ES2251734T3 - Genes sinteticos de hiv. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A MOLECULAS SINTETICAS DE ADN QUE CODIFICAN PARA GENES DE VIH Y PARA MODIFICACIONES DE DICHOS GENES. LOS CODONES DE LAS MOLECULAS SINTETICAS UTILIZAN CODONES PREFERIDOS POR LA CELULA HUESPED PROYECTADA. DICHAS MOLECULAS SINTETICAS SE PUEDEN UTILIZAR COMO UNA VACUNA POLINUCLEOTIDICA QUE PROPORCIONA INMUNOPROFILAXIS EFECTIVA FRENTE A LA INFECCION POR VIH, MEDIANTE LA NEUTRALIZACION DE LOS ANTICUERPOS Y DE LA INMUNIDAD MEDIADA POR CELULAS.
Description
Genes sintéticos de HIV.
Esta es una solicitud no provisional relacionada
con el Documento de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/
012.082, presentado el 22 de Febrero de 1996.
012.082, presentado el 22 de Febrero de 1996.
Vacunas HIV
El Virus-1 de la
Inmunodeficiencia humana (HIV-1) es el agente
etiológico del síndrome de inmuno deficiencia humana adquirida
(SIDA) y los transtornos relacionados. El HIV-1 es
un virus ARN de la familia Retroviridae y presenta la organización
5'LTR-gag-pol-env-LTR3' de todos los retrovirus. De
manera adicional, el HIV-1 comprende un puñado de
genes con funciones regulatorias o desconocidas, que incluyen los
genes tat y rev. El gen env codifica la envoltura de
glicoproteína vírica que se traduce en forma de un precursor de 160
kilodalton (kDa) (gp160) y que a continuación se rompe mediante una
proteasa celular para dar como resultado la envoltura de
glicoproteína (gp120) externa de 120 kDa y la envoltura de
glicoproteína (gp41) transmembrana de 41 kDa. Gp120 y gp41
permanecen asociadas, y se despliegan sobre las partículas víricas
y la superficie de las células infectadas por HIV. Gp120 enlaza con
el receptor CD4 presente sobre la superficie de los linfocitos T
auxiliares, los macrófagos y otras células diana. Después que la
gp120 se enlaza con el CD4, la gp41 media la fusión siendo incluso
responsable de la entrada del virus.
La infección comienza cuando la gp120 sobre las
partículas víricas se enlaza con el receptor CD4 en la superficie
de los linfocitos T4 u otras células diana. El virus enlazado se
fusiona con la célula diana y transcribe de manera inversa su
genoma de ARN en el ADN de doble hélice de la célula. El ADN vírico
se incorpora al material genético en el núcleo de la célula, donde
el ADN vírico dirige la producción del nuevo ARN vírico, las
proteínas víricas y las nuevas partículas de virus. Las nuevas
partículas brotan desde la membrana de la célula diana, e infectan
otras células.
La destrucción de los linfocitos T4, que son
críticos para la defensa inmune, es la causa principal de la
disfunción inmune progresiva que es la marca característica de la
infección por HIV. La pérdida de células diana perjudica de manera
grave la capacidad del cuerpo para combatir a la mayor parte de
invasores, pero tiene un impacto grave de manera particular en las
defensas frente a los virus, hongos, parásitos y algunas bacterias,
entre las que se incluyen mycobacteria.
El HIV-1 mata las células que
infecta mediante replicación, salida de las mismas y daño de la
membrana celular. El HIV-1 puede matar las células
diana mediante la gp120 vírica que se muestra sobre la superficie de
una célula infectada. Puesto que el receptor CD4 de las células T
tiene una fuerte afinidad por la gp120, las células sanas que
muestran el receptor CD4 se pueden enlazar con la gp120 y fusionarse
con células infectadas para formar un sincitio. Un sincitio no
puede sobrevivir.
El HIV-1 puede también excitar
las defensas normales de las células inmunes frente a las células
infectadas. Con o sin ayuda de los anticuerpos, las células
defensivas citotóxicas pueden destruir una célula infectada que
muestra proteínas víricas en su superficie. Finalmente, la gp120
libre puede circular por la sangre de los individuos infectados con
HIV-1. La proteína libre puede enlazarse con el
receptor CD4 de las células no infectadas haciéndolas aparecer como
infectadas y evocar la respuesta inmune.
La infección con HIV-1 es casi
siempre fatal, y en la actualidad no existe cura para la infección
por HIV-1. Todavía no están disponibles vacunas
efectivas contra la infección por HIV-1. Debido al
peligro de inversión o de infección, no se pueden usar
probablemente virus vivos atenuados como vacuna. La mayor parte de
soluciones con subunidades de vacuna no han resultado útiles en la
prevención de una infección por HIV. Los tratamientos de la
infección por HIV-1, aunque prolongan la vida de
algunas personas infectadas, muestran importantes efectos
secundarios. Existe por tanto una gran necesidad de tratamientos y
vacunas efectivos para combatir esta infección letal.
La vacunación es una forma efectiva de prevenir
enfermedades y se ha demostrado que tiene éxito contra algunos
tipos de infección vírica. Determinar la forma de presentar
antígenos HIV-1 al sistema inmunológico humano, con
el fin de excitar inmunidad humoral y celular protectora, es una
tarea difícil. Hasta la fecha, los intentos de generar una vacuna
efectiva contra HIV no han tenido éxito. En los pacientes de SIDA
los virus libre sólo están presentes en bajas cantidades. La
transmisión de HIV-1 se estimula por interacción
intercelular, por fusión y formación de sincitios. Por tanto, los
anticuerpos generados frente a virus libres o subunidades víricas
resultan por lo general ineficaces para eliminar las células
infectadas por virus.
Las vacunas explotan la capacidad del cuerpo de
"recordar" un antígeno. Después de los primeros encuentros con
un antígeno dado, el sistema inmune genera células que retienen un
recuerdo inmunológico del antígeno durante toda la vida del
individuo. La exposición posterior al antígeno estimula la respuesta
inmune, es decir, que da como resultado la eliminación o
inactivación del patógeno.
El sistema inmune se enfrenta a los patógenos en
dos formas: mediante respuestas humorales y mediadas por células.
En la respuesta humoral, los linfocitos generan anticuerpos
específicos que se enlazan con el antígeno inactivando de esta
manera el patógeno. La respuesta mediada por células implica
linfocitos T citotóxicos y auxiliares que atacan y destruyen de
forma específica las células infectadas.
El desarrollo de vacunas con virus
HIV-1 presenta problemas debido a que los
HIV-1 infectan algunas de las mismas células del
sistema inmunológico que la vacuna necesita activar (es decir, los
linfocitos T4). Sería ventajoso desarrollar una vacuna que
desarrolle una vacuna que inactive el HIV antes que se produzca el
desequilibrio del sistema inmunológico. Una tipo de vacuna de HIV
particularmente adecuada generaría una respuesta inmune
anti-HIV que reconocería las variantes del HIV y que
funcionaría en individuos HIV positivos al inicio de su
infección.
Un desafío principal para el desarrollo de
vacunas frente a virus, de forma particular aquellos que tienen una
tasa de mutaciones muy elevada, tal como el virus de la
inmunodeficiencia humana, contra la que sería deseable la
excitación de respuestas neutralizantes y protectoras, es la
diversidad de proteínas de envoltura vírica entre las diferentes
cepas o aislados víricos. Puesto que los linfocitos T citotóxicos
(CTL) tanto de ratones como de seres humanos son capaces de
reconocer epitopos derivados de proteínas víricas internas
preservadas, y se cree que son importantes en la respuesta inmune
frente al virus, se han dirigido los esfuerzos al desarrollo de
vacunas CTL capaces de proporcionar protección heteróloga frente a
diferentes cepas víricas.
Se sabe que los CTL CD8^{+} matan las células
infectadas con virus cuando sus receptores de células T reconocen
péptidos víricos asociados con las moléculas MHC de clase 1. Los
péptidos víricos se derivan de proteínas víricas sintetizadas por
vía endógena, sin tener en cuenta la localización o función de la
proteína frente al virus. De esta forma, debido al reconocimiento
de los epitopos procedentes de las proteínas víricas preservadas,
los CTL pueden proporcionar protección de cepa cruzada. Los péptidos
capaces de asociarse con las MHC de clase I para el reconocimiento
de CLT se originan a partir de proteínas que están presentes o de
paso a través del citoplasma o del retículo endoplasmático. Por lo
general, las proteínas exógenas que entran en la ruta de procesado
endosómico (como es el caso de los antígenos que presentan las
moléculas MHC de clase II), no son efectivos para generar
respuestas CTL CD8^{+}.
La mayor parte de los esfuerzos para generar
respuestas CTL han usado vectores replicantes para producir el
antígeno de la proteína en el interior de la célula, o se han
centrado en la introducción de péptidos en el citosol. Estas
soluciones tienen limitaciones que pueden reducir su utilidad como
vacunas. Los vectores retrovirales muestran restricciones en el
tamaño y estructura de los péptidos que pueden expresar en forma de
proteínas de fusión a la vez que mantienen la capacidad del virus
recombinante para replicarse, y la eficacia de vectores tales como
vaccinia para posteriores inmunizaciones puede quedar comprometida
por las respuestas inmunes frente a los propios vectores.
Igualmente, los vectores víricos y los patógenos modificados tienen
riesgos inherentes que pueden prohibir su uso en seres humanos.
Además, la selección de epitopos de péptido a presentar depende de
la estructura del antígeno MHC del individuo y, por tanto, las
vacunas de péptido pueden tener eficacia limitada debida a la
diversidad haplotipos de MHC en poblaciones no consanguíneas.
Benvenisty, N., y Reshef, L. [PNAS 83,
9551-9555, (1986)] demostraron que se podía expresar
el ADN precipitado con CaCl_{2} introducido en ratones por vía
intraperitoneal (i.p.) intravenosa (i.v.) o intramuscular (i.m.).
La inyección i.m. de vectores de expresión de ADN sin el tratamiento
con CaCl_{2} en ratones, dio como resultado la captación de ADN
por las células musculares, y la expresión de la proteína codificada
por el ADN. Los plásmidos se mantuvieron de manera episomal y no se
replicaron. Posteriormente se observó expresión persistente tras
inyección i.m. en el músculo esquelético de ratas, peces y primates
y en el músculo cardíaco de ratas. La técnica de utilizar ácidos
nucleicos como agentes terapéuticos se describe en el Documento WO
90/11092 (4 de Octubre de 1990), en el que se usan polinucleótidos
desnudos para vacunar vertebrados.
No es necesario para el éxito del procedimiento
que la inmunización sea intramuscular. La introducción de
microproyectiles de oro recubiertos con ADN que codifica la hormona
de crecimiento bovina (BGH) en la piel de los ratones dio como
resultado la producción de anticuerpos anti BGH en el ratón. Se
utilizó un inyector de chorro para transfectar los tejidos de piel,
músculo, grasa y mamarios de los animales vivos. Se han revisado
los procedimientos para introducir ácidos nucleicos. Zhu y col.
demostraron que la inyección intravenosa de un complejo
ADN:liposoma catiónico en ratones daba como resultado la expresión
sistémica de un transgen clonado [Science
261:209-211 (9 de Julio de 1993). Ulmer y col.,
[Science 259:1745-1749, (1993)] informaron de la
protección heteróloga frente a la infección del virus de la gripe
por inyección intramuscular de ADN que codificaba proteínas del
virus de la gripe.
La necesidad de agentes terapéuticos y
profilácticos específicos capaces de excitar respuestas inmunes
deseadas frente a patógenos y antígenos tumorales se consigue
mediante la presente invención. De particular importancia en esta
solución terapéutica es la capacidad de inducir respuestas inmunes
de las células T que pueden evitar infecciones o enfermedades
causadas incluso por cepas de virus que son heterólogas de la cepa a
partir de la cual se ha obtenido el gen del antígeno. Esto es de
particular interés cuando se trata con un virus como el HIV, del
que se sabe que muta rápidamente y del que se han aislado muchos
aislados virulentos [véase por ejemplo, LaRosa y col., Science
249:932-935 (1990), que identifica 245
aislados distintos de HIV]. En respuesta a esta diversidad
reconocida, los investigadores han intentado generar CTL basados en
la inmunización de péptidos. De esta forma, Takahashi y col.,
[Science 255;333-336 (1992] han informado de
la inducción de células T citotóxicas con amplia reactividad cruzada
que reconocen un determinante de cubierta de HIV (gp160). Sin
embargo, estos investigadores reconocieron la dificultad de
conseguir una respuesta CTL con reactividad cruzada verdadera, y
sugieren que existe una dicotomía entre el cebado o reestimulación
de células T que es muy riguroso, y el estímulo de la función del
efector, incluyendo la citotoxicidad para CTL ya estimulados.
Wang y col., informaron acerca de la estimulación
de respuestas inmunes en ratones frente a HIV por inoculación
intramuscular con un gen HIV clonado genómico (no conectado). Sin
embargo, el nivel de respuestas inmunes conseguido en estos estudios
fue muy bajo. De manera adicional a Wang y col., el constructo
utilizado como pieza esencialmente genómica de HIV codifica las
secuencias que codifican
Tat/REV-gp160-Tat/REV contiguos. Tal
como se describe en detalle a continuación, este es un sistema
subóptimo para obtener un nivel alto de expresión de la gp160. Esto
es también potencialmente peligroso debido a que la expresión de Tat
contribuye a la progresión del Sarcoma de Kaposi.
El Documento WO 93/17706 describe un
procedimiento para la vacunación de un animal frente a un virus, en
el que las partículas del vehículo se recubrieron con un constructo
de gen y las partículas recubiertas se aceleraron hacia el interior
de las células de un animal. Con relación al HIV, se propuso usar
esencialmente el genoma entero, menos las repeticiones del extremo
terminal de gran tamaño. Este procedimiento representa un riesgo
sustancial para los pacientes. Se cree de manera general que los
constructos de HIV deberían contener menos de aproximadamente el
50% del genoma de HIV para asegurar la seguridad de la vacuna; esto
asegura que las fracciones enzimáticas y las proteínas reguladoras
víricas, muchas de las cuales que tienen funciones desconocidas o
mal comprendidas se han eliminado. De esta manera, quedan numerosos
problemas si va a surgir una vacuna útil para el HIV humano a
partir de la tecnología de liberación de genes.
La presente invención contempla cualquiera de los
procedimientos conocidos para introducir polinucleótidos en el
tejido vivo para inducir la expresión de las proteínas. Sin embargo,
esta invención proporciona un inmunógeno nuevo para introducir HIV
y otras proteínas en la ruta de procesado del antígeno para generar
de manera eficiente CTL y anticuerpos específicos de HIV. El
producto farmacéutico es efectivo como una vacuna para inducir
respuestas inmunes neutralizantes anti HIV y HIV tanto celulares
como humorales En esta presente invención, los problemas señalados
anteriormente se dirigen y resuelven mediante el suministro de
inmunógenos de polinucleótidos que, cuando se introducen en una
animal, dirigen la expresión eficiente de las proteínas de HIV y los
epitopos. Las respuestas inmunes generadas de esta manera son
efectivas en el reconocimiento de HIV, en la inhibición de la
replicación de HIV, en la identificación y muerte de las células
infectadas con HIV, y presentan reactividad cruzada frente a muchas
cepas de HIV.
Los emparejamientos de los códones de los
organismos no son precisamente aleatorios, y difieren de organismo
a organismo. Esta información se usa para construir y expresar genes
alterados o sintéticos que tienen los niveles deseados de
eficiencia de traducción, para determinar qué regiones en un genoma
son regiones codificadoras de proteínas, para introducir los
emplazamientos de pausa de traducción en genes heterólogos, y para
determinar las relaciones o el origen ancestral de las secuencias
de nucleótidos.
La expresión de genes heterólogos extraños en
organismos transformados es en la actualidad cosa común. Se han
insertado con éxito un gran número de genes de mamíferos, entre los
que se incluyen, por ejemplo, murina y genes humanos, en organismos
monocelulares. Las técnicas estándar a este respecto incluyen la
introducción de genes extraños que se van a expresar en un vector
tal como un plásmido o un fago, y utilizar este vector para
insertar el gen en un organismo. Los promotores nativos de dichos
genes se sustituyen de manera habitual con promotores fuertes
compatibles con el huésped en el que el gen se inserta. La
maquinaria de secuenciamiento de proteínas permite la elucidación
de las secuencias de aminoácidos de incluso cantidades
insignificantes de proteína nativa. A partir de estas secuencias de
aminoácidos se pueden inferir las secuencias de ADN que codifican
dichas proteínas. La síntesis de ADN es una técnica en rápido
desarrollo, y se pueden construir fácilmente los genes sintéticos
que corresponden a aquellas secuencias de ADN inferidas
A pesar del conocimiento naciente de los sistemas
de expresión y el ADN recombinante, quedan obstáculos significativos
cuando se intenta expresar un gen extraño o sintético en un
organismo. Muchas proteínas activas nativas, por ejemplo, se
glicosilan de manera diferente de la que se produce cuando se
expresan en un huésped extraño. Por esta razón, se pueden preferir
huéspedes eucariotas tales como levaduras a los huéspedes
bacterianos para expresar muchos genes de mamíferos. El problema de
la glicosilación continua siendo tema de investigación.
