JPH1059868A - Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質からなるワクチン - Google Patents
Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質からなるワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エイズ予防用のワクチンに関する。
【解決手段】 天然のｇｐ１６０糖蛋白質の配列ＲＥＫ
Ｒのプロテアーゼによる切断部位を含まない、エイズ原
因ウィルスのエンヴェロープの非切断性ｇｐ１６０糖蛋
白質からなるワクチンを提供する。
Ｒのプロテアーゼによる切断部位を含まない、エイズ原
因ウィルスのエンヴェロープの非切断性ｇｐ１６０糖蛋
白質からなるワクチンを提供する。
Description
【０００１】本発明は、やや詳しく言えば、エイズ予防
用のワクチンに関するものである。後天性免疫不全症候
群（ＡＩＤＳ）は、現在北米、欧州及び中央アフリカで
特に問題となっているウイルス性疾患である。最近の推
定によれば、１００万の米国人がエイズウイルスに曝露
されている可能性が示唆されている。患者は重篤な免疫
不全を呈し、この疾患は一般的に致死的なものである。
この疾患は、最も一般的には、性的接触によって伝播さ
れる。麻薬を静脈内注射で使用する人々も高リスク群を
なす。他方では、汚染された血液または血液製品を受け
たことによって、多くの人がこのウイルスに感染してい
る。本疾患の原因因子はレトロウイルスである。動物の
多くの状態がレトロウイルスによりものであるとされて
いるが、ヒトを冒すレトロウイルスを記述できるように
なったのは、ごく最近のことである。
用のワクチンに関するものである。後天性免疫不全症候
群（ＡＩＤＳ）は、現在北米、欧州及び中央アフリカで
特に問題となっているウイルス性疾患である。最近の推
定によれば、１００万の米国人がエイズウイルスに曝露
されている可能性が示唆されている。患者は重篤な免疫
不全を呈し、この疾患は一般的に致死的なものである。
この疾患は、最も一般的には、性的接触によって伝播さ
れる。麻薬を静脈内注射で使用する人々も高リスク群を
なす。他方では、汚染された血液または血液製品を受け
たことによって、多くの人がこのウイルスに感染してい
る。本疾患の原因因子はレトロウイルスである。動物の
多くの状態がレトロウイルスによりものであるとされて
いるが、ヒトを冒すレトロウイルスを記述できるように
なったのは、ごく最近のことである。
【０００２】Ｉ型及びII型のヒトＴ細胞レトロウイルス
（ＨＴＬＶ：ヒトＴ細胞白血病ウイルス）が成人に於け
るある種のＴ細胞白血病の原因因子であるとされている
一方、III型ＨＴＬＶ又はエイズ関連ウイルス（ＡＲ
Ｖ）としても知られるリンパ節症関連レトロウイルス
（ＬＡＶウイルス）が現在エイズの原因となる因子であ
ると一般に認められている。
（ＨＴＬＶ：ヒトＴ細胞白血病ウイルス）が成人に於け
るある種のＴ細胞白血病の原因因子であるとされている
一方、III型ＨＴＬＶ又はエイズ関連ウイルス（ＡＲ
Ｖ）としても知られるリンパ節症関連レトロウイルス
（ＬＡＶウイルス）が現在エイズの原因となる因子であ
ると一般に認められている。
【０００３】ＬＡＶレトロウイルスのゲノムは極めて完
全に特性記述されており（Ｗain −Ｈobsonら、１９８
５年；Ｒatnerら、１９８５年；Ｍuesingら、１９８５
年、Ｓanchez Ｐescador ら、１９８５年）、配列に関
するデータは、レンチウイルス群と極めて密接な関係に
あることを示している。ヒツジビスナウイルスを原型と
するレンチウイルスは、典型的に長い潜伏期を示す遅発
性の疾患の原因因子である。ＬＡＶウイルスとビスナウ
イルスには多くの類似点があり、特に向神経組織性で類
似する。
全に特性記述されており（Ｗain −Ｈobsonら、１９８
５年；Ｒatnerら、１９８５年；Ｍuesingら、１９８５
年、Ｓanchez Ｐescador ら、１９８５年）、配列に関
するデータは、レンチウイルス群と極めて密接な関係に
あることを示している。ヒツジビスナウイルスを原型と
するレンチウイルスは、典型的に長い潜伏期を示す遅発
性の疾患の原因因子である。ＬＡＶウイルスとビスナウ
イルスには多くの類似点があり、特に向神経組織性で類
似する。
【０００４】他の周知のレトロウイルスの場合と同様
に、ＬＡＶゲノムの三つの最も重要な部分は、gag 、po
l およびenv と呼ばれている。env 遺伝子の配列は、gp
１１０及びgp４１の配列を含めて、トランスメンブレン
（transmembrane ）エンヴェロープ糖蛋白質に対して予
期された特性を有し、gp１１０とgp４１とから構成され
るenv 蛋白質前駆体gp１６０の本質が直接アミノ酸配列
決定法により確かめられている。以下、gp４１をgp４０
又はgp４１と呼ぶこともある。
に、ＬＡＶゲノムの三つの最も重要な部分は、gag 、po
l およびenv と呼ばれている。env 遺伝子の配列は、gp
１１０及びgp４１の配列を含めて、トランスメンブレン
（transmembrane ）エンヴェロープ糖蛋白質に対して予
期された特性を有し、gp１１０とgp４１とから構成され
るenv 蛋白質前駆体gp１６０の本質が直接アミノ酸配列
決定法により確かめられている。以下、gp４１をgp４０
又はgp４１と呼ぶこともある。
【０００５】env 蛋白質gp１６０並びにその切断生成物
gp１２０及びgp４１に対して生産される抗体はエイズ患
者の血清中に普通に検出され、env 糖蛋白質はエイズウ
イルスの主たる表面抗原に該当する。
gp１２０及びgp４１に対して生産される抗体はエイズ患
者の血清中に普通に検出され、env 糖蛋白質はエイズウ
イルスの主たる表面抗原に該当する。
【０００６】かくして、env 蛋白質は、予防接種戦略を
展開するための最も期待される候補であり、そのため
に、この蛋白質及びそれをコードする配列が注目を集め
ている。
展開するための最も期待される候補であり、そのため
に、この蛋白質及びそれをコードする配列が注目を集め
ている。
【０００７】多くのグループがenv 蛋白質の細菌内での
発現を報告している。しかし、グリコシル化及び翻訳後
構造修飾が行われないために、それら微生物により合成
された物質の免疫力が減じている可能性がある。
発現を報告している。しかし、グリコシル化及び翻訳後
構造修飾が行われないために、それら微生物により合成
された物質の免疫力が減じている可能性がある。
【０００８】それ故に、本発明は、env 蛋白質発現ベク
ターとして、グルコシル化及び翻訳後構造修飾を可能な
らしめるであろう環境中で蛋白質を発現させうるウイル
スベクターを使用することを提案する。
ターとして、グルコシル化及び翻訳後構造修飾を可能な
らしめるであろう環境中で蛋白質を発現させうるウイル
スベクターを使用することを提案する。
【０００９】すなわち、本発明は、エイズの原因となる
ウイルスのenv 遺伝子の全部又は一部を含有するウイル
スベクターに関するものである。
ウイルスのenv 遺伝子の全部又は一部を含有するウイル
スベクターに関するものである。
【００１０】使用可能なウイルスベクターの中では、特
にポックスウイルスが挙げられ、とりわけワクシニアウ
イルス（ＶＶ）が挙げられる。
にポックスウイルスが挙げられ、とりわけワクシニアウ
イルス（ＶＶ）が挙げられる。
【００１１】ワクシニアウイルスは、天然痘の制御及び
根絶のために世界中で極めて広く用いられている二重鎖
ＤＮＡウイルスである。最近の技術の進歩により、この
ウイルスをクローニングベクターとして開発することが
可能となり、更に生きた組換えウイルスによって外来抗
原の発現が可能となり、かつ種々のウイルス性及び寄生
虫性の疾患に対する免疫を得ることさえ可能となってい
る。
根絶のために世界中で極めて広く用いられている二重鎖
ＤＮＡウイルスである。最近の技術の進歩により、この
ウイルスをクローニングベクターとして開発することが
可能となり、更に生きた組換えウイルスによって外来抗
原の発現が可能となり、かつ種々のウイルス性及び寄生
虫性の疾患に対する免疫を得ることさえ可能となってい
る。
【００１２】すなわち、数グループが最近このタイプの
組換え体を使用してインフルエンザ抗原、Ｂ型肝炎抗原
及び狂犬病糖蛋白質を発現させ、これらの疾患に対して
免疫が得られることを示している（Ｓmithら、１９８３
年、Ｐanicaliら、１９８３年、Ｋienyら、１９８４
年）。
組換え体を使用してインフルエンザ抗原、Ｂ型肝炎抗原
及び狂犬病糖蛋白質を発現させ、これらの疾患に対して
免疫が得られることを示している（Ｓmithら、１９８３
年、Ｐanicaliら、１９８３年、Ｋienyら、１９８４
年）。
【００１３】ワクシニアウイルス（ＶＶ）による外来蛋
白質をコードする配列の発現には必然的に次の二つの段
階が含まれる： １）コードする配列がＶＶのプロモーターと一列にそろ
えられ、ＶＶ ＤＮＡの非必須区間中に挿入され、適当
な細菌プラスミド中にクローン化されなければならな
い； ２）コードする配列の両側に位置するＶＶ ＤＮＡの配
列は、プラスミドとウイルスゲノムとの間の生体内での
相同性組換えを可能にするものでなければならない；二
重相互組換えにより、挿入ＤＮＡ断片がプラスミドから
ウイルスゲノムへ移り、そこで増殖、発現される（Ｐan
icaliとＰaoletti 、１９８２年；Ｍackettら、１９８
２年；Ｓmithら、１９８３年；Ｐanicaliら、１９８３
年）。
白質をコードする配列の発現には必然的に次の二つの段
階が含まれる： １）コードする配列がＶＶのプロモーターと一列にそろ
えられ、ＶＶ ＤＮＡの非必須区間中に挿入され、適当
な細菌プラスミド中にクローン化されなければならな
い； ２）コードする配列の両側に位置するＶＶ ＤＮＡの配
列は、プラスミドとウイルスゲノムとの間の生体内での
相同性組換えを可能にするものでなければならない；二
重相互組換えにより、挿入ＤＮＡ断片がプラスミドから
ウイルスゲノムへ移り、そこで増殖、発現される（Ｐan
icaliとＰaoletti 、１９８２年；Ｍackettら、１９８
２年；Ｓmithら、１９８３年；Ｐanicaliら、１９８３
年）。
【００１４】当然のことながら、このタイプのベクター
の使用には、ベクターウイルスのゲノムの部分的欠失処
理をしばしば伴う。
の使用には、ベクターウイルスのゲノムの部分的欠失処
理をしばしば伴う。
【００１５】本発明はとりわけ、少なくとも次のものを
含有するウイルスベクターに関するものである： −ベクターウイルスのゲノムの一部、 −エイズ原因ウイルスのエンヴェロープの糖蛋白質（g
p）の一つをコードする遺伝子、及び −細胞中でのこの糖蛋白質の発現のための諸要素。
含有するウイルスベクターに関するものである： −ベクターウイルスのゲノムの一部、 −エイズ原因ウイルスのエンヴェロープの糖蛋白質（g
p）の一つをコードする遺伝子、及び −細胞中でのこの糖蛋白質の発現のための諸要素。
【００１６】本発明はまた、該ウイルスに対応する組換
えＤＮＡに関するものでもある。
えＤＮＡに関するものでもある。
【００１７】エイズの原因となるウイルスのエンヴェロ
ープ中には、ＫＤ単位でのそれらの質量に応じてgp１６
０、gp１２０及びgp４１と呼ばれる３種の糖蛋白質を数
えうることを指摘しておくことが適切である。最初のも
の、gp１６０は実際には後の２種の蛋白質の前駆体であ
る。これらの名称は未だ確立されたものではなく、gp４
１はgp４０又はgp４２と呼ばれることもあるが、これら
３種の糖蛋白質は、それらの名称にも拘らず、質量の差
からみて完全に同一とみなしうるものである。
ープ中には、ＫＤ単位でのそれらの質量に応じてgp１６
０、gp１２０及びgp４１と呼ばれる３種の糖蛋白質を数
えうることを指摘しておくことが適切である。最初のも
の、gp１６０は実際には後の２種の蛋白質の前駆体であ
る。これらの名称は未だ確立されたものではなく、gp４
１はgp４０又はgp４２と呼ばれることもあるが、これら
３種の糖蛋白質は、それらの名称にも拘らず、質量の差
からみて完全に同一とみなしうるものである。
【００１８】エイズ原因ウイルスとは、とりわけＬＡＶ
ウイルス、ＨＴＬＶ IIIウイルス又はＡＲＶ、またこれ
らウイルスから生じうる点変異体または部分欠失体、並
びに関連ウイルスを指すものと理解される。
ウイルス、ＨＴＬＶ IIIウイルス又はＡＲＶ、またこれ
らウイルスから生じうる点変異体または部分欠失体、並
びに関連ウイルスを指すものと理解される。
【００１９】ベクターウイルス（エイズ原因ウイルスと
は別の）のゲノムに相当する部分では、ウイルスベクタ
ーは任意の起源のウイルスのゲノムから形成されていて
よいが、ポックスウイルスのゲノムの一部、とりわけワ
クシニアのゲノムの一部を用いるのが好ましい。
は別の）のゲノムに相当する部分では、ウイルスベクタ
ーは任意の起源のウイルスのゲノムから形成されていて
よいが、ポックスウイルスのゲノムの一部、とりわけワ
クシニアのゲノムの一部を用いるのが好ましい。
【００２０】ワクシニアウイルス中での異種蛋白質の発
現に必要な条件は上に述べられている。
現に必要な条件は上に述べられている。
【００２１】一般に、問題の遺伝子、たとえばenv 遺伝
子が発現されうるためには、それがワクシニア遺伝子の
プロモーターに従属していなければならないであろう；
このプロモーターは一般にはワクシニアの７．５Ｋ蛋白
質プロモーターであろう。更に、コード配列が、標識遺
伝子として役立ちうるであろうワクシニアの非必須遺伝
子中にクローン化されなければならないであろう。これ
は大抵の場合ＴＫ遺伝子となろう。
子が発現されうるためには、それがワクシニア遺伝子の
プロモーターに従属していなければならないであろう；
このプロモーターは一般にはワクシニアの７．５Ｋ蛋白
質プロモーターであろう。更に、コード配列が、標識遺
伝子として役立ちうるであろうワクシニアの非必須遺伝
子中にクローン化されなければならないであろう。これ
は大抵の場合ＴＫ遺伝子となろう。
【００２２】発現を達成したいエンヴェロープ糖蛋白質
のうちでは、上述の３種の蛋白質、gp１６０、gp４１及
びgp１２０を挙げるべきである。
のうちでは、上述の３種の蛋白質、gp１６０、gp４１及
びgp１２０を挙げるべきである。
【００２３】一般には、完全なエンヴェロープ遺伝子、
即ちこの遺伝子のシグナル配列及びトランスメンブレン
配列を組入れたenv 遺伝子の発現を達成するのが好まし
いであろう。
即ちこの遺伝子のシグナル配列及びトランスメンブレン
配列を組入れたenv 遺伝子の発現を達成するのが好まし
いであろう。
【００２４】env 遺伝子蛋白質全体をコードする遺伝子
をクローン化したウイルスベクターを用いての最初の諸
試験の結果、発現生成物の免疫原性を改善するためにこ
の遺伝子の装飾が提案された。
をクローン化したウイルスベクターを用いての最初の諸
試験の結果、発現生成物の免疫原性を改善するためにこ
の遺伝子の装飾が提案された。
【００２５】培養上澄中へのenv 蛋白質のかなりの放出
が観察された（この放出は生体内では多分循環体液中へ
行われるであろう）。これは、該蛋白質の細胞膜中での
付着が弱いことによるのであろう；その上、細胞表面に
抗原が現われることが、ワクシニア系による免疫応答の
誘発にとって極めて重要なことが知られている。従っ
て、該蛋白質の細胞膜中での係留を向上させるようにen
v 蛋白質を装飾することが提案される。
が観察された（この放出は生体内では多分循環体液中へ
行われるであろう）。これは、該蛋白質の細胞膜中での
付着が弱いことによるのであろう；その上、細胞表面に
抗原が現われることが、ワクシニア系による免疫応答の
誘発にとって極めて重要なことが知られている。従っ
て、該蛋白質の細胞膜中での係留を向上させるようにen
