CZ266798A3

CZ266798A3 - Syntetický polynukleotid obsahující DNA sekvence kódující HIV proteiny

Info

Publication number: CZ266798A3
Application number: CZ982667A
Authority: CZ
Inventors: John W. Shiver; Mary-Ellen Davies; Daniel C. Freed; Margaret A. Liu; Helen C. Perry
Original assignee: Merck And Co., Inc.
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-18
Publication date: 1999-03-17
Also published as: WO1997031115A3; DE69734585D1; SK112998A3; EP0904380B1; HUP9901112A2; BR9707672A; AU729231B2; EE9800257A; CO4600706A1; ES2251734T3; KR19990087126A; CN1216064A; AU2124697A; IL125547A0; NO983876L; TR199801615T2; NZ331161A; EP0904380A2; WO1997031115A2; HUP9901112A3

Description

Vakcinační prostředky proti infekci HIV.

Dosavadní stav techniky

1. Infekce HIV.

Lidský virus selhání imunity typ-1 (HIV-1) se považuje za etiologické agens syndromu získaného selhání imunity (AIDS) a příbuzných onemocnění. HIV-1 je RNA virus z rodiny Retroviridae a má uspořádání genomu stejné, jako je u všech retrovirů 5'LTR-gag-pol-e.nv-LTR3'. Navíc HIV-1 zahrnuje geny tat a rev. Gen env kóduje virový obalový glykoprotein, který se překládá jako prekurzor o molekulové hmotnosti 160 000 (gpl60) a pak se štěpí buněčnou proteázou za vzniku externího obalového glykoproteinu o molekulové hmotnosti 120 000 (gpl20) a membránového obalového glykoproteinu o molekulové hmotnosti 41 000 (gp41). Gpl20 a gp41 zůstávají spojeny a objevují se na virových partikulích a na povrchu buněk infikovaných HIV. Gpl20 se váže na CD4 receptor, který je přítomný na povrchu pomocných T-lymfocytů, makrofágů a jiných cílových buněk. Jestliže se gpl20 naváže na receptor CD4, pak gp41 zprostředkovává fúzi, což umožňuje vstup viru do buňky.

Za počátek infekce se považuje okamžik, kdy se gpl20, který je přítomný na virových partikulích, naváže na receptor CD4 na povrchu T4 lymfocytů nebo jiných cílových buněk. Navázaný virus vejde do cílové buňky a jeho RNA genom se reverzně transkribuje na dvouřetězcovou DNA buňky. Virová DNA je inkorporovaná do genetického materiálu v buněčném jádru , kde virová DNA řídí produkci nové virové RNA, virových • 4 • 4 • · · · · · · 4 4 4 4

44 4 4 4 4444

44 4 4 4 4444 4

4 4 44 444

444 44 4444444 ·· 44 proteinů a nových virových partikuií. Tyto nové partikule puči z membrány cílové buňky a infikuji jiné buňky.

Destrukce Ť4 lymfocytů, která je kritická pro imunitní obranný systém, je hlavni činitel progresivní disfunkce imunitního systému, což je charakteristický znak infekce HIV. ztráta cílových buněk vážně ohrožuje schopnost těla bojovat s většinou vetřelců, ale má zvláště silný vliv na obranyschopnost proti vírům, houbám, parazitům a jistým bakteriím, mezi něž patří i mykobakteríe.

HÍV-1 zabijí buňky, které infikuje replikací, odštěpuje se z nich a poškozuje buněčnou membránu. HÍV-Í může zabíjet cílové buňky nepřímo prostřednictvím gpl20, který se nachází na povrchu infikovaných buněk. Protože receptor CD4 na Tbuňkách má silnou afinitu pro gpl20, pak zdravé buňky, které exprimují receptor CD4 se mohou vázat na gpl20 a fúzují s infikovanými buňkamiza vzniku syncytia. Syncytium nemůže přežít.

HIV-1 může také vyvolat normální buněčnou imunitní obranu proti infikovaným buňkám. S pomocí nebo bez pomoci protilátek, cytotoxické obranné buňky mohou zničit infikovanou buňku, která vyjadřuje na svém povrchu vírový protein. Nakonec volný gpl20 může cirkulovat v krvi jednotlivců infikovaných HIV-1.Volný protein se může vázat na receptor CD4 neinfikovaných buněk, které se pak mohou jevit jako infikované a vyvolávají imunitní odezvu.

Infekce HIV-1 je většinou vždy fatální a v současností neexistuje léčba infekce HIV-1. Ještě nejsou dostupné ani účinné vakcíny vhodné pro prevenci infekce HIV-1. Vzhledem k nebezpečí reverze nebo infekce není pravděpodobně možné pro vakcinační účely použít atenovaný virus. Většina podjednotkových vakcinačních přístupů nebyla pří prevencí infekce HIV účinná. Léčebné postupy infekce HIV-1, zatímco pouze prodlužují životy některých infikovaných osob , mají • · ί · <

··· · • · • ····

vážné vedlejší účinky. Proto je tak nutné léčebné a vakcinační postupy pro zvládnutí infekce.

najít účinné této letální

2. Vakcíny.

Vakcinace je účinná forma prevence onemocnění a je úspěšná proti několika typům vírové infekce. Obtížný úkol je předložit antigeny HIV-1 lidskému imunitnímu systému za účelem vyvolat ochranou humorální a buněčnou imunitu. Do této doby snaha o vytvoření účinné vakcíny proti HIV infekci nebyla úspěšná. U pacientů s AIDS je volný virus přítomný pouze v malém množství. Přenos HIV-1 se zvyšuje interakcí buňka-buňka prostřednictvím fúze a tvorby syncytia. Protilátky vytvořené proti volnému viru nebo virovým podjednotkám jsou pří eliminaci buněk infikovaných virem většinou neúčinné.

Vakcíny využívají schopností těla pamatovat si antigen. Pří prvním setkání s danným antigenem si imunitní systém generuje buňky, které uchovávají antigen v imunologické pamětí po celý život jedince. Následné vystavení jedince antigenu stimuluje imunitní odezvu a vede k eliminaci nebo deaktivaci patogenu.

Imunitní systém reaguje na patogen dvěma způsoby: humorální a buněčnou odezvou. Humorální odezva lymfocytů generuje specifické protilátky, které se váží na antigen a tak deaktivují patogen. Buněčná odezva zahrnuje cytotoxické a pomocné T lymfocyty, které specificky napadají a ničí infikované buňky.

Vývoj vakcíny s HIV-1 představuje problém, protože HIV-1 infikuje některé buňky, které potřebuje vakcína v imunitním sytému aktivovat, (to je T4 lymfocyty). Je výhodné vyvinout vakcínu, která deaktivuje HIV před tím, než dojde poškození imunitního systému. Zvláště vhodný typ vakcíny pro HIV by měl • · • · generovat anti-HIV imunitní odezvu, která rozpoznává varianty HIV a která fumguje u HIV pozitivních jedinců, u kterých infekce teprve začíná.

Pří vývoji vakcíny proti vírům, zvláště proti vírům s vysokou četnosti mutací, jako je lidský virus selhání imunity, se klade hlavni důraz na diverzitu virových obalových proteinů různých vírových izolátů nebo kmenů. Vzhledem k tomu, že cytotoxická T-lymfocyty (CTL) jak u myší tak u lidí jsou schopny rozeznávat epitopy odvozené od konzervativních vnitřních virových proteinů a uvažuje se, že jsou důležité při imunitní odpovědi proti vírům, hlavní úsilí se obrací na vývoj CTL vakcín, které jsou schopny poskytnout heterogenní ochranu proti různým vírovým kmenům.

Je známo, že cytotoxické T-lymfocyty (CTL) CD8⁺ usmrtí vírem infikované buňky, když jejích receptory rozpoznají virové peptidy spojené s molekulami MHC třídy I. Virové peptidy jsou odvozeny z endogenně syntetizovaných virových proteinů bezohledu na pozici proteinu nebo jeho funkci ve viru. Pak tím, že CTL rozezná epitopy z konzervativních virových proteinů může poskytnout křížovou ochranu proti kmenům. Peptidy, které jsou schopny se asociovat s MHC třídou 1/ aby je CTL rozeznaly, pochází z proteinů, které se nacházejí v cytoplazmě nebo v endoplazmatickém retikulu nebo těmito místy procházejí. Obecně lze říct, že exogenní proteiny, které se endozomálně zpracovávají (jako v případě antígenu, který představují molekuly MHC třídy II), nevyvolávají s dostatečnou účinností odezvy CTL CD8⁺.

Při vyvolání odezvy CTL se většinou používají replikační vektory, které produkují v buňce proteinový antigen, nebo se peptidy zavádí do cytozolu. Tyto přístupy mají omezení, které redukuje možnost jejich použití jako vakcín. Použití retrovirových vektorů je omezeno velikostí a strukturou polypeptidů, které se mohou exprimovat jako fúzní proteiny, • · · • · zatímco udržují schopnost rekombinantího viru se replikovat, účinnost vektorů, jako je například vakcínie, při následné imunizaci může být ohrožena imunitní odezvou proti samotným vektorům, vírové vektory a modifikované patogeny mají zákldní nedostatky, které mohou bránit jejich aplikací u lidí. Dále výběr peptídových epitopú závisí na struktuře jednotlivých MHC antigenů a proto peptidové vakcíny mají omezenou účinnost, což je způsobeno různorodostí MHC haplotypů v populací.

3. DNA vakcíny.

V publikaci Benvenisty, N., and Reshef, L. PNAS 83, 9551-9555, (1986) se popisuje, že intraperítonálně (í.p.), íntravenózně (i.v.) nebo íntramuskulárně (í.m.) do myší zavedená DNA, která se vysrážela CaCl₂, se může exprimovat. Intramuskulárni injekce exprešívních vektorů DNA, která se nesrážela s CaCl₂, vede u myší k tomu, že DNA je pohlcena svalovými buňkami a dochází k expresi proteinu, který je kódován DNA. Plazmidy se nezačleňují do buněčného genomu a samostatně se replikují. Po intramuskulárni injekci se v kosterním svalu krys, ryb a primátů a v srdečním svalu krys pozorovala perzistentní exprese. Způsob používání nukleových kyselin jako terapeutických činidel se popisuje v W090/11092 (4.10.1990), kde se nezpracované polyenukleotidy používají k imunizaci obratlovců.

Pro úspěch metody není nezbytné, aby se imunizace provedla íntramuskulárně. Zavedení partíkulí zlata, které jsou potaženy DNA, jenž kóduje bovinní růstový hormon (BGH), do kůže myší vede u myší k produkci anti-BGH protilátek. Při transfekcí kůže, svalu, tuku a prsní tkáně živých zvířat se používá proudový vstřikovač. v literatuře se uvádí různé metody, které jsou vhodné pro zavedení nukleových kyselin. Například intravenózní injekce DNA spolu s kationickým ·· · ·· ·· ·· • · « · · ·· · ·· · · · · ·· • · · · · ··· · · lipozomálním komplexem vede u myší k systémové expresi klonovaného transgenu (Zhu et al., Science 261:209-211 (9. 7. 1993)). V publikaci Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, (1993)) se popisuje heterogenní ochrana proti infekci virem chřipky, která se provedla zavedením DNA, která kóduje proteiny viru chřipky, intramuskulární injekcí.

Tento vynález naplňuje potřebu získání specifického terapeutického a profylaktického činidla, které je schopné vyvolat požadované imunitní odpovědi proti patogenům a nádorovým antigenům. Při terapeutickém přístupu se zvažuje schopnost indukovat imunitní odpovědi T-buněk, které mohou zabránit infekci nebo onemocnění způsobeném virovými kmeny, jenž jsou ve srovnání s kmenem, z kterého se gen antigenu získal, heterologní. Tato skutečnost je podstatná pokud se jedná o HIV, protože tento virus rychle mutuje a získalo se mnoho virulentních izolátů (například, LaRosa et al., Science 249:932-935 (1990), v této publikaci se popisuje identifikace 245 jednotlivých HIV izolátů). Na základě této různorodosti se vědci pokusily vytvořit CTL založené na peptidové imunizaci. V publikaci Takahashi et al., Science 255:333-336 (1992) popisuje indukci široce křížově reagujících cytotoxických T-buněk, které rozeznávají determinantu obalu HIV (gpl60). Vědci však zjistili obtížnost dosažení skutečné odezvy křížově reaktivních CTL a naznačily, že existuje dichotomie mezi primární stimulací nebo restimulací T buněk, která je velmi přísná, a vyvoláním funkce efektoru u už stimulovaných CTL, kam patří cytotoxicita. Wang et al. popisuje vyvolání imuntiní odezvy proti HIV u myší intramuskulární inokulací pomocí klonovaného, genomového (nesestřihaného) genu HIV. Úroveň imunitní odezvy, které se dosáhlo v těchto studiích, byla velmi nízká. Konstrukce DNA podle Wang et al., využívá v podstatě genomový kus HIV kódující Tat/H£V-gpl60-Tat/REV sekvence. Jak se popisuje dále

9 · • · ·· «

9 4 v textu, zde se předkládá suboptimální systém za účelem dosažení silné exprese gpl60. Tento postup je také částečně nebezpečný, protože exprese Tat se podílí na progresi Kaposiho syndromu.

WO 93/17706 popisuje metodu vakcinace zvířat proti viru, kde nesené partikule potažené genovou kounstrukcí jsou vneseny do buněk zvířete. Vzhledem k HIV se používal v podstatě celý genom bez bez dlouhých terminálních repetic. Tato metoda představuje pro recipienta podstatné nebezpečí. Obecně se věří, že konstrukce hlV by měla obsahovat méně než přibližně 50 % genomu HIV, aby se zabezpečila bezpečnost vakcíny; tato zabezpečuje, že dojde k odstranění enzymů a virových regulačních proteinů, kdy u většiny z nich není jejich funkce známá nebo není dostatečně pochopená. Pak stejně stále přetrvává řada problémů při použití lidské vakcíny proti HIV, které vyplývají z technologie zavádění genů.

Vynález zkoumá libovolnou známou metodu zavedení polynukleotidů do živé tkáně za účelem indukce exprese proteinů. Vynález popisuje nový imunogen, který je vhodný pro zavedení HIV a jiných proteinů do postupu zpracování antigenu za účelem účine vytvořit HIV specifické CTL a protilátky. Léčivo je účinné jako vakcína při indukci buněčné a humorální anti-HIV odezvy a imunitní odezvy neutralizující HIV. Vynález shora uvedené problémy řeší vytvořením polynukleotidových imunogenů, které, když se zavedou do zvířete, řídí účinnou expresi HIV proteinů a epitopů, aniž existuje nebezpečí spojené s touto metodou. Takto vytvořené imunitně odezvy jsou účinné při rozeznávání HIV, při inhibiční replikai HIV, při identifikaci a usmrcení buněk infikovaných HIV a vykazují křížovou reakci proti řadě kmenů HIV.

4. Použití kodónu a kontext kodónu.

• · · • · ·

Párování kodónů u organizmů je vysoce specifické a liší se podle organizmu. Tato informace se využívá ke konstrukci a expresi změněných nebo syntetických genů, které mají požadovaně vysokou účinnost translace, aby se mohlo určit, které oblasti genomu jsou oblasti kódující protein, a aby se mohly do heterogenních genů zavést místa pro pauzi při translaci a aby se mohl zjistit vztah nebo předcházející původ nukleotidové sekvence.

Exprese cizorodých heterogenních genů v transformovaných organizmech je nyní obvyklá. Velké množství savčích genů, které například zahrnují myší a lidské geny, se úspěšně vnesly do jednobuněčných organizmů. Standardní metody zahrnují začlenění cizorodého genu, aby mohl být exprimován, do vektoru, jako je plazmid nebo fág a tento vektor se pak využije pro zavední genu do organizmu. Nativní promotory takových genů se mohou běžně nahradit silnými promotory, které jsou kompatibilní s hostitelem, do kterého se gen zavede. Sekvenování proteinů umožňuje objasnění aminokyselinových sekvencí minimálního množství nativního proteinu. Z těchto aminokyselinových sekvncí je možné odvodit DNA skevence kódující uvedené proteiny. Syntéza DNA je také rychle se vyvíjející obor a snadno možná je i konstrukce genů, které odpovídají odvozeným sekvencím DNA.

Řada nativních aktivních proteinů jsou například glykosylovány způsobem, který se liší od způsobu glykosylace při expresi v cizím hostiteli. Z tohoto důvodu se mohou v případě exprese savčích genů preferovat před bakteriálními hostiteli eukaryontní hostitelé, jako jsou kvasinky. Problém glykosylace je předmětem pokračujícího výzkumu.

Existuje další problém, který není zcela objasněn.

Translace syntetického genu, dokonce i když je spojen se silným promotorem, často probíhá s nižší účinností než by se očekávalo. Toto často nastává při expresi exogenních genů v

• Φ ·· • · · • · · ·· · · ♦ • φ φ ·· ·· cizorodém organizmu. Dokonce když se gen přepisuje dostatečně účinným způsobem, což znamená, že se produkuje ziskatelné množství translačniho produktu, protein často není aktivní nebo se jeho vlastnosti liší od nativního proteinu.

Je zřejmé, že pozdější problém je běžně způsoben rozdílným balenímu různých organizmů. Řešení tohoto problému není spolehlivé a mechanizmy řídící balení proteinu nejsou zcela jasné.

Věří se, že problémy, které jsou spojeny účinností translaces účinky kodonového kontetu. Oblasti genů kódující protein ve všech organizmech jsou vystaveny různým funkčním tlakům, přičemž některé z nich závisí na požadavku kódování funkčního proteinu, stejně jako vhodných signálů pro začátek a konec translace. Našlo se několik rysů oblastí, které kódují protein, kterým se v souvislosti s těmito funkčními tlaky nerozumí. Dvě důležité třídy takových rysů jsou ty, které zahrnují použití kodónu a kontext kodónu.

Ví se, že využití kodónu je vysoce ovlivnitelné a podstatně se liší mezi různými oragnizmy. Ukázalo se, že paterny použití kodónu jsou spojeny s relativním přebytkem izoakceptorů tRNA. Geny kódující proteiny vysoké verzus nízké abundance vykazují rozdíly ve svých kodónových preferencích. Diskutuje se možnost dispozice použití kodónu při při pozměněné elongaci peptidu. Zatímco rozdíly při použití kodónu jsou spojeny s rozdíly v rychlosti translace obtížně se demonstrují účinky volby kodónu na translaci. Další vlivy na použití kodónu jsou maximalizace věrnosti translace a optimalizace kinetické účinnosti syntézy proteinu.

Shromáždily se důkazy, že rozeznávání kodón/antikodón je ovlivněno sekvencemo vně samotného kodónu jevem, který se nazývá kontext kodónu. Na účinnost suprese nesmyslných kodonů stejně jako kodonů s přeměněným smyslem má silný vliv vedlejší kodony. Nadbytek supresorové aktivity u přirozené ··· ·· ·· ·· • * · * t 9 • · · · » • · ··· » · • · · · • © · · · · · · bakteriální populace stejně jako použití terminačních kodonů pro kódování selenocysteinu a fosfoserinu vyžaduje, aby terminace byla závislá na kontextu. Ukázalo se, že podobné účinky kontextu mají vliv na věrnost translace, stejně jako na účinnost iniciace translace.