Otro problema se comprende peor. A menudo la
traducción de un gen sintético, incluso cuando se acopla con un
promotor fuerte, procede de manera mucho menos eficiente a la que
cabría esperar. Esto último es especialmente verdadero para los
genes exógenos extraños al organismo de expresión. Incluso cuando el
gen se transcribe de manera suficientemente eficiente, de tal manera
que se producen cantidades recuperables del producto de la
traducción, la proteína está inactiva o distinta de cualquier manera
en sus propiedades respecto de las de la proteína nativa.
Se reconoce que el último problema se debe de
manera habitual a las diferencias en el plegado de la proteína en
diversos organismos. La solución a este problema ha sido elusiva, y
los mecanismos que controlan el plegado de la proteína son poco
comprendidos.
Se cree que los problemas relacionados con la
eficiencia de traducción están relacionados con el efecto de
contexto del códon. La las regiones de los genes que codifican
proteínas en todos los organismos están sujeta a una amplia variedad
de restricciones funcionales, algunas de las cuales depende de los
requerimientos para codificar una proteína que funciona de manera
apropiada, así como a las señales de traducción apropiadas de inicio
y detención. Sin embargo, se han discernido diversas características
de las regiones que codifican la proteína que no son fácilmente
comprensibles en los términos de estas restricciones. Dos tipos
importantes de dichas características son aquellos que implican la
utilización del códon y el contexto del códon.
Se sabe que la utilización del códon está muy
sesgada y varía de manera considerable entre diferentes organismos.
Se ha demostrado que los modelos de utilización del códon están
relacionados con la abundancia relativa de isoaceptores del ARNt.
Los genes que codifican proteínas de abundancia alta frente a baja
muestran diferencias en sus preferencias por el códon. Ha sido
ampliamente descrita la posibilidad de desviaciones en el uso de
los codones que altera las velocidades de elongación de los
péptidos. Aunque las diferencias en la utilización del códon se
asocian con diferencias en las velocidades de traducción, los
efectos directos de la elección de códon han sido difíciles de
demostrar. Otras restricciones propuestas sobre los modelos de
utilización del códon incluyen maximizar la fidelidad de la
traducción y optimizar la eficiencia cinética de la síntesis de
proteínas.
Aparte del uso no aleatorio de los codones, se ha
acumulado evidencia considerables acerca de que el reconocimiento
códon/anticódon está influenciado por secuencias externas al propio
códon, un fenómeno denominado "contexto del códon". Existe una
fuerte influencia de los nucleótidos cercanos sobre la eficiencia de
la supresión de codones sin sentido así como codones con sentido
incorrecto. Claramente, la abundancia de la actividad supresora en
poblaciones bacterianas naturales, así como el uso de codones de
"terminación" para codificar la selenocisteína y la
fosfoserina requieren que la terminación sea dependiente del
contexto. Se ha demostrado que los efectos de contexto similares
influencian la fidelidad de la traducción, así como la eficiencia de
la iniciación de la traducción.
Los análisis estadísticos de las regiones que
codifican proteínas de E. coli han demostrado otra
manifestación del "contexto del códon". La presencia de un
códon concreto en una posición influencia fuertemente la frecuencia
de incidencia de algunos nucleótidos en los codones vecinos, y estas
restricciones del contexto difieren de manera marcada para los
genes expresados a niveles altos frente a bajos. Aunque se ha
reconocido el efecto contexto, el valor predictivo de las reglas
estadísticas que relacionan los nucleótidos preferidos adyacentes a
los codones es relativamente bajo. Esto ha limitado la utilidad de
dichos datos de preferencia de nucleótidos para seleccionar codones
para efectuar los niveles deseados de eficiencia de traducción.
La llegada de los equipos de secuenciamiento
automatizado de nucleótidos ha hecho que se disponga de grandes
cantidades de datos de secuencias para una amplia variedad de
organismos. La compresión de estos datos presenta sustanciales
dificultades. Por ejemplo, es importante identificar las regiones
que codifican el genoma con el fin de relacionar los datos de la
secuencia genética con las secuencias de proteína. De manera
adicional, los ancestros del genoma de algunos organismos son de
sustancial interés. Algunas secuencias que son víricas en origen se
han incorporado ahora de manera estable en el genoma de los
organismos eucariotas. Las propias secuencias víricas se pueden
haber originado en otra especie esencialmente no relacionada. Puede
ser importante una comprensión del ancestro de un gen para destacar
analogías correctas entre genes relacionados y sus productos de
traducción en otros
organismos.
organismos.
Existe necesidad de una mejor comprensión de los
efectos del contexto del códon sobre la traducción, y de un
procedimiento para determinar los codones apropiados para cualquier
efecto de traducción deseados. Existe también necesidad de un
procedimiento para identificar las regiones que codifican el genoma
a partir de los datos de las secuencias de nucleótidos. Existe
también necesidad de un procedimiento para controlar el plegado de
la proteína y para asegurar que un gen extraño se plegará de manera
apropiada cuando se exprese en un huésped. Los genes alterados o
construidos de acuerdo con las eficiencias traducciones adecuadas
serían de un valor significativo.
Otro aspecto de la práctica de las técnicas de
ADN recombinante para la expresión por microorganismos de las
proteínas de interés industrial y farmacéutico es el fenómeno de
"preferencia del códon". Aunque se ha indicado anteriormente
que la maquinaria existente para la expresión del gen está formada
por células huésped genéticamente transformadas, que
"operarán" para construir un producto deseado dado, los niveles
de expresión alcanzados en un microorganismo pueden estar sujetos a
una amplia variación, dependiendo en parte de las formas
alternativas específicas del código genético que especifica el
aminoácido en un gen exógeno insertado. Un códon "triplete" de
cuatro posibles bases de nucleótidos puede existir en 64 formas
variantes. Que estas formas proporcionan el mensaje para únicamente
20 aminoácidos diferentes (así como la iniciación y terminación de
la transcripción) significa que algunos aminoácidos se pueden
codificar por más de un códon. Debido a ello, algunos aminoácidos
tienen tanto como seis codones alternativos "redundantes"
mientras que algunos otros tienen un único códon requerido. Por
razones no completamente comprendidas, los codones alternativos no
están todos presentes de manera uniforme en el ADN endógeno de
diferentes tipos de células y parece existir una jerarquía natural
variable o "preferencia" para algunos codones en algunos tipos
de células.
Como ejemplo, el aminoácido leucina se especifica
por uno cualquiera de los seis codones de ADN que incluyen CTA, CTC,
CTG, CTT, TTA, y TTG (que corresponden, respectivamente a los
codones del ARN, CUA, CUC, CUG, CUU, UUA y UUG). El análisis
exhaustivo de las frecuencias de los codones del genoma de los
microorganismos ha revelado que el ADN endógeno de E. coli
contiene de manera más habitual el códon específico de la leucina
CTG, mientras que el ADN de levaduras y mohos del limo incluye de
manera común un códon TTA que específico de la leucina. En vista de
esta jerarquía, se mantiene de manera general que la probabilidad de
obtener altos niveles de expresión de un polipéptido rico en leucina
por un huésped de E. coli dependerá en alguna extensión de la
frecuencia de utilización del códon. Por ejemplo, un gen rico en
codones TTA será con toda probabilidad mal expresado en E.
coli, mientras que un gen rico en CTG expresará el polipéptido
probablemente de manera superior. De manera similar, cuando las
células de levadura son la transformación proyectada de las células
huésped para la expresión de un polipéptido rico en leucina, un
códon preferido para uso en un ADN insertado será TTA.
Las implicaciones del fenómeno de preferencia del
códon en las técnicas de ADN recombinante son manifiestas, y el
fenómeno puede servir para explicar errores anteriores en alcanzar
altos niveles de expresión de genes exógenos en organismos huésped
transformados con éxito – un códon menos "preferido" puede
estar presente de forma repetida en el gen insertado, y la
maquinaria de expresión de la célula huésped puede no funcionar de
forma tan eficaz. Este fenómeno sugiere que los genes sintéticos que
se han diseñado para incluir codones preferidos de células huésped
proyectadas proporcionan una forma preferida de material genético
extraño para la práctica de técnicas de ADN recombinante.
La diversidad de funciones que tipifican las
células eucariotas depende de la diferenciación estructural de sus
límites de membrana. Para generar y mantener estas estructuras, las
proteínas deben ser transportadas desde su emplazamiento de síntesis
en el retículo endoplasmático a los destinos predeterminados por
toda la célula. Esto requiere que las proteínas en transito
desplieguen señales de clasificación que sean reconocidas por la
maquinaria molecular responsable de dirigir la selección de la vía,
localizada en los puntos de acceso de las rutas de vehiculado
principales. Las decisiones de clasificación de la mayor parte de
proteínas necesitan realizarse sólo una vez a medida que atraviesan
sus rutas biosintéticas, ya que su destino final, la localización
celular donde realizan su función, se convierte en su residencia
permanente.
El mantenimiento de la integridad intracelular
depende en parte de la clasificación selectiva y el transporte
preciso de las proteínas a sus destinos correctos. En los últimos
años se ha diseccionado la maquinaria molecular de reconocimiento y
se estudiado ampliamente la localización de las proteínas. Se han
identificado motivos de secuencia definidos en proteínas que pueden
actuar como "marcadores de dirección". Se han encontrado
numerosas señales de clasificación asociadas con las regiones
citoplásmicas de las proteínas de membrana.
Se proporcionan moléculas de ADN sintético que
codifican env de HIV y se proporcionan modificaciones de
env de HIV. Los codones de las moléculas sintéticas incluyen
los codones preferidos de las células huésped proyectadas. Las
moléculas sintéticas proporcionan formas preferidas del material
genético extraño. Se pueden usar las moléculas sintéticas en forma
de vacuna de polinucleótido que proporciona inmunoprofilaxis
efectiva frente a la infección por HIV mediante la neutralización de
la inmunidad mediada por células y anticuerpos. Esta invención
proporciona polinucleótidos que, cuando se introducen directamente
en un vertebrado in vivo, incluyendo mamíferos tales como
primates y seres humanos, inducen la expresión de las proteínas
codificadas en el interior del
animal.
animal.
De manera específica se proporciona un
polinucleótido sintético según se define en la reivindicación 1.
La Figura 1 muestra el cassette de env de
HIV en función de las estrategias de expresión.
La Figura 2 muestra las respuestas de la vacuna
de ADN mediada por las respuestas anti-gp120.
La Figura 3 muestra los títulos ELISA de
anti-gp120 del suero de vacuna de ADN de murina.
La Figura 4 muestra la expresión relativa de la
gp120 tras la transfección del cultivo celular PNV con env de
HIV.
La Figura 5 muestra las respuestas medias
anti-gp120 según ELISA que siguen a la vacunación
con tPA-gp143/optA frente al ADN optB
La Figura 6 muestra la neutralización de HIV
mediante el suero de vacuna de ADN de murina.
La Figura 7 muestra la neutralización de HIV
medianotes sueros procedentes de vacunas de ADN de murina con
env de HIV.
La Figura 8 es un análisis inmunoblot de
constructos de ADN optimizados con env de HIV.
Se proporcionan moléculas de ADN sintético que
codifican env de HIV y moléculas de ADN sintético que
codifican formas modificadas de env de HIV. Se diseñan los
codones de las moléculas sintéticas de forma que se usen los codones
preferidos por la célula huésped proyectada. Se pueden usar las
moléculas sintéticas en forma de vacuna de polinucleótido que
proporciona una inmunoprofilaxis efectiva frente a la infección por
HIV mediante anticuerpos neutralizantes e inmunidad mediada por
células. Se pueden usar las moléculas sintéticas como una
composición inmunógena. Esta invención proporciona polinucleótidos
que, cuando se introducen directamente en un vertebrado in
vivo, incluyendo mamíferos tales como primates y seres humanos,
inducen la expresión de proteínas codificadas en el interior del
animal.
Tal como se usa en el presente documento, un
polinucleótido es una combinación de ácidos nucleicos que contiene
elementos reguladores tales que tras la introducción en una célula
viva de vertebrado, el polinucleótido es capaz de dirigir la
maquinaria celular para producir productos de traducción codificados
por los ácidos nucleicos que comprenden el polinucleótido. En una
forma de realización de la invención, el polinucleótido es un ácido
polidesoxiribonucleico que comprende al menos un gen de HIV enlazado
de manera operativa con un promotor de transcripción. En otra forma
de realización de la invención, la vacuna de polinucleótido (PNV)
comprende ácido poliribonucleico que codifica al menos un gen de
HIV que es responsable de la traducción mediante la maquinaria
celular eucariota (ribosomas, ARNt y otros factores de traducción).
Cuando la proteína codificada por el polinucleótido sea una que no
se produce de manera normal en el animal excepto en condiciones
patológicas, (es decir, una proteína heteróloga) tales como las
proteínas asociadas con el virus de la inmunodeficiencia adquirida,
(HIV), el agente etiológico de síndrome de inmuno deficiencia
adquirida, (SIDA), el sistema inmune del animal se activa para
lanzar una respuesta inmuno protectora. Debido a que estas proteínas
exógenas se producen por los tejidos del animal, las proteínas
expresadas se procesan por el sistema de mayor histocompatibilidad,
MHC, de una manera análoga a la que se produce con una infección
real del organismo relacionado (HIV). El resultado es la inducción
de respuestas inmunes frente al patógeno cognado.
Los polinucleótidos de la presente descripción,
cuando se introducen en un sistema biológico, inducen la expresión
de las proteínas y epitopos del HIV, y la producción de una
respuesta inmune específica. La respuesta inducida de anticuerpos es
específica para la proteína de HIV expresada, y neutraliza el HIV.
De manera adicional se inducen los linfocitos T citotóxicos (CTL)
que reconocen y destruyen de manera específica las células
infectadas por HIV.
La presente descripción proporciona
procedimientos para usar un polinucleótido que, tras la introducción
en el tejido de mamífero, induce la expresión en una célula única,
in vivo, de los productos del gen discretos. La descripción
proporciona una solución que no requiere manipulaciones múltiples de
genes de HIV dependientes de REV para obtener genes
independientes de REV. El sistema de expresión independiente
de REV descrito en el presente documento es útil por derecho
propio, y es un sistema para demostrar la expresión en una célula
única in vivo, de un producto de gen deseado único.
Debido a que muchas de las aplicaciones de la
presente invención se aplican a la vacunación antivírica, los
polinucleótidos se denominan con frecuencia como vacuna(s) de
polinucleótido, o PNV. Esto no significa que se considera que estén
fuera del alcance de la invención las utilidades adicionales de
estos polinucleótidos, en la estimulación inmune y en las
terapéuticas antitumorales,
De acuerdo con la invención, un gen que codifica
un producto de gen de HIV se incorpora a un vector de expresión. El
vector contiene un promotor de transcripción reconocido por una ARN
polimerasa eucariota y un terminador de transcripción al extremo de
la secuencia de codificación del gen de HIV. En una forma de
realización preferida, el promotor es el promotor de citomegalovirus
con la secuencia del intrón A (CMV-intA), aunque
aquellos expertos en la técnica reconocerán que se puede usar
cualquiera del resto de numerosos promotores conocidos, tales como
la inmunoglobulina fuerte u otros promotores de genes eucariotas. Un
terminador de transcripción preferido es el terminador de la hormona
de crecimiento bovina. La combinación de terminador
CMVintA-BGH es particularmente preferida.
Para ayudar a la preparación de los
polinucleótidos en las células procariotas, se puede incluir en el
vector de expresión un marcador de resistencia a un antibiótico; el
marcador puede estar bajo control de transcripción de un promotor
procariota de tal manera que la expresión del marcador no ser
produce en células eucariotas. Se pueden usar genes de resistencia a
la ampicilina, genes de resistencia a la neomicina y otros
marcadores de resistencia a antibióticos aceptables. Para ayudar a
la producción de altos niveles de polinucleótido mediante la
fermentación en organismos procariotas, puede ser útil que el vector
contenga un origen de replicación procariota y ser de alto número de
copias. Numerosos vectores de clonación procariota comercialmente
disponibles proporcionan estos beneficios. Es deseable eliminar las
secuencias no esenciales de ADN y asegurar que los vectores no son
capaces de replicarse en células eucariotas. Esto minimiza el riesgo
de integración de secuencias de la vacuna de polinucleótido en el
genoma del huésped. Se pueden usar promotores específicos de tejido
siempre que estos sea deseable para limitar la expresión del
polinucleótido en un tipo concreto de tejido.
Entre los ejemplos de vectores se incluyen V1, un
vector pBR322 mutado en el que se clonaron el promotor CMV y el
terminador trancripcional BGH. En otro vector se han combinado los
elementos V1 y pUC19 para producir un vector de expresión denominado
V1J. En otro refinamiento, se elimina el gen de resistencia a la
ampicilina del V1J y se sustituye por un gen de resistencia a la
neomicina, para generar ViJ-neo. En la invención, el
vector es V1Jns, que es el mismo que VIJneo excepto en que se ha
diseñado un único emplazamiento de restricción Sfil en el
emplazamiento Kpn1 único en la posición 2114 del
ViJ-neo. La incidencia de los emplazamientos Sfil
en el ADN genómico humano es muy baja (aproximadamente 1
emplazamiento por 100.000 bases). De esta manera, este vector
permite monitorizar cuidadosamente la integración del vector de
expresión en el ADN del huésped, simplemente mediante digestión Sfil
del ADN genómico extraído. En un refinamiento adicional, el vector
es V1R. En este vector, se "recorta" tanto ADN como sea posible
del vector para producir un vector muy compacto. Este vector es un
derivado de V1Jns. Este vector permite que se usen grandes insertos
con menor preocupación de que se codifiquen las secuencias no
deseadas y se optimiza la captación por las células.
