FR2596771A1 - Vecteur viral et adn recombinant codant pour une glycoproteine du virus agent causal du s.i.d.a., culture cellulaire infectee par ce vecteur, procede de preparation de la glycoproteine, glycoproteine obtenue, vaccin et anticorps obtenus - Google Patents
Vecteur viral et adn recombinant codant pour une glycoproteine du virus agent causal du s.i.d.a., culture cellulaire infectee par ce vecteur, procede de preparation de la glycoproteine, glycoproteine obtenue, vaccin et anticorps obtenus Download PDFInfo
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN VECTEUR VIRAL CARACTERISE EN CE QU'IL COMPORTE AU MOINS:-UNE PARTIE DU GENOME D'UN VIRUS,-UN GENE CODANT POUR L'UNE DES GLYCOPROTEINES (GP) DE L'ENVELOPPE DU VIRUS RESPONSABLE DU SIDA,-AINSI QUE LES ELEMENTS ASSURANT L'EXPRESSION DE CETTE GLYCOPROTEINE DANS DES CELLULES.
Description
La présente invention concerne plus particulibrement un vaccin destiné b la prévention du S.I.D.A..
Le syndrome d'immunod8ficience acquise (S.I.D.A.) est une affection virale qui présente maintenant une importance majeure en Amérique du Nord, en
Europe et en Afrique centrale.
Europe et en Afrique centrale.
Les estimations récentes suggèrent que environ 1 Million d'Américains peuvent avoir été exposés au virus du S.I.D.A. Les individus affectés présentent une immunodépression sévère et la maladie est, en gené- ral, fatale.
La transmission de la maladie s'effectue le plus souvent par contact sexuel, bien que les personnes utilisant des stupéfiants par voie intraveineuse représentent également un groupe à haut risque ; d'autre part, un grand nombre d'individus ont été infectés par ce virus après avoir reçu du sang ou des produits sanguins contaminés.
L'agent causal de cette affection est un rétrovirus. De nombreuses affections animales ont été attri-..
buées auxrétrovirus, mais c'est seulement récemment que des rétrovirus affectant des hommes ont pu être décrits.
Alors que des rétrovirus des cellules T humaines (HTLV: human T leukemia virus)de types I et II ont été impliqués comme agent causal de certaines leucémies des cellules T chez les adultes, le rétrovirus associé à des lymphadénopathies (virus LAV), qui est également appelé virus HTLV III ou A.I.D.S.-related virus (ARV), est maintenant couramment accepté comme l'agent responsable du
S.I.D.A.
S.I.D.A.
Le génome du rétrovirus LAV a été caractérisé de façon très complète (Wain-Hobson et al., 1985 t
Ratner et al., 1985 ; Muesing et al., 1985 ; Sanchez
Pescador et al., 1985) et des informations sur la séquence indiquent une relation étroite avec le groupe des lentivirus. Les lentivirus, dont le prototype est le virus ovin Visna, sont les agents de maladies d progression très lente et qui présentent typiquement une période d'incubation prolongée. Le LAV et le virus Visna par tagent de nombreuses similarités, en particulier dans leur tropisme pour le tissu neural.
Ratner et al., 1985 ; Muesing et al., 1985 ; Sanchez
Pescador et al., 1985) et des informations sur la séquence indiquent une relation étroite avec le groupe des lentivirus. Les lentivirus, dont le prototype est le virus ovin Visna, sont les agents de maladies d progression très lente et qui présentent typiquement une période d'incubation prolongée. Le LAV et le virus Visna par tagent de nombreuses similarités, en particulier dans leur tropisme pour le tissu neural.
Par analogie avec d'autres rétrovirus bien connus, les trois plus importantes parties du génome du LAV ont été désignées par g, pol et env. La séquence du gène env incluant la séquence de la gap110 et de la gp41 révèle des caractéristiques qui étaient attendues d'une glycoprotéine d'enveloppe transmembranaire et l'identité du précurseur de la protéine env, gpl60,constitué par la gel 10 et la gp42, a été confirmée par un séquençage direct des acides aminés.
Des anticorps dressés contre la protéine env gp160 et ses produits de clivage gp120 et gp41, sont communément détectés dans le sérum de patients ayant le
S.I.D.A., et la glycoprotéine env représente l'antigène de surface majeur du virus du S.I.D.A.
S.I.D.A., et la glycoprotéine env représente l'antigène de surface majeur du virus du S.I.D.A.
La protéine env est ainsi le candidat le plus prometteur pour développer une stratégie de vaccination, c'est pourquoi l'attention a été concentrée sur cette protéine et sur sa séquence codante.
Un grand nombre de groupes ont rapporté l'ex- pression de la protéine env dans les bactéries. Toutefois, l'absence de glycosylation et de structuration post-traductionnelle peuvent compromettre le pouvoir immunogène des matériaux synthétisés par de tels microorganismes.
C'est pourquoi la présente invention propose d'utiliser comme vecteur d'expression de la protéine env un vecteur viral permettant l'expression de la pro téine dans un environnement qui permettra sa glycosylation et sa restructuration post-traductionnelle.
C'est pourquoi la présente invention concerne un vecteur viral caractérisé en ce qu'il comporte tout ou partie du gène env du virus responsable du S.I.D.A.
Parmi les vecteurs viraux utilisables, il faut citer plus particulièrement les poxvirus, et notamment le virus de la vaccine (W).
Le virus de la vaccine est un virus & ADN double brin qui a été utilisé très largement dans le monde entier pour contrôler et éradiquer la variole. Des développements techniques récents ont permis le développement de ce virus comme vecteur de clonage et des virus recombinants vivants ont permis d'exprimer des antigènes étrangers et même d'obtenir des immunisations contre différentes maladies virales ou parasitaires.
Ainsi, plusieurs groupes ont récemment mis en évidence l'utilisation de recombinants de ce type pour exprimer l'antigène de 1'Influenza, de l'hépatite Bet
la glycoprotéine de la rage pour immuniser contre ces maladies (Smith et al., 1983 ; Panicali et al., 1983 ;
Kieny et al., 1984).
la glycoprotéine de la rage pour immuniser contre ces maladies (Smith et al., 1983 ; Panicali et al., 1983 ;
Kieny et al., 1984).
L'expression d'une séquence codant pour une protéine étrangère par le virus de la vaccine (W) implique nécessairement deux étapes 1) la séquence codante doit être alignée avec un promo
teur de W et être insérée dans un segment non
essentiel de l'ADN de W, cloné dans un plasmide
bactérien approprié 2) les séquences d'ADN de W situées de part et d'autre
de la séquence codante doivent permettre des recom
binaisons homologues in vivo entre le plasmide et le
génome viral ; une double recombinaison réciproque
conduit à un transfert de l'insert d'N du plasmide
dans le génome viral dans lequel il est propagé et
exprimé (Panicali et Paoletti, 1982 ; Mackett et al.,
1982 ; Smith et al., 1983 ; Panicali et al., 1983).
teur de W et être insérée dans un segment non
essentiel de l'ADN de W, cloné dans un plasmide
bactérien approprié 2) les séquences d'ADN de W situées de part et d'autre
de la séquence codante doivent permettre des recom
binaisons homologues in vivo entre le plasmide et le
génome viral ; une double recombinaison réciproque
conduit à un transfert de l'insert d'N du plasmide
dans le génome viral dans lequel il est propagé et
exprimé (Panicali et Paoletti, 1982 ; Mackett et al.,
1982 ; Smith et al., 1983 ; Panicali et al., 1983).
Bien entendu, l'utilisation de ce type de vec
teur implique souvent une délétion partielle du génome
du virus vecteur.
teur implique souvent une délétion partielle du génome
du virus vecteur.
La présente invention concerne plus particuliè
rement un vecteur viral caractérisé en ce qu'il comporte
au moins
- une partie du génome d'un virus vecteur,
- un gène codant pour l'une des glycoprotéines
(gp) de l'enveloppe du virus responsable du SIDA,
- ainsi que les éléments assurant l'expression de
cette glycoprotéine dans des cellules.
rement un vecteur viral caractérisé en ce qu'il comporte
au moins
- une partie du génome d'un virus vecteur,
- un gène codant pour l'une des glycoprotéines
(gp) de l'enveloppe du virus responsable du SIDA,
- ainsi que les éléments assurant l'expression de
cette glycoprotéine dans des cellules.