v 蛋白質を装飾することが提案される。
【００２６】このためには、アルギニンに対応するコド
ンをイソロイシンに対応するコドンで置換えるよう、ト
ランスメンブレン領域をコードする部分でenv 遺伝子を
装飾してもよいであろう。
ンをイソロイシンに対応するコドンで置換えるよう、ト
ランスメンブレン領域をコードする部分でenv 遺伝子を
装飾してもよいであろう。
【００２７】異種ウイルスのトランスメンブレン領域、
例えば狂犬病ウイルスのgpのトランスメンブレン領域を
env 蛋白質のトランスメンブレン領域に置換及び／又は
付加することによって該係留を向上させうる可能性もあ
る。
例えば狂犬病ウイルスのgpのトランスメンブレン領域を
env 蛋白質のトランスメンブレン領域に置換及び／又は
付加することによって該係留を向上させうる可能性もあ
る。
【００２８】更に、該蛋白質がその発現後に十分に組立
てられない可能性がある。実際上、シグナルペプチドは
かなり非定型的であり、蛋白質の完全な移出を損う可能
性もある。このため、異種ウイルスに由来するシグナル
配列、例えば狂犬病ウイルスのgpのシグナル配列を置換
及び／又は付加することが提案される。
てられない可能性がある。実際上、シグナルペプチドは
かなり非定型的であり、蛋白質の完全な移出を損う可能
性もある。このため、異種ウイルスに由来するシグナル
配列、例えば狂犬病ウイルスのgpのシグナル配列を置換
及び／又は付加することが提案される。
【００２９】最後に、細胞により放出されるのはgp１６
０よりもむしろgp１２０であるように思われる。それは
一方では免疫系のためのおとりを提供し、他方では、最
近のデータに合致して、Ｔ４細胞に結合することができ
るであろう。この結合は、Ｔ４細胞を不活性化する効果
又はそれらを他のＴ４細胞にとっての異物に見えさせる
効果をもつものであろう。
０よりもむしろgp１２０であるように思われる。それは
一方では免疫系のためのおとりを提供し、他方では、最
近のデータに合致して、Ｔ４細胞に結合することができ
るであろう。この結合は、Ｔ４細胞を不活性化する効果
又はそれらを他のＴ４細胞にとっての異物に見えさせる
効果をもつものであろう。
【００３０】それ故、放出され得ないgp１２０env 蛋白
質を得ることが有利であろう。これは、env 遺伝子を、
gp１２０をコードする配列とgp４１をコードする配列と
の間で装飾して、gp１２０とgp４１との間に位置するプ
ロテアーゼ切断部位を除去することにより、とりわけＲ
ＥＫＲ部位を除去することにより、達成される。
質を得ることが有利であろう。これは、env 遺伝子を、
gp１２０をコードする配列とgp４１をコードする配列と
の間で装飾して、gp１２０とgp４１との間に位置するプ
ロテアーゼ切断部位を除去することにより、とりわけＲ
ＥＫＲ部位を除去することにより、達成される。
【００３１】本発明のプラスミドでは、ＲＥＫＲ配列か
ら８アミノ酸下流に位置するＫＲＲ配列に相当する部位
で少なくとも１か所の追加の変異が行われる。そうして
得られたgp１６０はもはや切断されない。
ら８アミノ酸下流に位置するＫＲＲ配列に相当する部位
で少なくとも１か所の追加の変異が行われる。そうして
得られたgp１６０はもはや切断されない。
【００３２】本発明のベクターは、更に、env 蛋白質の
シンシチウム（合胞体）形成能、即ちウイルスが細胞融
合を起させ、巨細胞又はシンシチウムを生じる能力の原
因であるかもしれないと考えられているgp４１の疎水性
Ｎ末端ペプチドに相当する配列を欠いているところのgp
４１をコードする配列を含有する。
シンシチウム（合胞体）形成能、即ちウイルスが細胞融
合を起させ、巨細胞又はシンシチウムを生じる能力の原
因であるかもしれないと考えられているgp４１の疎水性
Ｎ末端ペプチドに相当する配列を欠いているところのgp
４１をコードする配列を含有する。
【００３３】最後に、本発明は、gp１６０の細胞質外領
域と細胞質内領域とがＣ末端疎水性ペプチド削除後に同
調して融合され、それによって得られるべき糖蛋白質の
分泌を可能ならしめているウイルスベクターに関するも
のである。
域と細胞質内領域とがＣ末端疎水性ペプチド削除後に同
調して融合され、それによって得られるべき糖蛋白質の
分泌を可能ならしめているウイルスベクターに関するも
のである。
【００３４】一般に、本発明のウイルスベクターは次の
蛋白質の一つをコードする配列を含有する：
蛋白質の一つをコードする配列を含有する：
【００３５】
【化１】
【００３６】・Ｓはシグナルペプチドであり、 ・gp１２０は糖蛋白質１２０であり、 ・Ｊはgp１２０とgp４０との間のプロテアーゼ切断部位
を欠いた連結部を概念的に示し、 ・gp４０は糖蛋白質４０であり、 ・tmはトランスメンブレンペプチドである。
を欠いた連結部を概念的に示し、 ・gp４０は糖蛋白質４０であり、 ・tmはトランスメンブレンペプチドである。
【００３７】又は −Ｓ−gp４０−tm−又は −Ｓ−gp
１２０−tm−なる構造の蛋白質。
１２０−tm−なる構造の蛋白質。
【００３８】シグナルペプチド及びトランスメンブレン
配列はエイズ原因ウイルスのそれらであっても、異種の
ものであってもよく、とりわけ狂犬病ウイルス又ＶＳＶ
或はエンヴェロープをもつ他のウイルスに由来するもの
であってもよい。
配列はエイズ原因ウイルスのそれらであっても、異種の
ものであってもよく、とりわけ狂犬病ウイルス又ＶＳＶ
或はエンヴェロープをもつ他のウイルスに由来するもの
であってもよい。
【００３９】gp４０はその疎水性Ｎ末端を欠いていても
よい。
よい。
【００４０】第一の発明は主として、ＬＡＶウイルスの
env 遺伝子によりコードされた糖蛋白質を細胞培養で得
るためのウイルスベクターの使用に関するものである。
従って、当該細胞はまずは本発明のウイルスベクターに
感染した哺乳動物細胞であり、或は相当する組換えＤＮ
Ａを含有する哺乳動物細胞である；これらの細胞のうち
では、とりわけ初代培養からのヒト二倍体細胞並びにＶ
ero 細胞を挙げておくべきである。当然のことながら、
後記実施例からも分るように、他のタイプの細胞を供す
ることも可能である。
env 遺伝子によりコードされた糖蛋白質を細胞培養で得
るためのウイルスベクターの使用に関するものである。
従って、当該細胞はまずは本発明のウイルスベクターに
感染した哺乳動物細胞であり、或は相当する組換えＤＮ
Ａを含有する哺乳動物細胞である；これらの細胞のうち
では、とりわけ初代培養からのヒト二倍体細胞並びにＶ
ero 細胞を挙げておくべきである。当然のことながら、
後記実施例からも分るように、他のタイプの細胞を供す
ることも可能である。
【００４１】かくして得られた糖蛋白質は精製後ワクチ
ン製造のために使用できる。
ン製造のために使用できる。
【００４２】本発明のウイルスベクターを予防接種のた
めに直接使用することも可能で、そのときは所要部位及
び生体内で糖蛋白質が産生される。
めに直接使用することも可能で、そのときは所要部位及
び生体内で糖蛋白質が産生される。
【００４３】２種以上の予防接種剤、特に上記装飾に付
されたgp１２０及びgp４０を個別に発現するベクターに
相当する予防接種剤を組合せ使用し、同時に又は別個に
投与するのが有利である。例えば、後記のベクター１１
３６及び１１３８から誘導された予防接種剤を合せて使
用することが有利であろう。
されたgp１２０及びgp４０を個別に発現するベクターに
相当する予防接種剤を組合せ使用し、同時に又は別個に
投与するのが有利である。例えば、後記のベクター１１
３６及び１１３８から誘導された予防接種剤を合せて使
用することが有利であろう。
【００４４】最後に、本発明は、上記糖蛋白質に対して
産生された抗体に関するものでもあり、該抗体は、生体
を上記ウイルスベクターに感染させ、一定時間後に誘発
された抗体を回収することによって得られる。
産生された抗体に関するものでもあり、該抗体は、生体
を上記ウイルスベクターに感染させ、一定時間後に誘発
された抗体を回収することによって得られる。
【００４５】糖蛋白質の取得、細胞培養及び予防接種に
用いられる技法は、既知のワクチンについて現在行われ
るものと同じであり、詳しく述べることはしない。
用いられる技法は、既知のワクチンについて現在行われ
るものと同じであり、詳しく述べることはしない。
【００４６】以下の方法及び実施例を読めば、本発明を
より十分に理解できるであろう。
より十分に理解できるであろう。
【００４７】５つの図は実施例を図解したものである：
【００４８】
【実施例】方 法 クローニング ：Ｍaniatisら、１９８２年。
【００４９】酵素：供給者の指示に従って使用。
【００５０】局所変異：ＺollerとＳmith、１９８３年
に準じた方法。
に準じた方法。
【００５１】ワクシニアへの移入：Ｋienyら、１９８４
年。
年。
【００５２】唯一の相違点：ＬＭＴＫ+細胞の代りにヒ
ト１４３Ｂ細胞を使用。
ト１４３Ｂ細胞を使用。
【００５３】保存ウイルスの調製 「無菌」ニワトリ初代細胞を０．０１pfu/細胞で４日間
にわたり温度３７℃で感染させる（ＭＥＭ培地＋５％Ｎ
ＣＳ）。
にわたり温度３７℃で感染させる（ＭＥＭ培地＋５％Ｎ
ＣＳ）。
【００５４】ウイルスの精製 上記保存ウイルスを２５００rpm で１５分間遠心分離す
る（ローターＧＳＡ、Ｓorvall）。上澄みをとってお
く。ペレットをＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭ Ｔris-ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ
2）中４℃で１５分間処理する。懸濁液を陶製容器（Ｐo
tter）中ですりつぶし、２５００rpm で１５分間遠心分
離する。上澄みを先述の上澄みに加え、２回目のすりつ
ぶしを同様に行う。
る（ローターＧＳＡ、Ｓorvall）。上澄みをとってお
く。ペレットをＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭ Ｔris-ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ
2）中４℃で１５分間処理する。懸濁液を陶製容器（Ｐo
tter）中ですりつぶし、２５００rpm で１５分間遠心分
離する。上澄みを先述の上澄みに加え、２回目のすりつ
ぶしを同様に行う。
【００５５】全部の上澄みを、３６％（ｗ／ｖ）スクロ
ースクッション（１０ｍＭ Ｔris、ｐＨ８）１０ｍｌ
の上にのせる。懸濁液を１４，０００rpm で２時間遠心
分離する（ローターＳＷ２８、Ｂeckman）。
ースクッション（１０ｍＭ Ｔris、ｐＨ８）１０ｍｌ
の上にのせる。懸濁液を１４，０００rpm で２時間遠心
分離する（ローターＳＷ２８、Ｂeckman）。
【００５６】ペレットを取り出し、砕き、別の同一クッ
ションの上に置く。２回目のペレットをＰＢＳ５ｍｌ中
へとり、２０〜４０％スクロース勾配（１０ｍＭ Ｔri
s 、ｐＨ８）上へのせる（同じローター）。懸濁液を１
２，０００rpm で４５分間遠心分離する。
ションの上に置く。２回目のペレットをＰＢＳ５ｍｌ中
へとり、２０〜４０％スクロース勾配（１０ｍＭ Ｔri
s 、ｐＨ８）上へのせる（同じローター）。懸濁液を１
２，０００rpm で４５分間遠心分離する。
【００５７】ウイルスのバンドを回収する。それを２
０，０００rpm で１時間遠心分離してペレットにする。
ペレットを１０ｍＭ Ｔris 、ｐＨ８中にとる。
０，０００rpm で１時間遠心分離してペレットにする。
ペレットを１０ｍＭ Ｔris 、ｐＨ８中にとる。
【００５８】免疫沈降 ＢＨＫ−２１細胞を０．２pfu/細胞で１８時間にわたっ
て感染させる（ディッシュ径３ｃｍ、細胞個数１０6／
ディッシュ、Ｇ−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で培養）。培
地をデカントし、メチオニン不含培地１ｍｌ及び
〔35Ｓ〕メチオニン（Ａmersham ）１０μｌ／ディッシ
ュで置換する。
て感染させる（ディッシュ径３ｃｍ、細胞個数１０6／
ディッシュ、Ｇ−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で培養）。培
地をデカントし、メチオニン不含培地１ｍｌ及び
〔35Ｓ〕メチオニン（Ａmersham ）１０μｌ／ディッシ
ュで置換する。
【００５９】２時間後に、過剰量の非放射性メチオニン
を加える。
を加える。
【００６０】標識後、感染細胞をかき取り、エッペンド
ルフ遠心器中で１分間遠心分離し、上澄みとペレット画
分を分離し、ペレットをＰＢＳ緩衝液で１回洗い、つぎ
に免疫沈降を行い、ゲル電気泳動を実施する（Ｌathe
ら、１９８０年に従う）。
ルフ遠心器中で１分間遠心分離し、上澄みとペレット画
分を分離し、ペレットをＰＢＳ緩衝液で１回洗い、つぎ
に免疫沈降を行い、ゲル電気泳動を実施する（Ｌathe
ら、１９８０年に従う）。
【００６１】Ｅndo-Ｆ処理 標識蛋白質をエイズ患者の血清で免疫沈降したのち、蛋
白質Ａ−セファローズ画分を ０．２Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ６．１ ０．０５％ ＳＤＳ ０．１％ノニデットＰ４０ ０．１％β−メルカプトエタノール ０．１％ＥＤＴＡ ｐＨ８ 中にとり、５分間煮沸して蛋白質を変性させる。
白質Ａ−セファローズ画分を ０．２Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ６．１ ０．０５％ ＳＤＳ ０．１％ノニデットＰ４０ ０．１％β−メルカプトエタノール ０．１％ＥＤＴＡ ｐＨ８ 中にとり、５分間煮沸して蛋白質を変性させる。
【００６２】１ｍｌ当り４単位のendo−Ｆを用いて３７
℃で２０時間インキベーションを行い、続いて氷中で１
／５容の１００％ＴＣＡにより２分間沈澱させる。ペレ
ットを８０％アセトンで３回洗い、試料緩衝液を加え、
混合物をＳＤＳゲル上にのせる。
℃で２０時間インキベーションを行い、続いて氷中で１
／５容の１００％ＴＣＡにより２分間沈澱させる。ペレ
ットを８０％アセトンで３回洗い、試料緩衝液を加え、
混合物をＳＤＳゲル上にのせる。
【００６３】ＥＬＩＳＡ法による抗体アッセイ ＬＡＶ ペルオキシダーゼにリンクさせたヒツジ抗マウス抗体を
第二抗体としてＥＬＡＶＩＡ試験（Ｐasteur−Ｄiagnos
tic ）を採用。
第二抗体としてＥＬＡＶＩＡ試験（Ｐasteur−Ｄiagnos
tic ）を採用。
【００６４】ワクシニア ９６平底穴プレート（ＮＵＮＣ）を炭酸緩衝液中１０7p
fu の野生型ワクシニアウイルスと３７℃で１８時間イ
ンキュベートする。つぎにプレートを０．０１％ゼラチ
ンで飽和させる。ついでマウス血清をプレートに吸着さ
せ、その余の操作はＬＡＶ ＥＬＩＳＡの場合と同様に
行う。
fu の野生型ワクシニアウイルスと３７℃で１８時間イ
ンキュベートする。つぎにプレートを０．０１％ゼラチ
ンで飽和させる。ついでマウス血清をプレートに吸着さ
せ、その余の操作はＬＡＶ ＥＬＩＳＡの場合と同様に
行う。
【００６５】４９２nmで読取り。
【００６６】実施例１ ハイブリッドプラスミドの構築 env 遺伝子のコード配列のＶＶゲノムへの移入及びその
後のそれの発現に必要な諸要素を合せた寸法は数ｋｂの
オーダーである。それ故、必要な操作を容易にするに
は、構築作業に用いる大腸菌中の複製のためのプラスミ
ドの寸法を極小に迄減じることが必要と考えられた。
後のそれの発現に必要な諸要素を合せた寸法は数ｋｂの
オーダーである。それ故、必要な操作を容易にするに
は、構築作業に用いる大腸菌中の複製のためのプラスミ
ドの寸法を極小に迄減じることが必要と考えられた。
【００６７】ＶＶゲノムのＨind III断片（Ｈin−Ｊ）
はキチジンキナーゼ（ＴＫ）のための完全な遺伝子を含
