PT969862E - Genes sintéticos gag de hiv - Google Patents

Description

ΡΕ0969862 1 DESCRIÇÃO "GENES SINTÉTICOS GAG DE HIV"

REFERENCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

Nao aplicável. DECLARAÇÃO REFERENTE A I & D PATROCINADOS A NÍVEL FEDERAL Não aplicável. REFERÊNCIA A APÊNDICE EM MICROFICHA Não aplicável.

CAMPO DA INVENÇÃO

Vacinas contra o HIV.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O vírus da imunodeficiência humana Tipo l(HIV-l) é o agente etiológico da síndrome da imunodeficiência humana adquirida (SIDA) e distúrbios relacionados. 0 HIV-1 é um vírus de RNA da família Retroviridae e exibe a 2 ΡΕ0969862 organização 5'LTR-gag-poi-env-LTR3' de todos os retrovírus. Adicionalmente, o HIV-1 compreende um conjunto de genes com funções reguladoras ou desconhecidas, incluindo os genes tat e rev. 0 gene env codifica a glicoproteína do envelope virai que é traduzido como um percursor de 160-kilodalton (kDa) (gpl60) e depois é clivado por uma protease celular para dar origem à glicoproteína externa do envelope com 120-kDa (gpl20) e à glicoproteína transmembranar do envelope com 41-kDa (gp41). A gpl20 e gp41 mantêm-se associadas e são exibidas nas partículas virais e na superfície de células infectadas com HIV. A gpl20 liga-se ao receptor CD4 presente na superfície de linfócitos T auxiliares, macrófagos e outras células alvo. Após a gpl20 se ligar a CD4, a gp41 actua como mediadora no evento de fusão responsável pela entrada do vírus. A infecção começa quando gpl20 na partícula virai se liga ao receptor CD4 na superfície de linfócitos T4 ou outras células alvo. 0 vírus ligado funde-se com a célula alvo e transcreve de forma reversa o seu genoma de RNA no DNA de dupla cadeia da célula. 0 DNA virai é incorporado no material genético no núcleo da célula, onde o DNA virai controla a produção de RNA virai novo, proteínas virais, e partículas virais novas. As novas partículas libertam-se da membrana da célula alvo e infectam outras células. A destruição de linfócitos T4, os quais são cruciais para a imunodefesa, é uma causa principal da disfunção imune progressiva que é a marca contraste da infecção 3 ΡΕ0969862 por HIV. A perda de células alvo diminui seriamente a capacidade do corpo para combater a maioria dos invasores, mas tem um impacto particularmente severo nas defesas contra vírus, fungos, parasitas e certas bactérias, incluindo micobactérias. 0 HIV—1 mata as células que infecta replicando, emergindo delas e danificando a membrana celular. 0 HIV-1 pode matar células alvo indirectamente por intermédio da gpl20 virai que é exibida na superfície de uma célula infectada. Uma vez que o receptor CD4 nas células T possui uma forte afinidade para a gpl20, as células saudáveis que expressam o receptor CD4 podem ligar-se a gpl20 e fundir-se com células infectadas para formar um sincício. 0 HIV-1 pode também produzir imunodefesas celulares normais contra células infectadas. Com ou sem a ajuda de anticorpos, as células defensivas citotóxicas podem destruir uma célula infectada que apresenta proteínas virais na sua superfície. Finalmente, gag e a proteína gpl20 livres podem circular no sangue de indivíduos infectados com HIV-1. A proteína gpl20 livre pode ligar-se ao receptor CD4 de células não infectadas, fazendo com que pareçam infectadas e desencadeando uma resposta imunitária. A infecção com HIV-1 é quase sempre fatal, e no presente não existem curas para a infecção com HIV. Não estão ainda disponíveis vacinas eficazes para a prevenção da infecção com HIV. Devido ao perigo de reversão ou 4 ΡΕ0969862 infecção, não podem provavelmente ser utilizados como uma vacina vírus vivos atenuados. A maioria das abordagens com vacinas de subunidades não foram bem sucedidas na prevenção de infecção com HIV. Os tratamentos para infecção com HIV, embora prolonguem a vida de algumas pessoas afectadas, têm sérios efeitos colaterais. Existe pois uma grande necessidade para tratamentos e vacinas eficazes para combater esta infecção letal. A vacinação é uma forma eficaz de prevenção da doença e foi bem sucedida contra vários tipos de infecção virai. A determinação de modos para apresentar antigénios HIV-1 ao sistema imunitário humano de modo a desencadear imunidade protectora humoral e celular, é uma tarefa difícil. Até ao momento, as tentativas para produzir uma vacina eficaz para o HIV não tiveram êxito. Em doentes com SIDA, o vírus livre está presente apenas em baixos níveis. A transmissão de HIV-1 é aumentada por interacção célula-a-célula por intermédio de fusão e formação de sincícios. Assim sendo, os anticorpos produzidos contra vírus ou subunidades virais livres não são geralmente eficazes na eliminação de células infectadas por vírus.

As vacinas exploram a capacidade do corpo de se "lembrar" de um antigénio. Depois do primeiro encontro com um determinado antigénio o sistema imunitário produz células que conservam memória imunológica do antigénio durante a vida de um indivíduo. A exposição subsequente ao 5 ΡΕ0969862 antigénio estimula a resposta imunitária e resulta na eliminação ou inactivação do patogénio. 0 sistema imunitário lida com patogénios de duas maneiras: por respostas humoral e por respostas mediadas por células. Na resposta humoral os linfócitos produzem anticorpos específicos que se ligam ao antigénio inacti-vando assim o patogénio. A resposta mediada por células envolve linfócitos T citotóxicos e auxiliares que espe-cificamente atacam e destroem células infectadas. 0 desenvolvimento de vacinas com o vírus HIV-1 apresenta problemas porque o HIV-1 infecta algumas das mesmas células que a vacina necessita de activar no sistema imunitário (i.e., linfócitos T4). Seria vantajoso desenvolver uma vacina que inactiva o HIV antes de ocorrer enfraquecimento do sistema imunitário. Um tipo particularmente adequado de vacina contra o HIV produziria uma resposta imunitária anti-HIV que reconheceria variantes de HIV e que funcionaria em indivíduos positivos para o HIV que se encontram no início da sua infecção.

Um grande desafio para o desenvolvimento de vacinas contra vírus, particularmente aqueles com uma elevada taxa de mutação, como o vírus da imunodeficiência humana, contra os quais é desejável o desencadeamento de respostas imunitárias neutralizadoras e protectoras, é a diversidade das proteínas do envelope virai entre diferentes isolados ou estirpes virais. Uma vez que os 6 ΡΕ0969862 linfócitos T citotóxicos (CTLs), tanto nos ratinhos como nos humanos, possuem a capacidade de reconhecer epitopos derivados de proteínas virais internas conservadoras, e que se pensa que são importantes na resposta imunitária contra vírus, foram direccionado esforços no sentido de desenvolver vacinas CTL com a capacidade de proporcionar protecção heteróloga contra diferentes estirpes virais. É conhecido que os CTLs CD8+ matam células infectadas com vírus quando os seus receptores de células T reconhecem péptidos virais associados com moléculas MHC de classe I. Os péptidos virais são derivados a partir de proteínas virais sintetizadas endogenamente, independentemente da localização ou função da proteína dentro do vírus. Deste modo, através do reconhecimento de epitopos de proteínas virais conservadoras, os CTLs podem proporcionar protecção cruzada contra estirpes. Os péptidos com capacidade de se associarem com MHC de classe I para reconhecimento por CTL têm origem em proteínas que estão presentes no ou passam através do citoplasma ou retículo endoplas-mático. De um modo geral, as proteínas exógenas, que entram a via de processamento endossomal (como no caso de antigé-nios apresentados por moléculas MHC de classe II), não são eficazes a produzir respostas CTL CD8+. A maioria dos esforços para produzir respostas CTL utilizaram vectores de replicação para produzir o antigénio proteico dentro da célula ou focaram-se na introdução de péptidos no citosol. Estas abordagens possuem 7 ΡΕ0969862 limitações que podem reduzir a sua utilidade como vacinas. Os vectores retrovirais têm restrições no tamanho e estrutura dos polipéptidos que podem ser expressos como proteínas de fusão enquanto mantendo a capacidade do vírus recombinante de se replicar, e a eficácia de vectores, tais como Vaccinia, para imunizações subsequentes pode ser comprometida devido a respostas imunitárias contra os próprios vectores. Igualmente, os vectores virais e pato-génios modificados possuem riscos inerentes que podem levantar dificuldades à sua utilização em humanos. Adicionalmente, a selecção de epitopos peptídicos a ser apresentada depende da estrutura dos antigénios MHC de um indivíduo e, assim sendo, as vacinas peptídicas podem ter uma eficácia limitada devido à diversidade de haplotipos de MHC encontrados em populações não consanguíneas.