L'invention concerne également les ADN recombinants correspondant auxdits vecteurs viraux.
Il convient de remarquer que les glycoprotéines (gp) de l'enveloppe du virus responsable du SIDA sont au nombre de 3, désignées par leur masse en kDA, à savoir la gap160, la gp120 et la gp41 ; la première, gp160, est en fait le précurseur des deux dernières protéines. Ces dénominations ne sont pas encore figées et la gp41 est parfois appelée gp40 ou gp42 mais les différences de masse font que ces 3 glycoprotéines sont parfaitement identifiables, quelle que soit leur dénomination.
Par virus responsable du SIDA, on entend notamment désigner le virus LAV, le virus HTLV III ou ARV, de même que d'éventuels mutants ponctuels ou des délétions partielles de ces virus, ainsi que les virus apparentés.
Les vecteurs viraux, dans la partie correspondant au génome du virus vecteur (distinct du virus responsable du S.I.D.A.), peuvent être constitués à partir du génome d'un virus d'origine quelconque. Toutefois, on préfèrera utiliser une partie du génome d'un poxvirus et plus particulièrement une partie du génome de la vaccine.
Les conditions nécessaires pour l'expression d'une protéine hétérologue dans le virus de la vaccine ont été rappelées précédemment.
De façon générale, le gène en cause, par exemple le gène env, devra, pour pouvoir être exprimé, être sous la dépendance d'un promoteur d'un gène de la vaccine, ce promoteur sera en général le promoteur de la protéine 7,5K de la vaccine.
En outre, la séquence codante devra Outre clonée dans un gène non essentiel de la vaccine qui pourra éventuellement servir de gène marqueur.Dans la plupart des cas, il s'agira du gène TK.
Parmi les glycoprotéines de l'enveloppe que l'on souhaite voir exprimer, il faut citer les trois protéines mentionnées précédemment, à savoir la gp 160, la gp 41 et la gp 120.
De façon générale, on préférera faire exprimer le gène d'enveloppe complète, c'est-à-dire le gène env comportant la séquence signal et la séquence transmembranaire de ce gène.
Les premiers essais conduits avec un vecteur viral dans lequel a été cloné le gène codant pour la protéine env totale a conduit à proposer des modifications de ce gène pour améliorer l'immunogénicité des produits d'expression.
On a constaté un relargage important de la protéine env dans les surnageants de culture (relargage qui se produit, probablement in vivo, dans les liquides circulants). Ceci peut être dû à un mauvais accrochage de la protéine dans la membrane cellulaire ; on sait en outre que la présentation des antigènes à la surface des cellules est très importante pour l'induction d'une réponse immunitaire avec le système vaccine. On propose donc de modifier le gène env de façon à améliorer l'ancrage de la glycoprotéine dans la membrane cellulaire.
Pour ce faire, le gène env pourra être modifié au niveau de sa partie codant pour la zone transmembranaire afin de remplacer le codon correspondant à une arginine par un codon correspondant à une isoleucine.
Il existe également une possibilité d'améliorer l'ancrage en remplaçant et/ou en ajoutant b la zone transmembranaire de la protéine env la zone transmembFa- naire d'un virus hétérologue, par exemple la zone transmembranaire de la gp du virus de la rage.
De plus, il se pourrait que la protéine ne soit pas bien assemblée d la suite de son expression- En effet, le peptide signal est assez atypique, et pourrait nuire 3 l'exportation complète de la protéine. C'est pourquoi il est proposé de remplacer et/ou d'ajouter une séquence signal qui provienne d'un virus hétérologue, par exemple la séquence signal de la gp du virus de la rage.
Enfin, il semble que c'est la gp 120, plutôt que la gp 160, qui est relarguée par les cellules. Elle peut, d'une part, fournir un leurre pour le système immunitaire, d'autre part en accord avec des données récentes, aller se fixer sur les cellules T4, ce qui pourrait avoir pour effet d'inactiver les cellules T4 ou de les faire apparaître comme étrangères aux autres cellules T.
Il peut donc être intéressant d'obtenir une protéine env gp 120 qui ne puisse pas être relarguée.
Ceci est effectué en modifiant le gène env entre les séquences codantes de la gp 120 et de la gp 41 pour supprimer le site de clivage par les protéases situé entre la gp 120 et la gp 40.
La première invention concerne principalement l'utilisation de vecteurs viraux pour l'obtention des glycoprotéines codées par le gène env du virus LAV dans des cultures cellulaires. Il s'agit donc dans un premier temps de cellules de nammifères qui ont été infectées par un vecteur viral selon l'invention ou bien qui peuvent contenir l'ADN recombinant correspondant ; parmi ces cellules, il faut citer plus particulièrement les cellules diploldes humaines, des cultures primaires ainsi que les cellules Verso.
Bien entendu, il est possible de prévoir d'autres types de cellules comme cela ressortira d'ailleurs des exemples ci-après
Les glycoprotéines ainsi obtenues peuvent être utilisées après purification pour la réalisation de vaccins.
Les glycoprotéines ainsi obtenues peuvent être utilisées après purification pour la réalisation de vaccins.
Il est également possible de prévoir l'utili- sation directe des vecteurs viraux selon l'invention afin d'effectuer une vaccination, les glycoprotéines étant alors produites in situ et in vivo.
Enfin, la présente invention concerne également les anticorps dressés contre les glycoprotéines précédentes obtenus par infection d'un organisme vivant avec un vecteur viral tel que décrit précédemment et récupération des anticorps induits après un temps déterminé.
Les techniques mises en oeuvre pour l'obtention des glycoprotéines, les cultures cellulaires et les techniques de vaccination sont identiques à celles qui sont pratiquées actuellement avec les vaccins connus et ne seront pas décrites en détail.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des méthodes et exemples suivants.
Trois figures illustrent les exemples
- la figure 1 représente l'action de l'endo-F sur les protéines synthétisées par les recombinants
WTGeLAV9-1 et WTGeLAV1132 et immunoprécipitées grâce à un sérum anti-LAV. Dans cette figure, les poids moléculaires sont donnés en kilodaltons, et on représente par
P, le culot cellulaire
S, le surnageant
u, les produits obtenus sans traitement
e, les produits obtenus après traitement
à ltendo-F.
- la figure 1 représente l'action de l'endo-F sur les protéines synthétisées par les recombinants
WTGeLAV9-1 et WTGeLAV1132 et immunoprécipitées grâce à un sérum anti-LAV. Dans cette figure, les poids moléculaires sont donnés en kilodaltons, et on représente par
P, le culot cellulaire
S, le surnageant
u, les produits obtenus sans traitement
e, les produits obtenus après traitement
à ltendo-F.
- La figure 2 représente la reconnaissance des protéines du virus LAV par les sérums de souris vaccinées avec le recombinant VVTGeLAV9-1. Dans cette figure,
T représente les cas où le sérum utilisé est celui d'un malade atteint de SIDA. Les poids moléculaires sont exprimés en kdaltons.
T représente les cas où le sérum utilisé est celui d'un malade atteint de SIDA. Les poids moléculaires sont exprimés en kdaltons.
- La figure 3 représente l'immunoprécipitation des protéines synthétisées par les virus de la vaccine recombinants portant le gène env. Dans cette figure, les poids moléculaires sont en daltons.
METHODES
Clonages : Maniatis et al., 1982.
Clonages : Maniatis et al., 1982.
Enzymes : utilisées selon les prescriptions du fournisseur.
Mutagénèse localisée=: méthode dérivée de Zoller and Smith, 1983.
Transfert dans la vaccine : Kieny et al., 1984.
Seule différence : les cellules humaines 143B remplacent les cellules LMTK
Préparation du stock de virus
Les cellules primaires de poulet "germ free" sont infectées à 0,01 pfu/cellule pendant 4 jours à une température de 370C (milieu MEM + 5 96 NCS).
Préparation du stock de virus
Les cellules primaires de poulet "germ free" sont infectées à 0,01 pfu/cellule pendant 4 jours à une température de 370C (milieu MEM + 5 96 NCS).
