JPH06508153A - 免疫不全ウイルス用の遺伝子ワクチン - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 免疫不全ウイルス用の遺伝子ワクチン 発明の分野 本発明は遺伝子ワクチンの一般的分野に関し、特に免疫不全ウィルス用の遺伝子 ワクチンに関するものである。

発明の背景 ワクチン接種した個体を感染症の発生に対して抵抗性とする該個体のワクチン接 種は医学における最も古典的な型の予防法の１種である。以前、小児、成人並び に獣医用途用のウィルス性および細菌性の病原体に対するワクチンは感染した生 物から直接誘導され、大きな３つのカテゴリー、即ち生の弱毒化ワクチン、死菌 ワクチンおよびサブユニットワクチンの１つとして分類できた。これら３つのカ テゴリーのワクチンはその発現および作用様式において異なっているが、これら ３種のカテゴリーのワクチンの何れかの投与は、該ワクチンの１回以上の接種に 伴って、該病原体に対する特異的な免疫学的な応答を発生させることにある。

この発生する免疫学的な応答は、該個体を後の感染に対して完全に免疫化するこ ともしないこともあるが、通常は疾患症状の出現を阻害し、かつあらゆる後の感 染の程度を大幅に制限するであろう。

現代分子生物学の方法は、種々の前臨床的および臨床的進展段階にある様々な新 規ワクチンによる方策の開発を可能とする。これらの努力の意図するところは旧 来の諸疾患用の新規なワクチンの製造のみならず、従来のワクチン開発戦略が不 首尾であることが立証された感染症に対する新規なワクチンを作成することにあ る。特に、免疫不全ウィルスの最近の同定並びにその蔓延は、従来のワクチン開 発戦略がこれまでに効果的な制御を達成し得なかった病原体の例である。

従来のワクチンの中の第一の広義のカテゴリーは生の弱毒化ワクチンである。

生の弱毒化ワクチンは病原性のウィルスまたはバクテリアの特定の菌株に相当し 、該菌株はその病原性を喪失するが、ヒト中での感染能および複製能を喪失しな いように変性されている。生の弱毒化ワクチンはワクチンの最も有効な型と考え られている。というのは、各個体内において真の感染を生ずるからである。該複 製病原体およびこれによるヒト細胞の感染は免疫系の体液性および細胞性部分を 刺激し、かつ長期に及ぶ免疫記憶を刺激する。かくして、ウィルスのおよび細胞 内バクテリアの感染に対する生の弱毒化ワクチンは、通常僅かに一回の接種後に 、中和性抗体産生を刺激し、かつ細胞毒性【−リンパ細胞（ＣＴＬｓ）の生産を 刺激する。

生の弱毒化ワクチンのＣＴＬｓ産生刺激能力が生の弱毒化ワクチン類の相対的な 有効性における差異の重要な理由であると考えられている。ＣＴＬｓは、実際の ウィルス並びにバクテリア感染の阻止の理由となる該免疫系の主な成分として認 識されている。ＣＴＬｓは宿主の各感染細胞における外来タンパクの生産により 誘発され、該感染細胞は該抗原を処理し、かつ免疫学的認識のために該細胞表面 上の特定の抗原決定基を与える。個々の感染細胞中での外来抗原の生産を含む、 該宿主細胞における実際の制限さイ廿−感染の確立により、弱毒化ワクチンによ るＣＴＬ免疫性が誘発される。生の弱毒化ワクチンに起因する免疫過程は、また 免疫記憶の誘発をも生じ、この免疫記憶は将来感染性の物質の病原型に暴露され た場合に、特異的ＣＴＬクローンおよび抗体−産生プラズマ細胞を即座に発生し 、この感染を迅速に阻止し、かつ実際に疾患を予防する。

生の弱毒化ワクチンの重大な欠点は、無秩序な遺伝的変異を通して新規なビルレ ント表現型に戻る固有の傾向をもつことである。統計的には、かかる復帰は今日 一般的に使用されている弱毒化ウィルスワクチンでは稀なできごとであるが、こ のようなワクチンは高頻度の復帰が避けえない程に大規模に投与されており、ワ クチン−誘発性疾患の存在が実証されている。更に、弱毒化ワクチンが該ワクチ ンのｌ／シビエント内で免疫系の応答能が低い状態にあるために、蔓延した感染 の発生を生じた場合には、しばしば合併症が観測される。弱毒化ワクチンの開発 に係わる更なる制限は、幾つかの病原体については適当な弱毒化菌株を同定する ことが困難であり、かつ幾つかの病原体に関する変異的浮動の頻度が著しく大き くて、復帰に関連した危険性をそのままでは許容し得ないことにある。後者の点 が特に十分に実証されているウィルスはヒト免疫不全ウィルス（ｌ（ＩＶ）であ り、このヒト免疫不全ウィルスについては、適当な動物モデルがないためにおよ びその病因的なメカニズムが十分に理解されていないために、弱毒化変異ウィル ス菌株の効果的な同定並びにテストは不可能である。このような変異株が同定で きたとしても、遺伝的浮動の迅速さおよびレトロウィルス、例え１ｆｌｌｌＶの 再組み換えのために、該ウィルスのあらゆる弱毒化された表現型の不安定性は許 容し得ないレベルとなってしまう。これらの複雑性のために、このワクチン接種 法が望ましい細胞毒性の細胞性免疫および免疫記憶を効果的に生ずるにも拘らず 、幾つかのウィルスに対する生の弱毒化ワクチンの製造は許容し得ないものとな ってしまう。

ワクチンの第二のカテゴリーは死菌およびサブユニットワクチンである。これら のワクチンは不活性化した全バクテリアまたはつ・ｆルスあるいはその精製した 成分からなる。これらのワクチンは病原性ウィルスまたはバクテリアから誘導さ れ、該ウィルスまたはバクテリアは物理的または化学的処理により不活性化され ており、該全微生物病原体または精製された該病原体の成分の何れかがワクチン として処方される。このカテゴリーのワクチンは該不活性化処理により比較的安 全に作成できるが、該不活性化の程度と該ワクチン接種された患者に誘発された 免疫系の反応の程度との間にある釣合いがある。過度の不活性化は、該生成物に 対する後の免疫応答が防禦性でないような、免疫学的決定基の構造の大幅な変化 を生ずる可能性がある。このことは、過去における不活性化した麻疹ウィルスワ クチンおよび呼吸性シンシチウムウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃ ｙｔｉｌ　ｖｉｒｕｓ；　ＲＳウィルス）ワクチンの臨床的評価により最もよく 実証され、該ワクチンは感染性のピリオンを中和し得ないばかりか、感染性ウィ ルスに暴露された場合に一層悪化させるという強力な抗体応答を生じた。他方、 免疫原性を保持するために不活性化処理を最小限に保った場合には、該ワクチン 処方物中に感染性物質が混入する高い危険性をもつ。

死菌またはサブユニットワクチンの主な利点は、ワクチン接種された個体内の抗 体を中和するかなりの力価を誘発し得ることにある。死菌ワクチンは、該病原体 上の多数の抗原サイトに対して応答性を誘発する点で、一般的にサブユニットワ クチンよりも免疫原性の高いものである。殺したウィルスワクチンまたはサブユ ニットワクチンは、通常適当な初回およびブースタ一応答を達成するのに多数回 の接種を必要とするが、長期に及ぶ免疫性を達成し得る。これらのワクチンは毒 素−産生バクテリアにより生ずる疾患の予防に特に有効である。この際の防禦形 式は毒素中和抗体の著しく高い力価である。この抗体応答はかなり長い期間に渡 り持続し、かつ既往応答または二次的応答のために、後の感染の際に迅速に再現 し得る。他方、これらのワクチンは、一般的に細胞毒性の細胞性免疫応答を生じ 得す、そのためにウィルス性疾患の予防にとってこれらワクチンは理想的なもの とはいえない。細胞毒性リンパ球はウィルス感染の排除にとって主要な媒介体で あるから、細胞毒性免疫性免疫性を刺激し得ない全てのワクチン手段は、通常ウ ィルス疾患に対してあまり好ましい方法ではなく、そのために通常選択される方 法は弱毒化ウィルス法である。