Benvenisty, N., e Reshef, L. [PNAS 83, 9551-9555, (1986)] demonstraram que DNA precipitado com CaCl2 introduzido em ratinhos intraperitonealmente (i.p.), intravenosamente (i.v.) ou intramuscularmente (i.m.) podia ser expresso. A injecção i.m. de vectores de expressão de DNA sem tratamento com CaCl2 em ratinhos resultou na tomada de DNA pelas células musculares e expressão da proteína codificada pelo DNA. Os plasmídeos foram mantidos em forma de epissoma e não se replicaram. Subsequentemente, observou-se expressão persistente após injecção i.m. no músculo esquelético de ratos, peixe e primatas, e no músculo cardíaco de ratos. A técnica de utilização de ácidos nucleicos como agentes terapêuticos foi divulgada no documento 8 ΡΕ0969862 WO90/11092 (4 de Outubro de 1990), em que foram utilizados polinucleótidos nus para vacinar vertebrados. Não é necessário para o sucesso do método que a imunização seja intramuscular. A introdução de micropro-jécteis de ouro revestidos com DNA que codifica a hormona de crescimento humana (HGH) na pele de ratinhos resultou na produção de anticorpos anti-HGH nos ratinhos. Tem sido utilizado um injector a jacto para transfecção de pele, músculo, gordura, e tecidos mamários de animais vivos. Foram revistos vários métodos para introdução de nucleico. A injecção intravenosa de um complexo lipossoma catió- nico:DNA em ratinhos foi demonstrado por Zhu et al., [Science 261: 209-211 (9 de Julho de 1993) resultar na expressão sistémica de um transgene clonado. Ulmer et al., [Science 259: 1745-1749, (1993)] escreveram sobre a protecção heteróloga contra infecção com o vírus da influ-enza por injecção intramuscular de DNA que codifica proteínas do vírus da influenza. A necessidade de agentes terapêuticos e profilácticos específicos com a capacidade de produzirem respostas imunitárias adequadas contra patogénios e antigénios de tumor é respondida pela presente invenção. De particular importância nesta abordagem terapêutica é a capacidade para induzir respostas imunitárias de células T que pode prevenir infecções ou doenças causadas até por estirpes virais que são heterólogas da estirpe a partir da qual foi ΡΕ0969862 obtido o gene do antigénio. Isto torna-se particularmente importante quando se trabalha com o HIV, uma vez que se reconhece que este virus muta rapidamente e que foram identificados muitos isolados virulentos [ver, por exemplo, LaRosa et al., Science 249: 932-935 (1990), identificaram 245 isolados de HIV distintos]. Em resposta a esta diversidade reconhecida, os investigadores tentaram produzir CTLs baseados em imunização peptidica. Deste modo, Takahashi et al., [Science 255: 333-336 (1992)] descreveram a indução de células T citotóxicas largamente com reacção cruzada reconhecendo um determinante de envelope de HIV (gpl60). No entanto, esses profissionais reconheceram a dificuldade em alcançarem uma resposta CTL verdadeiramente de reacção cruzada e sugeriram que existe uma dicotomia entre a iniciação ou re-estimulação de células T, que é muito restringente, e o desencadeamento de função efectora, incluindo citotoxicidade, de CTLs já estimuladas.

Wang et al. descrevem o desencadeamento de respostas imunitárias em ratinhos contra HIV por inoculação intramuscular com um gene de HIV genómico (não excisado) clonado. No entanto, o nível de respostas imunitárias alcançado nestes estudos foi muito baixo. Adicionalmente, a construção de DNA de Wang et al., utilizou uma porção essencialmente genómica de HIV codificando sequências codificantes contíguas Tat/rev-gpl60-Tat/rev. Assim como descrito detalhadamente mais à frente, este é um sistema sub-óptimo para a obtenção de expressão de elevado nível de gplôO. É também potencialmente perigoso, uma vez que a 10 ΡΕ0969862 expressão de Tat contribui para a progressão de Sarcoma de Kaposi's. 0 documento WO 93/17706 descreve um método para vacinação de um animal contra um virus, em que partículas transportadoras foram revestidas com uma construção génica e as partículas revestidas são aceleradas contra células de um animal. Em relação ao HIV, foi proposta a utilização de essencialmente o genoma completo, excepto as longas repetições terminais. Esse método representa riscos substanciais para os recipientes. Em geral crê-se que as construções de HIV devem conter menos do que cerca de 50% do genoma do HIV para assegurar a segurança da vacina; isto assegura que unidades enzimáticas e proteínas reguladoras virais, muitas das quais possuem funções desconhecidas ou pouco conhecidas, tenham sido eliminadas. Deste modo, persistem vários problemas se for produzida uma vacina humana útil contra o HIV a partir de tecnologia de distribuição de gene. A presente invenção contempla qualquer dos métodos conhecidos para introdução de polinucleótidos em tecido vivo para indução de expressão de proteínas. No entanto, esta invenção proporciona um novo imunogénio para introduzir HIV e outras proteínas na via de processamento do antigénio para produção eficaz de CTLs e anticorpos específicos para o HIV. O fármaco é eficaz como uma vacina para induzir respostas imunitárias celular e humoral anti-HIV e neutralizadora de HIV. Na presente invenção, os 11 ΡΕ0969862 problemas acima mencionados são considerados e resolvidos pela provisão de imunogénios polinucleóticos que, quando introduzidos num animal, orquestram a expressão eficaz de proteínas de HIV e epitopos sem os riscos concomitantes associados com esses métodos. As respostas imunitárias produzidas deste modo são eficazes no reconhecimento do HIV, na inibição da replicação do HIV, na identificação e morte de células infectadas com o HIV, e apresentam reactividade cruzada contra muitas estirpes do HIV.

Os emparelhamentos de codões dos organismos são altamente não aleatórios, e diferem de organismo para organismo. Esta informação é utilizada para construir e expressar genes alterados ou sintéticos que possuem níveis desejados de eficácia de tradução, para determinar quais as regiões num genoma que são regiões que codificam proteínas, para introduzir sítios de pausa de tradução em genes heterólogos, e para determinar parentesco ou origem ancestral de sequências nucleotídicas. A expressão de genes heterólogos estranhos em organismos transformados é agora lugar comum. Um número elevado de genes de mamífero, incluindo, por exemplo, genes humanos e de murino, foram inseridos com sucesso em organismos com uma única célula. As técnicas convencionais neste caso incluem a introdução do gene estranho a ser expressado num vector, tal como, um plasmídeo ou um fago e a utilização desse vector para inserir o gene num organismo. Os promotores nativos para tais genes são 12 ΡΕ0969862 geralmente substituídos com promotores fortes compatíveis com o hospedeiro no qual o gene é inserido. 0 equipamento para a sequenciação de proteínas permite elucidar sequências aminoacídicas mesmo a partir quantidades diminutas de proteína nativa. A partir destas sequências aminoacídicas, as sequências de DNA que codificam para essas proteínas podem ser inferidas. A síntese de DNA é também uma técnica em rápido desenvolvimento, e os genes sintéticos correspondendo a essas sequências de DNA podem ser facilmente construídos.

Apesar do crescimento do conhecimento sobre sistemas de expressão e DNA recombinante, permanecem obstáculos significativos quando se tenta a expressão de um gene estranho ou sintético num organismo. Muitas proteínas nativas, activas, por exemplo, são glicosiladas de um modo diferente do que ocorre quando são expressas num hospedeiro estranho. Por esta razão, os hospedeiros eucarióticos, tais como, leveduras podem ser preferidos a hospedeiros bacterianos para a expressão de muitos genes de mamíferos. 0 problema da glicosilação é objecto de investigação corrente.

Um outro problema é menos compreendido. Frequentemente a tradução de um gene sintético, mesmo quando associado com um promotor forte, ocorre de modo muito menos eficaz do que seria esperado. 0 mesmo é frequentemente verdade para genes exógenos estranhos ao organismo de expressão. Mesmo quando o gene é transcrito de um modo 13 ΡΕ0969862 suficientemente eficaz em que são produzidas quantidades recuperáveis do produto de tradução, a proteína é frequentemente inactiva ou de outro modo diferente nas propriedades da proteína nativa. É reconhecido que o último problema é geralmente devido a diferenças na dobra de proteínas em vários organismos. A solução para este problema tem sido elusiva, e os mecanismos que controlam a dobra de proteínas são mal compreendidos.

Crê-se que os problemas relacionados com a eficácia de tradução estão relacionados com efeitos do contexto de codão. As regiões que codificam para proteínas nos genes em todos os organismos estão sujeitas a uma grande variedade de limitações funcionais, algumas das quais dependem do requisito para codificarem uma proteína que funcione correctamente, assim como de sinais adequados de início e stop da tradução. No entanto, foram distinguidas várias características de regiões que codificam para proteínas que não são facilmente compreendidas em função destas limitações. Duas classes importantes de tais características são as que envolvem utilização de codões e contexto de codão. É conhecido que a utilização de codões é muito enviesada e varia consideravelmente entre diferentes organismos. Foi demonstrado que os padrões de utilização de codões estão relacionados com a abundância relativa de 14 ΡΕ0969862 isoaceitadores de tRNA. Os genes que codificam proteínas de abundância elevada versus baixa exibem diferenças nas suas preferências de codão. A possibilidade que o enviesamento na utilização de codões altere a velocidade de alongamento de péptidos têm sido vastamente discutida. Enquanto que as diferenças na utilização de codões estão associadas com diferenças em velocidade de tradução, os efeitos directos da escolha de codões na tradução têm sido difíceis de demonstrar. Outras limitações propostas para padrões de utilização de codões incluem maximização da fidelidade de tradução e optimização da eficácia cinética da síntese de proteínas.

Para além da utilização não ao acaso de codões, foi acumulada evidência considerável que o reconhecimento codão/anti-codão é influenciado por sequências fora do próprio codão, um fenómeno designado "contexto de codão". Existe uma forte influência de nucleótidos vizinhos na eficácia de supressão de codões sem sentido assim como de codões sem sentido. Evidentemente, a abundância de acti-vidade de supressão em populações naturais de bactérias, assim como a utilização de codões de "terminação" para codificar selenocisteína e fosfoserina requerem que a terminação seja dependente do contexto. Foi demonstrado que efeitos de contexto similares influenciam a fidelidade da tradução, assim como a eficácia da iniciação da tradução.