Purification du virus
On effectue une centrifugation du stock de virus ci-dessus pendant 15 minutes à 2 500 tours (Rotor GSA
Sorvall). Le surnageant est mis de côté. On reprend le culot dans un tampon RSB (Tris HCl 10 mM pH 7,4, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM) pendant 15 minutes à 40C. On effectue un broyage au potter, puis une centrifugation pendant 15 minutes à 2 500 tours. Le surnageant est ajouté au précédent puis on effectue un deuxième broyage de la même façon.
On effectue une centrifugation du stock de virus ci-dessus pendant 15 minutes à 2 500 tours (Rotor GSA
Sorvall). Le surnageant est mis de côté. On reprend le culot dans un tampon RSB (Tris HCl 10 mM pH 7,4, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM) pendant 15 minutes à 40C. On effectue un broyage au potter, puis une centrifugation pendant 15 minutes à 2 500 tours. Le surnageant est ajouté au précédent puis on effectue un deuxième broyage de la même façon.
Tous les surnageants sont déposés sur 10 ml de coussin de saccharose 36 % (p/v) (Tris 10 mM pE 8). On effectue une centrifugation pendant 2 heures à 14 000 tours (Rotor SW28, Beckman).
Le culot est repris, dissocié et remis sur un deuxième coussin identique. Le 2ème culot est repris dans 5 ml PBS et chargé sur un gradient 20-40 % de
Saccharose (Tris 10 mM pH 8) (morne rotor). On effectue une centrifugation pendant 45 minutes 32 12 000 tours.
Saccharose (Tris 10 mM pH 8) (morne rotor). On effectue une centrifugation pendant 45 minutes 32 12 000 tours.
On récupère la bande de virus - Elle est culottée par centrifugation pendant 1 heure à 20 000 tours. Le culot est repris dans du Tris 10 mM pH 8.
Immunoprécipitations
On effectue une infection de cellules BHR-21 (bottes de 3 cm de diamètre, 106 cellules par botte, cultivées en G-MEM + 10 % FCS) à 0,2 pfu/cellule pendant 18 heures. Le milieu est décanté et remplacé par 1 ml de milieu sans méthionine et 10 iii de méthionine 35S (Amersham) par boite.
On effectue une infection de cellules BHR-21 (bottes de 3 cm de diamètre, 106 cellules par botte, cultivées en G-MEM + 10 % FCS) à 0,2 pfu/cellule pendant 18 heures. Le milieu est décanté et remplacé par 1 ml de milieu sans méthionine et 10 iii de méthionine 35S (Amersham) par boite.
On ajoute un excès de méthionine non radioactive après 2 heures.
A la fin du marquage, on effectue un grattage des cellules infectées, une centrifugation pendant 1 minute dans une centrifugeuse Eppendorf, une séparation des fractions surnageant et culot, un lavage du culot une fois en tampon PBS, puis une immunoprécipitation et un gel (selon Lathe et al., 1980).
Traitement endo-F
Après immunoprécipitation des protéines marquées par un sérum de malade atteint du SIDA, la fraction protéine-A sepharose est reprise dans
0,2 M phosphate de Na, pH 6,1
0,05 % SDS
0,1 % Nonidet P40
0,1 % Bêta-mercaptoéthanol
0,1 % EDTA pH 8 et bouillie pendant 5 minutes pour dénaturer les protéines.
Après immunoprécipitation des protéines marquées par un sérum de malade atteint du SIDA, la fraction protéine-A sepharose est reprise dans
0,2 M phosphate de Na, pH 6,1
0,05 % SDS
0,1 % Nonidet P40
0,1 % Bêta-mercaptoéthanol
0,1 % EDTA pH 8 et bouillie pendant 5 minutes pour dénaturer les protéines.
On effectue une incubation pendant 20 heures à 370C, avec 4 unités d'Endo-F par ml, puis une précipitation pendant 2 minutes dans la glace avec 1/5 de volume de TCA 100 %. On lave le culot 3 fois à l'acétone 80 %, on ajoute le tampon d'échantillon et on charge sur gel
SDS.
SDS.
Dosage des anticorps par test ELISA
- LAV
Utilisation du test ELAVIA (Pasteur-Diagnostic) avec un deuxième anticorps mouton-antisouris lié à la peroxydase.
- LAV
Utilisation du test ELAVIA (Pasteur-Diagnostic) avec un deuxième anticorps mouton-antisouris lié à la peroxydase.
- Vaccine
Des plaques 96 trous (NUNC) å fond plat sont incubées pendant 18 heures à 370C avec 10 pfu de virus de la vaccine type sauvage en tampon carbonate. Les plaques sont ensuite saturées avec de la gélatine 0,01 %.
Des plaques 96 trous (NUNC) å fond plat sont incubées pendant 18 heures à 370C avec 10 pfu de virus de la vaccine type sauvage en tampon carbonate. Les plaques sont ensuite saturées avec de la gélatine 0,01 %.
Les sérums de souris sont alors adsorbés sur les plaques et on effectue le reste du protocole comme pour l'Elisa
LAV.
LAV.
Lectures à 492 nM.
EXEMPLE 1
Construction des plasmides hybrides
Les tailles combinées des différents éléments nécessaires pour letransfert de la séquence codant pour le gène env dans le génome de W et son expression subséquente sont de l'ordre de plusieurs Kb. Il a donc été jugé nécessaire de minimiser la taille du plasmide de réplication dans E. coli utilisé pour le travail de construction de façon à faciliter les manipulations nécessaires.
Construction des plasmides hybrides
Les tailles combinées des différents éléments nécessaires pour letransfert de la séquence codant pour le gène env dans le génome de W et son expression subséquente sont de l'ordre de plusieurs Kb. Il a donc été jugé nécessaire de minimiser la taille du plasmide de réplication dans E. coli utilisé pour le travail de construction de façon à faciliter les manipulations nécessaires.
Le fragment EindIII (Hin-J) du génome de W contient le gène complet de la thymidine kinase (TK) qui a déjà été utilisé précédemment pour permettre l'échange et la recombinaison de llADN inséré dans le génome de
W (Mackett et al., 1982). Il est important de noter que le transfert d'un insert dans le gène TK du génome de W crée un virus TK déficient qui peut être sélectionné. Il a tout d'abord été nécessaire de produire un plasmide de petite taille portant un site unique Hindili utilisable pour l'intégration du fragment Hin-J
W. En outre, il était nécessaire d'éliminer les séquences de restriction non nécessaires du plasmide de façon à permettre les manipulations suivantes.
W (Mackett et al., 1982). Il est important de noter que le transfert d'un insert dans le gène TK du génome de W crée un virus TK déficient qui peut être sélectionné. Il a tout d'abord été nécessaire de produire un plasmide de petite taille portant un site unique Hindili utilisable pour l'intégration du fragment Hin-J
W. En outre, il était nécessaire d'éliminer les séquences de restriction non nécessaires du plasmide de façon à permettre les manipulations suivantes.
La construction a été amorcée b partir du plasmide pML2 (Lusky et Botchan, 1981) qui est un vecteur dérivé du plasmide pBR322 par délétion spontanée dans lequel le segment entre les nucléotides 1089 et 2491 a été perdu. D'abord la séquence de PstI a été éliminée par insertion du fragment AhaIII-AhaIII de pUC8 (Vieira et Messing, 1982) entre deux sites AhaIII de pML2 en éliminant 19 paires de bases. On a utilisé la méthode du "linker-tailing" (Lathe et al., 1984) pour insérer un linker HindIII entre lessites NruI et EcoRI traité par S1 de ce plasmide, en éliminant le site BamHI.
Ceci conduit à un plasmide de 2049 paires de bases portant le gène bêta-lactamase fonctionnel (conférant la résistance à l'ampicilline) et comportant en outre une origine de réplication active dans E. coli et un site de restriction unique HindIII.
Cette construction a été appelée pTG1H.
Le fragment Hin-J de l'ADN de W portant le gène TK a préalabiement été cloné dans un vecteur provenant de pBR327 (Drillien et Spehner, 1983). Ce fragment de 4,6 Kb a été recloné dans le site HindIII de pTG1. Un clone a été sélectionné dans lequel le gène
TK est situé distalement par rapport au gène codant pour la résistance à l'ampicilline.
TK est situé distalement par rapport au gène codant pour la résistance à l'ampicilline.
Cette construction pTG1H-TK a été utilisée comme vecteur dans l'expérience suivante.