組み換えＤＮＡ法の開発は、今やワクチンとして使用するためのあらゆるタンパ ク、微生物またはウィルス病原体、またはその部分の異種生産を可能とした。従 って、ワクチンの構成成分は実際の病原性生物自体から誘導する必要はない。理 論的には、例えばウィルス表面の糖タンパクを、真核発現系において、適当な免 疫原性にとって固有のその配座として形成できる。しかしながら、実際には組み 換えウィルスタンパク構成成分は予防性の抗体応答を普遍的に誘発するものでは ない。更に、死菌ワクチンと同様に、細胞性の細胞毒性免疫応答は、一般的に組 み換えサブユニットタンパクによる接種後には見られない。かくして、このワク チン接種法は安全かつ潜在的に免疫原性のウィルスまたはバクテリアタンパクを 大量に生産する有効な方法を提供するが、かかるワクチンは血清抗体応答のみを 発揮することができ、従ってウィルス疾患に対する予防を保証する最良の選択で はあり得ない。

組み換えＤＮＡ技術の利用可能性および免疫学における発展は種々の微生物抗原 の抗原決定基の免疫学的に申し分のないマツピングに導く。従って、各々が明確 なエピトープまたは決定基に相当する短いペプチドに基く化学的に合成されたワ クチンを開発することが今や理論的には可能となる。Ｂ−細胞または抗体免疫応 答を導く手段となるヘルパーＴ−細胞決定基の同定法が発展した。ヘルパーＴ− 細胞ペプチドのＢ−細胞エピトープに相当するペプチドまたは抗体結合サイトに 対する共有結合は該Ｂ−細胞エビトープの免疫原性を大幅に高めることを可能と する。不幸なことに、ウィルス上の天然抗体結合サイトの多くは配座依存性であ るか、または１個以上のペプチド鎖から構成さＬ従って該完全なウィルス上のエ ピトープの構造を合成ペプチドと似せることが困難となる。かくして、ペプチド ワクチンはウィルス病原体に対する抗体の中和を刺激する最良のビヒクルである とは考えられない。他方、細胞毒性Ｔ−リンパ球により認識される決定基を表す ペプチドが、親油性部分とのカップリングを介してクラス■主要組織適合性（Ｍ ）ｌの抗原を担持する細胞膜を標的とする場合には、該ペプチドはＣＴＬｓを誘 発できることを立証する幾つかの既に知られた証拠がある。これらの実験的なペ プチドワクチンは安全カリ安価であると思われるが、複雑な三次元タンパク構造 を模倣する上で幾つかの難点がある。しかしながら、実験動物中に細胞毒性免疫 性を首尾よく誘発させ得ることに関連する幾つかの証拠がある。

ワクチンに関連して提案されたもう一つの新規な組み換え技術は、非−病原性ウ ィルス、例えばワクシニアウィルスまたはアデノウィルス等を発現する生の組み 換えワクチンを生成することであり、該ウィルスのゲノムのセグメントは異種病 原性ウィルスからのウィルス抗原をコードする遺伝子で置換されている。研究に よれば、実験動物をかかる組み換えウィルスで感染することにより、異種タンパ クを包含する種々のウィルスタンパクが生産されることが示された。この最終結 果は、通常接種後の異種タンパクの生産により生ずる該タンパクに対する細胞毒 性の細胞性免疫応答である。しばしば検出可能な抗体応答も同時に見られる。

生の組み換えウィルスは、従ってその作用様式において弱毒化ウィルスと類似し 、かつ免疫応答を与えるが、よりビルレントな表現型に復帰する傾向は示さない 。

他方、この方法は、非−病原性ではあるがワクシニアウィルスおよびアデノウィ ルスが依然として低頻度で病原性の感染を誘発し得るという欠点をもたない訳で はない。かくして、破滅的に蔓延する感染の可能性のために、免疫性の低下した 個体には使用しないように指示すべきであろう。更に、これらワクチンの異種タ ンパクに対する免疫性を誘発する能力は該キャリヤウィルスに対して元々存在す る免疫性により調和され、従って該組み換えウィルスによる感染が予防され、か つ該異種タンパクの生産が阻止される可能性がある。

概して、上記のワクチン接種法の全ては、種々の感染性の物質に対するその有用 性を制限する固有の利点および欠点をもつ。幾つかの方法は非−複製型の抗原を 使用している。これらの方法は中和血清抗体の誘発のために使用でき、かかるワ クチンは多数回の接種を必要とし、かつ細胞毒性免疫性を生成しない。ウィルス 性の疾患に対しては、弱毒化ウィルスの高い細胞毒性免疫性を誘発する能力およ び長期に渡る免疫記憶のために、該弱毒化ウィルスが最も有効であると考えられ ている。し力士ながら、全てのウィルス性病原体に対して安全な弱毒化ワクチン を開発することは不可能である。

従って、あらゆる許容し得ない病原性、またはワクチン接種された個体における 該ウィルスの変異もしくは組み換えの危険性をもっことなしに、細胞毒性免疫性 、免疫記憶並びに循環性抗体の生産を可能とするワクチンを開発することが望ま しい。

発明の概要 本発明は、要約すれば動物の細胞内で機能可能なプロモータおよびウィルスによ り生産される決定基をコードするタンパクコード領域を含む外来遺伝子構築体の コピーを調製し、該外来遺伝子構築体のコピーを該動物の細胞のサイズと比較し て小さなサイズの担体粒子上に被覆し、該被覆担体粒子をインビボで該動物の細 胞内に加速注入する（ａｃｃｅｌｅｒａｔ　ｉｎｇ）各工程を含む遺伝子ワクチ ン接種法により、該動物に該ウィルスに対する免疫性を付与することに関する。

本発明は、またヒト免疫不全ウィルス（Ｈｍのウィルスゲノムの全読み取り枠を コードするが長末端反復またはプライマー結合サイトをコードしないＤＮＡ配列 と、ヒト細胞中で遺伝子ワクチン（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｃｃｉｎｅ）を生成す るのに有効なプロモータとを結合し、次いで該遺伝子ワクチンを粒子媒介トラン スフェクション法により個体の細胞内に導入することにより、該ヒト免疫不全ウ ィルスに対する遺伝子ワクチンを生成することに関連する。

従って、本発明の目的の一つは、ワクチン接種（−だ個体内に遺伝子ワクチンを 使用して、ウィルス病原体に対する細胞毒性免疫性を該個体内に誘発させること にある。

本発明の特徴は、該遺伝子ワクチンの皮膚または粘膜への分配もしくは末梢血液 細胞内への分配の何れにも等しく採用でき、かくして該処理した個体内に血清並 びに粘膜性抗体応答を誘起するのに利用できることにある。

本発明の遺伝子ワクチン接種法の利点は、この方法が遺伝上安全であり、投与の 際に苦痛を伴わず、かつ該ワクチン接種した個体に有害な影響を及ぼさないはず であることにある。

