das mit dem Gen env fusioniert worden ist, wird anschließend in das Plasmid pTG1124 transferiert.
- Zu diesem Zweck kloniert man das Fragment HindIII- BglII von M13 TG157 in pTG1124, in dem eine Restriktion HindIII-BamHI (dadurch werden die Stellen BamHI und BglII zerstört) durchgeführt worden ist.
- Die Stelle BglII von M13 TG157 stammt aus dem Fragment gp Tollwut:
- Man erhält so das Plasmid pTG1126.
- Wie oben wird das Fragment PstI-PstI von pTG1126 in der Stelle PstI von Poly-pTG 186 kloniert, um das Plasmid pTG1130 zu ergeben.
- Ziel der Konstruktion dieses Plasmids ist es, die Signal-Sequenz des Gens env und die Signal-Sequenz des Tollwuterreger-Glycoproteins miteinander zu fusionieren.
- Die Signal-Sequenz des Glycoproteins der Tollwut wird entnommen aus dem Plasmid pTG155 PRO in Form eines Fragments BglII-HindIII, das in die Stellen PstI-HindIII von M13 TG130 kloniert wird mittels eines Einfachstrang-Adapters mit der folgenden Sequenz:
- 5' GATCTGCA 3'
- Man erhält so den Phagen M13 TG158.
- Der Transfer des Signal-Peptids von env in M13 TG158 erfolgt anschließend, um letzteres mit dem für das Signal- Peptid des Tollwuterreger-Glycoproteins codierenden Gen zu fusionieren.
- Um dies zu erreichen wird eine Klonierung des Fragments PstI durchgeführt, das mit der Nuclease S1 behandelt worden ist, dann mit Klenow und KpnI in M13 TG158, das mit HindIII, das mit Klenow und KpnI behandelt wurde, geschnitten wurde:
- Signal-env Signal-Tollwut
- Man erhält so das Plasmid M13 TG159.
- Man transferiert den Block KpnI-PstI von M13 TG159 in M13 TG131 zur Herstellung des Plasmids M13 TG160.
- Signa-Tollwut Signal-env
- Eine lokalisierte Mutagense an M13 TG160 erlaubt das Fusionieren der Sequenzen von env und des Tollwut-Glycoproteins in Phase (unter Bildung einer Schleife). Dies mit dem Oligonucleotid
- 5' GACCCACAATTTTTCTGTAATAGGCAATTTCCCAAA 3'
- Signal-Tollwut env
- Man erhält so den Phagen M13 TG161.
- Das Fragment PvuII-KpnI von M13 TG161 wird dann in pTG1126 kloniert, das durch EcoRI geschnitten ist, das behandelt wurde mit Klenow-KpnI (die Stelle PvuII von M13 TG161 stammt aus M13 in dem Bereich, der stromaufwärts von dem Polylinker angeordnet ist). Dies führt zu dem Plasmid pTG1129.
- Durch Klonierung des Fragments PstI-PstI von pTG1129 in dem Plasmid Poly-pTG186, das durch PstI geschnitten wird, erhält man das Plasmid pTG1131.
- Durch Klonierung des Fragments PstI-PstI von pTG1128 in der Stelle PstI von M13 TG131 erhält man das Plasmid M13 TG162.
- Anschließend führt man eine lokalisierte Mutagenese mit dem Oligonucleotid durch
- 5' ATTCCCACTGCTTAGTATTCATTCTGCACCACTC 3'
- Dies erlaubt es, einen Stopp-Codon am Ende des gp120 anzuordnen. Die erhaltenen Sequenzen sind die folgenden:
- Original-Sequenz
- angenommene Spaltungstelle (Schnittstelle) des gp120
- mutierte Sequenz:
- Man erhält so den Phagen M13 TG168.
- Durch erneutes Klonieren des Fragments PstI von M13 TG168 in der Stelle von PstI von Poly-pTG186 erhält man das Plasmid pTG1132.
- Durch lokalisierte Mutagenese an M13 TG162 mit dem folgenden Oligonucleotid:
- 5' ATTCCCACTGCTTGGTCTTCATTCTGCACCACTC 3'
- erhält man einen Bacteriophagen, in dem eine potentielle Schnittstelle, die das gp 120 und das gp 40 voneinander trennt, zerstört worden ist.