L'étape suivante a été d'isoler un promoteur de W utilisable pour commander l'expression de la séquence codant pour le gène à exprimer. Le promoteur d'un gène précoce codant pour une protéine de 7500 daltons (7,5 K) a déjà été utilisé avec succès dans un but identique (Smith et al., 1983) et on a donc procédé & l'isolement de ce segment.
Le gène 7,5 K est situé sur l'un des plus petits fragments SalI (fragment Sal-S) du génome de W type WR (Venkatasan et al., 1981). Comme les petits fragments sont clonés de façon préférentielle, une grande proportion des clones obtenus par clonage direct de l'ADN de
W type WR coupé par SalI dans le plasmide pBR322 porte le fragment Sal-S. Ce fragment est transféré sur le bactériophage vecteur M13mp701 (voir Kieny et al., 1983), par digestion SalI et religation, en conduisant ainsi au phage M13TGSal-S.
W type WR coupé par SalI dans le plasmide pBR322 porte le fragment Sal-S. Ce fragment est transféré sur le bactériophage vecteur M13mp701 (voir Kieny et al., 1983), par digestion SalI et religation, en conduisant ainsi au phage M13TGSal-S.
Dans ce clone, un site ScaI se trouve immédiatement à proximité de 1'ATG d'initiation du gène 7,5 K.
En aval du gène 7,5 K se trouvent situés des sites uniques BamHI et EcoRI provenant du vecteur. Les sites
BamHI et ScaI sont fusionnés par l'intermédiaire d'un linker BglII 6' -CGATCTG-3' après avoir complété les extrémités générées par digestion BamHI avec le fragment
Klenow de la polymérase de E. coli. Ce procédé élimine le site ScaI mais reconstitue le site BamHI et déplace le site unique EcoRI en aval. En même temps, le site
SalI (AccI) en aval est éliminé, le site Sal I en amont devient donc unique.
BamHI et ScaI sont fusionnés par l'intermédiaire d'un linker BglII 6' -CGATCTG-3' après avoir complété les extrémités générées par digestion BamHI avec le fragment
Klenow de la polymérase de E. coli. Ce procédé élimine le site ScaI mais reconstitue le site BamHI et déplace le site unique EcoRI en aval. En même temps, le site
SalI (AccI) en aval est éliminé, le site Sal I en amont devient donc unique.
Cette construction est appelée M13TG 7,5 K.
A l'intérieur du fragment Hind-J de l'ADN de W se trouvent situés des sites ClaI et EcoRI qui sont séparés par environ 30 paires de bases (Weir et Moss, 1983). Le fragment promoteur de 7,5 K présent dans
M13TG7, 5K est excisé par AccI et EcoRI et cloné entre les sites ClaI et EcoRI de pTG1H-TK pour générer pTG1H-TK-P7,5K.
M13TG7, 5K est excisé par AccI et EcoRI et cloné entre les sites ClaI et EcoRI de pTG1H-TK pour générer pTG1H-TK-P7,5K.
Cette construction conduit au transfert des sites BamHI et EcoRI uniques du vecteur M13 immédiatement en aval de la séquence du promoteur 7,5K.
Ces sites uniques BamHI et EcoRI sont utilisés dans la construction suivante.
Le segment polylinker du bactériophage
M13TG131 (Kieny et al., 1983) est excisé par EcoRI et Bgl Il et inséré entre les sites EcoRI et BamHI du plasmide pTGIH-TK-P7,5K, générant pTG186-poly.
M13TG131 (Kieny et al., 1983) est excisé par EcoRI et Bgl Il et inséré entre les sites EcoRI et BamHI du plasmide pTGIH-TK-P7,5K, générant pTG186-poly.
Dans cette construction, 10 sites de restriction sont disponibles pour le clonage d'un gène étranger sous le contrôle de P7,5K.
EXEMPLE 2
Construction du plasmide portant la
séquence env.
Construction du plasmide portant la
séquence env.
Afin d'obtenir une séquence codante pour env, on effectue tout d'abord l'assemblage des deux segments proviraux clonés PJ19-6 et PJ19-13.
De façon à assurer une traduction adéquate du mARN de env, la séquence de nucléotides autour du site d'initiation de la traduction présumée du gène env a été modifiée pour s'adapter à la séquence consensus des gènes eucaryotes et ceci par une mutagénèse dirigée avec un oligonucléotide au voisinage de la position 5767.
Les plasmides PJ19-13 et PJ 19-6 con- tiennent des fragments HindIIIdu génome proviral de LAV comprenant les nucléotides 1258 à 1698 et 1698 à 9173 respectivement.
Un fragment EcoRI-Rpn1 de PJ19-13 (contenant l'ATG d'initiation de env) a été inséré dans le phage M13TG130 et on a effectué une mutagénèse dirigée avec un oligonucléotide (séquence 5'CTCTCATTGTCACTGCAGTCTGCTCTTTC), pour introduire un site PstI en amont du codon d'initiation de la traduction de env (position 5767) et afin de substituer le G b la position -3 par un A. Le fragment muté a été introduit ensuite entre les sites EcoRI et KpnI du plasmide pTGl-POLY (qui est un mini plasmide de 2,1 kb similaire b pTG1H mais qui contient un segment polylinker de M13TG131.
Le fragment tEFI-HindIII provenant de PJ 19-13 a été ensuite cloné dans le même plasmide (entre KpnI et HindIII), suivi par un fragment HindIII-XhoI de PJ 19-6 (entre indIfI et SalI) pour générer une séquence codante env complète flanquée par deux sites PstI (plasmide pTG1124).
L'introduction de ces deux sites de restriction
PstI permet une manipulation plus aisée de 1'ADN du gène env dans la suite de la construction. Comme cela a été indiqué précédemment, l'expression d'une protéine été rologue dans le virus de la vaccine nécessite que la séquence codante soit alignée avec une séquence de promoteur de la vaccine et soit insérée dans un segment non essentiel de l'ADN de la vaccine. Cet ADN situé de part et d'autre permet la recombinaison avec le génome de la vaccine in vivo par une double recombinaison réciproque, qui transfère la séquence codante et le promoteur accompagnant dans le génome de la vaccine.
PstI permet une manipulation plus aisée de 1'ADN du gène env dans la suite de la construction. Comme cela a été indiqué précédemment, l'expression d'une protéine été rologue dans le virus de la vaccine nécessite que la séquence codante soit alignée avec une séquence de promoteur de la vaccine et soit insérée dans un segment non essentiel de l'ADN de la vaccine. Cet ADN situé de part et d'autre permet la recombinaison avec le génome de la vaccine in vivo par une double recombinaison réciproque, qui transfère la séquence codante et le promoteur accompagnant dans le génome de la vaccine.
Pour ce faire, le fragment PstI-PstI mentionné précédemment a été cloné dans le site PstI de pTG186-POLY.
On obtient ainsi un plasmide dénommé pTG1125.
Le plasmide pTG186-POLY peut être généré à partir du plasmide pTG188 digéré par PstI et religué par la ligase T4.
Le plasmide pTG188 a été déposé le 20 juin 1985 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de 1'Institut Pasteur - 28, rue du Docteur Roux - 75015
PARIS sous le numéro suivant :
E. Coli SKpTG188 = n0 I 458.
PARIS sous le numéro suivant :
E. Coli SKpTG188 = n0 I 458.
Le transfert de la séquence codante du gène env et du promoteur accompagnant dans le génome de la vaccine est effectué comme suit.
EXEMPLE 3
Clonage dans le virus de la vaccine
pour générer W.TG.e LAV 9-1
La stratégie décrite par Smith et colt, (1983) repose sur l'échange in vivo entre un plasmide portant un insert dans le gène W TK et le génome viral de type sauvage de façon à inactiver le gène TK porté par le virus. Les virus TIC peuvent être sélectionnés par étalement sur une lignée cellulaire (TK-négative) en présence de 5-bromodéoxyuridine (5BUDR) (Mackett et coll., 1982). La thymidine kinase phosphoryle le 5BUDR en 5'-monophosphate, qui est ensuite converti en triphosphate. Ce composé est un analogue de dTTP et son incorporation dans l'ADN bloque le développement correct du virus.Un virus TIC peut néanmoins répliquer son ADN normalement et il conduit à des plages virales visibles dans une lignée cellulaire également TK-.