Statistické analýzy kódujících oblastí proteinu v bakterii E. coli demonstrují další manifestaci kontextu kodónu. Přítomnost určitého kodonů v jedné pozici silně ovlivňuje frekvenci výskytu jistých nukleotidů' v okolních kodonech a tyto kontextové tlaky se značně liší mezi geny, jenž se exprimují silně verzus slabě. Ačkoli se rozeznává účinek kontextu, předpovězená hodnota statistických pravidel, které se vztahují k preferovaným nukleotidům sousedících s kodonem, je relativně nízká. Tato skutečnost omezuje použitelnost dat preferencí nukleotidů pro výběr kodonů za účelem ovlivnit hladinu účinnosti translace.

Vybavení pro automatizované sekvenování nukleotidů umožňuje zpřístupnění velkého množství sekvenčních dat z různých organizmů. Pokud se tomu dobře rozumí, tyto data představují podstatné obtížnosti. Například je důležité identifikovat kódující oblasti genomu za účelem získat data genomových sekvencí z proteinových sekvencí. Navíc velký zájem je o původ genomu jistých organizmů. Je známo, že genomy některých organizmů mají smíšený původ. Některé sekvence, které pocházejí původně z virů, jsou nyní stabilně začleněny do genomu eukaryontních organizmů. Samotné virové sekvence mohou pocházet z jiných specií, které v podstatě nejsou příbuzné. Znalost původu genu může být důležitá při generování vhodných analogií mezi příbuznými geny a jejich translačními produkty v dalších organizmech.

Je nutné lépe rozumět, jak kontextu kdonu působí na translaci a a také je nutné vyvinout metodu vhodnou pro stanovení vhodných kodonů, které mohou dosáhnout požadovaného

000 * · · • 0 translačního účinku. Existuje také nutnost vytvořit způsob, který je schopen identifikovat identifikace kódující sekvence genomu z z nukleotidových sekvenčních dat. Je nutné navrhnout metodu, která řídí balení proteinu a která zajistí, že cizorodý gen se bude balit správně a bude exprimován v hostiteli. Geny se mění nebo konstruují s tím, že požadovaná translační účinnosti bude podstatně horší.Preference kodonu hraje také důležitou roli při rekombinaci DNA při expresi farmaceuticky a průmyslově využitelných proteinech v mikroorganizmech. Jak se popisuje dříve v textu existující mašinérie genové exprese jsou genově trensformované hostitelské buňky, která funguje tak, že se konstruuje daný požadovaný produkt, síla exprese dosažená v organizmech se značně liší v závislosti na specifických alternativních formách · genetického kódu, který určuje aminokyseliny a nachází se v začleněném exogenním genu. tripletový kodón čtyř možných nukleotidových baží může existovat v 64 formách. Tyto formy představují vzkaz pro pouze 20 různých aminokyselin (stejně jako iniciace a terminace transkripce), což znamená, že některé aminokyseliny se mohou být kódovány více než jedním kodonem. Některé aminokyseliny mají až šest nadbytečných alternativních kodonů, zatímco některé z nich mají pouze jediný kodon. Z důvodů, které nejsou zcela zřejmé, alternativní kodony nejsou uniformně přítomny v endogenní DNA různých typů buněk a je jasné, že existuje neměnná přirozená hiarchie nebo preference jistých kodonů v určitých typech buněk.

Aminokyselina leucin se specifikuje libovolným ze šesti kodonů DNA, které zahrnují CTA, CTC, CTG, CTT, TTA a TTG (které korespondují s kodony RNA, CUA, CUC, CUG, CUU, UUA a UUG) . Analýza frekvence genomového kodonu v mikroorganizmech ukázala, že endogenní DNA bakterie E. coli nejběžněji obsahuje kodon specifický pro CTG, zatímco DNA kvasinek a ··♦

9··· plísně běžně zahrnují kodon TTA, který je specifický pro leucin. Z pohledu této hiearchie obecně vyplývá, že pravděpodobnost dosažení silné exprese polypeptidu bohatého na leucin v hostiteli, kterým je bakterie E. coli, bude záviset na frakvenci použití kodonu. Například gen bohatý na kodony TTA bude se vší pravděpodobností v bakteriiích E.coli exprimován velice slabě, zatímco gen bohatý na CTG bude pravděpodobně silně exprimovat polypeptid. Podobně je tomu u kvasinek, kde transformované buňky jsou uzpůsobeny k expresi polypeptidu bohatého na leucin, což znamená, že v začleněné DNA preferovaným kodonem bude TTA.

Vykazují se implikace jevu preference kodonu při způsobech rekombinace DNA a tento jev může sloužit pro vysvětlení předchozích neúspěchů při dosažení silné exprese exogenních genů v úspěšně transformovaných hostitelských organizmech. Méně preferované kodony se mohou v začleněném genu opakovat a mašinérie hostitelské buňky, která řídí expresi, nemůže fungovat tak účinně. Tento jev naznačuje, že syntetické geny, které se navrhly tak, aby obsahovaly kodony, které jsou preferují hostitelské buňky, poskytují preferovanou formu cizorodého genetického materiálu využitelného při rekombinaci DNA.

5. Doprava proteinů.

Diverzita funkce, která charakterizuje eukaryontní buňky závisí na strukturální diferenciaci jejich membrán. Za účelem vytvoření a udržení těchto struktur se musí proteiny dopravit z míst své syntézy v endoplazmatickém retikulu do předem určené pozice. To vyžaduje, že přepravované proteiny vykazují signály, které se rozeznávají molekulárními způsoby, které odpovídají rutinní selekci, k níž dochází v přístupových bodech hlavních cest přepravy.

• ·· · ·· ·· ··

.., ·· · · ···· • ··« · · · · ·· • · · · · · · ··· · · ··· ·· ··· ··· ·· ··· ···· ·· ··

Uchování vnitrobuně.čné integrity závisí částečně na selektivním druhovém přiřazení a nejvhodnějším transportu proteinů do jejcih správného místa výskytu. Během posledních let se mnoho úsilí věnovalo studiu molekulové mašinérie cílení a lokalizace proteinů. Definované sekvenční motivy se identifikovaly u proteinů, které působí jako štítky s adresou. Zjistilo se, že řada signálů, které slouží k zařazení do druhů, je spojena s cytoplazmatickými doménami membránových proteinů.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje molekuly syntetické DNA, které kódují gen env HIV, a jeho modifikace. Kodony syntetických molekul zahrnují projektované preferované kodony hostitelských buněk. Syntetické molekuly se mohou používat jako polynukleotidové vakcíny, které účinně vyvolávají imunoprofylaxi proti infekci HIV prostřednictvím neutralizujících protilátek a imunitu zprostředkovanou buňkou. Vynález popisuje polynukleotidy, které se přímo zavedou do obratlovců in vivo, mezi něž patří savci jako primáti a lidé, a indukuje se ve zvířeti exprese kódovaných proteinů.

Vynález popisuje molekuly syntetické DNA, které kódují gen env HIV a jeho modifikované formy. Kodony syntetických molekul jsou vytvořeny tak, aby se mohly používat kodony, které jsou preferovány hostitelskou buňkou. Syntetické molekuly se mohou použít jako polynukleotidová vakcína, která působí účinnou imunoprofylaxi proti infekci HIV prostřednictvím neutralizujících protilátek a buněčnou imunitou. Syntetické molekuly se mohou používat jako imunogenní kompozice. Vynález dále popisuje polynukleotidy, které, když se přímo zavedou do obratlovců in vivo, mezi něž

patří savci jako jsou primáti a lidé, indukují ve zvířeti expresi kódovaného proteinu.

Polynukleotid je kombinace nukleových kyselin, které obsahují regulační elementy, které po zavedení do živé buňky obratlovce, jsou schopny řídit buněčnou mašinérii produkce translačních produktů, kódovaných nukleovými kyselinami, které obsahují polynukleotid. V jednom provedení vynálezu polynukleotid je polydeoxyribonukleová kyselina, která obsahuje nejméně jeden gen HIV, který je operabilně spojen s transkripčním promotorem. V jiném provedení vynálezu polynukleotidová vakcína (PNV) obsahuje polyribonukleovou kyselinu kódující nejméně jeden gen HIV, který je přístupný translaci mašinérií eukaryontní buňky (zapojují se ribozomy, tRNA a jiné translační faktory). Protein kódovaný polynukíeotidem se za normálních podmínek u zvířete nevyskytuje. Jeho přítomnost je pouze při patologických stavech (to je heterogenní protein). Jde o proteiny spojené s výskytem lidského viru selháni imunity (HIV), etiologického činidla syndromu získaného selhání imunity (AIDS), přičemž zvířecí imunitní systém se aktivoval aby spustil ochranou imunitní odezvu. Protože tyto exogení proteiny produkují tkáně zvířete, exprimované proteiny se zpracovávají v hlavním kompatibilním systému, MHC, způsobem analogu v případě, že se objeví infekce příbuzného organizmu (HIV). Výsledkem je idukce imunitní odezvy proti příbuznému patogenu.

Polynukleotidy, když se zavedou do biologického systému, indukují expresi proteinů HIV a epitopů a produkci specifické imunitní odezvy. Indukovaná protilátková odezva je specifická pro exprimovaný HIV protein a neutralizuje HIV. Navíc se indukují cytotoxické T-lymfocyty (CTL), které specificky rozeznávají a ničí buňky infikované HIV.

Na základě stálého bádání vznikly metody pro použití polynukleotidu, který po zavedení do savčí tkáně, indukuje • · • · · ··· · • · ··

Není řečeno, že další imunitní stimulaci a expresi produktů diskrétního genu in vivo v jediné buňce. Na základě zkoumání se našlo řešení, které, aby se získaly REV nezávislé geny, nevyžaduje vícenásobné manipulace genů HIV závislých na REV. Zde popisovaný expresivní systém nezávislý na REV je použitelný podle jeho vlastního pravidla a je to systém, na kterém se může demonstrovat exprese jednoho produkt požadovaného genu in vivo v jedné buňce.

Protože mnoho aplikací podle vynálezu se týká antivirové vakcinace, polynukleotidy se zde často zmiňují jako polynukleotidová vakcína(y) nebo PNV.

využití těchto polynukleotidů při protinádorové terapii jsou mimo rámec vynálezu.

V jednom provedení vynálezu gen kódující produkt HIV genu je začleněn do expresivního vektoru. Vektor obsahuje transkripční promotor, který je rozeznáván eukaryontn! RNA polymerázou, a transkripční terminátor na konci kódující sekvence HIV genu. V preferovaném provedení vynálezu je promotorem promotor cytomegaloviru se sekvencí intronu A (CMV-intA), ačkoli v oboru je známo, že se může použít libovolný promotor , jako je například silný imunoglobinový promotor nebo jiné promotory eukaryontních genů. Terminátor boviního růstového hormonu je preferovaný transkripce. Zvláště se preferuje kombinace CMVintA-BGH.

Při přípravě polynukleotidů v prokarytontních buňkách se může do expresivního vektoru začlenit markér rezistence na antibiotika; transkripce markéru může být řízena prokaryontním protmotorem tak, že k expresi markéru nedochází v eukaryontních buňkách. Mohou se použít geny rezistence na ampicilin, na neomycin a jiné farmaceuticky přijatelné markéry rezistence na antibiotika. Pří silné produkci polynukleotidů fermentaci v prokaryontním organizmu může být výhodné, aby vektor obsahoval prokaryontní počátek replikace terminátor terminátotu • ·

a byl vektor s vysokým počtem kopií. Řada běžně dostupných prokaryontních klónovacích vektorů splňuje tuto výhodu. Je nutné odstranit nepodstatné sekvence DNA a zajistit, že se vektor nebude replikovat v eukaryontních buňkách. Tato skutečnost minimalizuje nebezpečí integraec polynukleotidových sekvencí vakcíny do recipientního genomu. Promotory nebo zesilovače, které jsou tkáňové specifické, se mohou použít všude, kde je nutné omezit expresi polynukleotidu v určitém typu tkáně.

V jednom provedení vynálezu se používá expresivní vektor pnRSV, kde jako promotor slouží dlouhá terminální repetice (LTR) viru Rousova sarkomu (RSV). V jiném provedení vynálezu se používá mutovaný vektor pBR 322, nyní VI, do kterého se klonoval promotor CMV a terminátor transkripce BGH. V jiném provedení vynálezu se kombinovaly, elementy VI a pUC19 za vzniku expresivního vektoru, který byl nazván VIJ. Do vektoru VIJ nebo jiného požadovaného expresivního vektoru se klonoval gen HIV, jako je například gpl20, gp41, gpl60, gag, pol, env nebo libovolný jiný gen HIV, který může indukovat imunitní odezvu proti HIV. V jiném provedení vynálezuse z vektoru VIJ odstarnil gen kódující rezistenci na ampicilin a nahradil se genem pro rezistenci na neomycin, přičemž vznikl VIJ-neo, do něhož se klonovaly různé geny HIV za účelem použití podle vynálezu. Jiným provedením vynálezu je vektor VIJns, který je stejný jako VIJ-neo až na to, že jediné restrikční místo Sřil se zavedlo do místa Kpnl v poloze 2114 vektoru VIJ-neo. Výskyt míst Sfil v DNA lidského genomu je velmi nízký (přibližně 1 místo na 100 000 baží). Pak tento vektor umožňuje přísné monitorování integrace expresivního vwktoru do DNA hostitele jednoduše tím, že se izolovaná genomová DNA štěpí restrikčním enzymem Sfil. Při dalším přepracování se vektor nazývá VIR. V tomto vektoru se odstranilo tolik nepodstatné DNA, kolik je nutné za vzniku vysoce kompaktního • ·

¹⁷ vektoru. Tento vektor je derivát vektoru Vljns. Tento vektor umonuje pouižití vštších inzertů s tím, že se méně bere do úvahu, že nežádoucí sekvence kódují a optimalizují pohlcení vektoru buňkou.

V jednom provedení vynálezu jsou inkorporovány geny kódující HIV gpl60, gpl20, gag a jiné genové produkty z laboratorně upravených kmenů HIV, jako jsou SF2, IIIB nebo MN. V oboru je známo, že použití genů, které pocházejí z kmenů HIV-2 a které mají homologní funkci ve srovnání s geny kmenů HIV-1, budou pravděpodobně generovat analogovou imunitní odezvu s tou, která se zde uvádí v případě konstrukce HIV-1. Způsoby klonování a manipulace za účelem získání těchto genů jsou dobře známy v oboru.

Je .známo, že vyvolání imunitní odezvy proti laboratorně adaptovaným kmenům HIV nemůže být adekvátní pro neutralizaci primárních izolátů HIV. Pak v jiném provedení vynálezu geny z virulentních primárních izolátů HIV jsou inkorporovány do polynukleotdivého imunogenu. To je provedeno přípravou cDNA kopií virových genů a pak subklónováním jednotlivých genů do polynukleotidového imunogenu. Sekvence mnoha genů řady kmenů HIV jsou nyní běžně dostupné v instituci GENBANK a takové primární izoláty HIV jsou dostupné z instituce National Institute of Allergy and Infectious Diseasee (NIAID), která má kontrakt s firmou Quality Biological, lne., (7581 Lindberg Drive, Gaithersburg, Maryland 20879), která umožňuje přístup k těmto kmenům. Takové kmeny jsou také dostupné u organizace World Health Organization (WHO) (Network for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Develop»ment Unit, Office of Research, Global Programme on AIDS, CH-1211 Geneva 27, Switzerland). Z této práce pro odborníky vyplývá, že jedno z použití vynálezu je poskytnout systém pro testování a analýzu in vivo a in vitro tak, že se může provést korelace diverzity sekvence HIV se sérologií neutralizace HIV, stejně jako ··· · • fl • · • flfl »· · * ··· jiných parametrů. Inkorporaci genů primárních izolátů kmenů HIV vzniká imunogen, který indukuje imunitní odezvu proti klinickým izolátům viru. Jak se mění virulentní izoláty, imunogen se může modifikovat tak, že reflektuje na nové sekvence, je-li to nezbytné. Aby terminologie zůstala konzistentní následuje úmluva pro popis polynukleotidových imunogenních konstrukcí: název vektoru - kmen HIV - gen přidané elementy. Pak konstrukce, kde je klonován do expresivního vektoru VIJneo gen gpl60 kmene MN, má jméno : VIJneo - MN - gpl60. Další elementy, které se přidaly ke konstrukci se popisují v detailech dále v textu. U etiologického kmene viru se může změnit gen, který je optimální pro zavedení do léčiva. Jak se popisuje dále v textu, protože se indukuje odezva CTL, která je schopna ochránit organizmus proti heterologním kmenům, variabilita kmenů je méně kritická u imunogenu a vakcín podle vynálezu ve srovnání s vakcínami, které tvoří celý virus nebo podjednotka polypeptidu. Protože je možné do léčiva jednoduchým způsobem začlenit nový gen, je to úprava, kterou lze snadno provést standardními metodami molekulární biologie.

Termín promotor znamená rozeznávací místo na řetězci DNA, na které se váže RNA polymeráza. Promotor tvoří iniciační komplex s RNA polymerázou, aby spustil a řídil transkripční aktivitu. Komplex se může módifikovataktivujíčími sekvencemi, které se nazývají zesilovače nebo inhibičními sekvencemi, které se nazývají tlumiče.

Termín vedoucí sekvence je sekvence DNA na 5'konci strukturního genu, která se přepisuje spolu s genem. Vedoucí sekvence obvykle vede ke vzniku proteinu, který má extenzi na N-konci peptidu, která se někdy nazývá pro-sekvence. U proteinů, které se vylučují extracelulárně do média nebo jsou v membráně, tato signální sekvence, která je obecně • · · * ·· • · · • ♦ · ·· hydrofóbní, řídí protein do endoplazmatického retikula, ze kterého odchází správného místa.

Termín intron znamená sekci DNA, která se vyskytuje uprostřed genu, který nekóduje aminokyselinu v genovém produktu. Prekurzor RNA intronu je vystřižen a proto se nepřepisuje do mRNA ani se nepřekládá do proteinu.

Termín kazeta znamená sekvenci podle vynálezu, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která se má exprimovat. Kazeta je v podstatě podobná kazetové pásce. Každá kazeta má svou vlastní sekvenci. Pak po vnitřních změnách kazety dochází k tomu, že vektor exprimuje různou sekvenci. Vzhledem k restrikčním místům na 5'a 3' koncích, kazeta se může jednoduše začlenit, odstranit nebo nahradit jinou kazetou.

Termín 3'nepřekládaná oblast nebo 3' UTR znamená sekvenci na 3'konci strukturálního genu, která se obvykla přepisuje s genem. Tato 3'UTR oblast obvykle obsahuje póly A sekvenci. Ačkoli 3'UTR se přepisuje z DNA je před translací na protein vystřižena.