- Die modifizierten Sequenzen sind die folgenden:
- Original-Sequenz:
- Schnittstelle
- mutierte Sequenz :
- Man erhält so den Phagen M13 TG165.
- Durch erneute Klonierung des Fragments PstI-PstI von M13 TG165 in Poly-pTG186 an der Stelle PstI erhält man das Plasmid pTG1133.
- Durch Klonierung des Fragments PstI-PstI von pTG1131 an der Stelle PstI von M13 TG131 erhält man den Phagen M13 TG163.
- Man führt eine lokalisierte Mutagenese an M13 TG163 durch, um die gleiche Schnittstelle wie oben bei dem gp120 zu zerstören. Um dies zu erreichen, verwendet man ein Oligonucleotid:
- 5' ATTCCCACTGCTTGATGTTCATTCTGCACCACTC 3'
- Dies erlaubt die Modifizierung der Sequenzen auf die folgende Weise:
- Original-Sequenz:
- mutierte Sequenz:
- Unter diesen Bedingungen erhält man den Phagen M13 TG166.
- Durch erneute Klonierung des Fragments PstI-PstI dieses Phagen M13 TG166 an der Stelle PstI von Poly-pTG186 erhält man das Plasmid pTG1134.
- Man arbeitet wie oben oben für da Plasmid pTG1125 beschrieben und erhält die Hybrid-Vakzine-Vektoren, die den oben hergestellten verschiedenen Plasmiden entsprechen.
- Diese Viren-Vektoren werden jeweils wie folgt bezeichnet:
- VV.TG. eLAV 1128
- VV.TG. eLAV 1130
- VV.TG. eLAV 1131
- VV.TG. eLAV 1132
- VV.TG. eLAV 1133
- VV.TG. eLAV 1134.
- Die wie oben beschrieben erhaltenen Proteine werden durch Immunopräzipitation getestet (Fig. 3).
- Aus der Gesamtheit der Immunopräzipitate für das Virus 9-1 ergibt sich eine Immunopräzipitation, die dem gp160, dem gp120 und dem gp41 entspricht.
- Das gleiche gilt für das Virus 1128.
- Das Virus 1130 zeigt ebenfalls ein gp160 und ein gp120.
- Das dem gp41 entsprechende Protein hat ein etwas niedrigeres Molekulargewicht aufgrund der Modifikation seines C-terminalen Endes.
- Das Virus 1131 weist ein Spektrum auf, das im wesentlichen identisch ist mit demjenigen, das für das Virus 1130 erhalten wurde.
- Das Virus 1132 weist kein eindeutig dem gp41 entsprechendes Protein auf. Das Protein von 105 kDA, das in den Zentrifugenrückständen enthalten ist, ist eine Isoform des gp120 (mit einer anderen Glycosylierung).
- Was das Virus 1133 angeht, so weist dieses Proteine 160, 120 und 41 auf, die den Proteinen 120 und 41 entsprechenden Banden sind jedoch schwächer als in den anderen Spektren.
- Daraus ergibt sich auch für das Virus 1134, daß das gp41 ebenfalls ein niedrigeres Molekulargewicht hat, für dieses ist jedoch klar, daß das Schneiden (Spalten) mit einer langsameren Kinetik erfolgt als bei den Viren VV.TG.1125 (9-1) bis 1131.
- Die mit dem Virus VV.TG.eLAV1133 und 1134 durchgeführten Ausscheidungs-Kinetiken zeigen, daß, obgleich die Schnitt-Kinetik (Spaltungskinetik) zwischen dem gp120 und dem gp40 langsamer ist, ein Schneiden (Spalten) noch stattfindet. Die Prüfung der DNA-Sequenz des Gens env zeigt eine andere potentielle Schnittstelle (KRR) 8 Aminosäuren stromabwärts von der ersten Schnittstelle. Es scheint daher wichtig zu sein, diese zweite Stelle zu mutieren, um ein rekombinantes Vakzine-Virus zu erhalten, welches nur das gp160 exprimiert.
- Durch lokalisierte Mutagenese an Ml3TG166 mit dem folgenden Oligonucleotid:
- 5, ATTCTGCACCACGTGATTCTGTGCCTTCGTGCGT 3'
- erhält man einen Phagen, in dem die zweite Schnittstelle modifiziert ist. Die modifizierten Sequenzen sind die folgenden:
- Original-Sequenz:
- potentielle Schnittstelle
- mutierte Sequenz:
- Das Fragment PstI-PstI des erhaltenen Phagen (M13TG181) wird in Poly-pTG186 kloniert an der Stelle PstI, um das Plasmid pTG1135 zu erzeugen.