Una forma de realización de esta invención
incorpora genes que codifican gp160 de HIV, gp120, gag y otros
productos de genes procedentes de cepas de HIV adaptadas de
laboratorio tales como SF2, IIIB o MN. Aquellos expertos en la
técnica reconocerán que se podría esperar que el uso de genes de
cepas de HIV-2 que tienen funciones análogas a las
de los genes de HIV-1 genere respuestas análogas a
aquellas descritas en el presente documento para constructos de
HIV-1. Se conocen los procedimientos de clonación y
manipulación de estos genes por aquellos expertos en la técnica.
Se reconoce que la excitación de respuestas
inmunes frente a cepas de HIV adaptadas de laboratorio puede no ser
adecuada para proporcionar la neutralización de los aislados de HIV
de campo primario. De esta manera, en otra forma de realización de
esta invención, se incorporan genes procedentes de aislados
virulentos de HIV de campo primario en el inmunógeno de
polinucleótido. Esto se lleva a cabo preparando copias de ADNc de
los genes víricos y a continuación subclonando los genes
individuales en el inmunógeno de polinucleótido. Las secuencias de
muchos genes de muchas cepas de HIV están en la actualidad
públicamente disponibles mediante GENBANK y dichos aislados de campo
primario de HIV están disponibles en el National Institute of
Allergy and Infectious Diseases (NIAID) que ha contratado con la
Quality Biological, Inc [7581 Lindbergh Drive, Gaitherburg, Maryland
20879] para que estas cepas estén disponibles. Dichas cepas están
también disponibles en la World Health Organization (OMS) [[Network
for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Development Unit,
Office of Research, Global Programme on AIDS,
CH-1211 Ginebra 27, Suiza]. A partir de este
trabajo, aquellos expertos en la técnica reconocerán que una de las
utilidades de la presente invención es proporcionar un sistema para
ensayar y analizar tanto in vivo, como in vitro de
forma que se puede llevar a cabo una correlación entre la diversidad
de secuencias de HIV y la serología de la neutralización de HIV, así
como otros parámetros. La incorporación de genes procedentes de
aislados primarios de cepas de HIV proporciona un inmunógeno que
induce respuestas inmunes frente a los aislados clínicos de los
virus, y de esta manera se cumple una necesidad que no se ha
cubierto todavía en el campo. Además, como los aislados virulentos
cambian, se puede modificar el inmunógeno tanto como sea necesario
para reflejar nuevas secuencias.
Para mantener consistente la terminología, se
siguen las siguientes convenciones en el presente documento para
describir los constructos de inmunógeno de polinucleótido "Nombre
del vector-cepa de
HIV-gen-elementos adicionales".
De esta manera, un constructo en el que se clona el gen gp160 de la
cepa MN en el vector de expresión V1Jneo, el nombre que se da en el
presente documento es:
"V1Jneo-MN-gp160". Se describen
con más detalle a continuación los elementos adicionales que se
añaden al constructo. Como cepa etiológica de los cambios en virus,
se puede cambiar el gen preciso que es óptimo para la incorporación
en el producto farmacéutico. Sin embargo, tal como se demuestra a
continuación, debido a que se inducen respuestas CTL que son capaces
de proteger frente a cepas heterólogas, la variabilidad de la cepa
es menos crítica en el inmmunógeno y las vacunas de esta invención,
en comparación las vacunas basadas en el virus completo o subunidad
de polipéptido. De manera adicional, debido a que el producto
farmacéutico se manipula fácilmente para insertar un nuevo gen, este
es un ajuste que se hace fácilmente mediante técnicas estándar de
biología molecular.
El término "promotor" tal como se usa en el
presente documento se refiere a un emplazamiento de reconocimiento
en una cadena de ADN al que se enlaza la ARN polimerasa. El promotor
forma un complejo de iniciación con la ARM polimerasa para iniciar y
dirigir la actividad de transcripción. Se puede modificar el
complejo activando las secuencias denominadas "mejoradores" o
inhibiendo las secuencias denominadas "silenciadores".
El término "lider" tal como se usa en el
presente documento se refiere a una secuencia de ADN en el extremo
5' de un gen estructural que se transcribe junto con el gen. El
líder de manera usual da como resultado una proteína que tiene una
extensión del péptido N-terminal denominada algunas
veces como pro-secuencia. Para las proteínas
destinadas bien a la secreción en el medio extracelular o a una
membrana, esta secuencia señal, que es generalmente hidrófoba,
dirige la proteína en el retículo endoplasmático desde el que se
descarga al destino apropiado.
El término "intrón" tal como se usa en el
presente documento se refiere a una sección del ADN que se encuentra
en el medio de un gen que no codifica un aminoácido en el producto
del gen. El precursor de ARN en el intrón se corta y por tanto no se
transcribe en el ADN ni se traduce a proteínas.
El término "cassette" se refiere a la
secuencia de la presente invención que contiene la secuencia del
ácido nucleico que se va a expresar. El cassette es similar en
concepto a una cinta cassette. Cada cassette tendrá su propia
secuencia . De esta manera, intercambiando el cassette el vector
expresará una secuencia diferente. Debido a los emplazamientos de
restricción en los extremos 5' y 3', el cassette se puede insertar
fácilmente, eliminarse o sustituirse con otro cassette.
El termino "región 3' no traducida" o "3'
UTR" se refiere a la secuencia en el extremo 3' de un gen
estructural que se transcribe de manera usual con el gen. Esta
región 3' UTR contiene de manera usual la secuencia poli A. Sin
embargo, la 3' UTR se transcribe desde el ADN y se corta antes de la
traducción a proteína.
El término "Región no codificante" o
"NCR" se refiere a la región contigua a la región 3' UTR del
gen estructural. La región NCR contiene una señal de terminación de
transcripción.
El término "emplazamiento de restricción" se
refiere a un emplazamiento de rotura de la secuencia específica de
las endonucleasas de restricción.
El término "vector" se refiere a algunos
medios por los cuales se pueden introducir los fragmentos de ADN en
un organismo huésped o en un tejido huésped. Existen diversos tipos
de vectores que incluyen plásmidos, bacteriófagos y cósmidos.
El término "cantidad efectiva" significa que
se inyecta suficiente PNV para producir los niveles adecuados de
polipéptido. Una persona experta en la técnica reconoce que este
nivel puede variar.
Para proporcionar una descripción de la presente
invención, se proporciona el siguiente antecedente sobre el HIV. El
virus de la inmunodeficiencia humana tiene un genoma de ácido
ribonucleico (ARN), la estructura del cual se representa en la
Figura 1. Este genoma de ARN se debe transcribir de manera inversa
de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica con el fin
de producir una copia de ADNc para la clonación y manipulación de
acuerdo con los procedimientos mostrados en el presente documento.
Cada uno de los extremos del genoma es una repetición a largo plazo
que actúa como un promotor. Entre estos términos, el genoma
codifica, en diversos marcos de lectura,
gag -pol- env como los principales
productos del gen: gag es el antígeno específico de grupo;
pol es la transcriptasa inversa, o polimerasa; se codifica también
un esta región, en un marco de lectura alternado, la proteasa vírica
responsable del procesamiento post-traducción, por
ejemplo, de gp160 en gp120 y gp41; env es la proteína de la
envoltura; vif es el factor de infectividad del virión; REV
es el regulador de la expresión de la proteína del virión; neg es el
factor de regulación negativo; vpu es el factor de productividad del
virión, "u"; tat es el trans-activador de la
transcripción; vpr es la proteína vírica r. Se ha descrito la
función de cada uno de estos elementos.
En una forma de realización de esta invención, un
gen que codifica una proteína de HIV o SIV se enlaza directamente
con un promotor de transcripción. El gen env codifica una
proteína grande enlazada a la membrana, la gp160, que se modifica en
post-traducción a gp41 y gp120. El gen de gp120 se
puede colocar bajo el control del promotor de citomegalovirus para
la expresión. Sin embargo, la gp120 no se enlaza a la membrana y por
tanto, tras la expresión, se puede secretar desde la célula. Como el
HIV tiende a permanecer durmiente en células infectadas, es deseable
que se generen también respuestas inmunes dirigidas a los epitopos
de HIV enlazados con la célula. De manera adicional, es deseable que
la vacuna produzca un antígeno oligomérico ENV enlazado con
la membrana que tenga una estructura similar a la que se produce
mediante infección vírica con el fin de generar las respuestas de
anticuerpo más eficaces para la neutralización vírica. Esta meta se
lleva a cabo en el presente documento mediante la expresión in
vivo del epitopo asociado con la membrana de la célula, gp160,
para primar el sistema inmune. Sin embargo, la expresión de gp160 se
reprime en ausencia de REV debido a la no salida desde el
núcleo de los genes no unidos. Para una comprensión de este sistema,
se describirá con mayor detalle el ciclo de vida del HIV.
En el ciclo de vida del HIV, tras la infección de
una célula huésped, el ARN del genoma del HIV se transcribe de forma
inversa en el ADN provírico que se integra en el ADN genómico del
huésped como una unidad de transcripción única. El LTR proporciona
el promotor que transcribe los genes del HIV en la dirección 5' a 3'
(gag, pol, env), para formar un transcripto no unido
con el genoma entero. El transcripto no unido actúa como el ARNm a
partir del cual se traduce aunque puede tener lugar una unión
limitada durante la traducción de los genes codificados env.
Para el producto del gen regulador REV que se va a expresar,
se puede producir más de un episodio de unión debido a que en la
regulación genómica, REV y env se solapan, tal como se
muestra en la figura 1. Con el fin que se produzca la transcripción
de env, debe pararse la transcripción de REV, y
viceversa. De manera adicional, se requiere la presencia de
REV para exportar el ARN no unido desde el núcleo. Para que
REV funcione de esta manera, sin embargo, debe estar
presente en el transcripto un elemento responsable de REV
(RRE) [Malim y col., Nature 338:254-257
(1989)]
En la vacuna de polinucleótido de esta invención,
se elimina la unión obligatoria de algunos genes de HIV
proporcionando genes completamente unidos (es decir: el suministro
de un marco de lectura abierto completo para el producto de gen
deseado sin necesidad de cambios en el marco de lectura o la
eliminación de regiones no codificadas; aquellos normalmente
expertos en la técnica reconocerían que cuando se une un gen
completo, existe alguna libertad en la secuencia precisa que
resulta; sin embargo en tanto en cuanto se obtenga una secuencia de
codificación funcional, esto es aceptable). De esta manera, en una
forma de realización, la secuencia de codificación completa de gp160
se une de tal manera que se requiere la expresión no intermitente de
cada gen.
La doble respuesta inmune, humoral y celular,
generada de acuerdo con esta invención resulta particularmente
significativa para inhibir la infección por HIV, dada la propensión
del HIV a mutar dentro de la población, así como en individuos
infectados. Con el fin de formular una vacuna protectora efectiva
para el HIV es deseable generar tanto una respuesta de anticuerpo
multivalente por ejemplo para gp160 (se conservan aproximadamente un
80% de env a través de las diferentes cepas
HIV-1 clado B, que son las cepas predominantes en
las poblaciones humanas de los Estados Unidos), la diana principal
de neutralización sobre HIV, así como las células T citotóxicas
reactivas a las porciones conservadas de gp160 y, las proteínas
víricas internas codificadas por gag. Hemos hecho una vacuna
para HIV que comprende genes de gp160 seleccionados entre cepas
comunes de laboratorio; predominantemente de aislados víricos
primarios que se encuentran dentro de la población infectada; a
partir de gp160 mutados diseñados para desenmascarar cepas cruzadas,
neutralizando los epitopos del anticuerpo; y de otros genes de HIV
representativos tales como los genes gag y pol (\sim
un 95% de conservación a través de aislados de HIV)
Virtualmente, todos los pacientes HIV
seropositivos que no han avanzado hacia un estado inmunodeficiente
hospedan CTL anti-gag mientras aproximadamente un
60% de estos pacientes muestran CTL específicos de gp160 en cepas
cruzadas. La cantidad de CTL específicos de HIV encontrados en
individuos infectados que han progresado en el estado de enfermedad
conocido como SIDA es, sin embargo, mucho menor, demostrando la
significación de nuestros hallazgos que podemos inducir respuestas
CTL de cepa cruzada.
Las respuestas inmunes inducidas por nuestros
constructos de vacuna de polinucleótido env y gag se
demostraron en ratones y primates. La monitorización de la
producción de anticuerpos contra env en ratones permite la
confirmación que un constructo dado es un inmunógeno adecuado, es
decir, una proporción alta de los animales vacunados muestra una
respuesta de anticuerpos. Los ratones proporcionan también el modelo
animal más fácil adecuado para ensayar la inducción de CTL por
nuestros constructos, y se usa por tanto para evaluar si un
constructo concreto es capaz de generar dicha actividad. Los monos
(cercopiteco verde, rhesus, chimpancés) proporcionan especies
adicionales que incluyen primates para la evaluación de anticuerpos
en animales grandes no roedores. Se prefieren también estas especies
a los ratones para los ensayos de neutralización de antisueros
debido a los altos niveles de actividades neutralizantes endógenas
frente a los retrovirus observados en suero de ratón. Estos datos
demuestran que se suscita inmunogenicidad suficiente por nuestras
vacunas para conseguir la protección en los experimentos en un
modelo desencadenador chimpancé/HIV_{IIIB} basado en niveles
protectores conocidos de anticuerpos neutralizantes para este
sistema. Sin embargo, la definición de protección actualmente
emergente y crecientemente aceptada en la comunidad científica se
separa de la así denominada "inmunidad esterilizante" que
indica la protección completa de la infección por HIV, para prevenir
la enfermedad. Varios correlatos de este objetivo incluyen la
reducción del título vírico en sangre, medida bien por la
transcriptasa inversa de HIV, por la infectividad de las muestras de
suero, por el ensayo ELISA de p24 o la concentración en sangre de
otros antígenos de HIV, la concentración aumentada de células T
CD4^{+}, y por las velocidades extendidas de supervivencia [véase,
por ejemplo, Cohen, J., Science
262:1820-1821, 1993, para una descripción de
la evolución de la definición de la eficacia de la vacuna
anti-HIV]. Los inmunógenos de la presente invención
generan también respuestas inmunes neutralizantes frente a aislados
infecciosos de HIV (campo clínico primario).
1. gp160 y gp120. Se usó un ensayo ELISA
para determinar si los vectores de vacuna que expresan bien la gp120
secretada o la gp160 enlazada a la membrana son eficaces en la
producción de anticuerpos específicos de env. La
caracterización inicial in vitro de la expresión de
env en nuestros vectores de vacunación se proporciona
mediante análisis inmunoblot de los lisados de células transfectadas
con gp160. Estos datos confirman y cuantifican la expresión de gp160
usando anticuerpos monoclonales anti-gp41 y
anti-gp120 para visualizar la expresión de gp160 de
la célula transfectante. En una forma de realización de esta
invención, se prefiere gp160 a gp120 por las siguientes razones:
(1) un vector gp120 inicial produjo inmunogenicidad inconsistente en
ratones y tuvo una respuesta muy pobre o ninguna en Cercopiteco
verde; (2) gp160 contribuye de manera adicional a neutralizar
anticuerpos así como epitopos de CTL proporcionando la adición de
aproximadamente 190 residuos de aminoácidos debido a la inclusión de
gp41; (3) la expresión de gp160 es más similar al env vírico
con respecto al conjunto de tetrámeros y a la conformación global,
lo que puede proporcionar epitopos de neutralización dependientes
del oligómero; y (4) encontramos que, al igual que el éxito del
enlace de la membrana, los constructos HA de la gripe para la
producción de respuestas de anticuerpo neutralizantes en ratones,
hurones y primates no humanos de generación de anticuerpos
anti-gp160 es superior a la generación de
anticuerpos anti-gp120. La selección de qué tipo de
env o que cocktail de subfragmentos de env se
prefiere, se determina mediante los experimentos que se detallan más
adelante.
Se ensayó antisuero ELISA positivo procedente de
monos y demostró que neutralizaba cepas de HIV tanto homólogas como
heterólogas.
Un objetivo principal de los PNV de env es
generar anticuerpos ampliamente neutralizantes. Se ha demostrado en
la actualidad que los anticuerpos dirigidos contra bucles V3 son muy
específicos de la cepa, y se ha usado la serología de esta respuesta
para definir cepas.
a. Los anticuerpos neutralizantes No V3 parecen
reconocer principalmente epitopos estructurales discontinuos en el
interior de gp120 que son responsables del enlace CD4. Los
anticuerpos de este dominio son policlonales y más ampliamente
neutralizantes cruzados debido probablemente a las restricciones
impuestas sobre las mutaciones por la necesidad de los virus de
enlazar su ligando celular. Se usó un ensayo in vitro para
ensayar el bloqueo del enlace de gp120 con CD4 inmovilizado en
placas de 96 pocillos mediante sueros procedentes de animales
inmunizados. Un segundo ensayo in vitro detecta el enlace
directo de los anticuerpos con los péptidos sintéticos que
representan los dominio seleccionados de V3 inmovilizados sobre
plástico. Estos ensayos son compatibles para antisueros de
cualquiera de los tipos de animales usados en nuestros estudios y
definen los tipos de anticuerpos neutralizantes que nuestras vacunas
han generado así como proporcionan un correlato in vitro para
la neutralización del virus.
b. gp41 hospeda al menos un determinante
principal de neutralización, que corresponde con epitopos lineales
altamente conservados reconocidos por el anticuerpo monoclonal 2F5
ampliamente neutralizante (comercialmente comercializado por Vírico
Testing System Corp., Texas Commerce Tower, 600 Travis Street, Suite
4750, Houston, TX 77002-3005 (USA), o Waldheim
Pharmazeutika GMBH, Boltzmangasse 11, A-1091 Viena,
Austria) así como otros emplazamientos potenciales el dominio bien
conservado "péptido de fusión" localizado en el término N de
gp41. Además de la detección de anticuerpos dirigidos contra gp41
mediante técnicas de inmunoblot tal como se ha descrito
anteriormente, se usó un ensayo in vitro para anticuerpos que
enlazan con péptidos sintéticos que representan estos dominios
inmovilizados sobre plástico.