Termín nekódující oblast nebo NCR je oblast, která přiléhá k oblasti 3'UTR strukturálního genu. NCR oblast obsahuje transkripční terminační signál.

Termín restrikční místo znamená sekvenci specifického místa štěpení restrikční endonukleázou.

Termín vektor znamená některé způsoby, které slouží pro zavedení fragmentů DNA do hostitelského organizmu nebo tkáně hostitele. Používají se různé tytpy vektorů, mezi něž patří plazmid, bakteriofág a kozmidy.

ζθ ?

Termín účinné množství znamená /dostatečný PNV se zavede injekcí a produkuje adekvátní množství polypeptidů. Odborník ví, že toto množství může kolísat. Aby se mohl popsat vynález jejnutno uvést následující známé informace o HIV. Lidský virus selhání imunity má genom tvořený ribonukleovou kyselinou (RNA), jehož struktura je zobrazena na obrázku č. 1. Tento genom RNA se reverzně přepisuje podle způsobů, které jsou známy v oboru, za účelem vzniku kopie cDNA pro klónování a manipulaci podle zde uvedených metod podle vynálezu. Na každém konci genomi je dlouhá terminální repetice, která působí jako promotor. Mezi těmito konci genom kóduje v různých čtecích rámcích gag-pol-env, který jehlavním genem produktů: gag je skupinový specifický antigen; pol je reverzní transkriptáza nebo polymeráza; v této oblasti v alaternativním čtecím rámci se kóduje virová proteáza, která odpovídá za posttranslační zpracování, například gpl60 na gpl20 a gp41; env je protein obalu ; vif je faktor infekčnosti viriónů; REV regulátor exprese viriónového proteinu; neg je negativní regulační faktor; vpu je faktor produktivity virionů u; tat je trans-aktivátor transkripce; vpr je virový protein r. Funkce každého z těchto elementů je popsána.

V jednom provedení podle vynálezu gen kódující protein HIV nebo SIV je přímo spojen s transkripčním promotorem. Gen env kóduje velký protein, který' je vázán na membránu, gpl60, jenž se posttranslačními procesy modifikuje na gp41 a gpl20. Exprese genu gpl20 se může řídit promotorem cytomegaloviru. Virus HIV má tendence zůstávat v infikovaných buňkách latentní, proto je nutné, aby se vyvolala také imunitní odezva řízená na epitopy HIV vázané na buňku. Navíc je nutné, aby vakcína produkovala oligomerický antigen ENV vázaný na membránu, který je strukturou podobný antigenu, jenž produkuje virová infekce za účelem vzniku protilátkové odezvy pro neutralizaci viru. Tento úkol je dosažen in vivo expresí epitopu gpl60 spojeného s buněčnou membránou. Avšak exprese gpl60 je potlačena za nepřítomnosti REV, což je způsobeno tím, že geny, které nejsou upraveny sestřihem nejsou exportovány z jádra. Aby se mohlo porozumět tomuto systému, životní cyklus HIV se musí popsat v detailech.

• « ·♦ ·· • * · · • · ··.

·· · · Β • · * • · **

Po infekci hostitelské buňky RNA genom HIV je reverzně transkribován na provirovou DNA, která se integruje do hostitelského genomu DNA jako jediná transkripční jednotka. LTR poskytuje promotor, který přepisuje geny HIV z 5'konce směrem do 3'konce (gag, pol, env), aby vznikl nesestřihaný transkript celého genomu. Nesetřihaný transkript funguje jako rnRNA, ze které se gag a pol překládá, zatímco pro translaci env kódovaných genů se musí objevit limitovaný - sestřih. Aby došlo k expresi produktu regulačního genu REV, musí se objevit víc jak jeden sestřih, protože jak je zobrazeno na obrázku č. Iv uspořádání genomu se REV a env překrývají. Aby došlo k transkripcí env musí se zastavit transkripce REV a obráceně. Aby došlo k exportu RNA, která není upravena sestřihem, z jádra, musí být přítomen REV. Aby REV fungovala tímto způsobem REV responzivní element (PRE) musí být přítomen na transkriptu (Malim et al., Nátuře 338:254-257 (1989) .

V polynukleotidové vakcíně podle vynálezu obligatorní sestřih jistých genů HIV je eliminován tím, že vakcína poskytuje geny zcela upravené sestřihem (to je zajištění celého otevřeného čtecího rámce pro vznik produktujpožadovaného genu, aniž jsou ve čtecím rámci potřeba přepínače nebo odstranění nekódujících oblastí; odborník ví, že když se určitý gen upraví sestřihem, existuje zde určitá volnost v přesnosti vzniklé sekvence; pokud se však získá funkční kódující sekvence tato volnost je přijatelná). Pak v jednom provedení celá sekvence kódující gpl60 je upravena sestřihem tak, že není nutné přerušit expresi produktu každého genu.

Humorální a buněčná imunitní odpověď podle vynálezu jsou zvláště důležité pro inhibici infekce HIV, což je dáno tím, že HIV je náchylný k mutaci v populaci stejně jako v infikovaných jedincích. Aby se mohla vytvořit účinná ochranná vakcína pro HIV je nutné vytvořit obě multivalentní *«

4 4 · · *·

44·

44

4 4 • ·

protilátkové odezvy například proti gpl60 (V různých HIV je env přibližně z 80% konzervativní, B kmeny, které jsou převládajícími kmeny v lidké populaci spojených států), Základním cílem neutralizace na HIV, stejně jako cíl pro cytotoxické T buňky, které reagují s konzervativními oblastmi gp 160, a vnitřní virové proteiny kódované genem gag. Byla vytvořena HIV vakcína, která obsahuje geny gpl60, které se vybraly z běžných laboratorních kmenů; z převládajících primárních virových izolátů, které se nacházejí v infikované populaci; z mutovaného gpl60 vytvořených za účelem odmaskování křížově reagujícího kmenu, který neutralizuje protilátkové epitopy; a z jiných reprezentativních genů HIV, jako jsou geny gag a pol (které jsou u HIV izolátů z «95% konzervativní).

Pacienti, jejichž séra jsou HIV pozitivní, nesou anti-gag CTL, zatímco okolo 60% těchto pacientů vykazuje křížový kmen CTL specifický k gp 160. Množství CTL specifických k HIV, které se nachází v infikovaných jedincích, které jsou ve stádiu nemoci AIDS, je daleko menší, což ukazujedůležitost našeho zjištění, že se může indukovat odezva CTL křížového kmenu.

Imunitní odezva indukovaná polynukleotidovou vakcínou, která obsahuje konstrukce env a gag se demonstruje v myších a u primátů. Monitorování produkce protilátek v myších proti env umožňuje potvrzení skutečnosti, že daná konstrukce je vhodně imunogenní, to znamená, že vysoká část vakcinovaných zvířat vykazuje protilátkovou odezvu. Myši také poskytují nejpřístupnější zvířecí model vhodný pro testování indukce CTL vytvořenou konstrukcí a proto se používá pro vyhodnocení zda určitá konstrukce je vhodná generovat takovou aktivitu. Opice (africká zelená opice, rhesus, šimpanz)poskytuj i další specie, mezi něž patří primáti, pro hodnocení produkce protilátek ve velkých zvířatech, jež nejsou obvyklí hlodavci.

Tyto specie se také preferují před myší, protože . myší sérum obsahuje vysokou hodnotu endogenních neutralizujících aktivit proti retrovirům. Tato data ukazují, že dostatečná imunogenicita je dosažena uvedenou vakcinací, přičemž se dosáhne v experimentech provedených na modelu šimpanz/HIVIIIB ochranyzaložené na známém ochraném množství neutralizujících protilátek pro tento systém. Avšak současně vyplývající definice ochrany, která je stále více akceptována, se vzdaluje od tzv. sterilizující imunity, která indikuje celkovou ochranu proti infekci HIV, jako prevence onemocnění. Řada hodnot, mezi něž patří redukovaný virový titr v krvi, jenž se měří buď HIV reverzní transkriptázovou aktivitou, infekčností vzorku séra, testem ELISA za použití p24 nebo dále koncentrací HIV antigenu v krvi, zvýšením koncentrace CD4⁺ T-buněk a zvýšením míry přeživších (například Cohen, J., Science 262: 1820-1821, 1993, zahrnuje definici účinosti antHIV vakcíny). Imunogeny podle vynálezu také generují vznik neutralizační imunitní odezvy proti infekčním izolátům HIV (klinické, primární).

Imunologie

A. Protilátková odezva na env.

1. gpl60 a gpl20. Test ELISA se používá pro stanovení zda vakcinační vektory, které exprimují buď sekretovaný gpl20 nebo gpl60 vázaný na membránu jsou účinné při produkci protilátek specifických proti env. Počáteční charakterizace ín vitro exprese env uvedeným vakcinačním vektorem se provedla imunoblotovacím test.em lyzátu buněk trans fe kovaných gpl60. Tyto data potvrzují a kvantifikují expresi gpl60 za použití anti-gp41 a anti-gpl20 monoklonálních protilátek, přičemž dochází k vizualizaci exprese gpl60 transfektantů. V jednom provedení vynálezu se gpl60 preferuje proti gpl20 z následujících důvodů: (1) počáteční vektor gpl20 vykazuje • · • · »· • · · · · « · · · · • · ··· · · > · · β

I·· ·· ·· nekonzistentní imunogenicitu u myší a u africké zelené opice vyvolává pouze velice slabou nebo žádnou odezvu; (2) gpl60 se navíc podílí na neutralizaci protilátek stejně jako epitopy CTL tím, že poskytují navíc přibližně 190 aminokyselinových zbytků, což je způsobeno inkluzí gp41; (3) exprese gpl60 je více podobná expresi virového env s ohledem na sestavení tetrameru a celé uspořádání, přičemž mohou vzniknout neutralizační epitopy závislé na oligoméru; a (4) zjistilo se, podobný úspěch na membránu vázaných konstrukcí viru chřipky HA při vyvolání neutralizující protilátkové odezvy u myší, fretky a primátů je lepší tvorba anti-gp!60 protilátek než anti-gpl20 protilátek. Selekce, který typ env se prferuje nebo zda se preferuje směs subfragmentů env , se provádí experimenty, které jsou uvedeny dále v textu.

2. Existence a rozsah neutralizační kapacity.

Testovala se antiséra získaná z opic, která jsou pozitivní v tetsu ELISA. Vykazují neutralizaci jak homogenních tak i heterogenních kmenů HIV.

3. V3 vs. protilátky, které nedokáží neutralizovat V3. Hlavním úkolem env PNV je generace široce neutralizujících protilátek. Ukázalo se, že protilátky směrované proti smyčce V3 jsou velmi kmenově specifické a sérologie této odezvy se používá při definici kmenů.

a. Protilátky, které nedokáží neutralizovat V3 epitop, dokáží primárně rozeznat přerušené strukturální epitopy v gp!20, které odpovídají za navázání -na CD4. Protilátky k této doméně jsou polyklonálními protilátkami a vykazují širokou křížovou neutralizaci, která je způsobena omezením mutací, jenž je vyvolané potřebou viru vázat se na na jeho buněčný ligand. Test in vitro se používá pro testování zablokování vazby gpl20 na CD4, který je • ·

A · · · · · • · · * · · • · · · · φ φ φφφφ φ • · · · • ·· · ·· · · imobilizovaný na destičkách s 96 buňkami pomoci séra z imunizovaných zvířat. Druhý test in vitro detekuje přímé navázání protilátek na syntetické peptidy, které reprezentují vybrané domény V3 imobilizované na umělé hmotě. Tyto testy používají kompatibilní antiséra, která pochází z libovolného typu zvířete, jenž se používalo při naší studii, a definují typy neutralizujících protilátek vznikající za použití uvedené vakcíny, stejně jako poskytují in vitro korelaci neutralizace viru.

b. gp41 nese nejméně jednu hlavní neutralizující determinantu, která odpovídá vysoce konzervativnímu lineárnímu epitopu, jenž rozeznávají široce neutralizující monoklonální protilátky 2F5 (běžně dostupné u Viral Testing Systems Corp., Texas Commerce Tower, 600 Travis Street, Suitě 4750, Houston, TX77002-3005 (USA), nebo Waldheim Pharmazeutika GmbH, Boltzmangasse 11, A-1091 Wien, Austria), stejně jako další potentiální místa, mezi něž patří konzervativní doména fúzního peptidu lokalizovaná na Ν'konci gp41. Mimo shora popsané detekci protilátek imunoblotem, které jsou směrovány proti gp41, test in vitro se používá v případě protilátek, které se váží na syntetické peptidy, které reprezentují tyto oblasti imobilizované na plastu.

c. Maturace protilátkové odezvy.

U pacientů, jejichž séra jsou pozitivní na HIV, se neutralizující protilátková odezva vyvíjí zejména z anti-V3, aby zahrnovala široce neutralizující protilátky, které obsahují shora popsané strukturální epitopy domény gpl20 (#3), mezi něž patří epitopy gp41. Tyto typy protilátkové odezvy se monitorují v závislosti na čase a následných vakcinacích.

B. Reaktivita T buněk proti env a gag.

• · • ·

I « I «

2. Vytvoření CTL odezvy.

Virové syntetizované proteiny v buňkách dávají vzniku CTL odezvy omezené na MHC I. Každý z těchto proteinů u séropozitivních pacientů vyvolává CTL. Uvedené vakcíny jsou schopny vyvolat CTL u myší. Imunogenetika myších kmenů přispívá k těmto studí jím, jak se demonstruje s NP chřipky. Na myších Balb/c se definovalo několik epitopů proteinů HIV env, REV, nef a gag, což umožňuje in vitro kultivaci CTL a cytotoxické tetsy. Je výhodné používat syngenní nádorové linie, jako je myší mastocytom P815, transfekované uvedenými geny za vzniku cílů pro CTL, stejně jako jsou vhodné pro specifickou restimulaci antigenu in vitro. Metody pro definici imunogenů schopných vyvolat cytotoxické T lymfocyty omezené na MHC třídy I. Také se zjistilo, že aminokyseliny peptidů 152 až 176 indukují protilátky neutralizující HIV a tyto metody se mohou použít pro identifikaci imunogenních epitopů pro inkluzi v PNV podle vynálezu. V jiném případě se může použít celý gen kódující gpl60, gpl20, proteázu nebo gag. V tomto vynálezu je funkce efektoru T-buňky spojena se zralým fenotypem T-buňky, např. cytotoxicity, sekrece cytokinů, která je nutná pro aktivaci B-buňky a/nebo pomnožení nebo stimulace makrofágů a neutrofilů.

2. Měření T_H aktivit.

U kultury buněk sleziny získaná z vakcinovaných zvířat se testovala schopnost znovuvyvolat specifické antigeny přidáním buď rekombinantího proteinu nebo epitopů peptidů. Aktivace T buněk takovými antigeny, což se provádí doprovázením sleziným antigenem, který je přítomný v buňkách, APC se monitoruje pomnožením těchto kultur nebo produkcí cytokinů. Patern produkce cytokinů také umožňuje klasifikaci T_H odezvy jako typ 1 nebo typ 2. Vzhledem k tomu, že odezvy T_h2 korelují s exkluzí buněčné imunity u • · • · «« · · · · • · · · · • · · 00 * · 00 0 0 0 imunokompromitovaných séropozitivních pacientů, je možné definovat typ odezvy, která vznikla u pacienta dannými PNV, což umožňuje manipulaci výsledné imunitní odezvy.

3. Opožděný typ hypersenzitivity (DTK)

DTH na virový antigen po i.d. injekci svědčí o buněčné, primárně MHC II omezené imunitě. Vzhledem ke komerční dostupnosti rekombinantích HIV proteinů a syntetických peptidů známých epitopů, je možné snadno detekovat DTH odezvu u vakcinovaných obratlovců za použití uvedených činidel a tak poskytnout in vivo korelaci při indukci buněčné imunity.

Ochrana.

Na základě shora uvedených imunologických studií se dá předpovídat, že uvedené vakcíny jsou účinné u obratlovců proti dávce virulentního HIV. Tyto studie se uskutečnily na vakcinačním modelu HIVuib/ šimpanz, po té co se uvedená zvířata imunizovaly konstrukcí PNV nebo směsí konstrukcí PNV, které obsahují gpl60m_B, gagm_B, nefmB a REV_IIIB. Kmen IIIB je v tomto ohledu použitelný. Musel se stanovit pro šimpanze titr letální dávky uvedeného kmene. Stejné studie se dají provést za použití libovolného kmene HIV a epitopů, které jsou specifické nebo heterogenní k dannému kmeni. Mimo modelu šimpanze se dá použít model myši scid-hu PBL. Tento model umožňuje testování lidského lymfocytního imunitního systému a vakcíny s následnou infekcí HIV. Tento systém je výhodný, protože se jednoduše adaptuje na použití libovolného kmene HIV a prokazuje ochranu proti více kmenům primárních izolátů HIV. Třetím modelem je hybridní HIV/SIV virus (SHIV). Ukázalo se, že některé z nich infikují opice rhezus a vedou k selhání imunitního systému a k úmrtí (Li, J., et al., J. AIDS 5: 639646, 1992). Vakcinace opice rhesus s uvedenými • · polynukleotidovými vakcinačními konstrukcemi ji ochrání proti následné infekci letální dávkou SHIV.

Shrnutí PNV konstrukce.

HIV a jiné geny se ligují do expresivního vektoru, který se optimalizoval za účelem polynukleotidové vakcinace. Z vektoru se odstranila prakticky celá zevní DNA, zanechaly se jen podstatné elementy, kterými jsou promotor transkripce, imunogenní epitopy, transkripční terminátor, bakteriální počátek replikace a gen rezistence na antibiotika.

Exprese pozdních genů HIV, jako jsou env a gag je závislá na REV je nutné, aby element odezvy REV (PRE) byl přítomen na transkriptu virového genu. Sekretované formy gpl20 se. mohou vytvořit za nepřítomnosti REV substitucí gpl20 vedoucího peptidu s heterologní vedoucí sekvencí, jako je tPA (aktivátor plazminogenu tkáňového typu), upřednostňuje se vedoucí peptid, který se například nachází u silně exprimovaných savčích proteinů, jako jsou vedoucí peptidy imunoglobinu. Chimérický gen tPA-gpl20 se začlenil do vektoru VIJns, který účině exprimuje v transfekovaných buňkách vylučovaný gpl20 (RD, linie lidského rabdomyosarkomu). Monocistronický gpl60 po transfekci neprodukuje žádný protein bez zavedení REV do expresivního vektoru.

Reprezentativní komponenty konstrukce zahrnují (ale nejsou omezeny na):

I. tPA-gpl20MN;

3. gpl60n_IB;

10. gaglIIB: pro anti-gag CTL;

II. tPA-gpl2Oihb;

12. gpl60 se strukturálními mutacemi: VI, V2 a/nebo V3 delece smyček nebo substituce

* * • ♦ · · * φφφ φ · φ · ·

20. geny kódující antigeny exprimované jinými patogeny, než je HIV, jako je například nukleoprotein viru chřipky, hemagglutinin, matrice, neuraminidáza a jiné antigenni proteiny; geny viru herpes simplex; geny lidských papilomavirů; antigeny tuberkulózy, antigeny viru hepatitidy A, B nebo C.