Análises estatísticas de regiões que codificam para proteínas de E. coli revelam outra manifestação de 15 ΡΕ0969862 "contexto de codão". A presença de um codão particular numa posição influencia fortemente a frequência de ocorrência de certos nucleótidos em codões vizinhos, e estes constrangimentos de contexto diferem grandemente entre genes expressos a elevados versus baixos niveis. Apesar de o efeito de contexto ter sido reconhecido, o valor de previsão das regras estatísticas relativas a nucleótidos preferidos adjacentes a codões é relativamente baixo. Isto limitou a utilidade de tais dados de preferência nucleo-tídica para seleccionar codões para produzirem níveis desejados de eficácia de tradução. 0 aparecimento de equipamento para sequenciação automática de nucleótidos tornou disponíveis grandes quantidades de dados de sequência para uma grande variedade de organismos. A compreensão de tais dados apresenta dificuldades substanciais. Por exemplo, é importante identificar as regiões codificantes do genoma de modo a se poder relacionar os dados de sequência genética com as sequências proteicas. Adicionalmente, a ascendência do genoma de certos organismos possui um interesse substancial. É conhecido que genomas de alguns organismos possuem ascendência mista. Algumas sequências que são de origem virai encontram-se agora incorporadas de modo estável no genoma de organismos eucariotas. As próprias sequências virais podem ter tido origem noutra espécie substancialmente não aparentada. A compreensão da ascendência de um gene pode ser importante para delinear analogias apro- 16 ΡΕ0969862 priadas entre genes aparentados e os seus produtos de tradução noutros organismos. É necessário um melhor conhecimento dos efeitos de contexto de codão na tradução, e um método para a determinação dos codões apropriados para qualquer efeito desejado de tradução. É também necessário um método para a identificação de regiões codificantes do genoma a partir de dados de sequências nucleotidicas. É também necessário um método para controlar a dobra de proteína e para garantir que um gene estranho irá dobrar apropriadamente quando expresso num hospedeiro. Os genes alterados ou construídos de acordo com eficácias de tradução desejadas terão um valor significante.

Um outro aspecto da prática de técnicas de DNA recombinante para a expressão por microrganismos de proteínas com interesse industrial e farmacêutico é o fenómeno de "preferência de codão". Enquanto que foi referido anteriormente que a maquinaria existente para expressão genética em células hospedeiras geneticamente transformadas irá "funcionar" para construir um determinado produto desejado, os níveis de expressão alcançados num microrganismo podem estar sujeitos a uma grande variação, dependendo em parte de formas alternativas específicas do código genético que específica aminoácidos presentes num gene exógeno inserido. Um codão "tripleto" de quatro bases nucleotidicas possíveis pode existir em 64 formas variantes. 0 facto de que estas formas proporcionam uma 17 ΡΕ0969862 mensagem para apenas 20 aminoácidos diferentes (assim como iniciação e terminação de transcrição) significa que alguns aminoácidos podem ser codificados por mais do que um codão. De facto, alguns aminoácidos possuem tantos como seis codões alternativos "redundantes", enquanto que alguns outros possuem um único codão necessário. Por razões não completamente compreendidas, os codões alternativos não estão de todo presentes uniformemente no DNA endógeno de diferentes tipos de células e parece existir uma hierarquia natural variável ou "preferência" para certos codões em certos tipos de células.

Como um exemplo, o aminoácido leucina é especificado por qualquer de seis codões de DNA incluindo CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, e TTG (que correspondem, respec-tivamente, aos codões de RNAm, CUA, CUC, CUG, CUU, UUA e UUG). As análises exaustivas de frequências de codões no genoma de microrganismos revelaram que o DNA endógeno de E. coli possui mais frequentemente o codão CTG que específica leucina, enquanto que o DNA de leveduras e fungos protistas incluiu mais comummente um codão TTA que específica leucina. Em função desta hierarquia, verifica-se geralmente que a probabilidade de se obterem elevados níveis de expressão de um polipéptido rico em leucina por um hospedeiro E. coli dependerá até certo ponto da frequência de utilização de codões. Por exemplo, um gene rico em codões TTA será com toda a probabilidade pouco expresso em E. coli, enquanto que um gene rico em CTG irá provavelmente ter expressão elevada do polipéptido. De modo similar, 18 ΡΕ0969862 quando as células de levedura são as células hospedeiras de transformação projectadas para expressão de um polipéptido rico em leucina, um codão preferido para utilização num DNA inserido será TTA.

Seed et al., (documento WO 96/09378 e Current Biology 1996, 6 315) divulgam expressão melhorada de proteínas env de HIV in vitro após optimização de codão.

As implicações do fenómeno de preferência de codão em técnicas de DNA recombinante são manifestas, e o fenómeno pode servir para explicar muitos insucessos anteriores para alcançar elevados níveis de expressão de genes exógenos em organismos hospedeiros transformados com sucesso - um codão menos "preferido" pode estar presente repetidamente no gene inserido e a maquinaria da célula hospedeira para expressão pode não operar tão eficazmente. Este fenómeno sugere que os genes sintéticos que foram concebidos para incluir os codões preferidos da célula hospedeira projectada proporcionam uma forma preferida de material genético estranho para a prática de técnicas de DNA recombinante. A diversidade de funções que tipificam células eucarióticas depende da diferenciação estrutural das suas fronteiras membranares. Para produzir e manter estas estruturas, as proteínas têm de ser transportadas do seu local de síntese no retículo endoplasmático para destinos pré-determinados em toda a célula. Isto requer que as 19 ΡΕ0969862 proteínas em trânsito apresentem sinais de distribuição que são reconhecidos pela maquinaria molecular responsável pela selecçao de rotas situada nos pontos de acesso das principais vias de tráfego. As decisões de distribuição para a maioria das proteínas necessitam de ser tomadas apenas uma vez quando atravessam as suas vias biossin-téticas uma vez que o seu destino final, o local celular no qual realizam a sua função, torna-se a sua residência permanente. A manutenção da integridade intracelular depende em parte da distribuição selectiva e transporte preciso de proteínas para os seus destinos correctos. Ao longo dos últimos anos a dissecação da maquinaria molecular para direccionamento e localização de proteínas tem sido estudada vigorosamente. Foram identificados motivos definidos de sequências em proteínas que podem actuar como "etiquetas de endereço". Os péptidos líder ou de sinal, tais como, o da proteína activadora de plasminogénio específico de tecido, tPA, servem para transportar a proteína para a via de secreção celular através do retículo endoplasmático e aparelho de golgi. Foram encontrados vários sinais de distribuição associados com os domínios citoplasmáticos de proteínas membranares, tais como, motivos aminoacídicos di-Leucina ou sequências baseadas em tirosina que podem dirigir proteínas para compartimentos lisossomais. Para o HIV, o transporte e extrusão da célula de partículas virais depende de miristoilação do resíduo de glicina número dois no terminal amino de gag. 20 ΡΕ0969862

SUMÁRIO DA INVENÇÃO São proporcionadas moléculas sintéticas de DNA que codificam gag de HIV e modificações de gag de HIV. Os codões das moléculas sintéticas incluem os codões preferidos da célula hospedeira projectada. As moléculas sintéticas proporcionam formas preferidas de material genético estranho. As moléculas sintéticas podem ser utilizadas como uma vacina polinucleotídica que proporciona imunoprofilaxia eficaz contra infecção com o HIV através de imunidade por neutralização de anticorpos e mediada por células. Esta invenção proporciona polinucleótidos que, quando introduzidos directamente in vivo num vertebrado, incluindo mamíferos, tais como, primatas e humanos, induz a expressão de proteínas codificadas no animal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS ESQUEMAS A figura 1 apresenta a expressão relativa de gag e tPA gag em transf ectantes da linha celular 293 após transfecção com DNA de gag de HIV. A figura 2 apresenta respostas optimizadas anti-gag no soro mediadas por vacinas de DNA de gag de HIV e de tPA-gag em ratinhos. A figura 3 apresenta respostas CTL anti-gag de 21 ΡΕ0969862 esplenócitos obtidas em ratinhos após vacinação com DNA optimizado de gag de HIV ou de tPA-gag. A figura 4 apresenta secreção de citoquina para antigénio especifico de gag em esplenócitos obtida em ratinhos após vacinação com DNA optimizado de gag de HIV ou tPA-gag. A figura 5 apresenta CTL anti- gag de HIV em ratinhos vacinados com DNAs de gag p55 de HIV.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO São proporcionadas moléculas sintéticas de DNA que codificam gag de HIV e moléculas sintéticas de DNA que codificam formas modificadas de gag de HIV. Os codões das moléculas sintéticas são concebidos para que sejam utilizados os codões preferidos pela célula hospedeira projectada. As moléculas sintéticas podem ser utilizadas como uma vacina polinucleotidica que proporciona imunopro-filaxia eficaz contra infecção com o HIV através de imunidade por anticorpos neutralizantes e mediada por células. As moléculas sintéticas podem ser utilizadas como uma composição imunogénica. Esta invenção proporciona polinucleótidos que, quando directamente introduzidos in vivo num vertebrado, incluindo mamíferos, tais como, primatas e humanos, induzem a expressão de proteínas no animal. 22 ΡΕ0969862

Como aqui utilizado, um polinucleótido é um ácido nucleico que contém elementos requladores essenciais tais que após introdução numa célula viva de vertebrado, tem a capacidade de orquestrar a maquinaria celular para produzir produtos de tradução codificados pelos qenes compreendendo o polinucleótido. Numa forma de realização da invenção, o polinucleótido é um ácido polidesoxirribonucleico compreendendo pelo menos um gene de HIV ligado operacionalmente a um promotor de transcrição. Quando a proteína codificada pelo polinucleótido é uma que não ocorre normalmente nesse animal, excepto em condições patológicas, (i.e., uma proteína heteróloga), tais como, proteínas associadas com o vírus da imunodeficiência humana, (HIV), o agente etio-lógico da síndrome de imunodeficiência adquirida, (SIDA), o sistema imunitário do animal é activado a lançar uma resposta imunitária protectora. Uma vez que estas proteínas exógenas são produzidas pelos tecidos do animal, as proteínas expressas são processadas pelo sistema de histocompatibilidade major, MHC, de um modo análogo ao quando ocorre realmente uma infecção com o organismo aparentado (HIV). 0 resultado, como apresentado nesta divulgação, é a indução de respostas imunitárias contra o patogénio cognado.

Consequentemente, os presentes inventores prepararam ácidos nucleicos que, quando introduzidos no sistema biológico induzem a expressão de proteínas e epitopos de HIV. A resposta de anticorpos induzida é específica para a proteína de HIV expressa, e neutraliza o HIV. Adicional- 23 ΡΕ0969862 mente, são induzidos os linfócitos T citotóxicos que especificamente reconhecem e destroem células infectadas com o HIV. A presente invenção proporciona um método para utilização de um polinucleótido que, após introdução em tecido de mamífero, induz a expressão in vivo numa célula única, de produtos génicos discretos. A presente invenção proporciona uma solução diferente que não requer manipulações múltiplas de genes de HIV dependentes de rev para se obter genes independentes de rev. 0 sistema de expressão independente de rev aqui descrito é útil por si só e é um sistema para a demonstração de expressão in vivo numa célula única de um único produto génico desejado.