En pacientes HIV seropositivos, las respuestas
del anticuerpo neutralizante progresan principalmente desde
anti-V3 para incluir anticuerpos neutralizantes de
mayor espectro que comprenden los epitopos del dominio gep120
estructural descritos anteriormente (#3), que incluyen epitopos
gp41, Estos tipos de respuestas de anticuerpos se monitorizan
durante el curso del tiempo y las subsiguiente vacunaciones.
1. Generación de respuestas CTL. Las
proteínas víricas que se sintetizan en el interior de las células
producen un aumento de respuestas CTL limitadas a MHC I. Cada una de
estas proteínas excita CTL en pacientes seropositivos. Nuestras
vacunas son también capaces de excitar CTL en ratones. Las
inmunogenéticas de las cepas de ratón conducen a dichos estudios,
tal como se demuestra con la gripe NP. Se han definido diversos
epitopos para las proteínas de HIV env, REV,
nef y gag en ratones Balb/c, facilitando de esta
manera el cultivo de CTL in vitro y los ensayos de
citotoxicidad. Es ventajoso usar líneas de tumor singénico, tales
como el mastocitoma P815 de murina, transfectado con estos genes
para proporcionar dianas para CTL así como para la reestimulación
in vitro de antígenos específicos. Se conocen procedimientos
para definir inmunógenos capaces de excitar linfocitos T citotóxicos
limitados a MHC de clase I. Se encuentra también que un péptido que
abarca los aminoácidos 152-176 induce los
anticuerpos que neutralizan el HIV], y se pueden usar estos
procedimientos para identificar epitopos inmunogénicos para la
inclusión en el PNV de esta invención. De manera alternativa se
podría usar el gen completo que codifica gp 160, gp120, la proteasa
o gag. Tal como se usa en el presente documento, la función
del efector de la célula T se asocia con el fenotipo de las células
T maduras, por ejemplo, la citotoxicidad, la activación de las
células B para la secreción de citoquina, y/o el restablecimiento o
la estimulación de macrófagos y neutrófilos.
Se ensayaron cultivos celulares de bazo derivados
de animales vacunados para determinar los antígenos específicos
mediante la adición bien de la proteína recombinante o de los
epitopos del péptido. La activación de las células T por dichos
antígenos, presentada mediante el acompañamiento de células que
presentan el antígeno esplénico, las APC, se monitoriza mediante la
proliferación de estos cultivos o mediante la producción de
citoquina. El modelo de producción de citoquina permite también la
clasificación de la respuesta T_{H} como tipo 1 o tipo 2. Debido a
que las respuestas T_{H}2 dominantes parecen correlacionarse con
la exclusión de la inmunidad celular en pacientes seropositivos
inmunocomprometidos, es posible definir el tipo de respuesta
suscitada por un PNV dado en los pacientes, lo que permite la
manipulación de las respuestas inmunes resultantes.
3. Hipersensibilidad de tipo retardado
(DTH). La DTH del antígeno vírico tras la inyección i.d. es
indicadora de la inmunidad celular restringida principalmente a MHC
II. Debido a la disponibilidad comercial de las proteínas de HIV
recombinantes y los péptidos sintéticos para epitopos conocidos, las
respuestas DTH se determinan fácilmente en vertebrados vacunados
usando estos reactivos, proporcionando de esta manera un correlato
adicional in vivo para inducir la inmunidad celular.
Basándose en los anteriores estudios
inmunológicos, es predecible que nuestra vacunas sean efectivas en
vertebrados frente a la estimulación por HIV virulento. Estos
estudios se llevaron a cabo en un modelo de estimulación
HIV_{IIIB}/chimpancé tras la vacunación suficiente de estos
animales con un constructo de PNV, o un cocktail de constructos de
PNV que comprende de gp160IIIb, gagIIIB, nefIIIB y REVIIIB, La cepa
IIIB es útil a este respecto como se ha establecido en el título de
dosis letales de esta cepa en chimpancé. Sin embargo, se proyectaron
los mismos estudios usando cualquier cepa de HIV y los epitopos
específicos de o los heterólogos de la cepa dada. Un segundo modelo
vacunación/estimulación, de manera adicional al de los chimpancés es
el scid-hu de PBL de ratón. Este modelo permite ensayar los
linfocitos del sistema inmune de los seres humanos y nuestra vacuna
tras el subsiguiente estímulo del HIV en un ratón huésped. Este
sistema es ventajoso así como fácilmente adaptado al uso con
cualquier cepa de HIV y proporciona evidencias de protección frente
a múltiples cepas de aislados de HIV de campo primario. Un tercer
modelo de estimulación utiliza virus HIV/SIV híbridos, algunos de
los cuales han demostrado infectar monos rhesus y conducen a la
enfermedad de inmunodeficiencia dando como resultado la muerte
[véase Li, J., y col., J. AIDS 5:639-646, 1992]. La
vacunación de rhesus con nuestros constructos de vacuna de
polinucleótido es protectora frente a la estimulación subsiguiente
con dosis letales de SHIV.
El HIV y otros genes se ligan en un vector de
expresión que se ha optimizado para vacunaciones de polinucleótido.
Esencialmente, se elimina todo el ADN extraño, dejando los elementos
esenciales del promotor de transcripción, epitopos inmunogénicos,
terminador trancripcional y genes de resistencia a antibióticos y
replicación de origen bacteriano.
La expresión de los genes antiguos de HIV tal
como env y gag es dependiente de REV y
requiere que el elemento de respuesta de REV (RRE) esté
presente en el transcripto del gen vírico. Se puede generar una
forma secretada de gp120 en ausencia de REV mediante
sustitución del péptido líder gp120 con un líder heterólogo tal como
a partir de tPA (tejido - activador del plasminógeno tipo), y de
manera preferible mediante un péptido líder tal como el que se
encuentra en las proteínas de mamífero altamente expresadas tales
como los péptidos líder de inmunoglobulina. Hemos insertado un gen
quimérico tPA-gp120 en V1Jns que expresa de manera
eficiente la gp120 secretada en las células transfectadas (RD, una
línea de rabdomiosarcoma humano). La gp160 monocistrónica no produce
ninguna proteína tras la transfección sin la adición de un vector de
expresión REV.
Los componentes representativos de los
constructos incluyen (pero no se restringen a):
- 1.
- tPA-gp120_{MN};
- 3.
- gp160_{IIIB}
- 10.
- gagIIIB: para anti-gag de CTL;
- 11.
- tPA-gp120_{IIIB};
- 12.
- gp160 con mutaciones estructurales: supresiones o sustituciones de bucles V1, V2, y/o V3
- 20.
- genes que codifican antígenos expresados mediante diferentes patógenos que HIV, tales como, pero no limitándose a, nucleoproteína del virus de la gripe, hemaglutinina, matriz, neuroaminidasa, y otras proteínas antigénicas; genes del virus del herpes simple; antígenos del virus de la hepatitis A, B, o C.
La eficacia protectora de los inmunógenos de
polinucleótido de HIV frente a la subsiguiente estimulación vírica
se demuestra mediante la inmunización con el plásmido de ADN no
replicante de esta invención. Esto es ventajoso ya que no está
implicado el agente infeccioso, no se requiere la concurrencia de
las partículas de virus, y se permite la selección determinante.
Además, debido a que se conservan la secuencia de gag y la proteasa
y otros diversos productos de genes víricos entre diversas cepas de
HIV, se conserva la protección frente a la subsiguiente estimulación
por una cepa virulenta de HIV que es homóloga a, asi como las cepas
heterólogas de la cepa de la que se obtiene el gen clonado.
La inyección i.m. de un vector de expresión del
ADN que codifica la gp160 da como resultado la generación de
inmunidad protectora significativa frente a la subsiguiente
estimulación vírica. De manera particular, se producen los
anticuerpos específicos de gp160 y los CTL primarios. Las respuestas
inmunes dirigidas contra las proteínas conservadas pueden ser
efectivas a pesar del cambio antigénico e impulsar las proteínas de
envoltura variable. Debido a que cada uno de los productos de gen de
HIV presentan algún grado de conservación, y debido a que el CTL se
genera en respuesta a la expresión intracelular y al procesado de
MHC, es predecible que muchos genes de virus aumenten las
respuestas análogas que se han alcanzado para gp160. De esta manera,
se han clonado muchos de estos genes, tal como se muestra mediante
las uniones secuenciadas y clonadas en el vector de expresión (véase
a continuación) de tal manera que estos constructos son agente
inmunógenos en forma disponible.
La invención ofrece un medio para inducir
inmunidad protectora de cepa cruzada sin necesidad de agentes auto
replicantes o coadyuvantes. De manera adicional, la inmunización con
los polinucleótidos presentes ofrece otras numerosas ventajas. Esta
solución de vacunación debería ser aplicable a los tumores así como
a los agentes infecciosos, ya que la respuesta CD8^{+} CTL es
importante para los procesos patofisiológicos [K. Tanaka y col.,
Annu. Rev. Immunol. 6, 359 (1988)]. Por tanto, obtener una
respuesta inmune frente a una proteína crucial para el proceso de
transformación puede ser un medio efectivo de protección o
inmunoterapia frente al cáncer. La generación de un título alto de
anticuerpos frente a las proteínas expresadas tras la inyección de
la proteína vírica y el ADN de la hormona de crecimiento humano
sugiere que esto es un medio fácil y altamente efectivo para
fabricar vacunas basadas en anticuerpos, bien de manera separada o
en combinación con vacunas de linfocitos T citotóxicos dirigidas
hacia los antígenos conservados.
La facilidad de producir y purificar constructos
de ADN se compara de manera favorable con los procedimientos
tradicionales de purificación de proteínas, facilitando de esta
manera la generación de vacunas de combinación. De acuerdo con esto,
se pueden preparar constructos múltiples, que codifican por ejemplo
gp160, gp120, gp41 o cualquier otro gen de HIV, mezclados y
coadministrados. Debido a que se mantiene la expresión de la
proteína tras la inyección de ADN, se puede mejorar la persistencia
de la memoria de las células B- y T- , suscitando por tanto
inmunidad mediada humoral y celular de larga vida.
Las técnicas estándar de biología molecular para
preparar y purificar constructos de ADN permite la preparación de
los inmunógenos de ADN de esta invención. Aunque las técnicas
estándar de biología molecular son por tanto suficientes para la
producción de los productos de esta invención, los constructos
específicos descritos en el presente documento proporcionan nuevos
inmunógenos de polinucleótido que producen de manera sorprendente
cepas cruzadas y la neutralización del aislado de HIV primario, un
resultado por tanto inalcanzable con la vacunas de virus completo
inactivado estándar o subunidad de proteína.
La cantidad de ADN expresable o ARN transcrito a
introducir en una vacuna dependerá de la fuerza de los promotores de
transcripción y traducción usados y de la inmunogenicidad del
producto de gen expresado. De manera general, se administra
directamente una dosis inmunológica o profilácticamente efectiva de
aproximadamente 1 ng a 100 mg, y de manera preferible
aproximadamente 10 mg a 300 mg en el tejido muscular. Se contemplan
también la inyección subcutánea, introducción intradérmica e
impresión a través de la piel, y otros modos de administración tales
como intraperitoneal, intravenoso o liberación por inhalación. Se
contempla también que se proporcione el estímulo de las
vacunaciones. Tras la vacunación con inmunógenos de polinucleótido
de HIV, se contempla también la estimulación con inmunógenos de
proteína HIV tales como productos del gen de gp160, gp120 y
gag. Es también ventajosa la administración parenteral, tal
como por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea u otros medios
de administración de la proteína interleuquina-12,
en paralelo con o subsiguiente a la introducción parenteral del PNV
de esta invención.
El polinucleótido puede estar desnudo, es decir,
sin asociar con ninguna proteína, coadyuvante u otros agentes que
alteren el sistema inmune del huésped. En este caso, es deseable que
el polinucleótido esté en una solución fisiológicamente aceptable,
tal como, pero no limitándose a, solución salina estéril o solución
salina tamponada estéril. De manera alternativa, el ADN puede estar
asociado con liposomas, tales como liposomas de lecitina u otros
liposomas conocidos en la técnica, como una mezcla
ADN-liposoma, o el ADN puede estar asociado con un
coadyuvante conocido en la técnica para estimular las respuestas
inmunes, tales como una proteína u otro vehículo. Se pueden usar
también con ventaja agentes que asisten en la captación celular del
ADN, tales como, pero no limitándose a, iones de calcio. Estos
agentes se denominan de manera general en el presente documento como
reactivos facilitantes de la transfección y vehículos
farmacéuticamente aceptables. Se conocen en la técnica las técnicas
para recubrir microproyectiles recubiertos con polinucleótido y son
también útiles en conexión con esta invenciones. Se ofrecen los
siguientes ejemplos a modo de ilustración y no se pretende que
limiten la invención de ninguna manera.
Vectores pF411 y pF412: Estos vectores se
subclonaron a partir del vector pSP62 que se construyó en los
laboratorios R. Gallo. El pSP62 es un reactivo comercializado por
Biotech Research Laboratories, Inc. El pSP62 tiene un fragmento Xbal
de 12,5 kb del genoma HXB2 subclonado de lambda HXB2. La digestión
de pSP62 con SalI y Xba I da como resultado los fragmentos de HXB2:
5'-XbaI/SaII, de 6,5 kb y
3'-SaII/XbaI, de 6 kb. Se subclonaron estos insertos
en pUC 18 en los emplazamientos SmaI y SaII dando como resultado
pF411 (5'-Xbal/SaII) y pF412
(39-XbaI/SaII). PF411 contiene gag/pol
y PF412 contiene tat/rev/env/nef.
Rev (IIIB) recombinante,
#RP1024-10
Gp120 (IIIB) rec., #RP1001-10
Anticuerpo monoclonal anti-rev,
#RP1029-10
Anti-gp120 mAB,
#RP1010-10
Se diseñaron las estrategias para inducir las
respuestas a HIV de los linfocitos T citotóxicos y el anticuerpo
neutralizante dirigidas de manera principal a los productos del gen
de gag de HIV (conservado \sim un 95%) y env gp160 o
gp120; conservado un 70-80%). La gp160 contiene los
únicos epitopos de anticuerpos neutralizantes conocidos en la
partícula de HIV mientras se subraya la importancia de las
respuestas CTL anti-env y anti-gag mediante la
asociación conocida con el inicio de estas inmunidades celulares con
rotura de la viremia primaria seguida por infección, que se produce
antes de la aparición de los anticuerpos neutralizantes, así como un
papel para los CTL en el mantenimiento del estado libre de
enfermedad. Debido a que el HIV es notorio por su diversidad
genética, tenemos la esperanza de obtener anticuerpos de mayor
espectro que incluyan diversos genes env representativos
derivados de aislados clínicos y gp41 (conservado \sim un 90%),
mientras que el gen gag altamente conservado debería generar amplias
respuestas CTL de cepa cruzada.
Los genes estructurales de HIV tales como
env y gag requieren la expresión del gen regulador de
HIV, rev, con el fin de producir de manera eficiente
proteínas de longitud completa. Hemos encontrado que la expresión de
gag dependiente de rev da como resultado bajos niveles
de proteína, y que el propio rev puede ser tóxico para las
células. Aunque hemos conseguido niveles relativamente altos de
expresión de gp160 dependiente de rev in vitro, esta
vacuna estimula bajos niveles de anticuerpos contra gp160 tras la
inmunización in vivo con ADN de rev/gp160. Esto puede
dar como resultado los efectos citotóxicos conocidos de rev
así como un aumento de la dificultad en obtener la función de
rev en los miotúbulos que contienen cientos de núcleos (la
proteína rev necesita estar en los mismos núcleos como un
transcripto dependiente de rev para que se produzca la
expresión de la proteína gag o env). Sin embargo, ha
sido posible obtener la expresión independiente de rev usando
modificaciones seleccionadas de los genes de env y gag. Está
en marcha la evaluación de estos plásmidos con objetivo de
vacuna.
De manera general, nuestras vacunas han utilizado
principalmente genes env y gag de HIV (IIIB) para la
optimización de la expresión dentro de nuestro vector generalizado
de vacunación, ViJns, que está comprendido por un promotor temprano
inmediato (IE) de CMV, el emplazamiento de poliadenilación BGH, y un
pUC como espina dorsal. Se pueden conseguir eficiencias variables
dependiendo de cuan largo es el segmento de gen que se usa (por
ejemplo, gp120 frente a gp160) en la expresión de env
independiente de rev sustituyendo su péptido líder secretorio
nativo con el del gen activador del plasminógeno especifico del
tejido (tPA) y expresando el gen quimérico resultante detrás del
promotor CMVIE don el intrón A de CMV. TPA-gp120 es
un ejemplo de un vector gp120 secretado construido de esta manera
que funciona lo suficientemente bien como para estimular las
respuestas inmunes anti-gp120 en ratones y monos
vacunados.