Účinnost ochrany polynukleotidových imunogenů HIV proti následné virové infekci se demonstruje imunizací plazmidovou DNA podle vynálezu, která se nereplikuje. To je výhodné, protože není zahrnuto infekční činidlo a umožňuje to vybrat determinantu. Vzhledem k tomu, že sekvence gag, proteázy a několika produktů virových genů různých kmenů HIV je konzervativní, je možné dosáhnout ochrany proti následné infekci virulentním kmenem HIV, který je homologní nebo heterologní s kmenem, z kterého se získal klonovaný gen.

I.m. injekce DNA expresivního vektoru, který kóduje gplSO, vede ke vzniku podstatné ochranné imunity proti následné virové infekci. Zvláště vznikají protilátky specifické pro gpl60 a primární CTL. Imunitní odezva směrovaná proti konzervativním proteinům může být účinná navzdory antigennímu posunu a přesunu variabilních obalových proteinů. Protože každý z genových produktů HIV vykazuje konzervativnost a protože CTL se generují v rámci odezvy na vnitrobuněčnou expresi a zpracování MHC, dá se předpovědět, že mnoho virových genů vede k odezvě analogů, kterých se dosáhlo pro gpl60. Pak řada těchto genů se klonovala, jak ukazuje klonované a sekvenované spojení v expresivním vektoru (uvedeno dále v textu) tak, že tyto konstrukce jsou ve formě imunogenních činidel.

Vynález nabízí způsob indukce křížové ochranné imunity proti různým kmenům, aniž jsou nutná činidla nebo adjuvans, která se sami replikují. Navíc imunizace se stálými ·· » · > · ··· polynukleotidami nabízí řadu jiných výhod, Tanto vakcinační přístup by se mel aplikovat v případě nádorů, stejně jako v případě infekčních agents, protože odezva CD8⁺CTL je důležitá pro oba patofyziologické postupy (K. Tanaka et al., Annu. Rev. Immunol. 6, 359 (1988)). Vzhledem k tomu, že vyvolání imunitní odezvy proti proteinu je důležité při procesu transformace, může být účinným způsobem ochrany proti rakovině nebo imunoterapií. Vytvoření vysokého titru protilátek proti exprimovaným proteinům po injekci virového proteinu a DNA lidského růstového hormonu naznačuje, že jde o vysoce účinný způsob přípravy protilátek na základě vakcín. Vakcíny jsou buď oddělené nebo se kombinují s cytotoxickými T-lymfocytovými vakcínami cílenými na konzervativní antigeny.

Jednoduchost produkce a čištění konstrukcí DNA se dá srovnat š tradičními metodami čištění proteinu, což umožňuje vznik kombinovaných vakcín. Může se připravit více konstrukcí, které například kódují gpl60, gpl20, gp41 nebo libovolný gen HIV, mohou se smíchat a společně aplikovat. Protože exprese proteinů je udržována následujícími injekcemi DNA, trvanlivost paměti B- a T-buněk se zvýší, přičemž vznikne dlouhodobá humorální a buněčná imunita.

Standardními metodami molekulární biologie pro přípravu a čištění konstrukcí DNA je možné připravit DNA imunogeny podle vynálezu. Zatímco standardní metody molekulární biologie jsou dostatečné pro produkci produktů podle vynálezu, zde popsané specifické konstrukce poskytují nové polynukleotidové imunogeny, které překvapivě působí neutralizaci křížových kmenů a primárních izolátů HIV, což není možné dosáhnout s vakcínami, které tvoří standardní deaktivovaný celý virus nebo podjednotka proteinu.

Množství exprimovatelné DNA nebo přepisované RNA, kterou lze zavést do recipientu vakcíny, závisí na síle použitých promotorů transkripce a translace a na imunogenicitě • · • · » 9 9 » ♦ « • φ Φ · • · • · « exp r linovaného genového produktu. Obecně lze říct, že pro aplikaci přímo do svalu je imunogenně a profylakticky účinná dávka přibližně 1 ng až 100 mg, upřednostňuje se přibližně 10 gg až 300 gg. Pro aplikaci se používá podkožní injekce, intradermální zavedení, imprese kůží a jiné způsoby aplikace, jako je intraperitonální, intravenózní zavedení nebo inhalace. Je možné také aplikovat vakcinaci s posilovacími dávkami. Provádí se také vakcinace s polynukleotidovým imunogenem HIV, posilovači dávkou jsou proteinové imunogeny HIV, jako je gpl60, gpl20 a produkt genu gag. S výhodou se používá parenterálni aplikace, jako je intravenózní, intramuskulární, podkožní nebo jiné způsoby aplikace proteinu interleukinu 12, s konkurenčním nebo následným parenterálním zavedením PNV podle vynálezu.

Polynukleotid může být nahý, což znamená, že není spojen s žádnými proteiny, adjuvans nebo jinými činidly, které působí na imunitní systém recipienta. V tomto případě je nutné, aby se polynukleotid nacházel ve fyziologicky přijatelném roztoku, jako je například sterilní fyziologický roztok nebo sterilní pufrovaný fyziologický roztok. V jiném případě DNA může být spojena s lipozomy, jako jsou lipozomy lecitinu nebo jiné lipozomy dobře známy v oboru, jako je například směs lipozómu a DNA, v jiném případě může být DNA spojena s adjuvans, kterým je v oboru známý protein nebo nosič, aby se posílila imunitní odezva. Výhodná mohou být také agens, která asistují při pojmutí DNA buňkou, jako jsou například ionty vápníku. Tato činidla se zde obecně nazývají činidla umožňující transfekci a farmaceuticky přijatelné nosiče. Způsoby obalování mikroprojektilů polynukleotidy jsou v oboru dobře známy a jsou také použitelné ve vztahu k tomuto vynálezu.

Přehled obrázků na výkrese • ··· · · · · ·♦ • · ♦ ♦ · « · ··· · * ··· · · · · · ··· ··· ···· ·· ··

Na obrázku č. 1 je kazeta genu env HIV vytvořená na základě strategií exprese.

Na obrázku č. 2 je DNA vakcína, která vyvolává odezvy proti gpl20.

Na obrázku č. 3 jsou titry vakcinačního séra myší DNA proti gp!20 získané testem ELISA.

Obrázek č. 4 ukazuje relativní expresi gp!20 po transfekci buněčné kultury buněk PNV genem env HIV.

Obrázek č. 5 zobrazuje průměrné odezvy proti gpl20 získané z testu ELISA po vakcinaci s tPA-gpl43/optA vs. optB DNA.

Obrázek č. 6 zobrazuje neutralizaci HIV pomocí myšího vakcinačního séra po vakcinaci s DNA.

Obrázek č. 7 zobrazuje neutralizaci HIV sérem po vakcinaci myší HIV env DNA.

Obrázek č. 8 zobrazuje analýzu optimalizované konstrukce HIV env DNA imunoblotem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Popis materiálů.

Vektory pF411 a pF412: Tyto vektory se subklónovaly z vektoru pSP62, které se konstruovaly v laboratoři R. Gallo. Vektor pSP62 reagent dostupný u Biotech Research Laboratories, lne.. Vektor pSP62 nese fragment Xbal o velikosti 12,5 kb genomu HXB2, který je subklónovaný z lambda HXB2. Štěpení vektoru pSP62 restrikčními enzymy Sáli a Xbal vede ke vzniku fragmentů HXB2: 5'-XbaI/SalI o velikosti 6,5 kb a 3'-SalI/XbaI o velikosti 6 kb. Tyto inzerty se subklónovaly do vektoru pUC18 do restrikčních míst Smál a Sáli, což vede ke vzniku pF411 (5'-XbaI/SalI) a pF412 (3'Sall/Xbal). Vektor pF411 obsahuje gag/pol a vektor pF412 obsahuje tat/rev/env/nef.

• ··

·« 9· 99

9 9 9 9

9 9 99

9 999 9 ·

9 9 9

999 99 ·9

Repligenová činidla:

rekombinantí rev (IIIB), #RP1024-10 rec. gpl20 (IIIB), #RP1001-10 anti-rev monoklonální protilátky, #RP1029-10 anti-gpl20 mAB, #1C1, #RP1010-10

Program výzkumu AIDS a referenčních činidel (AIDS Research and Reference Reagent Program): anti-gp41 mAB hybridom, Chessie #526

Byla vytvořena strategie pro indukci jak cytotoxických T lymfocytů (CTL) tak i neutralizující protilátkové odezvy na HIV, směrované ke genovým produktům HIV gag («95% konzervativní) a env (gpl60 nebo gp!20; 70 až 80 % konzervativní). gpl60 obsahuje pouze známé neutralizující protilátkové epitopy na HIV partikulích, zatímco důležitost anti-env a anti-gag odezvy CTL jsou zesíleny známou asociací počátku těchto buněčných imunit s vyléčeníprimární virémie následující infekcí, která se objeví před vytvořením neutralizujících protilátek, stejně jako úloha CTL u udržování statusu bez onemocnění. Vzhledem k tomu, že u HIV jsou známá genetická diverzita, doufá se, ež je možné získat větší rozsah neutralizujících protilátek tím, že se zahrne několik reprezentativních env genů odvozených z klinických izolátů a gp41 (přibližně z 90 % konzervativní), zatímco vysocxe konzervativní gen gag by měl generovat širokou křížovou CTL odezvu.

Příklad 2: Heterogenní exprese produktů pozdních genů HIV.

Strukturální geny HIV, jako je env a gag vyžadují expresi regulačního genu HIV rev za účelem účinné produkce proteinů v plné délce. Zjistilo se, že exprese gag závislá na • · rev vede k nízkému množství proteinu a že samotný rev může být pro buňky toxický. Ačkoli jsme dosáhly relativně silné in vitro exprese gpl60 závislé na rev, tato vakcína po in vivo imunizaci DNA rev/gpl60 vyvolává malé množství protilátek proti gpl60. To může způsobit známé cytotoxické účinky rev, stejně jako rev, jehož funkčnost v myotubulích, které obsahují stovky jader (protein rev se musí ve stejném jádru vyskytovat jako transkript závislý na rev, aby mohlo dojít expresi proteinu gag a env), není vždy zaručená. Za použití selektivnívh modifikací env genu gag je však možné dosáhnout exprese nezávislé na rev. Na zhodnocení vhodnosti těchto plazmidů pro účely vakcinace se pracuje.

Uvedené vakcíny primárně využívají geny HIV (IIIB) env a gag za účelem optimalizace exprese bez uvedeného zobecněného vakcinačního vektoru VIJns, který obsahuje časný promotor (IE) pocázející z CMV, BGH polyadenylační místo a kostru z pUC. Kolísající účinos, která závisí na tom, jak velký genový segment se použije (např. gpl20 vs. gpl60). V případě genu env se může dosáhnout exprese ' závislé na rev tím, že se nativní sekreční vedoucí peptid zamění za peptid odvozený z genu aktivátoru plazminogenu, který je tkáňově specifický (tPA) a výsledný chimérický gen se exprimuje za promotorem CMVIE s CMV intronem A. tPA-gpl20 je příkladem sekrečního vektoru konstruovaného tímto způsobem, který je dostatečně funkční, aby vyvolal u vakcinovaných myší a opic imunitní odezvu proti gpl20.

Na základě informací, že proteiny, které jsou ukotveny v membráně mohou indukovat daleko silnější (a možná více specifickou po neutralizaci HIV) protilátkovou odezvu ve srovnání se vylučovanými proteiny, stejně jako s dalšími získanými epitopy, se připravily vektory VlJns-tPA-gpl60 a VIJns-rev/gpl60. Vektor tpA-gp!60 produkuje detekovatelné ··· • I • · · · ·» 99 • · · 9 • 9 99 • ··♦ 8 ·

9 9

9 9 množství gpl60 a gpl20, aniž se musel přidat rev, což se ukázalo analýzou transřekováných buněk imunoblotem, ačkoli síla exprese je daleko nižší než je exprese rev/gpl60 za použití konstrukce rev-závislý gpl60-exprimující plazmid. To je pravděpodobně z toho důvodu, že inhibiční oblasti (označené INS), které potvryují závislost rev na transkriptu gpl60, se vyskytují ve více místech v gpl60 ataké na COOHkonci gp41 (schéma je uvedeno dále v textu) . Vektor se připravil pro na COOH-konci zkrácenou formu tPA-gpl60, tPAgpl43, která se vytvořila, aby zvíšila celkovou sílu exprese genu env tím, že se eliminují tyto inhibiční sekvence. Vektor gpl43 také eliminuje vnitrobuněnčé oblasti gp41, které obsahují peptidové motivy (jako je leu-leu), o kterých se ví, že způsobují odklonění membránových proteinů směrem k lysosomům spíše než k povrchu buňky. Pak se může očekávat, že gpl43 zvýší jak expresi proteinu env (tím, že se sníží závislost na rev) tak i účinnost transportu proteinu na buněčný povrch ve srovnání s případem gpl60 v plné délce, kde tyto proteiny jsou schopny po vakcinaci DNA lépe vyvolávat protilátky proti gp-160. tPA-gpl43 se dále modifikoval rozsáhlou tichou mutagenezí sekvence PRE (350 bp) za účelem eliminace dalších sekvencí, které inhibujíé expresi. Tato konstrukce gpl43/mutRPE se připravila ve dvouch formách: buď eliminací (forma A) nebo ponecháním (forma B) míst protewolytického štěpení gpl20/41. Obě formy se připravily na základě informací v literatuře, které zdělují, že vakcinace myší za použití něštěpitelného gpl60 exprimovaného ve vekcinii vyvolává daleko větší množství protilátek proti gpl60, než se děje v případě štěpitelné formy.

Za účelem stanovení relativní schopnosti exprese tohoto vektoru se vyvinul kvantitativní test ELISA pro hodnocení exprese gpl60/gpl20 v buněčných transfektantech. Transfekce in vitro buněk 293, po níž následuje kvantifikace buněk • flfl fl· flfl ·· • fl · · « * ♦ · · flfl « · ··· · * • · · · fl··· flfl ·♦ spojených s sekretovaný verzus uvolněný gpl20 vede k následujícím výsledkům: (1) tPa-gpl60 exprimuje 5 až lOx méně gpl20 než rev/gpl60, kdy podobné podíly zůstávají uvnitř buňky a transportují se na povrch buňky; (2) tPA-gpl43 exprimuje 3 až 6 krát větší sekreční gpl20 ve srovnání rev/gpl60, kdy v buňce zůstává pouze malé množství gpl43, což potvrzuje, že cytoplazmatický ocas gpl60 způsobuje vnitrobuněčnou retencigpl60, což je možné obejít částečnou delecí této sekvence; a (3) tPA-gpl43/mutRRE A a B dává přibližně 10 krát silnější expresi proteinuve srovnání s původním tPA-gpl43, zatímco pro formu A se potvrdila eliminace proteolytického zpracování.

Pak tato strategie zesílení exprese závislé na rev vede k postupnému zesílení celkové exprese, stejně jako dojde k přesměrování gpl43 kotveného v membráně na povrch buňky. Je důležité poznamenat, že by mělo být možné začlenit sekvence gpl20 odvozené od různých virových izolátů do vektorové kazety, která obsahuje uvedené modifikace, které se nacházejí buď na NH2-konci (tPA vedoucí sekvence) nebo na COOH-konci (gp41), kde existuje mezi různými virovými kmeny několik antigenních rozdílů. Jinými slovy jde o generickou konstrukci, která se může jednoduše modifikovat začleněním gpl20 získaným z různých primárních virových izolátů za účelem získání klinicky relevantních vakcín.

Za účelem aplikace těchto strategií pro expresi virů, které jsou relevantní pro účely vakcíny a potvrzují správnost uvedených přístupů se také připravil vektor tPA-gpl20 odvozený z primárních HIV izolátů (zahrnuje konzenzus Severní Ameriky o peptidové smyčce V3; makrofág-tropický fenotyp a fenotyp, který neindukuje vznik syncitia). Tento vektor poskytuje silnou expresi/sekreci gpl20 v transfekovaných buňkách 293 a vyvolává v myších anti-gpl20 protilátky, což dokazuje, že se klonoval ve funkční formě.Geny gpl60 z ·· ·· • · · · • · ·· • ···· * • · · ·9 ·· • ·· • · · • * • ·· • ··· · primárních izolátů se používaly pro expresi stejným způsobem jako geny gpl60 získané z laboratorních kmenů.

Příklad 3: Imunitní odezva na HIV-1 ertv polynukleotidovou vakcínu:

Africké zelené opice (AGM) a opice Rhesus (RHM), které se 2 krát až 3 krát vakcinovaly DNA gpl20 vykazují malé množství neutralizujících protilátek, jejichž množství nelze zvýšit ani další vakcinací. Tyto výsledky stejně jako skutečnost .okolo HIV vakcín, že oligomerní gp!60 je pravděpodobně více relevantní antigen pro vyvolání neutralizujících protilátek, než monomery gpl20 (Moore and Ho, J. Virol. 67: 863 (1993)), nás nutí zaměřit se na získání účinné exprese vektorů založených na gpl60 (uvedeno shora v textu) . Myši a AGM se také imunizovaly vakcínou, která obsahuje tPA-gpl20 z primárních izolátů. Tyto zvířata vykazují konečný reciproční titr protilátek proti V3 peptidu (za použití homologní sekvence), který se pohybuje v rozmezí 500 až 5 000, což ukazuje, že tato vakcína je funkční pro klinicky relevantní virové izoláty.

Vakcíny na bázi gpl60, rev-gpl60 a tPA-gpl60 nedokážou u lidí a u primátů stabilně vyvolávat protilátkovou odezvu nebo vyvolávají nízký titr protilátek. Počáteční výsledky s plazmidem tPA-gpl43 vykazují u myší a u AGM po dvouch vakcinacích hodnotu geometrického průměru titrů >10³. Tyto data indikují, že se podstatně zlepšila imunogenita vakcín, které odpovídají vakcínám gpl60, tím, že se zvýšila síla exprese. U těchto konstrukcí stejně jako u vektorů tPAgpl43/mutRRE A a B se budou dále zkoumat protilátková odezva, zvláště v případě neutralizace viru.

Vakcinace gpl20 DNA v podstatě produkuje potentní odezvu pomocných T buněk ve všech testovaných částech lymfatického systému (slezina, krev, tříselné, mezenterické a kyčelní • 4 • 4 4 • 4444 44 ·· žlázy) se sekrečním profilem cytokinů, který je podobný T_H1 (to znamená produkce g-interferonu a IL-2 s malým množstvím nebo bez IL-4). Tyto cytokiny obecně vyvolávají silnou buněčnou imunitu a dokáží pacienty s HIV pozitivními séry udržet ve stádiu aniž propuklo onemocnění. Ukázalo se, že lymfatické uzliny jsou primární místa replikace HIV, což znamená, že obsahují velké množství viru a to dokonce I v případě, že virus není možno detekovat v krvi. Vakcína, která je schopna vyvolat anti-HIV imunitní odezvu v různých místech lymfatického. systému, jako je například uvedená vakcína DNA, může pomoct při prevenci úspěšné kolonizace lymfatického systému, která následuje po počáteční infekci.