み、この遺伝子はＶＶゲノム中に挿入されたＤＮＡの交
換及び組換えのために既に先に使用されている（Ｍacke
ttら、１９８２年）。挿入断片のＶＶゲノムのＴＫ遺伝
子中への移入は選択可能なＴＫ欠損ウイルスを生じるこ
とに言及しておくことは重要なことである。まず、ＶＶ
Ｈin−Ｊ断片の組込みに用いうる単一のＨind III部
位をもった小型のプラスミドを製出することが必要であ
った。更に、以下の操作を可能ならしめるよう、不必要
な制限配列をプラスミドから除去することが必要であっ
た。
はキチジンキナーゼ（ＴＫ）のための完全な遺伝子を含
み、この遺伝子はＶＶゲノム中に挿入されたＤＮＡの交
換及び組換えのために既に先に使用されている（Ｍacke
ttら、１９８２年）。挿入断片のＶＶゲノムのＴＫ遺伝
子中への移入は選択可能なＴＫ欠損ウイルスを生じるこ
とに言及しておくことは重要なことである。まず、ＶＶ
Ｈin−Ｊ断片の組込みに用いうる単一のＨind III部
位をもった小型のプラスミドを製出することが必要であ
った。更に、以下の操作を可能ならしめるよう、不必要
な制限配列をプラスミドから除去することが必要であっ
た。
【００６８】構築は、プラスミドｐＢＲ３２２から自然
欠失により導かれたベクターで、ヌクレオチド１０８９
と２４９１との間のセグメントが失われているプラスミ
ドｐＭＬ２（ＬuskyとＢotchan、１９８１年）から出発
した。先ず、ｐＭＬ２の２か所のＡhaIII部位の間にｐ
ｕｃ８（Ｖieira とＭessing、１９８２年）のＡhaIII
−ＡhaIII断片を挿入し、１９塩基対を除くことによっ
て、ＰstＩ配列を除去した。「リンカーテイリング」法
（Ｌatheら、１９８４年）を用いてこのプラスミドのＮ
ruＩ部位とＥcoＲＩ部位との間にＳ１処理後にＨind II
Iリンカーを挿入し、ＢamＨＩ部位を除去した。これに
より、機能性β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン抵
抗性を付与する）を有し、更に大腸菌中で活性な複製開
始点及び単一のＨind III制限部位を含む２０４９塩基
対のプラスミドが生じる。
欠失により導かれたベクターで、ヌクレオチド１０８９
と２４９１との間のセグメントが失われているプラスミ
ドｐＭＬ２（ＬuskyとＢotchan、１９８１年）から出発
した。先ず、ｐＭＬ２の２か所のＡhaIII部位の間にｐ
ｕｃ８（Ｖieira とＭessing、１９８２年）のＡhaIII
−ＡhaIII断片を挿入し、１９塩基対を除くことによっ
て、ＰstＩ配列を除去した。「リンカーテイリング」法
（Ｌatheら、１９８４年）を用いてこのプラスミドのＮ
ruＩ部位とＥcoＲＩ部位との間にＳ１処理後にＨind II
Iリンカーを挿入し、ＢamＨＩ部位を除去した。これに
より、機能性β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン抵
抗性を付与する）を有し、更に大腸菌中で活性な複製開
始点及び単一のＨind III制限部位を含む２０４９塩基
対のプラスミドが生じる。
【００６９】この構築物をｐＴＧ１Ｈという。
【００７０】ＴＫ遺伝子を有するＶＶ ＤＮＡのＨin−
Ｊ断片は先に、ｐＢＲ３２７由来のベクター中にクロー
ン化されている（Ｄrillien とＳpehner、１９８３
年）。この４．６ｋｂの断片をｐＴＧ１ＨのＨind III
部位に再クローン化した。アンピシリン抵抗性をコード
する遺伝子よりも遠位にＴＫ遺伝子が位置するクローン
を選択した。
Ｊ断片は先に、ｐＢＲ３２７由来のベクター中にクロー
ン化されている（Ｄrillien とＳpehner、１９８３
年）。この４．６ｋｂの断片をｐＴＧ１ＨのＨind III
部位に再クローン化した。アンピシリン抵抗性をコード
する遺伝子よりも遠位にＴＫ遺伝子が位置するクローン
を選択した。
【００７１】この構築物ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫを以下の実験
でベクターとして用いた。
でベクターとして用いた。
【００７２】次の段階は、発現されるべき遺伝子をコー
ドする配列の発現を制御するのに用い得るＶＶプロモー
ターを単離するものであった。７５００ドルトン（７．
５Ｋ）の蛋白質をコードする初期遺伝子のプロモーター
が既に同じ目的のために成功裏に使用されている（Ｓmi
thら、１９８３年）。それ故、このセグメントの単離を
試みた。
ドする配列の発現を制御するのに用い得るＶＶプロモー
ターを単離するものであった。７５００ドルトン（７．
５Ｋ）の蛋白質をコードする初期遺伝子のプロモーター
が既に同じ目的のために成功裏に使用されている（Ｓmi
thら、１９８３年）。それ故、このセグメントの単離を
試みた。
【００７３】該７．５Ｋ遺伝子は、ＷＲ型のＶＶゲノム
の最小のＳalＩ断片（Ｓal−Ｓ断片）の一つの上に位置
している（Ｖenkatasan ら、１９８１年）。小さい断片
の方が優先的にクローン化されるので、ＳalＩ切断ＷＲ
型のＶＶのＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２中に直接ク
ローニングして得られるクローンの多くがＳal−Ｓ断片
を有している。この断片を、ＳalＩ消化及び再結合によ
って、ベクターバクテリオフアージＭ１３mp７０１（Ｋ
ienyら、１９８３年参照）に移す。これによりファージ
Ｍ１３ＴＧＳal−Ｓが得られる。
の最小のＳalＩ断片（Ｓal−Ｓ断片）の一つの上に位置
している（Ｖenkatasan ら、１９８１年）。小さい断片
の方が優先的にクローン化されるので、ＳalＩ切断ＷＲ
型のＶＶのＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２中に直接ク
ローニングして得られるクローンの多くがＳal−Ｓ断片
を有している。この断片を、ＳalＩ消化及び再結合によ
って、ベクターバクテリオフアージＭ１３mp７０１（Ｋ
ienyら、１９８３年参照）に移す。これによりファージ
Ｍ１３ＴＧＳal−Ｓが得られる。
【００７４】このクローンでは、７．５Ｋ遺伝子の開始
ＡＴＧのすぐ近位にＳcaＩ部位がある。７．５Ｋ遺伝子
の下流には、ベクターに由来する各単一のＢamＨＩ部位
とＥcoＲＩ部位がある。ＢamＨＩ部位とＳcaＩ部位と
を、ＢamＨＩ消化で生じた末端を大腸菌のクレノー断片
を用いて埋めたのち、ＢglIIリンカー５′−ＣＡＧＡＴ
ＣＴＧ−３′により融合する。このプロセスによりＳca
Ｉ部位が除去されるが、ＢamＨＩ部位が再形成され、単
一のＥcoＲＩ部位が下流へシフトする。同時に、下流の
ＳalＩ（ＡccＩ）部位が除去され、上流のＳalＩ部位が
唯一のＳalＩ部位となる。
ＡＴＧのすぐ近位にＳcaＩ部位がある。７．５Ｋ遺伝子
の下流には、ベクターに由来する各単一のＢamＨＩ部位
とＥcoＲＩ部位がある。ＢamＨＩ部位とＳcaＩ部位と
を、ＢamＨＩ消化で生じた末端を大腸菌のクレノー断片
を用いて埋めたのち、ＢglIIリンカー５′−ＣＡＧＡＴ
ＣＴＧ−３′により融合する。このプロセスによりＳca
Ｉ部位が除去されるが、ＢamＨＩ部位が再形成され、単
一のＥcoＲＩ部位が下流へシフトする。同時に、下流の
ＳalＩ（ＡccＩ）部位が除去され、上流のＳalＩ部位が
唯一のＳalＩ部位となる。
【００７５】この構築物をＭ１３ＴＧ７．５Ｋと呼ぶ。
【００７６】ＶＶ ＤＮＡのＨin−Ｊ断片中には、約３
０塩基対離れたＣlaＩ部位とＥcoＲＩ部位とがある（Ｗ
eirとＭoss 、１９８３年）。Ｍ１３ＴＧ７．５Ｋ中に
存在する７．５Ｋプロモーター断片をＡccＩとＥcoＲＩ
とにより切り出し、ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫのＣlaＩ部位とＥ
coＲＩ部位との間にクローン化し、ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫ−
Ｐ７．５Ｋを生ぜしめる。
０塩基対離れたＣlaＩ部位とＥcoＲＩ部位とがある（Ｗ
eirとＭoss 、１９８３年）。Ｍ１３ＴＧ７．５Ｋ中に
存在する７．５Ｋプロモーター断片をＡccＩとＥcoＲＩ
とにより切り出し、ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫのＣlaＩ部位とＥ
coＲＩ部位との間にクローン化し、ｐＴＧ１Ｈ−ＴＫ−
Ｐ７．５Ｋを生ぜしめる。
【００７７】この構築により、Ｍ１３ベクターからの各
単一のＢamＨＩ部位及びＥcoＲＩ部位が７．５Ｋプロモ
ーター配列のすぐ下流へ移る。これら各単一のＢamＨＩ
部位及びＥcoＲＩ部位を次の構築に用いる。
単一のＢamＨＩ部位及びＥcoＲＩ部位が７．５Ｋプロモ
ーター配列のすぐ下流へ移る。これら各単一のＢamＨＩ
部位及びＥcoＲＩ部位を次の構築に用いる。
【００７８】バクテリオファージＭ１３ＴＧ１３１（Ｋ
ienyら、１９８３年）のポリリンカーセグメントをＥco
ＲＩ及びＢglIIを用いて切り出し、プラスミドｐＴＧ１
Ｈ−ＴＫ−Ｐ７．５ＫのＥcoＲＩ部位とＢamＨＩ部位と
の間に挿入し、ｐＴＧ７１８６−ＰＯＬＹを生ぜしめ
る。この構築物にはＰ７．５Ｋの制御下の外来遺伝子の
クローニングに利用できる制限部位が１０か所ある。
ienyら、１９８３年）のポリリンカーセグメントをＥco
ＲＩ及びＢglIIを用いて切り出し、プラスミドｐＴＧ１
Ｈ−ＴＫ−Ｐ７．５ＫのＥcoＲＩ部位とＢamＨＩ部位と
の間に挿入し、ｐＴＧ７１８６−ＰＯＬＹを生ぜしめ
る。この構築物にはＰ７．５Ｋの制御下の外来遺伝子の
クローニングに利用できる制限部位が１０か所ある。
【００７９】実施例２ env 配列をもつプラスミドの構
築 env をコードする配列を得るために、プラスミドＰＪ１
９−６及びＰＪ１９−１３中にクローン化された２種の
プロウイルスセグメントを先ず会合させる。
築 env をコードする配列を得るために、プラスミドＰＪ１
９−６及びＰＪ１９−１３中にクローン化された２種の
プロウイルスセグメントを先ず会合させる。
【００８０】env ｍＲＮＡが十分に翻訳されるよう、en
v 遺伝子の推定される翻訳開始部位の周辺のヌクレオチ
ド配列を、真核生物遺伝子のコンセンサス配列にマッチ
するように装飾した。これは、５７６７位の近位でのオ
リゴヌクリレオチドを用いた定方向特異的変異により達
成された。
v 遺伝子の推定される翻訳開始部位の周辺のヌクレオチ
ド配列を、真核生物遺伝子のコンセンサス配列にマッチ
するように装飾した。これは、５７６７位の近位でのオ
リゴヌクリレオチドを用いた定方向特異的変異により達
成された。
【００８１】プラスミドＰＪ１９−１３及びＰＪ１９−
６は、それぞれヌクレオチド１２５８〜１６９８及び１
６９８〜９１７３からなるＬＡＶのプロウイルスゲノム
のＨind III断片を含有する。
６は、それぞれヌクレオチド１２５８〜１６９８及び１
６９８〜９１７３からなるＬＡＶのプロウイルスゲノム
のＨind III断片を含有する。
【００８２】ＰＪ１９−１３のＥcoＲＩ−ＫpnＩ断片
（env 開始ＡＴＧを含む）をファージＭ１３ＴＧ１３０
に挿入し、オリゴヌクレオチド（配列５′−ＣＴＣＴＣ
ＡＴＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣ）
を用いて定方向特異的変異を行って、env 翻訳開始コド
ン（５７６７位）の上流にＰstＩ部位を導入し、３位の
ＧをＡにより置換した。次に変異断片をプラスミドｐＴ
Ｇ１−ＰＯＬＹ（ｐＴＧ１Ｈに類似の２．１ｋｂのミニ
プラスミドであるが、Ｍ１３ＴＧ１３１のポリリンカー
セグメントを含有する）のＥcoＲＩ部位とＫpnＩ部位と
の間に導入した。
（env 開始ＡＴＧを含む）をファージＭ１３ＴＧ１３０
に挿入し、オリゴヌクレオチド（配列５′−ＣＴＣＴＣ
ＡＴＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣ）
を用いて定方向特異的変異を行って、env 翻訳開始コド
ン（５７６７位）の上流にＰstＩ部位を導入し、３位の
ＧをＡにより置換した。次に変異断片をプラスミドｐＴ
Ｇ１−ＰＯＬＹ（ｐＴＧ１Ｈに類似の２．１ｋｂのミニ
プラスミドであるが、Ｍ１３ＴＧ１３１のポリリンカー
セグメントを含有する）のＥcoＲＩ部位とＫpnＩ部位と
の間に導入した。
【００８３】ＰＪ１９−１３由来のＫpnＩ−Ｈind III
断片を次の同じプラスミド中にクローニングし（ＫpnＩ
とＨind IIIとの間に）、続いてＰＪ１９−６のＨind I
II−ＸhoＩ断片のクローニングを行って（Ｈind IIIと
ＳalＩとの間に）、２か所のＰstＩ部位にはさまれた完
全なenv コード配列を生じせしめた（プラスミドｐＴＧ
１１２４）。
断片を次の同じプラスミド中にクローニングし（ＫpnＩ
とＨind IIIとの間に）、続いてＰＪ１９−６のＨind I
II−ＸhoＩ断片のクローニングを行って（Ｈind IIIと
ＳalＩとの間に）、２か所のＰstＩ部位にはさまれた完
全なenv コード配列を生じせしめた（プラスミドｐＴＧ
１１２４）。
【００８４】これら２か所のＰstＩ制限部位の導入によ
り、以後の構築段階におけるenv 遺伝子ＤＮＡの操作が
より容易になる。上述の通り、ワクシニアウイルスでの
異種蛋白質の発現には、コード配列がワクシニアのプロ
モーター配列と整列し、ワクシニアＤＮＡの非必須（可
欠）セグメント中へ挿入されることを要する。両側に位
置するこのＤＮＡは、二重相互組換えにより生体内での
ワクシニアゲノムとの組換えを可能ならしめ、それによ
りコード配列及び付随するプロモーターがワクシニアゲ
ノム中へ移行する。
り、以後の構築段階におけるenv 遺伝子ＤＮＡの操作が
より容易になる。上述の通り、ワクシニアウイルスでの
異種蛋白質の発現には、コード配列がワクシニアのプロ
モーター配列と整列し、ワクシニアＤＮＡの非必須（可
欠）セグメント中へ挿入されることを要する。両側に位
置するこのＤＮＡは、二重相互組換えにより生体内での
ワクシニアゲノムとの組換えを可能ならしめ、それによ
りコード配列及び付随するプロモーターがワクシニアゲ
ノム中へ移行する。
【００８５】この目的で、上記ＰstＩ−ＰstＩ断片をｐ
ＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にクローニングし
た。これにより、ｐＴＧ１１２５と呼ぶプラスミドを得
た。
ＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にクローニングし
た。これにより、ｐＴＧ１１２５と呼ぶプラスミドを得
た。
【００８６】プラスミドｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹは、プ
ラスミドｐＴＧ１８８からＰstＩ消化及びＴ４リガーゼ
による再結合により生成され得る。
ラスミドｐＴＧ１８８からＰstＩ消化及びＴ４リガーゼ
による再結合により生成され得る。
【００８７】プラスミドｐＴＧ１８８は、１９８５年６
月２０日に、フランス国７５０１５パリ市ドクトゥール
ルー２８のパスツール研究所の国立微生物培養コレク
ションに次の番号で寄託されている： Ｅ．coli ５ＫｐＴＧ １８８＝No.Ｉ４５８env 遺伝子のコード配列及び随伴プロモーターのワクシ
ニアゲノムへの移入は次のようにして達成される。
月２０日に、フランス国７５０１５パリ市ドクトゥール
ルー２８のパスツール研究所の国立微生物培養コレク
ションに次の番号で寄託されている： Ｅ．coli ５ＫｐＴＧ １８８＝No.Ｉ４５８env 遺伝子のコード配列及び随伴プロモーターのワクシ
ニアゲノムへの移入は次のようにして達成される。
【００８８】実施例３ ワクシニアウイルスへのクローニングによるＶＶ．Ｔ
Ｇ．ｅＬＡＶ９−１の生成 Ｓmithら（１９８３年）が記載している方法は、ＶＶ
