MXPA98006842A - Genes sinteticos de vih - Google Patents

Abstract

Se proveen moléculas ADN sintético que codifican genes de VIH y modificaciones de genes de VIH;los condones de las moléculas sintéticas usan condones preferidos por la célula huésped proyectada;las moléculas sintéticas pueden usarse como una vacuna de polinucleótido que provee inmunoprofilaxisefectiva contra infección por VIH mediante anticuerpo neutralizante e inmunidad mediada por célula.

Description

SENES SINTÉTICOS DE VIH REFERENCIA RECIPROCA DE SOLICITUDES RELACIONADAS Esta es una solicitud no provisional relacionada con la solicitud de los E.U.A. serie No. 60/012,082» presentada el 22 de febrero de 1996.

DECLARACIÓN RESPECTO A INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE REFERENCIA A APÉNDICE DE MICROFICHA No se apl ca.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Vacunas de VIH.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Infección de VIH: El virus 1 de i munodeficiencia humana (VIH—1) es el age'nte etnológico del síndrome de inmunode ic encia adquirida humana (SIDA) y trastornos relac onados. El VIH—1 es un virus de ARN de la familia Retroviridae. y exhibe la organización 5U.TR-<3a2-pol-ertv-LTR3' de todos los retrovirus. Ademas» el VIH-1 comprende un número relativamente pequeño de genes con funciones reguladoras o desconocidas» incluyendo los genes tat y £__.' El 9^p env codifica la gl icoprotei'na de envoltura viral que. es traducida como un precursor de 160 Kilodaltons (KDa) (gplSO). que después es escindido por una proteasa celular para producir la gl icoprotei a de envoltura externa de 120 kDa (gpl20) y la gl icoprotei a de envoltura de transmembrana de 41 KDa (gp4l). ßpl20 y gp4l permanecen asociadas y son desplegadas sobre las partículas virales y la superficie de las células infectadas por VIH. La gpl20 se une al receptor CD4 presente sobre la superficie de los linfoc tos T auxil ares» macrófagos y stras células blanco. Después de que la gpl20 se une a CD4m» gp41 interviene en el evento de fusión responsable de 1 a entrada del virus. La infección comienza cuando la gpl20 sobre la partícula viral se une al receptor CD4 sobre la superficie de los linfocitos T4 u otras células blanco. El virus unido se combina con la célula blanco y transcribe inversamente su genoma de ARN en el ADN de doble cadena de la célula. El ADN viral es incorporado en el material genético en el núcleo de la célula» en donde el ADN viral dirige la producción de ARN viral nuevo» proteínas virales y nuevas partículas de virus. Las nuevas partículas brotan de la membrana de la célula blanco e infectan a otras células. La destrucción de l nfocitos T4> que es critico para la defensa inmune» es una causa principal de la disfunción inmune progresiva que es la marca distintiva de la infección de VIH. La pérdida de células blanco deteriora seriamente la capacidad del cuerpo para luchar contra la mayoría de los invasores» pero tiene un impacto particularmente severo sobre las defensas contra los virus» hongos» parásitos y ciertas bacterias» incluyendo micobacterias. El VIH-1 mata a las células que infecta» replicándose» surgiendo de ellas y dañando la membrana celular. El VIH—1 puede matar a células blanco nd ectamente por medio de la gp!20 viral que es desplegada sobre la superficie de una célula infectada. Puesto que el receptor CD4 sobre las células T tiene una fuerte afinidad por la gpl20. células sanas que expresan el receptor CD4 pueden unirse a la gpl20 y fundirse co células infectadas para formar un s?ncit?o. Un sincitio no puede sobrevivir. El VIH—1 también puede provocar defensas inmunes celulares normales contra células infectadas. Con o sin la ayuda de anticuerpos» las células defensivas citotó?icas pueden destruir una célula infectada que despliega proteínas virales sobre su superficie. Finalmente» gpl20 libre puede circular en la sangre de individuos infectados con VIH—1. La proteína libre puede unirse al receptor CD4 de células no infectadas» haciéndolas aparecer como infectadas y provocando una respuesta inmune. La infección por VIH-1 es casi siempre fatal» y en la actual dad no existen curas para la infección por VIH-1. Aun no se tienen disponibles vacunas efectivas para prevenir la infección por VIH-1. Debido al peligro de reversión o infección» el virus vivo atenuado probablemente no puede usarse co o vacuna. La mayoría de los enfoques de vacuna de subunidad no han sido acertados en la prevención de la infección por VIH. Los tratamientos para la infección por VIH—1» aunque alargan la vida de algunas personas infectadas» tienen efectos secundarios serios. Por lo tanto» existe una gran necesidad de tratamientos y vacunas efectivas para combatir esta infección letal. 2. Vacunas La vacunación es una forma efectiva de prevención de enfermedad y se ha probado que es acertada contra varios tipos de infección viral. La determinación de las formas para presentar antígenos de VIH-1 al sistema inmune humano para provocar inmunidad humoral y celular protectora» es una tarea difícil. A la fecha» no han sido acertados los intentos de generar una vacuna efectiva para VIH. En pacientes con SIDA» el virus libre está presente solamente a niveles bajos. La transmisión de VIH-1 es realzada por la interacción célula a célula mediante fusión y formación de sinci ti os. Por lo tanto» los anticuerpos generados contra virus libres o subunidades virales son por lo general inefectivos para eliminar células infectadas con el virus. Las vacunas explotan la capacidad del cuerpo para "recordar" un ant i geno. Después de encontrarse primero con un antígeno dado» el sistema inmune genera células que retienen una memoria inmunológica del antígeno durante toda la vida de un individuo. La exposición subsecuente al antígeno estimula la 5 respuesta inmune y da como resultado la eliminación o inactivación del patógeno. El sistema inmune trata con patógenos en dos formas: mediante respuestas humorales y mediante respuestas mediadas por células. En la respuesta humoral» los linfocitos generan 0 anticuerpos específicos que se unen al antígeno» inactivando as"' al patógeno. La respuesta mediada por células implica linfocitos T citotóxicos y auxiliares que atacan y destruyen específicamente a las células infectadas. El desarrollo de una vacuna con virus VIH-1 presenta ¡5 problemas» ya que el VIH-1 infecta a algunas de las mismas células que la vacuna necesita activar en el sistema inmune (es decir» linfocitos T4). Sería ventajoso desarrollar una vacuna que ínactive VIH antes de que ocurra el deterioro del sistema inmune. Un tipo particularmente adecuado de vacuna de VIH 0 generaría una respuesta inmune contra VIH que reconociera variantes de VIH y que trabajara en individuos VIH positivos que están al principio de su infección. Un reto mayor para el desarrollo de vacunas contra los virus» particularmente contra aquellos con un alto índice de mutación» tales como los virus de inmunodeficiencia humana, contra los cuales conviene provocar respuestas inmunes neutral zantes y protectoras, es la diversidad de las proteínas de envoltura viral entre diferentes aislados o cepas virales. Debido a que los linfocitos T c?totóxicos (LTC)» tanto en ratones como en humanos» son capaces de reconocer epítopes conservados derivados de proteínas virales internas» y se piensa que son importantes en la respuesta inmune contra los virus» se han dirigido esfuerzos hacia el desarrollo de vacunas de LTC capaces de proveer protección heteróloga contra diferentes cepas virales. Se sabe que los LTC CD8+ matan a células infectadas viral ente cuando sus receptores de células T reconocen péptidos v rales asociados con moléculas de HCM clase I. Los péptidos virales son derivados de proteínas virales sintetizados endógenamente» sin importar la localización o función de la proteína dentro del virus. De esta manera» por reconocimiento de epítopes conservados de las proteínas virales» los LTC pueden proveer protección contra cepas cruzadas. Los péptidos capaces de asociarse con HCM clase I para reconocimiento de LTC, se originan de proteínas que están presentes en» o que pasan a través del» citoplasma o retículo endoplásmico. En general» las proteína exógenas que entran a la ruta de procesamiento endosómico (como en el caso de antígenos presentados por moléculas de HCM clase ID» no son efectivas en la generación de respuestas de LTC CD8+. La mayoría de los esfuerzos para generar respuestas de LTC han usado vectores de replicación para producir el antigeno de protema dentro de la célula, o se han enfocado en la introducción de péptidos en el citosol. Estos enfoques tienen limitaciones que pueden reducir su utilidad como vacunas. Los vectores retrovirales tienen restricciones sobre el tamaño y la estructura de los polipéptidos que pueden ser expresados como proteínas de fusión» manteniendo la capacidad del virus recombinante para replicarse, y puede estar comprometida la efectividad de los vectores tales como la vacuna, para inmuni aciones subsecuentes» por respuestas imiunes contra los mismos vectores. También» vectores virales y patógenos modificados» tienen riesgos inherentes que pueden impedir su uso en humanos. Además» la selección de epítopes de péptido para ser presentados depende de la estructura de los antígenos de HCM de un individuo y» por lo tanto» las vacunas de péptidos pueden tener efectividad limitada debido a la diversidad de haploti os de HCM en poblaciones de razas mezcladas. 3.- Vacunas de ADN Benvenisty» N.» y Reshef » L. CPNAS 83, 9551-9555, (1986).] mostraron que podría ser expresado ADN precipitado con CaCl;.., introducido en ratones intraperitonealmente (ip), intravenosamente (iv) o ntramuscularmente (im). La inyección im de vectores de expresión de ADN sin tratamiento con CaCl2 en ratones, dio como resultado la captación de ADN por parte de las células del músculo, y la expresión de la proteína a codificada por el ADN. Los plasmidos se mantuvieron es isóm camente y no se repl caron. Subsecuentemente» se ha observado expresión persistente después de inyección im en músculo esquelético de ratas, pez y primates y músculo cardíaco de ratas. La técnica de usar ácidos nucleicos como agentes terapéuticos se reportó en 090/11092 (4 de octubre de 1990) , en la cual se usaron polinucleótidos descubiertos para vacunar vertebrados. No es necesario para el éxito del método que la i munización sea intramuscular. La introducción de microproyectiles de oro recubiertos con ADN que codifican la hormona de crecimiento de bovino (BGH) en la piel de ratones» dio co o resultado la producción de anticuerpos contra BGH en el ratón. Se ha usado un inyector de chorro para transfectar tejidos de piel» músculo» grasa y mamario de animales vivos. Se han revisado varios métodos para introducir ácido nucleico. Zhu y otros.» CScience 261:209-211 (9 de julio de 1993) mostraron que la inyección intravenosa de complejo ADN: l posoma catiónico en ratones» da como resultado la expresión general de un transgen clonado. Ulmer y otros.» CScience 259:1745-1749» (1993) reportaron sobre la protección heteróloga contra la infección por virus de influenza mediante inyección intramuscular de ADN que codifica proteínas de virus de la i f luenza. La necesidad de agentes terapéuticos y profilácticos específicos capaces de provocar las respuestas inmunes deseadas contra patógenos y antigenos de tumor» es cubierta por la presente invención. De particular importancia en este enfoque terapéutico es la capacidad para inducir respuestas inmunes de células T que pueden prevenir infecciones o enfermedades ocasionadas, incluso por cepas de virus que son heterólogas a la cepa de la cual se obtuvo el gen de antígeno. Esto es de particular interés cuando se trata con VIH, ya que se ha reconocido que este virus muta rápidamente y se han identificado muchos aislados virulentos E-véase» por ejemplo, LaRosa y otros., Science 249:932-935 (1990), dentif cando 245 aislados de VIH separados!.. En respuesta a esta diversidad reconocida» los investigadores han intentado generar LTC en base a inmunización con péptidos. De esta manera» TaKahashi y otros, CScience 255:333-336 (1992) reportaron la inducción de células T citotóxicas ampliamente reactivas en forma cruzada que reconocen un determinante de envoltura de VIH (gp ISO). Sin embargo» estos vestigadores reconocieron la dificultad en lograr una verdadera respuesta de LTC de reacción cruzada y sugirieron que existe un dicotomía entre la preparación o reestimulación de células T» que es muy rigurosa» y la evocación de la función efectora» incluyendo ci toxic i dad» de LTC ya estimulados. Wang y otros reportaron sobre la evocación de respuestas inmunes en ratones contra VIH mediante inoculación intramuscular con un gen de VIH genómico (no empalmado) clonado. Sin embargo» el nivel de respuestas inmunes alcanzadas ÍO en estos estudios fue muy bajo. Además» la construcción de ADN de Wang y otros» utilizó una pieza esencialmente genómica de VIH que codifica secuencias codif cadoras contiguas Tat/REV— gplGO-Tat/REV. Como se describe en detalle más adelante, este es un sistema subópti o para obtener expresión de alto nivel de la gpl60. También es potencialmente peligrosa» ya que la expresión de Tat contribuye al desarrollo de sarcoma de Kapos . WO 93/17706 describe un método para vacunar un animal contra un virus» en donde partículas de vehículo se recubrieron con una construcción de gen, y las partículas recubiertas se aceleraron en las células de un mamífero. Respecto a VIH» se propuso usar esencialmente todo el genoma» menos las repeticiones terminales largas. Ese método representa riegos substanc ales para los receptores. Se cree en general que las construcciones de VIH deben contener menos de aproximadamente 50% del genoma de VIH para garantizar la seguridad de la vacuna; esto asegura que han sido eliminadas entidades enzimáticas y proteínas reguladoras virales» muchas de las cuales tienen funciones desconocidas o escasamente entendidas. De esta manera» persisten varios problemas al querer desarrollar una vacuna útil contra VIH humano a partir de tecnología de liberación de gen. La presente invención contempla cualquiera de los mé-odos conocidos para introducir polinucleótidos en tejido vivo para inducir la expresión de proteínas. Sin embargo» esta invención provee un inmunógeno novedoso para introducir VIH y otras proteínas en la ruta de procesamiento de antígeno para generar ef cientemente LTC y anticuerpos específicos para VIH. El agente farmacéutico es efectivo como una vacuna para inducir respuestas inmunes tanto celulares como humorales contra VIH y neutral i zadoras de VIH. En la presente invención» los problemas indicados anteriormente son manejados y resueltos mediante la provisión de inmunógenos de polinucleótido que» cuando se introducen en un animal, dirigen la expresión eficiente de proteínas y epítopes de VIH sin los riegos consecuentes asociados con aquellos métodos. Las respuestas inmunes generadas de esta manera son efectivas al reconocer VIH» al inhibir la repl icación de VIH, al identificar y matar células infectadas con VIH» y son reactivas en forma cruzada contra muchas cepas de VIH.

A .- Uso de codón y contexto de codón El apareamiento de codones de organismos es altamente no aleatorio y difiere . de organismo a organismo. Esta información se usa para construir y expresar genes alterados o sintéticos que tienen los niveles deseados de eficiencia de traducción» para determinar qué regiones en un genoma son regiones que codifican proteína» para introducir sitios de pausa de traducción en genes heterólogos» y para determinar la relación u origen ancestral de las secuencias de nucleótidos. La expresión de genes heterólogos ajenos en organismos transformados es actualmente un lugar común. Un gran número de genes de mamífero» incluyendo por ejemplo genes de murino y humano» han sido insertados exitosamente en organismos de una sola célula. Las técnicas estándar a este respecto incluyen la introducción del gen ajeno por expresar en un vector tal como un plásmido o un fago» y utilizando ese vector para insertar el gen en un organismo. Los promotores naturales para dichos genes son reemplazados comúnmente con promotores fuertes compatibles con el huésped en el cual se inserta el gen. La maquinaria de secuenciación de proteína permite la elucidación de la secuencia de aminoácidos, incluso de cantidades pequeñas de proteína natural . A partir de estas secuencias de aminoácidos» pueden inferirse secuencias de ADN que codifican estas proteínas. La síntesis de ADN también es una técnica que se desarrolla rápidamente, y pueden construirse fácilmente genes que corresponden a las secuencias inferidas de AD . A pesar del conocimiento creciente de los sistemas de expresión y de ADN recombinante, persisten obstáculos signif cativos cuando se intenta expresar un gen ajeno o sintético en un organismo. Muchas proteínas activas naturales, por ejemplo, son glicosiladas de manera diferente a la que ocurre cuando son expresadas en un huésped ajeno. Por esta razón, puede preferirse a los huéspedes eucarióticos tales como levadura, sobre los huéspedes bacterianos para expresar muchos genes de mamíferos. El problema de gl icos lación es asunto de investigación conti ua.