Jak se uvádí dříve v textu, aby uvedený program měl maximální šance na úspěch zrealizovaly jsme následující: (1) připravily se vektory na bázi genu env, které jsou schopny generovat silnější neutralizující protilátkovou odezvu u primátů; (2) vektory gag a env, které u primátů vyvolávají silnou odezvu T-lymfocytů, jak charakterizují CTL, a efektor helpru, který také funguje u primátů; (3) použití genů env a gag z klinicky relevantních kmenů HIV-1 v uvedených vakcínách a charakterizace jimi vyvolané imunitní odezvy, zvláště neutralizace primárních izolátů; (4) demonstrace ochrany zvířecích modelů , jako je šimpanz /HIV (IIIB) nebo rhesus/SHIV za použití vhodných optimalizovaných vakcín; a (5) stanovení délky imunitní odezvy, která je vhodná pro klinické použití. Podstatného pokroku se dosáhlo u prvních třech bodů a experimenty stále pokračují, aby se stanovilo, zda poslední vakcinační konstrukce gpl60 a gag zlepší tyto počáteční výsledky.

Příklad 4; Vekotry vhodné pro produkci vakcíny.

A. Expresivní vektor VIJneo:

• φ »· φ φ φ φφφφ φφφ φ • φ φφ ·· • · φ φ φ ·

Je nzbytné odstranit gen amp^r, který se používá za účelem selekce v závislosti na antibiotikách bakterií, které nesou VIJ zdůvodu, že ampicilin se nemůže použít při fermentacích prováděných v průmyslovém měřítku. Gen amp^r se z pUC kostry vektoru VIJ odstranil štěpením restrikčními enzymy SspI a EamllO5I. Zbytek plazmidu se izoloval elektroforézou na agarovém gelu a konce se upravily na tupé konce T4 DNA polymerázou a pak se ošetřily telecí intestinální alkalickou fosfatázou. Běžně dostupný gen kan^r, který se získal z transpozonu 903 a je obsažen v plazmidu pUC4K, se vystřihl za použití restrikčního enzymy Pstl, izoloval se elektroforézou na agarovém gelu a konce se upravily na tupé konce T4 DNA polymerázou. Tento fragment se ligoval do kostry vektoru VIJ a získaly se plazmidy s genem kan^r v libovolné orientaci. Tyto plazmidy se označily VIJneo# 1 a 3. Správnost každého z těchto plazmidů se potvrdila restrikční analýzou, sekvenováním spojených oblastí a zjistilo se, že produkují podobné množství plazmidu jako VIJ. Exprese produktů heterogenních genů vektorů VIJneo je také srovantelná s VIJ. Jako expresivní konstrukce se vybral vektor VlJneo#3, který se označil VIJneo obsahující gen kan^r ve stejné orientaci, jako je gen amp^r v VIJ.

B. Expresivní vektor VIJns:

Do vektoru VIJneo se přidalo restrikční místo Sfil, aby mohla proběhnout integrační studie. Do restrikčního místa KpnI, které se nachází v sekvenci BGH vektoru, se přidal běžně dostupný Sfil linker s 13 páry baží (New England BioLabs). Vektor VIJneo se linearizoval restrikčním enzymem KpnI, čistil se na gelu, konce se upravily na tupé konce T4 DNA polymerázou a ligovaly se linkru Sfi I s tupými konci. Na základě retsrikční mapy se vybraly klonální izoláty a ověřily se sekvenací, do níž se zahrnul i linker. Nový vektor se označil jako VIJns. Exprese heterogenních genů ve vektoru VIJns (s Sfi I) se srovnala s expresí stejných genů v plazmidu VIJneo (s Κρη I).

C. VIJns-tPA:

Za účelem poskytnout heterogenní vedoucí peptidovou sekvenci sekretovaným a/nebo membránovým proteinům, se vektor VIJn modifikoval, aby zahrnoval vedoucí sekvenci aktivátoru plazminogenu (tPA), který je specifický pro lidskou tkáň. Spojily se dva syntetické komplementární oligoméry a pak se ligovaly do vektoru VIJn, který se štěpil restrikčním enzymem BglII. Sense a antisense oligoméry byly 5'-GATC ACC ATC GAT

GCA	ATG	AAG	AGA	GGG	CTC	TGC TGT GTG	CTG	CTG CTG TGT	GGA	GCA
GTC	TTC	GTT	TCG	CCC	AGC	GA-3', SEQ	ID: 18; a 5'-GAT	CTC	GCT
GGG	CGA	AAC	GAA	GAC	TGC	TCC ACA CAG	CAG	CAG CAC ACA	GCA	GAG
CCC	TCT	CTT	CAT	TGC ATC CAT GGT-3	' . V	sense oligoméru	je

potržena Kozáková sekvence. Tyto oligoméry obsahují přesahující báze, které jsou kompatibilní pro ligaci do sekvence štěpené restrikčním enzymem BglII. Po ligaci se poškodilo upstream restrikční místo BglII, zatímco downstream restrikční místo BglII se zachovalo pro následné ligace. Obě spojená místa stejně jako celá vedoucí sekvence tPA se ověřily sekvenováním DNA. Navíc, aby se vektor VIJns (je shodný s VIJneo s restrikčním místem Sfil) přizpůsobil konsenzusu, se do KpnI restrikčního místa, které je obsaženo v BGH terminační oblasti vektoru VIJn-tPA, zavedlo Sfil restrikční místo. To se provedlo tak, že se konce Κρη I restrikčního místa upravily na tupé konce T4 DNA polymerázou, pak následovala ligace linkeru Sfil (katalog #1138, New England Biolabs). Tato změna se ověřila restrikčním štěpepím a elektorforézou na agarózovém gelu.

Příklad 5: Vakcinační konstrukce HIV env: Vakcíny produkující sekretovaný antigen odvozený z genu env (gpl20 a gpl40):

Exprese genu env závislého na REV, jako je gpl20 se uskutečnila následujícícm postupem: gpl20 se pomocí pCR klonoval z kmene MN HIV buď s nativní vedoucí peptidovou sekvencí (VIJns-gpl20) nebo jako fúze s vedoucího peptidů aktivátoru tkáňového plazminogenu (tPA) tak, že nahradila nativní vedoucí peptid (VlJns-tPA-gpl20). Ukázalo se, že exprese tPA-gpl20 není závislá na REV (B.S. Chapman et al., Nuc. Acids. Res. 19, 3979 (1991)); je nutné poznamenat, že jiné vedoucí sekvence poskytnou při vyjádření genu gpl20 podobnou funkci nezávisle na REV) . To se uskutečnilo přípravou následujících konstrukcí gpl20, které využívají shora popsané vektory:

Příklad 6: Vakcinační konstrukce gpl20:

A. VIJns-tPA-HIV„Ngpl20:

Gen gpl20 HIVmn (Medimmune) se aplifikoval PCR za použití oligomérů, připravených za účelem odstranění prvních 30 aminokyselin peptidové vedoucí sekvence a klonování do vektoru VlJns-tPA za vzniku chimérického proteinu, který zahrnuje tPA vedoucí peptid, po němž následuje zbývající sekvence gpl20 a 30 aminokyselinových zbytků. Tento design umožňuje expresi gpl20 nezávislou na REV a sekreci rozpustného gpl20 z buněk, které nesou tento plazmid. Používané sense a antisense PCR oligoméry jsou 5'-CCC CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TGGGTC ACA GTC-3' a 5'-C CCC AGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT C-3'. Terminační kodon translace je podtržen. Tyto oligoméry obsahují místa, která rozeznává restrikční enzym BamHI, na libovolném konci translačního otevřeného čtecího rámce s • ·· «· · • ··· • · · « • · · '»4 ·· • ·· ·· · · • · • · • · »·« ·*·· • · · • · • ··· · • · ·· ·· « · restrikčním místem Bell na 3'konci BamHI sense oligoméru. Produkt PCR se sekvenčně štěpil restrikčním enzymem Bell, pak BamHI a ligoval se do vektoru VlJns-tPA, který se štěpil restrikčním enzymem BglII a ošetřil se telecí intestinální alaklickou fosfatázou. Výsledný vektor se sekvenoval, aby se potvrdila fúze uvnitř rámce mezi tPA vedoucí sekvencí a sekvencí kódující gpl20 a exprese a sekrece gpl20 se ověřila analýzou transfekovaných buněk RB imunoblotem.

B. Vektor VIJns-tPA-HIVm_Bgpl20:

Tento vektor je analogem I.A. s výjimkou, že sekvence gpl20 pochází z kmene HIV IIIB. Používané sense a antisense PCR oligoméry jsou: 5'-GGT ACA YGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3' a 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT CTG ČAC CAC TCT TC-3'. Tyto oligoméry zahrnují restrikční místa Bell na libovolném konci inzertu a EcoR V, které leží právě upstream restrikčního místa Bell na 3'-konci. Restrikční místo Bell na 5'-konci umožňuje ligaci do restrikčního místa BglII vektoru VlJns-tPA za vzniku chimérického genu tPA-gpl20, který kóduje vedoucí sekvenci tPA a gpl20 bez jeho nativní vedoucí sekvence. Ligační produkty se ověřily restrikční analýzou a sekvenováním DNA.

Příklad 7: Vakcinační konstrukce gpl40:

Tyto konstrukce se připravily pomocí PCR podobně jako tPA-gpl20 s tPa vedoucí sekvencí na místě nativní vedoucí sekvence. Uvedené konstrukce jsou navrženy tak, aby produkovaly sekretovaný antigen, jehož gen končí bezprostředně na NH2-konci transmembránového peptidu (navržená karboxyterminální aminokyselinová sekvence je NH2„.„.TNWLWYIK-COOH) . Na rozdíl do konstrukcí, které produkují gpl20, konstrukce gpl40 by měly produkovat oligomerní antigen a měly by udržet známé v gp41 obsažené protilátkové • · neutralizační epitopy, jako je ELDKWA, definované monoklonálními protilátkami 2F5.

Konstrukce se připravily ve dvouch formách (A nebo B) v závislosti na skutečnosti, zda se zachovají místa proteolytického štěpení v gpl60 ve spojení gpl20 a gp41 (forma B) nebo se odstraní (forma A) vhodnou substitucí aminokyselin, jak popisuje v publikaci Kieny et al., Prot.

Eng. 2: 219-255 (1988) (sekvence divokého typu je NH2-.......

KAKRRWQREKR._____COOH a mutovaná sekvence je

NH2......KAQNHWQNEHQ......COOH, mutované aminokyseliny jsou podtrženy).

A. VlJns-tPA-gpl40/mutRRE-A/SRV-l 3'-UTR (odvozeno z kmene HIV1_ii1b) :

Tato konstrukce se získala PCR za použití sense a antisense PCR oligomérů: 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG CTG TGG-3', SEQ ID: ; a 5'- CGC AGG GGA

GGT GGT CTA GAT ATC TTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT G-3' za vzniku segmentu AvrlI/EcoRV z vektoru IVB (obsahující optimalizovaný segment RRE-A). 3'-UTR, která se připravila jako syntetický genový segment, jenž se získal s opičího retroviru-1 (SRV-1, uvedeno dále v textu), se začlenil do restrikčního místa enzymu Srfl zavedeného bezprostředně vedle 3'-konce otevřeného čtecího rámce gpl40. Tato sekvence UTR, jak se popisuje dříve v textu, umožňuje expresi genů HIV env a gag, která není závislá na REV.

Β. VIJns-tPA-gpl40/mutRRE-B/SRV-l 3'-UTR (odvozeno z kmene HIV1_iiib) :

Tato konstrukce je podobná IIA s výjimkou, že se místo proteolytického štěpení v genu env zachovalo za použití konstrukce IVC jako počátečního materiálu.

9 • ·

C. VlJns-tPA-gpl40/opt30-A (odvozeno z kmene HlVlms) :

Tato konstrukce se získala z IVB štěpením restrikčními enzymy AvrlI a Srfl, po němž následuje ligace syntetického segmentu DNA odpovídajícího gp30, který obsahuje optimální kodony pro translaci (uvedeno dříve v textu pod heslem gp32.opt). DNA gp30-opt se získala z gp32-opt PCR amplifikaci za použití následujících sense a antisense oligomérů: 5'-GGT ACA CCT AGG CAT CTG GGG CTG CTC TGG-3'; a 5'-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GAT G-3' . Segment DNA ·se štěpil restrikčními enzymy AvrlI a EcoRV a ligoval se do VIJns-tPA -gpl43/opt32-A (IVD), který se štěpil restrikčními enzymy AvrlI a Srfl, aby se odstranil korespondující segment DNA. Výsledné produkty se ověřily sekvenováním DNA ligačního spojení a analýzou imunoblotem.

D. VIJns-tPA-gpl40/opt30-B (odvozeno z kmene HIVl_inB)':

Tato konstrukce je podobná IIC mimo to, že se zachovalo u genu env proteolytické místo štěpení.

E. VlJns-tPA-gpl40/opt celé A:

V této konstrukci je gen env zcela obsažen v optimálních kodonech. Konstatní oblastí (Cl, C5, gp32) jsou ty, které se popisují v IVB, D, H, navíc syntetický DNA segment, který odpovídá variabilním oblastem 1 až 5, se začlenil za použití syntetického DNA segmentu obsaženého v optimálních kodonech vhodných pro translaci (uvedeno například dále v textu na příkladech HIV-1 MN VI až V5) .

F. VlJns-tPA-gpl40/opt celé-B:

Tato konstrukce je podobná IIE mimo to, že se zachovalo v genu env proteolytické místo štěpení.

G. VIJns-tPA-gpl40/opt celé-A (nejde o kmeny IIIB):

··· · • ·

Tato konstrukce je podobná IIE s tou výjimkou, že se používají env aminokyselinové sekvence z kmenů jiných než je IIIB, aby se stanovilo optimální použití kodonu ve variabilních oblastech (VI až V5) .

Η. VIJns-tPA-gpl40/opt celé-B (nejde o kmeny IIIB):

Tato konstrukce je podobná IIG mimo to, že se zachovalo v genu env proteolytické místo štěpení.

Příklad 8: Vakcinační konstrukce gpl60:

Konstrukce se připravily ve dvouch formách (A nebo B) v závislosti na skutečnosti na gpl60 místech proteolytického štěpení.

A. VIJns-rev/env:

Tento vektor je variace vektoru popsaného v sekci D s výjimkou, že celá tat kódující oblast v exonu 1 se deletovala až do počátku otevřeného čtecího rámce REV. VIJns-gpl60m_B(shora popsáno v sekci A) .se štěpil restrikčními enzymy Pstl a KpnI za účelem odstranění 5'-oblasti genu gpl60. Za použití PCR amplifikace se získal segment DNA kódující první exon REV až do restrikčního místa KpnI v gpl60, který pochází z genomového klonu HXB2. Sense a antisense PCR oligoméry jsou 5'-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC3' a 5'-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC-3' . Tyto oligoméry poskytují místa, která rozeznávají restrikční enzymy Pstl a KpnI na 5'- a 3'- konci fragmentu DNA. Výsledná DNA se štěpila restrikčními enzymy Pstl a KpnI, čistila se elktroforézou na agarovém gelu a ligovala se do vektoru VlJns-gpl60(Pst/KpnI). Výsledný plazmid se ověřil restrikční analýzou.

B. VlJns-gpl60:

• ·

• φ ·· • φφφ φ · • · · φφ φφ

HIVxii_Bgpl60 se klonoval PCR amplifikací z plazmidu pF412, který obsahuje 3'-terminální polovinu genomu HIVm_Bzískaného z HIVuib klonu HXB2. Pro PCR se použily anisense a sense oligoméry 5'-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAG AAA TAT CAG C-3' a 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3'. Kozáková sekvence a terminační kodon translace je podtržený. Tyto oligoméry poskytují Bell restrikční místa vně translačního otevřeného čtecího rámce na obouch koncích genu env (Bell restrikční . místa jsou kompatibilní pro ligaci s místy, která rozeznává restrikční enzym BglI, přičemž dochází k následné ztrátě citlivosti na oba restrikční enzymy. (Restrikční místo Bell se vybralo pro PCR klonování genu gpl60, protože tento gen obsahuje vnitřní restrikční místa BglII a BamHI). Antisense oligomér také vnesl restrikční místo EcoRV, právě před restrikční místo Bell, jak se popisuje shora v textu v případě jiných genů získaných způsobem PCR. Amplifikovaný gen gpl60 se čistil na agarózovém gelu, štěpil se restrikčním enzymem BclII a ligoval se do vektoru VIJns, který se štěpil restrikčním enzymem BglII a ošetřil se telecí intestinální alkalickou fosfatázou. Velikost klonovaného genu je okolo 2,6 kb a každé spojení genu gpl60 s vektorem VIJns se potvrdilo sekvenací DNA.

C. VlJns-tPA-gpl60 (odvozeno od kmene HIVIihb) :

Tento vektor je podobný vektoru z příkladu 1 (C) s výjimkou, že gen fpl60 v plné délce bez antivní vedoucí sekvence se získal PCR. Použil se stejný sense oligomér jako v I.C a antisense oligomér měl sekvenci 5-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3'. Tyto oligoméry poskytují restrikční místa BclII na libovolném konci inzertu stejně jako EcoRV, právě upstream restrikčního místa Bell na 3'-konci. Bell restrikční místo na 5'-konci umožňuje ligaci • ·

do BglII místa vektoru VIJns-tPA za vzniku chimérického genu tPA-gpl60, který kóduje tPA vedoucí sekvenci a gpl60 bez nativní vedoucí sekvence. Ligační produkty se ověřily restrikční analýzou a sekvenací DNA.

D. VIJns-tPA-gpl60/optCl/opt41-A (odvozeno od kmene HIVIiub) :

Tato konstrukce je založena na IVH, nese celý optimalizovaný segment kodonu pro C5 a gp41, spíše než gp32, s dalším optimalizovaným kodonovým segmentem (uvedeno dále v textu), který nahrazuje Cl na N-konci genu gpl20, který následuje po tPA vedoucí sekvenci. Nový segment Cl se spojil se zbývajícím segmentem gpl43 prostřednictvím SOE PCR za použití následujících oligomérů, aby se syntetizovalo spojení segmentu Cl/143: 5'-CCT GTG TGT GAG TT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT. GAT ACT AAT AC-3'. Výsledný gen gpl43 obsahuje optimální kodon s výjimkou oblastí VI až V a nese jediné restrikční místo Pmel, které se nachází ve spojení Cl a VI a jevhodné pro inzerci variabilních oblastí, které pocházejí z jiných genů HIV.

E. VlJns-tPA-gpl60/optCl/opt41-B (odvozeno od kmene HIVIiub) :

Tato konstrukce je podobná konstrukci popsané v odstatvci IIID s tou výjimkou, že se zachovala proteolytická štěpící místa.