Puesto que los informes acerca de las proteínas
ancladas a la membrana pueden inducir respuestas de anticuerpo mucho
más sustanciales (y quizás más específicas para la neutralización
con HIV en comparación con las proteínas secretadas así como para
ganar epitopos inmunes adicionales, se prepararon
V1Jns-tPA-gp160 y
V1Jns-rev/gp160. El tPA-gp160 produce
cantidades detectables de gp160 y gp120, sin la adición de
rev, tal como se muestra por el análisis inmunoblot de
células transfectadas, aunque los niveles de expresión son mucho
menores que los obtenidos para rev/gp160, un plásmido
dependiente de rev que expresa gp160. Esto es probablemente
debido a las regiones inhibitorias (designadas INS), que confiere
dependencia de rev sobre el transcripto de gp160, se producen
en emplazamientos múltiples dentro de gp160 que incluyen un terminal
de COOH de gp41 (véase esquema a continuación). Se preparó un vector
para una forma truncada de terminal COOH de
tPA-gp160, tPA-gp143, que se diseñó
para aumentar los niveles de expresión global de env mediante
eliminación de estas secuencias inhibitorias. El vector gpo143
elimina también las regiones gp41 intracelulares que contienen
motivos péptidos (tales como leu-leu) conocidos por
producir la desviación de las proteínas de membrana en los lisosomas
más bien que en la superficie de la célula. De esta manera, se puede
esperar que gp143 aumente la expresión de la proteína env
(disminuyendo la dependencia de rev) y la eficiencia de
transporte de la proteína en la superficie de la célula en
comparación con la longitud completa de gp160 donde estas proteínas
pueden ser más capaces de estimular los anticuerpos
anti-gp160 que siguen a la vacunación del ADN. Se
modificó tPA-gp143 de manera adicional mediante
mutagénesis silenciosa extensiva de la secuencia del elemento de
respuesta de rev (RRE). Este constructo, gp143/mutRRE, se
preparó de dos formas: bien eliminando (forma A) o reteniendo (forma
B) los emplazamientos de rotura proteolítica para gp120/41. Se
prepararon ambas formas debido a los informes bibliográficos de la
vacunación de ratones usando gp160 sin romper expresado en una
vacuna que estimula muco más los niveles de anticuerpos que las
formas gp160 preparadas rotas.
Se desarrolló un ELISA cuantitativo para la
expresión de gp160/gp120 en células transfectantes para determinar
las capacidades de expresión relativa de estos vectores. La
transfección in vitro de 293 células seguida por la
cuantificación de la gp120 asociada a las células frente a la
secretada/liberada dio los siguientes resultados: (1)
tPA-gp160 expresó entre 5 y 10 veces menos gp120 que
rev/gp160 con similares proporciones retenidas
intracelularmente respecto de las vehiculadas hacia la superficie
celular; (2) tPA-gp143 produjo 3-6
veces más secreción de gp120 que rev/gp160 con solamente
bajos niveles de gp143 asociado a células, confirmando que la cola
citoplasmática de gp160 origina la retención intracelular de gp120
que se puede resolver por el borrado parcial de esta secuencia; y,
(3) tPA-gp143/mutRRE A y B dieron 10 veces más
niveles de expresión de proteína de lo que lo hizo el pariente
tPA-gp143 aunque la eliminación de procesado
proteolítico se confirmó para la formación de A.
Así, nuestra estrategia de incrementar la
expresión independiente de rev ha producido incrementos
escalonados en la expresión global así como la redirección de la
gp143 anclada a la membrana hacia la superficie celular lejos de los
lisosomas. Es importante reseñar que debería ser posible insertar
secuencias gp120 en el interior de varios aislados víricos en el
interior de la cassette de un vector que contiene estas
modificaciones, que pueden residir en el extremo NH_{2} (líder
tPA) o extremo COOH (gp41), donde existen pocas diferencias
antigénicas entre distintas cepas víricas. En otras palabras, se
trata de un constructo genérico que se puede modificar con facilidad
insertando un gp120 derivado de diferentes aislados víricos
primarios para obtener vacunas clínicamente relevantes.
Para aplicar estas estrategias de expresión a los
virus que son relevantes para los objetivos de vacuna y confirmar la
generalidad de nuestras hipótesis también preparamos un vector
tPA-gp120 derivado a partir de un aislado primario
de HIV (conteniendo el bucle del péptido V3 norteamericano de
consenso; fenotipos macrófago-trópico e inductor sin
sincitio). Este vector produjo una elevada expresión/secreción de
gp120 con las 293 células transfectadas, y desarrolló anticuerpos
anti-gp120 en ratones demostrando que se clonaron de
forma funcional. Se usarán también los genes gp160 de un aislado
primario para la expresión de la misma forma que para la gp160
derivado de cepas de laboratorio.
Los monos Cercopiteco verde (AGM) y Rhesus (RHM)
que recibieron vacunas de ADN de gp120 mostraron bajos niveles de
anticuerpos neutralizantes tras 2-3 vacunaciones,
que no pudieron aumentarse con vacunación adicional. Estos
resultados así como una mayor conciencia en el campo de la
vacunación de HIV acerca de que la gp160 oligomérica es de manera
probable un antígeno diana para estimular anticuerpos neutralizantes
de los monómeros de gp120 (Moore y Ho, J. Virol. 67: 863 (1993), nos
han permitido centrarnos en la obtención de la expresión efectiva de
vectores basados en gp160 (véase anterior). Se vacunaron también
ratones y AGM con el aislado primario derivado de la vacuna de
tpA-gp120. Estos animales presentaron títulos de
anticuerpo de punto final recíprocos de péptido anti
V-3 (usando secuencias homólogas) que oscilaban
entre 500-500, demostrando que este diseño de vacuna
es funcional para aislados víricos clínicamente relevantes.
Las vacunas basadas en gp160, rev-gp160 y
tPA-gp160 fracasan en estimular de manera
consistente las respuestas de anticuerpos en ratones y primates no
humanos o dan como resultado títulos de anticuerpos bajos. Nuestros
resultados iniciales con el plásmido de tPA-gp143
dieron como resultado títulos de media geométrica > 10^{3} en
ratones y AGM tras dos vacunaciones. Estos datos indican que hemos
mejorado de manera significativa la inmunogenicidad de las vacunas
similares a gp160 aumentando los niveles de expresión. Este
constructo, así como los vectores tPA-gp143/mutRRE A
y B, continuará caracterizándose por respuestas de anticuerpo,
especialmente para la neutralización del virus.
De manera significativa, la vacunación con ADN de
gp120 produce potentes respuestas de células T auxiliares en todos
los compartimentos linfáticos ensayados (bazo, sangre, inguinal,
mesentérico y nódulos iliacos) con perfiles de secreción de
citoquina similares a T_{H}1 (es decir, producción de interferón g
e IL-2 con poco o sin IL-4). Estas
citoquinas promueven de manera general inmunidad celular fuerte y se
han asociado con el mantenimiento de un estado libre de enfermedad
para pacientes HIV seropositivos. Se han mostrado los nódulos
linfáticos por ser emplazamientos primarios para la replicación del
HIV, hospedando grandes reservorios de virus incluso cuando el virus
no puede detectarse de manera fácil en la sangre. Una vacuna que
puede estimular las respuestas inmunes anti-VIH en
una variedad de emplazamientos linfáticos, tal como hemos mostrado
con nuestra vacuna de ADN, puede ayudar a evitar la colonización con
éxito de los emplazamientos linfáticos que sigue a la infección
inicial.
Como hemos indicado anteriormente, consideramos
la realización de los siguientes objetivos eran esenciales para
maximizar bazas de éxito con este programa: (1) vectores basados en
env capaces de generar respuestas de anticuerpo neutralizante
más fuertes en primates; (2) los vectores gag y env
que estimulan las respuestas fuertes de los linfocitos T como se
caracteriza mediante los CTL y las funciones del efector auxiliar en
primates; (3) estimulan el uso de los genes de env y
gag procedentes de cepas de HIV-1
clínicamente relevantes; (4) la demostración de la protección en un
modelo de estímulo animal tal como el de Chimpancé/HIV (IIIB) o
Rhesus/SHIV usando vacunas optimizadas apropiadas; y, (5) la
determinación de la duración de las respuestas inmunes apropiadas
para el uso clínico. Se ha hecho un progreso significativo en los
tres primeros de estos objetivos y los experimentos siguen en
progreso para determinar si nuestros constructos de vacunación
reciente para gp160 y gag mejorarán tras estos resultados
iniciales.
Fue necesario eliminar el gen amp^{r} usado
para la selección con antibiótico de las bacterias que hospedad V1J
debido a que no se puede usar la ampicilina en fermentadores a gran
escala. Se eliminó el gen amp^{r} del pUC del esqueleto de V1J
mediante digestión con los enzimas de restricción SspI y Eam1105I.
El plásmido restante se purificó mediante electroforesis en gel de
agarosa, se enromó con T4 ADN polimerasa, y a continuación se trató
con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. El gen kan^{r}
comercialmente disponible, derivado del transposoma 903 y contenido
en el interior del plásmido pUC4K, se rompió usando el enzima de
restricción PstI, se purificó mediante electroforesis en gel de
agarosa, y se enromó con T4 ADN polimerasa. Este fragmento se ligó
con el V1J del esqueleto y los plásmidos con el gen kan^{r} se
derivaron en cualquier orientación que se designara como V1Jneo # s
1 y 3. Se confirmó cada uno de estos plásmidos mediante análisis con
digestión mediante enzima de restricción, secuenciando el ADN de las
regiones de unión, y se mostró que produce cantidades similares de
plásmido como V1J. La expresión de los productos de gen heterólogo
fue también comparable a V1J para estos vectores V1Jneo.
Seleccionamos de manera arbitraria V1Jneo#3, denominado a partir de
ahora en el presente documente como V1Jneo, que contiene el gen
kan^{r} en la misma orientación que el gen amp^{r} en V1J como
el constructo de expresión.
Se añadió un emplazamiento Sfi I a V1Jneo para
facilitar los estudios de integración. Se añadieron 13 pares de
bases Sfi enlazantes comercialmente disponibles (New England BioLabs
en el emplazamiento Kpn I en el interior de la secuencia BGH del
vector. Se linealizó V1Jneo con gel purificado de Kpn I, enromado
mediante T4 ADN polimerasa, y se ligó al enlazante Sfi I romo. Se
escogieron aislados clónicos mediante un mapeado de restricción y se
verificaron mediante secuenciamiento a través del enlazante. Se
designó el nuevo vector V1Jns. La expresión de los genes heterólogos
en V1Jns (con Sfi I) fue comparable a la expresión de los mismos
genes en V1Jneo (con Kpn I).
Con el fin de proporcionar una secuencia de
péptido líder heteróloga para proteínas de membrana y/o secretadas,
se modificó V1Jn para incluir el activador del plasminógeno
específico del tejido humano (tPA) líder. Se templaron dos
oligómeros complementarios sintéticos y a continuación se ligaron en
V1Jn que había sido digerido con BgIII. Los oligómeros sentido y
antisentido fue 5'-GATC ACC ATG GAT GCA ATG
AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG
CCC AGC GA-3', SEC. ID:18, y 5'-GAT
CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG
CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT CGT-3'. Se subraya la
secuencia Kozak en el sentido del oligómero. Estos oligómeros bases
sobresalientes compatibles para la ligadura con las secuencias rotas
mediante BgIII. Tras la ligadura se destruye el emplazamiento de
BgIII corriente arriba mientras se retiene el de BgIII corriente
abajo para ligaduras subsiguientes. Se verificaron los
emplazamientos de unión así como la secuencia líder de tPA completa
mediante el secuenciamiento del ADN. De manera adicional, con el fin
de conformar con nuestro consenso el vector optimizado V1Jns (=
V1Jneo con un emplazamiento Sfil), se colocó un emplazamiento de
restricción Sfil en el emplazamiento KpnI en el interior de la
región del terminador BGH de V1Jn-tPA mediante
enromado del emplazamiento KpnI con t4 ADN polimerasa seguido por
ligadura con un enlazante SfiI (catálogo #1138, New Englands
Biolabs) Esta modificación se verificó mediante digestión por
restricción y electroforesis en gel de agarosa.
Se llevó a cabo la expresión del gen de
env dependiente de REV como gp120 como sigue: gp120
se clonó mediante PCR a partir de la cepa MN de HIV con cualquiera
de las secuencias péptido líder nativas
(V1Jns-gp120), o como una fusión con el péptido
líder activador del plasminógeno del tejido (tPA) sustituyendo el
péptido líder nativo
(V1Jns-tPA-gp120) Se ha mostrado la
expresión de tPA-gp120 por ser independiente de
REV [B.S. Chapman y col., Nuc. Acids Res. 19, 3979
(1991); debería señalarse que otras secuecias líder proporcionarían
una función similar en volver independiente de REV el gen de
gp120]. Esto se llevó a cabo preparando los siguientes constructos
de gp120 utilizando los vectores anteriormente descritos.
Se amplificó mediante PCR el gen HIV_{MN} gp120
(Medimmume) usando oligómeros diseñados para eliminar los primeros
30 aminoácidos de la secuencia del péptido líder y para facilitar la
clonación en V1Jns-tPA creando una proteína
quimérica constituida por el péptido líder tPA seguido por el resto
de secuencias gp120 seguido por 30 residuos de aminoácido. Este
diseño permitió la expresión de gp120 independiente de REV y
la secreción de gp120 soluble a partir de células que hospedan este
plásmido. Los oligómeros sentido y antisentido de PCR usados fueron
5'-CCC CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TGGGTC ACA
GTC-3', y 5'-c CCC AGG AATC CAC CTG
TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT C-3'.
Se subraya el códon de detención de la traducción. Estos oligómeros
contienen los emplazamientos del enzima de restricción BamHI en
cualquier extremo del marco abierto de lectura y traducción con un
emplazamiento BcII localizado en 3' del BamHI del oligómero sentido.
Se digirió de manera secuencial el producto de PCR con BcII seguido
por BamHI y se ligó en V1Jns-tPA que se ha digerido
con BgIII seguido por tratamiento con fosfatasa alcalina de
intestino de ternero. Se secuenció el vector resultante para
confirmar la fusión en marcos entre la secuencia de codificación del
tPA líder y la gp120, y la expresión y secreción de gp120 se
verificaron mediante análisis inmunoblot de las células RB
transfectadas.
Este vector es análogo a I. A. excepto en que la
cepa de HIV IIIB se usó para la secuencia de gp120. Los oligómeros
sentido y antisentido de PCR usados fueron: 5'-CGT
ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3', y
5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT CTG
CAC CAC TCT TC-3', de manera respectiva. Estos
oligómeros proporcionan emplazamientos BcII en cualquier extremo del
inserto así como un EcoRV justo corriente arriba del emplazamiento
BcII en el extremo 3'. El emplazamiento BcII 5' terminal permite la
ligadura en el emplazamiento BgIII de V1Jns-tPA para
crear un gen tpA-gp120 quimérico que codifica la
secuencia líder de tPA y gp120 sin su secuencia líder nativa. Se
verificaron los productos de la ligadura mediante digestión por
restricción y secuenciamiento del ADN.
Se prepararon estos constructos mediante PCR de
manera similar como tPA-gp120 con el tPA líder en
lugar del líder nativo, pero diseñado para producir antígeno
secretado mediante terminación inmediata del gen
NH_{2}-terminal del péptido de la transmembrana
(secuencia del aminoácido carboxiterminal proyectado =
NH_{2}-.....TNWLWYIK-COOH). A diferencia de los
constructos que producen gp120, los constructos de gp140 deberían
producir antígeno oligomérico y retener epitopos de neutralización
del anticuerpo contenido en gp41 conocido tales como ELDKWA definido
mediante el anticuerpo monoclonal 2F5.
Se prepararon los constructos de dos formas (A o
B) dependiendo de si los emplazamientos de rotura proteolítica de
gp160 en la unión de gp120 y gp41 se retenían (B) o eliminaban (A)
mediante sustituciones de aminoácidos apropiadas tal como se
describe por Kieny y col., (Prot. Eng. 2:
219-255 (1988)) (secuencia de tipo salvaje =
NH_{2}-...KAKRRVVQREKR...COOH y la secuencia mutada =
NH_{2}-...KAQNHVVQNEHQ...COOH con los
aminoácidos mutados subrayados).
Se obtuvo este constructo mediante PCR usando el
siguiente sentido y anti sentido de los oligómeros de PCR:
5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG
CTC TGG-3', SEC. ID. :, y 5'-CGC AGG
GGA GGT GGT CTA GAT ATC TTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT
G-3' para obtener un segmento AvrII/EcoRV del vector
IVB (que contiene el segmento optimizado de RRE-A).
El 3'-UTR, preparado como un segmento de gen
sintético, que se deriva del Retrovirus-1 de Simios
(SRV-1, véase a continuación) se insertó en un
emplazamiento del enzima de restricción SrfI introducido de manera
inmediata en 3' del marco de lectura abierto de gp140. Esta
secuencia UTR ha sido descrita anteriormente como facilitante de la
expresión independiente de rev de env y gag de
HIV.