本発明の他の目的、利点並びに特徴は以下の本明細書の記載から明らかとなろ図 面の簡単な説明 第１図は、プラスミドｐＷＲＧ１６０２の遺伝子および制限サイトを示すプラス ミドマツプであり、 第２図は本発明の遺伝子ワクチンプラスミドｐＣＨｆｆｐＡＬのプラスミドマツ プであり、 第３図は以下に記載する実施例の１つにおいて得られた結果の幾つかをグラフで 示した図であり、および 第４図はもう一つの以下に記載する実施例において得られた結果をグラフで示し た図である。

好ましい態様の説明 本発明は、ウィルス特に免疫不全ウィルスに対する遺伝子ワクチンを生成するこ とを目的とし、この目的は免疫化すべき動物の細胞内で該病原性ウィルス由来の 抗原的に正確なタンパクの発現を誘発し得る遺伝子配列により該動物の体細胞を トランスフェクションすることにより達成される。該遺伝子配列はウィルスの複 製または発病に必要とされるウィルスゲノムのエレメントを含まない。このよう な遺伝子ワクチンの動物体細胞への導入は、健康なまたは免疫性−低下個体にお ける病原体感染の危険性なしに、弱毒化または組み換え生ウィルスの作用を模倣 するためである。この遺伝子ワクチンの導入は、これら細胞内で該ウィルス粒子 に関連した構造タンパク決定基の発現を生じるであろう。この処理された構造タ ンパクは、該トランスフェクションされた細胞の表面上に正常な細胞の主要組織 適合性複合体（ＭＨＣ）抗原と共に配列されるであろう。ＭＣ抗原と関連するこ れらのウィルス抗原決定基の配列により、該ウィルス決定基に特異的な細胞毒性 Ｔ−細胞クローンの増殖が誘発される。更に、該発現性のトランスフェクション された細胞により遊離される該構造タンパクも、抗原表示細胞により取り出され て抗体応答を開始し得る。この免疫応答を誘発し得る該遺伝子ワクチン構築体を 、好ましくは加速−粒子による形質転換装置によって該トランスフェクションす べき細胞内に分配する。

幾つかの理由のために、本発明の該遺伝子ワクチン法は、特に免疫不全ウィルス 、例えばヒト免疫不全ウィルス（Ｈｍおよび関連する動物ウィルス、サル免疫不 全ウィルス（ＳＩＶ）およびネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）に対する免疫化の ために有利に利用される。このＨＩＶウィルスに対しては、このウィルスに固有 の変異型への復帰の可能性のために、弱毒化ワクチン法は適さない。これらのウ ィルスに対するウィルスタンパクサブユニットワクチンも開発されつつあるが、 かがるサブユニットワクチンは細胞毒性応答を生じ得す、ＨＩＶ感染またはＨＩ Ｖ−関連疾患の発病を予防する必要があるかもしれない。ここに記載する如き遺 伝子ワクチントランスフェクション法の利用は細胞毒性応答を生ずるであろう。

また、このワクチン法はウィルスの侵入に対する抵抗性を授与する上で役立つと 考えられる粘膜組織への分配を可能とする。即ち、ＨＩＶについては、しばしば 粘膜を介して発症すると考えられているからである。

本発明の免疫化工程においてめている細胞性免疫応答を達成するためには、ワク チン接種した個体のトランスフェクションされた細胞が該ウィルスの主要な抗原 決定基を発現し得るような遺伝子ワクチン構築体を生成する必要がある。これは 、該ウィルスのゲノムによりコードされる種々のタンパクに対するコード領域を 同定し、このようなタンパク各々に対する合成コード配列を生成し、かつかかる コード配列の各々を哺乳動物細胞内で該配列を発現することのできるプロモータ と結合することにより可能となる。あるいは、該ウィルスゲノム自体を使用する こともできる。レトロウィルスに対しては、プロウィルスクローンが長末端反復 およびプライマー結合サイト等の、感染過程においてウィルスの複製に必要な配 列をそこから除去するように変更されている限り、該ウィルスゲノムのＤＮＡ型 、即ち該プロウィルスから該コード配列を作成することができる。このようなプ ロウィルスは、先天的にトランスフェクションされた細胞内で該ウィルス構造タ ンパクの全てを発現するのに必要なｌｌＲＮＡプロセッシング配列をもつであろ う。

ウィルスの遺伝物質を変更して、初めからその発病過程を阻止しなければならな い。該ウィルスを変更する方法はウィルス毎に異なるであろう。該免疫不全ウィ ルスはその遺伝物質をＲＮＡとして担持するレトロウィルスである。その正常な 感染過程中、該ＲＮＡは逆転写酵素と呼ばれる酵素により処理される。この酵素 は該ウィルスのＲ１１ｉＡ配列をプロウィルスとして公知のＤＮＡ形状に転化す る。ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｆｆ）のプロウィルスは１ダース程の読み取り枠 を含み、その全てがその感染過程中に翻訳されてタンパクを生成する。該タンパ クの幾つかは構造タンパクであり、他のタンパクは該感染過程における諸段階の 調節タンパクである。感染が生じた場合、該プロウィルスにより生成されたタン パクの全てが実際には単一のｍＲＮＡプリカーサにより生成され、該プリカーサ は分化にょリスプライスされて、別々にスプライスされた種々のＲＮＡ生成物を 形成し、該ＲＮＡ生成物は該ウィルスにより発現される様々なタンパクに翻訳さ れる。有利には、本発明の免疫化工程で利用する該トランスフェクションされた 細胞が出来る限り多くのウィルス構造タンパクを発現することが有用であろう。

従って、ワクチン接種した個体内でウィルスの複製工程を開始しないように、該 プロウィルスから該複製を防止するのに十分な部分を除去することのみを仮定し て、この遺伝子ワクチンで使用する該遺伝子ワクチンコード配列として、出来る だけ多くのプロウィルスを使用することが望ましい。

ＨＩｆまたはＳＩＶウィルスに関するこの目的を達成するための有利な方法は、 該感染性ウィルスが長末端反復（ＬＴＲ）エレメントとして知られ、該天然のプ ロウィルス配列の末端に位置する該ウィルスゲノムの複製に必要とされる重要な 遺伝子エレメントと、該プライマー結合サイトとを有するという事実に基く。該 プライマー結合サイトは、ｔＲＮＡが該ウィルスＲＮ＾を認識し、かつこれと結 合して該逆転写過程の開始用のプライマーとして機能する該ウィルス泥上のサイ トである。

該ＬＴＲエレメントおよび該プライマー結合サイト両者は逆転写を生ずるのに必 要である。該ＬＴＲエレメントおよび該プライマー結合サイトの何れかの除去は ウィルスの複製を妨害するであろう。該ＤＮＡプロウィルスからの該ＬＴＲエレ メントおよび該プライマー結合サイト両者の除去は、かくして生成された遺伝子 配列がウィルスの複製を生じずもしくは病原性のウィルス粒子をコードしないこ とを保証する。

かくして、有利な遺伝子ワクチンの生成および出来る限り多くのウィルスタンパ クを正確に形成して、自然の感染を有効に模倣することを保証するという２つの 理由から、構造並びに調節タンパクに対する完全なウィルスコード領域の使用が 本発明にとって好ましい。しかしながら、幾つかの例においては、ウィルスタン パクの全組み合わせを生成することなく、僅かに１種のまたは数種のウィルスタ ンパクを発現することが望ましく、かつ十分であり得る。これは、標準的な組み 換え技術を利用して、望ましい各ウィルスタンパクに対する個々の発現ベクター を組み立てることにより達成できる。