Uma vez que muitas das aplicações da presente invenção dizem respeito a vacinação anti-viral, os poli-nucleótidos são frequentemente referidos como uma vacina polinucleotídica, ou PNV. Isto não significa que as utilidades adicionais destes polinucleótidos, em simulação imuno e terapêuticas anti-tumor, sejam consideradas fora do âmbito da invenção.

Numa forma de realização desta invenção, um gene que codifica um produto génico de HIV é incorporado num vector de expressão. 0 vector possui um promotor de transcrição reconhecido por uma RNA polimerase eucariótica, e um terminador de transcrição no final da sequência codificante do gene de HIV. Numa forma de realização - 24 - ΡΕ0969862 preferida, o promotor é o promotor do citomegalovírus com a sequência do intrão A (CMV-intA), apesar de os peritos na técnica reconhecerem que qualquer dos vários outros promotores conhecidos, tais como, a imonoglobulina forte, ou outros promotores de genes eucariotas possam ser utilizados. Um terminador de transcrição preferido é o terminador da hormona de crescimento bovina. A combinação de CMVintA- terminador BGH é particularmente preferida.

Para assistir na preparação dos polinucleótidos em células procariotas, é também incluído de modo preferido um marcador de resistência a antibiótico no vector de expressão sob controlo de transcrição de um promotor procariota, de modo que a expressão do antibiótico não ocorre em células eucariotas. Os genes de resistência à ampicilina, os genes de resistência à neomicina e outros marcadores de resistência a antibióticos farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados. Para auxiliar nos elevados níveis de produção do polinucleótido por fermentação em organismos procariotas, é vantajoso para o vector conter uma origem de replicação procariota e ser de elevado número de cópias. Vários vectores de clonagem procariotas disponíveis comercialmente proporcionam estes benefícios. É desejável remover as sequências de DNA não essenciais. É também desejável que os vectores não tenham a capacidade de se replicar em células eucariotas. Isto minimiza o risco de integração de sequências polinucleotídicas da vacina no genoma dos recipientes. Podem ser utilizados promotores específicos para tecidos ou intensificadores sempre que 25 ΡΕ0969862 seja desejável limitar a expressão do polinucleótido para um tipo de tecido particular.

Numa forma de realização, é utilizado o vector de expressão pnRSV, em que a longa repetição terminal (LTR) do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV) é utilizada como o promotor. Noutra forma de realização, é utilizado VI, um vector pBR32 2 mutado em que o promotor CMV e o terminador BGH de transcrição foram clonados. Noutra forma de realização, os elementos de VI e pUC19 foram combinados para produzir um vector de expressão designado V1J. É clonado em V1J ou noutro vector de expressão desejável um gene de HIV, gag, que pode induzir uma resposta imunitária anti-HIV. Noutra forma de realização, o gene de resistência à ampicilina é removido do V1J e substituído por um gene de resistência à neomicina, para produzir VIJ-neo no qual foram clonados genes gag de HIV para utilização de acordo com esta invenção. Noutra forma de realização, o vector é VIJns, que é o mesmo que VIJneo excepto que foi construído um sítio de restrição único Sfil no sítio único Kpnl na posição 2114 do VIJ-neo. A incidência de sítios Sfil no DNA genómico humano é muito baixa (aproximadamente 1 sítio por 100 000 bases). Deste modo, este vector permite monitorização cuidada para integração do vector de expressão no DNA hospedeiro, simplesmente por digestão com Sfil de DNA genómico extraído. Num aperfeiçoamento adicional, o vector é VIR. Neste vector, foi "aparado" do vector tanto DNA não-essencial quanto possível para se produzir um vector altamente compacto. Este vector é um derivado de VIJns. 26 ΡΕ0969862

Este vector permite a utilização de inserções maiores, com menos preocupação que sequências não desejáveis sejam codificadas e optimiza a incorporação por células.

Uma forma de realização desta invenção incorpora genes que codificam gag de HIV de estirpes de HIV adaptadas ao laboratório, tais como, IIIB ou CAM-1. Os peritos na técnica reconhecerão que a utilização de genes de outras estirpes de HIV-1 ou estirpes de HIV-2 com função análoga à dos genes de HIV-1 é esperada produzir respostas imunitárias análogas às aqui descritas para construções de HIV-1. Os métodos de clonagem e manipulação para a obtenção destes genes são conhecidos dos peritos na técnica.

As sequências para muitos genes de muitas estirpes de HIV estão agora disponíveis publicamente no GENBANK e os campos principais isolados de HIV estão disponíveis no Instituto Nacional de Alergias e Doenças Infecciosas (NIAID) que possui contrato com a Quality Biological, Inc., [7581 Lindbergh Drive, Gaithersburg, Maryland 20879] para tornar estas estirpes disponíveis. Tais estirpes estão também disponíveis na Organização Mundial de Saúde (WHO) [Rede para o Isolamento e Caracterização do HIV, Unidade de Desenvolvimento de Vacina, Gabinete de Investigação, Programa Global para a SIDA, CH-1211 Geneva 27, Suiça]. A partir deste trabalho os peritos na técnica reconhecerão que uma das utilidades da presente invenção é proporcionar um sistema para teste e análises in vivo assim como in vitro de modo que a correlação de diversidade das 27 ΡΕ0969862 sequências de HIV com a serologia de neutralização de HIV, assim como outros parâmetros possa ser realizada. A incorporação de genes de isolados primários de estirpes de HIV proporciona um imunogénio que induz respostas imunitárias contra isolados clínicos do vírus e deste modo preenche uma necessidade ainda não preenchida na área. Adicionalmente, como os isolados virulentos mudam, o imunogénio pode ser modificado como necessário para reflectir novas sequências.

Para se manter a terminologia consistente, é aqui seguida a seguinte convenção para a descrição de construções de imunogénios polinucleotídicos: "nome do vector - estirpe de HIV - gene - elementos adicionais". Os elementos adicionais que são adicionados à construção são descritos com mais detalhe em baixo. À medida que a estirpe etiológica do vírus muda, o gene preciso que é óptimo para incorporação no fármaco pode ser alterado. No entanto, como é demonstrado em baixo, porque são induzidas respostas CTL que têm a capacidade de protecção contra estirpes heteró-logas, a variabilidade da estirpe é menos crítica no imunogénio e vacinas desta invenção, quando comparado com vacinas baseadas no vírus completo ou subunidades poli-peptídicas. Adicionalmente, uma vez que o fármaco é facilmente manipulado para inserir um novo gene, este é um ajustamento que é facilmente executado por técnicas convencionais de biologia molecular. 0 termo "promotor" como aqui utilizado refere-se 28 ΡΕ0969862 a um sítio de reconhecimento numa cadeia de DNA à qual se liga a RNA polimerase. 0 promotor forma um complexo de iniciação com a RNA polimerase para iniciar e orquestrar a actividade de transcrição. 0 complexo pode ser modificado pela activação de sequências designadas "intensificadores" ou pela inibição de sequências designadas "silenciadores." 0 termo "líder" como aqui utilizado refere-se a uma sequência de DNA na extremidade 5' de um gene estrutural que é transcrito com o gene. 0 líder resulta normalmente na proteína possuindo uma extensão peptídica no N-terminal por vezes designada uma pro-sequência. Para proteínas destinadas a secreção para o meio extracelular ou uma membrana, esta sequência sinal, que é geralmente hidrofóbica, dirige a proteína para o retículo endoplasmático do qual é libertada para o destino apropriado. 0 termo "intrão" como aqui utilizado refere-se a uma secção de DNA que ocorre no meio de um gene que não codifica para um aminoácido no produto génico. 0 precursor RNA do intrão é excisado e consequentemente não é transcrito em mRNA nem traduzido em proteína. 0 termo "cassete" refere-se à sequência da presente invenção que possui a sequência de ácido nucleico que é para ser expressa. A cassete é similar em conceito a uma fita de cassete. Cada cassete possuirá a sua própria sequência. Deste modo, mudando a cassete o vector irá 29 ΡΕ0969862 expressar uma sequência diferente. Devido aos sítios de restrição nas extremidades 5' e 3', a cassete pode ser facilmente inserida, removida ou substituída por outra cassete. 0 termo " região 3' não traduzida " ou "3' UTR" refere-se à sequência na extremidade 3' de um gene estrutural que é normalmente transcrita com o gene. Esta região 3' UTR possui normalmente a sequência poli A. Apesar de a 3' UTR ser transcrita a partir do DNA é excisada antes da tradução para a proteína. 0 termo "Região Não Codificante" ou "NCR" refere-se à região que é contígua com a região 3' UTR do gene estrutural. A região NCR possui um sinal de terminação da transcrição. 0 termo "sítio de restrição" refere-se a um sítio de clivagem específico para sequências de endonucleases de restrição. 0 termo "vector" refere-se a alguns meios pelos quais fragmentos de DNA podem ser introduzidos num organismo hospedeiro ou tecido hospedeiro. Existem vários tipos de vectores incluindo plasmídeos, bacteriófagos e cosmídeos. 0 termo "quantidade eficaz" significa que suficiente PNV é injectado para produzir os níveis 30 ΡΕ0969862 adequados do polipéptido. Os peritos na técnica reconhecem que este nível pode variar.