ＴＫ遺伝子中に挿入片を有するプラスミドと野生型ウイ
ルスゲノムとの間で生体内交換を行わせて、ウイルスが
もつＴＫ遺伝子を不活性化することを基礎としている。
ＴＫ+ウイルスは、５−ブロモデオキシウリジン（５Ｂ
ＵＤＲ）の存在下に細胞株（ＴＫ欠損）をプレーティン
グすることにより選択できる（Ｍackettら、１９８２
年）。チミジンキナーゼは５ＢＵＤＲを燐酸化してモノ
燐酸エステルとする。これが次にトリ燐酸エステルに転
化される。この化合物はｄＴＴＰのアナログであり、Ｄ
ＮＡ中へそれが組込まれると、ウイルスの適正な発育が
阻害される。しかし、ＴＫ+ウイルスはそのＤＮＡを正
常に複製し、やはりＴＫ+の細胞株にて目に見えるウイ
ルスプラクを生じる。
Ｇ．ｅＬＡＶ９−１の生成 Ｓmithら（１９８３年）が記載している方法は、ＶＶ
ＴＫ遺伝子中に挿入片を有するプラスミドと野生型ウイ
ルスゲノムとの間で生体内交換を行わせて、ウイルスが
もつＴＫ遺伝子を不活性化することを基礎としている。
ＴＫ+ウイルスは、５−ブロモデオキシウリジン（５Ｂ
ＵＤＲ）の存在下に細胞株（ＴＫ欠損）をプレーティン
グすることにより選択できる（Ｍackettら、１９８２
年）。チミジンキナーゼは５ＢＵＤＲを燐酸化してモノ
燐酸エステルとする。これが次にトリ燐酸エステルに転
化される。この化合物はｄＴＴＰのアナログであり、Ｄ
ＮＡ中へそれが組込まれると、ウイルスの適正な発育が
阻害される。しかし、ＴＫ+ウイルスはそのＤＮＡを正
常に複製し、やはりＴＫ+の細胞株にて目に見えるウイ
ルスプラクを生じる。
【００８９】ワクシニアウイルスは、感染細胞の核内で
よりも細胞質内で増殖する。このため、宿主ＤＮＡの複
製及び転写機構を利用することができず、ヴィリオン
（ウイルス粒子）がそのゲノム発現のための諸要素をも
つことが必要である。精製されたＶＶ ＤＮＡは非感染
性である。
よりも細胞質内で増殖する。このため、宿主ＤＮＡの複
製及び転写機構を利用することができず、ヴィリオン
（ウイルス粒子）がそのゲノム発現のための諸要素をも
つことが必要である。精製されたＶＶ ＤＮＡは非感染
性である。
【００９０】組換え体の生成には、ＶＶヴィリオンによ
る細胞の感染とクローン化された対象ＤＮＡセグメント
によりトランスフェクションとを同時に行う必要があ
る。しかし、組換え体の生成は、ＤＮＡによるトランス
フェクションに対しコンピテントな細胞中の小さな割合
に限定される。そのため、組換え体でない親ウイルスか
らなるバックグラウンドを減じるための間接的「適合
（congruence）」法を採用することが必要であった。こ
れは、生きた感染性ウイルスとして、３９．５℃という
非許容温度では増殖できない温度感受性（ｔｓ）ワクシ
ニア変異株（ＤrillienとＳpehner、１９８３年）を用
いて達成された。細胞をｔｓ変異株に非許容条件下で感
染させ、野生型ウイルスのＤＮＡでトランスフェクトす
ると、トランスフェクションに対しコンピテントで、野
生型ウイルスＤＮＡとｔｓウイルスのゲノムとの間の組
換えが起った細胞内でのみ、ウイルスの増殖が起るであ
ろう；他の細胞中では、それらが感染していても、ウイ
ルスは増殖しないであろう。ｐＴＧ１１２５の如き、ワ
クシニアのＤＮＡ断片を含有する組換えプラスミドがト
ランスフェクション混合物中に適切な濃度で野生型ＤＮ
Ａと共に含まれていると、それをコンピテント（被感染
性）細胞中でのワクシニアＤＮＡとの相同組換えに加わ
らせることも可能である。
る細胞の感染とクローン化された対象ＤＮＡセグメント
によりトランスフェクションとを同時に行う必要があ
る。しかし、組換え体の生成は、ＤＮＡによるトランス
フェクションに対しコンピテントな細胞中の小さな割合
に限定される。そのため、組換え体でない親ウイルスか
らなるバックグラウンドを減じるための間接的「適合
（congruence）」法を採用することが必要であった。こ
れは、生きた感染性ウイルスとして、３９．５℃という
非許容温度では増殖できない温度感受性（ｔｓ）ワクシ
ニア変異株（ＤrillienとＳpehner、１９８３年）を用
いて達成された。細胞をｔｓ変異株に非許容条件下で感
染させ、野生型ウイルスのＤＮＡでトランスフェクトす
ると、トランスフェクションに対しコンピテントで、野
生型ウイルスＤＮＡとｔｓウイルスのゲノムとの間の組
換えが起った細胞内でのみ、ウイルスの増殖が起るであ
ろう；他の細胞中では、それらが感染していても、ウイ
ルスは増殖しないであろう。ｐＴＧ１１２５の如き、ワ
クシニアのＤＮＡ断片を含有する組換えプラスミドがト
ランスフェクション混合物中に適切な濃度で野生型ＤＮ
Ａと共に含まれていると、それをコンピテント（被感染
性）細胞中でのワクシニアＤＮＡとの相同組換えに加わ
らせることも可能である。
【００９１】ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の初代細
胞の単層を３３℃でＶＶ−コペンハーゲンｔｓ７（０．
１pfu/細胞）に感染させ、野生型ＶＶ−コペンハーゲン
ウイルスのＤＮＡ（５０ng／１０6細胞）と組換えプラ
スミド（５０ng／１０6細胞）との燐酸カルシウム共沈
物でトランスフェクトする。
胞の単層を３３℃でＶＶ−コペンハーゲンｔｓ７（０．
１pfu/細胞）に感染させ、野生型ＶＶ−コペンハーゲン
ウイルスのＤＮＡ（５０ng／１０6細胞）と組換えプラ
スミド（５０ng／１０6細胞）との燐酸カルシウム共沈
物でトランスフェクトする。
【００９２】ｔｓウイルスの成育を許容しない温度（３
９．５℃）で２時間インキュベーションを行ったのち、
細胞を再び３９．５℃で４８時間インキュベートする。
ｔｓ++ウイルスの希釈液を用いて、ヒト１４３Ｂ細胞の
単層を３７℃で再感染処理し、次にそれら細胞を５ＢＵ
ＤＲ（１５０μｇ／ｍｌ）の存在下にインキュベートす
る。組換えプラスミドを受容したこれらの細胞からＴＫ
+ウイルスのプラクが種々得られ、一方、プラスミドな
しの対照培養は目に見えるプラクを示さない。ＴＫ+ウ
イルスを次に５ＢＵＤＲ存在下に２回目の選択を行うこ
とにより、サブクローニングする。
９．５℃）で２時間インキュベーションを行ったのち、
細胞を再び３９．５℃で４８時間インキュベートする。
ｔｓ++ウイルスの希釈液を用いて、ヒト１４３Ｂ細胞の
単層を３７℃で再感染処理し、次にそれら細胞を５ＢＵ
ＤＲ（１５０μｇ／ｍｌ）の存在下にインキュベートす
る。組換えプラスミドを受容したこれらの細胞からＴＫ
+ウイルスのプラクが種々得られ、一方、プラスミドな
しの対照培養は目に見えるプラクを示さない。ＴＫ+ウ
イルスを次に５ＢＵＤＲ存在下に２回目の選択を行うこ
とにより、サブクローニングする。
【００９３】ハイブリッドプラスミドｐＴＧ１１２５と
ＶＶゲノムとの間で正しい二重相互組換えが行われる
と、挿入断片を有するＴＫ遺伝子とウイルスのＴＫ遺伝
子とが交換され、組換え体がＴＫ+となる。
ＶＶゲノムとの間で正しい二重相互組換えが行われる
と、挿入断片を有するＴＫ遺伝子とウイルスのＴＫ遺伝
子とが交換され、組換え体がＴＫ+となる。
【００９４】種々のＴＫ+組換えウイルスから精製した
ＤＮＡをＨind IIIで消化して、アガロースゲル電気泳
動に付す。ＤＮＡ断片を、Ｓouthern（１９７５年）が
記載している手法に従って、ニトロセルロースフィルタ
ーに移す。次にフィルターを32Ｐを用いたニックトラン
スレーション後のプラスミドｐＴＧ１１２５とハイブリ
ダイスさせる。フィルターを洗浄後、フルオログラフィ
を行うと、ワクシニアウイルスがＬＡＶのenv 遺伝子を
組込んでおれば、オートラジオグラフ上に３．８５−、
２．９−及び０．８−ｋｂのバンドが見える。これら組
換え体の一つであるＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ９−１を以下
の実験用に選択した。
ＤＮＡをＨind IIIで消化して、アガロースゲル電気泳
動に付す。ＤＮＡ断片を、Ｓouthern（１９７５年）が
記載している手法に従って、ニトロセルロースフィルタ
ーに移す。次にフィルターを32Ｐを用いたニックトラン
スレーション後のプラスミドｐＴＧ１１２５とハイブリ
ダイスさせる。フィルターを洗浄後、フルオログラフィ
を行うと、ワクシニアウイルスがＬＡＶのenv 遺伝子を
組込んでおれば、オートラジオグラフ上に３．８５−、
２．９−及び０．８−ｋｂのバンドが見える。これら組
換え体の一つであるＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ９−１を以下
の実験用に選択した。
【００９５】実施例４ 組換えワクシニア−ＬＡＶウイ
ルスから合成されたenv 蛋白質 ハイブリッドワクシニアウイルスからのＬＡＶのenv 遺
伝子の発現を証明するために、Ｇ−ＭＥＭ培地＋１０％
ウシ胎児血清中で培養した齧歯動物細胞ＢＨＫ２１を前
記組換え体ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ９−１に感染させる。
ルスから合成されたenv 蛋白質 ハイブリッドワクシニアウイルスからのＬＡＶのenv 遺
伝子の発現を証明するために、Ｇ−ＭＥＭ培地＋１０％
ウシ胎児血清中で培養した齧歯動物細胞ＢＨＫ２１を前
記組換え体ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ９−１に感染させる。
【００９６】新鮮な半コンフルエントの単層（１０6細
胞）を０．２pfu/細胞で感染処理し、１８時間インキュ
ベートする。
胞）を０．２pfu/細胞で感染処理し、１８時間インキュ
ベートする。
【００９７】ついで培地を除去し、１０μｇ／ｍｌの〔
35Ｓ〕メチオニンを加えた低メチオニン濃度の培地（１
０6細胞に対し１ｍｌ）を加える。細胞を３７℃でイン
キュベートし、標識された蛋白質を遠心分離によって集
める。ペレットと上澄みに分離したのち、蛋白質をエイ
ズ患者の血清と共にインキュベートする。該血清と反応
する蛋白質をプロテインＡ−セファローズ樹脂に吸着さ
せて回収し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって広げ、オートラジオグラフィを行う（Ｌatheら、
１９８０年の手法による）。オートラジオグラフは、エ
イズ患者の血清が感染細胞抽出物中の３種の蛋白質と特
異的に結合することを示す（この結果は、他の患者の血
清を用いて得られるものと同一又は類似である）。見掛
けの分子量１６０、１２０及び４１ＫＤは、標準env 糖
蛋白質調製物中及びＬＡＶウイルス感染細胞の抽出物中
にエイズ患者の血清を用いて確認されたgp１６０、gp１
２０及びgp４１のバンドとの同等性を示唆する。ＬＡＶ
のenv 遺伝子のコード配列のみを有する組換えベクター
から３種の蛋白質が発現されるというこの観察は、一次
翻訳産物gp１６０の蛋白質分解性の切断によってgp１２
０及びgp４１が生成するとする仮説を支持する。
35Ｓ〕メチオニンを加えた低メチオニン濃度の培地（１
０6細胞に対し１ｍｌ）を加える。細胞を３７℃でイン
キュベートし、標識された蛋白質を遠心分離によって集
める。ペレットと上澄みに分離したのち、蛋白質をエイ
ズ患者の血清と共にインキュベートする。該血清と反応
する蛋白質をプロテインＡ−セファローズ樹脂に吸着さ
せて回収し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって広げ、オートラジオグラフィを行う（Ｌatheら、
１９８０年の手法による）。オートラジオグラフは、エ
イズ患者の血清が感染細胞抽出物中の３種の蛋白質と特
異的に結合することを示す（この結果は、他の患者の血
清を用いて得られるものと同一又は類似である）。見掛
けの分子量１６０、１２０及び４１ＫＤは、標準env 糖
蛋白質調製物中及びＬＡＶウイルス感染細胞の抽出物中
にエイズ患者の血清を用いて確認されたgp１６０、gp１
２０及びgp４１のバンドとの同等性を示唆する。ＬＡＶ
のenv 遺伝子のコード配列のみを有する組換えベクター
から３種の蛋白質が発現されるというこの観察は、一次
翻訳産物gp１６０の蛋白質分解性の切断によってgp１２
０及びgp４１が生成するとする仮説を支持する。
【００９８】env をコードする配列は約９０ＫＤの一次
翻訳産物をもたらす。一方、上記の方法で得られるenv
前駆体は約１６０ＫＤという見掛け分子量をもつ。この
差は、かなりの量のグリコシル化のあることに帰され
る。グリコシル基を除去するエンドグリコシダーゼＦで
消化することにより、本発明により得られた生成物と予
想生成物との良好な相関を証明することができた（図
１）。
翻訳産物をもたらす。一方、上記の方法で得られるenv
前駆体は約１６０ＫＤという見掛け分子量をもつ。この
差は、かなりの量のグリコシル化のあることに帰され
る。グリコシル基を除去するエンドグリコシダーゼＦで
消化することにより、本発明により得られた生成物と予
想生成物との良好な相関を証明することができた（図
１）。
【００９９】実施例５ ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ９−１ウイルス接種マウスでの抗
env 抗体の証明 ２週令の雄性Ｂalb/c マウスにＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ９
−１を１頭当り５×１０7pfu の皮下注射により接種す
る。２週間後、それらマウスに同用量でブースター注射
を行い、ブースターから１、２及び４週間後に血液サン
プルを採取する。それらの血清中にＬＡＶウイルス及び
ワクシニアウイルスの抗原決定基に対する抗体が存在し
ないか調べる。
env 抗体の証明 ２週令の雄性Ｂalb/c マウスにＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ９
−１を１頭当り５×１０7pfu の皮下注射により接種す
る。２週間後、それらマウスに同用量でブースター注射
を行い、ブースターから１、２及び４週間後に血液サン
プルを採取する。それらの血清中にＬＡＶウイルス及び
ワクシニアウイルスの抗原決定基に対する抗体が存在し
ないか調べる。
【０１００】接種した動物の全てが、ＥＬＩＳＡ試験で
ワクシニアウイルスと反応しうる血清を与える。これに
対し、ＬＡＶウイルスに対するＥＬＩＳＡ試験での応答
は弱く、再現性も低い。試験の感度を向上させるべく、
「ウェスタンブロッティング」の手法を用いた。この方
法は、ＬＡＶウイルスの蛋白質と反応しうる抗体を、そ
れら蛋白質を電気泳動ゲル中でＳＤＳにより変性し、ニ
トロセルロース膜へ移したのちに証明できるようにす
る。この実験では、使用したニトロセルロース膜は、Ｄ
iagnostic −Ｐasteurが販売しているＬＡＶ−ＢＬＯＴ
のそれであり、それにはＬＡＶウイルスの蛋白質が既に
結合されている。これらの膜を細片状に切断し、各細片
を接種マウスの血清（１／２０希釈）と共にインキュベ
ートする。ペルオキシダーゼに結合させた第二抗体（ヒ
ツジ抗マウス）が、マウス抗体に結合したＬＡＶウイル
ス蛋白質の可視化を可能とする。
ワクシニアウイルスと反応しうる血清を与える。これに
対し、ＬＡＶウイルスに対するＥＬＩＳＡ試験での応答
は弱く、再現性も低い。試験の感度を向上させるべく、
「ウェスタンブロッティング」の手法を用いた。この方
法は、ＬＡＶウイルスの蛋白質と反応しうる抗体を、そ
れら蛋白質を電気泳動ゲル中でＳＤＳにより変性し、ニ
トロセルロース膜へ移したのちに証明できるようにす
る。この実験では、使用したニトロセルロース膜は、Ｄ
iagnostic −Ｐasteurが販売しているＬＡＶ−ＢＬＯＴ
のそれであり、それにはＬＡＶウイルスの蛋白質が既に
結合されている。これらの膜を細片状に切断し、各細片
を接種マウスの血清（１／２０希釈）と共にインキュベ
ートする。ペルオキシダーゼに結合させた第二抗体（ヒ