Este constructo es similar a IIA excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica de env se han
retenido usando el constructo IVC como material de partida.
Se derivó este constructo de IVB mediante
digestión del enzima de restricción AvrII y SrfI seguido por
ligadura de un segmento de ADN sintético que corresponde a gp30 pero
comprendido por codones óptimos para la traducción (véase
gp32-opt a continuación). El ADN de
gp30-opt se obtuvo de gp32-opt
mediante amplificación del PCR usando el siguiente sentido y anti
sentido de los oligómeros: 5'-CGT ACA CCT AGG CAT
CTG GGG CTG CTC TGG-3'; y, 5'-CCA
CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GGT GAT
G-3', de manera respectiva. Este segmento de ADN se
digirió con enzimas de restricción AvrII y EcoRV y se ligó en
V1Jns-tPA-gp143/opt32-A
(IVD) que ha sido digerido con AvrII y SrfI para eliminar el
segmento de ADN correspondiente. Los productos resultante se
verificaron mediante secuenciamiento del ADN de la ligadura de las
uniones y análisis inmunoblot.
Este constructo es similar a IIC excepto en que
se han retenido los emplazamientos de rotura proteolítica de
env.
El gen env de este constructo está
comprendido de manera completa por codones óptimos. Las regiones
constantes (C1, C5, gp32) son aquellas descritas en IVB, D, H con un
segmento de ADN sintético adicional que corresponde a las regiones
variables 1-5 se insertan usando un segmento de ADN
sintético comprendido por codones óptimos para la traducción (véase
ejemplo a continuación basándose en HIV-1 MN
V1-V5).
Este constructo es similar a IIE en se han
retenido los emplazamientos de rotura proteolítica de
env.
Este constructo es similar al IIE anterior
excepto en que se usan secuencias de aminoácidos de env a
partir de otras cepas que IIIB para determinar la utilización del
códon óptimo a través de las regiones variables
(V1-V5).
Este constructo es similar a IIG, excepto en que
se han retenido los emplazamientos de rotura proteolítica de
env.
env.
Los constructos se prepararon de dos formas (A y
B), dependiendo de los emplazamientos de rotura proteolítica de la
gp160 que se han descrito anteriormente.
Este vector es una variación del que se describe
en la sección D anterior, excepto en que la región de codificación
completa tat del exón 1 de borra hasta el principio del marco
abierto de lectura REV. Se digirió el
V1Jns-gp160_{IIIB} (ver la sección A anterior) con
los enzimas de restricción PstI y KpnI para eliminar la región 5'
del gen de gp160, Se usó la ampliación mediante PCR para obtener un
segmento de ADN que codificaba el primer exón REV hasta el
emplazamiento KpnI en la gp160 desde el clon genómico HXB2. Los
oligómeros PCR sentido y anti sentido fueron 5'-GGT
ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC-3, y
5'-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG
ACC-3', respectivamente. Estos oligómeros
proporcionan los emplazamientos de los enzimas de restricción PstI y
KpnI en los extremos 5'- y 3'- del fragmento de ADN,
respectivamente. El ADN resultante se digirió con PstI y KpnI, se
purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, y se ligó con
V1Jns-gp160 (PstI/KpnI). El plásmido resultante se
verificó por digestión con enzimas de restricción.
El HIV_{IIIb} gp160 se clonó mediante
amplificación PCR a partir del plásmido pF412 que contiene la mitad
3'-terminal del genoma HIV_{IIIb} derivado del
clon HIVIIIB de HXB2. Los oligómeros PCR sentido y anti sentido
fueron 5'-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG
GAC AAA TAT CAG C-3', y 5'-CCA CAT
TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC
C-3' respectivamente. La secuencia de Kozak y el
codon de fin de traducción se muestran subrayados. Estos oligómeros
proporcionan los emplazamientos del enzima de restricción BcII fuera
del marco de lectura de traducción abierta en ambos extremos del gen
env. (los emplazamientos digeridos con BcII son compatibles
por ligadura con los emplazamientos digeridos con BgIII así como por
los emplazamientos BamHI). El oligómero anti sentido también inserta
un emplazamiento EcoRV justo antes del emplazamiento BcII, tal como
se ha descrito anteriormente con otros genes derivados mediante PCR.
El gen de gp160 amplificado se purificó en gel de agarosa, se
digirió con BcII y se enlazó con V1Jns que se había digerido con
BgIII y tratado con fosfatasa alcalina de intestino de ternera. El
gen clonado tuvo un tamaño aproximado de 2,6 kb, y cada unión de la
gp160 con el V1Jns se confirmó mediante secuenciamiento de ADN.
Este vector es similar al del Ejemplo 1(C)
anterior, mediante PCR el excepto en que se obtuvo gp160 de longitud
completa, sin la secuencia líder nativa. El oligómero con sentido es
el mismo que el usado en I.C., y el oligómero anti sentido fue
5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT
CCT TTC C-3'. Estos oligómeros proporcionan
emplazamientos BcII tanto al final del inserto como un EcoRV justo
aguas arriba del emplazamiento BcII en el extremo 3'. El
emplazamiento BcII 5'-terminal permite la ligadura
en el emplazamiento BgIII de V1Jns-tPA para crear
un gen quimérico tPA-gp160 que codifica la secuencia
líder tPA y gp160 sin su secuencia nativa líder. Los productos de
ligazón se verificaron mediante enzimas de restricción y
secuenciamiento de ADN.
Este constructo se basó en IVH, teniendo un
segmento de codon completo optimizado para C5 y gp41, mejor que para
gp32, con un segmento de codon completo optimizado adicional (ver
más adelante) que sustituye a C1 en el término amino de la gp120 que
sigue al líder tPA. El nuevo segmento C1 se junto al resto del
segmento gp143 mediante SOE PCR usando los siguientes oligómeros de
PCR para sintetizar el segmento unido C1/143 5'-CCT
GTG TGT GAC TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT
AC-3'. El gen de gp143 resultante contiene el uso
óptimo del codon, excepto las regiones V1-V5, y
tiene un único emplazamiento del enzima de restricción PmeI en la
unión de C1 y V1 para la inserción de regiones variables procedentes
de otros genes HIV.
Este constructo es similar a IIID excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica env se han
retirado.
El gen env de este constructo está
comprendido completamente por los codones óptimos anteriormente
descritos. Las regiones constantes (C1, C5, gp32) son las que se
describen en IIID,E que se usan como cassette (empleado para la
gp160s completamente optimizado), mientras que las regiones
variables, V1-V5, se derivan de un segmento de ADN
sintético comprendido por codones óptimos.
Este constructo es similar a IIIF excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica env se han
retirado.
Este constructo es similar a IIIF anterior
excepto en que se usaron las secuencias de aminoácidos env
procedentes de cepas distintas a IIIB para determinar el uso optimo
del codon a través de las regiones variables
(V1-V5).
Este constructo es similar a IIIH excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica env se han
retirado.
Estos constructos se prepararon mediante PCR de
manera similar al resto de constructos que contienen tPA descritos
anteriormente (tPA-gp120, tPA-gp140,
y tPA-gp160), con el líder tPA en lugar de la nativa
líder, pero diseñada para producir env terminado en COOH
ligado a la membrana (secuencia de aminoácidos celular proyectada =
NH2-NRVRQGYSP-COOH). Este constructo
se diseño con el objetivo de combinar la expresión aumentada de
env que acompaña la introducción de tPA, y minimizar la
posibilidad de que un transcripto o región del péptido
correspondiente a la porción intracelular de env podría
afectar negativamente a la expresión o estabilidad/trasporte de la
proteína hasta la superficie celular. Los constructos se prepararon
de dos formas (A y B), dependiendo de los emplazamientos de rotura
proteolitica de la gp160 como se han descrito anteriormente. El
fragmento residual gp41 que resulta del truncamiento de gp143 se
denomina gp32.
Este constructo se preparó mediante PCR usando el
plásmido pF412 con los siguientes oligómeros PCR sentido y anti
sentido 5'-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC
ACA GTC-3', ID DE SEC..:, y 5'-CCA
CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT
CAC-3'. El segmento de ADN resultante contiene el
emplazamiento de restricción BcII en ambos extremos para clonación
en el V1Jns-tPA/digerido con BgIII con un
emplazamiento SrfI localizado inmediatamente 3'- al marco abierto de
lectura env. Los constructos se verificaron mediante
secuenciamiento de ADN de las uniones de ligadura y análisis por
inmunoblot de las células transfectadas.
Este constructo estuvo basado en el IVA
Rompiendo el segmento de ADN usando el único
emplazamiento del enzima de restricción MunI y el emplazamiento SrfI
situado aguas abajo anteriormente descrito. Este segmento
corresponde a una porción gp120 del dominio C5, y la gp32 completo.
Un segmento de ADN sintético correspondiente al elemento de
respuesta rev de 350 bp (RRE A) de la gp160, comprendido por
codones óptimos de traducción, se juntó con el resto del segmento
gp32 mediante PCR de extensión solapada de uniones (SOE) creando un
emplazamiento del enzima de restricción AvrII en la unión de los dos
segmentos (pero sin cambios en la secuencia de aminoácidos). Estas
reacciones PCR se llevaron a cabo usando los mismos oligómeros
sentido y anti sentido que para usar la región que contenía gp32
5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG
CTG TGG-3' y 5'-CCA CAT TGA TCA G
CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT
CAC-3' (que se usó como oligómero anti sentido para
IVA), respectivamente. El segmento RRE mutado
(mutRRE-A) se junto con la secuencia salvaje de gp32
mediante SOE PCR usando el siguiente oligómero con sentido
5'-GGT ACA CAA TTG GAC GAC CGA GTT ATA TAA
ATA TAA G-3' y el oligómero anti sentido usado para
fabricar el segmento gp32. El segmento de ADN unido resultante se
digirió con los enzimas de restricción MunI y SrfI y se ligó en el
plásmido digerido pariente gp143/MunI/SrfI. El constructo resultante
se verifico por secuenciamiento de ADN de la ligadura, y mediante
análisis SOE PCR de las uniones e inmunoblot de las células
transfectadas.
Este constructo es similar a IVB excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido
usando el segmento del gen sintético mutRRE-B en
lugar de mutRRE-A.
\newpage
Este constructo se derivó a parir de IVB mediante
digestión con los enzimas de restricción AvrII y Srfl seguido de
ligadura con un segmento sintético de ADN que corresponde a gp32,
pero que comprendo codones óptimos para traducción (ver gp32 opt,
más adelante). Los productos resultantes se verificaron mediante
secuenciamiento de ADN de las uniones de ligadura y análisis por
inmunoblot.
Este constructo es similar a IVD excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica env se han retenido
usando IVC como plásmido inicial.
Este constructo es similar a IVA excepto en que
el 3'-UTR derivado del Retrovirus-1
de simio (SRV-1, ver más adelante) se insertó en el
emplazamiento del enzima de restricción SrfI introducido
inmediatamente 3'- después de marco de lectura abierta gp143. Esta
secuencia UTR se ha descrito anteriormente como facilitador de la
expresión independiente de rev del env y gac de
HIV.
Este constructo se basó en IVD, teniendo un
segmento codon completo optimizado para C5 y gp32 con un segmento
codon completo optimizado adicional (ver más adelante) sustituyendo
C1 en el extremo terminal de la gp120 siguiendo el líder tPA. El
nuevo segmento C1 se unió al segmento gp143 restante mediante SOE
PCR usando los siguientes oligómeros para sintetizar mediante PCR el
segmento unido C1/143 5'-CCT GTG TGT GAC TTT
AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. El
gen de gp143 resultante contiene el codon de uso óptimo, excepto por
las regiones V1-V5 y tiene un único emplazamiento
del enzima de restricción PmeI colocado en la unión de C1 y V1 para
la inserción de regiones variables procedentes otros genes HIV.
Este constructo es similar a IVH excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica env se han
retenido.
El gen env de este constructo esta
comprendido completamente por codones óptimos. Las regiones
constantes (C1, C5, gp32) son los que se describen en 4B,D,H con un
segmento adicional sintético correspondiente a las regiones
variables V1-V5 insertado usando un segmento
sintético de ADN comprendido por codones óptimos para la
traducción.
traducción.
Este constructo es similar a IVJ excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica env se han
retenido.
Este constructo es similar a IIIG anterior
excepto en que se usaron secuencias de aminoácidos env
procedentes de cepas diferentes a IIIB para determinar codones de
uso optimo a través de las regiones variables
(V1-V5).
Este constructo es similar a IIIG anterior
excepto en que se usaron secuencias de aminoácidos env
procedentes de cepas diferentes a IIIB para determinar codones de
uso optimo a través de las regiones variables
(V1-V5).
Estos constructos se prepararon mediante PCR de
manera similar al resto de constructos que contienen tPA descritos
anteriormente (tPA-gp120, tPA-gp140,
tPA-gp143, y tPA-gp160), con el
líder tPA en lugar de la nativa líder, pero diseñada para producir
env terminado en COOH ligado a la membrana, como gp143. Sin
embargo, los constructos gp143/glyB difieren de gp143 en que los
seis aminoácidos proyectados para comprender la región del péptido
intracelular, los últimos 4 son iguales que los que tienen el
extremo carboxilo de la glicoforina humana (glyB) (secuencia de
aminoácidos intracelular proyectada =
NH_{2}-NRLIKA-COOH, con los residuos
subrayados correspondientes a glyB y "R" comunes tanto a
env como a gly). Este constructo se diseñó con el objetivo de
conseguir más expresión de env y visando directamente la
superficie celular eliminando completamente cualquier transcripto o
región del péptido correspondiente a la porción intracelular de
env que podría afectar negativamente a la expresión o
estabilidad/trasporte de la proteína hasta la superficie celular,
sustituyendo esta región por una secuencia de péptido procedente de
una proteína abundantemente expresada (glyB), que tiene una región
citoplasmática corta (secuencia de aminoácidos intracelular =
NH_{2}-RRLIKA-COOH). Los constructos se
prepararon de dos formas (A y B), dependiendo de cómo los
emplazamientos de rotura proteolitica de la gp160 se han eliminado o
retenido, como se ha descrito anterior-
mente.
mente.
Este constructo es el mismo que IVD excepto en
que se usó el siguiente oligómero anti sentido PCR para sustituir la
región del péptido intracelular gp143 con el de la glicoforina B que
se ha descrito anteriormente: 5'-CCA CAT GAT ATC G
CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CAC AAT GGA CAG CAC
AGC-3.
Este constructo es similar a VA excepto en que en
que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han
retenido.
Este constructo es similar a VA, excepto que la
primera región constante (C1) de gp120 se sustituye por los codones
óptimos para la traducción como en IVH.
Este constructo es similar a VC excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica env se han
retenido.
El gen env de este constructo esta
comprendido enteramente por codones óptimos, tal como se ha descrito
anteriormente.
Este constructo es similar a VE excepto en que
los emplazamientos de rotura proteolítica env se han
retenido.
Este constructo es similar a IIIG anterior
excepto en que se usaron secuencias de aminoácidos env
procedentes de cepas diferentes a IIIB para determinar codones de
uso optimo a través de las regiones variables
(V1-V5).
Este constructo es similar a VG excepto que en
que los emplazamientos de rotura proteolítica env se han
retenido.
Estos constructos pueden incluir todas las formas
env anteriormente relacionadas (gp120, gp140, gp143, gp160,
gp143/glyB) pero tiene bucles variables en el interior de la región
gp120 borradas durante la preparación de (por ejemplo, V1, V2, y/o
V3). El objetivo de estas modificaciones es eliminar los segmentos
de péptido que pueden ocluir la exposición de los epitopos de
neutralización conservados tales como el emplazamiento de enlace
CD4. Por ejemplo, se uso el siguiente oligómero en una reacción PCR
para crear un borrado V1/V2 que resulta de juntar los segmentos C1 y
C2: 5'-CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGT
AAC ACC TCA GTC ATT ACA
CAG-3.
CAG-3.
Los segmentos de gen se convirtieron en
secuencias que tenias idénticas secuencias traducidas/excepto donde
se indica), pero con un uso alternativo del codon como define R.
Lathe en un artículo de investigación J. Molec. Biol. Vol.
183, pp. 1-12 (1985) entitled "Synthetic
Oligonucleotide Probes Deduced from Aminoácido Sequence Data:
Theoretical y Practical Considerations". La metodología que se
describe más adelante para incrementar la expresión independiente de
rev de los segmentos de genes env de HIV se basó en
nuestra hipótesis que la conocida incapacidad para expresar este
gene de forma eficaz en células de mamífero es consecuencia de la
composcion del transcripto global. Así, usando codones alternativos
que codifican la misma secuencia de proteína se pueden eliminar las
restricciones de la expresión de env en ausencia de
rev. La inspección del utilización del códon en el interior
de env revela que un elevado porcentaje de codones están
entre los que se usan de forma infrecuente por los genes humanos
altamente expresados. El procedimiento de sustitución específica del
codon se puede describir como siguen, empleando los datos de Lathe
y col.:
- 1.
- Identificar la localización de codones para un marco de lectura abierta adecuado.
- 2.
- Comparar los codones de tipo salvaje respecto de las de las frecuencias observadas de uso por los genes humanos (se referencia a la Tabla 3 de Lathe y col.).
- 3.
- Si el codon no es el que se emplea más habitualmente, se sustituye por un codon óptimo para una expresión elevada basada en los datos de la Tabla 5.
- 4.