Para proporcionar uma descrição da presente invenção, é proporcionado o seguinte conhecimento prévio sobre o HIV. O vírus da imunodeficiência humana possui um genoma de ácido ribonucleico (RNA). Este genoma de RNA tem de ser transcrito de modo reverso de acordo com métodos conhecidos na técnica de modo a se produzir uma cópia de cDNA para clonagem e manipulação de acordo com os métodos aqui ensinados. Em cada extremidade do genoma existe uma longa repetição terminal que actua como um promotor. Entre estes terminais, o genoma codifica, em diversas grelhas de leitura, gag-pol-env como os principais produtos génicos: gag é o antigénio específico de grupo; pol é a trans-criptase reversa, ou polimerase; também codificada por esta região, numa grelha de leitura alternada, encontra-se a protease virai que é responsável pelo processamento pós-tradução, por exemplo, de gpl60 em gpl20 e gp41; env é a proteína do envelope; vif é o factor de infecciosidade do virião; rev é o regulador de expressão da proteína do virião; nef é o factor de regulação negativa; vpu é o factor de produtividade do virião "u"; tat é o trans- activador de transcrição; vpr é a proteína virai r. A função de cada um destes elementos já foi descrita.

Numa forma de realização desta invenção, um gene que codifica uma proteína gag de HIV está directamente ligado a um promotor de transcrição. No entanto, a 31 ΡΕ0969862 expressão de gag é reprimida na ausência de rev devido à não exportação do núcleo de genes não excisados. Para a compreensão deste sistema, o ciclo de vida do HIV tem de ser descrito com maior detalhe.

No ciclo de vida do HIV, após infecção de uma célula hospedeira, o genoma de RNA do HIV é transcrito de modo reverso num DNA proviral que se integra no DNA genómico hospedeiro como uma única unidade de transcrição. A LTR proporciona o promotor que transcreve genes de HIV da direcção 5' para 3' {gag, pol, env), para formar um transcripto não excisado do genoma completo. 0 transcripto não excisado funciona como o mRNA a partir do qual são traduzidos gag e pol, enquanto que deve de ocorrer excisão-união limitada para a tradução de genes env codificados. Para o produto génico regulador rev ser expresso, tem de ocorrer mais do que um evento de excisão-união uma vez que na composição genómica, rev e env, como apresentado na figura 1, se sobrepõem. De modo a ocorrer transcrição de env, a transcrição de rev tem de parar, e vice-versa. Adicionalmente, a presença de rev é necessária para a exportação de RNA não excisado do núcleo. Para o rev funcionar deste modo, no entanto, tem de estar presente um elemento de resposta rev (RRE) no transcripto [Malim et al., Nature 338: 254-257 (1989)].

Na vacina polinucleotídica desta invenção, a excisão-união obrigatória de certos genes de HIV é eliminada proporcionando-se genes completamente excisados 32 ΡΕ0969862 (i.e.: provisão de grelha de leitura aberta completa para o desejado produto génico sem a necessidade de trocas na grelha de leitura ou eliminação de regiões não codificantes; pessoas familiarizadas na técnica reconhecerão que quando da excisão-união de um gene em particular, existe alguma latitude na sequência precisa resultante; no entanto desde de que seja obtida uma sequência codificante funcional, isso é aceitável). Deste modo, numa forma de realização, a sequência completa codificante para gag é excisado de tal modo que não é necessária expressão intermitente de cada produto génico.

As respostas imunitárias duplas humoral e celular produzidas de acordo com esta invenção são particularmente significativas para inibir infecção pelo HIV, dada a propensão do HIV para mutar dentro da população, assim como em indivíduos infectados. De modo a se formular uma vacina protectora eficaz contra o HIV é desejável a produção de uma resposta de anticorpos multivalente por exemplo para gpl60 (env é aproximadamente 80% conservado em várias estirpes de HIV-1 do ciado B, que são as estirpes prevalentes em populações humanas dos EUA), o alvo principal de neutralização em HIV, assim como células T citotóxicas reactivas às porções conservadas de gpl60 e, proteínas virais internas codificadas por gag. Nós produzimos uma vacina contra o HIV compreendendo genes gpl60 seleccionados de estirpes comuns de laboratório; de isolados virais primários predominantes na população infectada; de gpl60s mutados concebidos para desmascarar 33 ΡΕ0969862 estirpes cruzadas, epitopos neutralizadores de anticorpos; e de outros genes de HIV representativos, tais como, os genes gag e pol (conservados ~95% entre isolados de HIV).

Virtualmente todos os paciente seropositivos para HIV gue não evoluíram na direcção de um estado de imunodeficiência possuem CTLs anti-gag enquanto que cerca de 60% destes pacientes possuem CTLs específicos para gpl60, de estirpe cruzada. A quantidade de CTLs específicos para HIV encontrada em indivíduos infectados que evoluíram para o estado de doença conhecido como SIDA, no entanto, é muito mais baixo, demonstrando a importância das nossas descobertas de que podemos induzir respostas CTL de estirpe cruzada.

As respostas imunitárias induzidas pelas nossas construções de vacina polinucleotídica env e gag são demonstradas em ratinhos e primatas. A monitorização da produção de anticorpos para env em ratinhos permite confirmar que uma determinada construção é adequadamente imunogénica, i.e., uma elevada proporção de animais vacinados exibe resposta por anticorpos. Os ratinhos proporcionam também o modelo animal mais fácil adequado para testar indução de CTL pelas nossas construções e são por isso utilizados para avaliar se uma construção particular tem a capacidade para produzir tal actividade. Os macacos (verde africano, resus, chimpanzés) proporcionam espécies adicionais incluindo primatas para avaliação de anticorpos em animais maiores não roedores. Estas espécies 34 ΡΕ0969862 são também preferidas a ratinhos para ensaios de neutralização por anti-soro devido aos elevados níveis de actividades endógenas de neutralização contra retrovirus observados em soro de ratinho. Estes dados demonstram que é produzida imunogenicidade suficiente pelas nossas vacinas para alcançar protecção em experiências num modelo de desafio chimpanzé/HIViIIB baseado em níveis de protecção conhecidos para anticorpos de neutralização para este sistema. No entanto, a definição de protecção que está a emergir no presente, e cada vez mais aceite na comunidade científica, está a afastar-se da designada "imunidade esterilizante", o que indica protecção completa com infecção com HIV, para prevenção de doença. Vários correlativos deste objectivo incluem título virai reduzido no sangue, medido por PCR, actividade da transcriptase reversa do HIV, por infecciosidade de amostras de soro, por ensaio de ELISA de p24 ou outra concentração de antigénio de HIV no sangue, concentração elevada de células T CD4+, e por taxas de sobrevivência [ver, por exemplo, Cohen, J., Science 262: 1820-1821, 1993, para uma discussão da evolução da definição da eficácia da vacina anti-HIV]. Os imunogénios da presente invenção também produzem respostas imunitárias neutralizadoras contra isolados infecciosos (clínicos, campo principal) de HIV. É utilizado um ensaio de ELISA para determinar se vectores gag de vacina optimizados que expressam tPA-gag excretado ou gag nativo são eficazes para a produção de anticorpos específicos para gag. Inicialmente a 35 ΡΕ0969862 caracterização in vitro da expressão de gag pelos nossos vectores de vacinação é proporcionada por análises de imunotransferência de lisados celulares transfectados com gag optimizado. Estes dados confirmam e quantificam a expressão de gag utilizando anti-soros anti-HIV para visualizar a expressão de gag em células transfectadas.

Produção de Respostas CTL. As proteínas virais que são sintetizadas dentro das células dão origem a respostas CTL restritas a MHC I. Cada uma destas proteínas desencadeia CTL em pacientes seropositivos. As nossas vacinas têm também a capacidade de desencadear CTL em ratinhos e macacos resus. A imunogenética de estirpes de ratinho é apropriada para tais estudos, como demonstrado com NP de influenza, [ver Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993] . Foram definidos vários epitopos para as proteínas de HIV env, rev, nef e gag (Frankel, F.R., et al., J. Immunol. 155, 4775-82 (1995) em ratinhos Balb/c, deste modo facilitando a cultura in vitro de CTL e ensaios de citotoxicidade. Alternativamente, o gene completo que codifica gpl60, gpl20, pol, ou gag pode ser utilizado. Para revisões adicionais neste assunto, ver por exemplo,(HIV Molecular Immunology Database 1995, Korber et al. eds., Los Alamos National Laboratório, Los Alamos, NM, EUA). Como aqui utilizado, a função efectora das células T está associada com o fenótipo de células T maturas, por exemplo, citotoxicidade, secreção de citoquina para activação de células B, e/ou recrutamento ou estimulação de macrófagos e neutrófilos. 36 ΡΕ0969862

Medição de Actividades de TH. São testadas culturas celulares de baço derivadas de animais vacinados para memória de antigénios específicos pela adição de uma proteína recombinante ou epitopos peptídicos. A activação de células T por tais antigénios, apresentados por células acompanhantes apresentadoras de antigénio esplénico, APCs, é monitorizada pela proliferação destas culturas ou pela produção de citoquina. 0 padrão de produção de citoquina permite também a classificação da resposta TH como tipo 1 ou tipo 2. Uma vez que as respostas TH2 dominantes parecem estar correlacionadas com a exclusão de imunidade celular em pacientes seropositivos imunocomprometidos, é possível definir o tipo de resposta produzida em pacientes por um determinado PNV, permitindo a manipulação das respostas imunitárias resultantes.