Otro problema se entiende menos. Frecuentemente, la traducción de un gen sintético, aún cuando esté acoplado con un promotor fuerte» procede muchos menos eficientemente de lo que prodría esperarse. Lo mismo es cierto frecuentemente para genes exógenos ajenos al organismo de expresión. Aunque el gen es transcrito de una manera suf cientemente eficiente de manera que se producen cantidades recuperables del producto de traducción» la proteína frecuentemente es inactiva o es diferente en propiedades a la proteína natural. Se reconoce que este problema es común debido a diferencias en el pliegue de proteína en varios organismos. La solución a este problema ha sido evasivo y se entienden poco los mecanismos que controlan el pl egue de proteínas. Se cree que los problemas relacionados con la eficiencia de traducción están relacionados con efectos de contexto de codón. Las regiones de genes que codifican proteínas en todos los organismos» están sometidas a una amplia variedad de restricciones funcionales» algunas de las cuales dependen del requerim ento para codificar una proteína que funcione apropiadamente» así como señales apropiadas de inicio y detención de traducción. Sin embargo» se han discernido varias características de las regiones que codifican proteínas que no se entienden fácilmente en términos de estas restricciones. Dos clases importantes de tales característ cas son las que implican uso de codón y contexto de codón. Se sabe que la utilización de codón se encuentra altamente influida» y que varia considerablemente entre diferentes organismos. Los patrones de uso de codón se ha visto que están relacionados con la abundancia relativa de isoaceptores de ARNt . Los genes que codifican proteínas de abundancia alta contra abundancia baja muestran diferencias en sus preferencias de codón. Se ha discutido ampliamente la posibilidad de que las influencias en el uso de codón alteran las velocidades de alargamiento del péptido. Aunque las diferencias en uso de codón están asociadas con diferencias en velocidades de traducción» ha sido difícil demostrar efectos directos de elección de codón sobre la traducción. Otras restr cciones propuestas sobre patrones de uso de codón incluyen el aumento al máximo de la fidelidad de traducción y la optimización de la eficiencia cinética de la síntesis de proteína. Aparte del uso no aleatorio de los codones» se ha acumulado evidencia considerable de que el reconocimiento de codón/anticodón está influida por secuencias fuera del mismo codón» un fenómeno denominado "contexto del codón". Existe una fuerte influencia de nucleótidos cercanos sobre la eficiencia de supresión de codones sin sentido» así como codones sin sentido. Claramente» la abundancia de actividad supresora en poblaciones bacterianas naturales» así como el uso de codones de "terminación" para codificar selenocisteína y fosfoserina» requiere que la terminación sea dependiente del contexto. Se ha mostrado que efectos de contexto similares tienen influencia sobtre la fidelidad de traducción» así como sobre la eficiencia de la m"cac ion de traducción. Los análisis estadísticos de regiones codificadores de proteína de E. coli han demostrado otra manifestación del "contexto del codón". La presencia de un codón particular en una posición influye fuertemente la frecuencia de ocurrencia de ciertos nucleótidos en codones vecinos» y estas restricciones de contexto difieren notablemente para genes expresados a niveles altos contra bajos. Aunque el efecto del contexto ha sido reconocido» el valor predictivo de las reglas estadísticas en relación con nucleótidos preferidos adyacentes a los codones» es relati amente bajo. Esto ha limitado la utilidad de dichos datos de preferencia de nucleótidos para seleccionar codones para efectuar niveles deseados de eficiencia de traducción. El advenimiento de equipo de secuenciación automática de nucleótidos» ha hecho disponible grandes cantidades de datos de secuencias para una amplia variedad de organismos. La corrprensión de estos datos presenta dificultades sustanciales. Por ejemplo» es importante identificar las regiones codificadoras del genoma para relacionar los datos de secuencia genética con las secuencias de proteína. Además, la ascendencia del genoma de ciertos organismos es de interés substancial . Se sabe que los genomas de algunos organismos son de ascendencia mixta. Algunas secuencias que son de origen viral están ahora incorporadas establemente en el genoma de organismos eucarioticos. Las mismas secuencias virales pueden haberse originado en otras especies substancialmente no relacionadas. Una comprensión de la ascendencia de un gen puede ser importante en la deducción de analogías propias entre genes 5 relacionados y sus productos de traducción en otros organismos. Existe la necesidad de una mejor comprensión de los efectos del contexto del codón sobre la traducción, y de un método para determinar los codones apropiados para cualquier efecto deseado de traducción. También existe la necesidad de un método para identificar regiones codificadoras del genoma» a partir de datos de secuencias de nucleótidos. También existe la necesidad de un método de control del pliegue de proteínas y para asegurar que un gen ajeno se pliegue apropiadamente cuando se expresa en un huésped. Serían de importancia significativa l¡ß genes alterados o construidos de acuerdo con eficiencias de traducción deseadas. Otro aspecto de la práctica de la técnica de ADN recombinante para la expresión de proteínas en microorganismos de interés industrial y farmacéutico» es el fenómeno de "preferencia de codón". Aunque se observó antes que la maquinaria existente para la expresión de genes en células huésped transformadas genéticamente» "operará" para construir un producto deseado dado, los niveles de expresión obtenidos en un microorganismo pueden estar sujetos a una amplia variación» 5 dependiendo en parte de las formas al ternaturales específicas del código genético especif cador de aminoácidos presente en un gen exógeno insertado. Un codón de "triplete" de cuatro posibles bases de nucleótido puede existir en 64 formas variantes. El que estas formas provean el mensaje para solamente 20 aminoácidos diferentes (así como iniciación y terminación de transcripción)» significa que algunos aminoácidos pueden ser codificados por más de un codón. En realidad» algunos aminoácidos tienen hasta 6 codones alternativos "redundantes", mientras que otros tienen un solo codón requerido. Por razones que no se entienden completamente» los codones alternativos no están todos presentes uniformemente en el ADN endógeno de tipos diferentes de células» y parece que existe una jerarquía natural variable o "preferencia" para ciertos codones en ciertos tipos de células. Como un ejemplo» el aminoácido leucina es especificado por cualquiera de 6 codones de ADN que incluyen CTA» CTC. CTG» CTT» TTA» y TTG (que corresponden» respect vamente» a los codones de ARNm» CUA» CUC» CUG. CUU» UUA y UUG). El análisis exhaustivo de las frecuencias de codón de genoma para microorganismos» ha revelado que ADN endógeno de E^. col i contiene muy comunmente el codón especificador de leucina CTG.r mientras que el ADN de levaduras y mohos de limo muy comunmente incluye un codón espec ficador de leucina TTA. En vista de esta jerarquía» se sostiene en general que la provabi lidad de obtener altos niveles de expresión de un pol péptido rico en leucina por medio de un huésped E. col , dependerá en cierta medida de la frecuencia de uso del codón.

P?"~ ejemplo» un gen rico en codon TTA sera» con toda probabilidad» expresado def cientemente en E. col i , mientras que un gen rico en CTG probablemente expresará abundantemente el polipéptido. Similarmente, cuando células de levadura son las células huésped proyectadas de transformación para expresión de un polipéptido rico en leucina, un codón preferido para uso en un ADN insertado sería TTA. Las i pl caciones del fenómeno de preferencia de codón sobre las técnicas de ADN recombinante son manifiestas, y el fenómeno puede servir para explicar muchas fallas anteriores para lograr altos niveles de expresión de geners exógenos en organismos huésped transformados exitosamente —un codón menos "preferido" puede estar presente repet damente en el gen insertado, y la maquinar a celular del huésped para expresión puede no operar tan ef cientemente. Este fenómeno sugiere que los genes sintéticos que han sido diseñados para incluir unos codones preferidos de célula huésped proyectada» proveen una forma preferida de material genético ajeno para la práctica de la técnica de ADN recombinante.

.— Tráfico de Proteínas La diversidad de función que tipifica a las células eucarióticas» depende de la diferenciación estructural de sus fronteras de membrana. Para generar y mantener estas estructuras» las proteínas deben ser transportadas desde su sitio de síntesis en el retículo endoplásmico hasta sus destinos predeterminados en toda la célula. Esto requiere que las proteínas de tráfico desplieguen señales de distribución que son reconocidas por la maquinaria molecular responsable de seleccionar la ruta localizada en los puntos de acceso a las principales vías de tráfico. Necesitan hacerse decisiones de distribución para la mayoría de las proteínas» solamente una vez conforme atraviesan sus rutas biosintéticas» ya que su destino final» la localización celular en la cual real zan su función» se hace su residencia permanente. El mantenimiento de la integridad intracelular depende en parte de la distribución selectiva y el transporte exacto de las proteínas hacia sus destinos correctos. Desde hace algunos años» se ha estudiado enfáticamente la disección de la maquinaria molecular para la dirección y localización de proteínas. Se han identificado motivos de secuencia definidos sobre proteínas» que pueden actuar como "marcas de dirección". Se han encontrado varias señales de distribución asociadas con los dominios citoplásmicos de las proteínas de membrana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proveen moléculas de ADN sintético que codifican env de VIH y modif cac ones de env de VIH. Los codones de las moléculas sintéticas incluyen los codones preferidos de la célula huésped proyectada. Las moléculas sintéticas proveen formas preferidas de material genético ajeno. Las moléculas sintéticas pueden usarse como una vacuna de pol inucleotido que provee in unoprof i láxis efectiva contra infección por VIH» mediante neutralización de anticuerpo e inmunidad mediada por células. Esta invención provee polinucleótidos que» cuando se introducen i vivo directamente en un vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates y humanos» inducen la expresión de proteínas codificadas dentro del animal .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra estrategias de expresión basadas en cassette de env de VIH. La figura 2 muestra respuestas anti-gpl20 mediadas por vacuna de ADN. La figura 3 muestra títulos de ELISA ant?-gpl20 de sueros de vacunas de ADN de murino. La figura 4 muestra la expresión relativa de gpl20 después de transfección de cultivo celular con VPM env de VIH. La figura 5 muestra las respuestas medias de ELISA anti-gpl20 después de vacunación con ADN de tPA-gpl43/optA contra optB. La figura S muestra la neutral zación de VIH mediante sueros de vacunas de ADN de murino. La figura 7 muestra neutral zación de VIH mediante sueros de vacunas de ADN de VIH env de murino. La figura 8 es un análisis de inmunoblot de construcciones de ADN de VIH env optimizadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proveen moléculas de ADN sintético que codifican env de VIH y moléculas de ADN sintético que codifican formas modi icadas de env de VIH. Los codones de las moléculas sintéticas son diseñados de tal manera de utilizar los codones preferidos por la célula huésped proyectada. Pueden usarse las moléculas sintéticas como una vacuna de pol nucleótidos que provee nmunoprofila s efectiva contra infección por VIH por medio de inmunidad de anticuerpos neutralizantes e inmunidad mediada por células. Las moléculas sintéticas pueden usarse corno una composición inmunogénica. Esta invención provee po"! inucleótidos que, cuando se introducen directamente en un vertebrado in vivo, incluyendo mamíferos tales como primates y humanos» inducen la expresión de proteínas codificadas dentro del animal . Como se usa aquí» un poli ucleótido es una combinación de ácidos nucleicos que contiene elementos reguladores» a fin de que después de su introducción en una célula viva de vertebrado» el polinucleótido es capaz de dirigir la maquinaria celular para producir productos de traducción codificados por los ácidos nucleicos que comprenden el poli ucleótido. En una modal dad de la invención» el pol ucleótido es un ácido pol desox rribonucleico que comprende por lo menos un gen de VIH unido en operación a un promotor de transcripción. En otra modalidad de la invención» la vacuna de polinucleótido (VPN) comprende un ácido po"! irri bonucleico que codifica por lo menos un gen de VIH que es susceptible de traducción por parte de la maquinaria celular eucariótica (ribosomas, ARN, y otros factores de traducción). En donde la proteína codificada por el polinucleótido es una que; no se presenta normalmente en ese an al, excepto en condiciones patológicas (es decir, una proteína heteróloga)» tales como por ejemplo proteínas asociadas con el virus de inirunodeficiencia humana (VIH), el agente etiológico de síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), el sistema inmune del animal es activado para dar principio a una respuesta inmune protectora. Debido a que estas proteínas exógenas son producidas por los tejidos del animal, las proteínas expresadas son procesadas por el sistema de histocompatibi 1 idad mayor, HCM, de forma análoga a cuando ocurre una infección real con el organismo relacionado (VIH). El resultado es 1 a inducción de respuestas inmunes contra el patógeno cognado. Los polinucleótidos de la presente descripción» cuando se introducen en un sistema biológico, inducen la expresión de proteínas y epítopes de VIH y la producción de una respuesta inmune específica. La respuesta de anticuerpo inducida es específica para la proteína de VIH expresada y neutraliza al VIH. Además» son inducidos li focitos T citotoxicos (LTC) que reconocen y destruyen específicamente a células infectadas con VIH. La presente descripción provee métodos para usar un polinucleótido que» por su introducción en tejido de mamífero, induce la expresión en una sola célula» i n vi vo , de productos discretos de gen. La descripción provee una solución que no requiere manipulaciones múltiples de genes de VIH dependientes de RE para obtener genes ndependientes de REV. El sistema de expresión independiente de REV descrito en la presente es útil por su propia capacidad y es un sistema para demostrar la expresión en una sola célula in vivo de un sólo producto de gen deseado. Debido a que muchas de las aplicaciones de la presente invención son para vacunación antiviral» los polinucleótidos son referidos frecuentemente como vacunas de pol nucleótido o VPN. Esto no quiere decir que las utilidades adicionales de estos pol nucleótidos» en estimulación inmune y terapéutica contra tumor» se consideren fuera del alcance de la invenc ón. En una modalidad» un gen que codifica un producto de gen de VIH» es incorporado en un vector de expresión. El vector contiene un promotor de transcripción reconocido por una ARN pol merasa eucariótica» y un terminador de transcripción al final del gen de VIH que codifica la secuencia. En una modalidad preferida» el promotor es el promotor de citomegalovirus con la secuencia de intrón A (CMV-intA)» aunque el experto en la materia reconocerá que puede usarse cualquiera de varios otros promotores conocidos» tales como el promotor fuerte de inmunoglobul na» u otros promotores de gen eucariótico. Un terminador de transcripción preferido es el terminador de hormona de crecimiento de bovino. Se prefiere particularmente la combinación de CMVi tA-termi ador de BGH. Para ayudar a la preparación de los pol inucleótidos en células procarióticas» puede incluirse un marcador de resistencia de antibiótico en el vector de expresión» el marcador puede estar bajo control de transcripción de un promotor procariótico» de manera tal que no ocurra expresión del marcador en células eucarióticas. Puede usarse genes de ' resistencia a la ampicilina» genes de resistencia a la neomicina y otros marcadores de resistencia a antibiótico farmacéuticamente aceptables. Para ayudar a la producción de altos niveles de poli ucleótido por fermentación en organismos procarióticos» puede ser conveniente que el vector contenga un origen procariótico de replicación y sea de número alto de copias. Varios vectores de clonación procarióticos disponibles conerc almente proveen estos beneficios. Es conveniente remover secuencias de ADN no esenciales y asegurar que los vectores no sean capaces de replicarse en células eucarióticas. Esto reduce al mínimo el riesgo de integración de las secuencias de vacuna de pol nucleótido en el genoma del receptor. Pueden usarse promotores o refuerzos específicos de tejido cuando sea conveniente limitar la expresión del polinucleótido a un tipo particular de tejido. En una modalidad» se usa el vector de expresión pnRSV» en donde la repetición terminal larga (RTL) del virus de sarcoma de Rous (VSR) es usada como el promotor. En otra modalidad, se usa VI, un vector pBR322 mutado» en el cual se clonó el promotor de CMV y el terminador de transcripción de BGH. En otra modalidad, los elementos de VI y ?UC19 han sido combinados para producir un vector de expresión denominado VIJ. En el V1J u otro vector de expresión conveniente» se clona un gen de VIH» tal como gpl20» gp41 » gpl60> gag» pol» env» o cus»1 quier otro gen de VIH que pueda inducir respuestas inmunes contra VIH. En otra modalidad» el gen de resistencia a ampicilina es removido de VIJ y reemplazado con un gen de resistencia a neomicina» para generar V1J—neo en diferentes genes de VIH» que ha sido clonado para usarse de conformidad con esta invención. En otra modalidad» el vector es VIJns» que es el mismo que VUneo» excepto que ha sido construido un sitio de restricción Sfil único en el sitio individual Kpnl en la posición 2114 de VIJ-neo. La i cidencia de sitios Sfil en ADN genómico humano es muy baja (aproximadamente un sitio por 10»O0O bases). De esta manera» este vector permite monitorear cu dadosamente la integración del vector de expresión en el ADN del huésped» simplemente por medio de digestión con Sfil del ADN genómico extraído. En una refinación adicional» el vector es VlR. En este vector» fue "podado" tanto ADN no esencial como fue posible para producir un vector altamente compacto. Este vector es un derivado de VIJns . Este vector permite usar insertos más grandes» con menos preocupación de que secuencias indeseables sean codificadas» y optimiza la captación por parte de las células. Una modalidad de esta invención» incorpora genes que codifican gp 160» gp 120» gag de VIH y otros productos de gen de cepas adaptadas en laboratorio de VIH» tales como SF2» IIIB o MN. Los expertos en la materia reconocerán que el uso de genes de cepas de VIH-2 que tienen función análoga a los genes de VIH—1, se esperaría que generara respuestas inmunes análogas a las descritas aquí para construcciones de VIH-1. Los métodos de clonación y manipulación para obtener estos genes son conocidos para el experto en la materia. Se reconoce que la evocación de respuestas inmunes contra cepas adaptadas en laboratorio de VIH puede no ser adecuado para proveer neutral zac ón de aislados primarios de campo de VIH. De esta manera» en otra modalidad de esta invención, se incorporan genes de aislados primarios virulentos de campo de VIH en el inmunógeno de polinucleótido. Esto se logra preparando copias de ADNc de los genes virales y después subclonando los genes individuales en el inmunógeno de pol i ucleótido . Ahora se tienen disponibles públ camente secuencias para muchos genes de muchas cepas de VIH en GENBANK» y d-ichos aislados primarios de campo de VIH están disponibles del National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)» (Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas)» que ha pactado con Quality Biological» Inc.» C7581 Lindbergh Drive» Gaithersburg» Maryland 20879-1 para hacer disponibles estas cepas. Dichas cepas están disponibles ahora de la Organización Mundial de la Salud (WHO) CNetwork for HIV Isolation and Characterization» Vaccine Development Unit, Office of Research, Global Programme on AIDS (Red para el Aislamiento y Caracterización del VIH» Unidad de Desarrollo de Vacuna» Oficina de Investigación» Programa Global)» CH-1211 Genova 27» Suiza-]. A partir de este trabajo» el experto en la materia reconocerá que una de las utilidades de la presente invención es proveer un sistema para prueba y análisis» tanto in vivo como in vi tro» de tal manera que puede hacerse una correlación de la diversidad de secuencias de VIH con la serología de la neutralización de VIH, así como otros parámetros. La incorporación de genes provenientes de aislados primarios de cepas de VIH provee un inmunógeno que induce respuestas inmunes contra aislados clínicos del virus, y de esta manera cubre la necesidad no cubierta aún en el campo. Además, conforme cambian los aislados virulentos, el inmunógeno puede ser modificado para reflejar nuevas secuencias conforme sea necesario. Para mantener consistente la terminología, se sigue la siguiente convención en la presente para describir construcc ones in unógenas de pol nucleótido: "Nombre del vector—cepa de VIH—gen-elementos adicionales". De esta manera, para una construcción en la cual el gen de gp 160 de la cepa MN es clonada en el vector de expresión VUneo» el nombre dado aquí es: "VlJneo-MN-gp 160". Los elementos adicionales que se añaden a la construcción se describen en mayor detalle a continuación. Como cambia la cepa etiológica del virus» puede cambiarse el gen preciso que es óptimo para la incorporación en el agente farmacéutico. Sin embargo» como se demuestra más adelante» debido a que son inducidas respuestas de LTC que son capaces de proteger contra cepas heterólogas» la variabilidad de la cepa es menos crítica en el inmunógeno y en las vacunas de esta invención» en comparación con las vacunas a base del virus completo o de subum'dad de péptido. Además» debido a que el agente farmacéutico se manipula fác lmente para insertar un nuevo gen» este es un ajuste que se hace fácilmente por medio de las técnicas estándar de Biología molecular. El término "promotor" como se usa aquí» se refiere a un sitio de reconocimiento sobre una cadena de ADN a la cual se une la ARN polímerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con ARN polimerasa para iniciar y manejar la actividad de transcripción. El complejo puede modificarse activando secuencias denominadas "reforzadores" o inhibiendo secuencias denominadas "s lenciadores". El término "guía" como se usa aquí» se refiere a una secuencia de ADN en el extremo 5' de un gen estructural que es transcrita junto con el gen. La guía usualmente da por resultado la proteína que tiene una extensión de péptido N— term" nal denominada algunas veces una pro—secuencia. Para proteínas destinadas ya sea a secreción hacia el medio extracelular o a una membrana» esta secuencia de señal que es por lo general hidrofóbica» dirige la proteína hacia el retículo endoplásmico desde el cual es descargada hacia el destino apropiado. El término " ntrón" como se usa aquí» se refiere a unai sección de ADN que se presenta en la mitad de un gen» que no codifica un aminoácido en el producto de gen. El ARN precursor del intrón es cortado y por lo tanto no es transcrito hacia ARNm» ni traducido en proteína. El término "cassette"- se refiere a la secuencia de la presente invención que contiene la secuencia de ácidos nucleicos que se va a expresar. El cassette es similar en concepto a una cinta de cassette. Cada cassette tendrá su propia secuencia. De esta manera» intercambiando el cassette» el vector expresará una secuencia diferente. Debido a los sitios de restricciones en los extremos 5'y 3'» el cassette puede insertarse» removerse o reemplazarse fácilmente con otro cassette. El término "región 3" no traducida" o "R3*NT"» se refiere a la secuencia en el extremo 3T de un gen estructural que es usualmente transcrito con el gen. Esta región R3'NT contiene usualmente la secuencia poli A. Aunque la R3'NT es transcrita a partir del ADN» es cortada antes de su traducción en proteína. El término "región no codificadora" o "RNC" se refiere a la región que es contigua a la región R3'NT del gen estructural . La región RNC contiene una señal de terminación de transen"peión. El término "sitio de restricción" se refiere a un sitio de rompimiento específico de secuencia de las endonucleasas de restr cción. El término "vector" se refiere a algunos medios mediante los cuales pueden introducirse fragmentos de ADN en un organismo huésped o tejido huésped. Hay varios tipos de vectores incluyendo plásmidos» bacteriófagos y cósmidos. El término "cantidad efectiva" significa que se inyecta suficiente VPN para producir los niveles adecuados del polipéptido. Un experto en la materia reconoce que este nivel puede variar. Para proveer una descripción de la presente invención» se provee el siguiente antecedente sobre VIH. El virus de inmunodef ciencia humana tiene un genoma de ácido ribonucleico (ARN)» la estructura del cual está representada en la figura 1. Este genoma de ARN debe ser transcrito inversamente de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica» para producir una copia de ADNc para su clonación y manipulación de acuerdo con los métodos enseñados en la presente. En cada extremo del genoma está una repetición terminal larga que actúa como un promotor. Entre estos extremos» el genoma codifica» en varios marcos de lectura» gag— pol -env como los productos principales del gen: gag es el an-t ígeno específico de grupo; pol es la transcriptasa inversa o polimerasa; también es codificada por esta región» en un marco de lectura alternativo, la proteasa viral responsable de procesamiento posterior a la traducción, por ejemplo» de gp 160 a gp 120 y gp 41; env es la proteína de envoltura» v?f es el factor de infectiv?dad del virión» REV es el regulador de la expresión de la proteína de virión; neg es el factor regulador negativo; vpu es el factor de producti idad del virión "u"; tat es el trans—activador de transcripción; vpr es la proteína viral r. Ha sido descrita la función de cada uno de estos elementos. En una modalidad de esta invención» un gen que codifica una proteína de VIH o VIS es unido directamente a un promotor de trascripción. El gen env codifica una proteína de unión de membrana grande, gp 160, que es modificada poster ormente a la traducción en gp 41 y gp 120. El gen de gp 120 puede colocarse bajo el control del promotor de ci tomegalovirus para la expresión. Sin embargo, la gp 120 no se une en la membrana y por lo tanto» después de su expresión» puede ser secretada de la célula. Como el VIH tiende a permanecer en estado latente en células infectadas, es conveniente generar también respuesta inmunes dirigidas en epíiopes de VIH unidos a células. Adicionalmente, es conveniente que una vacuna produzca antígeno de ENV oligomérico unido a membrana similar en estructura al producido por infección viral, para generar respuestas de anticuerpo más eficaces para neutralización viral. Esta meta se logra aquí mediante la expresión n vivo del epítope asociado con la membrana celular, gp 160, para cebar el sistema inmune. Sin embargo, la expresión de gp IGO es reprimida en ausencia de REV debido a la no exportación desde el núcleo de los genes no empalmados. Para una comprensión de este sistema, debe describirse en mayor detalle el ciclo de vida del VIH. En el ciclo de vida del VIH, después de infección de uní célula huésped, el genoma de ARN del VIH es transcrito inversamente en un ADN proviral que se integra en el ADN genómico del huésped como una sola unidad de transcripción. La RTL provee el promotor que transcribe genes de VIH desde la dirección 5' hacia 3' (gag, pol» env ) » para formar un trstnscrito no empalmado de todo el genoma. El transcrito no empalmado funciona como el ARN a partir del cual son traducidos gag y pol» mientras que debe ocurrir empalme limitado para la traducción de genes codificados de env. Para que sea expresado el producto de gen regulador REV» debe ocurrir más de un evento de empalme» ya que en la armadura genómica» REV y env» se traslapan» como se muestra en la figura 1. Para que ocurra la transcripción de env» debe detenerse la transcripción de REV, y viceversa. Además» se requiere la presencia de REV para exportar ARN no empalmado desde el núcleo. Para que REV funcione de esta manera» sin embargo, debe estar presente un elemento sensible a REV (RRE) sobre el transcrito CMal m y otros, Nature 338:254-257 (1989)):.