ツジ抗マウス）が、マウス抗体に結合したＬＡＶウイル
ス蛋白質の可視化を可能とする。
【０１０１】いくつかの血清（１２／２７）が、env の
gp１６０に相当する分子量約１６０ＫＤの蛋白質と特異
的反応を呈する（図２）。いくつかの血清では、gp４１
蛋白質との反応も観察される。少数のマウスの血清が、
ウエスタンブロッティングで、膜に結合させたＬＡＶウ
イルスの未同定蛋白質に相当するシグナルを生じること
を注記しておくべきであろう。
gp１６０に相当する分子量約１６０ＫＤの蛋白質と特異
的反応を呈する（図２）。いくつかの血清では、gp４１
蛋白質との反応も観察される。少数のマウスの血清が、
ウエスタンブロッティングで、膜に結合させたＬＡＶウ
イルスの未同定蛋白質に相当するシグナルを生じること
を注記しておくべきであろう。
【０１０２】実施例６ ｐＴＧ１１２８の構築 このプラスミドｐＴＧ１１２８は、トランスメンブレン
領域をコードする配列が変異されていて、アルギニンが
イソロイシンにより置換されるようになっている以外
は、プラスミド１１２５と同じである。この変異は、細
胞膜中での当該蛋白質の付着を改善するためのものであ
る。
領域をコードする配列が変異されていて、アルギニンが
イソロイシンにより置換されるようになっている以外
は、プラスミド１１２５と同じである。この変異は、細
胞膜中での当該蛋白質の付着を改善するためのものであ
る。
【０１０３】実施例２に記載したenv のトランスメンブ
レン領域を含有するｐＴＧ１１２４のＨind III−Ｂam
ＨＩ断片を、Ｈind III−ＢamＨＩ消化後のファージＭ
１３ＴＣ１３１へ挿入する。これによりファージＭ１３
ＴＧ１５４が得られる。
レン領域を含有するｐＴＧ１１２４のＨind III−Ｂam
ＨＩ断片を、Ｈind III−ＢamＨＩ消化後のファージＭ
１３ＴＣ１３１へ挿入する。これによりファージＭ１３
ＴＧ１５４が得られる。
【０１０４】次にこのファージＭ１３ＴＧ１５４につい
て、アルギニンをコードするコドンをイソロイシンをコ
ードするコドンにより置換するようデザインされた限局
性変異誘発を行う。この目的のため、次のオリゴヌクレ
オチドを用いる：５′ＧＧＴＴＴＡＡＴＡＡＴＡＧＴＴ
ＴＴ３′かくして、ファージＭ１３ＴＧ１５５が得ら
れ、その配列は次のように修飾されている： かくして変異したＢamＨＩ−Ｈind III断片をＭ１３
ＴＧ１５５からプラスミドｐＴＧ１１２４の相当する部
位へ移すと、プラスミドｐＴＧ１１２７が得られ、この
ものは、アルギニンコドンがイソロイシンコドンにより
置換されている以外は上述のものと同じenv 遺伝子を再
び形成する。
て、アルギニンをコードするコドンをイソロイシンをコ
ードするコドンにより置換するようデザインされた限局
性変異誘発を行う。この目的のため、次のオリゴヌクレ
オチドを用いる：５′ＧＧＴＴＴＡＡＴＡＡＴＡＧＴＴ
ＴＴ３′かくして、ファージＭ１３ＴＧ１５５が得ら
れ、その配列は次のように修飾されている： かくして変異したＢamＨＩ−Ｈind III断片をＭ１３
ＴＧ１５５からプラスミドｐＴＧ１１２４の相当する部
位へ移すと、プラスミドｐＴＧ１１２７が得られ、この
ものは、アルギニンコドンがイソロイシンコドンにより
置換されている以外は上述のものと同じenv 遺伝子を再
び形成する。
【０１０５】実施例１に記載した通りにして、ｐＴＧ１
１２７のＰstＩ−ＰstＩ断片をプラスミドｐＴＧ１８６
−ＰＯＬＹのＰstＩ部位中にクローン化して、プラスミ
ドｐＴＧ１１２８を得る。
１２７のＰstＩ−ＰstＩ断片をプラスミドｐＴＧ１８６
−ＰＯＬＹのＰstＩ部位中にクローン化して、プラスミ
ドｐＴＧ１１２８を得る。
【０１０６】実施例７ プラスミドｐＴＧ１１３０の構築 このプラスミドでは、狂犬病糖蛋白質のトランスメンブ
レン領域をコードする配列が、env 糖蛋白質の疎水性蛋
白質をコードする配列の最初と融合している。
レン領域をコードする配列が、env 糖蛋白質の疎水性蛋
白質をコードする配列の最初と融合している。
【０１０７】狂犬病糖蛋白質のトランスメンブレン領域
は、ファージＭ１３ ＴＧＲＧ１５１のＢamＨＩ−Ｐst
Ｉ断片に由来している。
は、ファージＭ１３ ＴＧＲＧ１５１のＢamＨＩ−Ｐst
Ｉ断片に由来している。
【０１０８】この断片をファージＭ１３ＴＧ１５４のＢ
amＨＩ部位とＰstＩ部位との間にクローン化する（上記
実施例参照）。かくしてファージＭ１３ ＴＧ１５６が
得られる。
amＨＩ部位とＰstＩ部位との間にクローン化する（上記
実施例参照）。かくしてファージＭ１３ ＴＧ１５６が
得られる。
【０１０９】次に、Ｍ１３ＴＧ１５６に対して限局性変
異誘発を行って、env 配列と狂犬病配列を、オリゴヌク
レオチドを用い、５′ＧＣＴＧＴＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡ
ＡＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧ３′ループを形成
させることにより同調的に融合させる。
異誘発を行って、env 配列と狂犬病配列を、オリゴヌク
レオチドを用い、５′ＧＣＴＧＴＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡ
ＡＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧ３′ループを形成
させることにより同調的に融合させる。
【０１１０】
【化２】
【０１１１】かくしてファージＭ１３ＴＧ１５７を得
る。
る。
【０１１２】env 遺伝子と融合させたばかりの狂犬病糖
蛋白質のトランスメンブレン（tm）領域を次にプラスミ
ドｐＴＧ１１２４に移入する。
蛋白質のトランスメンブレン（tm）領域を次にプラスミ
ドｐＴＧ１１２４に移入する。
【０１１３】この目的のため、Ｍ１３ＴＧ１５７のＨin
d III−ＢglII断片を、Ｈind III−ＢamＨＩ制限を行っ
たｐＴＧ１１２４中にクローニングする（これによりＢ
amＨＩ部位及びＢglII部位がこわされる）。
d III−ＢglII断片を、Ｈind III−ＢamＨＩ制限を行っ
たｐＴＧ１１２４中にクローニングする（これによりＢ
amＨＩ部位及びＢglII部位がこわされる）。
【０１１４】Ｍ１３ＴＧ１５７のＢglII部位は狂犬病gp
断片：
断片：
【０１１５】
【化３】
【０１１６】に由来する。
【０１１７】かくしてプラスミドｐＴＧ１１２６を得
る。
る。
【０１１８】上記と同様に、ｐＴＧ１１２６のＰstＩ−
ＰstＩ断片をｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にク
ローニングして、プラスミドｐＴＧ１１３０を得る。
ＰstＩ断片をｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にク
ローニングして、プラスミドｐＴＧ１１３０を得る。
【０１１９】実施例８ ｐＴＧ１１３１の構築 このプラスミドを構築する目的は、env 遺伝子のシグナ
ル配列と狂犬病糖蛋白質のシグナル配列とを融合させる
ことである。
ル配列と狂犬病糖蛋白質のシグナル配列とを融合させる
ことである。
【０１２０】狂犬病糖蛋白質のシグナル配列をプラスミ
ドｐＴＧ１１５ＰＲＯからＢglII−Ｈind III断片の形
で取り出し、下記配列をもつ一本鎖アダプターを用いて
Ｍ１３ＴＧ１３０のＰstＩ−Ｈind III部位にクローニ
ングする： ５′ＧＡＴＣＴＧＣＡ３′ かくしてファージＭ１３ ＴＧ１５８を得る。
ドｐＴＧ１１５ＰＲＯからＢglII−Ｈind III断片の形
で取り出し、下記配列をもつ一本鎖アダプターを用いて
Ｍ１３ＴＧ１３０のＰstＩ−Ｈind III部位にクローニ
ングする： ５′ＧＡＴＣＴＧＣＡ３′ かくしてファージＭ１３ ＴＧ１５８を得る。
【０１２１】次に、env シグナルペプチドのＭ１３ＴＧ
１５８への移行を行って、これを、狂犬病糖蛋白質のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子と融合させる。
１５８への移行を行って、これを、狂犬病糖蛋白質のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子と融合させる。
【０１２２】この目的で、Ｓ１ヌクレアーゼで、ついで
クレノー及びＫpnＩで処理したＰstＩ断片を、Ｈind II
Iで切断し、クレノー−ＫpnＩで処理したＭ１３ ＴＧ
１５８中にクローニングする：
クレノー及びＫpnＩで処理したＰstＩ断片を、Ｈind II
Iで切断し、クレノー−ＫpnＩで処理したＭ１３ ＴＧ
１５８中にクローニングする：
【０１２３】
【化４】
【０１２４】かくしてファージＭ１３ ＴＧ１５９を得
る。
る。
【０１２５】Ｍ１３ ＴＧ１５９のＫpnＩ−ＰstＩブロ
ックをＭ１３ＴＧ１３１中へ移し、プラスミドＭ１３
ＴＧ１６０を得る。
ックをＭ１３ＴＧ１３１中へ移し、プラスミドＭ１３
ＴＧ１６０を得る。
【０１２６】
【化５】
【０１２７】Ｍ１３ ＴＧ１６０に対して限局性変異誘
発を行うと、env 配列と狂犬病糖蛋白質配列とを同調的
に融合させうる（ループを形成させて）。これは次のオ
リゴヌクレオチドを用いて達成される：
発を行うと、env 配列と狂犬病糖蛋白質配列とを同調的
に融合させうる（ループを形成させて）。これは次のオ
リゴヌクレオチドを用いて達成される：
【０１２８】
【化６】
【０１２９】かくしてファージＭ１３ ＴＧ１６１を得
る。
る。
【０１３０】１３ ＴＧ１６１のＰvuII−ＫpnＩ断片を
次に、ＥcoＲＩで切断し、クレノー−ＫpnＩで処理した
ｐＴＧ１１２６中へクローニングする（Ｍ１３ ＴＧ１
６１のＰvuII部位は、ポリリンカーの上流に位置する領
域中のＭ１３に由来する）。これによりプラスミドｐＴ
Ｇ１１２９を得る。
次に、ＥcoＲＩで切断し、クレノー−ＫpnＩで処理した
ｐＴＧ１１２６中へクローニングする（Ｍ１３ ＴＧ１
６１のＰvuII部位は、ポリリンカーの上流に位置する領
域中のＭ１３に由来する）。これによりプラスミドｐＴ
Ｇ１１２９を得る。
【０１３１】ｐＴＧ１１２９のＰstＩ−ＰstＩ断片の、
ＰstＩ切断プラスミドｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹ中へのク
ローニングにより、プラスミドｐＴＧ１１３１を得る。
ＰstＩ切断プラスミドｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹ中へのク
ローニングにより、プラスミドｐＴＧ１１３１を得る。
【０１３２】実施例９ プラスミドｐＴＧ１１３２の調
製 ｐＴＧ１１２８のＰstＩ−ＰstＩ断片をＭ１３ ＴＧ１
３１のＰstＩ部位にクローニングすることにより、プラ
スミドＭ１３ ＴＧ１６２を得る。
製 ｐＴＧ１１２８のＰstＩ−ＰstＩ断片をＭ１３ ＴＧ１
３１のＰstＩ部位にクローニングすることにより、プラ
スミドＭ１３ ＴＧ１６２を得る。
【０１３３】次にオリゴヌクリオチド
【０１３４】
【化７】
【０１３５】を用いて限界性変異誘発を行う。
【０１３６】これにより、停止コドンをgp１２０の最後
に位置させることができる。得られた配列は次の通りで
ある：
に位置させることができる。得られた配列は次の通りで
ある：
【０１３７】
【化８】
【０１３８】かくしてファージＭ１３ ＴＧ１６８を得
る。
る。
【０１３９】Ｍ１３ ＴＧ１６８のＰstＩ断片をｐＴＧ
１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にクローニングすること
により、プラスミドｐＴＧ１１３２を得る。
１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にクローニングすること
により、プラスミドｐＴＧ１１３２を得る。
【０１４０】実施例１０ プラスミドｐＴＧ１１３３の
構築 次のオリゴヌクレオチドを用いたＭ１３ ＴＧ１６２の
限局性変異誘発により、gp１２０とgp４０とを分離する
潜在性切断部位が破壊されたバクテリアファージを得
る：
構築 次のオリゴヌクレオチドを用いたＭ１３ ＴＧ１６２の
限局性変異誘発により、gp１２０とgp４０とを分離する
潜在性切断部位が破壊されたバクテリアファージを得
る：
【０１４１】
【化９】
【０１４２】装飾された配列は次の通りである：
【０１４３】
【化１０】
【０１４４】かくしてファージＭ１３ ＴＧ１６５を得
る。
る。
【０１４５】Ｍ１３ ＴＧ１６５のＰstＩ−ＰstＩ断片
をｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にクローニング
することにより、プラスミドｐＴＧ１１３３を得る。
をｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にクローニング
することにより、プラスミドｐＴＧ１１３３を得る。
【０１４６】実施例１１ プラスミドｐＴＧ１１３４の
構築 ｐＴＧ１１３１のＰstＩ−ＰstＩ断片をＭ１３ ＴＧ１
３１のＰstＩ部位にクローニングすることにより、ファ
ージＭ１３ ＴＧ１６３を得る。
構築 ｐＴＧ１１３１のＰstＩ−ＰstＩ断片をＭ１３ ＴＧ１
３１のＰstＩ部位にクローニングすることにより、ファ
ージＭ１３ ＴＧ１６３を得る。
【０１４７】上記と同じgp１２０の切断部位を破壊する
ために、Ｍ１３ ＴＧ１６３に対して限局性変異誘発を
行う。この目的には、次のオリゴヌクレオチドを用い
る：
ために、Ｍ１３ ＴＧ１６３に対して限局性変異誘発を
行う。この目的には、次のオリゴヌクレオチドを用い
る：
【０１４８】
【化１１】
【０１４９】これにより配列を次のように装飾できる：
【０１５０】
【化１２】
【０１５１】これらの条件下に、ファージＭ１３ ＴＧ
１６６を得る。
１６６を得る。
【０１５２】ファージＭ１３ ＴＧ１６６のＰstＩ−Ｐ
stＩ断片をｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位に再ク
ローニングすることにより、プラスミドｐＴＧ１１３４
を得る。
stＩ断片をｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位に再ク
ローニングすることにより、プラスミドｐＴＧ１１３４
を得る。
【０１５３】実施例１２ ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ組換えウイルスにより合成された
蛋白質の免疫沈降 プラスミドｐＴＧ１１２５について上に記載した通り作
業して、上記で調製した各種プラスミドに対応するハイ
ブリッドワクシニアベクターを得る。
蛋白質の免疫沈降 プラスミドｐＴＧ１１２５について上に記載した通り作
業して、上記で調製した各種プラスミドに対応するハイ
ブリッドワクシニアベクターを得る。
【０１５４】これらのウイルスベクターをそれぞれ ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ１１２８ ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ１１３０ ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ１１３１ ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ１１３２ ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ１１３３ ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ１１３４． と名付ける。
【０１５５】上記のようにして得た蛋白質を免疫沈降に
より試験する（図３）。