- Inspeccionar el tercer nucleótido del nuevo codon, y el primer nucleótido del codon adyacente inmediatamente 3'- del primero. Si se ha creado un par 5'-CG-3' por la nueva selección del codon, sustituirlo por la elección indicada en la Tabla 5.
- 5.
- Repetir este procedimiento hasta que se haya sustituido la secuencia completa del gen.
- 6.
- Inspeccionar la secuencia del nuevo gen respecto de las secuencias indeseables generadas por estas sustituciones del codon (por ejemplo, secuencias "ATTTA", creación inadvertida de emplazamientos de unión de intrones, emplazamientos no deseados de enzimas de restricción, y sustituir los codones que eliminan estas secuencias.
- 7.
- ensamblar los segmentos de los genes sintéticos, y ensayar la expresión mejorada.
Estos procedimientos se usaron para crear los
siguientes segmentos del gen sintético del env de HIV creando
un gen enteramente comprendido por el uso de codones óptimos para la
expresión (i) gp120-C1 (opt); (ii)
V1-V5 (opt); (iii) RRE-A/B (mut ó
opt); y (iv) gp30 (opt) con porcentajes de sustitución de
codon/sustituciones de nucleótido de 56/19, 73/26, 78/28, y 61/25
obtenidos para cada segmento, respectivamente. Cada uno de estos
segmentos se ha descrito en detalle anteriormente, listándose a
continuación las secuencias reales.
Se trata de una región constante 1 (C1) del
segmento de gen de gp120 procedente del V1 desde el extremo N hasta
el principio, diseñado para tener un uso optimo del codon para
expresión.
\newpage
Se trata de un segmento de gen que corresponde a
la secuencia de la proteína derivada de HIV MN V1-V5
(1066BP) que tiene un uso óptimo del codon para expresión
\vskip1.000000\baselineskip
Se trata de un segmento de Y que corresponde al
elemento de respuesta rev (RRE) de HIV-1 que
comprende el uso optimo del codon para expresión. La forma "A"
se ha eliminado también mediante los emplazamientos de rotura
proteolítica en las uniones gp120/gp41 usando los nucleótidos
indicados en negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se trata de un segmento de Y que corresponde al
elemento de respuesta rev (RRE) de HIV-1 que
comprende el uso optimo del codon para expresión. La forma "B"
retiene los emplazamientos de rotura proteolítica en las uniones
gp120/gp41.
Se trata de un segmento del gen de gp32
procedente del emplazamiento AvrII (que comienza inmediatamente al
final del RRE) hasta el extremo de la gp143 comprendido por los
codones óptimos para la expresión.
Se trata de un segmento del gen sintético que
corresponde a 3'-UTR procedente del
Retrovirus-1 de genoma de simio. Este ADN está
colocado en la siguiente orientación en el extremo 3'- de los genes
HIV para incrementar la expresión independiente de rev.
Este segmento de gen sintético es idéntico al
SRV-1 CTE (A) mostrado anteriomente, excepto en que
se uso una única mutación del nucleótido (que se indica en negrita)
para eliminar una secuencia ATA. Se ha asociado esta secuencia con
una mayor sustitución de ARNm.
La expresión In vitro se ensayó en células
de rabdomiosarcoma (RD) humanas transfectadas respecto de estos
constructos. La cuantificación de la tPA-gp120
secretada procedente de las células RD transfectadas mostró que el
vector V1Jns-tPA-gp120 produjo gp120
segregado.
Ver la Fig. 12 (datos de ratón)
Se sacrificaron ratones Balb/c que se habían
vacunado dos veces con 200 \mug de
V1Jns-tPA-gp120MN, y se extrajeron
sus bazos para las determinaciones in vitro de las
reactividades de los linfocitos T auxiliares respecto de la gp120
recombinante. Se llevaron a cabo los ensayos de proliferación de
células T con PBMC (células mononucleares de la sangre periférica)
usando gp120IIIB recombinante (Repligen, catalogo
#RP1016-20) a 5 \mug/ml usando 4 x 10^{5}.
células/ml. Se obtuvieron los niveles basales de captación de
^{3}-timidina cultivando las células solamente en
medio, a la vez que se inducía la máxima proliferación con
estimulación con 2 \mug/ml de ConA. Las reactividades inducidas
con ConA alcanzaron el máximo a \sim3 días, y se recogieron en ese
momento, con muestras con medio de control a la vez que las muestras
tratadas con antígeno se recogieron a los 5 días con más medio de
control. Las respuestas de los ratones vacunados se compararon con
ratones singénicos de edad similar. Los controles ConA positivos
produjeron una proliferación elevada, tanto para los ratones
inmunizados como no inmunizados. Se obtuvieron respuestas de memoria
en células auxiliares T4 fuertes con el tratamiento con gp120 en los
ratones vacunados, mientras que los ratones no inmunizados no
presentaron respuesta (el umbral de la reactividad específica es un
índice de estimulación (SI) de >3-4; el SI se
calcula como la relación entre cpm de la muestra/cpm del medio. Se
obtuvieron SI de 65 y 14 para los ratones vacunados, cuando se les
compara con los títulos ELISA anti-gp120 de 5.643 y
11.900, respectivamente, para estos ratones. De forma interesante,
para estos dos ratones, el mayor respondedor al anticuerpo produjo
una reactividad de células T significativamente inferior a del ratón
que tenia el menor titulo de anticuerpos. Este experimento demuestra
que el vector gp120 secretado activa de forma eficiente las células
auxiliares T tanto in vivo como in vitro, ya que
genera fuertes respuestas de anticuerpo. Además, cada uno de estas
respuestas inmunes se determino usando un antígeno que era
heterólogo, comparado con la que se codifica mediante la inoculación
de PNV
(IIIB vs. MN):
(IIIB vs. MN):
Además de los constructos gp120 secretados, hemos
preparado constructos de expresión para la gp160 de longitud
completa enlazado a la membrana. Las razones de un constructo gp160,
además de la gp120, son (1) más epitopos disponibles, tanto para la
estimulación de CTL como para la producción de anticuerpos
neutralizantes que incluyen gp41, frente al que se dirige un potente
anticuerpo monoclonal de HIV (2F5, ver más adelante); (2) se puede
obtener una estructura de proteína más nativa respecto al gp160
producido por virus; y, (3) el éxito de los constructos HA de la
gripe ligados a la membrana respecto de la inmunogenicidad [Ulmer
et al., Science 259:1745-1749, 1993;
Montgomery, D., et al., DNA y Célula Biol.,
12:777-783, 1993]. La gp160 retiene sustancialmente
la dependencia REV incluso con una secuencia líder de péptido
heterólogo, de forma que se fabricaron más constructos para
incrementar la expresión en ausencia de REV.
Los procedimientos descritos en esta sección
ilustran el ensayo usado para ratones vacunados. Se puede usar un
ensayo similar en lo esencial con primates, salvo que las líneas de
células B autólogas deben establecerse para uso como células diana
para cada animal. Esto se puede llevar a cabo para seres humanos
usando el virus Epstein-Barr y para mono rhesus, el
virus del herpes B.
Se derivaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) se tanto de sangre recientemente extraída como de
bazo usando centrifugación de Ficoll-Hypaque para
separar los eritrocitos de los glóbulos blancos. Para los ratones,
se pueden usar también los ganglios linfáticos. Se pueden preparar
los efectores CTL a partir de los PBMC mediante tanto cultivo in
vitro en L-2 (20 U/ml) y concanavalina A (2
\mug/ml) durante 6-12 días o usando un antígeno
específico que emplea un número igual de células que presentan
antígeno irradiado. El antígeno específico puede consistir tanto de
péptidos sintéticos (9-15 aminoácidos normalmente)
que son epitopos conocidos para el reconocimiento de CTL en los
haplotipos MHC de los animales usados, o constructos del virus
vaccinia diseñados para expresar el antígeno apropiado. Las células
diana pueden ser líneas celulares tanto singénicas como emparejadas
con el haplotipo MHC que se han tratado para presentar el antígeno
apropiado, como se describe para la estimulación in vitro de
los CTL. Para los ratones Balb/c, se puede usar el péptido P18
(ArgIIeHisIIeGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn, ID DE SEC.: 51.,
para la cepa MN de HIV) en concentración 10 \muM para reestimular
el CTL in vitro usando esplenocitos singenéticos irradiados,
y se puede usar para sensibilizar células diana durante el ensayo de
citotoxicidad a 1-10 \muM por incubación a 37ºC
durante aproximadamente dos horas antes del ensayo. Para este
haplotipo de ratón MHC, H-2^{d}, la línea de
células de mastotitoma de murina P815 proporciona buenas células
diana. Las células diana sensibilizadas al antígeno se cargan con
Na^{51}CrO_{4}, que se libera desde el interior de las células
diana tras matarlas con CTL, por incubación de las dianas durante
1-2 horas a 37ºC. (0,2 mCi para \approx 5 x
10^{6} células), seguido por varios lavados de las células diana.
Las poblaciones CTL se mezclaron con las células diana en relaciones
diferentes de efector a diana, tales como 100:1, 50:1, 25:1, etc.,
se peletizaron conjuntamente, y se incubaron durante
4-6 horas a 37ºC antes de recoger los sobrenadantes,
que a continuación se ensayaron respecto de la liberación de
radioactividad usando un contador gamma. Se calculó la citotoxicidad
en forma de cuentas que se pueden liberar desde las células diana
(que se pueden obtener usando tratamiento con Triton
X-100 al 0,2%) del que se había restado la
liberación espontánea procedente de las células diana.
Se diseño ELISA para detectar los anticuerpos
generados frente a HIV usando tanto proteína recombinante específica
o péptidos sintéticos como antígenos sustrato. Re recubrieron placas
de microvaloración de 96 pocillos a 4ºC durante toda la noche con el
antígeno recombinante a 2 \mug/ml en solución PBS (solucion salina
de fosfato tamponada) usando 50 \mul/pocillo, en una plataforma
oscilante. Los antígenos consistieron tanto en proteína recombinante
(gp120, rev: Repligen Corp.; gp160, gp41: American
Bio-Technologies, Inc.) o péptido sintético (péptido
V3 correspondiente a secuencias de aislado de virus a partir de
IIIB, etc.: American Bio-Technologies, Inc.; epitopo
gp41: American Bio-Technologies, Inc; epitopo gp41
del anticuerpo monoclonal 2F5). Las placas se lavaron dos veces con
tampón de lavado (PBS/Tween 20 al 0,05%) seguido por la adición de
200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo (solución de leche de
Carnation al 1% en PBS/Tween 20 al 0,05%) durante 1 h a temperatura
ambiente con oscilación. Se diluyeron el pre-suero y
el suero inmune en el tampón del bloqueo en el intervalo de
concentraciones deseado, y se añadieron 100 \mul por pocillo. Las
placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con
oscilación, y después se lavaron cuatro veces con tampón de lavado.
Se añadieron a continuación a cada muestra anticuerpos secundarios
conjugados con la peroxidasa del rábano picante (Ig
anti-rhesus, Southern Biotechnology Associates; Ig
anti-mouse y anti-rabbit, Jackson
Immuno Research) diluída a 1:2000 en tampón de bloqueo a 100
ml/pocillo y se incubaron 1 h a temperatura ambiente con oscilación.
Las placas se lavaron cuatro veces con tampón de lavado, y se
revelaron a continuación por adición de 100 \mul/pocillo de una
solucion de o-fenilendiamina (o-PD,
Calbiochem) al 1 mg/ml en 100 mM de tampón de citrato a pH 4,5. Se
leyó la absorbancia de las placas a 450 nm tanto cinéticamente
(primeros diez minutos de reacción) y a los puntos finales de 10 y
30 minutos (lector de microplacas Thermo-max,
Molecular Devices).
Se llevo a cabo como sigue los ensayos de
neutralización in vitro de asilados de HIV usando sueros
derivados de animales vacunados. Los sueros de ensayo y
pre-inmune se inactivaron térmicamente a 56ºC
durante 60 minutos antes del uso. Se añadió una cantidad valorada de
HIV-1 con diluciones 1:2 en serie de suero de
ensayo, y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente
antes de la adición de 10^{5} células linfoides humanas
MT-4 en placas de microvaloración de 96 pocillos.
Las mezclas virus/célula se incubaron durante días a 37ºC y se
ensayó la muerte de células muertas por virus en cultivos teñidos
con tinción de tetrazolio. La neutralización de los virus se observa
evitando la muerte de las células mediada por virus.
Los genes víricos HIV se clonaron a partir de
PBMC infectados que se habían activado mediante tratamiento con
ConA. El procedimiento preferido para obtener los genes víricos fue
la amplificación con PCR a partir del genoma celular infectado
usando oligómeros específicos que flanqueaban los genes deseados. Un
segundo procedimiento para obtener genes víricos es la purificación
de ARN vírico procedente de los sobrenadantes de células infectadas,
y preparando ADNc a partir de este material con posterior PCR. Este
procedimiento fue muy parecido al que se ha descrito anteriormente
para la clonación del gen B7 de murina, excepto en los oligómeros
de PCR usados, y los hexámeros aleatorios usados para fabricar ADNc
en lugar de los oligómeros cebadores específicos.
El ADN genómico se purifico desde los residuos
celulares infectados mediante lisis en solucion STE (NaCl 10 mM,
EDTA 10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) a las que se
añadieron Proteinasa K y SDS a concentraciones finales de 0,1 mg/ml
y 0,5%, respectivamente. Esta mezcla se incubó durante toda la noche
a 56ºC y se extrajo con 0,5 volúmenes de fenol:cloroformo:alcohol
isoamílico (25:24:1). La fase acuosa se precipitó a continuación por
adición de acetato de sodio hasta una concentración final de 0,3 M y
dos volúmenes de etanol frío. Tras peletizar el ADN a partir de las
solucion, se resuspendió el ADN en la solucion 0,1 x TE (1 x TE =
Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). En este punto,
se añadió SDS al 0,1% con 2 U de ARNasa con incubación durante 30
minutos a 37ºC. Esta solución se extrajo con
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y se precipitó a continuación
con etanol, como antes. Se suspendió el ADN en 0,1 x TE y se
cuantificó midiendo su absorbancia en el ultravioleta a 260 nm. Las
muestras se almacenaron a -20ºC hasta que se usaron en PCR.
Se llevó a cabo el PCR usando el kit y
procedimiento Perkin-Elmer Cetus usando los
siguientes oligómeros sentido y antisentido para gp160:
5'-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAA TGA -3', y
5'-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG C ATG
TGG-3', respectivamente. Estos oligómeros se añaden
en un emplazamiento SrfI en el extremo 3'- del fragmento de ADN
resultante. Los segmentos derivados por PCR se clonan en cualquiera
de los vectores de vacunación V1Jns o V1R y en las regiones V3 así
como en los emplazamientos de unión de ligaduras que se confirma
por secuenciamiento del ADN.
Se obtuvieron las PBMC, y se ensayaron respecto a
respuestas de memoria para un antígeno específico, tal como se ha
determinado mediante proliferación dentro de la población de PBMC.
Se siguió la proliferación mediante
^{3}H-timidina, que se añade a los cultivos de
células en las últimas 18-24 horas de incubation
antes del cultivo. Las células recogidas retienen en ADN que
contiene el isótopo sobre los filtros, si se ha producido la
proliferación, mientras que las células durmientes no incorporan el
isótopo, que no se retiene en el filtro de forma libre. Para
cualquier especie de roedor o primate, se plaquean a x 10^{5}
células en placas de micro valoración de 96 pocillos en un total de
200 m\mul de medio completo (RPMI/fetal de ternera al 10%). Se
determinaron las respuestas de proliferación de fondo usando
solamente PBMC y medio, mientras que no se generaron respuestas
específicas por el uso de lectinas tales como fitohemoaglutina (PHA)
o concanavalina A (ConA) a concentraciones de 1-5
\mug/ml para servir como control positivo. El antígeno específico
consiste de cualquier epitopo de péptido conocido, proteína
purificada, o virus inactivo. Las concentraciones de antígeno están
comprendidas entre 1-10 \muM para péptidos y
1-10 \mug/ml para proteína. Los máximos de
proliferación inducidas por lectinas se produjeron a los
3-5 días de incubación de las células de cultivo,
mientras que el máximo de las respuestas al antígeno ocurrieron a
5-7 días. La proliferación específica se produce
cuando el conteo de radiación que se obtiene es al menos tres veces
superior al del fondo del medio, y es a menudo una relación respecto
del fondo, o Índice de Estimulación (SI). Se sabe que la gp160 del
HIV contiene varios péptidos conocidos por producir proliferación
de las células T inmunizadas con gp160/gp120 o individuos infectados
por HIV. Los más frecuentemente usado de estos son:
T1(LysGlnIIeIIeAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla; T2
(HisGluAspIIeIIeSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys); y, TH4
(AspArgVaIIIeGluValValGlnGlyAalTyrArgAlaIIeArg). Se ha demostrado
que estos péptidos estimulan la proliferación de PBMC en ratones,
primates no humanos y seres humanos sensibilizados al antígeno.