F. VIJns-tPA-gpl60/opt vše-A (odvozeno od kmene HIVIiub) :

Gen env této konstrukce je zcela obsažen v otpimálních kodonech, jak se popisuje shora. Konstantní oblasti (Cl, C5, gp332) jsou ty, které se popisují v odstavcích IIID, E a které se používají jako kazeta (používají se pro zcela optimalizovaný gpl60), zatímco variabilní oblasti VI až V5 se získaly ze syntetického segmentu DNA, který je obsažen v optimálních kodonech.

• · · · ·

G. VlJns-tPA-gpl60/opt celé-B

Tato konstrukce je podobná konstrukci v odstavci IIIF z tou výjimkou, že se zachovala místa proteolytického štěpení env.

Η. VIJns-tPA-gpl60/opt celé-A (není odvozen z kmene HIVlm_B) : Tato konstrukce je podobná konstrukci ze shora uvedeného odstavce IIIF s tou výjimkou, že se za účelem stanovení optimálního použití kodonu variabilních sekvencí (VI až V5) použily aminokyselinové sekvence z kmene jiného než je kmen IIIB.

I. VlJns-tPA-gpl60/opt celé-B (není odvozen z kmene HIVlm_B) : Tato konstrukce je podobná konstrukci z odstavce IIIH s tou výjimkou, že se zachovala místa proteolytického štěpení env.

Příklad 9: gpl43 vakcinační konstrukce:

Tyto konstrukce se připravily pomocí PCR podobně jako jiné shora popsané konstrukce, které obsahují tPA (tPA-pgl20, tPA-gpl40 a tPA-gpl60) s vedoucí sekvencí tPA na místě nativní vedoucí sekvence, ale je navržena tak, aby vznikl na membránu vázaný env s koncem COOH (navržená aminokyselinová sekvence = NH2-NRVRQGYSP-COOH). Tato konstrukce se navrhla za účelem kombinace zesílení exprese env zavedením tPA a minimalizace možnosti, že transkript nebo peptidová oblast, která odpovídá intracelulární části genu env, může negativně ivlivnit expresi nebo stabilitu/transport proteinu na povrch buňky. Konstrukce se připravily ve dvouch formách (A nebo B) v závislosti na tom, zda se odstarnila místa proteolytického štěpení gpl60 nebo zda zůstala zachována. Zbytkový fragment • ·

gp41, který vznikla zkrácením gpl43, je zde označen jako gp32.

A. VIJns-tPA-gpl43:

Tato konstrukce se připravila pomocí PCR za použití plazmidu pF412 s následujícími sense a antisense PCR oligoméry: 5'-GGT ACA TGA TGA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC3', SEQ ID: ; a 5'- CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3'. Výsledný, segment DNA obsahuje restrikční místa Bell na libovolném konci vhodné pro klonování do vektoru VIJns-tPA/BglII, který se štěpí restrikčním enzymem Srfl v místě, které je lokalizováno bezprostředně 3'- konce otevřeného čtecího rámce env. Konstrukce se ověřila sekvenováním ligačního spoje a imunoblotovací analýzou transfekovaných buněk.

Β. VIJns-tPA-gpl43/mutRRE-A:

Tato konstrukce je založena na konstrukci z odstavce IVA, přičemž se vystřihne segment DNA použitím jediného místa, které rozeznává restrikční enzym MunI a downstream položeného restrikčního místa Srfl, jak se popisuje shora v textu. Tento segment odpovídá části oblasti gpl20 C5 a zcelým gp32. Syntetický segment DNA korespondující přibližně s 350 bp rev responzivního elementu (RRE A) gpl60, obsažený v optimálních segmentech translace, se připojil ke Zachovalému segmentu gp32 pomocí sestřihu přesahující extenze (SOE) PCR za vzniku AvrlI restrikčního místa ve spojení dvouch segmentů (ale nedošlo k žádným změnám v aminokyselinové sekvenci) . Tyto reakce PCR se provedly za použití následujících sense a antisense PCR oligomérů za vzniku oblasti, která zahrnuje gp32: 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3' a 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3' (která se používá jako antisense oligomér v případě IVA) . Mutovaný segment RRE (mut RRE-A) se připojil k sekvenci divokého typu gp32 pomocí SOE PCR za použití následujícího sense oligoméru 5'-GGT ACA CAA TTG GAG GAG CGA GTT ΑΤΑ TAA ΑΤΑ TAA G-3' a antisense oligoméru se vytvořil segment gp32. Výsledný spojený segment DNA se štěpil restrikčními enzymy MunI a Srfl a ligoval se do rodičovského štěpeného plazmidu gpl43/MunI/SrfI. Výsledná konstrukce se ověřila sekvenováním DNA ligovaného a SOE PCR spojení a analýzou transfekovaných buněk imunoblotem.

C. VIJns-tPA-gpl43/mutRRE-B:

Tato konstrukce je podobná konstrukci z odstavce IVB s tou výjimkou, že se zachovaly místa proteolytického štěpení env, přičemž se použil syntetický genový segment mutRRE-B na místě mutRRE-A.

D. VIJns-tPA-gpl43/opt32-A:

Tato konstrukce se získala z konstrukce popsané v odstavci IVB tak, že se štěpila restrikčními enzymy AvrlI a Srfl, pak následuje ligace synteického segmentu DNA, který odpovídá gp32, ale obsahuje optimální kodony pro translaci (uvedeno gp32 opt dále v textu). Výsledné produkty se ověřily sekvenováním DNA ligačního spojení a analýzou imunoblotem.

E. VIJns-tPA-gpl43/opt32-B:

Tato konstrukce je podobná konstrukci z odstavce IVD s tou výjimkou, že se zachovala místa proteolytického štěpení env, přičemž se jako počáteční plazmid používá IVC.

G. VIJns-tPA-gpl43/SRV-l 3'-UTR:

Tato konstrukce je podobná konstrukci popsané v odstavci IVA s tou výjimkou, že se do restrikčního místa Srfl, které leží bezprostředně vedle 3'-konce otevřeného čtecího rámce • · · · · · 9 · · • 9 9 99

9 999 9 9

9 9 gpl43 3'-UTR získaná z opičího retroviru-1 (SRV-1, uvedeno dále v textu). Tato shora popsaná sekvence UTR umožňuje expresi HIV env a gag nezávislou na rev.

Η. VIJns-tPA-gpl43/opt Cl/opt32A:

Tato konstrukce je založena na konstrukci IVD. Nese celý optimalizovaný kodonový segment C5 a gp32 dalším optimalizovaným kodonovým segmentem (uvedeno dále v textu), který nahrazuje Cl amino konce gpl20, po němž následuje tPA vedoucí sekvence. Nový segment Cl se připojil ke zbývajícímu segmentu gpl43 prostřednictvím SOE PCR za použití následujících oligomérů vhodných pro PCR, jejímž prostřednictvím se syntetizoval spojený segment Cl/143: 5'CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. Výsledný gen gpl43 obsahuje optimální použití kodonu mimo oblastí VI až V5 a má jediné restrikční místo Pmel umístěné ve spojení Cl a VI vhodné pro inzerci variabilních oblastí z jiných genů HIV.

I. VIJns-tPA-gpl43/optCl/opt32B:

Tato konstrukce je podobná konstrukci popsané v odstavci IVH s tou výjimkou, že se zachovala místa proteolytického štěpení env.

J. VIJns-tPA-gpl43/opt celé-A:

Gen env této konstrukce je zcela tvořen optimálními kodony. Konstantní oblasti (Cl, C5, gp32) jsou ty popsané v odstavcích 4B, D, H s dalším začleněným syntetickým segmentem DNA, který odpovídá variabilním oblastem VI až V5. Uvedený segment se začlenil pomocí syntetického segmentu DNA, který obsahuje optimální kodony pro translaci.

K. VlJns-tPA-gpl43/opt celé-B:

• · · ··· · • · • · 4

Tato konstrukce je podobná konstrukci popsané v odstavci IVJ s tou výjimkou, že se zachovala místa proteolytického štěpení env.

L. VIJns-tPA-gpl43/opt celé-A (není odvozeno z kmenů IIIB):

Tato konstrukce je podobná konstrukci ze shora uvedeného odstavce IIIG s tou výjimkou, že se za účelem stanovení optimálního použití kodonu variabilních sekvencí (VI až V5) použily aminokyselinové sekvence z kmene jiného než je kmen IIIB.

M. VlJns-tPA-gpl43/opt celé-B (není odvozeno z kmenů IIIB):

Příklad 10: Vakcinační konstrukce gpl43/glyB:

Tyto konstrukce se připravily pomocí PCR podobně jako jiné konstrukce, které obsahují tPA, jak se popiosuje shora v textu (tpA-gpl20, tPA-gpl40, tPA-gp!43 a tPA-gpl60), s tPA vedoucí sekvencí v místě nativní vedoucí sekvence, ale jsou navržšny tak, že vzniká na membránu vázaný env jako s gpl43, který má konec COOH. Konstrukce gpl43/glyB se však liší od gpl43 v tom, že ze šesti aminokyselin, které se navrhly tak, že obsahují intracelulámí peptidovou doménu, poslední čtyři jsou stejné jako ty na C-konci lidského glykoforinu B (glyB) (navržená intracelulámí aminokyselinová sekvence je NH2NRLIKA-COOH, kde potržené zbytky odpovídají glyB a R se běžně nachází jak u env tak I glyB) . Tato konstrukce se vytvořila za účelem získání další exprese env a řízeného cílení na buněčný povrch tím, že se kompletně eliminuje ·· libovolný transkritp nebo peptidová oblast, která odpovídá intracelulární části env, která může negativně ovlivnit expresi proteinu nebo jeho stabilitu/transport na buněnčý povrch. Tato oblast se nahradí peptidovou sekvencí z nadměrně exprimovaného proteinu (glyB), která nese krátkou cytoplazmatickou doménu (intracelulární aminokyselinová sekvence je NH2-RRLIKA-C00H). Konstrukce se připravily ve dvouch formách v závislosti na tom, zda se odstranila místa proteolytického štěpení nebo zůstala zachována, jak se popisuje shora v textu.

A. VIJns-tPA-gpl43/opt32-A/glyB:

Tato konstrukce je stejná jako konstrukce uvedená v odstavci IVD s tou výjimkou, že se pro nahrazení intracelulární peptidové domény gpl43 doménou glykoforinu B, jak se popisuje shora v textu, použil následující antisense PCR oligomér: 5'- CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CAC AAT GGA CAG CAC AGC-3' .

Β. VIJns-tPA-gpl43/opt32-B/glyB:

Tato konstrukce je podobná konstrukci popsané v odstavci VA s tou výjimkou, že se zachovala místa proteolytického štěpení env.

C. VlJns-tPA-gpl43/opt32-A/glyB:

Tato konstrukce je podobná konstrukci popsané v odstavci VC s tou výjimkou, že se zachovala místa proteolytického štěpení env.

D. VIJns-tPA-gpl43/opt Cl/opt32-B/glyB:

Tato konstrukce je podobná konstrukci popsané v odstavci

VC s tou výjimkou, že se zachovala místa proteolytického štěpení env.

. ... · · . · ··

......·····» ·*· ·· ··· ··· ·· φ·· ΦΦΦΦ φφ ··

Ε. VlJns-tPA-gpl43/opt celé-A/glyB:

Gen env této konstrukce je tvořen zcela optimálními genomy, jak se popisuje shora v textu.

F. VIJns-tPA-gpl43/opt celé-B/glyB:

Tato konstrukce je podobná konstrukci popsané v odstavci VE s tou výjimkou, že se zachovala místa proteolytického štěpení env.

G. VlJns-tPA-gpl43/opt celé-A/glyB (není odvozeno z kmenů IIIB):

Η. VIJns-tPA-gpl43/opt celé-B/glyB (není odvozeno z kmenů IIIB):

Vakcinační konstrukce HIV env s delecemi variabilních smyček.

Tyto konstrukce mohou zahrnovat všechny shora uvedené formy env (gp!20, gpl40, gpl43, gplSO, gp!43/glyB), ale všechny variabilní smyčky v oblasti gpl20 se odstranily během přípravy (např. VI, V2 a/nebo V3). Účel těchto modifikací je eliminace peptidových segmentů, které mohou bránit vystavení konzervativních neutralizačních epitopů, jako je vazebné místo CD4. Následující oligomér se například použil při PCR reakci za účelem vytvoření VI/V2 delece vedoucí ke spojení Cl ·· • · «· *· • · · · • · *· • ···« · • · · • · · · a C2 segmentů: 5'-CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGT AAC ACC TCA GTC ATT ACA CAG-3' .

Přiklad 11: Navržení syntetických genových segmentů za účelem zesílení exprese genu env.

Genové segmenty se převedly na sekvence, které mají identické translační sekvence (mimo ty, je.li uvedeno jinak), ale s alternativním kodonovým použitím, jak definuje R. Lathe v článku J. Molec. Biol. Vol. 183, pp. 1-12 (1985), který se nazývá Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Consideration. Metodologie popsaná dále v textu pro účely zesílení exprese segmentů genu env HIV závislé na rev je založena na hypotéze, že známá neschopnost účinně exprimovat tento gen v savčích buňkách je následek celkového složení transkriptu. Za použití alternativních kodonů, které kódují stejnou proteinovou sekvenci, se pak může odstranit zábrana exprese env za nepřítomnosti rev. Inspekce kodonového užití v genu env ukázala, že vysoké procento kodonů je mezi těmi, které se nepoužívají velmi často ve velmi silně exprimovaných lidských genech. Způsob specifického nahrazení kodonu se může popsat následovně za použití dat z publikace autora Lathe et al.:

1. Identifikace umístění kodonů z hlediska správného otevřeného čtecího rámce.

2. Srovnání pozorované frekvence použití u lidských genů v případě kodonu divokého typu (tabulka č. 3 v publikaci Lathe et al.,).

3. Jestliže kodon není používán nejběžněji, nahradí se kodonem, který je optimální pro silnou expresi na základě dat uvedených v tabulce č. 5.

4. Kontrola třetího nukleotidu nového kodonu a prvního nukleotidu kodonu, který bezprostředně sousedí s 3'φφ ♦

φ«φ • φ· ·· · · • · • * t• » ««· *»ΙΓ· • φ ·

Φ 94

4 · ·

Φ 4 9 ht 4 4 koncem prvního. Jestliže se vyvtořilo na základě selekce nového kodonu párování 5'-CG-3', je nutné to nahradit volbou uvedenou v tabulce č. 5.

5. Opakování tohoto postupu až se nahradí celý genový segment.

6. Kontrola nežádoucích sekvencí, které vznikly těmito manipulacemi kodonu v nové genové sekvenci (např. sekvence ATTTA, nežádoucí vznik rozeznávacích míst sestřihu intronu, nežádoucí místa ’ rozeznávaná restrikčními enzymy, atd.) a substituční kodony, které eliminují tyto sekvence.

7. Sestavení segmentů syntetických genů a testování jejich vylepšené exprese.

Tyto metody se použily pro přípravu následujících syntetických genových segmentů HIV env za vzniku genu, který je zcela tvořen kodony optimálními vzhledem k expresi: (i) gpl20-Cl (opt); (ii) VI až V5 (opt); (iii) RRE-A/B (mut nebo opt); a (iv) gp30 (opt) s procenty záměn kodonů/substitucí kodonů 56/19, 73/26, 78/28 a 61/25 získaných z každého segmentu. Každý z těchto segmentů se popisuje detailnějive skutečných sekvencích uvedených dále v textu.

• .* φ φ • •Φ φ φ φφ φ φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φφφ φ·· φφφφ ·· · ·

Gpl20-Cl (opt)

Toto je genový segment konstantní oblasti 1 (Cl) gpl20 od zralého N-konce na začátek VI. Je navržen tak, aby měl optimální použití kodonů pro expresi.

TGATCACAGA GAAGCTGTGG GTGACAGTGT ATTATGGCGT GCCAGTCTGG

AAGGAGGCCA CGACCACCCT GTTCTGTGCC TCTGATGCCA AGGCCTATGA

101 CACAGAGGTG CACAATGTGT GGGCCACCCA TGCCTGTGTG CCCACAGACC

151 CCAACCCCCA GGAGGTGGTG CTGGTGAATG TGACTGAGAA CTTCAACATG

201 TGGAAGAACA ACATGGTGGA GCAGATGCAT GAGGACATCA TCAGCCTGTG

251 GGACCAGAGC CTGAAGCCCT GTGTGAAGCT GACCCCCCTG TGTGTGAGTT

301 TAAAC « · φ φ • φ Φ·· φ sekvenci použití

MN VI až V5 (Qtp)

Jde ο genový segment odpovídající proteinové odvozené z HIV M V1-V5 (1066BP), který mi optimální kodonu pro expresi.

AGTTTAAACT GCACAGACCT GAGGAACACC ACCAACACCA ACAACTCCAC

AGCCAACAAC AACTCCAACT CCGAGGGCAC CATCAAGGGG GGGGAGATGA

101 · AGAACTGCTC CTTCAACATC ACCACCTCCA TCAGGGACAA GATGCAGAAG

151 GAGTATGCCC TGCTGTACAA GCTGGACATT GTGTCCATTG ACAATGACTC

201 CACCTCCTAC AGGCTGATCT CCTGCAACAC CTCTGTCATC ACCCAGGCCT

251 GCCCCAAAAT CTCCTTTGAG CCCATCCCCA TCCACTACTG TGCCCCTGCT

301 GGCTTTGCCA TCCTGAAGTG CAATGACAAG AAGTTCTCTG GCAAGGGCTC

351 CTGCAAGAAT GTGTCCACAG TGCAGTGCAC ACATGGCATC AGGCCTGTGG

401 TGTCCACCCA GCTGCTGCTG AATGGCTCCC TGGCTGAGGA GGAGGTGGTC

451 ATCAGGTCTG AGAACTTCAC AGACAATGCC AAGACCATCA TCGTGCACCT

501 GAATGAGTCT GTGCAGATCA ACTGCACCAG GCCCAACTAC AACAAGAGGA

551 AGAGGATCCA CATTGGCCCT GGCAGGGCCT TCTACACCAC CAAGAACATC

SOI ATTGGCACCA TCAGGCAGGC CCACTGCAAC ATCTCCAGGG CCAAGTGGAA

651 TGACACCCTG AGGCAGATTG TGTCCAAGCT GAAGGAGCAG TTCAAGAACA • · ···

701 AGACCATTGT GTTCAACCAG TCCTCTGGGG GGGACCCTGA GATTGTGATG

751 CACTCCTTCA ACTGTGGGGG GGAGTTCTTC TACTGCAACA CCTCCCCCCT

301 GTTCAACTCC ACCTGGAATG GCAACAACAC CTGGAACAAC ACCACAGGCT

351 CCAACAACAA CATCACCCTC CAGTGCAAGA TCAAGCAGAT CATCAACATG

901 ' TGGCAGGAGG TGGGCAAGGC CATGTATGCC CCCCCCATTG AGGGCCAGAT

951 CAGGTGCTCC TCCAACATCA CAGGCCTGCT GCTGACCAGG GATGGGGGGA

1001 AGGACACAGA CACCAACGAC ACCGAAATCT TCAGGCCTGG GGGGGGGGAC

1051 ATGAGGGACA ATTGG • · e · · « • · · · · • · ·· · · 1 • · · « • ··*· ·· ··

RRE Mut (A)

Jde o segment DNA odpovídající rev rasponzivnímu elementu (RRE) HIV-1, který je tvořen kodony optimálními pro expresi. U formy A se odstarnily známá místa proteolytického štěpení na spojení gpl20/gp41 za použití nukleotidů silně psaných nukleotidů.