- Der C-terminale Abschnitt des Gens env, das mit dem rekombinanten Vakzine-Vektor VV.TG. eLAV1135 synthetisiert worden ist, ist eine Sequenz, die aus dem Tollwuterreger- Glycoprotein stammt. Es erscheint daher vorteilhaft, auch über ein anderes Rekombinant zu verfügen, in dem dieser cterminale Abschnitt durch den C-terminalen Abschnitt des Gens env des Virus LAV ersetzt ist.
- Um dies zu erreichen, führt man mit dem Phagen MI3TGI65 die gleiche Mutagenese durch wie sie mit dem Phagen M13TG166 durchgeführt worden ist (vgl. Beispiel 13), unter Bildung des Phagen M13TG184.
- Das Fragment PstI-PstI von M13TG184 wird anschließend in das Plasmid Poly-pTG186 erneut kloniert unter Bildung des Plasmids pTG1139.
- Man würde auch gerne über ein rekombinantes Vakzine- Virus verfügen, das nur das gp120 exprimiert. Dieses gp120 wäre im Gegensatz zu dem mit dem Virus VV.TG.eLAc1132 erhaltenen Fall mit einer C-terminalen Verankerungszone versehen.
- Um dies zu erreichen, eliminiert man durch lokalisierte Mutagenese die dem gp40 entsprechenden Sequenzen in dem Phagen M13TG181 mit Hilfe des folgenden Oligonucleotids:
- 5'TGCPLCTCAGTAATACATPLCACGTATTCTGTGCCTT 3'
- Dieses Oligonucleotid erlaubt die Fusionierung der Sequenzen gp120 (mit den zwei modifizierten Schnittstellen) und der Sequenzen der Transmembranzone des Tollwut- Glycoproteins in Phase:
- Man erhält so den Phagen M13TG182. Das Fragment PstI- PstI von M13TG182 wird anschließend in die Stelle PstI von POLY-pTG186 inseriert, um das Plasmid pTG1136 zu bilden.
- Die Rolle der an dem N-terminalen Abschnitt des gp40 angeordneten hydrophoben Zone ist kaum bekannt. Diese Zone des Proteins env könnte für die Induktion der Bildung der Syncitia verantwortlich sein.
- Es scheint daher interessant (vorteilhaft), ein gp160 herzustellen, das diese Sequenz nicht enthält.
- Um dies zu erreichen, fusioniert man die Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts von dem für dieses hydrophobe Peptid codierenden Abschnitt in dem Phagen M13TG181 in Phase mittels des folgenden Oligonucleotids:
- 5'CAATAATTGTCTGGCCTGCACGTGATTCTGTCCTT 3'
- Dies erlaubt die Herstellung des Phagen M13TG183 durch Durchführung der Fusion:
- gp120 hydrophiler Abschnitt des gp40
- Das Fragment PstI-PstI von M13TG183 wird erneut kloniert in der Stelle PstI von POLY-pTG186 zur Bildung des Plasmids pTG1137.
- Außer den rekombinanten Viren, die das pg160 oder das gp120 exprimieren, kann es auch nützlich sein, ein rekombinantes Vakzine-Virus zu erzeugen, welches nur das gp40 exprimiert.
- Um dies zu erreichen, fusioniert man die für das Signal-Peptid codierende Sequenzen mit den für das gp40 codierenden Sequenzen in dem Phagen M13TG163 mittels des folgenden Oligonucleotids:
- 5 'CAATAATTGTCTGGCCTGAATAGGGAATTTCCCAAA 3'
- Dies erlaubt die Bildung des Phagen M13TG180, der die Fusion enthält:
- Signal der Tollwuterreger-gp gp 40 (hydrophiler Abschnitt)
- Das Fragment PstI-PstI von M13TG180 wird in die Stelle PstI von POLY-pTG186 inseriert zur Bildung des Plasmids pTG1138.
- Wie im Falle des gp160 (Plasmid pTG1139) kann es wichtig sein, auch über ein rekombinantes Virus zu verfügen, das ein gp40 exprimiert, in dem die Verankerungszone und die Intracytoplasma-Zone eher Sequenzen des Gens env des Virus LAV sind als die entsprechenden Sequenzen des Tollwuterreger-Glycoproteins.