En la vacuna de polinucleótido de esta invención» se elimina el empalme obligatorio de ciertos genes de VIH proveyendo genes completamente empalmados (es decir: la provisión de un marco de lectura abierto completo para el producto de gen deseado» sin la necesidad de cambios en el marco de lectura ni eliminación de regiones no codificadoras; los expertos en la materia reconocerán que cuando se empalma un gen particular» existe cierta libertad que se origina en la secuencia precisa; sin embargo, es aceptable en tanto se obtenga una secuencia codificadora funcional). De esta manera» en una modalidad» toda la secuencia codificadora para gp 160 es empalmada de tal manera que no se requiere expresión intermitente de cada producto de gen. Las respuestas inmunes duales humorales y celulares generadas de acuerdo con esta invención» son particularmente significativas para inhibir la infección por VIH, dada la propensión del VIH a mutar dentro de la población» así como en individuos infectados. Para formular una vacuna protectora efectiva para VIH» es conveniente generar tanto una respuesta de anticuerpo multivalente por ejemplo para gp 160 (env está aproximadamente 80% conservado a través de varias cepas B de VIH-l» que son las cepas prevalecientes en las poblaciones humanas de los Estados Unidos), el principal blanco de neutral zación sobre VIH» como células T citotóxicas reactivas a las porciones conservadas de gpl60 y» proteínas virales internas codificadas por gag. Los autores de la presente han hecho una vacuna para VIH que comprende genes de gp 160 sel ccionados de cepas comunes de laboratorio; de aislados virales primarios predominantes encontrados dentro de la población infectada; de gpl60 mutadas diseñadas para desenmascarar epítopes de anticuerpo neutralizantes de cepas cruzadas, y de otros genes de VIH representativos tales como los genes gag y pol (aproximadamente 95% conservados de un aislado a otro de VIH). Virtualmente todos los pacientes seropos tivos de VIH que no han avanzado hacia un estado i munodef ciente, hospedan LTC anti-gag, mientras que aproximadamente 60% de estos pacientes muestran LTC específicos de gp 160 de cepas cruzadas. Sin embargo» la cantidad de LTC específicos de VIH encontrada en individuos infectados que han avanzado hacia el estado patológico conocido como SIDA, es mucho más ba a» demostrando el significado de los hallazgos de los presentes inventores que pueden inducir respuestas de LTC en cepas cruzadas. Las respuestas inmunes inducidas por las construcciones de vacuna de polinucleótido de env y gag son demostradas en ratones y primates. El monitoreo de la producción de anticuerpo para env en ratones» permite la confirmación de que una construcción dada es convenientemente inmunogénica» es decir» que una alta proporción de animales vacunados muestra una respuesta de anticuerpo. Los ratones también proveen el modelo animal más fácil para probar la inducción de LTC por parte de las construcciones de los inventores» y por lo tanto se usan para evaluar si una construcción en particular es capaz de generar dicha actividad. Los monos (verde Africano» rhesus» chimpancés) proveen especies adicionales que incluyen primates para evaluación de anticuerpo en animales no roedores más grandes. También se prefiere estas especies a los ratones para las pruebas de neutralización de antisuero debido a los altos niveles de actividades neutral zantes endógenas contra retrovirus observadas en el suero de ratón. Estos datos demuestran que se engendra suficiente nmunogenicidad con las vacunas de la presente para lograr protección en experimentos en un modelo de exposición de chimpancé/VIH ?XXB en base a niveles protectores conocidos de anticuerpos neutralizantes para este sistema. Sin embargo» la definición actualmente emergente y crecientemente aceptada de protección en la comunidad científica» se está alejando de la denominada "inmunidad esteril zante", que indica protección completa de infección por VIH» hacia la prevención de la enfermedad. Varios correlativos de esta meta incluyen título viral en sangre reducido» medido ya sea mediante actividad de trascriptasa inversa de VIH» por infectividad de muestras de suero» por prueba de ELISA de p24 u otra concentración en sangre de antígeno de VIH» concentración aumentada de células T CD4+, y tasas prolongadas de sobrevivencia Cvéase por ejemplo Cohén, J. , Science 262:1820-1821, 1993, para una discusión de la definición en surgimiento de la eficacia de la vacuna contra VIH 1. Los inmunógenos de la presente invención también generan respuestas inmunes neutral zantes contra aislados infecciosos (clínicos, de campo primario) de VIH.

Inmunología A. Respuestas de anticuerpo a env. 1.- gp 160 y gp 120. Se usó un análisis de ELISA para determinar si los vectores de vacuna que expresan gp 120 secretada o gp 160 unida a membrana» son eficaces para la producción de anticuerpos específicos de env. Se provee la caracterización inicial i n v tro de la expresión de env por medio de los vectores de vacunación de la presente invención» mediante análisis de inmunoblot de lisados de células transfectadas con gp 160. Estos datos confirman y cuantifican la expresión de gp 160 usando anticuerpos monoclonales anti-gp 41 y anti—gp 120 par visualizar la expresión de gp 160 en célula transfectante. En una modalidad de esta invención, se prefiere gp 160 a gp 120, por las siguientes razones: (1) un vector inicial de gp 120 dio i munogenicidad inconsistente en ratones y no fue sensible o fue escasamente sensible en monos verdes Africanos» (2) gp 160 contribuye a anticuerpos neutral zantes adicionales, así como epítopes de LTC, proveyendo la adición de apro imadamente 190 residuos de aminoácidos debido a la inclusión de gp 41; (3) la expresión de gp 160 es más similar a env viral con respecto al ensamble tetrámero y la conformación global, lo que puede proveer epítopes de neutralización dependientes de oligómero; y (4) los autores de la presente encontraron que, a semejanza del acierto de la unión a membrana» las construcciones HA de influenza para producir respuestas de anticuerpos neutralizantes en ratones, hurones y primates no humanos, la generación de anticuerpo anti-gp 160 es superior a la generación de anticuerpo anti-gp 120. La selección de cual tipo de env , o de si una mezcla de subfrag entos de env se prefiere, se determina mediante los experimentos bosquejados más adelante. 2.— Presencia y extensión de la actividad neutral zante. Se prueba antisuero positivo de ELISA de monos y se muestra que neutraliza cepas tanto homologas como heterólogas de VIH. 3.— Anticuerpos neutral zantes V3 contra no V3. Una meta principal para la VPN de env es generar anticuerpos ampliamente neutralizantes. Se ha mostrado ahora que los anticuerpos dirigidos contra lazos de V3 son muy específicos de la cepa, y la serología de esta respuesta ha sido utilizada para definir las cepas. (a) los anticuerpos neutralizantes no—V3 parecen reconocer primariamente epítopes estructurales discontinuos dentro de gp 120. que son responsables de la unión a CD4. Los anticuerpos para este dominio son policlonales y más ampliamente de neutralización cruzada, probablemente debido a restricciones sobre mutaciones» impuestas por la necesidad del virus para unir su ligando celular. Se usó un ensayo in vi tro para probar el bloqueo de la unión de gp 120 a CD4 inmovilizado sobre placa de 96 pozos» por medio de suero de animales inmunizados. Una segunda prueba i vitro detecta la unión directa de anticuerpo a péptidos sintéticos que representan dominios de V3 seleccionados» inmovilizados sobre plástico. Estas pruebas son compatibles para antisuero de cualquiera de los tipos de animal usados en los estudios» y definen los tipos de anticuerpos neutral zantes que las vacunas de la presente invención han generado» y también proveen una correlación in v ro con la neutralización del virus. (b) gp 41 hospeda por lo menos un determinante de neutralización mayor» correspondiente al epítope lineal altamente conservado reconocido por el anticuerpo monoclonal 2F5 ampliamente neutralizante (disponible comercialmente de Viral Testing Systems Corp., Texas Co merce Tower» SOO Travis Street, Suite 4750, Houston, Texas 77002-3005 (E.U.)» o Waldhei Pharmazeut ika GmbH» Bol tzmangasse II. A-1091 Wien» Austria), así como otros sitios potenciales incluyendo el dominio bien conservado de "péptido de fusión" localizado en el extremo N de 1 a gp 41. Además de la detección de anticuerpos dirigidos contra gp 41 mediante inmunoblot como se describió antes» se utilizó una prueba in vitro para anticuerpos que se unen a péptidos sintéticos que representan estos dominios» inmov lizados sobre plástico. 4.- Maduración de la respuesta de anticuerpo. En pacientes seroposi ti vos de VIH» las respuestas de anticuerpo neutral zante avanzan principalmente de anti-V3 para incluir anticuerpos más ampliamente neutralizantes que comprenden los ep i topes del dominio estructural de gpl20 descritos anteriormente (#3), incluyendo epítopes de gp41. Estos tipos de respuestas de anticuerpo son moni toreados en el transcurso del tiempo y de vacunaciones subsecuentes.

B . Reactividades de células T contra env y gag. 1.— Generación de respuestas de LTC. Las proteínas virales que son sintetizadas dentro de las células ocasionan respuestas de LTC HCMI—restring das. Cada una de estas proteínas provoca LTC en pacientes seroposit vos. Las vacunas de la presente son capaces también de provocar LTC en ratones. La inmunogenética de la cepas de ratón es conducente para tales estudios» como se muestra con NP de influenza. Se han identif cado varios epítopes definidos para las proteínas de env, REV, nef y gag de VIH en ratones Balb/c, facilitando así el cultivo de LTC i n vi tro y las pruebas de citotoxicidad. Es ventajoso usar l neas de tumor singénicas» tal como el mastoc toma de murino P815» transfectado con estos genes para proveer blancos para LTC» así como para reestimulación específica de antígeno i_n vi tro . Se conocen métodos para determinar inmunógenos capaces de provocar l nfocitos T citotóxicos HCM clase I-restringidos. También se encontró que un péptido que abarca los aminoácidos 151—176 induce anticuerpos neutralizantes de VIH3» y estos métodos pueden utilizarse para identificar epítopes inmunogénicos para su inclusión en la VPN de esta invención. Alternativamente» podría usarse el gen completo que codifica gp 160» gp 120» proteasa o gag. Como se usa en la presente, la función efectora de células T está asociada con el fenotipo de células T maduras» por ejemplo» c totoxicidad» secreción de citocina para activación de células B» y/o reclutamiento o estimulación de macrófagos y neutrófi los. 2.- Medición de la actividades de T_,. Se probaron cultivos de células de bazo derivadas de animales vacunados para recordar antígenos específicos mediante la adición de epítopes de proteína o péptidos reco bi antes. La activación de células T por parte de tales antígenos» presentados por células de presentación de antígeno esplénicas acompañantes» CPAs» es mom'toreada por la proliferación de estos cultivos» o mediante producción de citocina. El patrón de producción de citocina también permite la clasif cac ón de la respuesta de T como tipo 1 o tipo 2. Debido a que respuestas THZ dominantes parecen correlacionarse con la exclusión de inmunidad celular en pacientes seropositivos inmunocomprometidos» es posible definir el tipo de respuesta engendrado por una VPN dada en los pacientes» permitiendo la manipulación de las respuestas inmunes resultantes. 3.- Hipersensibilidad tipo tardía (HTT). La HTT al antígeno viral después de inyección i.d. es indicativa de la inmunidad celular primariamente HCMII-restringida . Debido a la disponibilidad comercial de proteínas y péptidos sintéticos recomb antes de VIH para epi topes conocidos, las respuestas de HTT son determinadas fácilmente en vertebrados vacunados utilizando estos reactivos» proveyendo así una correlación adicional ±n vi vo para la inducción de inmunidad celular.

Protección En base a los estudios inmunológicos anteriores, es predecible que las vacunas de la presente son efectivas en vertebrados contra exposición a VIH virulento. Estos estudios se realizan en un modelo de exposición de VIHIXIß/chimpancé después de vacunación sufiente de estos animales con una construcción de VPN» o una mezcla de construcc ones de VPN comprendida de gpl60IIIB, gagttt--r, nefIIXT y REVtttn. La cepa IIIB es útil a este respecto, ya que se ha establecido en chimpancé el título de dosis letales de esta cepa. Sin embargo» se contemplan los mismos estudios utilizando cualquier cepa de VIH y los epítopes específicos a» o heterólogos a, la cepa dada. Un segundo modelo de vacunación/exposición» además de los chimpancés» es el ratón scid-hu PBL. Este modelo permite analizar el sistema inmune de l nfocitos humanos y la vacuna de la invención con exposición subsecuente a VIH en un ratón huésped. Este sistema es ventajoso» ya que se adapta fácilmente para usarse con cualquier cepa de VIH y provee evidencia de protección contra cepas múltiples de aislados de campos primarios de VIH. Un tercer modelo de exposición utiliza virus VIH/VIS híbridos (VIHS), algunos de los cuales se ha visto que infectan monos rhesus y conducen a enfermedad de i nmunodeficiencia dando como resultado la muerte Cvéase Li , J. » y otros» J. AIDS 5:639—646» 19923. La vacunación de rhesus con las construcciones de vacuna de polinucleótido de la invención es protectora contra exposición subsecuente con dosis letales de VIHS.