トランスフェクションした細胞内で該ウィルス遺伝子配列を適当に発現するため には、該標的細胞内で機能可能なプロモータ配列が必要である。数種のかかるプ ロモータが哺乳動物系について知られており、鎖糸は発現すべきタンパクに対す るコード配列の５゛、または上流に結合していてもよい。下流側の翻訳ターミネ ータまたはポリアデニル化配列も、該タンパクコード配列の３゛に付加すること ができる。

遺伝子ワクチンとして有効であるためには、免疫化すべき個体の細胞内に該ウィ ルスタンパクをコードする遺伝子配列を分配する方法が必要となる。免疫不全ウ ィルス疾患に罹患した哺乳動物の体細胞に遺伝子を分配することを可能とする技 術が幾つか知られている。公知の技術は直接的ＤＮＡ注入、遺伝子配列を体細胞 内に分配するためのレトロウィルスベクターの利用、または感染され易い個体の １種以上の細胞型内にカプセル化されたＤＮＡの放出を可能とするリポソームま たは他のカプセル化剤中にカプセル化したＤＮＡの分配等を包含する。しかし、 本発明においては該ＤＮＡが加速粒子の遺伝子転移デバイスにより該感染性の個 体に転移させることが好ましい。該加速−粒子の遺伝子放出技術は、細胞内に放 出すべき極めて小さな担体粒子上に遺伝子構築体を被覆することに基くものであ り、該担体粒子はこの方法により形質転換しようとする該細胞に比して小さいよ うに設計される。次いで、この被覆された担体粒子が該形質転換すべき細胞、即 ち標的細胞内に止まるように、該粒子を該細胞に向けて物理的に加速する。この 技術はインビボまたはインビトロの何れにおいても利用できる。幾分かの頻度で 、該担体粒子上に予め被覆した該ＤＮＡが該標的細胞内で発現される。この遺伝 子発現法は原核生物および真核生物両者のバクテリアおよび酵母から高等植物お よび動物に渡る範囲内で巧く機能することが証明されている。かくして、該加速 粒子法はンビボで細胞に遺伝子を分配することを可能とする。

加速粒子による遺伝子形質転換技術の遺伝子操作法はサンフォード（Ｓａｎｆｏ ｒｄ）の米国特許第４．９４５．０５０号に記載されている。この方法の改良法 に基く装置は、バイオラドラボラトリーズ（Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ）社から市販品として入手できる。加速粒子による形質転換装置に係わる もう一つの方法は米国特許第５、０１５．５８０号に開示されており、該方法は 大豆株の形質転換に関連するが、これは哺乳動物細胞および完全な全哺乳動物に 対して使用する際にも同様に適している装置を開示している。

裸のＤＮＡを含有する水性液滴（内部に該ウィルスの遺伝的ワクチンを含む）を 適当な加速技術により免疫化しようとする個体の組織内に放出し得ることも特別 に意図されている。幾分かの頻度で、このような「裸の（ｎａｋｅｄ）　Ｊ　Ｄ ＮＡが該処理された組織内に取り込まれるであろう。

ここで使用する用語［トランスフェクションされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ） 　Ｊとは、何れの放出技術を使用しようとも、該分配された外来遺伝子ワクチン 構築体を組み込んだ細胞を意味するものとする。発癌過程における細胞性の変化 を言及する際にも使用される「形質転換」なる用語に固有の曖昧性を回避するた めに、この「形質転換」なる用語よりもむしろ該「トランスフェクション」なる 用語を使用する。

該加速粒子注入デバイスまたは直接的ＤＮＡ注入の何れを使用しても、遺伝子ワ クチンを、非−侵入的様式で、種々の感染性組織型に分配して、該個体内に所定 の抗原的応答を達成することができる。最も有利には、該遺伝子ワクチンは表皮 に導入できる。見出されたこのような分配法は、全身的な体液性免疫応答を形成 し、かつ同様に細胞毒性応答をも刺激するであろう。この技術にから付随的な有 効性を得るために、該遺伝子を粘膜組織表面に分配して、粘膜性並びに全身的抗 原性応答の該免疫化した個体内での発現を保証することも可能である。表皮、末 梢血液細胞、即ちリンパ球（これらはインビトロで処理し、該個体に戻すことが できる）、並びに種々の口内、上部呼吸器および生殖器粘膜表面上の任意の数の サイトを含む利用可能な種々の適当な放出サイトが存在すると考えられている。

加速粒子トランスフエフシコン法により細胞内にトランスフェクションされるべ き免疫不全ウィルスワクチン発現ベクターの妥当性はインビトロで哺乳動物細胞 内でのウィルス性抗原産生をアッセイすることにより評価できる。培地中に維持 できる型の細胞、例えばサルのＣＯ５細胞の感染性の哺乳動物細胞は多数の細胞 トランスフェクション技術、例えば燐酸カルシウム媒介トランスフェクション並 びに加速粒子によるトランスフェクション等のいずれかにより、インビトロでト ランスフェクションすることが可能である。一旦該遺伝子ワクチン発現ベクター を該感染性の細胞中に導入したら、該ウィルス抗原の発現をかかる細胞の培養物 の中位の上澄につき、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンプロット法、または逆転写酵素 アッセイ等を包含する種々の技術により監視することができる。

与えられた発現ベクターがインビトロで培養された細胞内に適当なウィルスタン パク産生を誘発するかを確認した後、かかるベクターがマウス等の小動物モデル 内で同様にタンパク産生を誘発する機能をもつことを証明することができる。

かかる遺伝子ワクチンに応答する、マウス中の抗体および細胞毒性の細胞性免疫 応答の測定はこの概念の重要な証拠であり、また適当な動物刺激モデルでのより 厳密なテストの開始を正当化するであろう。

一旦、該遺伝子ワクチンが小実験動物内でウイルスタンノくり産生および免疫応 答を誘発し得ることを立証した後には、ヒト免疫不全症に対する動物モデルにお ける有意の免疫応答を達成するのに適した投与量およびタイミングを決定するこ とが必要となる。これはＳＩｖおよびＲｈマカツク属のサルモデル（ｒｈｅｓｕ ｓ　ｍｃａｑｕｅｌｌｏｄｅｌ）を利用して最も効果的に行うことができる。動 物には、その種々の組織サイトにおいて、加速粒子トランスフェクション法によ り数種のドーズで該発現構築体を与えた。これらの処理された組織サイトは表皮 、真皮（該表皮を介して）、口腔および上部呼吸器粘膜並びに末梢血液細胞を包 含するが、これらに制限されない。種々の誘発技術を利用でき、遺伝子ワクチン の投与回数およびそのタイミングを系統的に変化させて、任意の得られる免疫原 性応答を最適化し、かつ何れの投与量が最大の応答を与えるかを決定する。処理 した個体内の抗体応答は特異的なウィルス抗原に対する抗体を認識する任意の公 知技術により、例えば標準的ウェスタンプロット法およびＨＬＩＳＡ法を利用し て検出できる。免疫生物学における当業者には公知の標準的方法を利用して、細 胞媒介性細胞毒性応答を検出することも可能である。具体的には、膵臓または末 梢血液中における細胞毒性Ｔ−細胞の存在は、溶菌活性の存在により示され、該 溶菌活性の存在は組織適合性標的細胞を識別し、該標的細胞はそれ自体該免疫不 全ウィルス由来のウィルス抗原を発現している。