- Um dies zu erreichen, ersetzt man das Fragment HindIII-BglI von Ml3TG180 durch das Fragment HindIII-BglI von M13TG165 unter Bildung des Phagen M13TG190.
- Das Plasmid pTG1162 wird erhalten durch Klonierung des Fragments PstI-PstI des Phagen MI3TG190 in der Stelle PstI des Plasmids POLY-pTG186.
- Es scheint auch wichtig zu sein, über ein rekombinantes Vakzine-Virus zu verfügen, das ein nicht-geschnittenes und in das Medium sekretiertes gp160 synthetisiert. Dieses Protein könnte nämlich als abgetöteter Impfstoff verwendet werden zusammen mit Adjuvantien oder es könnte in Liposome oder Ischome eingeschlossen werden (Morein et al., "Nature" (1984), 308, 5958, S. 457-460).
- Zu diesem Zweck konstruiert man den Bacteriophagen M13TG194, in dem die für die Extracytoplasma- und Intracytoplasma-Bereiche codierenden Sequenzen in dem Bacteriophagen M13TG194 in Phase miteinander fusioniert werden mittels des folgenden Oligonucleotids:
- 5 'TCCCTCZCTGACTCTATTTTTTATATACCACAGCCA 3'
- Das Fragment PstI-PstI von M13TG194 wird anschließend an der Stelle PstI von POLY-pTG186 kloniert zur Bildung von pTG1163.
- Die so erhaltenen rekombinanten Proteine und insbesondere das nicht-schneidbare (nicht-spaltbare) gp160 können in Diagnose-Kits verwendet werden zum Nachweis der in dem Blut von Kranken, die mit dem Virus in Kontakt gekommen sind, vorhandenen potentiellen Antikörper. Diese Tests können nach Verfahren durchgeführt werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise durch ELISA, RIPA, "Western-Transfer" (Immuno-Abdruck).
- Diese Proteine können auch verwendet werden zur Erzeugung von Hybridomen und monoklonalen Antikörpern, die dazu bestimmt sind, die Anwesenheit des Virus in Proben nachzuweisen.
- Die verschiedenen Plasmide und Phagen M13 sind insbesondere in den folgenden Patentschriften beschrieben:
- M13 TG131 : Kieny et al., 1983
- M13 TGRG151 : WO 83/04052
- pTG155 PRO : FR 84 06499
- M13 TG130 : Kieny et al., 1983.
- Die folgenden Plasmide wurden am 16. November 1984 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de 1'Institut Pasteur hinterlegt und sie sind in dem britischen Patent GB-A-84 29099 beschrieben:
- PJ 19-6 : CNCM Nº 366-1
- PJ 19-13 : CNCM Nº 367-1.
- Das Plasmid pTG1125 wurde am 6. Juni 1986 in der gleichen Sammlung hinterlegt in Form des transformierten Bakteriums E. coli 1106/pTG1125 unter der Nr. I-557.
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- 3. - M.P. Kieny, R. Lathe, R. Drillien, D. Spehner, S. Skory, D. Schmitt, T. Wiktor, H. Koprowski und J.P. Lecoq, 1984, "Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus" in "Nature" 312: 163-166.
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Claims (30)
1. Virus-Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er
mindestens umfaßt:
- einen Teil des Genoms eines Virus,
- eine Sequenz, die für die Signal-Sequenz des
Vorläufers des Glycoproteins gp160 der Hülle des AIDS-Virus
codiert, oder eine Signal-Sequenz, die aus einem
heterologen Virus stammt,
- die Sequenz des Gens, das für das Glycoprotein gp160
der Hülle des AIDS-Virus codiert, wobei das für das
genannte gp160 codierende Gen nicht die Schnittstelle
für die Proteasen mit der Sequenz REKR enthält,
- sowie die Elemente, welche die Expression dieses
Glycoproteins in Zellen gewährleistet.
2. Virus-Vektor nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Gen des gp160 für ein gp160 codiert, das
nicht die Schnittstellen für die Proteasen mit der Sequenz
REKR und KRR enthält.
3. Virus-Vektor nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Sequenz REKR durch die Sequenz NEHQ ersetzt
ist.