より試験する（図３）。
【０１５６】ウイルス９−１については、免疫沈降物群
がgp１６０、gp１２０及びgp４１に相当する免疫沈降を
示す。
がgp１６０、gp１２０及びgp４１に相当する免疫沈降を
示す。
【０１５７】ウイルス１１２８についても同様である。
【０１５８】ウイルス１１３０もgp１６０及びgp１２０
を示す。
を示す。
【０１５９】gp４１に対応する蛋白質はそのＣ末端の装
飾のため僅かに低い分子量をもつ。
飾のため僅かに低い分子量をもつ。
【０１６０】ウイルス１１３１は、ウイルス１１３０で
得られるものと実質的に同一のスペクトルを示す。
得られるものと実質的に同一のスペクトルを示す。
【０１６１】ウイルス１１３２は当然のことながらgp４
１に対応する蛋白質を示さない。ペレット中に存在する
１０５ＫＤの蛋白質はgp１２０のイソフォーム（グリコ
シル化の相違）である。
１に対応する蛋白質を示さない。ペレット中に存在する
１０５ＫＤの蛋白質はgp１２０のイソフォーム（グリコ
シル化の相違）である。
【０１６２】ウイルス１１３３に関しては、これは蛋白
質１６０、１２０及び４１を明瞭に示すが、蛋白質１２
０及び４１に対応するバンドは他のスペクトルの場合よ
りも弱い。
質１６０、１２０及び４１を明瞭に示すが、蛋白質１２
０及び４１に対応するバンドは他のスペクトルの場合よ
りも弱い。
【０１６３】ウイルス１１３４についても同じで、これ
の場合にも、４１の分子量が低いが、ウイルスＶＶ．Ｔ
Ｇ．１１２５（９−１）〜１１３１と比較して切断が遅
い速度で起っていることが明らかである。
の場合にも、４１の分子量が低いが、ウイルスＶＶ．Ｔ
Ｇ．１１２５（９−１）〜１１３１と比較して切断が遅
い速度で起っていることが明らかである。
【０１６４】実施例１３ プラスミドｐＴＧ１１３５の構築 ＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ１１３３及び１１３４について行
った放出の速度論的解析は、gp１２０とgp４１との間の
切断の速度は遅いが、それでも切断は起ることを示す。
env 遺伝子のＤＮＡ配列を調べると、第一の切断部位か
ら８アミノ酸下流にもう一つ潜在的切断部位（ＫＲＲ）
のあることが分る。それ故、gp１６０のみを発現する組
換えワクシニアウイルスを得るにはこの第二の部位を変
異させることが重要であろう。
った放出の速度論的解析は、gp１２０とgp４１との間の
切断の速度は遅いが、それでも切断は起ることを示す。
env 遺伝子のＤＮＡ配列を調べると、第一の切断部位か
ら８アミノ酸下流にもう一つ潜在的切断部位（ＫＲＲ）
のあることが分る。それ故、gp１６０のみを発現する組
換えワクシニアウイルスを得るにはこの第二の部位を変
異させることが重要であろう。
【０１６５】次のヌクレオチドを用いたＭ１３ ＴＧ１
６６の限局性変異誘発により、第二の切断部位を装飾し
たファージを得る：
６６の限局性変異誘発により、第二の切断部位を装飾し
たファージを得る：
【０１６６】
【化１３】
【０１６７】装飾された配列は次の通りである：
【０１６８】
【化１４】
【０１６９】得られたファージ（Ｍ１３ ＴＧ１８１）
のＰstＩ−ＰstＩ断面をｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰst
Ｉ部位にクローニングして、プラスミドｐＴＧ１１３５
を生ぜしめる。
のＰstＩ−ＰstＩ断面をｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰst
Ｉ部位にクローニングして、プラスミドｐＴＧ１１３５
を生ぜしめる。
【０１７０】実施例１４ プラスミドｐＴＧ１１３９の
構築 組換えワクシニアベクターＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ１１３
５により合成されるenv 遺伝子のＣ末端部は狂犬病糖蛋
白質由来の配列である。従って、このＣ末端部分がＬＡ
Ｖウイルスのenv 遺伝子のＣ末端部分によって置換され
た他の組換え体をもつことも有用と思われる。
構築 組換えワクシニアベクターＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ１１３
５により合成されるenv 遺伝子のＣ末端部は狂犬病糖蛋
白質由来の配列である。従って、このＣ末端部分がＬＡ
Ｖウイルスのenv 遺伝子のＣ末端部分によって置換され
た他の組換え体をもつことも有用と思われる。
【０１７１】この目的で、ファージＭ１３ ＴＧ１６６
について行った（実施例１３参照）と同じ変異誘発をフ
ァージＭ１３ＴＧ１６５に対して行って、ファージＭ１
３ＴＧ１８４を生ぜしめる。
について行った（実施例１３参照）と同じ変異誘発をフ
ァージＭ１３ＴＧ１６５に対して行って、ファージＭ１
３ＴＧ１８４を生ぜしめる。
【０１７２】Ｍ１３ＴＧ１８４のＰstＩ−ＰstＩ断片を
次にプラスミドｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹ中にクローニン
グして、プラスミドｐＴＧ１１３９を生ぜしめる。
次にプラスミドｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹ中にクローニン
グして、プラスミドｐＴＧ１１３９を生ぜしめる。
【０１７３】実施例１５ プラスミドｐＴＧ１１３６の
構築 gp１２０のみを発現する組換えワクシニアウイルスをも
つことも望ましいであろう。このgp１２０は、ＶＶ．Ｔ
Ｇ．ｅＬＡＶ１１３２ウイルスで得たものと違い、Ｃ末
端係留（アンカレッジ）領域を備えているであろう。
構築 gp１２０のみを発現する組換えワクシニアウイルスをも
つことも望ましいであろう。このgp１２０は、ＶＶ．Ｔ
Ｇ．ｅＬＡＶ１１３２ウイルスで得たものと違い、Ｃ末
端係留（アンカレッジ）領域を備えているであろう。
【０１７４】この目的で、次のヌクレオチドを用いた限
局性変異誘発により、ファージＭ１３ ＴＧ１８１中の
gp４０に対応する配列を除去する：
局性変異誘発により、ファージＭ１３ ＴＧ１８１中の
gp４０に対応する配列を除去する：
【０１７５】
【化１５】
【０１７６】このオリゴヌクレオチドは、gp１２０の配
列（装飾された切断部位を２か所もつ）と狂犬病糖蛋白
質のトランスメンブレン領域の配列とを同調的に融合さ
せることを可能にする。
列（装飾された切断部位を２か所もつ）と狂犬病糖蛋白
質のトランスメンブレン領域の配列とを同調的に融合さ
せることを可能にする。
【０１７７】
【化１６】
【０１７８】かくしてファージＭ１３ＴＧ１８２を得
る。ファージＭ１３ＴＧ１８２のＰstＩ−ＰstＩ断片を
次にｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位に挿入して、
プラスミドｐＴＧ１１３６を生ぜしめる。
る。ファージＭ１３ＴＧ１８２のＰstＩ−ＰstＩ断片を
次にｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位に挿入して、
プラスミドｐＴＧ１１３６を生ぜしめる。
【０１７９】実施例１６ プラスミドｐＴＧ１１３７の
構築 gp４０のＮ末端部に位置する疎水性領域の役割は殆ど知
られていない。env 蛋白質のこの領域は、シンシチウム
形成誘発能の要因となっているのかもしれない。
構築 gp４０のＮ末端部に位置する疎水性領域の役割は殆ど知
られていない。env 蛋白質のこの領域は、シンシチウム
形成誘発能の要因となっているのかもしれない。
【０１８０】従って、この配列を有しないgp１６０を生
成させることも有利であると思われる。
成させることも有利であると思われる。
【０１８１】この目的のため、ファージＭ１３ＴＧ１８
１中のこの疎水性ペプチドをコードしている部分の上流
及び下流の配列を、次のオリゴヌクレオチドを用いて融
合させる：
１中のこの疎水性ペプチドをコードしている部分の上流
及び下流の配列を、次のオリゴヌクレオチドを用いて融
合させる：
【０１８２】
【化１７】
【０１８３】これは、下記融合を行うことによってファ
ージＭ１３ＴＧ１８３を得ることを可能ならしめる：
ージＭ１３ＴＧ１８３を得ることを可能ならしめる：
【０１８４】
【化１８】
【０１８５】Ｍ１３ＴＧ１８３のＰstＩ−ＰstＩ断片を
ｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位に再クローニング
して、プラスミドｐＴＧ１１３７を生ぜしめる。
ｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位に再クローニング
して、プラスミドｐＴＧ１１３７を生ぜしめる。
【０１８６】実施例１７ プラスミドｐＴＧ１１３８の
構築 gp１６０又はgp１２０を発現する組換えウイルスに加え
て、gp４０のみを発現する組換えワクシニアウイルスを
生ぜしめることは有用であろう。
構築 gp１６０又はgp１２０を発現する組換えウイルスに加え
て、gp４０のみを発現する組換えワクシニアウイルスを
生ぜしめることは有用であろう。
【０１８７】この目的で、シグナルペプチドをコードす
る配列を、ファージＭ１３ＴＧ１６３上でgp４０をコー
ドする配列と、次のヌクレオチドを用いて融合させる：
る配列を、ファージＭ１３ＴＧ１６３上でgp４０をコー
ドする配列と、次のヌクレオチドを用いて融合させる：
【０１８８】
【化１９】
【０１８９】これは、次の融合を含むファージＭ１３Ｔ
Ｇ１８０の生成を可能ならしめる：
Ｇ１８０の生成を可能ならしめる：
【０１９０】
【化２０】
【０１９１】Ｍ１３ＴＧ１８０のＰstＩ−ＰstＩ断片を
ｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位に挿入して、プラ
スミドｐＴＧ１１３８を得る。
ｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位に挿入して、プラ
スミドｐＴＧ１１３８を得る。
【０１９２】実施例１８ プラスミドｐＴＧ１１６２の
構築 gp１６０の場合（プラスミドｐＴＧ１１３９）の場合と
同様に、係留領域及び細胞質内領域が対応する狂犬病糖
蛋白質の配列ではなくＬＡＶウイルスのenv 遺伝子の配
列であるgp４０発現組換えウイルスをもつことも重要で
あろう。
構築 gp１６０の場合（プラスミドｐＴＧ１１３９）の場合と
同様に、係留領域及び細胞質内領域が対応する狂犬病糖
蛋白質の配列ではなくＬＡＶウイルスのenv 遺伝子の配
列であるgp４０発現組換えウイルスをもつことも重要で
あろう。
【０１９３】これを得るべく、Ｍ１３ＴＧ１８０のＨin
d III−ＢglＩ断片をＭ１３ＴＧ１６５のＨind III−Ｂ
glＩ断片により置換して、ファージＭ１３ＴＧ１９０を
生ぜしめる。
d III−ＢglＩ断片をＭ１３ＴＧ１６５のＨind III−Ｂ
glＩ断片により置換して、ファージＭ１３ＴＧ１９０を
生ぜしめる。
【０１９４】ファージＭ１３ＴＧ１９０のＰstＩ−Ｐst
Ｉ断片をプラスミドｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部
位にクローニングすることにより、プラスミドｐＴＧ１
１６２を得る。
Ｉ断片をプラスミドｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部
位にクローニングすることにより、プラスミドｐＴＧ１
１６２を得る。
【０１９５】実施例１９ プラスミドｐＴＧ１１６３の構築 切断されずに培地中へ分泌されるgp１６０を合成する組
換えワクシニアウイルスを得ることも重要と思われる。
実際には、この蛋白質は、死菌ワクチンとして、アジュ
バントと組合せて又はリポソームやＩＳＣＯＭＳ〔Ｍor
einら、Ｎatire（１９８４）３０８、５９５８、ｐ４５
７−６０〕中に挿入して使用することができよう。
換えワクシニアウイルスを得ることも重要と思われる。
実際には、この蛋白質は、死菌ワクチンとして、アジュ
バントと組合せて又はリポソームやＩＳＣＯＭＳ〔Ｍor
einら、Ｎatire（１９８４）３０８、５９５８、ｐ４５
７−６０〕中に挿入して使用することができよう。
【０１９６】この目的で、細胞質外領域及び細胞質内領
域をコードする配列がバクテリオファージＭ１３ＴＧ１
８４中で同調的に融合しているバクテリオファージＭ１
３ＴＧ１９４を次のオリゴヌクレオチドを用いて構築す
る：
域をコードする配列がバクテリオファージＭ１３ＴＧ１
８４中で同調的に融合しているバクテリオファージＭ１
３ＴＧ１９４を次のオリゴヌクレオチドを用いて構築す
る：
【０１９７】
【化２１】
【０１９８】Ｍ１３ＴＧ１９４のＰstＩ−ＰstＩ断片を
次にｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にクローニン
グして、ｐＴＧ１１６３を得る。
次にｐＴＧ１８６−ＰＯＬＹのＰstＩ部位にクローニン
グして、ｐＴＧ１１６３を得る。
【０１９９】かくして得た組換え蛋白質、特に非切断性
gp１６０は、該ウイルスと接触した患者の血液中に存在
する潜在的抗体を検出するための診断キットに利用でき
る。これらの試験は、当業者によく知られた方法、例え
ばＥＬＩＳＡ、ＲＩＰＡ又は「ウエスタンブロッティン
グ」（免疫インプリンティング）により実施できる。
gp１６０は、該ウイルスと接触した患者の血液中に存在
する潜在的抗体を検出するための診断キットに利用でき
る。これらの試験は、当業者によく知られた方法、例え
ばＥＬＩＳＡ、ＲＩＰＡ又は「ウエスタンブロッティン
グ」（免疫インプリンティング）により実施できる。
【０２００】これらの蛋白質は、サンプル中のウイルス
の存在を検出するようデザインされたモノクローナル抗
体及びハイブリドーマの生産のためにも使用できる。
の存在を検出するようデザインされたモノクローナル抗
体及びハイブリドーマの生産のためにも使用できる。
【０２０１】用いた種々のプラスミド及びＭ１３ファー
ジは、とりわけ下記特許出願等に、記載されている： Ｍ１３ ＴＧ１３１：Ｋienyら、１９８３年 Ｍ１３ ＴＧＲＧ１５１：ＷＯ８３／０４０５２ ｐＴＧ１５５ＰＲＯ：ＦＲ８４ ０６４９９ Ｍ１３ＴＧ１３０：Ｋienyら、１９８３年 下記プラスミドは、１９８４年１１月１６日にパスツー
ル研究所の国立微生物培養コレクション（ＣＮＣＭ）に
寄託されており、特許明細書ＧＢ−Ａ−８４／２９，０
９９中に記載されている： ＰＪ１９−６：ＣＮＣＭ No.３６６−Ｉ ＰＪ１９−１３：ＣＮＣＭ No.３６７−Ｉ プラスミドｐＴＧ１１２５は、１９８６年６月６日に同
コレクションに、形質転換細菌Ｅ．coli１１０６／ｐＴ
Ｇ１１２５の形で、No.Ｉ−５５７として寄託されてい
る。
ジは、とりわけ下記特許出願等に、記載されている： Ｍ１３ ＴＧ１３１：Ｋienyら、１９８３年 Ｍ１３ ＴＧＲＧ１５１：ＷＯ８３／０４０５２ ｐＴＧ１５５ＰＲＯ：ＦＲ８４ ０６４９９ Ｍ１３ＴＧ１３０：Ｋienyら、１９８３年 下記プラスミドは、１９８４年１１月１６日にパスツー
ル研究所の国立微生物培養コレクション（ＣＮＣＭ）に
寄託されており、特許明細書ＧＢ−Ａ−８４／２９，０
９９中に記載されている： ＰＪ１９−６：ＣＮＣＭ No.３６６−Ｉ ＰＪ１９−１３：ＣＮＣＭ No.３６７−Ｉ プラスミドｐＴＧ１１２５は、１９８６年６月６日に同
コレクションに、形質転換細菌Ｅ．coli１１０６／ｐＴ
Ｇ１１２５の形で、No.Ｉ−５５７として寄託されてい
る。
【０２０２】参 考 資 料 １．ドリリアン，アール．(Drillien,R.) ，スペーナ
ー，デイー．(Spehner,D.)，ヴィアロロジー(Virolog
y)，131,385-393 (1983) ２．キーニー，エム．ピー．(Kieny,M.P.)，ラセ，アー
ル．(Lathe,R.)，ルコック，ジェイ．ピー．(Lecocq,J.