Clonage dans le virus de la vaccine
pour générer W.TG.e LAV 9-1
La stratégie décrite par Smith et colt, (1983) repose sur l'échange in vivo entre un plasmide portant un insert dans le gène W TK et le génome viral de type sauvage de façon à inactiver le gène TK porté par le virus. Les virus TIC peuvent être sélectionnés par étalement sur une lignée cellulaire (TK-négative) en présence de 5-bromodéoxyuridine (5BUDR) (Mackett et coll., 1982). La thymidine kinase phosphoryle le 5BUDR en 5'-monophosphate, qui est ensuite converti en triphosphate. Ce composé est un analogue de dTTP et son incorporation dans l'ADN bloque le développement correct du virus.Un virus TIC peut néanmoins répliquer son ADN normalement et il conduit à des plages virales visibles dans une lignée cellulaire également TK-.
Le virus de la vaccine se propage dans le cytoplasme des cellules infectées plutôt que dans leur noyau. C'est pourquoi il n'est pas possible de tirer avantage de la machinerie de réplication et de transcription de l'ADN de l'hôte et il est nécessaire que le virion possède les composants pour l'expression de son génome. L'ADN de W purifié est non infectieux.
Afin de générer les recombinants, il est nécessaire d'effectuer simultanément l'infection cellulaire avec du virion W et une transfection avec le segment d'ADN cloné qui présente de l'intérêt. Toutefois, la génération des recombinants est limitée à la petite proportion des cellules qui sont compétentes pour la transfection par 1'ADN. C'est pour cette raison qu'il a été nécessaire de mettre en oeuvre une stratégie de *congruence" indirecte pour réduire le bruit de fond des virus parentaux non-recombinants. Ceci a été effectué en utilisant comme virus infectieux vivant un mutant thermosensible (ts) de la vaccine qui n'est pas capable de se propager à une température non permissive de 39,50C (Drillien et Spehner, 1983).Lorsque les cellules sont infectées par un mutant ts dans des conditions non permissives et transfectées avec l'ADN d'un virus de type sauvage, la multiplication virale interviendra seulement dans les cellules qui sont compétentes pour la transfection et dans lesquelles une recombinaison entre l'ADN viral sauvage et le génome du virus ts aura eu lieu ; aucun virus ne se multipliera dans les autres cellules, en dépit du fait qu'elles ont été infectées.
Si un plasmide recombinant contenant un fragment de l'ADN de vaccine tel que pTG1125 est inclus dans le mélange de transfection, à la concentration appropriée, avec l'ADN du type sauvage, il est également possible d'obtenir qu'il participe à la recombinaison homologue avec l'ADN de la vaccine dans les cellules compétentes.
Des monocouches de cellules primaires de fibroblastes d'embryons de poulets (CEF) sont infectées à 330C avec W-Copenhague ts7 (0,1 pfu/cellule) et transfectées avec un coprécipité au phosphate de calcium de l1ADN du virus de type sauvage W-Copenhague (50 ng/106 cellules) et le plasmide recombinant (50 ng/106 cellules)
Après incubation pendant 2 heures à une température qui ne permet pas le développement du virus ts (39,50C), les cellules sont incubées de nouveau pendant 48 heures à 39,50C. Des dilutions de virus ts+ sont utilisées pour réinfecter une monocouche de cellules de souris L-TIC à 370C qui sont ensuite incubées en présence de 5BUDR (150 g/ml). Différentes plaques de virus TIC sont obtenues à partir de ces cellules qui ont reçu le plasmide recombinant, tandis que les cultures contrôles sans plasmide ne montrent pas de plaques visibles. Les virus TIC sont ensuite sous-clonés par une deuxième sélection en présence de 5BUDR.
Après incubation pendant 2 heures à une température qui ne permet pas le développement du virus ts (39,50C), les cellules sont incubées de nouveau pendant 48 heures à 39,50C. Des dilutions de virus ts+ sont utilisées pour réinfecter une monocouche de cellules de souris L-TIC à 370C qui sont ensuite incubées en présence de 5BUDR (150 g/ml). Différentes plaques de virus TIC sont obtenues à partir de ces cellules qui ont reçu le plasmide recombinant, tandis que les cultures contrôles sans plasmide ne montrent pas de plaques visibles. Les virus TIC sont ensuite sous-clonés par une deuxième sélection en présence de 5BUDR.
Une double recombinaison réciproque correcte entre le plasmide hybride pTG1125 et le génome de W aboutit b l'échange du gène TK portant l'insert avec le gène TK du virus, les recombinants devenant ainsi TIC
Les ADN purifiés à partir des différents virus recombinants TIC sont digérés par Hindi il et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose. Les fragments d'ADN sont transférés sur un filtre de nitrocellulose selon la technique décrite par Southern (1975). Le filtre est ensuite hybridé avec le plasmide pTG1125 nicktranslaté au 32p. Après lavage du filtre, ce dernier est fluorographié et des bandes de 3.85, 2.9, 0.8 Kb sont visibles sur l'autoradiographie quand le virus vaccine a incorporé le gène env du LAV.L'un de ces recombinants W .TG. eLAV 9-1 a été sélectionné pour les études suivantes.
Les ADN purifiés à partir des différents virus recombinants TIC sont digérés par Hindi il et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose. Les fragments d'ADN sont transférés sur un filtre de nitrocellulose selon la technique décrite par Southern (1975). Le filtre est ensuite hybridé avec le plasmide pTG1125 nicktranslaté au 32p. Après lavage du filtre, ce dernier est fluorographié et des bandes de 3.85, 2.9, 0.8 Kb sont visibles sur l'autoradiographie quand le virus vaccine a incorporé le gène env du LAV.L'un de ces recombinants W .TG. eLAV 9-1 a été sélectionné pour les études suivantes.
EXEMPLE 4
Protéine env synthétisée à partir
d'un virus recombinant vaccine-LAV
Pour mettre en évidence l'expression du gène env du LAV à partir du virus vaccine hybride, on infecte des cellules de rongeur, BHK21, qui sont cultivées dans un milieu G-MEM + 10 s6 de sérum de veau foetal avec ledit recombinant W.TG. eLAV 9-1.
Protéine env synthétisée à partir
d'un virus recombinant vaccine-LAV
Pour mettre en évidence l'expression du gène env du LAV à partir du virus vaccine hybride, on infecte des cellules de rongeur, BHK21, qui sont cultivées dans un milieu G-MEM + 10 s6 de sérum de veau foetal avec ledit recombinant W.TG. eLAV 9-1.
Une monocouche semi-confluente fraîche (106 cellules) est infectée avec 0,2 pfu/cellule et incubée pendant 18 heures.
Le milieu est ensuite éliminé et on ajoute un milieu à faible teneur en méthionine (1 ml pour 106 cellules) supplémenté avec 10 Fl/ml de méthionine 35
Les cellules sont incubées å 370C et les protéines marquées sont collectées par centrifugation. Après sepa- ration en culot et surnageant, les protéines .8eut incubées avec un sérum appartenant b un patient atteint de SIDA.
Les cellules sont incubées å 370C et les protéines marquées sont collectées par centrifugation. Après sepa- ration en culot et surnageant, les protéines .8eut incubées avec un sérum appartenant b un patient atteint de SIDA.
Les protéines réagissant avec le sérum sont récupérées par adsorption sur une résine protéine A-sépharose et étalées par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide
SDS et autoradiographiées selon une technique décrite par
Lathe et al., 1980. Les autoradiographies montrent que le sérum du patient atteint du SIDA lie spécifiquement trois protéines des extraits cellulaires infectés (le résultat est identique ou similaire à celui obtenu avec d'autres sérums de patients). Les poids moléculaires apparents de 160, 120 et 41 Kd suggèrent l'équivalence avec les bandes gp 160, gp 120 et gp 41 identifiées par des sérums de malades atteints du SIDA, dans une préparation de glycoprotéine env. authentique et dans des extraits de cellules infectées par le virus LAV.Cette observation que trois protéines sont exprimées à partir du vecteur recombinant portant seulement la séquence codant pour le gène env du LAV supporte l'hypothèse que la gp 120 et gp 41 sont générées par clivage protéolytique du produit de traduction primaire gp 160.