ヒト免疫不全疾患用の遺伝子ワクチンの放出に最適の組織サイトおよび投与回数 並びに投与のタイミングは動物モデルにおいておよび後の臨床的研究において経 験的に決定する必要があるが、かかるワクチンを実際のヒトの健康整復において 使用できる正確な方法をこの時点で予測することは困難である。このようなワク チンは生の弱毒化ワクチンまたは組み換えウィルスワクチンの作用を、発病の危 険性なしに模倣することにあるので、かかるワクチンがナイーブ（ｎａｉｖｅ） な個体に防禦免疫性を誘発する際に有用であるばかりか、ＨＩＶ−感染した、免 疫性の低下した個体において使用して、該疾患の進行を阻止または防止するよう にその免疫状態を人工的に刺激する目的にとっても有用であると考えられる。単 一のワクチン投与法の何れも、健康な個体内に防禦性を確立し、もしくは感染し た患者の疾患の進行を阻止するのに必要とされる種々の免疫応答を誘発すること ができないと考えることも重要である。寧ろ、種々の方法の組み合わせがこれら の最終目的を達成する際の真の協働作用を明らかにする可能性がある。かくして 、真の感染を模倣した遺伝子ワクチンおよび死菌またはサブユニットワクチンと を組み込んだ組み合わせワクチン療法が、効果的に細胞毒性免疫性および免疫記 憶並びに高濃度での防禦性抗体産生を達成するための魅力ある方法であると考え られる。

遺伝子ワクチンは生ワクチンの使用に代わる安全な代替法として機能し、かつ種 々の免疫化プロトコールおよび所定の結果を達成するために他のワクチンとの組 み合わせで使用できる。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）の遺伝 子配列は完全に決定され、公表されており、一般的に入手可能である。例えば、 ＬＡＶ−１／ＢＲＵと命名された該旧Ｖ株のＤＮＡ配列は承認番号ＫＯ２０１３ の下でゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に寄託されており、以下に言及するそのヌ クレオチド位置はその配列からとったものである。ＨＩＶおよびＳＩＶ両者の試 料はヘルスリサーチファシリティーズ（ｈｅａｌｔｈ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｆａ ｃｉｌｉｔｉｅｓ）の適当な寄託機関を通して資格のある研究者にとって容易に 入手できる。

このＨＩｖ遺伝子ワクチン発現ベクターを、Ｈｆｆ株ＬＡＹ−１／ＢＲＵのプロ ウィルスゲノム由来の８２６６塩基対フラグメントを含むように構築した。この フラグメントはヌクレオチド位置６７８のＳａｃ　ｌサイトから開始し、かつヌ クレオチドＮｏ、　８９４４のＸｈｏ　ｌサイトで終止するＨＩＶ　ＤＮＡプロ ウィルス配列部分であった（ここで使用するヌクレオチドの番号付けに関する約 束では、ヌクレオチドＮ０８１が５’　ＬＴＲのＵ３領域の第一ヌクレオチドに 対応するものと仮定している）。）ＩＩＶゲノムのここに示したフラグメントは 、ｎｅｆタンパクのカルボキシ末端をコードする部分を除く該ウィルスの読み取 り枠の全てを含む。このフラグメントが一旦転写されると、該ＨＩＶウィルスに より開始される発病過程中に感染細胞内で作用するＲＮＡスプライシング経路を 実行するのに必要とされるスプライシングドナーおよびアクセプタの全てを含有 するｍＲＮＡを生ずる。

このコード配列フラグメントは哺乳動物細胞内で発現可能なプロモータと結合し て、感染性の細胞内で該ウィルス抗原タンパクを発現するものでなければならな い。一旦ブロモータと結合すると、このコード配列フラグメントは該ウィルスか らの主読み取り枠（ｇａｇ、　ｐｏｌおよびｅｎｖを含む）を発現し、元のリポ ソーム枠転位（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｆｒａｍｅ　ｓｈｉｆｔｉｎｇ）およびｍ ＲＮＡプロセッシング経路を、該ウィルス自体が利用しているのと同様な様式で 利用する。しかしながら、このフラグメントはウィルスゲノムの複製に必要な幾 つかのウィルス遺伝子エレメント（具体的には、長末端反復（ＬＴＲ）エレメン トおよびプライマー結合サイトを含む）を含むべきではない。従って、このフラ グメントは逆転写不能であり、かくしてあらゆる潜在的な発病過程のこの遺伝子 配列による発生を阻害する。

該ＨＩＶ抗原をコードする該コード配列と哺乳動物内で発現可能なプロモータと を結合するために、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）の即時型プロモータ を使用した。発現カセットを構築し、これをｐＷＲＧ１６０２と命名した。これ は第１図のプラスミドマツプに示されている。このプラスミドｐＷＲＧ１６０２ は６６０塩基対のＥｃｏ　Ｒ１およびＢｕ＋Ｈ１制限フラグメントを生じ、これ は該１（ＣＭＶ即時型プロモータを含む６１９塩基対領域の末端に付加された数 個の合成制限サイトを含む。

使用した転写終止セグメントはＳＶ４０ウィルス由来のポリアデニル化配列であ った。このＳＶ４０ウィルス由来のポリアデニル化配列は、前にベテスダリサー チラブズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ；カタログ番号５３ ６９ＳＳ）から市販品として入手したプラスミドｐｓｖ２ｄｈｆｒ由来の約８０ ０塩基対のフラグメント（Ｂｇｌ　ＩＩおよびＢｕ＋Ｈｌ消化により得た）であ る。同一のポリアデニル化フラグメントはサブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　） 等、　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１９８１．１．　ｐｐ、　８５４− ８６４にも記載されている。

このフラグメントは、また該Ｂｇｌ　ＩＩ末端近傍に小さなＳＶ４０介在配列を 含み、該ＳＶ４０ポリアデニル化領域は該フラグメントのＢａｍＨＩ末端に向か って配置されている。

ｐｃＨＩＶｐＡＬと命名したＨＩＶ遺伝子ワクチン発現プラスミドを以下のよう に構築した。該ｐｓｖ２ｄｈｆｒ由来の８００塩基対のＳＶ４０フラグメントを フレノウのＤＮＡポリメラーゼで処理して、その張出し末端（ｏｖｅｒｈａｎｇ ｉｎｇ　ｔｅｒｍｉｎｉ）を［閉じた（ｆｉｌｌ　１ｎ）Ｊｏこれと平行して、 一定量のブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｍ１３＋ＳＫ　ＤＮＡ　（ 承認番号Ｘ５２３２５、位置６６８にＸｈｏ　ｌサイトをもつ）をＸｈｏ　Ｉで 開裂し、かつ同様にフレノウのＤＮＡポリメラーゼで処理した。２個のフラグメ ントを連結してｐＢｓｐＡＬと命名されたプラスミドを得た。該ブルースクリプ トベクター中の該ＳＶ４０フラグメントの配向は、該ＢａｍＨＩ末端またはポリ アデニル化サイトを含む該末端が該プラスミドに含まれるポリリンカ一本体を向 くようなものであった。

次いで、種々の量の該プラスミドｐＢＳｐＡＬを制限酵素Ｓａｃ　ＩおよびＳａ ｌ　Ｉで消化して、Ｘｈｏ　ＩおよびＳａｃ　Ｉ消化により生成したフラグメン トに連結するのに適した末端をもつプラスミドを形成した。このプラスミドに、 該ＨＩＶプロウィルス由来の８２６６塩基対のフラグメントを連結して、ｐＨＩ ＶｐＡＬと命名されたプラスミドを得た。このプラスミドは該ＳＶ４０のポリア デニル化シグナルに続＜ＨＩＶ抗原決定基コード領域を含む。