P.) ，ニュー ヴァーサタイル クローニングアンド
シークエンシング ベクターズ ベイスト オン バク
テリオファージＭ１３(New versatile cloning and seq
uencing vectors based on bacteriophage M13)，ジー
ン(Gene)，26,91-99 (1983) ３．キーニー，エム．ピー．(Kieny,M.P.)，ラセ，アー
ル．(Lathe,R.)，ドリリアン，アール．(Drillien,R.)
，スペーナー，デイー．(Spehner,D.)，スコリー，エ
ス．(Skory,S.)，シュミット，デイ(Schmitt,D.)，ヴィ
クター，テイ(Wiktor,T.) ，コプロヴスキ，エイチ．(K
oprowski,H.)，ルコック，ジェイ．ピー．(Lecocq,J.
P.) ，エクスプレション オブ ラベズ ウイルス グ
リコプロテインフロム ア リコンビナント ワクシニ
ア ウイルス(Expression of rabiesvirus glycoprotei
n from a recombinant vaccnia virus)，ネイチャー(Na
ture)，312,163-166(1984) ４．ラセ，アール．(Lathe,R.)，ハース，ピー(Hirth,
P.)，デヴィルト，エム．(Dewilde,M.)，ハーフォー
ド，エヌ．(Harford,N.)，ルコック，ジェイ．ピー．(L
ecocq,J.P.) ，セルーフリー シンテシス オブ バイ
オロジカリー アクテイブ ヒート ステイブル エン
テロトキシン オブ エケリキア コリ フロム ア
クローンドジーン(Cell-free synthesis of biological
ly active heat-stable enterotoxin of Echerichia co
li from a cloned gene)，Nature,284,473-474 (1980) ５．ラセ，アール．(Lathe,R.)，キーニー，エム．ピ
ー．(Kieny,M.P.)，シュミット，デイ(Schmitt,D.)，カ
ーチス，ピー(Curtis,P.) ，ルコック，ジェイ．ピー．
(Lecocq,J.P.) ，J. Mol. Appl. Genet.，2,331-342 (1
984) ６．ラセ，アール．(Lathe,R.)，キーニー，エム．ピ
ー．(Kieny,M.P.)，スコリー，エス．(Skory,S.)，ルコ
ック，ジェイ．ピー．(Lecocq,J.P.) ，デイエヌエイ
（ＤＮＡ），3,173-182 (1984) ７．ラスキー，エム．(Lusky,M.)，ボッキャン，エム．
(Botchan,M.)，Nature,293,79-81 (1981) ８．マケット，エム．(Mackett,M.)，スミス，ジー．エ
ル．(Smith,G.L.)，モス，ビー．(Moss.B.) ，ワクシニ
ア ウイルス ： ア セレクタブル ユーカリオテイク
クローニング アンド エクスプレション ベクター
(Vaccinia virus : a selectale eukalyotic cloning
and expression vector)，プロシーデイングス オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オ
ブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ (P
roc. Natl. Acad. Sci. USA) ，79,7415-7419 (1982) ９．マニアテイス，テイ．(Maniatis,T.) ，フリッシ
ュ，イー．エフ．(Fritsch,E.F.)，サムブルック，ジェ
イ．(Sambrook,J.) ，モレキュラー クローニング：ア
ラボラトリー マニュアル(Molecular cloning: a la
boratory manual)，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，ニューヨーク(Cold Spring Harbor La
b.,N.Y.) 10．ミュージング，エム．エイ．(Muesing,M.A.) ，ス
ミス，デイ．エイチ．(Smith,D.H.)，カブラデラ，シ
ー．デイ．(Cabradilla,C.D.) ，ベントン，シー．ヴ
イ．(Benton,C.V.) ，ラスキー，エル．エイ．(Lasky,
L.A,)，カポン，デイ．ジェイ．(Capon,D.J.)，ヌクレ
イック アシッド ストラクチャー アンド エクスプ
レッション オブ ザ ヒューマン エイズ／リンパデ
ノパシー レトロウイルス(Nucleic acid structure and
expression of human AIDS/lymphadenopathy retrovir
us) ，Nature，313,450-458 (1985) 11．メッシング(Messing) ，ヴィアラス(Vieras)，Gen
e，19,269-276 (1982) 12．パニカリ，デイ．(Pnicali,D.)，パオレッテイ，イ
ー．(Poletti,E.)，コンストラクション オブ ポック
スウイルスイズ アズ クローニング ベクターズ：イ
ンサーション オブ ザ チミジン キナーゼ ジーン
フロム ヘルペス シムプレックス ウイルス イン
トウ ザ デイエヌエイ オブ インフェクシャス ワ
クシニア ウイルス(Construction of poxvirus as clo
ning vectors:insertion of the thymidine kinase gen
e form herpes simplex virus intothe DNA of infecti
ous vaccinia virus)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，
79,4927-4931 (1982) 13．パニカリ，デイ．(Panicali,D.) ，デイヴィス，エ
ス．ダブリュ．(Davis.S.W.)，ワインバーグ，アール．
エル．(Weinberg,R.L.) ，パオレッテイ，イー．(Polet
ti,E.)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，80,5364-5368
(1983) 14．ラトナー，エル．(Ratner,L.) ，ハセルチン，ダブ
リュ．(Haseltine,W.)，パターカ，アール．(Patarca,
R.)，リヴァック，ケイ．ジェイ．(Livak,K.J.)，スタ
ーキッヒ，ビー．(Starcichi,B.)，ジョセフス，エス．
エフ．(Josephs,S.F.)，ドラン，イー．アール．．(Dor
an,E. R.) ，ラファルスキ，ジェイ．エイ．(Rafalski,
J.A.) ，ホワイトホルン，イー．エイ．(Whitehorn,E.
A.)，バウマイスター，ケイ．(Baumeister,K.) ，イワ
ノフ，エル．(Ivanoff,L.)，ペターウエイ ジュニア，
エス．アール．(Petterway Jr.,S.R.)，ペアソン，エ
ム．エル．(Peason,M.L.) ，ロイテンバーガー，ジェ
イ．エイ．(Lautenberger,J.A.) ，パパス，テイ．エ
ス．(Papas,T.S.)，グレイブ，ジェイ．(Ghrayeb,J.)，
チャン，エヌ．テイ．(Chang,N.T.)，ギャロ，アール．
シー．(Gallo,R.C.)，ウオン−スタール，エフ．(Wong-
stall,F.) ，コンプリート ヌクレオチド シークエン
スオブ ザ エイズ ウイルス，エイチテイエルヴイ−
ＩＩＩ (Complete nucleotide sequence of the AIDS v
irus, HTLV-III)，Nature，313,277-284 (1985) 15．サンチェーペスカドール(Sanchez-Pescador)等，サ
イエンス(Science)，227,484-492 (1985) 16．スミス，ジー．エル．(Smith,G.L.)，マッケト，エ
ム．(Mackett,M.)，モス，ビー．(Moss,B.)，Nature，3
02,490-495 (1983) 17．スミス，ジー．エル．(Smith,G.L.)，マーフィ，ビ
ー．アール．(Murphy,B.R.)，モス，ビー．(Moss,B.),
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA，80,7155-7159 (1983) 18．ヴェンカテサン，エス．(Venkatesan,S.)，バラウ
デイ，ビー．エム．(Baroudy,B.M.)，モス，ビー．(Mos
s,B.)，セル(Cell)，125,805-813 (1985) 19．ウエイン−ホブソン，エス．(Wain-Hobson,S,)，ソ
ニーゴ，ピー．(Sonigo,P.)，ダノス，オウ．(Danos.
O.)，コール，エス．(Cole,S.)，アリゾン，エム．(Ali
zon,M.) ，ヌクレオチド シークエンス オブ ジ エ
イズウイルス，エルエイヴイ(Nucleotide sequence of
the AIDS virus, LAV), Cell, 40,9-17 (1985) 20．ワイア，ジェイ．ピー．(Weir,J.P.)，モス，ビ
ー．(Moss,B.)，ジャーナルオブ ヴィアロロジー(J. V
irol.), 46,530-537 (1983) 21．ゾラー，エム．ジェイ．(Zoller,M.J.)，スミス，
エム．(Smith,M.)，オリゴヌクレオチド−デイレクテイ
ド ミュータゲネシス オブ デイエヌエイ フラグメ
ンツ クローンド イントウ エム１３ ベクターズ
(Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragm
ents cloned into M13 vectors), メソズイン エンザ
イモロジー(Methods in Enzymology)，100,468-500 (19
83）。
ー，デイー．(Spehner,D.)，ヴィアロロジー(Virolog
y)，131,385-393 (1983) ２．キーニー，エム．ピー．(Kieny,M.P.)，ラセ，アー
ル．(Lathe,R.)，ルコック，ジェイ．ピー．(Lecocq,J.
P.) ，ニュー ヴァーサタイル クローニングアンド
シークエンシング ベクターズ ベイスト オン バク
テリオファージＭ１３(New versatile cloning and seq
uencing vectors based on bacteriophage M13)，ジー
ン(Gene)，26,91-99 (1983) ３．キーニー，エム．ピー．(Kieny,M.P.)，ラセ，アー
ル．(Lathe,R.)，ドリリアン，アール．(Drillien,R.)
，スペーナー，デイー．(Spehner,D.)，スコリー，エ
ス．(Skory,S.)，シュミット，デイ(Schmitt,D.)，ヴィ
クター，テイ(Wiktor,T.) ，コプロヴスキ，エイチ．(K
oprowski,H.)，ルコック，ジェイ．ピー．(Lecocq,J.
P.) ，エクスプレション オブ ラベズ ウイルス グ
リコプロテインフロム ア リコンビナント ワクシニ
ア ウイルス(Expression of rabiesvirus glycoprotei
n from a recombinant vaccnia virus)，ネイチャー(Na
ture)，312,163-166(1984) ４．ラセ，アール．(Lathe,R.)，ハース，ピー(Hirth,
P.)，デヴィルト，エム．(Dewilde,M.)，ハーフォー
ド，エヌ．(Harford,N.)，ルコック，ジェイ．ピー．(L
ecocq,J.P.) ，セルーフリー シンテシス オブ バイ
オロジカリー アクテイブ ヒート ステイブル エン
テロトキシン オブ エケリキア コリ フロム ア
クローンドジーン(Cell-free synthesis of biological
ly active heat-stable enterotoxin of Echerichia co
li from a cloned gene)，Nature,284,473-474 (1980) ５．ラセ，アール．(Lathe,R.)，キーニー，エム．ピ
ー．(Kieny,M.P.)，シュミット，デイ(Schmitt,D.)，カ
ーチス，ピー(Curtis,P.) ，ルコック，ジェイ．ピー．
(Lecocq,J.P.) ，J. Mol. Appl. Genet.，2,331-342 (1
984) ６．ラセ，アール．(Lathe,R.)，キーニー，エム．ピ
ー．(Kieny,M.P.)，スコリー，エス．(Skory,S.)，ルコ
ック，ジェイ．ピー．(Lecocq,J.P.) ，デイエヌエイ
（ＤＮＡ），3,173-182 (1984) ７．ラスキー，エム．(Lusky,M.)，ボッキャン，エム．
(Botchan,M.)，Nature,293,79-81 (1981) ８．マケット，エム．(Mackett,M.)，スミス，ジー．エ
ル．(Smith,G.L.)，モス，ビー．(Moss.B.) ，ワクシニ
ア ウイルス ： ア セレクタブル ユーカリオテイク
クローニング アンド エクスプレション ベクター
(Vaccinia virus : a selectale eukalyotic cloning
and expression vector)，プロシーデイングス オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オ
ブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ (P
roc. Natl. Acad. Sci. USA) ，79,7415-7419 (1982) ９．マニアテイス，テイ．(Maniatis,T.) ，フリッシ
ュ，イー．エフ．(Fritsch,E.F.)，サムブルック，ジェ
イ．(Sambrook,J.) ，モレキュラー クローニング：ア
ラボラトリー マニュアル(Molecular cloning: a la
boratory manual)，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，ニューヨーク(Cold Spring Harbor La
b.,N.Y.) 10．ミュージング，エム．エイ．(Muesing,M.A.) ，ス
ミス，デイ．エイチ．(Smith,D.H.)，カブラデラ，シ
ー．デイ．(Cabradilla,C.D.) ，ベントン，シー．ヴ
イ．(Benton,C.V.) ，ラスキー，エル．エイ．(Lasky,
L.A,)，カポン，デイ．ジェイ．(Capon,D.J.)，ヌクレ
イック アシッド ストラクチャー アンド エクスプ
レッション オブ ザ ヒューマン エイズ／リンパデ
ノパシー レトロウイルス(Nucleic acid structure and
expression of human AIDS/lymphadenopathy retrovir
us) ，Nature，313,450-458 (1985) 11．メッシング(Messing) ，ヴィアラス(Vieras)，Gen
e，19,269-276 (1982) 12．パニカリ，デイ．(Pnicali,D.)，パオレッテイ，イ
ー．(Poletti,E.)，コンストラクション オブ ポック
スウイルスイズ アズ クローニング ベクターズ：イ
ンサーション オブ ザ チミジン キナーゼ ジーン
フロム ヘルペス シムプレックス ウイルス イン
トウ ザ デイエヌエイ オブ インフェクシャス ワ
クシニア ウイルス(Construction of poxvirus as clo
ning vectors:insertion of the thymidine kinase gen
e form herpes simplex virus intothe DNA of infecti
ous vaccinia virus)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，
79,4927-4931 (1982) 13．パニカリ，デイ．(Panicali,D.) ，デイヴィス，エ
ス．ダブリュ．(Davis.S.W.)，ワインバーグ，アール．
エル．(Weinberg,R.L.) ，パオレッテイ，イー．(Polet
ti,E.)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，80,5364-5368
(1983) 14．ラトナー，エル．(Ratner,L.) ，ハセルチン，ダブ
リュ．(Haseltine,W.)，パターカ，アール．(Patarca,
R.)，リヴァック，ケイ．ジェイ．(Livak,K.J.)，スタ
ーキッヒ，ビー．(Starcichi,B.)，ジョセフス，エス．
エフ．(Josephs,S.F.)，ドラン，イー．アール．．(Dor
an,E. R.) ，ラファルスキ，ジェイ．エイ．(Rafalski,
J.A.) ，ホワイトホルン，イー．エイ．(Whitehorn,E.