Com base nos estudos imunológicos acima referidos, é previsível que as nossas vacinas sejam eficazes em vertebrados contra desafio com HIV virulento. Estes estudos são realizados num modelo de desafio HIVinB/chimpanzé após vacinação suficiente destes animais com uma construção de PNV, ou um cocktail de construções de PNV compreendendo gpl60niB, gaglIIB, neflIIB e REVIIIB. A estirpe IIIB é útil neste respeito uma vez que o título em chimpanzé de doses letais desta estirpe foi estabelecido. No entanto, os mesmos estudos são visionados utilizando qualquer estirpe de HIV e os epitopos específicos para ou heterólogos para uma determinada estirpe. Um segundo modelo de vacina- 37 ΡΕ0969862 ção/desafio, adicionalmente a chimpanzés, é o ratinho PBL scid-hu. Este modelo permite testar o sistema imunitário linfocitico humano e a nossa vacina com desafio subsequente com HIV num ratinho hospedeiro. Este sistema é vantajoso uma vez que é facilmente adaptável para utilização com qualquer estirpe de HIV e proporciona prova de protecção contra estirpes múltiplas de campo principal isolados de HIV. Um terceiro modelo de desafio utiliza virus híbridos HIV/SIV (SHIV), alquns dos quais foram demonstrados infectar macacos resus e conduzirem a doença de imunode-ficiência resultando em morte [ver Li, J., et al., J. AIDS 5:639-646, 1992]. A vacinação de resus com as nossas construções de vacina polinucleotídica é protectora contra desafio subsequente com doses letais de SHIV. A eficácia protectora de imunogénios de HIV polinucleot ídicos contra desafio virai subsequente é demonstrado por imunização com o plasmídeo não-replicante de DNA desta invenção. Isto é vantajoso uma vez que não está envolvido um agente infeccioso, não é necessária a montagem de partículas virais, e é permitida selecção determinante. Adicionalmente, uma vez que a sequência de gag é conservada entre várias estirpes de HIV, é possibilitada a protecção contra desafio subsequente por uma estirpe virulenta de HIV que é homóloga à, assim como estirpes heterólogas à estirpe a partir da qual o gene clonado é obtido. A invenção oferece um meio para induzir imunidade protectora de estirpe cruzada sem a necessidade de agentes 38 ΡΕ0969862 ou adjuvantes auto-replicantes. Adicionalmente, a imunização com os presentes polinucleótidos oferece várias outras vantagens. A facilidade de produção e purificação de construções de DNA é favoravelmente comparada com métodos tradicionais de purificação de proteínas, facilitando deste modo a produção de vacinas de combinação. Consequentemente, as construções múltiplas, por exemplo, que codificam gpl60, gpl20, gp41, gag, ou outro qualquer gene de HIV podem ser preparadas, mistas e co-administradas. Uma vez que a expressão proteica é mantida após injecção de DNA, a persistência de células B e T de memória pode ser aumentada, produzindo assim imunidade humoral e mediada celularmente de longa duração.

As técnicas convencionais de biologia molecular para a preparação e purificação de construções de DNA permitem a preparação dos imunogénios de DNA desta invenção. Enquanto que as técnicas convencionais de biologia molecular são consequentemente suficientes para a produção dos produtos desta invenção, as construções específicas aqui divulgadas proporcionam imunogénios polinucleotídicos novos que surpreendentemente produzem neutralização de estirpe cruzada e de isolado primário de HIV, um resultado até agora impossível de alcançar com vacinas convencionais de vírus completo inactivado ou subunidades proteicas. A quantidade de DNA expressável ou RNA transcrito 39 ΡΕ0969862 para ser introduzido num recipiente de vacina irá depender do poder dos promotores de transcrição e tradução utilizados e da imunogenicidade do produto génico expresso. De um modo geral, uma dose imunologicamente ou profilac- ticamente eficaz de cerca de 1 ng a 100 mg, e de modo preferido de cerca de 10 pg a 300 pg é administrada directamente em tecido muscular. São também contemplados injecção subcutânea, introdução intradermal, impressão através da pele, e outros modos de administração, tais como, intraperitoneal, intravenoso, ou distribuição por inalação. É também contemplado que as vacinações de reforço são para ser proporcionadas. Após vacinação com imunogénio polinucleotidico de HIV, o reforço com imunogénios proteicos de HIV, tais como, gpl60, gpl20, e produto génicos de gag é também contemplado. A administração parentérica, tais como, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou outros meios de administração de proteína interleucina-12, ao mesmo tempo que ou subsequentemente a introdução parentérica do PNV desta invenção é também vantajosa. 0 polinucleótido pode ser nu, isto é, não associado com quaisquer proteínas, adjuvantes ou outros agentes que têm impacto no sistema imunitário do recipiente. Neste caso, é desejável que o polinucleótido se encontre numa solução fisiologicamente aceitável, tais como, mas não limitado a, soro fisiológico estéril ou soro fisiológico tamponado estéril. Alternativamente, o DNA pode estar associado com lipossomas, tais como, lipossomas de lecitina ou outros lipossomas conhecidos na técnica, como uma 40 ΡΕ0969862 mistura DNA-lipossoma, ou o DNA pode estar associado com um adjuvante conhecido na técnica para reforçar respostas imunitárias, tais como, uma proteína ou outro transportador. Os agentes que assistem na tomada celular de DNA, tal como, mas não limitado a, iões de cálcio, podem também ser utilizados com vantagem. Estes agentes são geralmente aqui referidos com reagentes facilitadores de transfecção e transportadores farmaceuticamente aceitáveis. As técnicas para revestir microprojécteis revestidos com polinucleótido são conhecidos na técnica e são também úteis em relação a esta invenção.

Os seguintes exemplos são apresentados como modo de ilustração e não se pretende que limitem a invenção em qualquer maneira. EXEMPLO 1

Expressão Heteróloga de Produtos Génicos Tardios de HIV

Os genes estruturais de HIV, tais como, env e gag requerem a expressão do gene regulador de HIV, rev, de modo a produzirem eficazmente proteínas de tamanho completo. Descobrimos que a expressão dependente de rev de gag produziu baixos níveis de proteína e que o próprio rev pode ser tóxico para as células. Apesar de termos alcançado níveis relativamente elevados de expressão dependente de rev de gpl60 in vitro esta vacina desencadeia níveis baixos de anticorpos contra gp!60 após imunização in vivo com DNA 41 ΡΕ0969862 de rev/gpl60. Isto pode resultar de conhecidos efeitos citotóxicos de rev assim como dificuldade acrescida na obtenção de função rev em miotúbulos contendo centenas de núcleos (a proteína de rev precisa de estar no mesmo núcleo do que um transcripto dependente de rev para ocorrer expressão proteica de gag ou env) . No entanto, foi possível obter expressão independente de rev utilizando modificações seleccionadas do gene env.

De um modo geral, as nossas vacinas utilizaram principalmente genes env e gag de HIV (IIIB, MN ou CAM-1) para optimização da expressão dentro do nosso vector de vacinação generalizado, VIJns, que é composto por um promotor precoce imediato de CMV (IE), um sítio de poliadenilação, e BGH e um esqueleto pUC. Podem ser alcançadas eficácias variadas de expressão independente de rev, dependendo de quão grande é o segmento génico utilizado (e.g., gpl20 vs. gpl60), para env substituindo o seu péptido líder de segregação nativo com o do gene activador de plasminogénio especícfico para tecidos (tPA) e expressando o gene quimérico resultante atrás do promotor CMVIE com o intrão A de CMV.

Como apresentado anteriormente, consideramos ser essencial a realização dos seguintes objectivos para maximizar as hipóteses de sucesso com este programa: (1) vec-tores com base em env com capacidade de produção de respostas de anticorpo neutralizantes mais fortes em primatas; 42 ΡΕ0969862 (2) vectores gag e env que desencadeiam respostas de linfó-cito T como caracterizadas por CTL e funções efectoras auxiliares em primatas; (3) utilização de genes env e gag de estirpes de HIV-1 clinicamente relevantes nas nossas vacinas e caracterização das respostas imunológicas que desencadeiam, especialmente neutralização de isolados primários; (4) demonstração de protecção num modelo de desafio animal, tal como, chimpanzé/HIV (IIIB) ou resus/SHIV utilizado vacinas apropriadas optimizadas; e, (5) determinação da duração apropriada das respostas imunitárias para utilização clinica. Foi feito um progresso significativo nos primeiros três destes objectivos e estão em progresso experiências para determinar se as nossas recentes construções para vacinação contra gplôO e gag irão melhorar os resultados iniciais. EXEMPLO 2

Vectores Para Produção de Vacina A. VECTOR DE EXPRESSÃO VIJneo:

Foi necessário remover o gene ampr utilizado para a selecção por antibiótico da bactéria albergando V1J uma vez que a ampicilina não pode ser utilizada em fermenta-dores de grande escala. 0 gene ampr do esqueleto pUC do VIJ foi removido por digestão com as enzimas de restrição SspI e Eamll05I. 0 plasmídeo restante foi purificado por 43 ΡΕ0969862 electroforese em gel de agarose, as extremidades foram tornadas rombas com DNA polimerase T4, e depois tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitelo. 0 gene kanr disponível comercialmente, derivado do transposão 903 e contido no plasmídeo pUC4K, foi excisado utilizando a enzima de restrição PstI, purificado por electroforese em gel de agarose, e as extremidades tornadas rombas com DNA polimerase T4. Este fragmento foi ligado com o esqueleto V1J e foram derivados plasmídeos com o gene kanr em qualquer orientação que foram designados VIJneo nos 1 e 3. Cada um destes plasmídeos foi confirmado por análises por digestão com enzimas de restrição, sequenciação de DNA das regiões de junção, e foi demonstrado produzirem quantidades similares de plasmídeo como o V1J. A expressão de produtos génicos heterólogos foi também comparada com V1J para estes vectores VIJneo. Nós escolhemos arbitrariamente VIJneo n° 3, referido daqui em diante como VIJneo, que possui o gene kanr na mesma orientação do que o gene ampr em V1J como a construção de expressão. B. Vector de Expressão VIJns:

Foi adicionado um sítio Sfi I ao VIJneo para facilitar os estudos de integração. Um ligante Sfi I disponível comercialmente de 13 pares de bases (New England BioLabs) foi adicionado ao sítio Κρη I dentro da sequência BGH do vector. O VIJneo foi linearizado com Κρη I, purificado em gel, as extremidades foram tornadas rombas com DNA polimerase T4, e ligado ao ligante Sfi I rombo. 44 ΡΕ0969862

Foram escolhidos isolados clonados por mapeamento de restrição e verificados por sequenciação do ligante. 0 novo vector foi designado VIJns. A expressão de genes heterólogos em VIJns (com Sfi I) foi comparável à expressão dos mesmos genes em VIJneo (com Κρη I). C. VIJns-tPA:

De modo a proporcionar uma sequência peptídica líder heteróloga para ser excretada e/ou proteínas membranares, o VIJn foi modificado para incluir o activador líder humano de plasminogénio específico para tecidos (tPA) . Foram emparelhados dois oligómeros sintéticos complementares e depois ligado no VIJn que fora digerido com BglII. Estes oligómeros possuem bases penduradas compatíveis para ligação com sequências clivadas com BglII. Após a ligação o sítio BglII a montante é destruído enquanto que o BglII a jusante é mantido para subsequentes ligações. Tanto os sítios de junção assim como a sequência líder completa de tPA foram verificados por sequenciação de DNA. Adicionalmente, de modo a estar conforme com o nosso vector VIJns de consenso optimizado (=VlJneo com um sítio Sfi I), foi colocado um sítio de restrição Sfi I no sítio Kpnl dentro da região de terminação BGH do VIJn-tPA tornando rombo o sítio Kpnl com DNA polimerase T4 seguido de ligação com um ligante SfiI (n° de catálogo 1 138, New England Biolabs). Esta modificação foi verificada por digestão por restrição e electroforese em gel de agarose. 45 ΡΕ0969862 D. Preparaçao do Vector VIR:

Num esforço para continuar a optimização do nosso vector básico de vacinação, preparamos um derivado de VIJns que foi designado como VIR. 0 objectivo da construção deste vector foi a obtenção de um vector de vacina com tamanho mínimo, i.e., sem sequências desnecessárias de DNA, que ainda mantinha as características de expressão geral optimizada de genes heterólogos e os rendimentos plasmí-dicos elevados que o V1J e VIJns possibilitavam. Determinámos a partir da literatura assim como por experimentação que (1) as regiões dentro do esqueleto pUC compreendendo a origem de replicação de E. coli podiam ser removidas sem afectar o rendimento do plasmídeo da bactéria; (2) a região 3' do gene kanr após a grelha de leitura aberta para a canamicina podia ser removida se um terminador bacteriano fosse inserido no seu lugar; e, (3) ~300 pb da metade 3' do terminador BGH podia ser removido sem afectar a sua função reguladora (após o sítio original da enzima de restrição Kpnl dentro do elemento BGH). 0 VIR foi construído utilizando PCR para sintetizar três segmentos de DNA de VIJns representando o promotor CMVintA / terminador BGH, origem de replicação, e elementos de resistência à canamicina, respectivamente. Foram adicionadas enzimas de restrição únicas para cada segmento a cada extremidade do segmento utilizando os oligómeros de PCR: SspI e Xhol para CMVintA/BGH; FcoRV e 46 ΡΕ0969862

BamHI para o gene kanr; e, Bell e SalI para o orir. Estes sítios enzimáticos foram escolhidos uma vez que permitem ligação direccional de cada um dos segmentos de DNA derivados de PCR com perda subsequente de cada sítio: EcoRV e Sspl deixam os DNAs com extremidades rombas que são compatíveis para ligação enquanto que BamHI e Bell deixam pontas complementares assim como SalI e XhoI. Após obtenção destes segmentos por PCR cada segmento foi digerido com as enzimas de restrição apropriadas acima indicadas e depois ligado entre si numa única mistura de reacção contendo todos os três segmentos de DNA. A extremidade 5' do orir foi concebida para incluir a sequência de terminação independente T2 rho que é normalmente encontrada nesta região de modo a poder fornecer informação de terminação para o gene de resistência à canamicina. 0 produto ligado foi confirmado por digestão com enzima de restrição (>8 enzimas) assim como por sequenciação de DNA das junções de ligação. Os rendimentos de DNA plasmídico e expressão heteróloga utilizando genes virais dentro do VIR parecem similares a VIJns. A redução líquida no tamanho do vector alcançada foi de 1 346 pb (VIJns = 4,86 kb; VIR = 352 kb). EXEMPLO 3

Desenho de Segmentos Génicos Sintéticos para Expressão Génica aumentada de gag:

Os segmentos génicos foram convertidos em sequências possuindo sequências traduzidas idênticas mas com 47 ΡΕ0969862 utilização alternativa de codões como definido por R. Lathe num artigo de investigação do J. Molec. Biol. Vol. 183, pp. 1-12 (1985) intitulado "Sondas Oligonucleotidicas Sintéticas Deduzidas de Dados de Sequência de Aminoácidos: Considerações Teóricas e Práticas". A metodologia em baixo descrita para aumentar a expressão de segmentos génicos gag de HIV foi baseada na nossa hipótese de que a incapacidade conhecida para expressar eficazmente este gene em células de mamífero é uma consequência da composição geral do transcripto. Deste modo, utilizando codões alternativos que codificam a mesma sequência proteica podem-se remover as limitações na expressão de gag. 0 método específico de substituição de codão utilizado pode ser descrito com se segue: 1. Identificar posicionamento dos codões para grelha de leitura aberta apropriada. 2. Comparar codão tipo selvagem para frequência observada de utilização por genes humanos. 3. Se o codão não é o mais comummente utilizado, subs-titui-lo por um codão óptimo para expressão elevada em células humanas. 4. Repetir este procedimento até que o segmento génico completo tenha sido substituído. 48 ΡΕ0969862 5. Inspeccionar a nova sequência génica para sequências não desejadas produzidas por estes codões de substituição (e.g.r sequências "ATTTA", criação inadvertida de sítios de reconhecimento de excisão de intrão, sítios de enzimas de restrição não desejados, etc.) e substituir codões que eliminam estas sequências. 6. Montar segmentos génicos sintéticos e testar para expressão melhorada.

Estes métodos foram utilizados para produzir os seguintes segmentos génicos sintéticos para gag de HIV produzindo um gene composto na totalidade por utilização óptima de codões para expressão. Enquanto que os procedimento acima apresentados proporcionam um sumário da nossa metodologia para o desenho de genes optimizados para codões para vacinas de DNA, é compreendido por peritos na técnica que eficácia similar da vacina ou expressão aumentada de genes podem ser alcançadas por pequenas variações no procedimento ou por pequenas variações na sequência. EXEMPLO 4 I. Construções de Vacina de gag de HIV:

Este é uma orf completa gag de HIV-1 (CAM1) formada por codoes óptimos. 49 ΡΕ0969862 ι si $mp®3®ssm MKMVCMQC TOaG&OC^a SMSCMSe mi fjyy^c&eM? msMosjysc *sm&@a®®sr t^ts®s&&£ 151 ficfemffic mmmmç assscMs&m? ^&mxmsr soí. eeftfifeecsKc oo^iyyyi&g; sersassTec cTS-mcmc^ 251 c-Ãã^eme ee©smcw aosc&ecjusA ãísãttg&isst s&asGftc&ec sai ARflss&saoec ccaamm

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Ii«l I^CfCCCaST MMTM&SC €GQS®CJ&&$ O? 1¾ xis mtt) EXEMPLO 5

Expressão In vitro de Vacina gag: A expressão in vitro foi testada para estas construções em rabdomiossarcoma(RD) humano transfectado ou células 293. A quantificação de gag a partir células 293 transfectadas mostrou que ο VIJns-opt-gag e o vector gag VIJns-tPA-opt produziram gag excretado. EXEMPLO 6

Ensaio Para Linfócitos T Citotóxicos para HlV-gag

Os métodos descritos nesta secção ilustram o ensaio utilizado para ratinhos vacinados. Pode ser utilizado um ensaio essencialmente similar com primatas excepto que as linhas celulares B autólogas têm de ser estabelecidas para utilização como células alvo para cada animal. Isto pode ser alcançado para humanos utilizando o vírus Epstein-Barr e para macacos resus utilizando o vírus B de herpes. 51 ΡΕ0969862

As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são derivadas quer de sangue recentemente tirado ou baço utilizando centrifugação de Ficoll-Hypaque para separar eritrócitos de células brancas do sangue. Para ratinhos, podem também ser utilizados nódulos linfáticos. Podem ser preparados CTLs efectores a partir de PBMC quer por cultura in vitro em IL-2 (20 U/mL) e concanavalina A (2 yg/mL) durante 6-12 dias ou por utilização de antigénio especifico utilizando um número igual de células apresentadoras de antigénio irradiadas. O antigénio especifico pode consistir quer em péptidos sintéticos (normalmente 9-15 aminoácidos) que são epitopos conhecidos para reconhecimento por CTL para o haplotipo de MHC dos animais utilizados, ou construções de virus Vaccinia construídas para expressarem o antigénio apropriado. As células alvo podem ser quer linhas celulares singénicas ou emparelhadas com o haplotipo de MHC que foram tratadas para apresentarem antigénio apropriado como descrito para simulação in vitro dos CTLs. Para ratinhos Balb/c o péptido gag de Paterson (J. Immunol., 1995), foi utilizado a uma concentração de 10 μΜ para re-estimular CTL in vitro utilizando esplenócitos singénicos irradiados e pode ser utilizado para sensibilizar células alvo durante o ensaio de citotoxicidade a Ι-ΙΟ μΜ por incubação a 37 °C durante cerca de duas horas antes do ensaio. Para estes ratinhos com haplotipo MHC H-2d, a linha celular murino de mastocitoma, P815, proporciona boas células alvo. As células alvo sensibilizadas com antigénio são carregadas com Na51Cr04, que é libertado do 52 ΡΕ0969862 interior das células alvo após morte por CTL, por incubação de alvos durante 1-2 horas a 37 °C (0,2 mCi para ~5 x 106 células) seguida por várias lavagens das células alvo. As populações de CTL são misturadas com células alvo em proporções variadas de efectores para alvos, tal como, 100:1, 50:1, 25:1, etc., sedimentadas juntas, e incubadas 4-6 horas a 37 °C antes da recolha dos sobrenadantes que são depois ensaiados para libertação de radioactividade utilizando um contador gama. A citotoxicidade é calculada como uma percentagem de contagens totais libertáveis das células alvo (obtida utilizando tratamento com Triton X-100 a 0,2%) da qual foi subtraída a libertação espontânea de células alvo. EXEMPLO 7

Ensaio Para Anticorpos específicos para gag de HIV:

Foram concebidas ELISA para detectar anticorpos produzidos contra HIV utilizando qualquer proteína p24 gag específica recombinante como substrato de antigénios. Foram revestidas placas de microtitulação de 96 poços a 4 °C durante a noite com antigénio recombinante a 2 pg/mL em solução de PBS (soro fisiológico tamponado com fosfato) utilizando 50 pL/poço numa plataforma com agitação. Os antigénios consistiram em gag p24 recombinante (Intracell). As placas foram enxaguadas quatro vezes utilizando tampão de lavagem (PBS/Tween 20 a 0,05%) seguida da adição de 200 pL/poço de tampão de bloqueamento (solução a 1% de leite 53 ΡΕ0969862

Carnation em PBS/ Tween 20 a 0,05%)) durante 1 h à temperatura ambiente com agitação. Os pré-soros e imuno soros foram diluídos em tampão de bloqueamento no intervalo desejado de diluições e foram adicionados 100 pL por poço. As placas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com agitação e depois lavadas quatro vezes com tampão de lavagem.