次いで、このプラスミドｐＨＩＶｐＡＬを制限酵素Ｓａｃ　Ｉで開裂し、その３ ゛張出し末端をフレノウのＤＮＡポリメラーゼを使用して除去した。かくして形 成された開裂部に、該ＨＣＭＶプロモータ（その末端はフレノウのＤＮＡポリメ ラーゼで占められている）を含む該６６０塩基対フラグメントを挿入した。

得られたプラスミドは第２図に示され、５′末端から３′末端に向かって配向し た該ＨＣＭＶ即時型プロモータ、）ＩＩＶウィルス上の重要な全ての読み取り枠 をコードする該ＨＩＶゲノムからの８２６６塩基対のフラグメント、および該Ｓ Ｖ４０ポリアデニル化フラグメントを含む。この構築体を本発明の方法で用いる 遺伝子ワクチン構築体として使用した。　該ＳＩＶ発現ベクターを該ＨＩＶ発現 ベクターと同様な方法で構築した。但し、該ＨＩＶ遺伝子配列の代わりに、ヌク レオチド位置８２３におけるＮａｒ　ｌサイトから開始し、ヌクレオチド位置９ ２２６におけるＳａｃ　ｌサイトで終止するＳＩＶｍａｃ２３９（承認番号Ｍ３ ３２６２としてゲンバンクに寄託されている）のプロウィルスゲノムからの８４ ０４塩基対フラグメント（ヌクレオチドの番号付けに係わる約束は該ＨＩＶの場 合と同様である）を使用した。このＳＩＶゲノム発現フラグメントを上記のプラ スミドｐＣＨＩＶｐＡＬのＨＩＶゲノムフラグメントに変えることができる。

２、培養中の細胞への遺伝子ワクチンの組み込み哺乳動物細胞内で適当な抗原タ ンパクを発現する該遺伝子構築体の能力を確認ドのＤＮＡのコピーを、培養中の 細胞内にトランスフェクションする前に、全担体粒子上に被覆した。この被覆は ｌｏｍｇの沈殿させた金粉末（平均径１．５μ）と、５０μｌのＯ，１Ｍスペル ミジンおよび該プラスミドｐＣ）ＩＩＶｐＡＬのＤＮＡ　２５μｇとを混合する ことにより実施した。この混合物を室温にて１０分間インキュベートした。次に 、連続的に攪拌しつつ５０μｌの２．５ＭＣａＣｌ　！を該混合物に添加し、そ の後該試料を更に３分間室温にてインキュベートして、該金粒子上に該ＤＮＡを 堆積させた。この混合物をマイクロ遠心機で３０秒間遠心処理して、該ＤＮＡを 担持した該担体粒子を濃縮し、その後膣担体粒子をエタノールで穏やかに洗浄し 、ガラス栓を備えたバイアル中のエタノール１０ｍｌ中に再懸濁した。このエタ ノール中の該担体粒子の再懸濁液を超音波印加した水浴に数秒間浸漬することに より十分に分散させた。

次いで、このＤＮＡ−被覆担体粒子を３５ｍ平方のマイラーシート上に各マイラ ーシート当たりＤＮＡ−被覆全担体粒子１７０μｌの割合で層状（各側に１．７ ｃ＋ｎ）に展開した。

これは該担体粒子のエタノール懸濁液を該担体シート上に適用し、次いで該エタ ノールを蒸発させることにより実施した。次に、各マイラーシート上の該ＤＮＡ −被覆金被覆粒担体粒子国特許第５．０１５．５８０号に記載された型の加速粒 子形質転換装置内に配置した。この装置は該担体（ＩＮＡによりトランスフェク ションすべき標的細胞に向けて該担体粒子を加速するために調節可能な火花放電 を使用する。

一方で、サルのＣＯ３−７細胞の培養物を３．５ｃｍの培養皿内で調製した。こ のＣＯ８細胞から培地を一時的に除去し、該培養皿を転倒させて、この加速粒子 トランスフェクション法用の標的表面として使用した。８ｋＶの火花放電を、上 記米国特許第５．０１５．５８０号により詳細に記載されている方法で使用した 。該細胞中に該粒子を注入した後、２ｍｌの新たな培地を該培養皿に添加し、該 細胞が継続的に生存し易いようにした。

この加速粒子導入の２４時間後に、３５個の該細胞の培養皿から培地を収穫し、 濃縮して高分子量ＨＩＶ抗原の存在についてテストした。該培地を高速遠心機で 濃縮した。その濃縮されなかった培地０．５ｍｌを、市販のＥＬＩＳＡキットを 使用して後に実施するＨＩＶｐ２４含量の測定のために取っておいた。新鮮な育 成培地を該プレートに添加して、）ＩＩＶ抗原産生の連続的な監視を行った。こ の収穫した培地を先ず標準的な研究室用の遠心機内で１５０ＯＲＰＭにて遠心処 理し、次いで０．４５μの膜を通して濾過することにより、該培地中の細胞デブ リスを除去した。この清浄化された濾液を、６個の超遠心管（ベックマン（Ｂｅ ｃｋｍｎ）　！Ｖ４１０−ター）の各々中の、２０！％　（７）グリセリン、１ ００ｍＭ　（７）ＫＣＩ　、５０＃ｌ　トリス（Ｔｒｉｓ）−１（ＣＩ（ｐＨ７ ，８）を含む１ｍｌの緩衝層上に穏やかに層状に展開した。これら試料を４℃に て、７０分間３５．０００ＲＰＭで遠心処理した。この遠心処理後、該培地を捨 て、生成したベレットを全体テ２０ｕ　ｌ　（７）０．１５１１　（７）ＮａＣ １，５噛のトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）およびｌ　ＩＩＩＩＩ（ ７）ＥＤsＡを 含む溶液中に再懸濁した。

この濃縮した試料を、予備−注型した１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））による電気泳動処理に付した。このゲルをブッ フラー（Ｂｕｃｈｌｅｒ）半一乾燥ブ０−／ター（モデルＮｏ、　４３３−２９ ０のを使用して、製造業者等の指示に従ってニトロセルロースシート上でエレク トロブロッティング処理した。

次に、該ニトロセルロースシート上に固定化された該ＨＩＶウィルス抗原を検出 するアッセイを実施した。該ＨＩＶ抗原ｐ２４およびｇｐ１２０をバイオ−ラド 社のイムノプロットアッセイキット（カタログＮｏ、　１７０−６４５１）を使 用して検出した。このイムノプロットアッセイキットを使用するためには、検出 されると考えられる抗原に特異的な抗体が必要である。該ＨＩＶ特異的アッセイ に対して、市販品として入手可能な以下のモノクローナル抗体を使用した。ｇｐ １２０に対しては、アメリカンバイオ−チクノロシーズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂ ｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社から入手したモノクローナル抗体１１ｏ、 　１００１およびデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）社から入手したモノクローナル抗体 ＮＥＡ　９３０５を使用した。該抗原ｐ２４に対しては、アメリカンバイオ−チ クノロシーズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社から 入手したモノクローナル抗体Ｎｏ、　４００１およびデュポン（ＤｕＰｏｎｔ） 社から入手したモノクローナル抗体ＮＥＡ　９２８３を使用した。