SDS et autoradiographiées selon une technique décrite par
Lathe et al., 1980. Les autoradiographies montrent que le sérum du patient atteint du SIDA lie spécifiquement trois protéines des extraits cellulaires infectés (le résultat est identique ou similaire à celui obtenu avec d'autres sérums de patients). Les poids moléculaires apparents de 160, 120 et 41 Kd suggèrent l'équivalence avec les bandes gp 160, gp 120 et gp 41 identifiées par des sérums de malades atteints du SIDA, dans une préparation de glycoprotéine env. authentique et dans des extraits de cellules infectées par le virus LAV.Cette observation que trois protéines sont exprimées à partir du vecteur recombinant portant seulement la séquence codant pour le gène env du LAV supporte l'hypothèse que la gp 120 et gp 41 sont générées par clivage protéolytique du produit de traduction primaire gp 160.
La séquence codant pour env conduit à un produit de traduction primaire d'environ 90 kDA alors que le précurseur de env obtenu par le procédé précédent présente un poids moléculaire apparent d'environ 160 kDA.
Cette différence est attribuée à une glycosylation très importante. Par digestion avec l'endoglycosydase F qui élimine les groupes glycosyl, on a pu mettre en évidence une bonne corrélation entre les produits obtenus par la présente invention et les produits prévus (figure 1).
EXEMPLE 5
Mise en évidence des anticorps anti
env chez des souris vaccinées avec
le virus W.TG.e LAV 9-1
Des souris BalbF mâles de 5 semaines sont vaccinées par injection sous-cutanée de 5.107 pfu de virus W.TG.e LAV 9-1 par animal. Elles reçoivent une injection de rappel avec la même dose après 2 semaines, et subissent une prise de sang 1, 2 et 4 semaines après le rappel. La présence d'anticorps dirigés contre des déterminants du virus LAV et du virus de la vaccine dans leurs sérums est recherchée.
Mise en évidence des anticorps anti
env chez des souris vaccinées avec
le virus W.TG.e LAV 9-1
Des souris BalbF mâles de 5 semaines sont vaccinées par injection sous-cutanée de 5.107 pfu de virus W.TG.e LAV 9-1 par animal. Elles reçoivent une injection de rappel avec la même dose après 2 semaines, et subissent une prise de sang 1, 2 et 4 semaines après le rappel. La présence d'anticorps dirigés contre des déterminants du virus LAV et du virus de la vaccine dans leurs sérums est recherchée.
Tous les animaux vaccinés donnent des sérums capables de réagir avec le virus de la vaccine dans un test ELISA. Par contre, la réponse en test ELISA contre le virus LAV est faible et peu reproductible. Pour améliorer la sensibilité des tests, une technique de "western blot" a été utilisée. Cette méthode permet de mettre en évidence les anticorps capables de réagir avec les protéines du virus LAV après que celles-ci aient été dénaturées au SDS dans un gel d'électrophorèse et transférées sur une membrane de nitrocellulose. Dans cette expérience, les membranes de nitrocellulose employées sont celles du kit LAV-BLOT vendu par Pasteur-Diagnostic et sur lesquelles les protéines du virus LAV sont déjà fixées. Ces membranes sont découpées en bandes, et chaque bande est incubée avec le sérum des souris vaccinées (dilution au 1/20).Un deuxième anticorps (mouton antisouris) lié à la peroxydase permet de visualiser les protéines du virus LAV qui ont fixé des anticorps de souris.
Plusieurs sérums (12/27) donnent une réaction spécifique avec une protéine de poids moléculaire autour de 160 kDA, correspondant à la gp 160 de env (figure 2).
Dans un certain nombre de sérums, on observe également une réaction avec la protéine gp 41. Il faut noter que les sérums de quelques souris produisent en Western blot des signaux correspondant b des protéines non-identifi8es de la préparation de virus LAV fixée sur les membranes.
EXEMPLE 6
Construction de pTG1128
Ce plasmide pTG1128 est identique au plasmide 1125 b ceci près que la séquence codant pour la zone transmembranaire a été mutée pour remplacer l'arginine par une isoleucine, ceci afin d'améliorer l'accrochage de la protéine dans la membrane cellulaire.
Construction de pTG1128
Ce plasmide pTG1128 est identique au plasmide 1125 b ceci près que la séquence codant pour la zone transmembranaire a été mutée pour remplacer l'arginine par une isoleucine, ceci afin d'améliorer l'accrochage de la protéine dans la membrane cellulaire.
Le fragment HindIII-BamHI de pTG1124 contenant la zone transmembranaire de env décrit à l'exemple 2 est inséré dans le phage M13 TG131 après une digestion HindîlI-
BamHI. On obtient ainsi un phage M13 TG154.
BamHI. On obtient ainsi un phage M13 TG154.
On effectue ensuite sur ce phage M13 TG154 une mutagénèse localisée destinée à remplacer le codon codant pour l'arginine par un codon codant pour l'isoleucine. On utilise pour ce faire l'oligonucléotide suivant
5' GGTTTAATAATAGTTTT 3'.
5' GGTTTAATAATAGTTTT 3'.
On obtient ainsi le phage M13 TG155, les séquences ayant été modifiées comme suit
Gly Leu Arg Ile Val
Séquence originale : GGT TTA AGA ATA GTT
Séquence mutée : GGT TTA ATA ATA GTT
Ile
Le fragment BamHI-lIindIII ainsi muté est transféré de M13 TG155 dans le plasmide pTG1124 dans des sites équivalents pour donner le plasmide pTG1127 qui reconstitue le gène env comme précédemment sauf que le codon de l'arginine a été remplacé par un codon isoleucine.
Gly Leu Arg Ile Val
Séquence originale : GGT TTA AGA ATA GTT
Séquence mutée : GGT TTA ATA ATA GTT
Ile
Le fragment BamHI-lIindIII ainsi muté est transféré de M13 TG155 dans le plasmide pTG1124 dans des sites équivalents pour donner le plasmide pTG1127 qui reconstitue le gène env comme précédemment sauf que le codon de l'arginine a été remplacé par un codon isoleucine.
Comme cela a été décrit dans l'exemple 1, le fragment PstI-PstI de pTG1127 est cloné dans le site PstI du plasmide pTG186-POLY pour donner le plasmide pTG1128.
EXEMPLE 7
Construction du plasmide pTG1130
Dans ce plasmide, la séquence codant pour la zone transmembranaire de la glycoprotéine rabique est fusionnée avec le début de la séquence codant pour la partie hydrophobe de la glycoprotéine env.
Construction du plasmide pTG1130
Dans ce plasmide, la séquence codant pour la zone transmembranaire de la glycoprotéine rabique est fusionnée avec le début de la séquence codant pour la partie hydrophobe de la glycoprotéine env.
La zone transmembranaire de la glycoprotéine rabique provient d'un fragment BamHI-PstI du phage
M13 TGRG751.
M13 TGRG751.
Ce fragment est cloné dans le phage M13 TG154 entre les sites BamHI et PstI (voir exemple précédent).
On obtient ainsi le phage M13 TG156.
On effectue ensuite une mutagénèse localisée sur M13 TG156 pour fusionner en phase les séquences env et rage avec un oligonucléotide en formant une boucle 5' GCTGTGGTATATAAAATATGTATTACTGAGTG 3'
Tyr Leu Lys Ile Phe Gly Lys Tyr Val
Tyr Leu Lys Ile Phe Gly Lys Tyr Val
On obtient ainsi le phage M13 TG157.
La zone transmembranaire (tm) de la glycoprotéine rabique qui vient d'être fusionnée avec le gène env est ensuite transférée dans le plasmide pTG1124.
Pour ce faire, on clone le fragment HindîlI- BglII de M13 TG157 dans pTG1124 dont on a effectué une restriction HindIII-BamHI (ceci détruit les sites BamHI et BglII).
Le site BgllI de M13 TG157 provient du fragment rage
BamHI BglII
t.m. PstI
On obtient ainsi le plasmide pTG1126.
BamHI BglII
t.m. PstI
On obtient ainsi le plasmide pTG1126.
Comme précédemment le fragment PstI-PstI de pTG1126 est cloné dans le site PstI de pTG 186-POLY pour donner le plasmide pTG1130.
EXEMPLE 8
Construction de pTG1131
L'objectif de la construction de ce plasmide est de fusionner la séquence signal du gène env et la séquence signal de la glycoprotéine rabique.