Resumen de la construcción de VPN El VIH y otros genes son ligados en un vector de expresión que ha sido optimizado para vacunaciones de polinucleótido. Se remueve esencialmente todo el ADN ajeno» dejando los elementos esenciales de promotor de transcripción» epítopes inmunogénicos» terminador de transcripción» origen bacteriano de replicación y gen de resistencia a antibiótico. La expresión de genes tardíos de VIH tales como env y gag depende de REV» y requiere que el elemento de respuesta de REV (RRE) esté presente sobre el transcrito de gen viral. Una forma secretada de gpl20 puede generarse en ausencia de REV mediante substitución del péptido gu a de gp!20 con una guía heteróloga tal como la de tPA (activador de plasminógeno tipo tejido), y preferiblemente por medio de un péptido guía tal come se encuentra en proteínas de mamífero altamente expresadas» tales como péptidos guía de inmunoglobulina. Los autores de 1 a presente han insertado un gen quimérico tPA-gp!20 en VUns que expresa eficientemente gpl20 secretada en células transfectadas (RD, una línea de rabdomiosarcoma humano). gp!60 cnosistrónico no produce ninguna proteína después de transfección sin la adición de un vector de expresión de REV.

Los componentes de construcción representativos incluyen (pero no están restringidos a): l.- tPA-gpl20MN; 3.- gplSOIIIS; 10.- aaaIIIB: para LTC anti-gag 11.- tPA-gpl20IIXQ; 12.- gpl60 con mutaciones estructurales: supresiones de lazo o substituc ones de VI» V2. y/o V3. 20.- genes que codifican antígenos expresados por patógenos diferentes a VIH» tales como, pero no limitados a» nucleoproteína de virus de la influenza» hemoaglutim'na» matriz» neuram m'dasa» y otras proteínas antigénicas; genes de virus de herpes simple; genes de virus de papiloma humano; antígenos de tuberculosis; ant genos del virus de la hepatitis A» B» o C. La eficacia protectora de los inmunógenos de VIH de po nucleótido contra exposición viral subsecuente es demostrada mediante inmunización con el ADN plamídico no repl cante de esta invención. Esto es ventajoso» ya que no está implicado agente infeccioso» no se requiere ensamble de partículas de virus, y se permite la selección de determinante.

Además» debido a que la secuencia de gag y proteasa, y varios de los otros productos del gen viral» esta conservada entre varias cepas de VIH» se permite la protección contra exposición subsecuente a una cepa virulenta de VIH que es homologa a» así como cepas heterólogas a» las cepas de las cuales se obtiene el gen clonado. La inyección i.m. de un vector de expresión de ADN que codifica gpl60 da co o resultado la generación de una significat va inmunidad protectora contra exposición viral subsecuente. En particular» se producen anticuerpos específicos de gp60 y LTC primarios. Las respuestas inmunes dirigidas contra proteínas conservadas pueden ser efectivas a pesar del cambio y deriva antigénica de las proteínas variables de envoltura. Debido a que cada uno de los productos de gen de VIH exhibe cierto grado de conservación» y debido a que son generados LTC en respuesta a la expresión intracelular y procesamiento de HCM» es predecible que muchos genes de virus ocasionen respuestas análogas a las logradas para gpl60. De esta manera» muchos de estos genes han sido clonados» como se muestra con las uniones clonadas y secuenciadas en el vector de expresión (ver más adelante)» para que estas construcciones sean agentes inmunogénicos en forma disponible. La invención ofrece un medio para inducir inmunidad protectora contra cepas cruzadas sin la necesidad de agentes de autorrepl cación ni adyuvantes. Además, la inmunización con los pol nucleótidos presentes ofrece varias otras ventajas. Este enfoque de vacunación sería aplicable a tumores» así como a agentes infecciosos, ya que la respuesta de LTC CD8* es importante para ambos procesos patofisiológicos. CK. Tanaka y otros, Annu. Rev. Inmuno!, 6, 359 (1988)3. Por lo tanto, la evocación de una respuesta inmune contra una proteína crucial para el proceso de transformación» puede ser un medio efectivo de protección o nmunoterapia de cáncer. La generación de alto título de anticuerpos contra proteínas expresadas después de la inyección de la proteína viral y ADN de la hormona de crecimiento humano» sugiere que éste es un medio fácil y altamente efectivo de hacer vacunas a base anticuerpo» ya sea separadamente o en combinación con vacunas de linfocitos T citotóxicos dirigidos hacia antígenos conservados. La facilidad de producción y purificación de construcc ones de ADN se compara favorablemente con los métodos tradicionales de purificación de proteina, facilitando as la generación de vacunas de combinación. Consecuentemente» pueden preparase» mezclarse y coadministrarse construcciones múltiples» por ejemplo que codifican gpl60» gpl20, gp41, o cualquier otro gen de VIH. Debido a que la expresión de proteína se mantiene después de la inyección de ADN» puede incrementarse la persistencia de la memoria de células T y B» engendrando con ello inmunidad humoral y mediada por células duradera. Las técnicas estándar de Biología molecular para preparar y purificar construcciones de ADN permiten la preparación de los inmunógenos de ADN de esta invención. Aunque las técnicas estándar de Biología molecular» por tanto» son suficientes para la producción de los productos de esta invención» las construcciones específicas descritas en la presente proveen inmunógenos novedosos de polinucléotido que producen sorprendentemente neutralización de cepas cruzadas y aislado primario de VIH» un resultado hasta ahora inalcanzable con vacunas estándar de virus completos inacti vados o de subunidad de proteína. La cantidad de ADN expresable o de ARN transen" bi ble por introducir en un receptor de vacuna» dependerá de 1 a fuerza de los promotores de transcripción y traducción usados» y de la in unogem'cidad del producto de gen expresado. En general > se administra directamente una dosis i munológicamente o prof lácticamente efectiva de aproximadamente 1 ng a 100 mg» y de preferencia apro imadamente 10 µg a 300 µg» en el tejido muscular. También se contempla la inyección subcutánea» introducción intradérmica» impresión a través de la piel» y otros modos de administración tales como liberación intraperi oneal» intravenosa» o inhalación. También se contempla la provisión de vacunaciones de refuerzo. Después de la vacunación con el inmunógeno de polinucléotido de VIH» se contempla también el refuerzo con inmunógenos de proteína de VIH tales como gpl60» gpl20» y productos de gen de gaq. También es ventajosa la admin stración parenteral, tal como intravenosa» tramuscular, subcutánea u otro medio de administración» de la proteína interleucina 12, concurrentemente con o subsecuente a» la introducción parenteral de la VPN de esta invención. El pol nucléotido puede estar descubierto» esto es» no asociado con ninguna proteína» adyuvante ni otro agente que tenga impacto sobre el sistema inmune del receptor. En este caso» es conveniente que el pol nucléotido esté en una solución fisiológicamente aceptable tal como por ejemplo solución salina estéril o solución salina amortiguada estéril» pero no limitado a las mismas. Alternativamente» el ADN puede estar asociado con liposomas» tal como liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica» como una mezcla ADN y un liposoma» o puede estar asociado el ADN con un adyuvante conocido en la técnica para reforzar las respuesta inmunes» tal como una proteína u otro vehículo. También pueden usarse convenientemente agentes que ayudan en la captación celular de ADN» tal como por ejemplo iones calcio» pero sin limitarse a ellos. Estos agentes son referidos en general en la presente como reactivos que facilitan la transfección y vehículos farmacéuticamente aceptables. Las técnicas para recubrimiento de microproyectiles recubiertos con polinucléotido son conocidas en la técnica y son útiles también en relación con esta invención. Se ofrece los siguientes ejemplos a manera de ilustración» y no están destinados a limitar la invención de ninguna manera.

EJEMPLO 1 Descripciones de Materiales Vectores pF411 y pF412: Estos vectores fueron subclonados del vector pSPS2 que fue construido en el laboratorio R. Gallo. pSP62 es un reactivo disponible de Biotech Research Laboratories» Inc. pSP62 tiene un fragmento XBal de 12.5 kb del genoma HXB2 subclonado de HXB2 lambda. La digestión con Salí y Xbal de pSP62 produce fragmentos de HXB2: 5'-XbaI/SalI, de 6.5 Kb y 3f-Sal I/Xbal » de 6 Kb. Estos insertos fueron subclonados en pUC 18 en los sitios Smal' y Salí» produciendo pF411 (5»-XbaI/Sal I ) y pF412 ( 3'-XbaI/Sal I ) . pF411 contiene gag/pol y pF412 contiene tat/rev/env/nef .

Reactivos de Rep1 igen: rev recombinante (IIIB), #RP1024-10. gpl20 rec. (IIIB), 8RP1001-10. anticuerpo monoclonal anti-rev , »RP1029—10. mAB anti-gpl20, 81C1, «RP1O1O-10.

Programa de Investigación de SIDA y Reactivo de Referencia: Hibridoma de mAB anti-gp41» Chessie 8» #526. Las estrategias se diseñan para inducir respuestas tanto de linfocitos T citotóxicos (LTC) como de anticuerpo neutralizante para VIH, dirigidas principalmente en los productos de gen de VIH gag (aproximadamente 95% conservada) y env (gpl60 o gpl20» 70-80% conservada). gplGO contiene los únicos epítopes de anticuerpo neutralizante conocidos sobre la partícula de VIH» mientras que la importancia de las respuestas de LTC anti-env y anti—gag es puesta de relieve por la conocida asociación entre la aparición de estas inmunidades celulares y la eliminación de la vire ia primaria después de la infección» qus ocurre antes de la aparición de anticuerpos neutralizantes» así como una función para LTC en mantener el estado l bre de enfermedad. Debido a que el VIH es notable por su diversidad genética» los autores de la presente esperan obtener mayor amplitud de anticuerpos neutralizantes incluyendo varios genes env representativos derivados de aislados clínicos y gp41 (aproximadamente 90% conservado), mientras que el gen gag altamente conservado debe generar amplias respuestas de LTC a cepas cruzadas.

EJEMPLO 2 Expresión Heteróloga de Productos Tardíos de Gen de VIH Los genes estructurales de VIH tales como env y gag requieren la expresión del gen regulador VIH, rev, para producir eficientemente proteínas de longitud completa. Los autores de la presente han encontrado que la expresión rev— dependiente de gag produjo bajos niveles de proteína, y que el mismo rev puede ser tóxico para las células. Aunque lograron niveles relativamente altos de expresión rev-depend ente de gplGO in vitro, esta vacuna provocó bajos niveles de anticuerpos para gplGO después de la inmunización i vivo con ADN de rev/gplGO. Esto puede originarse de los conocidos efectos citotóxicos de rev así como de la dificultad incrementada para obtener la función rev en iotúbulos que contienen cientos de núcleos (la proteína de rev necesita estar en el mismo núcleo que el transcrito dependiente de rev para que ocurra la expresión de proteína gag o env) . Sin embargo» ha sido posible obtener expresión independiente de rev usando modif caciones seleccionadas del gen de env, gag. La evaluación de estos plásmidos para propósitos de vacuna se encuentra en avance. En general» las vacunas de la invención han util zado primariamente genes de env y gag de VIH (IIIB) para optimizar la expresión dentro del vector de vacunación generalizado de la presente invención, VIJns, que está comprendido de un promotor i med? ato-temprano (IE) de CMV, sitio de pol iadeni lación de BGH, y un esqueleto de pUC. Puede lograrse variar las eficiencias, dependiendo de qué tan grande se use un segmento de gen (v.gr., gpl20 contra gplGO) , de la expresión independiente de rev, para env, reemplazando su péptido guía secretor natural con el del gen de activador de plasminógeno específico de tejido (tPA) y expresado el gen quimérico resultante detrás de'l promotor CMVIE con el intron A de CMV. tPA-gpl20 es un ejemplo de un vector de gplZO secretado construido de esta manera, que funciona suficientemente bien para provocar respuestas inmunes anti—gpl20 en ratones y monos vacunados. Debido a los reportes de que proteínas ancladas en membrana pueden inducir respuestas de anticuerpo mucho más substanciales (y quizás más específicas para neutralizac ón de VIH), en comparación con las proteínas secretadas, así como para ganar epi topes inmunes adicionales, los autores de la presente prepararon VlJns-tPA-gpl60 y VUns-rev/gpl60. El vector tPA—gpl60 produjo cantidades detectables de gpl60 y gp 20, sin la adición de rev, como se muestra con el análisis de in unoblot de células transfectadas, aunque los niveles de expresión fueron mucho más bajos que los obtenidos para rev/gplGO, un plásmido de expresión de gpl60 dependiente de rev. Esto es probablemente porque ocurren regiones inhibidoras (designadas como INS ) , que confieren dependencia a rev sobre el transcrito de gplGO, en sitios múltiples dentro de gplGO» incluyendo en el extremo COOH de gp41 (ver esquema más adelante). Se preparó un vector para una forma truncada COOH— terminal de tPA—gplSO, tPA—gpl43, que fue diseñada para incrementar los niveles de expresión global de env mediante eliminación de estas secuencias inhibidoras. El vector gpl43 también elimina regiones de gp41 intracelulares que contienen motivos de péptido (tales como leu—leu) que se sabe ocasionan desviación de proteínas de membrana a los lisosomas, en lugar de la superficie celular. De esta manera, puede esperarse que gp 143 incremente la expresión tanto de proteína de env (reduciendo la dependenc a a rev ) como la eficiencia de transporte de proteína a la superficie celular, en comparación con gpl60 de longitud completa, en donde estas proteínas pueden ser más capaces de provocar anticuerpos anti-gp ISO después de vacunación con ADN. tPA—gp 143 se modificó posteriormente mediante mutagénesis silenciosa extensiva de la secuencia del elemento de respuesta a rev (RRE) (350 bp ) para eliminar secuencias inhibidoras adicionales para la expresión. Esta construcción, gp 143/mutRRE, se preparó de dos formas: ya sea eliminando (forma A) o reteniendo (forma B) sitios de rompimiento proteolítico para gp 120/41. Se prepararon ambas formas debido a que la literatura reporta que la vacunación de ratones ut lizando gp 160 no escindible expresado en vacuna» evocó niveles mucho más altos de anticuerpos para gp 160 de los que produjeron las formas escindí' bles. Una prueba de ELISA cuantitativa para la expresión de gp 160/gp 120 en transfectantes de células» fue desarrollada para determinar las capacidades de expresión relativa para estos vectores. La transfección in v tro de 293 células» seguida por cuantificación de gpl20 asociada a células contra gpl20 secretada/l berada» produjo los siguientes resultados: (1) tPA—gp 160 expresó 5 a 10 veces menos gp 120 que rev/gp 160 con proporciones similares retenidas i tracel ul ármente contra las traficadas hacia la superficie celular; (2) tPA—gpl43 dio 3 a 6 veces más secreción de gp 120 que rev/gplGO» con apenas niveles bajos de gp!43 asociada con células» confirmando que la cola citoplas ica de gpl60 ocasiona retención intracelular de gp 160» que puede superarse mediante supresión parcial de esta secuencia; y (3) tPA-gp 143/mutRRE A y B dieron aproximadamente 10 veces más niveles de expresión de proteína de lo que hizo tPA—gpl43, mientras que se confirmó la eliminación de procesamiento proteolítico para la forma A. De esta manera, la estrategia de la invención para incrementar la expresión ndependiente de rev» ha producido incrementos escalonados en la expresión global» así como redirección de la gpl43 anclada en la membrana hacia la superficie celular» lejos de los lísosomas. Es importante observar que sería posible insertar secuencias de gp 120 derivadas de varios aislados virales dentro de un cassette de vector que contiene estas modif caciones» que residen ya sea en el extremo NH-, (guía de tPA) o el extremo COOH (gp41)» en donde existen unas pocas diferencias antigénicas entre diferentes cepas virales. En otras palabras» esta es una construcción genérica que puede ser modificada fácilmente insertando gpl20 derivada de varios aislados virales primarios para obtener vacunas clínicamente relevantes. Para aplicar estas estrategias de expresión a los virus que son relevantes para los propósitos de la vacuna, y para confirmar la general i dad de los enfoques de la invención, los autores prepararon un vector de tPA-gpl20 derivado de un aislado primario de VIH (conteniendo el lazo de péptido V3 de consenso de NorteAmérica; fenotipos macrofágo-tropícos y no inductores de sincitio). Este vector dio alta expresión/secresión de gpl20 con 293 células transfectadas y provocó anticuerpos anti—gpl20 en ratones, demostrando que estaba clonado en una forma funcional. También serán usados genes de gp 160 aislados primarios para la expresión, de la misma forma que para gp 160 derivado de cepas de laboratorio.