このイムノプロットアッセイは製造業者等の指示に従って実施したが、ゼラチン を必要とする全ての溶液におけるゼラチンの代わりにカーネーシ目ン（Ｃａｒｎ ａｔ　１ｏｎ）脱脂乾燥乳を使用した。現像したイムノプロットアッセイは、該 処理したＣＯ３細胞由来の試料中で生産された該ｐ２４およびｇｐｔ２ｏ両者に 対応するバンドを示した。負のコントロールはかがるバンドを全く示さず、かつ 抗原タンパク自体からなる正のコントロールは該処理した細胞由来の試料から得 たものと同様なバンドを形成した。このことは該ＣＯ３細胞中のプラスミドｐＣ ＨＩＶｐＡＬの活性および発現を実証しており、また該抗原の分子量型が該ウィ ルスに対して正常な宿主中で形成されたものと類似することを実証した。未処理 ｃｏｓ細胞由来の平行して調製操作された試料は反応性の証拠を何等示さなかっ た。該ＣＯ８細胞由来の該ｇｐ１２０バンドと該正のコントロール中の該ｇｐ１ ２０バンドとの間には移動度における僅かな差異があり、これはグリコジル化に おける差異によるものと考えられている。

サルのＣＯ５細胞内での１（ＩＶ決定基の産生を更に立証するために、処理した 細胞からの成育培地をコールタ−（Ｃｏｕｌ　ｔｅｒ）Ｈｆｆｐ２４抗原アッセ イキット（カタログＭ。

６６０３６９Ｂ）を使用して分析した。遺伝子注入後の第一の２４時時間位の３ つの期間中に採取した成育培地の試料を９２４抗原含量につきアッセイしたとこ ろ、それぞれ１ｍｌ当たり４２．３０および１２μｇの該ｐ２４抗原を含んでい ることを示した。これらの値は各２４時間の期間内に該培地中に遊離されたｐ２ ４抗原の量を反映している。というのは、該細胞に対する該成育培地は処理後毎 日完全に交換されたからである。

平行して検討された未処理ＣＯ３細胞から採取した試料は反応性を示さなかった 。

３、　健全なマウスの皮膚におけるウィルス抗原の検出次いで、加速粒子トラン スフェクションプロトコールを利用して、該プラスミドｐｃＨＩＶｐＡＬを健全 なマウス本体の皮膚に注入した。加速粒子が遺伝子を健全な動物の表皮または皮 膚層に注入するのに利用でき、また該遺伝子が一旦注入されると発現可能である ことは既に立証されている。該プラスミドｐＣＨ［ＶｐＡＬのコピーを前記の例 に記載の如くして全担体粒子上に被覆した。但し、該プラスミド５層ｇを全担体 粒子１ｗ＋ｇにつき使用し、かつ該処方物をエタノール１ｍｌ当たり５■の担体 粒子なる濃度でエタノールに懸濁させた。この懸濁液１６３μｌを２つの担体シ ート各々の上に載せ、健全なマウスへの粒子加速プロトコールで使用した。更に ２種の全担体粒子の懸濁液をコントロールとして調製した。第一のコントロール 処方物ではヒト成長ホルモン遺伝子を含むプラスミドを使用し、また第二のコン トロールは全担体粒子上に何等ＤＮＡを担持させずに調製した。６匹のＢａ１ｂ ／Ｃマウスをｌ０＝２のケタミノ／ロンビン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ／ＲｏＩＩｐｉ ｎ）混合物５０μｌで麻酔し、該マウスの腹部の体毛をハサミで除去した。上置 を脱毛クリーム（ナイール（Ｎａｉｒ））で除去した。この麻酔したマウスを、 スペーサとしてのプラスチックベトリ皿を使用し、公開されたＰＣＴ出願Ｎｏ、 　１１’０９１／１９７８１に記載された方法を利用して、粒子放出チャンバー 上に維持したスクリーンの上方１５ｍ＋の位置に懸垂させた。該ベトリ皿の底部 に正方形の孔を形成して、該加速担体粒子を該麻酔したマウスの腹部皮膚層に侵 入させた。６匹のマウスを各２匹からなる３群に分けた。この３群の各マウスは １回の担体粒子による「衝撃（ｂｌａｓｔ）　Ｊを受けた。該担体粒子は２５ｋ Ｖでの放電を使用して加速された。これら３群の各々のマウスは、それぞれ該ｐ ｃＨＩＶｐＡＬ、成長ホルモンプラスミド、またはＤＮＡを含まない全担体粒子 を発現する処理に付された。この処理の３日後に、該標的皮膚領域を該処理マウ ス並びに粒子−媒介トランスフェクションプロトコールに付されていない２種の コントロールマウス群から切除した。これらの組織試料を解剖用の鉗子で、０． ５％のトライ］・ン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ）Ｘ−１００を含む燐酸緩衝塩水６００μ ｌ中で細かく裁断した。次いで、この組織懸濁液を５分間５．　ＯＯＯＲＰＭに て遠心処理し、生成する上澄を集めた。この上澄試料を１０倍に希釈し、コール タ−ＨＩＶ　ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡキット（カタログＮｏ。

６６０３６９８）を使用して、製造業者等の指示に従って、ＨＩＭ　ｐ２４抗原 の含有率について分析した。第３図に、このプロトコールの結果を示した。該１ ）ＣＨＴＶｐＡＬで処理したマウスから採取した組織試料は、コントロール試料 の３−倍を越える反応性を示した。このことは、該処理組織が、該遺伝子注入プ ロトコールの結果としてＨＩＶ　！１２４抗原を合成したことを示す。バックグ ラウンドを差し引いた後、反応性のこのレベルは、該ＥＬＩＳＡキットの正のコ ントロール試薬について得られた標準カーブと比較して、該細かく裁断した組織 からＨＩＶ　ｐ２４抗原０．６μｇが遊離されたことと一致する。

４、　ワクチン接種したマウス内でのＨＩＶ　ｐ２４特異的血清抗体の検出マウ スの表皮細胞への遺伝子注入の結果として発現される、該マウスの外来タンパク に対する系統的な免疫応答を発揮する能力をテストするために、以下の実験を実 施した。プラスミドｐＣＨ［ＶｐＡＬのコピーを作成し、上記実施例１および２ に記載の如く全担体粒子に被覆した。但し、該全担体粒子１■当たり１０８ｇの プラスミドＤＮＡを使用した。コントロールとして、ヒト成長ホルモン遺伝子を 含む異種プラスミドをも、インビボでの遺伝子注入用のプラスミド−被覆全担体 粒子を調製するのに使用した。この例については、ヒト成長ホルモンプラスミド のサイズが小さいために全担体粒子ｌｏｇ当たり５．０μｇのＤＮＡを使用して 、インビボで該細胞に注入される該プラスミドのコピー数をほぼ同一とした。

１０匹の雄Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（５〜７週令）をそれぞれ４匹、３匹および３匹 からなる３つの群に分けた。初回免疫化処理の第一工程は群ｌの４匹のマウスに 対して実施し、ここで各動物は該成長ホルモンプラスミドのみて被覆された加速 粒子による単一の処理に付された。この加速は上記実施例３に記載の方法によっ て、２５ｋＶにて実施した。群２のマウスの各々は該プラスミドｐｃＨｆｆｐＡ Ｌで被覆した全担体粒子により単一の処理に付された。群３のマウス各々はｐｃ ＨＩＶｐＡＬで被覆した加速粒子による３回の処理をその腹部に受けた。群３の 場合において、該粒子衝撃領域は相互に重複しないように配置した。該群３匹の 全てに対する粒子衝撃手順は免疫応答を誘発するために４〜７週後に繰り返した 。該最終の処理の８〜１０日経過後に、各マウスから眼窩後部血液試料を採取し 、マイクロチイナー（ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）チューブ内で４℃にて凝固させ た。５０００　ＲＰＭにて遠心処理した後、その血清を集めた。