Construction de pTG1131
L'objectif de la construction de ce plasmide est de fusionner la séquence signal du gène env et la séquence signal de la glycoprotéine rabique.
La séquence signal de la glycoprotéine de la rage est prélevée à partir du plasmide pTG155 PRO sous forme d'un fragment BglII-HindIII qui est cloné dans les sites PstI-HindIII de M13 TG130 grâce à un adaptateur simple brin ayant la séquence suivante
54 GATCTGCA 3'
On obtient ainsi le plasmide M13 TG158.
54 GATCTGCA 3'
On obtient ainsi le plasmide M13 TG158.
Le transfert du peptide signal de env dans
M13 TG158 est ensuite réalisé afin de fusionner ce dernier avec le gène codant pour le peptide signal de la glycoprotéine rabique.
M13 TG158 est ensuite réalisé afin de fusionner ce dernier avec le gène codant pour le peptide signal de la glycoprotéine rabique.
On effectue pour ce faire le clonage du fragment
PstI traité à la nucléase S1 puis à la Klenow et KpnI dans M13 TG158 coupé par HindIII traité à la Klenow-KeflI
EcoRI KpnI PstO/HindIIIO Pst+/BglII +
signal signal env rage
PstI traité à la nucléase S1 puis à la Klenow et KpnI dans M13 TG158 coupé par HindIII traité à la Klenow-KeflI
EcoRI KpnI PstO/HindIIIO Pst+/BglII +
signal signal env rage
On obtient ainsi le plasmide M13 TG159.
On transfère le bloc KpnI-PstI de M13 TG159 dans M13 TG131 pour obtenir le plasmide M13 TG160.
Pst+/BglII+ Hind /Pst kpnI EcoRI
signal signal rage env
signal signal rage env
Une mutagénèse localisée sur M13 TG160 permet de fusionner en phase les séquences env et glycoprotéine rabique (en formant une boucle). Ceci grâce à l'oligonucléotide
5' GACCCACAATTTTTCTGTAATAGGGAATTTCCCAAA 3'
Signal rage env
5' GACCCACAATTTTTCTGTAATAGGGAATTTCCCAAA 3'
Signal rage env
On obtient ainsi le phage M13 TG161.
Le fragment PvuII-KpnI de M13 TG161 est alors cloné dans pTG1126 coupé par EcoRI traité à la Klenow-RpnI (le site PvuII de M13 TG161 provient de M13 dans la région située en amont du polylinker). Ceci conduit au plasmide pTG1129.
Par clonage du fragment PstI-PstI de pTGii2p dans le plasmide pTG186-POLY coup par PstI, on obtient le plasmide pTG1131.
EXEMPLE 9
Préparation du plasmide pTG1132
Par clonage du fragment PstI-PstI de pTG1128 dans le site PstI de M13 TG131, on obtient le plasmide
M13 TG162.
Préparation du plasmide pTG1132
Par clonage du fragment PstI-PstI de pTG1128 dans le site PstI de M13 TG131, on obtient le plasmide
M13 TG162.
On effectue ensuite une mutagénèse localisée grâce à l'oligonucléotide
5' ATTCCCACTGCTTAGTATTCATTCTGCACCACTC 3'
Ceci permet de placer un codon stop à la fin de la gp120. Les séquences obtenues sont les suivantes
Séquence originale : CAG
5' ATTCCCACTGCTTAGTATTCATTCTGCACCACTC 3'
Ceci permet de placer un codon stop à la fin de la gp120. Les séquences obtenues sont les suivantes
Séquence originale : CAG
GCA GTG
site de clivage présumé
de la gp 120 Q E Y ###
Séquence mutée : CAG AAT GAA TAC TAA GCA GTG
On obtient ainsi le plamide M13 TG168.
site de clivage présumé
de la gp 120 Q E Y ###
Séquence mutée : CAG AAT GAA TAC TAA GCA GTG
On obtient ainsi le plamide M13 TG168.
Par reclonage du fragment PstI de M13 TG168 dans le site de PstI de pTG186-POLY, on obtient le plasmide pTG1132.
EXEMPLE 10
Construction du plasmide pTG1133
Par mutagénèse localisée sur M13 TG162 gråce b l'oligonucléotide suivant
5' ATTCCCACTGCTTGGTGTTCATTCTGCACCACTC 3' on obtient un plasmide dans lequel le site de clivage séparant gp 120 et gp 40 a été détruit.
Construction du plasmide pTG1133
Par mutagénèse localisée sur M13 TG162 gråce b l'oligonucléotide suivant
5' ATTCCCACTGCTTGGTGTTCATTCTGCACCACTC 3' on obtient un plasmide dans lequel le site de clivage séparant gp 120 et gp 40 a été détruit.
Les séquences modifiées sont les suivantes séquence originale : CAG AGA GAA AAA AGA
GCA GTG
R E K R
A V
site de clivage séquence mutée : CAG AAT GAA CAC CAA GCA
Q E H N
On obtient ainsi le plasmide pTG165.
R E K R
A V
site de clivage séquence mutée : CAG AAT GAA CAC CAA GCA
Q E H N
On obtient ainsi le plasmide pTG165.
Par reclonage du fragment PstI-PstI de M13 TG165 dans pTG1 86-POLY au site PstI, on obtient le plasmide pTG1133.
EXEMPLE 11
Construction du plasmide pTG1134
Par clonage du fragment PstI-PstI de pTG7131 dans le site PstI de M13 TG131, on obtient le plasmide
M13 TG163.
Construction du plasmide pTG1134
Par clonage du fragment PstI-PstI de pTG7131 dans le site PstI de M13 TG131, on obtient le plasmide
M13 TG163.
On effectue une mutagénèse localisée sur
M13 TG163 afin de détruire le site de clivage de la qp120.
M13 TG163 afin de détruire le site de clivage de la qp120.
Pour ce faire, on utilise un oligonucléotide
5' ATTCCCACTGCTTGATGTTCATTCTGCACCACTC 3'
Ceci permet de modifier les séquences de la façon suivante
R E X R Séquence originale ; CAG AGA GAA AAA AGA
5' ATTCCCACTGCTTGATGTTCATTCTGCACCACTC 3'
Ceci permet de modifier les séquences de la façon suivante
R E X R Séquence originale ; CAG AGA GAA AAA AGA
GCA GTG
Séquence mutée : CAG AAT GAA CAT CAA GCA
Q E H N
On obtient dans ces conditions le phage
M13 TG166.
Séquence mutée : CAG AAT GAA CAT CAA GCA
Q E H N
On obtient dans ces conditions le phage
M13 TG166.
Par reclonage du fragment PstI-PstI de ce phage M13 TG166 dans le site PstI de pTG186-POLY, on obtient le plasmide pTG1134.
EXEMPLE 12
Immunoprécipitation des protéines
synthétisées par les virus recombi
nants W.TG. eLAV.
Immunoprécipitation des protéines
synthétisées par les virus recombi
nants W.TG. eLAV.
En opérant comme cela a été décrit précédemment pour le plasmide pTG1125, on obtient les vecteurs vaccine hybrides correspondant: aux différents plasmides préparés précédemment.
Ces vecteurs viraux seront appelés respectivement
W.TG. eLAV 1128
W .TG. eLAV 1130
W.TG. eLAV 1131
W.TG. eLAV 1132
W .TG. eLAV 1133
W .TG. eLAV 1134.
W.TG. eLAV 1128
W .TG. eLAV 1130
W.TG. eLAV 1131
W.TG. eLAV 1132
W .TG. eLAV 1133
W .TG. eLAV 1134.
Les protéines obtenues comme cela a été décrit précédemment sont testées par immuno-précipitation (figure 3).
L'ensemble des immuno-précipites fait apparaître pour le virus 1125, une immuno-précipitation correspondant b la gp160, la gpl20 et la gp41.
fl en va de même pour le virus 1128.
Le virus 1130 montre également une gap160 et une gp120.
La protéine correspondant b la gp41 a un poids légèrement inférieur dû à la modification de son extrémité C-terminale.
Le virus 1131 présente un spectre sensiblement identique à celui obtenu pour le virus 1130.
Le virus 1132 ne présente pas bien entendu de protéine correspondant à la gp41. La protéine de 105 kDA présente dans les culots est une isoforme de la gp120 (glycosylation différente).