EJEMPLO 3 Respuestas Inmunes a Vacunas de Pol nucleótido de env de VIH-1 Monos verdes africanos (AGM) y monos Rhesus (RHM) que recibieron vacunas de ADN de gp 120 mostraron bajos niveles de anticuerpos neutralizantes después de 2-3 vacunaciones, los cuales no se pudieron incrementar mediante vacunación adicional. Estos resultados» así como el conocimiento creciente dentro del campo de las vacunas de VIH» de que la gp 160 oligomérica es probablemente un antígeno blanco más relevante para provocar anticuerpos neutral zantes que los monómeros de gp 120 (Moore y Ho , J. Virol. 67: 863 (1993)), han conducido a los inventores de la presente a enfocarse en la obtención de expresión efectiva de vectores basados en gp 160 (véase anteriormente). También fueron vacunados ratones y AGM con la vacuna tPA—gp 120 derivada de aislado primario. Estos animales exhibieron títulos de anticuerpo de punto final recíproco de péptido anti—V3 (usando secuencia homologa) que varían de 500— 500Q» demostrando que este diseño de vacuna es funcional para aislados virales clinicamente relevantes. Las vacunas basadas en gp 160. rev-gp!60 y tPA-gplGO» fallaron para provocar consistentemente respuestas de anticuerpo en ratones y primates no humanos» o produjeron títulos bajos de anticuerpo. Los resultados iniciales de los autores de la presente con el plásmido tPA—gpl43 produjeron títulos de media geométrica > 103 en ratonas y AGM después de dos vacunaciones. Estos datos indican que los autores de la presente han mejorado significativamente la inmunogenicidad de vacunas tipo gpl60 aumentando los niveles de expresión. Esta construcción» así como los vectores tPA-gpl43/mutRRE A y B» continuarán caracterizándose en sus respuestas de anticuerpo» especialmente para neutralización de virus. Singnificati vamente. la vacunación con ADN de gpl20 produjo potentes respuestas de células T auxiliares en todos los compartimientos linfáticos analizados (bazo, sangre» nodos inguinal » esentérico e iliaco) con perfiles de secreción de citocina semejantes a TM (es decir» producción de g—interferon e IL-2» con poco o nada de IL-4 ) . Estas citocinas promueven generalmente fuerte inmunidad celular y han sido asociadas con el mantenimiento de un estado libre de enfermedad en pacientes VIH seropositivos. Se ha visto que los nodos linfáticos son sitios primarios para la replicación de VIH» hospedando grandes depósitos de virus» aún cuando el virus no puede ser detectado fácilmente en la sangre. Una vacuna que puede provocar respuestas inmunes anti—VIH en una variedad de sitios linfáticos» tal como los autores de la presente han mostrado con la vacuna de ADN de la invención» puede ayudar a prevenir la colonización exitosa de los sitios linfáticos después de la infección inicial. Como se afirmo anteriormente» los autores de la presente consideran que la realización de los siguientes objetivos es esencial para aumentar al máximo las probab lidades de éxito con este programa: (1) vectores basados en env capaces de generar respuestas de anticuerpo neutralizantes más fuertes en primates; (2) vectores gag y env que? evocan fuertes respuestas de linfocitos T caracterizadas por funciones efectoras auxil ares y LTC en primates; (3) el uso de genes env y gag de cepas de VIH—1 cl nicamente relevantes en las vacunas de la invención, y caracterización de las respuestas inmunológicas que evocan, especial ente neutralización de aislados primarios; (4) demostración de protección en un modelo de exposición animal, tal como chimpancé/VIH (IIIB) o rhesus/VIHS , usando vacunas optimizadas apropiadas; y, (5) determ ación de la duración de las respuestas inmunes apropiadas para uso clínico. Se ha hecho avance signif cat vo sobre los primeros tres de estos objetivos, y los experimentos avanzan para determinar si las recientes construcciones de vacunación de la invención para gpl60 y gag mejorarán sobre estos resultados iniciales.

EJEMPLO 4 Vectores para la Producción de Vacuna A) Vector de expresión VUneo: Fue necesario remover el gen amp1" usado para selección de antibiótico de bacterias que hospedan V1J porque la ampicilina no puede usarse en fermentadores a gran escala. El gen amp*" del esqueleto de pUC de V1J fue removido por di?iestión con enzimas de restricción SspI y Eam 1051. El plásmido remanente fue purificado por medio de electrofóresis en gel de agarosa» rasurado en sus extremos con ADN polimerasa T4» y después tratado con fosfatasa alcalina intestinal de becerro. El gen Kan*" disponible comercial ente» derivado del treinsposon 903 y contenido dentro del plásmido pUC4K» fue extirpado usando la enzima de restricción PstI» purificado mediante electrofóresis de gel de agarosa, y rasurado en sus extremos con ADN polimerasa T4. Este fragmento fue ligado con el esqueleto de V1J, y se derivaron plásmidos con el gen kan'" en cualquier orientación, que fueron designados como VIJneo 8's 1 y 3. Cada uno de estos plásmidos fue confirmado mediante análisis de digestión con enzima de restricción y secuenciación de ADN de las regiones de unión, y se mostró que produce cantidades de plásmido similares a las de V1J. La expresión de productos de gen heterólogo fue también comparable a V1J para estos vectores VIJneo. Los autores de la presente invención seleccionaron arbitrariamente VIJneo#3» referido como VIJneo en adelante» que contiene el gen kanr" en la misma orientación que el gen ampr" en VIJ como la construcción de expresión.

B) Vector de expresión VIJns: Se agregó un sitio Sfil a VIJneo para facilitar los estudios de integración. Se agregó un adaptador de Sfil de 13 pares de bases» disponible comercialmente (New England BioLabs) en el sitio Kpnl dentro de la secuencia BGH del vector. Se linealizó VIJneo con Kpn 1, se purificó en gel» se rasuró med-'iante ADN polimerasa T4» y se ligó con el adaptador rasurado Sfi]:. Se eligieron aislados clónales mediante mapeo de restricción y se verificó mediante secuenciación a través del adaptador. El nuevo vector fue designado como VIJns. La expresión de genes heterólogos en VIJns (con Sf l) fue comparable con la expresión de los mismos genes en VIJneo (con Kpn 1) .

C) VIJns-tPA: Para proveer una secuencia heteróloga de péptido guía para proteínas secretadas y/o de membrana, se modificó VIJn para incluir la guía de activador de plasmínógeno humano específico de tejido (tPA). Dos pol gómeros complementarios sintéticos se fijaron» y después se ligaron en VIJn que había sido digep'do con Bglll. Estos oligó eros de sentido y anti sentido fueron: 5'-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCGCCC AGCGA-3*, SEQ.ID:18:, y 5'-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GACTGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3'.

La secuenc a de Kozak está subrayada en el oligómero de -., sentido. Estos oligómeros tienen bases colgantes compatibles para ligación con secuencias escindidas por Bglll. Después de ligación, el sitio Bglll hacia el extremo 5' es destruido» mientras que el sitio de Bglll hacia el extremo 3" es retenido para ligaciones subsecuentes. Ambos sitios de unión» así como toda la secuencia guía de tPA fueron verificados mediante secuenciación de ADN. Adicionalmente» para conformar con el vector optimizado de consenso de la presente invención» VUns (=VIJneo con un sitio Sfil)» se colocó un sitio de restricción Sf-i' I en el sitio Kpnl dentro de la región terminadora de BGH de VIJn-tPA» rasurando el sitio Kpnl con ADN polimerasa T4 seguido por ligación con un adaptador Sfil (catálogo ttl 138» New England Biolabs). Esta modificación fue verificada mediante digestión con enzimas de restricción y electrofóresis en gel de agarosa.

EJEMPLO 5 I. Construcciones de Vacuna de env de VIH: Vacunas que producen antígeno derivado de env secretado (gp!2Q y gpl4Q ) : Se realizó expresión del gen env dependiente de REV co o gpl20, de la manera siguiente: se clonó gp!20 mediante RCP de la cepa MN de VIH con la secuencia natural de péptido guía (VIJns—gpl20) , o como una fusión con el péptido guía de activador de plasminógeno de tejido (tPA), reemplazando el péptido guía natural (VIJns-tPA-gpl20) . Se mostró que la expresión de rPA-gpl20 es i dependiente de REV CB.S. Chapman y otros, Nuc. Acids Res. 19» 1979 (1991); debe observarse que otras secuencias guía proverían una función similar al hacer al gen de gpl20 independ ente de REV3. Esto se logró preparando las siguientes construcciones de gpl20 utilizando los vectores anteriormente descritos: EJEMPLO 6 Construcciones de Vacuna de gp!20: A. VIJns-tPA-HIVMN gp!2Q: El gen gpl20 de VIHMIJ (Medi mune) se amplificó mediante RCP utilizando oligómeros diseñados para remover los primeros 30 aminoácidos de la secuencia de péptido guía y para facilitar la clonación en VUns-tPA» creando una proteína quimérica que consiste del péptido guía de tPA seguido por la secuencia remanente de gp!20 después del residuo de aminoácido 30. Este diseño permite la expresión de gpl20 in ependientemente de REV y la secreción de gpl20 soluble de las células que hospedan a este plásmido. Los oligómeros de RCP de sentido y anti sentí" do usados fueron: S'-CCC CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TGGGTC ACA GTC-3' , y 5'-C CCC AGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT C-3 ' . Está subrayado el codón de detención de traducción. Estos oligómeros contienen sitios de enzima de restricción Ba Hl en cualquier extremo del marco de estructura abierta de traducción con un sitio Bcll localizado en el extremo 3' al sitio BamHl del oligómero de sentido. El producto de RCP fue digerido secuencialmente con Bcll, seguido por BamHl, y ligado en VIJns—tPA» que había sido digerido con Bglll, seguido por tratamiento con fosfatasa alcalina intestinal de becerro. El vector resultante fue secuenciado para confirmar la fusión en estructura entre la guía de tPA y la secuencia de codificación de gpl20, y se verificó la expresión y secreción de gpl20 mediante análisis de inmunoblot de glóbulos rojos transfectados.

B. VIJns-tPA-HIVt-...-^ qp!20 : Este vector es análogo a I. A., excepto que se usó la cepa IIIB de VIH para la secuencia de gplZO. Los oligómeros de RCP de sentido y antisentido usados fueron: 5*-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3T, y 5T-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TC-31, respectivamente. Estos oligómeros proveen sitios Bcll en cualquier extremo del injerto» así como un EcoRV hacia el extremo 5" del sitio Bcll en el extremo 3'. El sitio 5 '-term nal de Bcll permite ligación en el sitio Bglll de VIJns—tPA, para crear un gen de tPA-gpl20 quimérico que codifica una secuencia guía de tPA y gpl20 sin su secuencia guía natural. Los productos de ligación se verificaron mediante digestión con enzimas de restricción y secuenc ación de ADN.

EJEMPLO 7 Construcciones de Vacuna de pg!4Q: Estas construcciones se prepararon mediante RCP» de manera similar a tPA-gpl20» con la guía de tPA en lugar de la guía natural» pero diseñada para producir antígeno secretado» terminando el gen inmediatamente en el extremo NH.., del péptido de transmembrana (secuencia de aminoácidos carboxi-termi nal proyectada = NH-.- TNWLWYIK-COOH) . A diferencia de las construcciones que producen gpl20» las construcciones de gpl40 deben producir antígeno oligomérico y retienen epítopes de neutralización de anticuerpo contenidos en gp41, tales como ELDKWA, definido por el anticuerpo monoclonal 2F5. Las construcciones se prepararon de dos formas (A o B) dependiendo de si los sitios de rompimiento proteolítico de gp!60 en la unión de gplZO y gp41, se retuvieron (B) o se eliminaron (A) mediante substituciones apropiadas de aminoácidos como describe Kieny y otros, (Prot. Eng.2: 219-255 (1988) (secuencia tipo silvestre = NH-.,,-...KAKRRVVQREKR ...COOH, y la secuencia mutada = NH- -...KAQNHVVQNEHQ...COOH, con los aminoácidos mutados subrayados).

A. VIJns-tPA-gpl40/m?tRRE-A/RVS-l R3'NT (Basada en VIH-1,TT^): Esta construcción se obtuvo mediante RCP utilizando los siguientes oligómeros de RCP de sentido y antisentido: 5*-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG CTC TGG-3', SEQ. ID: :, y 5 '-CGC AGG GGA GGT GGT CTA GAT ATC TTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT G-3* » para obtener un segmento de AvrlI/EcoRV del vector IVB (que contiene el segmento RRE—A optimizado). La R3*NT» preparada como un segmento sintético de gen, que está derivada del retrovirus 1 de simio (RVS—1, ver más adelante), fue insertada en un sitio de enzima de restricción Srfl introducido inmediatamente en el extremo 3* del marco de lectura abierta de gpl40. Se ha descrito previamente que esta secuencia de RNT facilita la expresión independiente de rev, de env y gag de VIH.

B. VIJns-tPA-gpl40/mutRRE-B/RVS-l R3'NT (basado en VIH-1„T,-.): Esta construcción es similar a IIA, excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos usando la construcción IVC como material de partida.

C. VIJns-tPA-ppl4Q/opt3Q-A (basado en VIH-1TTTI?): Esta construcción se derivó de IVB mediante digestión con enzimas de restricción Avrll y Srfl» seguida por ligación de un segmento de ADN sintético correspondiente a gp30» pero comprendido de codones óptimos para traducción (véase gp32—opt más adelanta). Se obtuvo el ADN de gp30~opt a partir de gp32-opt» mediante amplificación de RCP utilizando los siguientes ol- gomeros de sentido y antisentido: 5*-GGT ACA CCT AGG CAT CTG GGG CTG CTC TGG-3 » y 5'-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GTT GAT G-3 ' » respectivamente. Este segmento de ADN fue digerido con enzimas de restricción Avrll y EcoRV» y ligado en VIJns-tPA-gpl43/opt32-A (IVD), que había sido digerido con Avrll y Srfl» para remover el segmento correspond ente de ADN. Los productos resultantes se verificaron mediante secuenciacíón de ADN de las uniones de ligación y análisis de inmunoblot.

D. VIJns-tPA-gpl40/opt3Q-B (basado en IH- T^): Esta construcción es similar a IIC» excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos.

E. VIJns-tPA-gpl40/opt all-A El gen env de esta construcción está comprendido completamente de codones óptimos. Las regiones constantes (Cl, C5» gp32). son aquéllas descritas en IVB»D,H» con un segmento de ADN sintético adicional correspondiente a las regiones variables 1—5» que es insertado usando un segmento de ADN sintético comprendido de codones óptimos para traducción (véase el ejemplo más adelante basado en MN V1-V5 de VIH-1).

F. VIJns-tP -gpl40/opt a11-B : Esta construcción es similara a IIE» excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos.

G. VIJns-tPA-gpi4Q/opt all-A (cepas diferentes de IIIB): Esta construcción es similar a IIE anterior, excepto que. se usan secuencias de aminoácidos de env de cepas diferentes a IIIB para deter ar uso óptimo de codón en todas las regiones variables (VI—V5).

H. VlJns-tPA-gpl40/opt all-B (cepas diferentes de IIIB): Esta construcción es similar a IIG» excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos.

EJEMPLO B Construcciones de vacuna da gp!60: Las construcciones se prepararon en dos formas (A o B) dependiendo de los sitios de rompimiento proteolítico de gplSO» según se describió anteriormente. 6G A. VIJns-rev/env : Este vector es una variación del que se describe en la sección D anterior» excepts que toda la región codificadora de tat en el exón 1» está suprimida hasta el comienzo del marco de lectura abierta de REV. VlJns-gpl60XXIT (véase la sección A anterior) fue digerido con enzimas de restricción PstI y Kpnl para remover la región 5' del gen de gpl60. Se usó amplificación por RCP para obtener un seg ento de ADN que codifica el primer exón de REV hasta el sitio de Kpnl en gp 160 de la clona genómica HXB2. Los oligómeros de RCP de sentido y antisentido fueron : 5-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC-3* » y 5*-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC—3'» respect vamente. Estos oligómeros proveen sitios de enzima de restricción PstI y Kpnl en los extremos 5T- y 3'— del fragmento de ADN» respectivamente. El ADN resultante fue digerido con Pstl y Kpnl» purificado de un gel electroforético de agarosa y ligado con VlJns-gpl60(PstI/KpnI ) . El plásmido resultante se verificó mediante digestión con enzima de restricción.

B. VlJns-gplGO: Se clonó gpl60 de VIHIXIt- mediante amplificación por RCP del plásmido pF4l2 que contiene la mitad 3'-term al del genoma de VIHIIXt> derivado de la clona de VIHXIXt> HXB2. Los oligómeros de la RCP de sentido y antisentido fueron: 5'-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAG AAA TAT CAG C-3'. y 5"-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3', respect amente. La secuencia de Kozak y el codón de detención de traducción están subrayados. Estos oligómeros proveen sitios de enzima de restricción Bcll fuera del marco de lectura abierta de traducción en ambos extremos del gen env. (los sitios digeridos con Bcll son compatibles para ligación con sitios digeridos con Bglll» con pérdida subsecuente de sensibilidad a ambas enzimas de restricción. Se eligió Bcll para clonación por RCP de gpl60» ya que este gen contiene sitios internos de Bglll y también BamHl). El oligómero de an senti do también inserta un sitio EcoRV justo antes del sitio Bcll» como se describió antes para otros genes deri vados en RCP. El gen de gp!60 amplificado fue purificado en gel de agarosa» digerido con Bcll» y ligado a VIJns» que había sido digerido con Bglll y tratado con fosfatasa alcalina intestinal de becerro. El gen clonado era de aproximadamente 2.6 kb de tamaño y cada unión de gplSO con VIJns fue confirmada mediante secuenciación de ADN.

C. VlJns-tPA-gpl60( basado en VIH-1 ): Este vector es similar al ejemplo KC) anterior» excepto que se obtuvo» mediante RCP» gpl60 -de longitud completa» sin la secuencia guía natural. El oligómero de sertido fue el mismo usado en I.C.» y el oligómero de antisentido fue 5T-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3T. Estos oligómeros proveyeron sitios de Bcll en cualquier extremo del inserto» asi como un EcoRv hacia el extremo 5r del sitio Bcll en el extremo 3'. El sitio 5' terminal de Bcll permite la ligación en el sitio Bglll de VIJns—tPA para crear un gen quimérico de tPA-gpl60 que codifica la secuencia guía de tPA y gpl60 sin su secuencia guía natural. Los productos de ligación se verificaron mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación de ADN.

D. VlJns-tPA-gplGO/opt Cl/opt41-A (basado en VIH-1TTT.-.): Esta construcción se basó en IVH» que tiene un segmento de codón optimizado completo para C5 y gp41, en lugar de gp32, con un segmento de codón optimizado adicional (ver más adelante) reemplazando Cl en el extremo amino de gpl20 después de la guía de tPA. El nuevo segmento Cl fue unido al segmento rerranente de gpl43 mediante RCP ETE, utilizando los siguientes oligómeros para RCP para sintetizar el segmento unido Cl/143: 5'-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. El gen de gpl43 resultante contiene uso óptimo de codón, excepto para las regiones V1-V5, y tiene un sitio único de enzima de restricción Pmel colocado en la unión de Cl y VI para inserción de regiones variables de otros genes de VIH.

E. VUns-tPA-gpl60/opt Cl/opt41-B (basado en VIH-1^^^„): Esta construcción es similar a IID, excepto que los sitios de rompimiento preoteol tico de env han sido retenidos.