次いで、酵素イムノアッセイにより該マウス血清中のＨＩＶ　ｐ２４−特異的抗 体を検出するアッセイを実施した。このアッセイは０．４μｇのＩ（ＩＶ　ｐ２ ４抗原（アメリカンバイオ−チクノロシーズ社（Ａｍｅｒｉｃａｌ　Ｂｉｏ−Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、））を、５ｏＩｉｌのドゥルベコズ燐酸緩衝 塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中で、４℃にて一夜インキユベートすることにより、９６ウ エルをもつマイクロタイタープレートの各ウェルに吸着させることによって実施 した。該抗原の吸着後、残留するタンパク結合サイトを２％カーネーション（Ｃ ａｒｎａｔｉｏｎ）脱脂乾燥乳含有Ｄ−ＰＢＳ（ウェル当たり２００μｌ）を添 加し、２時間維持することにより隠蔽した。次いで、該ウェルを３回３００μｌ の０．０２５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含むＤ−ＰＢＳで洗浄した。

各々５μｌの該血清試料をＤ−ＰＢＳ（４５μｌ）で１：１０に希釈し、単一の ウェルに添加し、次いで室温にて１時間インキュベートした。上記の如くツイー ン（Ｔｗｅｅｎ）−２０含有Ｄ−ＰＢＳで洗浄した後、結合したマウス抗体の存 在を、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０含有Ｄ−ＰＢＳ（ウェル当たり５０μりで １：１５００に希釈した山羊−抗−マウスアルカリホスファターゼ複合第二抗体 （パイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；カタｏｆｌｏ、　１７２−１０１５）を使用 して検出した。室温にて３０分間インキュベートした後、該ウェルを再度洗浄し 、該複合抗体をパイオーラドアルカリホスファターゼ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ；カタロ’ｆＮｏ、　１７２−１０６３）を使用して、その製造業者の指示に 従って検出した。このＥＬＩＳＡプレートを４０５　ｎｕフィル夕を使用してマ イクロプレートリーダー上で解析した。

このアッセイの結果を第４図に示した。該ｐｃＨＩＶｐＡＬ被覆金粒子の衝撃を １回受けた群のマウスの１匹および同一の粒子の衝撃を３回受けた群の２匹のマ ウスは有意の９２４−特異的抗体応答（バックグラウンドの５〜１０倍）を示し た。該コントロール動物から採取した血清全ては典型的なバックグラウンドＥＬ ＩＳＡ反応性を示した。この実験は、インビボでの健全な動物の表皮細胞内への 、抗原−コード性遺伝子を被覆した担体粒子の注入に伴って、抗原−特異的抗体 応答が誘発される可能性を立証している。

かくして、大量の該ウィルスの抗原性タンパクまたは該ウィルス自体を該患者に 注入するのではなく、寧ろ該治療すべき患者に、ワクチン接種された個体中の発 明の方法はワクチン接種された個体中に血清抗体応答を誘発することができ、そ の際に生ウィルスの任意の部分または個体内で該ウィルスを複製し得る遺伝物質 の任意の部分を該個体に導入する必要はない。

Ｂａ１ｂ／Ｃマウｘ Ｂａ１ｂ／Ｃマウス

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．疾病を起こすウイルスに対する動物の予防接種法であって、該方法が以下の 諸工程： （ａ）該動物の細胞内で機能性のプロモータおよび該ウイルスにより生成される 決定基をコードするタンパクコード領域を含む外来遺伝子構築体のコピーを調製 する工程と、 （ｂ）該外来遺伝子構築体のコピーを、該動物の細胞のサイズに比して小さなサ イズの担体粒子上に被覆する工程と、 （ｃ）該被覆担体粒子を、インビボで該動物の細胞内に加速注入する工程、を含 むことを特徴とする上記方法。
2. ２．該担体粒子を平坦な担体シート上に被覆し、かつガス噴射により該担体粒子 を加速して、該粒子を該動物に向けて加速注入する請求の範囲第１項に記載の方 法。
3. ３．該担体粒子を該動物の皮膚に向けて加速注入する請求の範囲第１項記載の方 法。
4. ４．該担体粒子を該動物の粘膜に向けて加速注入する請求の範囲第１項記載の方 法。
5. ５．該担体粒子を該動物の末梢血リンパ球に向けて加速注入する請求の範囲第１ 項記載の方法。
6. ６．該タンパクコード領域が該ウイルスのゲノムによりコードされる該決定基の 全てをコードするのに十分であるが、ウイルスの複製に必須の配列を含まないＤ ＮＡを含む請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．個体内にウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、（ａ）該 個体の細胞内で機能性のプロモータおよび該ウイルス抗原の抗原決定基をコード するタンパクコード領域を含む外来遺伝子構築体のコピーを調製する工程と、但 し該外来遺伝子構築体は該ウイルスの複製に必要な配列を含まず、（ｂ）該外来 遺伝子構築体のコピーを、該個体の細胞のサイズに比して小さなサイズの担体粒 子上に被覆する工程と、 （ｃ）該被覆担体粒子を、インビボで該動物の細胞内に加速注入する工程、を含 むことを特徴とする上記方法。
8. ８．該担体粒子を平坦な担体シート上に被覆し、かつガス噴射により該担体粒子 を加速して、該粒子を該動物に向けて加速注入する請求の範囲第７項に記載の方 法。
9. ９．該担体粒子を該動物の皮膚に向けて加速注入する請求の範囲第７項記載の方 法。
10. １０．該担体粒子を該動物の粘膜に向けて加速注入する請求の範囲第７項記載の 方法。
11. １１．該担体粒子を該動物の末梢血リンパ球に向けて加速注入する請求の範囲第 ７項記載の方法。
12. １２．該タンパクコード領域が該ウイルスのゲノムによりコードされる該決定基 の全てをコードするのに十分なＤＮＡを含む請求の範囲第７項記載の方法。
13. １３．靈長類内に、免疫不全ウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって 、（３）該靈長類の細胞内で機能性のプロモータおよび該ウイルスのゲノムの読 み取り枠の全てを含むタンパクコード領域を含む外来遺伝子構築体のコピーを調 製する工程と、但し該外来遺伝子構築体は逆転写またはウイルスの複製に必要な 領域を含まず、 （ｂ）該外来遺伝子構築体のコピーを、該靈長類の細胞のサイズに比して小さな サイズの担体粒子上に被覆する工程と、（ｃ）該被覆担体粒子を、インビボで該 靈長類の細胞内に加速注入する工程、を含むことを特徴とする上記方法。
14. １４．該担体粒子を平坦な担体シート上に被覆し、かつガス噴射により該担体粒 子を加速して、該粒子を該動物に向けて加速注入する請求の範囲第１３項に記載 の方法。
15. １５．該担体粒子を該動物の皮膚に向けて加速注入する請求の範囲第１３項記載 の方法。
16. １６．該担体粒子を該動物の粘膜に向けて加速注入する請求の範囲第１３項記載 の方法。
17. １７．該担体粒子を該動物の末梢血リンパ球に向けて加速注入する請求の範囲第 １３項記載の方法。
18. １８．該逆転写に必要な領域が長末端反復配列およびプライマー結合サイトであ る請求の範囲第１３項記載の方法。
19. １９．免疫不全ウイルス由来であってかつ該ウイルスからの読み取り枠の全てを 含むが長末端反復配列を含まないＤＮＡ配列の上流側に、ヒトの細胞において有 効なプロモータを含むことを特徴とするＤＮＡ構築体。