En ce qui concerne le virus 1133, celui-ci présente bien des protéines 160, 120 et 41 mais les traces des protéines 120 et des protéines 41 sont beaucoup plus faibles que dans les autres spectres.
Il en va de même pour le virus 1134 avec lequel la gp41 présente également un poids moléculaire plus faible mais pour lequel il est clair que le clivage s'est fait avec une cinétique plus lente que celle-des virus W .TG.1125 à 1131.
Les différents plasmides et phages M13 sont décrits notamment dans les demandes de brevet suivants :
M13 TG131 : Kieny et al., 1983
M13 TGRG151 : WO 83/04052 pTG155 PRO : FR 84 06499
M13 TG130 : Kieny et al., 1983.
M13 TG131 : Kieny et al., 1983
M13 TGRG151 : WO 83/04052 pTG155 PRO : FR 84 06499
M13 TG130 : Kieny et al., 1983.
Les plasmides suivants ont été déposés le 16 novembre 1984 à la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes de l'institut Pasteur et sont décrits dans le brevet GB-A-84 29099 :
PJ 19-6 : CNCM NO 366-I
PJ 19-13 : CNCM NO 367-I.
Microorganismes de l'institut Pasteur et sont décrits dans le brevet GB-A-84 29099 :
PJ 19-6 : CNCM NO 366-I
PJ 19-13 : CNCM NO 367-I.
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Spehner, D., Skory, S., Schmitt, D., Wiktor, T.,
Koprowski, H. and Lecocq, J.P. 1984. Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus.
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N. and Lecocq, J.P. 1980. Cell-free synthesis of biologically active heat-stable enterotoxin of Escherichia coli from a cloned gene. nature 284 : 473-474.
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Curtis, P., Lecocq, J.P. (1984) J. Mol. Appl. Genet., vol. 2, 331-342.
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Nature 302, 490-495.
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Moldave, eds.) 100 : 468-500.
Moldave, eds.) 100 : 468-500.
Claims (26)
1. - Vecteur viral caractérisé en ce qu'il comporte au moins
- une partie du génome d'un virus,
- un gène codant pour l'une des glycoprotéines (gp) de l'enveloppe du virus responsable du SIDA,
- ainsi que les éléments assurant l'expression de cette glycoprotéine dans des cellules.
2. - Vecteur viral selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie du génome d'un virus est une partie du génome d'un poxvirus.
3. - Vecteur viral selon la revendication 2, caractérisé en ce que le poxvirus est la vaccine.
4. - Vecteur viral selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le gène codant pour l'une des gp de l'enveloppe est le gène codant pour la gp 160.
5. - Vecteur viral selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le gène codant pour l'une des gp est le gène codant pour la gp 41.
6. - Vecteur viral selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le gène codant pour l'une des gp est le gène codant pour la gp 120.
7. - Vecteur viral selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le gène codant pour la gp de l'enveloppe du virus responsable du S.I.D.A. est précédé de la séquence signal S du gène env.
8. - Vecteur viral selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le gène codant pour la gp de l'enveloppe du virus responsable du S.I.D.A. est suivi de la séquence transmembranaire tm du gène env.
9. - Vecteur viral selon les revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence signal et/ou une séquence transmembranaire provenant d'un virus hétérologue.
10. - Vecteur viral selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence signal et/ou la séquence transmembranaire provenant d'un virus hétérologue provient du virus de la rage.
11. - Vecteur viral selon les revendications 1 à 3 et 7 à 10, caractérisé en ce que le gène codant pour l'une des gp est le gène env total comportant depuis l'extrémité 5'
- la séquence signal du gène env,
- la gp 120,
- la gp 40,
- la zone transmembranaire (tm) du gène env.
12. - Vecteur viral selon la revendication 11, caractérisé en ce que le gène codant pour le gène env total est le gène env du virus LAV.
13. - Vecteur viral selon les revendications 7 à 12, caractérisé en ce que la zone tm a été mutée pour remplacer le codon Arg par un codon Ile.
14. - Vecteur viral selon les revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le gène env a subi une mutation pour supprimer le site de clivage par les protéases entre la gp 120 et la gp 40.
15. - Vecteur viral selon l'une des revendications à à 14, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour la ou les gp est sous la dépendance d'un promoteur d'un gène du proxvirus.
16. - Vecteur viral selon la revendication 15, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur du gène de la vaccine.
17. - Vecteur viral selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour la ou les gp est sous le contrôle du promoteur du gène de la protéine 7,5 K de la vaccine.
18. - Vecteur viral selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que la séquence codant pour la ou les gp est clonée dans le gène TIC de la vaccine.
19. - Vecteur viral choisi parmi
- W.TG. eLAV 1125,
- W.TG. eLAV 1128,
- W.TG. eLAV 1130,
- W.TG. eLAV 1131,
- W.TG. eLAV'1132,
- W.TG. eLAV 1133,
- W .TG. eLAV 1134.
20. - ADN recombinant correspondant à un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 19.
21. - Culture de cellules de mammifères infectées par un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 19 ou comportant un ADN selon la revendication 20.
22. - Procédé de préparation de glycoprotéines d'enveloppe de virus responsable du S.I.D.A., caractérisé en ce que l'on cultive des cellules selon la revendication 21 et que l'on récupère les glycoprotéines produites.
23. - Glycoprotéines d'enveloppe de virus responsable du S.I.D.A. obtenues par mise en oeuvre du procédé selon la revendication 22.
24. - Glycoprotéine selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'elle comporte, en outre, une partie de glycoprotéine de la rage.
25. - Vaccin caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 19 et/ou par les glycoprotéines selon l'une des revendications 23 ou 24.
26. - Anticorps dressés contre les glycoprotéines d'enveloppe du virus responsable du S.I.D.A., caractérisés en ce qu'on inocule un organisme vivant avec un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 19 ou avec les glycoprotéines obtenues selon les revendications 23 ou 24 et en ce qu'on récupère les anticorps formés après un temps déterminé.
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| FR8615106A FR2606029B2 (fr) | 1986-04-08 | 1986-10-29 | Vecteur viral et adn recombinant codant pour une glycoproteine du virus agent causal du s.i.d.a., culture cellulaire infectee par ce vecteur, procede de preparation de la glycoproteine, glycoproteine obtenue, vaccin et anticorps obtenus |
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| JP7277533A JP2743164B2 (ja) | 1986-04-08 | 1995-10-25 | Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質をコードするウィルスベクター及び組換えｄｎａ、該ベクターにより感染された細胞培養物、並びに抗体 |
| JP9131138A JPH1059868A (ja) | 1986-04-08 | 1997-05-21 | Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質からなるワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| FR8605043A FR2596771B1 (fr) | 1986-04-08 | 1986-04-08 | Vecteur viral et adn recombinant codant pour une glycoproteine du virus agent causal du s.i.d.a., culture cellulaire infectee par ce vecteur, procede de preparation de la glycoproteine, glycoproteine obtenue, vaccin et anticorps obtenus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2596771A1 true FR2596771A1 (fr) | 1987-10-09 |
| FR2596771B1 FR2596771B1 (fr) | 1988-10-21 |
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ID=9334043
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| FR8605043A Expired FR2596771B1 (fr) | 1986-04-08 | 1986-04-08 | Vecteur viral et adn recombinant codant pour une glycoproteine du virus agent causal du s.i.d.a., culture cellulaire infectee par ce vecteur, procede de preparation de la glycoproteine, glycoproteine obtenue, vaccin et anticorps obtenus |
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|---|---|
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-
1986
- 1986-04-08 FR FR8605043A patent/FR2596771B1/fr not_active Expired
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BIO/TECHNOLOGY, vol. 4, no. 3, mars 1986, page 166, Nature Publishing Co.; H.BIALY: "IL-2 crystals, TNF tests, and aids vaccines" * |
| NATURE, vol. 312, no. 5990, 8 novembre 1984, pages 163-166, Reading, Berks, GB; M.P.KIENY et al.: "Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus" * |
| SCIENCE, vol. 227, 1 février 1985, pages 484-492; R.SANCHEZ-PESCADOR et al.: "Nucleotide sequence and expression of an AIDS-associated retrovirus (ARV-2)" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2596771B1 (fr) | 1988-10-21 |
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