F. VlJns-tPA-gpl60/opt all-A (basado en VIH-1TTTH,) El gen de env de esta construcción está comprendido completamente de codones óptimos como se describió antes. Las regiones constantes (Cl» C5, gp32) son las descritas en IIID»E, que se usaron como un cassette (empleado para todas las gpl60 co pletamente optimizadas) mientras que las regiones variables» V1-V5» están derivadas de un segmento de ADN sintético comprendido de codones óptimos.

G. VlJns-tPA-gpl60/opt all-B : Esta construcción es similar a IIIF, excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos.

H. VlJns-tPA-gpl60/opt all-A (cepas diferentes ds IIIB): Esta construcción es similar a IIIF anterior» excepto que se usaron secuencias de aminoácidos de env de otras cepas diferentes de IIIB para determinar el uso de codón óptimo en todas las regiones variables (V1-V5).

I . VUns-tPA-gpl60/opt all-B (cepas diferentes de IIIB): Esta construcción es similar a ISIH» excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos.

EJEMPLO 9 Construcciones de vacuna de gp!43: Estas construcciones se prepararon mediante RCP similarmente a otras construcciones que contienen tPA descritas anteriormente (tPA-gpl20, tPA—gpl40, y tPA—gpl60) , con la guía de tPA en lugar de la guía natural, pero diseñada para producir env unido a membrana terminado en COOH (secuencia de aminoácidos intracelular proyectada = NH2-NRVRQGYSP-COOH ) . Esta construcción fue diseñada con el propósito de combinar la expresión incrementada de env que acompaña la introducción de tPA y reduce al mínimo la posibilidad de que un transcrito o región de péptido que corresponde a la porción intracelular de env, pudiera impactar negati vamente la expresión o estabilidad/transporte de la proteína a la superficie celular. Se prepararon construcciones en dos formas (A o B), dependiendo de si los sitios de rompimiento propio! ítico de gpl60 fueron removidos o retenidos, como se describió anteriormente. El fragmento de gp41 residual que se origina del truncamiento a gp!43» es referido como gp32.

A. VIJns-tPA-gpl43: Esta construcción se preparó mediante RCP utilizando el plásmido pF4l2 con los siguientes oligómeros de RCP de sentido y ant sent do: 5'-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3'» SEQ. ID: » y 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3* . El segmento de ADN resultante contiene sitios de restricción de Bcll en cualquier extremo para clonación en VUns-tPA/BglII-digerido con un sitio Srfl localizado inmediatamente en el extremo 3T- al marco de lectura abierta de env. Las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN de uniones de ligación y análisis de nmunoblot de células transfectadas.

B. VlJns-tPA-gpl43/m?tRRE-A: Esta construcción se basó en IVA cortando el segmento de ADN» utilizando el sitio único de enzima de restricción Mu í y el sitio Srfl hacia el extremo 3' descrito anteriormente. Este segmento corresponde a una porción del dominio C5 de gpl20 y la totalidad de gp32. Se unió un segmento de ADN sintético correspondiente a aproximadamente 350 pb del elemento de respuesta de rev (RRE A) de gpl60» comprendido de codones óptimos para traducción, al segmento remanente gp32 mediante RCP de extensión de traslapo de empalma (ETE) creando un sitio de enzima de restricción Avrll en la unión de los dos segmentos (pero sin cambios en la secuencia de aminoácidos). Estas reaccionas de RCP se efectuaron usando los siguientes ol gómeros de RCP de sentido y anti sentido para generar el dominio que contiene gp32: 5r-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3' y 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3 ' (que fue usado como el oligómero de antisentido para IVA), respectivamente. El segmento RRE mutado (mutRRE-A) fue unido a la secuencia tipo silvestre de gp32 mediante RCP ETE utilizando el siguiente oligómero de sentido: 5'-GGT ACA CAA TTG GAG GAG CGA GTT ATA TAA ATA TAA G—3' , y el oligómero de antisentido usado para hacer el segmento gp32. El segmento de ADN unido resultante fue digerido con enzimas de restricción Muñí y Srfl, y ligado en el plásmido original digerido con gpl43/MunI/SrfI . La construcción resultante fue verificada mediante secuenciación de ADN de ligación y análisis de las uniones de RCP ETE e inmunoblot de células transfectadas.

C. VIJns-tPA-gpl43/mutRRE-B : Esta construcción es similar a IVB, excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos utilizando el segmento del gen sintético mutRRE-B» en lugar de utRRE—A.

D . VUns-tPA-gpl43/opt32-A : Esta construcción fue derivada de IVB mediante digestión con las enzimas de restricción Avrll y Srfl» seguido por ligación de un segmento de ADN sintético correspondiente a gp32. pero comprendido de codones óptimos para traducción (véase gp32optm más adelante). Los productos resultantes fueron verificados mediante secuenciación de ADN de las uniones de ligación y análisis de inmunoblot.

E. VlJns-tPA-gpl43/opt32-B : Esta construcción es similar a IVD» excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos utilizando IVC como el plásmido n cial. 5 G. VIJns-tPA-GP143/RVS-lR3 ' T : Esta construcción es similar a IVA» excepto que la R3'NT derivada del retrovirus-1 de simio (RVS-1, ver más adelante) fue insertada en el sitio de enzima de restricción Srfl introducido inmediatamente en el extremo 3r del marco de lectura abierta de gpl43. Se ha descrito anteriormente que esta secuencia de RNT facilita la expresión independiente de rev, de env y gag de VIH. IB H. VlJns-tPA-gpl43/QPt Cl/opt32A: Esta construcción se basó en IVD, teniendo un seg ento de codón optimizado co pleto para C5 y gp32, con un segmento de codón optimizado adicional (véase más adelante) ree plazando Cl en el extremo amino del gpl20 después de la guía de tPA. El nuevo segmento de Cl fue unido al segmento remanente de gpl43 mediante RCP ETE utilizando los siguientes oligómeros de RCP para sintetizar el segmento unido Cl/143: 5'- CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. El gen gpl43 resultante contiene uso óptimo de codón, excepto para las regiones V1-V5, y tiene un sitio único de enzima de restricción Pmel colocado en la unión de Cl y VI para inserción de regiones variables de otros genes de VIH.

I- VlJns-tPA-gpl43/opt Cl/opt32B: Esta construcción es similar a IVH excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos. J. VIJns-tPA-gpl43/opt all-A: El gen env de esta construcción está comprendido completamente de codones óptimos. Las regiones constantes (Cl» C5» gp32) son aquellas descritas en 4B> D» H con un segmento de ADN sintético adicional correspondiente a las reg ones variables V1-V5» que es insertado usando un segmento de ADN sintético comprendido de codones óptimos para traducción.

K. VUns-tPA-gpl43/opt all-B: Esta construcción es similar a IVJ excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos.

L. VUns-tPA-gpl43/opt all-A (cepas diferentes de IIIB): Esta construcción es similar a IIIG anterior» excepto que se usaron secuencias de aminoácidos de env de cepas diferentes a IIIB» para determinar el uso de codón óptimo en todas las regiones variables (V1-V5).

. VlJns-tPA-gpl43/opt all-B (cepas diferentes de IIIB): Esta construcción es similar a IIIG anterior» excepto que se usaron secuencias de aminoácidos de env de cepas diferentes a IIIB» para determinar el uso de codón óptimo en todas las regiones variables (V1-V5).

EJEMPLO 10 Construcciones de vacuna de gp!43/glyB: Estas construcc ones fueron preparadas mediante RCP similarmente a otras construcciones que contienen tPA descrito anteriormente ( tPA—gpl20-tPA-gpl40» tPA—gpl43 y tPA—gpl60) » con la guía de tPA en lugar de la guía natural » pero diseñada para producir env unido a membrana» terminado en COOH» como con gp!43. Sin embargo» las construcciones gpl43/glyB difieren de gpl43 en que» de los seis aminoácidos que se proyecta comprendan el dominio de péptido intracelular » los últimos 4 son los mismos a los del extremo carboxilo de la proteína glicoforina B humana (glyB) (secuencia de aminoácidos intracelular proyectada = NH^-NRLIKA-CQQH con los residuos subrayados correspondientes a glyB y "R" comunes a ambos» env y glyB). Esta construcción fue diseñada con el propósito de ganar expresión adicional de env y objetivo dirigido hacia la superficie de la célula eliminando completamente cualquier transcrito o región de péptido correspondiente a la porción intracelular de env que pudiera impactar negativamente la expresión o estabilidad/transporte de proteína a la superficie de la célula» ree plazando esta región con una secuencia de peptidos de una protema expresada abundantemente (glyB) que tiene un dominio citoplásmico corto (secuencia de aminoácidos intracelular = NH-.-RRLIKA-CQ0H) . Las construcciones se prepararon de dos formas (A o B)» dependiendo de si los sitios 5 de rompimiento proteolítico de gpl60 fueron removidos o retenidos» según se describió anteriormente.

A. VlJns-tPA-gpl43/opt 32-A/glyB: Esta construcción es la misma que IVD» excepto que se 10 usó el siguiente oligómero de antisentido de RCP» para reemplazar el dominio de péptido intracelular de gpl43 con el de gli cofor na B» como se describió antes: 5'-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CAC AAT GGA CAG CAC AGC-3' . Í5 B. VlJns-tPA-gpl43/opt 32-B/glyB: Esta construcción es similar a VA, excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos.

C. VlJns-tPA-gpl43/opt Cl/opt32-A/gly B: Esta construcción es la misma que VA» excepto que la primera región constante (Cl) de gpl20 es reemplazada por codones óptimos para traducción como con IVH.

D. VlJns-tPA-gpl43/optCl/opt32-B/glyB: Esta construcción es similar a VC» excepto que los sitios de rompimiento proteo! i tico de env han sido retenidos.

E. VIJns-tPA-qpl43/optCl/Q t a11-A/g1yB : El gen de env de esta construcción está comprendido completamente de codones óptimos como se describió ante iormente .

F- VlJns-tPA-gpl43/opt all-B/glyB: Esta construcción es similar a VE» excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos.

G. VUns-tPA-gpl43/opt all-A/glyB (cepas diferentes de IIIB): Esta construcción es similar a III6 anterior» excepto que se usaron secuencias de aminoácidos de env diferentes de IIIB» para determinar uso de codón óptimo en todas las regiones variables (V1-V5).

H. VUns-tPA-gpl43/opt all-B/glyB (cepas difarentes de IIIB): Esta construcción es similar a VG» excepto que los sitios de rompimiento proteolítico de env han sido retenidos.

Construcciones de vacuna de env de VIH con supresiones ds lazo variables: Estas construcciones pueden incluir todas las formas env enlistadas anteriormente (gpl20> gpl40. gpl43» gpl60» gp!43/glyB)» pero tienen lazos variables dentro de la región de gp,120 suprimidos durante la preparación (v.gr. VI» V2, y/o V3) . El propósito de estas modificaciones es eliminar segmentos de péptido que puedan obstruir la exposición de epítopes de neutral zac ón conservados» tales como el sitio de unión de CD4. Por ejemplo» se usó el siguiente oligómero en una reacción de RCP para crear una supresión V1/V2» dando como resultado la asociación de los segmentos Cl y C2: 5T—CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGT AAC ACC TCA GTC ATT ACA CAG-3' .

EJEMPLO 11 Diseño de segmentos de gen sintético para expresión incrementada de gen env Se convirtieron segmentos de gen en secuencías que tie.nen secuencias traducidas idénticas (excepto en donde se haga notar) pero con uso de codón alternativo» según define R.

Lathe en un artículo de investigación de J. Molec . Biol. Vol . 183» págs. 1-12 (1985) titulado "Synthetic 01 igonucleotide Probes Deduced from Amino Ac d Sequence Data: Theorical and Practical Considerat ons". La metodología descrita más adelante para incrementar la expresión» independiente de rev de los segmentos del gen env de VIH» se basó en la hipótesis de los autores de la presente de que la incapacidad conocida para expresar este gen eficientemente en células de mamífero» es una consecuencia de la composición global del transcrito. Así, utilizando codones alternativos que codifican la misma secuencia de proteína» se puede eliminar las restricciones sobre la expresión de env en ausencia de rev. La inspección del use de codón dentro de env reveló que un alto porcentaje de codones estaba entre aqellos usados i frecuentemente por genes humanos altamente expresados. El método de reemplazo de codón específico e pleado puede describirse como sigue» empleando datos de Lathe y otros: 1. Identificar la colocación de codones para el marco de lectura abierto apropiado. 2. Comparar el codón tipo s lvestre en cuanto a frecuencia observada de uso por los genes humanos (refiérase al cuadro 3 en Lathe y otros). 3. Si el codón no es el más empleado comúnmente» reemplazarlo con un codón óptimo para alta expresión basado en los datos del cuadro 5. 4. Inspeccionar el tercer nucleótido del nuevo codón y el primer nucleótido del codón adyacente i med atamente al extremo 3' del primero. Si ha sido creado un apareamiento 5*— CG-3' por la nueva selección de codón» reemplazarlo con la elección indicada en el cuadro 5. 5. Repetir este procedimiento hasta que todo el segmento de gen ha sido reemplazado. 6. Inspeccionar la nueva secuencia de gen en cuanto a secuencias no deseadas generadas por estos reemplazos de codón (por ejemplo» secuencias "ATTTA", creación inadvertida de sitios de reconocimiento de empalme de intrón, sitios de enzima de restricción no deseados) y codones substitutos que eliminan estas secuencias. 7. Ensamblar segmentos de gen sintéticos y probar su expresión mejorada. Estos métodos se usaron para crear los siguientes segmentos de gen sintéticos para env de VIH» creando un gen comprendido completamente de uso óptimo de codón para expresión: (i) gpl20-Cl (opt) ( i i ) V1-V5 (opt); (i i RRE-A/E3(mut u opt); y (iv) gp30 (opt) con porcentajes de reemplazos de codón/subst tuciones de nucleótido de 56/19» 73/26» 78/28, y 61/25» obtenidos para cada segmento» respectivamente. Cada uno de estos segmentos ha sido descrito en detalle anterior ente con las secuencias reales enlistadas enseguida. g?l20-Cl (opt) Este es un segmento de gen de la región constante 1 (Cl ) de gpl20 desde el extremo N maduro hasta el comienzo de I» diseñado para tener uso óptimo de codón para expresión. 1 TGATCACAGA GAAGCTGTGG GTGACAGTGT ATTATGGCGT GCCAGTCTGG 51 AAGGAGGCCA CCACCACCCT GTTCTGTGCC TCTGATGCCA AGGCCTATGA 101 CACAGAGGTG CACAATGTGT GGGCCACCCA TGCCTGTGTG CCCACAGACC 151 CCAACCCCCA GGAGGTGGTG CTGGTGAATG TGACTGAGAA CTTCAACATG 201 TGGAAGAACA ACATGGTGGA GCAGATGCAT GAGGACATCA TCAGCCTGTG 251 GGACCAGAGC CTGAAGCCCT GTGTGAAGCT GACCCCCCTG TGTGTGAGTT 301 TAAAC MN V1-V5 (opt) Este es un segmento de gen que corresponde a la secuencia de proteína der vada para MN VI—V5 de VIH ( 1066BP ) que tiene uso óptimo de codón para expresión. 1 AGTTTAAACT GCACAGACCT GAGGAACACC ACCAACACCA ACAACTCCAC 51 AGCCAACAAC AACTCCAACT CCGAGGGCAC CATCAAGGGG GGGGAGATGA 101 AGAACTGCTC CTTC ACATC ACCACCTCCA TCAGGGACAA GATGCAGAAG 151 GAGTATGCCC TGCTGTACAA GCTGGACATT GTGTCCATTG ACAATGACTC 201 CACCTCCTAC AGGCTGATCT CCTGCAACAC CTCTGTCATC ACCCAGGCCT 251 GCCCCAAAAT CTCCTTTGAG CCCATCCCCA TCCACTACTG TGCCCCTGCT 301 GGCTTTGCCA TCCTGAAGTG CAATGACAAG AAGTTCTCTG GCAAGGGCTC 351 CTGCAAGAAT GTGTCCACAG TGCAGTGCAC ACATGGCATC AGGCCTGTGG 401 TGTCCACCCA GCTGCTGCTG AATGGCTCCC TGGCTGAGGA GGAGGTGGTC 451 ATCAGGTCTG AGAACTTCAC AGACAATGCC AAGACCATCA TCGTGCACCT 501 GAATGAGTCT GTGCAGATCA ACTGCACCAG GCCCAACTAC AACAAGAGGA 551 AGAGGATCCA CATTGGCCCT GGCAGGGCCT TCTACACCAC CAAGAACATC 601 ATTGGCACCA TCAGGCAGGC CCACTGCAAC ATCTCCAGGG CCAAGTGGAA 651 TGACACCCTG AGGCAGATTG TGTCCAAGCT GAAGGAGCAG TTCAAGAACA 701 AGACCATTGT GTTCAACCAG TCCTCTGGGG GGGACCCTGA GATTGTGATG 751 CACTCCTTCA ACTGTGGGGG GGAGTTCTTC TACTGCAACA CCTCCCCCCT 801 GTTCAACTCC ACCTGGAATG GCAACAACAC CTGGAACAAC ACCACAGGCT 851 CCAACAACAA CATCACCCTC CAGTGCAAGA TCAAGCAGAT CATCAACATG 901 TGGCAGGAGG TGGGCAAGGC CATGTATGCC CCCCCCATTG AGGGCCAGAT 951 CAGGTGCTCC TCCAACATCA CAGGCCTGCT GCTGACCAGG GATGGGGGGA 1001 AGGACACAGA CACCAACGAC ACCGAAATCT TCAGGCCTGG GGGGGGGGAC 1051 ATGAGGGACA ATTGG RRE, ut (A) Este es un segmento de ADN que corresponde al elemento de respuesta a rev (RRE) de VIH-1 comprendido de uso óptimo de codón para expresión. La forma "A" también ha removido los sitios de rompimiento proteo! tico conocidos en la unión gpl20/gp41 usando los nucleótidos indicados en negritas. 1 GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC 51 CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTCAGAACCACGTGGTG CAGAACGAGC 101 ACCAGGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT 151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA 201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG 251 AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT 301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT 351 AGGC RRE, ut (B) Este es un segmento de ADN que corresponde al elemento de respuesta a rev (RRE) de VIH—1, comprendido de uso óptimo de codón para expresión. La forma "B" retiene los sitios de rompimiento proteolítico conocidos en la unión de gp!20/gp41. 1 GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC 51 CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTAAGAGAAGAGTGGTG CAGAGAGAGA 101 AGAGAGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT 151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA 201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG 251 AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT 301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT 351 AGGC gp32 (opt) Este es un segmento de gen gp32 desde el sitio Avrll (comenzando inmediatamente en el extremo del RRE) hasta el extremo de gpl43, comprendido de codones óptimos para expresi n. 1 CCTAGGCA TCTGGGGCTG CTCTGGCAAG CTGATCTGCA CCACAGCTGT 51 GCCCTGGAAT GCCTCCTGGT CCAACAAGAG CCTGGAGCAA ATCTGGAACA 101 ACATGACCTG GATGGAGTGG GACAGAGAGA T AACAACTA CACCTCCCTG 151 ATCCACTCCC TGATTGAGGA GTCCCAGAAC CAGCAGGAGA AGAATGAGCA 201 GGAGCTGCTG GAGCTGGACA AGTGGGCCTC CCTGTGGAAC TGGTTCAACA 251 TCACCAACTG GCTGTGGTAC ATCAAAATCT TCATCATGAT TGTGGGGGGC 301 CTGGTGGGGC TGCGGATTGT CTTTGCTGTG CTGTCCATTG TGAACCGGGT 351 GAGACAGGGC TACTCCCCCT AATAAGCCCG GGCGATATC RVS-1 CTE C ) Este es un segmento de gen sintético correspondiente a una R3'NT del genoma de Retrovirus 1 de Simio. Este ADN está colocado en la siguiente orientación en el extremo 3T de los genes de VIH para aumentar la expresión independ nte de rev. Srfl EooRV 5 • -GCCC GGGC G- TftTC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACA GCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGG GCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATG TATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGT TTTATATATA TT2AAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATG ATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3 ' EcoRV Srfl RVS-1 CTE (B) Este segmento de gen sintético es idéntico a RVS-1 CTE (A) mostrado anteriormente, excepto que se usó una sola mutación de nucleótido (indicada en negritas) para eliminar una secuencia ATTTA. Esta secuencia ha sido asociada con renovación incrementada de ARNm. Srfl EcoRV 5 ' -GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACA GCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGG GCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATG TATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGT i ; TTTATATATA TTAAAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATG ATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3 ' EcoRV Srfl BJB-FLO 12 Expresión de la vacuna de gp!20 In Vitro: Se analizó la expresión in v tro en células de rabdomiosarcoma (RD) humano transfectadas para estas construcciones. La cuantificación de tPA-gp!20 secretado de las células RD transfectadas mostró que el vector VUns-tPA-gpl20 produjo gpl20 secretada.