1	GACAATTGGA	GGAGCGAGTT	ATATAAATAT	AAGGTGGTGA	AGATTGAGCC
51	CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTCAGAACCACGTGGTG	CAGAACGAGC
101	ACCAGGCCGT	GGGCATTGGG	'gccctgtttc	TGGGCTTTCT	GGGGGCTGCT
151	GGCTCCACAA	TGGGCGCCGC	TAGCATGACC	CTCACCGTGC	AAGCTCGCCA
201	GCTGCTGAGT	GGCATCGTCC	AGCAGCAGAA	CAACCTGCTC	CGCGCCATCG
251	AAGCCCAGCA	GCACCTCCTC	CAGCTGACTG	TGTGGGGGAT	CAAACAGCTT
201	CAGGCCCGGG	TGCTGGCCGT	CGAGCGCTAT	CTGAAAGACC	AGCAACTCCT

251 AGGC

• · · · · · · • * · · · · · « 0 0 · · · · • 0 0 · · · · · • 0 0 · 0

0000000 ·· ··

RRE Mut (B)

Jde o segment DNA odpovídající rev responzivnímu elementu (RRE) HIV-1, který je tvořen kodony optimálními pro expresi. U formy B se zachovala známá místa proteolytického štěpení na spojení gpl20/gp41

GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC

CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTAAGAGAAGAGTGGTG CAGAGAGAG&

101 AGAGAGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT

151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA

201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG

251 AAGCCCAGCA GGACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT

301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT

351 AGGC • · • · · gp32 (opt)

Jde o segment genu gp32 od restrikčního místa ArvII (začíná bezprostředně na konci RRE) do konce gpl43, který obsahuje optimální kdodony pro expresi.

CCTAGGCA TCTGGGGGTG CTCTGGCAAG CTGATCTGCA CCACAGCTGT

GCCCTGGAAT GCCTCCTGGT CCAACAAGAG CCTGGAGCAA ATCTGGAACA

101 ACATGACCTG GATGGAGTGG GACAGAGAGA TCAACAACTA CACCTCCCTG

151 ATCCACTCCC TGATTGAGGA GTCGCAGAAC CAGCAGGAGA AGAATGAGCA

201 GGAGCTGGTG GAGCTGGACA AGTGGGCCTC CCTGTGGAAC TGGTTCAACA

251 TCACCAACTG GCTGTGGTAC ATCAAAATCT TCATCATGA? TGTGGGGGGC

301 CTGGTGGGGC TGCGGATTGT CTTTGCTGTG CTGTCCATTG TGAACCGGGT

351 GAGACAGGGC TACTCCCCCT AATAAGCCCG GGCGATATC • ·· · ·· ···· ♦ · · · · · · · ·· · • · ·· · · · · ·· • · · · · * · · · · · « • · · · · ··· ··· ·· ··· ···· ·· ··

SRV-1 CTE (A)

Jde o syntetický genový segment, který odpovídá 3'-UTR z genomu opičího retroviru-1. Tato DNA se umístila v následujícíc orientaci na 3'-konec genů HIV za účelem zesílení exprese závislé na rev.

Srfl EcoRV

5‘-GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACA

GCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGG

GCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATG

TATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGT

TTTATATATA TTTAAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATG

ATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC - 3¹

EcoRV

Srfl • · · * • · • ·

SRV-1 CTE (B)

Tento syntetický genový segment je identický se shora popsaným SRV-1 CTE (A) s tou výjimkou, že se použila mutace jednotlivých nukleotidů (označeno silným písmem), aby se eliminovala sekvenec ATTTA. Tato sekvence se spojuje se zvýšením přeměny mRNA.

Srfl EcoRV

5' -GCCC_GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACA

GCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGG

GCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATG

TATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGT

TTTATATATA TT&AAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATG

ATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC - 2 ¹

EcoRV

Srfl • *· · ·· ·· ·· • · » ···· * · 9 · • ·«· 9 9 9 9 9 9

9999 9 9999999

9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 9999 99 99

Příklad 11:

In vitro exprese vakcíny gpl20:

U transfekovaných lidských buněk rabdomyosarkomu (RD) se tesovala in vitro expree těchto konstrukcí. Kvantifikace tPAgpl20 vylučovaných z transfekovaných RD buněk ukazuje, ež vektor VIJns-tPA-gpl20 produkuje sekreteované gpl20.

In vivo vakcinace gpl20:

Uvedeno na obrázku č. 120 (data získaná na myších): Specifická reaktivita T lymfocytú k antigenu gpl20 omezená MHC třídy II, která se indukovaly VlJns-tPAgpl20MNPNV. Myši Balb/c se dvakrát vakcinovaly 200 μg VlJnstPA-gpl20MN, pak se usmrtily a extrahovala se jejich slezinaza účelem in vitro stanovení reaktivity T lymfocytú k rekombinantímu gp!20. Test proliferace T buněk se uskutečnil s PBMC 4 x 10⁵ buněk/ml (periferní krevní mononukleové buňky) za použití rekombinantího gpl20_IIIB (Repligen, katalog #RP1016-20) v koncentraci 5 μg/ml. Základní množství pohlceného ³H těmito buňkami sé získalo kultivací buněk v samotném médiu, zatímco maximum proliferace se dosáhlo stimulací ConA v koncentraci 2 μg/ml. ConA indukoval pík reaktivity přibližně ve třech dnech. Kontrolní vzorek se odebral v uvedeném časovém rozmezí, zatímco vzorky s aplikovaným antigenem se izolovaly 5-tý den s další kontrolou média. Odezva vakcinovaných myší se srovnala s odezvou nepoužitých syngenních myší srovnatelného stáří. Jak se očekávalo, ConA pozitivní kontroly vykazují velmi vysokou úroveň proliferace jak u nepoužitých tak i u imunizovaných myší. Velmi silná odezva T pomocných buněk se získala aplikací gpl20 na vakcinované myši, zatímco nevakcinované myši nevykazují žádnou odezvu (práh specifické reaktivity je stimulační index (SI) >3 až 4; SI se vypočítá jako poměr cpm ·· ·· • · · · • · ·· • «· · · · • · · • · · · • · · · · ·· • ·♦ vzorku/cpm média) . V případě vakcinovaných myší se získal SI v rozmezí 65 až 14, tyto hodnoty se srovnaly s hodnotami titru antí-gpl20 testu ELISA 5643 a 11 900. Je zajímavé, že v případě těchto dvouch myší jedinec, který vykazuje vyšší protilátkovou odpověď, má nižší reaktivitu T buněk, než je tomu u myší s nižším titrem protilátek. Tento experiment demonstruje, že sekretovaný vektor gpl20 účinně aktivuje pomocné buňky in vivo, stejně jako generuje silnou protilátkovou odezvu. Navíc každá tato imunitní odezvase stanovila za použití antigenu, který je heterogenní ve srovnání s antigenem, který je kódován inokulaci PNV (IIIB verzus MN).

Příklad 12: Vakcíny gpl60.

Mimo sekretované konstrukce gpl20 se připravily expresívní konstrukce pro na membránu vázaný gpl60, který je v plné délce. Odůvodnění konstrukce gpl60 vedle konstrukce pro gpl20 jsou (1) pro stimulaci CTL a pro produkci neutralizujících protilátek, které zahrnují silné HIV neutralizující monoklonální protilátky (2F5, uvedeno shora v textu) určené proti gp41, je dostupno více epitopů; (2) vzhledem k gpl60 produkovaným virem je možné získat více struktur nativního proteinu; a (3) úspěšné použití konstrukcí influenza HA vázaných na membránu pro imunogenicitu (Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993; Montgomery, D et al., DNA and Cell Biol., 12:777-783, 1993). Gpl60 zůstává podstatně závislé na REV dokonce i s heterogenní vedoucí peptidovou sekvencítak, že se vytvořily další konstrukce, aby se zesílila exprese za nepřítomnosti REV.

Příklad 13: Test pro Hiv cytotoxické T-lymfocytyt:

Způsoby popsané v této sekci ukazují test, který se použil u vakcinovaných myší. V podstatě stejný test se může ·· ·· » · * · » · ·· ·· · · · • · 9 ·· ·· • ·· • 4 • 4 použít u primátů s tou výjimkou, že se musí pro každé zvíře ustanovit použití autologních linií B buněk, které jsou cílovými buňkami. To se může provést v případě lidí za použití viru Epstein-Bárové a v případě opice rhesus za použití viru herpes B.

Periferní krevní mononukleární buňky (PBMC) se získaly buď z čerstvě odebrané krve nebo ze sleziny za použití Ficoll-Hypaqueovi centrifugace, za účelem separace erytrocytů od bílých krevních buněk. V případě myší se mohou také použít lymfatické žlázy. Efektor CTL se může připravit z PBMC buď in vitro kultivací v IL-2 (20 U/ml) a v konkanavalinu A (2 μg/ml) po dobu 6 až 120 dnů nebo použitím specifického antigenu za použití stejného počtu buněk, které obsahují ozářený antigen. Specifický antigen může zahrnovat buď syntetické peptidy (obvykle 9 až 15 aminokyselin) , které jsou známými epitopy pro rozeznávání CTL pro MHC haplotyp použitých zvířat nebo konstrukce viru vakcínie , které vznikají za účelem exprimovat vhodný antigen. Cílovými buňkami mohou být buď syngenní buněčné linie nebo buněčné linie srovnatelného MHC haplotypu, na které se aplikoval vhodný antigen, jak se popisuje v případě in vitro stimulace CTL. V případě myší Balb/c se pro restimulaci CTL in vitro může použít peptid P18 (ArglleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn, SEQ ID NO: 51; v koncentraci 10 μΜ za použití ozářených syngenních splenocytů a může se použít pro zvýšení citlivosti během testu cytotoxicity. Peptid se aplikuje v koncentraci 1 až 10 μΜ a buňky se inkubují při teplotě 37°C po dobu přibližně dvě hodiny. V případě myší, které jsou H-2^dMHC haplotyp, se použijí jako cílové buňky buněčná linie myšího mastocytomu P815. Cílové buňky citlivé na antigen se naplní Na⁵¹CrO₄. Tato látka se uvolní z cílových buněk po jejich usmrcení pomocí φ φφ φ φφ φφ ΦΦ • Φ φ · · · φ · φ · · • φφφ · φ Φ · φφ ·· · · Φ Φ φ φφφ · Φ • · · ·· · φ φ φφφ φφ φφφ φφφφ φφ ·φ

CTL, tak, že se cílové buňky inkubují po dobu 1 až 2 hodin při teplotě 37°C (0,2 mCi se aplikuje na přibližně 5 x 10⁶buněk), pak jsou cílové buňky několikrát promyty. Populace CTL se smíchá s cílovými buňkami v různých poměrech efektoru a cílových buněk, jako například 100:1, 50:1, 25:1 atd.. Vytvoří se pelet centrifugací a před tím než se izolují supernatanty, tak se vše inkubuje po dobu 4 až 6 hodin při teplotě 37 °C. Za použití gamma počítače se u supernatantů testuje uvolněná radioaktivita. Cytotoxicita se určí jako procento celkového uvolněného množství s cílových buněk (získáno aplikací 0,2 % Triton X-100).

Příklad 14: Testování specifických protilátek proti HIV.

Test ELISA se navrhl pro detekci protilátek vytvořených proti HIV, kdy se pouižívají jako substrátové antigeny buď specifického rekombinantního proteinu nebo syntetické peptidy. Mikrotitrační destičky s 96 buňkami se potáhly při teplotě 4 °C přes noc rekombinantím antigenem v roztoku PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem) v koncentraci 2 pg/ml. Do každé buňky mikrotitračních destiček se naneslo 50 μΐ a vše se míchalo na houpající se podložce. Antigeny obsahovaly buď rekombinantní protein (gpl20, rev; Repligen Corp.; gpl60, gp41: American Bio-Technologies, Inc.) nebo syntetický peptid (V3 peptid odpovídající sekvencím sekvencím virového izolátu z kmene IIIB, atd.: American BioTechnologies, Inc.; epitop gp41 vhodný pro monoklonální protilátky 2F5). Destičky se čtyřikrát promyly za použití promývacího prufru (PBS/0,05% Tween 20), pak se do každé buňky mikrotitračních destioček přidá 200 μΐ blokovacího pufru (1 % roztoku karafiátového mléka v PBS/0,05 % Tween20), vše se inkubovalo po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti za stálého míchání. Pre-séra a imunitní séra se • · ·· ·· • · « · • · ·· • ···· « • · · ·♦ ·· naředila v blokovacím pufruna požadované rozmezí ředění a do každé buňky mikrotitračni destičky se přidalo 100 μΐ. Destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti za stálého míchání a pak se čtyřikrát promyly promývacím pufrem. Sekundární protilátky se spojily s peroxidázou křenu (anti.rhesus Ig, Southern Biotechnology Associates; anti-myší a anti-králičí Ig, Jackson Immuno Research), naředily se blokovacím pufrem v poměru 1:2 000 a pak se do každé buňky mikrotitračni destičky se vzorkem přidalo 100 μΐ a vše se inkubovalo po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti za stálého míchání. Destičky se čtyři krát promyly promývacím pufrem a pak se přidalo 100 μΐ roztoku ofenylendiaminu (o-PD, Calbiochem) v koncentraci 1 mg/ml ve 100 mM citrátového pufru při pH 4,5. Absorbance jednotlivých buněk mikrotitračních destiček se ode čítala při vlnové délce 450 nm a to jak v kynetickém režimu (prvních deset minut reakce) tak i po deseti a třiceti minutách (odečítač mikrodestiček Thermomax, Molecular Devices).

Příklad 15: Testování HIV neutralizujících protilátek.

In vitro neutralizace HIV izolátů se testovala za použití séra získaného z vakcinovaných zvířat podle následujícího popisu. Tetovací séra a pre-imunní séra se před použitím deaktivovala teplem při teplotě 56 °C po dobu 60 minut. K sériovému ředění 1:2 tesovacího séra se přidalo titrované množství HIV-1. Směs se inkubovala po dobu 60 minut při teplotě místnosti a pak se do každé z 96 buněk mikrotitračních destiček přidalo 10⁵ MT-4 lidských lymfoidních buněk. Směs virus/buňka se inkubovala po dobu 7 dnů při teplotě 37 °c a zjišťovalo se usmrcení buněk zprostředkované virem tak, že se kultura obarvila «· ·· *· • · · · · · • · ♦ ·· • · ··· · · • · · · ···»· · · · · • ··

ΊΟ tetrazoliovým barvivém. Neutralizace viru se pozorovala tak, že se předcházelo usmrcení buněk zprostředkované virem.

Příklad 16: Izolace genů z klinických HIV izolátů.

Geny viru HIV se klonovaly z infikovaných PBMC, které se aktivovaly aplikací ConA. Preferovaným způsobem získání virových genů je PCR amplifikace z genomu infikovaných buněk za použití specifických oligomérů, které lemují požadované geny. Druhou metodou získání virových genů je izolace virové RNA ze supeřnatantu infikovaných buněk a příprava cDNA z tohoto materiálu s následnou PCR. Tato metoda je analogem shora popsaného způsobu klonování myšího genu B7 s výjimkou PCR oligomérů a náhodných hexamérů používaných za účelem přípravy cDNA spíše než specifických oligomérů.

Genomová DNA se izoluje z peletu infikovaných buněk lyží v roztoku STE (10 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH8,0). Přidala se proteináza K a SDS ke koněčné koncentraci 0,1 mg/ml a 0,5 %. Tato směs se inkubovala přes noc při teplotě 56 °C a extrahovala se 0,5 objemy směsi fenol:chloroform:izoamylalkohol (25:24:1). Vodní fáze se pak precipitovala přidáním acetátu sodného, jehož konečná koncentrace je 0,3 M, a dvou objemů chladného etanolu. Po vytvoření peletu DNA z roztoku se DNA resuspendovala v roztoku 0,1 χ TE (lx TE= 10 mM Tris-HCl, pH8,0; 1 mM EDTA). V tomto okamžiku se přidalo SDS na konečnou koncentraci 0,1 % s 2U Rnázy A a směs se inkubovala po dobu 30 minut při teplotě 37 °c. Tento roztok se extrahoval směsí fenol/chloroform/izoamylalkohol a pak se precipitoval etanolem. DNA se suspendovala v 0,1 x TE a kvantifikovala se měřením absorbance v oblasti ultrafialového světla při vlnové délce 260 nm. Vzorky se uchovávaly při teplotě -20 °C až do doby použití v PCR reakci.

φ ·· » ·· ·· φφ • Φ · φφφ · φφφφ φ φφφ φ φ φ φ φφ φφφφ φ φφφφφφφ • ΦΦ φφ φφφ φφφ φφ φφφ φφφφ »φ φφ

PCR se uskutečnila za použití kitu Perkin-Elmer Cetus a postupu, kde se používají sense a antisense oligoméry pro gpl60: 5'-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAA TGA-3' a 5'-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG C ATG TGG-3'. Tyto oligoméry vnesly na 3'-konec výsledného fragmentu DNA restrikční místo SrfI. Segmenty získané PCR se klonovaly do vakcinačních vektorů buď VIJns nebo VIR. Oblasti V3 stejně jako ligační spojení se ověřilo sekvenováním DNA.

Příklad 17: Testy proliferace T buněk.

U získaných PBMC se testovala vyvolaná odezva na specifický antigen, jak se stanovilo proliferací populace PBMC. Proliferace se monitoruje za použití ³H-tymidinu, který se přidal do do buněčných kultur v posledních 18 až 24 hodinách inkubace před tím, než se buňky shromáždily. V případě, že došlo k poliferaci buněk, zařízení pro izolaci buněk zadrželo na filtrech DNA obsahující izotop. Buňky, které se nemnozí, izotop nepohlcují a ten se nezachycuje na filtru ve volné formě. V případě jiných druhů hlodavců a primátů se 4 χ 10⁵ buněk naneslo na do 96 buněk mikrotitračních destiček, celkem 200 μΐ kompletního média (RPMI/10% fetální telecí sérum) . Pozadí proliferační odezvy se stanovilo za použití PBMC a samotného média, zatímco nespecifické odezvy vznikly použitím lektinů, jako je fytohaemagglutin (PHA) nebo konkavalin A (ConA) v koncentracích 1 až 5 gg/ml, které slouží jako pozitivní kontrola. Specifický antigen zahrnuje buď známé peptidové epitopy, čištěný protein nebo deaktivovaný virus. Koncentrace antigenu je v rozmezí 1 až 10 μΜ v případě peptidu a 1 až 10 gg/ml v případě proteinu. Proliferační maximum indukované lektinem se dosáhlo třetí až pátý den inkubace kultury, zatímco pík antigen-specifické odezvy je 5 až 7 den inkubace.