4. Virus-Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Sequenz REKR und KRR jeweils durch die Sequenz
NEHQ und QNH ersetzt sind.
5. Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Genoms eines Virus
ein Teil des Genoms eines Pocken-Virus ist.
6. Virus-Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß das Pocken-Virus das Vakzine-Virus ist.
7. Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß er nicht für die den
Transmenbran-Bereich des natürlichen gp160 codierenden Sequenz enthält.
8. Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die für das C-terminale hydrophobe
Peptid codierende Sequenz, die der Transmembran(tm)-Zone
des natürlichen gp160 entspricht, durch Ersatz des Codons
arg durch einen Codon Ile mutiert worden ist.
9. Virus-Vektor nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß er eine Sequenz aufweist, die für einen
Transmembran-Bereich codiert, die aus einem heterologen Virus,
insbesondere dem Tollwut-Virus, stammt.
10. Virus-Vektor nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß er keine Sequenz aufweist, die für einen
Transmembran-Verankerungsbereich codiert.
11. Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz, die für das
gp160 codiert, abhängig ist von einem Promotor eines
Pocken-Virus-Gens.
12. Virus-Vektor nach Anspruch 10, dadurch
gekennzeichnet, daß der Promotor ein Promotor eines Gens des
Vakzine-Virus ist.
13. Virus-Vektor nach Anspruch 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz, die für das gp160 codiert,
unter der Kontrolle des Promotors des Gens des Proteins
7,5 K des Vakzine-Virus steht.
14. Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, daß die für das gp160 codierende
Sequenz in das TK-Gen des Vakzine-Virus cloniert ist.
15. Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und
bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das C-terminale
hydrophobe Peptid des gp160 deletiert ist.
16. Rekombinante DNA, die einem Virus-Vektor nach
einem der Ansprüche 1 bis 15 entspricht.
17. Kultur von Säugetier-Zellen, die mit einem Virus-
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15 infiziert sind
oder eine DNA nach Anspruch 16 enthalten.
18. Verfahren zur Herstellung von
Hüllen-Glycoproteiden des AIDS-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen
gemäß Anspruch 17 kultiviert und das gebildete
Glycoprotein gewinnt.
19. Nicht-schneidbares Hüllen-Glycoprotein gp160 des
AIDS-Virus, das insbesondere durch Durchführung des
Verfahrens nach Anspruch 18 erhältlich ist.
20. Nicht-schneidbares Glycoprotein gp160 der Hülle
des AIDS-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß es keine
Schnittstelle für die Proteasen mit der Sequenz REKR des
natürlichen Glycoproteins gp160 aufweist.
21. Nicht-schneidbares Glycoprotein gp160 nach
Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es keine
Schnittstellen für die Proteasen mit den Sequenzen REKR
und KRR des natürlichen Glycoproteins gp160 aufweist.
22. Nicht-schneidbares Glycoprotein gp160 nach
Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz REKR
durch die Sequenz NEHQ ersetzt ist.
23. Nicht-schneidbares Glycoprotein gp160 nach
Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die
Sequenzen REKR und KRR des natürlichen gp160 jeweils durch die
Sequenzen NEHQ und KNH ersetzt sind.
24. Glycoprotein nach einem der Ansprüche 20 bis 23,
dadurch gekennzeichnet, daß es nicht den
Transmembran-Verankerungsbereich des natürlichen gp160 aufweist.
25. Glycoprotein nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß es den Transmembran-Bereich des
Tollwut-Virus umfaßt.
26. Glycoprotein nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß das C-terminale hydrophobe Peptid, das dem
Transmembran-Bereich des gp160 entspricht, modifiziert
ist, wobei das Arginin durch ein Isoleucin ersetzt ist.
27. Glycoprotein nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß es keinen Transmembran-Verankerungsbereich
aufweist.
28. Glycoprotein nach einem der Ansprüche 22 bis 25
oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß das C-terminale
hydrophobe Peptid des natürlichen gp160 deletiert ist.
29. Vakzine, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht
aus einem Virus-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 13
und/oder einem Glycoprotein nach einem der Ansprüche 19
oder 28.
30. Antikörper, die gegen die Hüllen-Glycoproteine
des AIDS-Virus gerichtet sind, nach den Ansprüchen 19 bis
28, ausgenommen die Antikörper, die gegen die natürlichen
Glycoproteine gp160 gerichtet sind.
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