Vacunación de gpl2Q In Vivo: Véase la figura 12 (datos para ratón): Ractividades de antígeno específicas de gp!2Q para linfocitos T HCM clase II—restring dos » inducidas por VPN de VIJns—tPA— gpl2QM(-,. Se sacrificó a ratones Balb/c que habían sido vacunados dos veces con 200 microgramos de VUns-tPA-gpl20Mlvl» y sus bazos se extrajeron para determi ac ones n vitro de react vidades de linfocitos T auxiliares a gpl20 recombinante. Se efectuaron pruebas de proliferación de células T con CMSP (células mononucleares de sangre periférica) usando gp!20xx?e recombinante ( Rep1 igen» catálogo #RP1Q16-2Q) a 5 µg/ml con 4 x 10s células/ml. Se obtuvieron niveles básales de la captación de 3H—timidina por parte de estas células» cultivando las células en medio solo» mientras se indujo proliferación máxima usando estimulación con ConA» a 2 µg/ml. Las react idades ConA-inducidas alcanzaron un pico aproximadamente a los 3 días y se cosecharon en ese momento con muestras de control de medio» mientras se cosecharon muestras tratadas con antígeno a los 5 días con un control de medio adicional. Se compararon las respuestas de ratones vacunados con ratones s?ngenéicos de la misma edad no afectados. Los controles positivos de ConA dieron proliferación muy alta para ratones tanto no afectados como inmunizados» como se esperaba. Se obtuvieron respuestas de memoria de células T auxiliares muy fuertes mediante tratamiento con gpl20 en ratones vacunados» mientras que los ratones no afectados no respondieron (el umbral para reactividad específica es un índice de estimulación (IE) de >3— 4; se calcula el IE como la relación de cpm de muestra/cpm de medio). Se obtuvieron IE de 65 y 14 para los ratones vacunados» que se compara con títulos de ELISA anti-gpl20 de 5643 y 11.900» respecti vamente» para estos ratones. De manera interesante» de estos dos ratones el más sensibilizado para anticuerpo dio reactividad de células T significat vamente más baja que el ratón que tenía el título de anticuerpo más bajo. Este experimento demuestra que el vector de gpl20 secretado activa ef icientemente células T auxiliares in vivo» y también genera fuertes respuestas de anticuerpo. Además» cada una de estas respuestas inmunes fue determinada ut lizando antígeno que era heterólogo en comparación con el codificado por la inoculación de VPN (IIIB contra MN) : EJEMPLO 13 Vacunas de gp!60 Además de las construcciones de gpl20 secretadas» los autoras de la presente han preparado construcciones de expres ón para gpl60 unida a membrana de longitud completa. Las razones para una construcción de gpl60» además de gp!20» son (1) más epítopes se tienen disponibles para estimulación de LTC y para producción de anticuerpo neutralizante incluyendo gp41» contra el cual está dirigido un potente anticuerpo monoclonal neutralizante de VIH (2F5, ver más adelante); (2) puede obtenerse una estructura de proteína más natural en relación con la gplSO producida por el virus; y (3) el éxito de construcciones de HA de influenza unida a membrana para su i munogenicidad (Ul er y otros, Science 259:1745-1749, 1993; Montgomery» D. » y otros» DNA y Cell B ol . , 12:777-783» 1993). gp!60 retiene dependencia substancial de REV» aún con una secuencia de péptido guía heteróloga» de tal manera que se hicieron más construcciones para aumentar la expresión en ausencia de REV.

E-p-MPLO 14 Prueba para linfocitos T c?totóxicos de VIH Los métodos descritos en esta sección ilustran la prueba usada para ratones vacunados. Puede usarse una prueba esencialmente similar con primates» excepto que debe establecerse líneas de células B autólogas para usarse como células blanco para cada animal. Esto puede realizarse para hu-ranas usando el virus Epstein-Barr y para mono rhesus usando el virus de herpes B. Se derivan células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de sangre recién extraída o bazo utilizando centrifugación de Ficol 1-Hypaque» para separar eritrocitos de leucocitos. Para ratones» pueden usarse también nodos linfáticos. Pueden prepararse LTC efectores a partir de las CMSP, ya sea mediante cultivo in vitro en IL-2 (20 U/ml) y con concanavalina A (2µg/ml) durante 6 a 12 días, o utilizando antigeno especifico usando un numero igual de células que presentan el antígeno irradiado. El antígeno específico puede consistir ya sea de péptidos sintéticos (usualmente 9 a 15 aminoácidos) que son epítopes conocidos para reconocimiento de LTC para el haplotipo de HCM de los animales usados, o construcciones de virus de vacuna diseñados genéticamente para expresar el antígens apropiado. Las células blanco pueden ser» ya sea singeneicas o líneas celulares igualadas con haplotipo de HCM que han sido tratadas para presentar el antígeno apropiado como se describe para estimulación i vitro de los LTC. Para ratones Balb/c» el péptido pl8 ( ArglleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn» SEQ.ID:5l: » para la cepa MN de VIH) puede usarse a concentración de lOµM para reestimular CTL in vitro utilizando esplenocitos si geneicos irradiados y puede usarse para sensibil zar células bla-tnco durante la prueba de citotox cidad a l-10µM mediante incubación a 37°C durante aproximadamente dos horas antes de la prueba. Para estos ratonas de haplotipo H-S1 MHC. la 1 ínea ce"'ular de mastocito a de murino P815 » provee buenas células blanco. Son cargadas células blanco sensibilizadas con antígeno con NaßiCr04, que es liberado desde el interior de las células blanco después de su muerte por medio de CTL, mediante incubación de los blancos durante l a 2 horas a 37°C (0.2 mCi para ~5 x 10ß células), seguido por varios lavados de las células blanco. Las poblaciones de CTL se mezclan con las células blanco a diferentes relaciones de efector a blanco, talas como 100:1, 50: 1, 25 :i, ate, se hacen pella juntas, y se incuban durante 4 a 6 horas a 37°C antes de cosechar los sobrenadantes que entonces son analizados para deter inar la liberación de radioact vidad utilizando un contador gamma. Se calcula la ci totoxicidad como un porcentaje de cuentas liberables totales de las células blanco (obtenidas usando tratamiento con Tritón X-lOO al 0.2%) del cual ha sido restada la liberación espontánea de las células blanco.

EJEMPLO 15 Prueba para anticuerpos específicos de VIH: Se diseño prueba ELISA para detectar anticuerpos generados contra VIH utilizando proteína recombinante específica o péptidos sintéticos como antígenos de substrato. Se recubrieron placas de microtítulo de 96 pozos a 4°C durante la noche con antígeno recombinante a 2 µg/ml en PBS (solución salina de fosfato amortiguada) utilizando 50 micro! i tos/pozo sobre una plataforma de balanceo. Los antígenos consistían de proteína recombinante (gpl20, rev: Rsepligen Corp.; gpl60» gp4i: American Bio-Technologies» Inc.) o péptido sintético (péptido V3 correspondiente a secuencias aisladas de virus a partir de IIIB» etc: American Bio-Technologies» Inc.; epítope gp41 para anticuerpo monoclonal 2F5). Las placas se enjuagaron cuatro veces usando amortiguador de lavado (PBS/0.05% T een 20) seguido por la adición de 200µl/pozo de amortiguador de bloqueo (solución al IV. de leche Carnation» en PBS/0.05% Tween-20) durante una hora a temperatura ambiente con balanceo. Se diluyeron pre—sueros y sueros inmunes en amortiguador de bloqueo en la escala deseada de diluciones y se agregaron 100 icrol tros por pozo. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con balanceo y después se lavaron cuatro veces con amortiguador de lavado. Entonces se agregaron a cada muestra anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano ( Ig anti—rhesus» Southern Biotechnology Associates; IgGs anti-ratón y anti-conejo, JacKsoln Inmuno Research) diluidas 1:2000 en amortiguador de bloqueo, a lOO µl/pozo y se incubaron una hora a temperatura ambiente con balanceo. Las placas se lavaron cuatro veces con amortiguador de lavado y después se desarrollaron mediante la adición de lOO µl/pozo de una so'lución de o—feni lendiamina (o—PD» Calbiochem) a 1 mg/ml en amortiguador de citrato 100 mM a pH 4.5. Se leyó la absorbancia de las placas a 450 nm tanto cinéticamente (primeros diez minutos de reacción) y en puntos finales de 10 y 30 minutos (le-ctora de microplacas (Thermo ax, Molecular Devices).

EJEMPLO 16 Prueba para anticuerpos neutral zantes de VIH: Se efectuaron pruebas de neutralización in vitro de aislados de VIH usando sueros derivados de animales vacunados» corro sigue. Sueros de prueba y sueros pre-inmunes se inacti varón con calor a 56°C durante 60 minutos antes de usarse. Se agregó una cantidad titulada de VIH-1 en diluciones en seri de 1:2 de sueros de prueba y se incubó 60 minutos a temperatura ambiente antes de la adición a 10? células linfoides humanas MT-4 en placas de microtítulo de 96 pozos. Las mezclas virus/célula se incubaron durante 7 días a 37°C y se analizaron para determinar la muerte mediada por virus de células, tiñiendo los cultivos con colorante de tetrazolio. Se observa la neutralización del virus por la prevención de la muerte celular mediada por el virus.

EJEMPLO 17 Aislamiento de genes de aislados clínicos de VIH: Se clonaron genes virales de VIH de CMSP's infectadas» que habían sido activados mediante tratamiento con ConA. El método preferido para obtener los genes virales fue por amplificación de RCP de genoma celular infectado usando ol?gómeros específicos que flanquean los genes deseados. Un segundo método para obtener genes virales fue mediante purificación de ARN viral de los sobrenadantes de células infectadas y preparando ADNc a partir de este material con RCP subsecuente. Este método fue muy análogo al descrito anteriormente para la clonación del gen B7 de murino» excepto por los oligómeros de RCP usados y hexámeros aleatorios usados para hacer ADNc en lugar de oligómeros de iniciación específ icos . Se purificó ADN genómico de las pellas de células infectadas mediante lisis en solución de STE (10 mM NaCl » 10 mM EDTA» 10 mM Tris-HCl» pH 8.0)» a la cual se le agregó prcteinasa K y SDS a 0.1 mg/ml» y 0.5% de concentraciones finales» respectivamente. Esta mezcla se incubó durante la noche a 56°C y se extrajo con 0.5 volúmenes de ferol : cloroformóla! cohol isoamílico (25:24:1). Después» la fase acuosa se hizo precipitar mediante la adición de acetato de sodio a concentración final de 0.3 M y dos volúmenes de etanol frío. Después de hacer una pella del ADN de la solución» el ADN fue resuspendido en solución TE 0.1X (TE IX = 10 M Tris-HCl» pH 8.0» 1 mM EDTA). En este punto» se agregó SDS a 0.1% con 2 U de ARNasa A con incubación durante 30 minutos a 37°C. Esta solución fue extraída con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y después precipitada con etanol como antes. El ADN fue suspendido en 0.1 X TE y cuantificado midiendo su absorbencia en ultravioleta a 260 nm . Las muestras se guardaron a —20°C hasta que se utilizaron para RCP. Se efectuó la RCP utilizando el equipo y procedimiento de Perkin-Elmer Cetus, utilizando los siguientes oligómeros de sentido y antisentido para gpl6?: 5'-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAA TGA -3', y 5'-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG C ATG TGG-3', respecti vamente . Estos oligó eros añaden un sitio Srfi en el extremo 3* del fragmente de ADN resjl tanta. Los segmentos derivados de RCP se clonaron en los vectores de vacunación VIJns o VIR» y 1 as regiones V3, así como los sitios de unión de ligación confirmados mediante secuenc ación de ADN.

EJEMPLO 18 Pruebas de proliferación de células T: Se obtuvieron CMSPs y se analizaron para determinar las respuestas de memoria a antígeno específico, determinadas mediante la proliferación dentro de la población de CMSP. La proliferación es moni toreada utilizando "3H-timidina, que es agregada a los cultivos celulares durante las últimas 18 a 24 horas de incubación antes de la cosecha. Los cosechadores de células retienen ADN que contiene isótopo sobre filtros, si ha ocurrido proliferación» mientras que las células inactivas no incorporan el isótopo que no es reteni o sobre el filtro en la forma l bre. Para cualquier especie de roedor o primate, se siembran en placa 4 x 10"3 células en placas de microtítulo de 96 pozos en un total de 200 micro! tos de medio completo (RPMI/suero fetal de becerro al 10%). Se determinaron respuestas base de proliferación utilizando CMSP y medio solo, mientras son generadas respuestas no específicas usando lectinas tales como fi tohe oaglutinina (PHA) o concanaval na A (ConA) a concentraciones de 1—5 µg/ml , para servir como un control positivo. El antígeno específico consiste de cualquier epítope de péptido conocido» proteína purificada o virus inactivado. Las concentraciones de antigeno varían de l a ÍO micro molar para péptidos y 1-10 µg/ml para proteína. La proliferación inducida por lectina alcanza picos en 3—5 días de incubación del cultivo celular, mientras que las respuestas específicas de antígeno alcanzan picos en 5-7 días. Ocurre proliferación específica cuando se obtienen cuentas de radiación que son por lo menos 3 veces más a las de la base del medio, y frecuente ente se da como un cociente sobre la base, o índice de estimulación (IE). Se sabe que gpl60 de VIH contiene varios péptidos conocidos que ocasionan prol feración de células T de individuos infectados con VIH o inmunizados con gpl60/gpl2C Los usados más comunmente son: TI (LysGlnllelleAsnMetTrpGlnGlnValGlyLysAlaMetTyrAla, ; T2 (HisGluAspIlelleSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys) 5 y TH4 (AspArgValIleGluValValGlnGlyAal TyrArgAlalleArg) . Se ha demostrado que estos péptidos estimulan la prol feración de CMSP de ratones sensibilizados con antígeno, primates no hurranos y humanos.