« *9 · ·· ·· 99

9« 9 99 9 9 9 9 9 9 • ··· 9 · · · ·· • · · · 9 9 9 999· · • 99 99 · · 9 • «9 99 999 9··9 99 ·«

Specifická proliferace se objevila v případě, že množství radiace je nejméně třikrát vyšší než je hodnota pozadí média a často se vyjadřuje jako poměr k hodnotě pozadí nebo jako stimulační index (SI). Je známo, že gpl60 HIV obsahuje několik peptidů, o kterých se ví, že způsobují proliferaci T buněk imunizovaných jedinců gp!60/gpl20 nebo jedinců infikovaných HIV. Nejběžněji se používají peptidy: TI (LysGlnllelleAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla) ; T2 (HisGluAspIlelleSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys); a TH4 (AspArgValIlěGluValValGlnGlyAalTyrArgAlalleArg) . Ukázalo se, že tyto peptidy stimulují proliferaci PBMC, které pocházejí antigen senzitivních myší, primátů a lidí.

Příklad 18: Příprava vektoru VIR.

Za účelem optimalizace základního vakcinačního vektoru se připravil derivát vektoru VIJns, který se označil jako VIR. Důvod konstrukce tohoto vektoru je získání vakcinačního vektoru s minimální velikostí, to znamená bez sekvencí DNA, které nejsou nezbytné, a který si stále zachovává optimalizované charakteristiky exprese heterogenních genů a možnost vysokého výtěžku plazmidu, což umožňují vektory VIJ a VIJns. Za použití literatury a experimentů se stanovilo, že (1) oblasti v kostře vektoru pUC obsahující počátek replikace bakterie E. coli se mohou odstranit, aniž se ovlivní výtěžek plazmidu z bakterie; (2) 3'-oblast genu karf, která následuje otevřený čtecí rámec kanamycinu, se může také odstranit, jestliže místo ní začlení bakteriální terminátor; a (3) přibližně 300 bp z 3'-poloviny terminátoru BGH se může odstranit, aniž se ovlivní jeho regulační funkce (element BGH následuje po původním restrikčním místě Kpnl).

Vektor VIR se zkonstruoval za použití PCR za účelem syntézy tří segmentů DNA, které pochází z vektoru VIJns. Jsou to promotor CMVintA/terminátor BGH, počátek replikace a • ·

• · · · • · ·· ··· · · • · · elemnty rezistence na kanamycin. Do každého konce segmentu se vnesla za použití PCR oligomérů jediná restrikční místa: SspI a Xhol v případě CMVintA/BGH; EcorV a BamHI v případě genu karfi a Bell a Sáli v případě ori^r. Tato restrikční místa se vybrala z důvodu, že dovolují přímou ligaci každého z DNA segmentů, které vznikly PCR, přičemž dochází k následné ztrátě každého místa: EcoR V a SspI zanechávají DNA s tupými konci, které jsou kompatibilní při ligaci, zatímco BamHI a Bell zanechávají komplementární přesahy, stejně jako restrikční enzymy Sáli a Xhol. Po té, co se získaly tyto segmenty pomocí PCR, každý segment se štěpil vhodnými shora uvedenými restrikčními enzymy a pak se ligovaly dohromady v jedné ligační směsi, která obsahuje tři segmenty DNA. 5'konec ori^r se navrhla tak, aby obs ahovalne závislou terminátorovou sekvenci T2rho, která se normálně nachází v této oblasti tak, že může poskytnout terminační informaci pro gen rezistence na kanamycin. Ligovaný produkt se potvrdil štěpením restrikčními enzymy (> 8 enzymů) stejně pak sekvenováním DNA ligačního spojení. Výtěžky plazmidové DNA a heterogenní exprese za použití virových genů ve vektoru VIR je stejná jako u vektoru VIJns. Redukce velikosti vektoru je 1346 bp (VIJns = 4,86 kb; VIR = 3,52 kb), uvedeno na obrázku č. 11, SEQ ID No:45:

Sekvence pCR oligomérů, které se používají při syntéze VIR (místa, která rozeznávají restrikční enzymy jsou podtržená a jsou uvedená v závorkách):

(1) 5'-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3' (SspI), SEQ. ID:, (2) 5'-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3' (Xhol), SEQ. ID:

(v případě segmentu CMVintA/BGH) • ·

						•	• · •	•	• · • ·	• · • ·	• · • ·
							• · · • ·	•	•	• ···	• · • ·
						•	• * • · ·	•	• · · · ·	• ·	• ·
					74
(3)	5'-GGT	ACA	GAT ATC	GGA	AAG CCA	CGT	TGT	GTC	TCA	AAA	TC-3'
	(EcoRV) ,	SEQ	ID :
(4)	5'-CCA	CAT	GGA TCC	G	TAA TGC	TCT	GCC	AGT	GTT	ACA	ACC-

3'(BamHI), SEQ. ID:

(v případě segmentu genu rezistence na kanamycin) (5) 5'-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG3'(Bell), SEQ ID:

(6) 5'-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3' (Sáli), SEQ ID:

V případě počátku replikace u bakterie E. coli).

Ligační spojení se sekvenovalo v případě vektoru VIR za použití následujících oligomérů:

5'-GAG CCA ΑΤΑ TAA ATG TAC-3', SEQ ID :

(spojení CMVintA/kan^r)

5'-CAA TAG CAG GCA TGC-3', SEQ ID: (spojení BGH/ori)

5'-G CAA GCA GCA GAT TAC-3'; SEQ ID: (spojení ori/kan^r)

Příklad 19: Heterogenní exprese produktů pozdních genů HIV.

Strukturální geny HIV, jako je env a gag, vyžadují expresi HIV regulačního genu rev za účelem účinné produkce proteinů v plné délce. Zjistilo se, že exprese genu gag závislá na rev dává nízký výtěžek proteinu a že samotný rev může být pro buňky toxický. Ačkoli jsme dosáhly relativně silní in vitro exprese gpl60 závislé na rev, tato vakcína po imunizaci in vivo DNA rev/gpl60 vyvolává malé množství protilátek proti gpl60. Důvodem mohou být známé cytotoxické účinky rev, stejně jako obtížné získání fungujícího rev v myotubulech, která obsahují stovky jader (aby došlo k expresi proteinů gag nebo env, rev musí být ve stejném jádře jako transkript závislý na rev) . Při použití selektované ·· ·· • · modifikace genu env je však možné dosáhnout exprese nezávislé na rev.

1. exprese env, která je nezávislá na rev.

Uvedené vakcíny primárně využívaly HIV (IIIB) geny env a gag za účelem optimalizace exprese v obecném vakcinačním vektoru VIJns, který je tvořen časným promotorem (IE) z CMV, polyadenylační a transkripční terminační sekvencí získanou z BGH a kostrou plazmidu pUC. Kolísavá účinnost exprese env nezávislé na rev dosažená záměnou nativního sekrečního vedoucího peptidu peptidem, který pochází z genu tkáňově specifického aktivátoru plazminogenu (tPA), a expresí výsledného chimérického genu ležícího za promotorem CMVIE s CMV intronem A, závisí na velikosti použitého genového segmentu (např. gpl20 verzus gpl60). tPa-gpl20 je příklad sekretovaného vektoru gpl20, který se konstruoval způsobem, aby dostatečně fungoval při vyvolání anti-gpl20 imunitní odezvy u vakcinovaných myší a opic.

Na základě informací, že proteiny zachycené v membráně indukují daleko podstatnější protilátkovou odezvu (a možná více specifickou pro neutralizaci HIV) ve srovnání se sekretovanými proteiny stejně jako další epitopy, jsme připravily vektor VlJns-tPA-gpl60 a VIJns-rev/gpl60. Vektor tPA-gpl60 produkoval detekovatelné množství gpl60 a gpl20, aniž se přidal rev, jak ukazuje analýza transfekovaných buněk imunoblotem, ačkoli síla exprese byla daleko nižší než ta, které se odsáhlo pro rev/gpl60, což znamená rev-závislý gpl60-expresivní plazmid. Důvodem jsou pravděpodobně inhibiční oblasti, které udělují gpl60 transkriptu závislost na rev. Tyto oblasti se objevují na více místech v gpl60a v na COOH.konci gp41. Vektor se připravil pro formu tPA-gpl60 (tPA-gpl43) zkrácenou na COOH-konci, která se navrhla za účelem zvýšení síly exprese env tím, že se eliminují uvedené inhibiční sekvence. Vektor gpl43 také eliminuje intracelulární oblasti gp41, které obsahují peptidové motivy (jako Leu-Leu), které jsou známé tím, že způsobují otočení membránových proteinů do lyzosomů spíše než na povrch buněk. Pak je možné očekávat, že gpl43 má silnější expresi proteinu env (snížením závislosti na rev) a vyšší účinnost transportu proteinu na buněčný povrch ve srovnání s gpl60 v plné délce, i kde jsou tyto proteiny schopny lépe vyvolat anti-gpl60 protilátky po vakcinaci DNA. tPa-gpl43 se dále modifikoval extenzivní tichou mutací sekvence rev resonzivního elementu (RRE) (350 bp) , přičemž se eliminují sekvence inhibující expresi. Tato konstrukce gpl43/mutRRE se připravila ve dvouch formách: buď se eliminovala místa proteolytického štěpení u gpl20/41 (forma A) nebo tato místa zůstala zachována (forma B) . Obě formy se připravily na základě informací z literatury, které zdělují, že vakcinace myší za použití neštěpeného gpl60 exprimovaného ve vakcinii vyvolává větší množství protilátek proti gpl60 ve srovnání se štěpenými formami.

Vyvinula se kvantitativní ELISA exprese gp!60/gpl20 v transfekovaných buňkách za účelem stanovení relativních schopností exprese těchto vektorů. In vitro transfekce buněk 293, po níž následuje kvantifikace výtěžku gpl20 spojeného z i buňkami verzus sekretovaného/uvolněného, dává tyto výsledky:

(1) vektor tPA-gpl60 exprimoval 5 až 10 x méně gpl20 než * rev/gpl60. Zachovaly se podobné poměry mezi intracelulárním proteinem a vylučovaným na povrch buněk; (2) vektor tPA-gpl43 dává 3 až 6 krát větší sekreci gpl20 ve srovnání s rev/gpl60, kdy je pouze malá část gpl43 spojena s buňkou, což potvrzuje, ež cytoplazmatický ocas gpl60 způsobuje intracelulární retenci, kterou lze obejít částečnou delecí této sekvence; a (3) tPA-gpl43/mutRRE A a B dává přibližně 10 krát větší • · • · · ·· ··

I · · 4 sekreci proteinu ve srovnání s rodičovským vektorem tPAgpl43, zatímco se potvrdila eliminace proteolytického zpracování u formy A.

Uvedená strategie zesílení rev-nezávislé exprese vede k postupnému zesílení exprese, stejně jako přesměrování v membráně vázaného gpl43 na povrch buněk. Je důležité poznamenat, že jde o generickou konstrukci, do které je možné začlenit inzert sekvencí gpl20, které se získaly z různých * primárních virových izolátů, ve vektorové kazetě, která obsahuje tyto modifikace, jenž jsou buď na NH2-konci (tPA vedoucí sekvence) nebo na COOH-konci (gp41), kde jednotlivé virové kmeny se liší pouze několik antigenními rozdíly.

2. Exprese gpl20 získaného z klinického izolátu.

Při aplikaci této expresívní strategie na virus, který je relevantní pro vakcinační účely, a zá účelem zobecnění uvedených přístupů, se připravil vektor tPA-gpl20 získaný z primárních HIV izolátů (podle severoamerické úmluvy obsahuje V3 peptidovou smyčku; makrofágový tropický fenotyp a fenotyp, který neindukuje syncytia). Tento vektor umožňuje silnou expresi/sekreci gpl20 v transfekováných buňkách 193 a vyvolává anti-gpl20 protilátky u myší, což dokazuje, že se klonovala jeho funkční forma. Geny gpl60 primárního izolátu se mohou také použít při expresi stejným způsobem, jako gpl60 * získané z labioratorních kmenů.

* B. Imunitní odezvy na polynukleotidové vakcíny HIV-1 env.

Účinek způsobu vakcinace na imunitní odezvu u myší: Zatímco je snaha vylepšit expresigpl60, využívá se konstrukce DNA tPA-gpl20 pro vyvolání imunitní odezvy a její zesílení. Intramuskulárni (i.m.) a intradermální (i.d.) způsoby vakcinace se prorovnaly v případě uvedeného vektoru u myší, kdy vektor se aplikoval v dávkách 100, 10 a 1 gg. Vakcinace • ·

libovolným způsobem vyvolává po 2 až 3 vakcinacích při všech třech dávkách u všech recipientů protilátkovou odezvu (GMTs=10^{2 3} až 10⁴) . Každý způsob vyvolává podobný titr antigpl20 protilátek se zřejmou na dávce závislou odezvou. Pozorovala se však větší variabilita odezvy při i.d. vakcinací, zvláště při nižších dávkách, které následují po počáteční inokulaci. Odezva pomocných T-buněk, jak se stanovilo antigen-specifickou in vitro proliferaci a sekrecí cytokinu byla vyšší po vakcinací i.m. než po i.ď. vakcinací. Lze říci, že·i.d. vakcinace nenabízí žádné výhody ve srovnání s vakcinací i. m..

2. Imunita pomocných T buněk u myší zprostředkovaná gp!20 DNA vakcinou.

Gpl20 DNA vakcína produkovala silnou odezvu pomocných T buněk ve všech testovaných částech lymfatického systému (slezina, krev, inguinální, mesenterické a iliální žlázy) s s cytokinovými sekrečními profily, které se podobají T_H1 (to znamená produkce g-interferonu a IL-2 s malým množstvím nebo bez IL-4). Tyto cytokiny obecně podporují silnou buněčnou imunitu a u pacintů, které mají HIV pozitivní séra, se spojují s udržením stádia bez onemocnění. Lymfatické žlázy jsou primárními místy replikace HIV , nesou velkou zásobu viru, dokonce v případě, že virus nemůže být detekován v krvi. Vakcína, která může vyvolat anti-HIV imunitní odezvu v různých místech lymfatického systému

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Syntetický polynukleotid, který obsahuje sekvenci DNA kódující env protein HIV nebo jeho fragment, přičemž sekvence DNA zahrnuje kodony, které se optimalizovaly pro expresi v savčím hostiteli.
2. Polynukleotid podle nároku 1, který se vybral ze skupiny zahrnující:

VlJns-tPA-HIVm gpl20;

VI Jns-tPA-HIV_IIIBgpl20;

VIJns-tPA-gpl40/mutRRE-A/SRV-l 3'-UTR;

VIJns-tPA-gpl40/mutRRE-B/SRV-1 3'-UTR;

VlJns-tPA-gpl40/opt30-A;

VIJns-tPA-gpl40/opt30-B;

VIJns-tPA-gpl40/opt all-A;

VlJns-tPA-gpl40/opt all-B;

VIJns-tPA-gpl40/opt all-A;

VlJns-tPA-gpl40/opt all-B;

VIJns-rev/env:;

VlJns-gpl60;

VIJns-tPA-gpl60;

VIJns-tPA-gpl60/optCl/opt41-A;

VlJns-tPA-gpl60/optCl/opt41-B;

VIJns-tPA-gpl60/opt all-A;

VIJns-tPA-gpl60/opt all-B;

VIJns-tPA-gpl60/opt all-A;

VIJns-tPA-gpl60/opt all-B;

VIJns-tPA-gpl43;

VI Jns -1 PA-gpl 4 3/mutRRE-A;

VIJns-tPA-gpl43/mutRRE-B;

φ φ φ

φ φφ φ φ

ΦΦ Φ ΦΦΦΦ φφ φφ » Φ Φ <

I Φ ΦΦ

ΦΦΦΦ <

VlJns-tPA-gpl43/opt32-A;

VlJns-tPA-gpl43/opt32-B;

VlJns-tPA-gpl43/SRV-l 3'-UTR;

VlJns-tPA-gpl43/optCl/opt32A;

VlJns-tPA-gpl43/optCl/opt32B;

VlJns-tPA-gpl43/opt all-A;

VlJns-tPA-gpl43/opt all-B;

VlJns-tPA-gpl43/opt all-A; i VlJns-tPA-gpl43/opt all-B;

VlJns-tPA-gpl43/opt32-A/glyB;

VlJns-tPA-gpl43/opt32-B/glyB;

VlJns-tPA-gpl43/optCl/opt32-A/glyB;

VlJns-tPA-gpl43/optCl/opt32-B/glyB;

VlJns-tPA-gpl43/opt all-A/glyB;

VlJns-tPA-gpl43/opt all-B/glyB;

VlJns-tPA-gpl43/opt all-A/glyB;

VlJns-tPA-gpl43/opt all-B/glyB; a jejich kombinace.
3. Polynukleotid podle nároku 1, který indukuje anti-HIV neutralizující protilátky, HIV specifickou imunitní odezvu Tbuněk nebo ochrannou imunitní odezvu po jeho zavedení do tkání obratlovců, které zahrnují lidskou tkáň in vivo, přičemž polynukleotid obsahuje gen kódující HIV gag, gagproteázu nebo produkt genu env.

·,
4. Způsob indukce imunitní odezvy obratlovců proti ' epitopům HIV, vyznačující se tím, že se do tkáně obratlovce zavede 1 ng až 100 mg polynukleotidu podle nároku 1.
5. Způsob indukce imunitní odezvy proti infekci nebo onemocnění způsobené virulentními kmeny HIV, φ φ

ΦΦΦ φφ φφ • · · · φ ΦΦΦ φφφφ φ φ φ φ vyznačující se tím, že se do tkáně obratlovce zavede polynukleotid podle nároku 1.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e se dále aplikuje atenuovaný HIV, usmrcený HIV, HIV env protein, HIV gag protein, HIV pol protein a jejich kombinace.
7. Vakcína proti infekci HIV, vyznačuj ící se t i m, ' ž e obsahuje polynukleotid podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
8. Způsob indukce anti-HIV imunitní odezvy u primáta, vyznačující se tím, že se do tkáně primáta zavede polynukleotidu podle nároku 1 a současně se parenterálně aplikuje interleukin 12.
9. Způsob indukce buňky prezentující antigen ke stimulaci proliferace cytotoxických a pomocných T-buněk a funkcí efektoru, které zahrnují sekreci lymfokinu specifického pro HIV antigeny, vyznačující se tím, že se buňky obratlovce vystaví in vivo polynukleotidu podle nároku 1.
10. Způsob zesílení exprese DNA kódující protein HIV nebo jeho fragment, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) identifikaci umístění kodonů do vhodného otevřeného čtecího rámce;

(b) srovnání pozorované frekvence použití kodonů divokého typu v lidských genech;

(c) nahrazení kodonů divokého typu kodony optimalizovanými pro silnou expresi lidských genů;

(d) testování zdokonalené exprese.