En un esfuerzo por continuar optimizando nuestro
vector básico de vacunación, preparamos un derivado de V1Jns que se
denominó V1R. El objetivo de la construcción de este vector fue
obtener un vector vacuna de tamaño mínimo, es decir, sin secuencias
innecesarias ADN, que siguiera reteniendo todas las características
de expresión del gen heterólogo optimizado y con un rendimiento de
plásmido tan alto como los que obtuvieron V1J y V1Jns. Determinamos
a partir de la bibliografía así como mediante experimentación que
(1) las regiones en el interior del esqueleto pUC que comprende el
origen de replicación de E. coli podían eliminarse sin
afectar al rendimiento del plásmido a partir de la bacteria; (2), la
región 3'- del gen kan^{T} seguido del marco abierto de
lectura de la kanamicina podrían eliminarse si se inserta en su
lugar un terminador bacteriano; y, (3), se podían eliminar \approx
300 bp procedentes de la mitad 3' del terminador BGH sin afectar su
función reguladora (siguiendo el emplazamiento original del enzima
de restricción KpnI en el interior del elemento BGH).
El V1R se construyó usando PCR para sintetizar
tres segmentos de ADN a partir de V1Jns, que representaban el
promotor CMVintA/terminador BGH, origen de replicación, y los
elementos de resistencia a la kanamicina, respectivamente. Se
añadieron enzimas de restricción únicos para cada segmento en cada
extremo del segmento usando oligómeros PCR: SspI y XhoI para
CMVintA/BGH; EcoRV y BamHI para el gen kan^{r} gene; y,
BcII y SalI para el ori^{r}. Estos emplazamientos de enzima
se eligieron debido a que permiten la ligadura direccional de cada
uno de los segmentos de ADN derivados mediante PCR, con pérdida
posterior de cada emplazamiento: EcoRV y SspI dejan ADN de extremos
romos que son compatibles para enlace, mientras que BamHI y BcII
dejan salientes complementarios, al igual que SalI y XhoI. Tras la
obtención de estos segmentos mediante PCR, cada segmento se digirió
con los enzimas de restricción apropiados anteriormente indicados, y
a continuación se ligaron entre sí en una única reacción de mezcla
que contenía los tres segmentos de ADN. Se diseñó el extremo 5'- del
ori^{r} para que contuviera el la secuencia independiente
del terminador T2 rho que se encuentra normalmente en esta región,
de forma que pueda proporcionar información de terminación para el
gen de resistencia a la kanamicina. El producto ligado se confirmó
por digestión con enzimas de restricción (> 8 enzimas), así como
mediante secuenciamiento de ADN de las uniones de ligadura. Los
rendimientos del plásmido de ADN y la expresión heteróloga usando
genes víricas dentro de V1R parecieron similares al de V1Jns. La
reducción neta conseguida en el tamaño del vector fue de 1346 bp
(V1Jns = 4,86 kb; V1R =3,52 kb), ver la Fig. 11, ID de SEC.:45:.
Las secuencias de oligómero PCR usadas para
sintetizar el V1R (los emplazamientos del enzima de restricción
están subrayados e identificados entre corchetes detrás de la
secuencia.
(1) 5'-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG
GCC ATT GCA TAC G-3' [SspI], ID de SEC.:,
(2) 5'-CCA CAT CTC GAC GAA CCG
GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3' [XhoI], ID DE SEC.::
- (para el segmento CMVintA/BGH)
(3) 5'-GGT ACA GAT ATC GGA AAG
CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3' [EcoRV], ID DE
SEC.::
(4) 5'-CCA CAT GGA TCC G TAA TCC
TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3' [BamHI], ID DE SEC.::
- (para el segmento del gen de resistencia a la kanamicina)
(5) 5'-GGT ACA TGA TCA CGT AGA
AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3' [BclI], ID DE
SEC.::,
(6) 5'-CCA CAT GTC GAC CC
GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3' [SalI], ID DE
SEC.::
- (para el origen de replicación de E. coli)
Las uniones de ligadura se secuenciaron para V1R
usando los oligómeros siguientes:
5'-GAC CCA ATA TAA ATG
TAC-340 , ID de SEC:: [unión CMVintA kan^{r}.]
5'-CAA TAG CAG GCA
TGC-3', ID de SEC.:: [unión BGH/ori]
5'-G CAA GCA GCA GAT
TAC-3', ID de SEC.:: [unión ori/kan^{r}]
Los genes estructurales de HIV tales como
env y gac requieren la expresión del gen regulador
rev, con el fin de producir proteínas de longitud completa de
manera eficiente. Hemos encontrado que la expresión de gac
dependiente de rev produjo niveles menores de proteínas, y
que el propio rev podía ser tóxico para las células. Aunque
hemos conseguido niveles relativamente elevados de expresión
dependiente de rev de la gp160 in vitro, esta vacuna
excita bajos niveles de anticuerpos a la gp160 tras la inmunización
in vivo con ADN rev/gp160. Esto puede ser el resultado
de los conocidos efectos citotóxicos del rev, que incrementan
la dificultad de obtener la función rev en los miotúbulos que
contienen cientos núcleos (las proteínas rev necesitan estar
en el mismo núcleo que el transcripto dependiente de rev con
el fin que tenga lugar la expresión de la proteína rev o
gac). Sin embargo, ha sido posible obtener la expresión
independiente de rev usando modificaciones del gen
env.
Por lo general, nuestras vacunas han usado
principalmente los genes env y gac de HIV (IIIB) para
la optimización de la expresión en el interior de nuestro vector de
vacunación generalizado, V1Jns, comprendido por un promotor CMV
inmediato-temprano (IE), una secuencia de
poliadenilación y de finalización de la transcripción derivada de la
BGH, y un esqueleto pUC. Se pueden conseguir eficacias variables,
dependiente de la longitud del segmento de gen usado (por ejemplo,
gp120 vs. gp160), o se puede conseguir para env la expresión
independiente de rev sustituyendo su péptido líder nativo
secretor con otra procedente del gen del activador del plasminógeno
específico del tejido (tPA) t expresar el gen quimérico resultante
detrás del promotor CMVIE con el intrón CMV. Un
tPA-gp120 es un ejemplo de vector gp120 construido
de esta forma que funciona lo suficientemente bien para excitar
respuestas inmunes anti-gp120 en ratones y monos
vacunados.
Debido a los informes acerca que las proteínas
ancladas a la membrana pueden inducir respuestas de anticuerpo mucho
más sustanciales (y quizás más específicas para la neutralización de
HIV), en comparación con las proteínas secretadas así como ganancia
de epitopos adicionales, preparamos
V1Jns-tPA-gp160 y
V1Jns-rev/gp160. El vector tPA-gp160 produjo
cantidades detectables de gp160 y gp120, sin añadir rev, como
se muestra por análisis por inmunoblot de las células transfectadas,
aunque los niveles de expresión fueron mucho menores de los
obtenidos con rev/gp160, un plásmido que expresa gp160
dependiente de rev. Esto es debido, probablemente, a que las
regiones inhibitorias, que confieren dependencia de rev al
transcripto de gp160, se encuentran en múltiples emplazamientos
dentro de gp160, incluyendo un extremo en COOH de la gp41. Se
preparó un vector para una forma truncada terminada en COOH de
tPA-gp160 (tPA-gp143) que se diseño
para incrementar los niveles globales de expresión de env por
eliminación de estas secuencias inhibitorias. El vector gp143
también elimina las regiones go41 intracelulares que contienen
modelos de péptido (tales como Leu-Leu) de los que
se sabe que provocan la desviación de las proteínas de la membrana
hacia los lisosomas, en lugar de hacia la superficie de la célula.
De esta forma, se puede esperar que gp143 tenga mayores niveles de
expresión de la proteína env (disminuyendo la dependencia de
rev) y mayor eficiencia de transporte de la proteína hasta la
superficie de la célula, en comparación con la gp160 de longitud
completa, en las que estas proteínas pueden ser más capaces de
excitar los anticuerpos anti-gp160 tras la
vacunación con ADN. El tPA-gp143 se modificó aún más
mediante mutagénesis silenciosa extensa de la secuencia del elemento
de respuesta rev (RRE) (350 bp) para eliminar secuencias
inhibitorias de la expresión adicionales. Este constructo,
gp143/mutRRE, se preparó en dos formas. Tanto eliminando (forma A)
como reteniendo (forma B) los emplazamientos de rotura proteolítica
de gp120/41. Ambas formas se prepararon debido a que la bibliografía
informa que la vacunación de ratones usando gp160 irrompible
expresado en vaccinia excitó niveles de anticuerpos mucho más
elevados al gp160 que las formas rompibles.
Se desarrolló un ELISA cuantitativo para la
expresión de gp160/gp120 en transfectantes celulares para determinar
las capacidades de expresión relativa de estos vectores. La
transfección in vitro de 293 células seguido por la
cuantificación de gp120 secretada/liberada asociada a las células
produjo los siguientes resultados (1) tPA-gp160
expresó 5-10 veces menos gp120 que rev/gp160
con proporciones similares retenidas en el interior de la célula vs,
a liberada desde la superficie celular; (2) 2)
tPA-gp143 produjo de 3 a 6 veces más secreción de
gp120 que rev/gp160, con únicamente bajos niveles de gp143
asociada a células, confirmando que la cola citoplasmática de gp160
da lugar a la retención intracelular de gp160 que se puede superar
mediante el borrado parcial de dicha secuencia; y (3)
tPA-gp143/mutRRE A y B produjeron \approx10 veces
más niveles de expresión de proteína que el
tPA-gp143 pariente, mientras que se confirmó para A
la eliminación del procesado proteolítico.
De esta forma, nuestra estrategia de incrementar
la expresión independiente de rev ha producido incrementos
escalonados en los niveles de expresión totales, así como un
redireccionamiento de la gp143 anclado a la membrana hacia la
superficie de la célula, lejos de los lisosomas. Es importante tener
en cuenta que se trata de un constructo genérico en cuyo interior
debería ser posible insertar secuencias gp120 derivadas de
diferentes asilados víricos primarios en el interior de un cassette
vector que contenga dichas modificaciones, que residen tanto en el
extremo NH2 (líder tPA) como en el extremo COOH (gp41), en los que
existen pocas diferencias antigénicas entre las diferentes cepas
víricas.
Para aplicar estas estrategias de expresión a los
virus que son relevantes a efectos de vacunaciones, y para confirmar
la generalidad de nuestras hipótesis, preparamos también un vector a
tPA-gp120 derivado de un aislado primario de HIV
(que contiene el bucle de péptido V3 norteamericano de consenso;
fenotipos macrófago-trópico e inductor de
no-sincitia). Este vector produjo una elevada
expresión/secreción de gp120 con 293 células transfectadas, y excitó
anticuerpos anti-gp120 en ratones, demostrando de
esta forma que se había clonado de forma funcional. Los genes gp160
del aislado primario se usarán también para la expresión en la misma
forma que los gp160 derivados de cepas de laboratorio.
Efecto de la ruta de vacunación sobre la
respuesta inmune en ratones: aunque continúan los esfuerzos para
mejorar la expresión de gp160, hemos utilizado el constructo
tPA-gp120 ADN para evaluar las respuestas inmunes y
las formas de aumentarlas. Se compararon las rutas de vacunación
intramuscular (i.m.) e intradermal (i.d.) respecto de este vector a
dosis de 100, 10, y 1 \mug en ratones. La vacunación por
cualquiera de las rutas excito la respuesta de anticuerpos (GMT =
10^{3}-10^{4}) en todos los pacientes tras
2-3 vacunaciones en los tres niveles de
dosificación. Cada ruta excitó similares títulos de anticuerpos
anti-gp120 con respuestas claramente dependientes de
la dosis. Sin embargo, observamos mayor variabilidad para las
respuestas con vacunación i.d., de forma particular en los niveles
menores tras la inoculación inicial. Más aún, las respuestas de las
células T auxiliares, tal como se determina mediante la
proliferación in vitro específica del antígeno y la secreción
de citoquinas, fueron más elevadas con vacunación i.m. que con i.d.
Concluimos que la vacunación i.d. no ofrece ninguna ventaja,
comparada con la i.m., para esta vacuna.
La vacunación con ADN de gp120 produjo potentes
respuestas de las células T4 auxiliares en todos los compartimentos
linfáticos ensayados (bazo, sangre, y ganglios inguinal, mesentérico
e ilíaco) con perfiles de secreción de citoquinas similares a los de
T_{H} 1 (es decir producción de g-interferón e
IL-2 con poco o nada de IL-4). Estas
citoquinas promueven por lo general fuerte inmunidad celular, y se
han asociado con el mantenimiento de un estado libre de enfermedad
en pacientes HIV-seropositivos. Se ha demostrado que
los ganglios linfáticos son los emplazamientos de replicación
principales del HIV, albergando grandes depósitos de virus incluso
cuando los virus no se detectan fácilmente en la sangre. Una vacuna
que excite respuestas inmunes anti-HIV en varios
emplazamientos linfáticos, tal como hemos demostrado con nuestra
vacuna de ADN, puede ayudar a evitar la colonización exitosa de los
ganglios linfáticos, tras la infección inicial.
Los monos Cercopiteco Verde (AGM) y Rhesus (RHM)
que recibieron vacunas de ADN de gp120 mostraron niveles inferiores
de anticuerpos neutralizantes tras 2-3 vacunaciones,
que no se pudieron incrementar mediante vacunación adicional. Estos
resultados, así como la mayor concienciación en el campo de la
vacuna de HIV que la gp160 oligomérico es probablemente un antígeno
diana más relevante para excitar anticuerpos neutralizantes que los
monómeros de gp120 nos ha conducido a centrarnos en la obtención de
la expresión efectiva de vectores basados en gp160 (ver más arriba).
Los ratones y AGM fueron también vacunados con la vacuna
tPA-gp120 derivada del aislado primario. Estos
animales mostraron títulos de anticuerpo con punto final recíproco
anti-V3 (usando secuencia homóloga) comprendidos
entre 500-5000, demostrando que este diseño de
vacuna era funcional para aislado víricos clínicamente
relevantes.
Las vacunas basadas en gp160, rev-gp160 y
tPA-gp160, fallaron en la excitación consistente de
respuestas de anticuerpos en ratones y primates no humanos, o dieron
bajos títulos de anticuerpos. Nuestros resultados iniciales con el
plásmido tPA-gp143 produjeron una media geométrica
de títulos (GMT) > 10^{3} en ratones y AGM después de dos
vacunaciones. Estos datos indican que hemos mejorado de forma
significativa la inmunogenicidad de las vacunas similares a gp160
incrementando los niveles de expresión, y vehiculando de forma más
eficaz el env hacia la superficie de la célula. Este
constructo, así como los vectores tPA-gp143/mutRRE A
y B continuarán caracterizándose por sus respuestas de anticuerpo,
especialmente para la neutralización de virus.
Continuamos caracterizando las respuestas CTL de
RHM que se habían vacunado con gp120 y gp160/IRES/ADN de rev.
Los cuatro monos que recibieron esta vacuna mostraron actividades
CTL significativas MHC de Clase I restringida
(20-35% de muerte específica con una efector/diana
20) tras dos vacunaciones. Tras una cuarta vacunación, estas
actividades aumentaron a un 50-60% de muerte en
similares condiciones de ensayo, indicando que una vacunación
adicional estimula la respuesta de manera significativa. Las
actividades CTK persistieron durante al menos siete meses después de
la vacunación final con aproximadamente el 50% de sus niveles
máximos, indicando que se había establecido una memoria a largo
plazo.
Claims (4)
1. Un polinucleótido sintético que comprende una
secuencia de ADN que codifica la proteína env de HIV,
comprendiendo la secuencia de ADN codones optimizados para la
expresión en un huésped de mamífero, en el que el polinucleótido se
selecciona entre.
V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-1
3'-UTR;
V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-1
3'-UTR;
V1Jns-tPA-gp140/opt30-A;
V1Jns-tPA-gp140/opt30-B;
V1Jns-tPA-gp140opt
all-A;
V1Jns-tPA-gp140/opt
aII-B (sin cepas IIIB);
V1Jns-tPA-gp140/opt
aII-A (sin cepas IIIB);
V1Jns-tPA-gp140opt
all-B;
V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A;
V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B;
V1Jns-tPA-gp143/opt-32-A;
V1Jns-tPA-gp143/opt32-B;
V1Jns-tPA-gp143/SRV-1
3'-UTR;
V1Jns-tPA-gp143/opt
C1/opt32A;
V1Jns-tPA-gp143/opt
C1/opt32B;
V1Jns-tPA-gp143/opt
aII-A;
V1Jns-tPA-gp143/opt
aII-B
V1Jns-tPA-gp143/opt
all-A;
V1Jns-tPA-gp143/opt
all-B;
V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB;
V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB;
V1Jns-tPA-gp143/opt
C1/opt32-A/glyB;
V1Jns-tPA-gp143/opt
C1/opt32-B/glyB;
V1Jns-tPA-gp143/opt
all-A/glyB;
V1Jns-tPA-gp143/opt
all-B/glyB;
V1Jns-tPA-gp143/opt
all-A/glyB;
V1Jns-tPA-gp143/opt
all-B/glyB;
tal como se describe en los ejemplos
1-11 en el presente documento; y las combinaciones
de los mismos.
2. El uso del polinucleótido de la Reivindicación
1 para la fabricación de un medicamento para la prevención o
tratamiento de la infección por HIV en vertebrados.
3. Una vacuna contra la infección por HIV que
comprende el polinucleótido de la Reivindicación 1 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
4. El uso de acuerdo con la Reivindicación 2 en
el que dicho medicamento induce un antígeno que está presente en la
célula para estimular la proliferación de las células T auxiliares y
citotóxicas y las funciones del efector que incluyen la secreción
específica de linfoquina para los antígenos de HIV.
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