E?-MPLO 19 Preparación del Vector V1R En un esfuerzo por continuar la opti izacion del vector de vacunación básico de la invención, los autores prepararon un derivado de VIJns» que fue designado como V1R. El propósito de esta construcción de vector fue obtener un vector de vacuna de tamaño mínimo, es decir, sin secuencias innecesarias de ADN, que retuvieran todavía las características de expresión del gen heterólogo optimizado global y los altos rendimientos de plásmido que producen V1J y VIJns. Los autores determinaron de la literatura» así como mediante experimentos que: (1) las regiones dentro del esqueleto de pUC que comprenden el origen de replicación de E. col i , podían ser removidas sin afectar el rendimiento de plásmido de la bacteria; (2) la región 3T del gen Kan*" después del marco de lectura abierta de kanamicina» podía ser removida si se inserta un terminador bacteriano en su lugar; y (3) apro imadamente 300 pb de la mitad 3' del terminador de BGH podía ser removido sin afectar su función reguladora (después del sitio de enzima de restricción Kpnl original dentro del elemento BGH). Se construyó V1R utilizando RCP para sintetizar tres segmentos de ADN a partir de VIJns» que representan el promotor CMVVintA/ter nador de BGH. origen de replicación, y elementos de resistencia a la Kanamicina. respectivamente. Enzimas de restricción única para cada segmento se añadieron a cada extremo de segmento usando los olí gomeros de RCP: SspI y Shol para CMVintA/BGH; EcoRV y BamHl para el gen kan1" y, Bcll y Salí para el orí1". Estos sitios de enzima se eligieron porque per iten la ligación direccional de cada uno de los segmentos de ADN dan" vados de RCP con pérdida subsecuente de cada sitio: EcoRV y SsPI dejan ADN rasurados en sus extremos que son compatibles para ligación» mientras que BamHl y Bcll dejan salientes complementarias como lo hacen Salí y Xhol. Después de obtener estos segmentos mediante RCP» cada segmento fue digerido con las enzimas de restricción apropiadas indicadas anteriormente» y después ligados juntos en una sola mezcla de reacción conteniendo los tres segmentos de ADN. E! extremo 5T del 032-1-.*" fue diseñado para incluir la secuencia terminadora independiente de T2 rho que se encuentra normalmente en esta región» de tal manera que pudo proveerse información de terminación para el gen de resistencia a la Kanamicina. El producto ligado fue confirmado por medio de digestión con enzima de restricción (>8 enzimas)» así como por medio de secuenciac ón de ADN de las uniones de l gación. Los rendi ientos de plásmido de ADN y la expresión heteróloga usando genes virales dentro de V1R parece similar a VIJns. La reducción neta en tamaño de vector alcanzada fue de 1346 pb (VIJns = 4.86 Kb; V1R = 3.52 Kb)» ver la figura 11» SEQ.ID:45:. Las secuencias de oligómero para RCP usadas para sintetizar V1R (los sitios de enzima de restricción están subrayados e identificados en corchetes después de la secuencia): (1) 5' -GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3' [SspI], SEQ. ID:, (2) 5' -CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3 ' [Xhol], SEQ. ID:: para el segmento O-WintA/BG-H ( 3 ) 5 ' -GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3 ' [EcoRV] , SEQ. ID: : (4) 5' -CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3 • [BamHl] , SEQ. ID: : paza el segmento de gen de resistencia a la Kanamicina (5) 5' -GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG- 3 ' [Bcll] , SEQ.ID: :, ( 6 ) 5 ' -CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3 ' [Salí] , SEQ. ID: : para origen de replicación de E. Coli Las uniones de ligación fueron secuenciadas para V1R utilizando los siguientes olí gomeros: 5*-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3* » SEQ. ID:: Cunión de CMVintA/Kan,--I 5'-CAA TAG CAG GCA TGC-3'» SEQ. ID:: Cunión de '-G CAA GCA GCA GAT TAC-3 ' , SEQ. ID:: Cunión de ori/Kan 3 EJEMPLO 20 Expresión Heteróloga de Productos Tardíos de Gen de VIH Genes estructúralas de VIH tales como env y gag» requieren la expresión, del gen regulador de VIH» rev. para producir eficientemente proteínas de longitud completa. Los autores de la presente han encontrado que la expresión de gag dependiente de rev, produjo niveles bajos de proteína, y que el mismo rev puede ser tóxico para las células. Aunque consiguieron niveles relativamente altos de expresión» dependiente de rev , de gpl60 _n v tro , esta vacuna evocó bajos niveles de anticuerpos para gpl60 después de inmunización ±n vi o con ADN rev/gpl60. Esto puede originarse de los efectos citotóxicos conocidos de rev, así como de la dificultad incrementada de obtener la función de rev en miotúbulos que contienen cientos de núcleos (la proteína de rev necesita estar en el mismo núcleo que el transcrito dependiente de rev para que ocurra la expresión de proteína de gag o env) . Sin embargo» ha sido posible obtener la expresión independiente de rev usando modificaciones seleccionadas del gen env . 1.— Expresión de env independiente de rev: En general, las vacunas de la invención han util zado primar amente genes env y gag de VIH (IIIB) para optimización de la expresión dentro del vector de vacunación general izado de la invención» VIJns» que está comprendido de un promotor in edi ato-temprano de CMV (IE)» una secuencia de terminación de poliadenilación y transcripción derivada de BHG. y un esqueleto de pUC. Puede lograrse la variación de eficiencias» dependiendo de qué tan grande sea un segmento de gen usado (v.gr.» gpl20 contra gpl60) » de la expresión de env ndependiente de rev, reemplazando su péptido guía secretor natural con el del gen de activador de plasminógeno específico de tejido (tPA) y expresando el gen quimérico resultante detrás del promotor de lOl CMVIE con el i tro A de CMV. tPagpl20 es un ejemplo de un vector de gpl20 secretado construido de esta manera» que funciona suficientemente para bien evocar respuestas inmunes anti-gp!20 en ratones y monos vacunados. Debido a los reportes de que las proteínas ancladas a la membrana pueden inducir repuestas de anticuerpo mucho más subtanciales (y quizás más específicas para la neutralización de VIH) en comparación con las proteínas secretadas» así como para ganar epítopes adicionales» los autores de la presente prepararon VUns-tPA-gpl60 y VIJns-rev/gp!60. El vector tPA-gp!60 produjo cantidades detectables de gpl60 y gpl20» sin la adición de rev, según se muestra por análisis de inmunoblot de células transfectadas, aunque los niveles de expresión fueron mucho más bajos que los obtenidos para rev/gpl60, un plásmido de expresión de gp!60 rey-dependiente. Esto es probablemente debido a que ocurren regiones inhibidoras» que confieren dependencia a rev sobre el transcri o de gpl60» en sitios múltiples dentro gpl60, incluyendo el extremo COOH de gp41. Se preparó un vector para una forma COOH-term nal mente truncada de tPA-gplS0( PA-gpl43) , que fue diseñada para aumentar los niveles de expres ón global de env. mediante el minación de estas secuencia inhibidoras. El vector gpl43 también elimina regiones intrecelulares de gp41 que contienen motivos de péptido (tales como Leu-Leu) que sabe ocasionan desviación de las proteínas de membrana hacia los lisosomas» en lugar de la superficie celular. Así» puede esperarse que gpl43 tenga niveles incre entados de expresión de la protema env (reduciendo la dependencia rev) y mayor eficiencia de trsnsporte de proteína a la superficie de la célula» en comparación con gpl60 de longitud completa» en donde estas proteínas puede ser más capaces de evocar anticuerpos anti— gp!60 después de vacunación con ADN. Se modificó adicionalmente tPA-gpl43 mediante mutagénesis silenciosa extensiva de la secuencia de elemento de respuesta a rev (RRE) (350 pb) para eliminar secuencias inhibidoras adicionales para expresión. Esta construcción» gpl43/mutRRE» se preparó en dos formas: ya sea eliminando (forma A) o reteniendo (forma B) sitios de rompimiento proteolítico para gpl20/41. Ambas formas se prepararon debido a reportes de la l teratura de que la vacunación de ratones usando gplSO no escindible expresada en vacuna» evoca niveles mucho más altos de anticuerpos a gpl60 que las formas escindibles. Se desarrolló una prueba ELISA cuantitativa para expresión de gpl60/gpl20 en transfectantes de células» para determinar las capacidades de expresión relativa para estos vectores. La transfección in vitro de 293 células» seguida por cuantif cación de gpl20 asociada a célula, contra secretada/liberada, produjo los siguientes resultados: (1) tPA— GP1S0 expresó 5 a ÍO veces menos gpl20 que rev/gp!6Q, con proporciones similares retenidas intracel ularmente contra las liberadas de la superficie celular; (2) tPA—GP143 dio secreción 3 a 6 veces mayor de gpl20 que revgpl60» con apenas bajos niveles de gp!43 asociada a célula, confirmando que la cola citoplásmica de gpl60 ocasiona retención ?ntracelular de gpl60, que puede ser superado mediante supresión parcial de esta secuencia; y (3) tPA-GP143mutRRE A y B dieron apro imadamente 10 veces más niveles de expresión de proteína que tPA-GP143 parenteral, mientras que la eliminación del procesam ento proteo! tico fue confirmada para la forma A. De esta manera» la estrategia de la invención para incrementar la expresión rev—i ndependi ente ha producido incrementos escalonados en niveles de expresión global, así como redirección de la gpl43 anclada en membrana hacia la superficie celular» lejos de los lisosomas. Es importante observar que esta es una construcción genérica en la cual sería posible insertar secuencias de gpl20 derivadas de varios aislados virales primarios dentro de un cassette de vector que contiene estas modificaciones, que residen ya sea en el extremo NH.?? (guía de tPA) o el extremo de COOH (gp41), en donde existen pocas diferencias antigénicas entre diferentes cepas virales. 2. Expresión de gp!20 derivada de un aislado clínico: Para aplicar estas estrategias de expresión a virus que son relevantes para propósitos de vacuna» y confirmar la gereralidad de los enfoques de la invención» se preparó también un vector tPA— P120, derivado de un aislado primario de VIH (conteniendo el lazo de péptido V3 de consenso de Norteamér ca; fenotipos acrófago-trópico y no inductor de sincitio). Este vector dio alta expresión/secreción de gp!20 con 293 células transfectadas y evocó anticuerpos anti-g?l20 en ratones» demostrando así que se clonó en una forma funcional. También pueden usarse genes de gpl60 aislados primarios para expresión» 5 de la misma forma que para gpl60 derivada de cepas de laboratorio .

B. Respuestas inmunes a vacunas de psl ionucl éotido de env de VIH-l lO Efecto de la vía de vacunación sobre las respuestas inmunes en ratones: Aunque están en marcha esfuerzos para mejorar la expresión de gpl60» los autores de la invención han ut-i lizado la construcción de ADN de tPA—GP120 para determinar respuestas inmunes y maneras de aumentarlas. Se comparó las zí 15 vías de vacunación intramuscular (i.m.) e intradérmica (e.d.) para este vector a dosis de lOO» lO y 1 microgramo en ratones.

La vacunación por cualquier vía evocó respuestas de anticuerpo (GMTs = lO3—ÍO-* en todos los receptores después de 2 a 3 vacunaciones a los tres niveles de dosificación. Cada vía evocó títulos similares de anticuerpo anti-gpl20 con claras respuestas dependientes de la dosis. Sin embargo» se observó mayor variabilidad de respuestas para la vacunación i.d.» particularmente en las dosis más bajas después de la inoculación inicial. Además, las respuestas de células T au iliares» determinada mediante proliferación i n vi tro específica de antígeno y secreción de citocina» fueron más altas después de vacunación i.m. que en el caso de i.d. Se concluye que la vacunación i.d. no ofrece ninguna ventaja en comparación con i.m. para esta vacuna. 2. Inmunidad de células T auxiliares mediada por la vacuna de ADM de gpl20 en ratones: La vacunación con ADN de gpl20 produjo respuestas potentes de células T auxiliares en todos los compartimientos lirfátícos probados (bazo» sangre, nodos inguinal» esentérico e iliaco) con perf les de secreción de c toei a semejantes a TH1 (es decir, producición de g-interferon e IL-2 con poco o ningún L-4). Estas citocinas promueven generalmente fuerte inmunidad celular y han sido asociadas con el mantenimiento de un estado libre de enfermedad para pacientes VIH—seropositi vos. Se ha visto que los nodos linfáticos son los sitios primarios de replicación de VIH, hospedando grandes depósitos de virus aún cuando el virus no puede ser detectado fácilmente en la sangre. Una vacuna que puede evocar respuestas ?n unes anti-VIH en una variedad de sitios linfáticos, tal como se ha mostrado con la vacuna de ADN de la invención, puede ayudar a ev tar colonización sucesiva de los nodos linfáticos después de la infección inicial. 3. Respuestas de anticuerpo mediadas por la vacuna de ADN env: Monos verde africanos (AGM) y monos Rhesus (RHM), que recibieron vacunas de ADN de gpl20 mostraron bajos niveles de anticuerpos neutralizantes después de 2 a 3 vacunaciones, que no puedo ser incrementada por vacunación adicional . Estos resultados, así como el conocimiento creciente dentro del campo de las vacunas de VIH de que la gplGO oligomérica es probabl emente un ant geno blanco más relevante para avocar anticuerpos neutral izantes que los monómeros de gpl20. han conducido a los autores de la presente a enfocarse en la obtención de expresión efectiva de vectores basados en gpl60 (véase anteriormente). Ratones y AGM también fueron vacunados con la vacuna tPA—gplZO derivada de aislado primario. Estos animales exhibieron títulos de anticuerpo de punto final recíproco del pépt do anti—V3 (usando secuenc a homologa) que varían de 500 a 5000» demostrando que este diseño de vacuna es funcional para aislados virales clínicamente relevantes. Las vacunas basadas en gpl60» rey-gpl60 y tPA-gpl60» fallaron para avocar consi stentemente respuestas de anticuerpo en catones y en primates no humanos, o produjeron bajos títulos de anticuerpo. Los resultados iniciales de esta invención con el plásmido tPA—gpl43, produjeron medias geométricas de títulos (GMD > 103 en ratones y AGM después de dos vacunaciones. Estos datos indican que los autores de la presente han mejorado significati vamente la inmunogenicidad de vacunas tipo gpl60 aumentando los niveles de expresión y haciendo más eficiente la treificación intracelular de env hacia la superficie de la célula. Esta construcción, así como los vectores tPA— gpl.43/mutRRE A y B, continuarán caracter zándose para respuestas de anticuerpo, especialmente para neutralización de virus. 4. Respuestas de CTL mediadas por la vacuna de ADN env en monos Los autores continuaron caracterizando respuestas de LTC de RHM que habían sido vacunados con gpl20 y ADN gpl60/IRESrey. Los cuatro monos que recibieron esta vacuna mostraron actividades de LTC significativas» restringidas a HCM clase I (20 a 35% de muerte específica en una relación efector/blanco = 20) después de dos vacunaciones. Después de una cuarta vacunación» estas actividades aumentaron a 50-60% de muerte bajo condiciones de prueba similares» indicando que la vacunación adicional reforzó signif cativamente las respuestas. Las actividades de LTC han persistido durante por lo menos siete meses después de la vacunación final en aproximadamente 50% de sus niveles pico» indicando que se ha establecido memoria de larga duración.

Claims (6)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.— Un poli ucleótido sintético que comprende una secuencia de ADN que codifica proteína env de VIH» o un fragmento de 1 a misma» la secuencia de ADN comprende codones optimizados para su expresión en un huésped mamífero.

2.— El polinucleótido de conformidad con la re vindicación 1» que se selecciona de: VUns-tPA-HF/MN gpl20; VUns-tPA-HIVniB gpl20; VUns-tPA-gpl40/mutRRE-A/SRV-l 3'-UTR; VI Jns-tPA-gp 140/mutRRE-B/SRV-l 3'-UTR; V 1 Jns-tP A-gp 140/opt30-A; V 1 Jns-tP A-gp 140/opt30-B ; V 1 Jns-tP A-gp 140/opt all-A; VUns-tPA-gpl40/opt all-B; VI Jns-tP A-gp 140/opt all-A; VUns-tPA-gpl40/opt all-B; VUns-rev/env:; VUns-gpl60; VlJns-tPA-gp 60; VI Jns-tP A-gp 160/o?t Cl/opt41-A; VlJns-tPA-gpl60/opt Cl/opt41-B; VI Jns-tP A-gp 160/opt all-A; VI Jns-tP A-gp 160/opt all-B; VI Jns-tP A-gp 160/opt all-A; VI Jns-tP A-gp 160/opt all-B; VI Jns-tP A-gp 143; V 1 Jns-tP A-gp 143/mutRRE-A; V 1 Jns-tP A-gp 143/mutRRE-B; VUns-tPA-gpl43/opt32-A; V 1 Jns-tPA-gp 143/opt32-B ; VUns-tPA-gpl43/SRV-l 3*-UTR; VI Jns-tPA-gp 143/opt Cl/opt32A; VUns-tPA-gpl43/opt Cl/opt32B; VI Jns-tPA-gp 143/opt all-A; VI Jns-tPA-gp 143/opt all-B; V 1 Jns-tPA-gp 143/opt all-A; VI Jns-tPA-gp 143/o?t all-B; VUns-tPA-gpl43/opt32-A/glyB; VI Jns-tPA-gp 143/opt32-B/glyB; VUns-tPA-gpl43/opt Cl/opt32-A/glyB; V 1 Jns-tPA-gp 143/opt C l/opt32-B/gíyB; VI Jns-tPA-gp 143/opt all-A/glyB; VUns-tPA-gpl43/opt all-B/glyB: V 1 Jns-tPA-gp 143/opt all-A/glyB; VI Jns-tPA-gp í 43/opt all-B/glyB; and combinations y combi aciones de los mismos.

3.- El pol nucleótido de conformidad con la reivi dicaci n 1, que induce anticuerpo neutralizante anti-VIH» respuestas inmunes de células T específicas para VIH. o respuestas inmunes protectoras después de su introducción en tejido de vertebrado. incluyendo tejido humano, in vivo, en donde el polinucleótido comprende un gen que codifica gag» proteasa de gag» o un producto de gen env de VIH.

4.- El uso del polinucleótido de conformidad con la rei indicación 1» para preparar una vacuna para ser introducida en el tejido de un vertebrado » para inducir respuestas inmunes en dicho vertebrado contra epítopes de VIH» en donde la vacuna obtenida que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1» provee entre 1 ng y 100 mg de dicho pol inucleotido a dicho vertebrado.

5.- El uso del pol nucleótido de conformidad con la reivindicación 1» para preparar una vacuna para ser introducida en el tejido de un vertebrado» para inducir respuestas inmunes contra infección o enfermedad ocasionada por cepas virulentas de VIH.

6.- El uso de VIH atenuado» VIH muerto» proteína env de VIH» proteína gag de VIH» proteína pol de VIH» y comoi naciones de las mismas» para preparar una vacuna para ser introducida en el tejido de un vertebrado» para inducir respuestas inmunes contra infección o enfermedad ocasionada por cepas virulentas de VIH. 1.— Una vacuna contra la infección por VIH que comprende el pol inucleotido de conformidad con la rei indicación 1» y un vehículo farmacéut camente aceptable. B.- El uso del pol nucleótido de conformidad con la rei indicación 1» para preparar una vacuna para ser introducida concurrentemente con interleucina 12 en el tejido de un primate» para inducir respuestas inmunes anti-VIH en dichos primates. 9.- Un método para inducir a una célula a presentar un antígeno para estimular funciones efectoras citotóxicas y de proliferación de células T auxiliares» incluyendo secreción de linfoci a específica para los antígenos de VIH» que comprende exponer in vivo las células de un vertebrado al polinucleótido de la reivindicación 1. lO.— Un método para aumentar la expresión de ADN que codifica una proteína de VIH o un fragmento de la misma» que coniprende: a) identificar la colocación de codones para el marco de lectura abierto apropiado; b) comparar la frecuencia de uso observada entre los codones de tipo silvestre y de los genes humanos; c) reemplazar los codones tipo silvestre con cociones optimizados para alta expresión de genes humanos; y d) prcbar la expresión mejorada.