Foram depois adicionados anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano silvestre, (Ig anti-resus, Southern Biotechnology Associates; Igs anti-ratinho e anti-coelho, Jackson Immuno Research) diluídos 1:2 000 em tampão de bloqueamento, a cada amostra a 100 pL/poço e incubado 1 h à temperatura ambiente com agitação. As placas foram lavadas 4 vezes com tampão de lavagem e depois reveladas por adição de 100 pL/poço de uma solução de o-fenilenodiamina (o-PD, Calbiochem) a 1 mg/mL em tampão citrato a 100 mM a pH 4,5. As placas foram lidas para absorvência a 450 nm cineticamente (primeiros dez minutos da reacção) e a pontos finais de 10 e 30 minutos (leitor de microplacas Thermo-max, Molecular Devices). EXEMPLO 8

Ensaios de Proliferação de Células T:

As PBMCs sao obtidas e testadas para respostas de memória contra antigénios específicos como determinado por 54 ΡΕ0969862 proliferação na população de PBMC. A proliferação é monitorizada utilizando 3H-timidina que é adicionada às culturas celulares durante as últimas 18-24 horas de incubação antes da colheita. Os colectores de células retêm o DNA contendo isótopos em filtros se ocorreu proliferação enquanto que as células quiescentes não incorporam o isótopo que não é retido no filtro na forma livre. Tanto para espécies de roedores como primatas são plaqueadas 4 X 105 células em placas de microt itulação com 96 poço num total de 200 pL de meio completo (RPMI/ soro fetal de vitela a 10%) . As respostas de proliferação de fundo são determinadas utilizando PBMCs e meios apenas, enquanto que as respostas não especificas são produzidas utilizando lectinas, tais como, fito-hemaglutina (PHA) ou concana-valina A (ConA) a concentrações de 1- 5 pg/mL para funcionarem como um controlo positivo. Os antigénio específicos consistem quer em epitopos peptídicos conhecidos, proteínas purificadas, ou vírus inactivados. As concentrações de antigénio variam entre 1- 10 pM para péptidos e 1-10 pg/mL para proteína. A proliferação induzida por lectina tem um pico a 3-5 dias de incubação da cultura celular enquanto que as respostas específicas para antigénio têm um pico a 5-7 dias. A proliferação específica ocorre quando são obtidas contagens de radiação que são pelo menos três vezes mais do que a média do valor de fundo e é muitas vezes apresentada como uma razão com o valor de fundo, ou índice de Simulação (SI). 55 ΡΕ0969862 EXEMPLO 9

As estratégias que empregámos foram concebidas para induzirem respostas de linfócitos T citotóxicos (CTL) e de neutralização por anticorpos contra o HIV, principalmente dirigidas aos produto génicos gag (-95% conservado) e env (gpl60 ou gpl20; 70-80% conservado) de HIV. O gplôO possui os únicos epitopos de neutralização para anticorpos conhecidos para a partícula de HIV, enquanto que a importância das respostas CTL anti-env e anti-gag é sublinhada pela associação conhecida entre o início destas imunidades celulares e o desaparecimento de viremia primária após infecção, o que ocorre antes do aparecimento de anticorpos de neutralização (Koup et ai., J. Virol. 68: 4650 (1994)), assim como um papel para o CTL na manutenção do estado livre de doenças. Apesar do HIV ser notável pela sua diversidade genética, esperamos obter um universo maior de anticorpos de neutralização quer incluindo vários genes env representativos derivados de isolados clínicos e gp41 (~90% conservados; e possui o epitopo de neutralização mais conservado 2F5), enquanto que o gene gag muito conservado deverá produzir respostas CTL de estirpe cruzada amplas. Uma vez que esta estratégia de vacina produz forte imunidade humoral e celular contra o HIV (em primatas não humanos) esta abordagem oferece vantagens únicas comparado com outras estratégias de vacinação disponíveis contra o HIV. 56 ΡΕ0969862 A. Desenvolvimento de Vacina Polinucleotídica de gag de HIV-1:

Com base nas nossas experiências para expressão genética de env de HIV utilizando genes constituídos por codões óptimos para expressão em humanos, foi concebido e sintetizado um gene gag p55 sintético (gag opt) possuindo utilização óptima de codões em toda a extensão resultando em ~350 mutações silenciosas (de um total de 1 500 nt) e clonado em VIR. Foi também construída uma segunda forma do vector gag opt que possuía a sequência que codifica o sinal peptídico tPA no terminal NH2 similar ao acima descrito para env de HIV e que também eliminou um motivo de sequência de localização nuclear situado nesta posição no gene tipo selvagem. Esta modificação foi concebida para testar se alterando os padrões de trânsito intracelulares normais para gag na via de segregação do ER/golgi poderia alterar a imunogenicidade da vacina de DNA de gag. A adição do péptido líder tPA ao gag resultou na segregação de níveis muito mais elevados de gag e a proteína segregada migrou como uma forma de peso molecular mais elevado comparado com o t.s. de gag. Isto indicou que ocorreu modificação na pós-tradução, provavelmente glicosilação, como o resultado de modificação com o péptido líder tPA.

Os ratinhos que foram imunizados com uma das duas construções optimizadas de gag p55 (VIR-gag opt ± líder tPA) ou VIR-gag (tipo selvagem) foram testados para respostas CTL peptídicas anti-gag após uma injecção (doses ΡΕ0969862 cie vacinação = 10, 3,3, ou 1 yg/ratinho). Foram produzidos niveis elevados de CTL anti-gag por ambos os DNAs de V1R-gag opt para todas as doses com VIR-tPA-gag opt produzindo a morte específica mais elevada (~85% θ E/T = 3 com a dose de 1 yg) . A comparação das curvas de citotoxicidade para cada dose de DNA demonstrou que a vacinação com VIR-tPA-gag opt produziu respostas CTL ~100 vezes mais fortes do que VlR-gag (tipo selvagem). Em geral, as respostas imunitárias para os três grupos de vacina demonstrou a mesma potência relativa para respostas CTL, T auxiliar, e anticorpo (em ordem da resposta mais elevada para a mais baixa): VlR-tPA-gag opt > VlR-gag opt > VIR gag (tipo selvagem). Em resumo, as respostas CTL, humoral e célula T auxiliar são muito mais elevadas para as construções gag opt, especialmente com um lider tPA. EXEMPLO 10 Método de Tratamento

Uma pessoa com necessidade de imunização terapêutica ou profiláctica contra infecção com vírus da imunodef iciência humana é injectada com DNA de HIV que codifica todo ou parte do gene gag ou suas combinações com toda ou parte dos genes env ou pol. A injecção pode ser i.p., subcutânea, intramuscular ou intradérmica. O DNA de HIV pode ser utilizado como um iniciador da resposta imunitária ou pode ser utilizado como um reforço da resposta imunitária. A injecção de DNA pode anteceder, 58 ΡΕ0969862 coincidir ou ser após a injecção da pessoa com uma composição farmacêutica compreendendo HIV inactivado, HIV atenuado, composições compreendendo proteínas derivadas de HIV, ou suas combinações. EXEMPLO 11 Método de Tratamento

Uma pessoa com necessidade de tratamento terapêutico contra infecção com o vírus da imunodeficiência humana é tratada com um agente anti-viral anti-HIV ou suas combinações. 0 indivíduo tratado é injectado com as composições farmacêuticas de DNA de HIV da presente divulgação.

Lisboa, 15 de Dezembro de 2006

Claims (7)

1. ΡΕ0969862 1 REIVINDICAÇÕES 1. Vector para vacina de DNA plasmídico para utilização para indução de uma resposta imunitária contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV) em hospedeiro mamífero, o referido vector para vacina de DNA plasmídico compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica um antigénio gag de HIV, e a referida sequência polinu-cleotídica compreendendo uma grelha aberta de leitura completa para o antigénio gag de HIV como apresentado na SEQ ID NO: 1.
2. 2. Vector para vacina de DNA plasmídico da reivindicação 1 em que a sequência polinucleotídica que codifica um antigénio gag de HIV consiste na grelha aberta de leitura completa para o antigénio gag de HIV como apresentado na SEQ ID NO: 1.
3. 3. Vector para vacina de DNA plasmídico de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 que compreende um promotor precoce imediato operacional de CMV e intrão A de CMV na 5'da sequência polinucleotídica que codifica um antigénio gag de HIV.
4. 4. Vector para vacina de DNA plasmídico da reivindicação 3 que compreende uma sequência sinal tPA na 3' do promotor precoce imediato de CMV /intrão A de CMV, e em que a sequência polinucleotídica que codifica um 2 ΡΕ0969862 antigénio gag de HIV se encontra 3' da sequência sinal de tPA.
5. 5. Vector para vacina de DNA plasmídico da reivindicação 3 ou reivindicação 4 que compreende ainda uma sequência de terminação BGH operacional na extremidade 3' da sequência polinucleotídica que codifica um antigénio gag de HIV.
6. 6. Formulação farmacêutica compreendendo um vector para vacina de DNA plasmidico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 5 e um transportador farmaceu-ticamente aceitável.
7. 7. Utilização, para a produção de um medicamento para indução de uma resposta imunitária contra o vírus da imunodeficiência humana num hospedeiro mamífero, de um vector para vacina de DNA plasmídico como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 5. Lisboa, 15 de Dezembro de 2006