A.)，バウマイスター，ケイ．(Baumeister,K.) ，イワ
ノフ，エル．(Ivanoff,L.)，ペターウエイ ジュニア，
エス．アール．(Petterway Jr.,S.R.)，ペアソン，エ
ム．エル．(Peason,M.L.) ，ロイテンバーガー，ジェ
イ．エイ．(Lautenberger,J.A.) ，パパス，テイ．エ
ス．(Papas,T.S.)，グレイブ，ジェイ．(Ghrayeb,J.)，
チャン，エヌ．テイ．(Chang,N.T.)，ギャロ，アール．
シー．(Gallo,R.C.)，ウオン−スタール，エフ．(Wong-
stall,F.) ，コンプリート ヌクレオチド シークエン
スオブ ザ エイズ ウイルス，エイチテイエルヴイ−
ＩＩＩ (Complete nucleotide sequence of the AIDS v
irus, HTLV-III)，Nature，313,277-284 (1985) 15．サンチェーペスカドール(Sanchez-Pescador)等，サ
イエンス(Science)，227,484-492 (1985) 16．スミス，ジー．エル．(Smith,G.L.)，マッケト，エ
ム．(Mackett,M.)，モス，ビー．(Moss,B.)，Nature，3
02,490-495 (1983) 17．スミス，ジー．エル．(Smith,G.L.)，マーフィ，ビ
ー．アール．(Murphy,B.R.)，モス，ビー．(Moss,B.),
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA，80,7155-7159 (1983) 18．ヴェンカテサン，エス．(Venkatesan,S.)，バラウ
デイ，ビー．エム．(Baroudy,B.M.)，モス，ビー．(Mos
s,B.)，セル(Cell)，125,805-813 (1985) 19．ウエイン−ホブソン，エス．(Wain-Hobson,S,)，ソ
ニーゴ，ピー．(Sonigo,P.)，ダノス，オウ．(Danos.
O.)，コール，エス．(Cole,S.)，アリゾン，エム．(Ali
zon,M.) ，ヌクレオチド シークエンス オブ ジ エ
イズウイルス，エルエイヴイ(Nucleotide sequence of
the AIDS virus, LAV), Cell, 40,9-17 (1985) 20．ワイア，ジェイ．ピー．(Weir,J.P.)，モス，ビ
ー．(Moss,B.)，ジャーナルオブ ヴィアロロジー(J. V
irol.), 46,530-537 (1983) 21．ゾラー，エム．ジェイ．(Zoller,M.J.)，スミス，
エム．(Smith,M.)，オリゴヌクレオチド−デイレクテイ
ド ミュータゲネシス オブ デイエヌエイ フラグメ
ンツ クローンド イントウ エム１３ ベクターズ
(Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragm
ents cloned into M13 vectors), メソズイン エンザ
イモロジー(Methods in Enzymology)，100,468-500 (19
83）。
【図１】図１は、組換え体ＶＶＴＧｅＬＡＶ９−１及び
ＶＶＴＧｅＬＡＶ１１３２により合成され、抗ＬＡＶ血
清を用いて免疫沈降させられた蛋白質に対するendo−Ｆ
の作用を示す。この図に於て、分子量はキロドルトン単
位で示されており、符号は次の通りである： ・Ｐ、細胞ペレット、 ・Ｓ、上澄み、 ・ｕ、無処理で得られた生成物、 ・ｅ、endo−Ｆ処理後に得られた生成物。
ＶＶＴＧｅＬＡＶ１１３２により合成され、抗ＬＡＶ血
清を用いて免疫沈降させられた蛋白質に対するendo−Ｆ
の作用を示す。この図に於て、分子量はキロドルトン単
位で示されており、符号は次の通りである： ・Ｐ、細胞ペレット、 ・Ｓ、上澄み、 ・ｕ、無処理で得られた生成物、 ・ｅ、endo−Ｆ処理後に得られた生成物。
【図２】図２は、組換え体ＶＶＴＧｅＬＡＶ９−１を接
種したマウスの血清によりＬＡＶウイルスの蛋白質が認
識される様子を示す。この図に於て、Ｔは使用血清がエ
イズ患者のものである場合を示す。分子量はキロドルト
ン単位で示されている。
種したマウスの血清によりＬＡＶウイルスの蛋白質が認
識される様子を示す。この図に於て、Ｔは使用血清がエ
イズ患者のものである場合を示す。分子量はキロドルト
ン単位で示されている。
【図３】図３は、env 遺伝子を有する組換えワクシニア
ウイルスにより合成された蛋白質の免疫沈降を示す。こ
の図では、分子量はキロドルトン単位で表示されてい
る。
ウイルスにより合成された蛋白質の免疫沈降を示す。こ
の図では、分子量はキロドルトン単位で表示されてい
る。
【図４】図４は、組換えウイルスＶＶ．ＴＧ．ｅＬＡＶ
１１３５、１１３６、１１３７及び１１３８により合成
された蛋白質の免疫沈降を示す。ウイルス１１３５は培
養上澄み中には現われないgp１６０を合成する。ウイル
ス１１３６及び１１３８は、それぞれ、細胞ペレットに
関連する関連蛋白質gp１２０及びgp４０を産生する。ウ
イルス１１３７はウイルス１１３５よりも僅かに小さい
蛋白質を生産し、分子量は予期されるものに一致する。
１１３５、１１３６、１１３７及び１１３８により合成
された蛋白質の免疫沈降を示す。ウイルス１１３５は培
養上澄み中には現われないgp１６０を合成する。ウイル
ス１１３６及び１１３８は、それぞれ、細胞ペレットに
関連する関連蛋白質gp１２０及びgp４０を産生する。ウ
イルス１１３７はウイルス１１３５よりも僅かに小さい
蛋白質を生産し、分子量は予期されるものに一致する。
【図５】図５は、本発明で記載した組換えウイルスによ
り合成されたenv 蛋白質の構造を示す。 Ｓ：シグナルペプチド Ｈ：内部疎水性領域 ＴＭ：トランスメンブレン係留領域 ↑：gp１２０／gp４０切断部位 ■：狂犬病糖蛋白質由来の配列
り合成されたenv 蛋白質の構造を示す。 Ｓ：シグナルペプチド Ｈ：内部疎水性領域 ＴＭ：トランスメンブレン係留領域 ↑：gp１２０／gp４０切断部位 ■：狂犬病糖蛋白質由来の配列
配列番号：1 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CTCTCATTGT CACTGCAGTC TGCTCTTTC 29 配列番号：2 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGTTTAATAA TAGTTTT 17 配列番号：3 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCTGTGGTAT ATAAAATATG TATTACTGAG TG 32 配列番号：４ 配列の長さ：8 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GATCTGCA 8 配列番号：5 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GACCCACAAT TTTTCTGTAA TAGGGAATTT CCCAAA 36 配列番号：6 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATTCCCACTG CTTAGTATTC ATTCTGCACC ACTC 34 配列番号：7 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATTCCCACTG CTTGGTGTTC ATTCTGCACC ACTC 34 配列番号：8 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATTCCCACTG CTTGATGTTC ATTCTGCACC ACTC 34 配列番号：９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATTCTGCACC ACGTGATTCT GTGCCTTGGT GGGT 34 配列番号：10 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TGCACTCAGT AATACATACA CGTGATTCTG TGCCTT 36 配列番号：11配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CAATAATTGT CTGGCCTGCA CGTGATTCTG TGCCTT 36 配列番号：12配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＡＴＡＡＴＴＧＴ ＣＴＧＧＣＣＴＧＡＡ ＴＡＧＧＧＡＡＴＴＴ ＣＣＣ
ＡＡＡ ３６ 配列番号：13 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＴＣＣＣＴＧＣＣＴＡ ＡＣＴＣＴＡＴＴＴＴ ＴＴＡＴＡＴＡＣＣＡ ＣＡＧ
ＣＣＡ ３６
ＡＡＡ ３６ 配列番号：13 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＴＣＣＣＴＧＣＣＴＡ ＡＣＴＣＴＡＴＴＴＴ ＴＴＡＴＡＴＡＣＣＡ ＣＡＧ
ＣＣＡ ３６
フロントページの続き (72)発明者 ギー ラウトマン フランス国 Ｆ−67000 ストラスブール リュ マリノ 16 (72)発明者 ジャン−ピエール ルコック フランス国 Ｆ−67116 ライヒステート リュ デュ シャン デュ フォ ６ (72)発明者 シモン ウェイン−ホブソン フランス国 Ｆ−78180 モンティニ ル ブルトンヌー リュ ジャン ド ラ フォンテーヌ ３ (72)発明者 マルク ジラール フランス国 Ｆ−75015 パリ リュ セ ザール フランク ６ (72)発明者 リュク モンタニエ フランス国 Ｆ−92350 ル プレシス− ロビンソン リュ ド マラブリ 21
Claims (24)
- 【請求項１】 天然のｇｐ１６０糖蛋白質の配列ＲＥＫ
Ｒのプロテアーゼによる切断部位を含まない、エイズ原
因ウィルスのエンヴェロープの非切断性ｇｐ１６０糖蛋
白質からなるワクチン。 - 【請求項２】 該糖蛋白質が、天然のｇｐ１６０糖蛋白
質の配列ＲＥＫＲ及びＫＲＲのプロテアーゼによる切断
部位を含まない、請求項１に記載のワクチン。 - 【請求項３】 ＲＥＫＲ配列が、ＮＥＨＱ配列で置換さ
れている請求項１又は２に記載のワクチン。 - 【請求項４】 天然のｇｐ１６０のＲＥＫＲ及びＫＲＲ
配列が、ＮＥＨＱ及びＱＮＨ配列でそれぞれ置換されて
いる請求項１又は２に記載のワクチン。 - 【請求項５】 該糖蛋白質が、天然のｇｐ１６０のトラ
ンスメンブレンの係留領域を含まない請求項１〜４のい
ずれかに記載のワクチン。 - 【請求項６】 該糖蛋白質が、狂犬病ウィルスのトラン
スメンブレン領域を含む請求項５に記載のワクチン。 - 【請求項７】 ｇｐ１６０のトランスメンブレン領域に
相当するＣ末端の疎水性のペプチドが、修飾されてアル
ギニンがイソロイシンに置換されている請求項５に記載
のワクチン。 - 【請求項８】 該糖蛋白質が、全くトランスメンブレン
係留領域を含有していない請求項５に記載のワクチン。 - 【請求項９】 天然のｇｐ１６０のＣ末端の疎水性ペプ
チドが削除されている請求項３〜６及び８のいずれかに
記載のワクチン。 - 【請求項１０】 少なくとも ・ウィルスゲノムの一部、 ・エイズ原因ウィルスのエンヴェロープの糖蛋白質ｇｐ
１６０の前駆体のシグナル配列又は異種ウィルスからの
シグナル配列をコードする配列、 ・エイズ原因ウィルスのエンヴェロープの糖蛋白質ｇｐ
１６０をコードする遺伝子配列であって、配列ＲＥＫＲ
のプロテアーゼによる切断部位を含まない該ｇｐ１６０
をコードする遺伝子及び ・細胞中での該糖蛋白質の発現をもたらす諸要素 を含有するウィルスベクターに感染した又は該ウィルス
ベクターに対応する組換えＤＮＡを含有する哺乳動物細
胞を培養し、産生される糖蛋白質を回収する、エイズ原
因ウィルスのエンヴェロープ糖蛋白質の製造方法によっ
て得られるエイズ原因ウィルスのエンヴェロープの非切
断性ｇｐ１６０糖蛋白質からなる請求項１に記載のワク
チン。 - 【請求項１１】 ｇｐ１６０の遺伝子が、配列ＲＥＫＲ
及びＫＲＲのプロテアーゼによる切断部位を含まないｇ
ｐ１６０をコードする請求項１０に記載のワクチン。 - 【請求項１２】 ＲＥＫＲ配列が、ＮＥＨＱ配列で置換
されている請求項１０に記載のワクチン。 - 【請求項１３】 ＲＥＫＲ及びＫＲＲ配列が、ＮＥＨＱ
及びＱＮＨ配列でそれぞれ置換されている請求項１１に
記載のワクチン。 - 【請求項１４】 ウィルスゲノムの一部がポックスウィ
ルスのゲノムの一部である請求項１０〜１３のいずれか
に記載のワクチン。 - 【請求項１５】 ポックスウィルスがワクシニアウィル
スである請求項１４に記載のワクチン。 - 【請求項１６】 該ウィルスベクターが、天然のｇｐ１
６０のトランスメンブレン領域をコードする配列を含ま
ない請求項１０〜１５のいずれかに記載のワクチン。 - 【請求項１７】 天然のｇｐ１６０のトランスメンブレ
ン（tm）領域に相当するＣ末端の疎水性のペプチドをコ
ードする配列が、変異されてＡｒｇコドンがＩｌｅコド
ンにより置換されている請求項１０〜１６のいずれかに
記載のワクチン。 - 【請求項１８】 該ウィルスベクターが、異種ウィル
ス、特に狂犬病ウィルスからのトランスメンブレン領域
をコードする配列を含む請求項１６に記載のワクチン。 - 【請求項１９】 該ウィルスベクターが、トランスメン
ブレンの係留領域をコードする配列を含まない請求項１
６に記載のワクチン。 - 【請求項２０】 ｇｐ１６０をコードするＤＮＡ配列
が、ポックスウィルス遺伝子のプロモーターの依存下に
ある請求項１０〜１９のいずれかに記載のワクチン。 - 【請求項２１】 プロモーターが、ワクシニアウィルス
の遺伝子のプロモーターである請求項２０に記載のワク
チン。 - 【請求項２２】 ｇｐ１６０をコードするＤＮＡ配列
が、ワクシニアウィルスの７．５Ｋ蛋白質遺伝子のプロ
モーターの制御下にある請求項２１に記載のワクチン。 - 【請求項２３】 ｇｐ１６０をコードする配列が、ワク
シニアウィルスのＴＫ遺伝子中にクローン化されている
請求項２０〜２２のいずれかに記載のワクチン。 - 【請求項２４】 ｇｐ１６０のＣ末端疎水性ペプチドが
削除されている請求項１０〜１６及び１８〜２３のいず
れかに記載のワクチン。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8605043 | 1986-04-08 | ||
| FR8605043A FR2596771B1 (fr) | 1986-04-08 | 1986-04-08 | Vecteur viral et adn recombinant codant pour une glycoproteine du virus agent causal du s.i.d.a., culture cellulaire infectee par ce vecteur, procede de preparation de la glycoproteine, glycoproteine obtenue, vaccin et anticorps obtenus |
| FR8615106 | 1986-10-29 | ||
| FR8615106A FR2606029B2 (fr) | 1986-04-08 | 1986-10-29 | Vecteur viral et adn recombinant codant pour une glycoproteine du virus agent causal du s.i.d.a., culture cellulaire infectee par ce vecteur, procede de preparation de la glycoproteine, glycoproteine obtenue, vaccin et anticorps obtenus |
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