AT405607B

AT405607B - Verbesserte vakzine zur immunisierung gegen tbe-virusinfektionen sowie ein verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: AT405607B
Application number: AT0087195A
Authority: AT
Inventors: Franz Xaver Dr Heinz; Steven Dr Allison; Christian Dr Mandl; Christian Dr Kunz
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1995-05-23
Filing date: 1995-05-23
Publication date: 1999-10-25
Also published as: ATA87195A

Description


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   Die Erfindung betrifft eine Vakzine zur Immunisierung gegen   Tick-Borne-Enzephalitis-Virus   (TBE-Virus)Infektionen. 



   Das TBE-Vlrus ist ein wichtiger Krankheitserreger beim Menschen und gehört zur Gattung Flavi-Virus innerhalb der Familie Flaviviridae. Es Ist endemisch in Zentral- und Osteuropa, Skandinavien und Teilen von   As ! en   und stellt in diesen Gebieten ein signifikantes Problem für die öffentliche Gesundheit dar (Kunz, Acta   leldensia   60 (1992), 1-14). 



   Das   Flavi-Vlrus-Vlrion   besteht aus einem   Nukleocapsid, weiches   das Positivstrang-RNA-Genom in Verbindung mit dem viralen Capsid   (C) -Protein enthält.   Das Nukleocapsid ist von einer   Upidhüiie   umgeben, die die Membran-assoziierten Proteine E (50 bis 60 kD) und M (7 bis 8 kD) enthält (Heinz und Roehrig in : van Regenmortel und Neurath (Hrsgb.) "Immunochemistry of Viruses 11. The Basis for Seradiagnosis and Vaccines.   Elsevier Sciences,   Amsterdam (1990), 289-305). 



   Das Haupthüllprotein E spielt eine zentrale   Rolle 10   der Biologie von Flavi-Viren, indem es bedeutende 
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 wurde ein Strukturmodell auf Basis einer Vielzahl von biochemischen und immunologischen Daten vorgeschlagen   (Mandl et al.,   J.   Virol.   63 (1989), 564-571). 



   In der AT 402897 B sind Vakzinen gegen TBE-Infektionen beschrieben, umfassend nicht-infektiöse subvirale Partikel, welche im wesentlichen das Protein E in seiner vollständigen nativen Form und gegebenenfalls das Protein prM/M enthalten, welche Proteine aus dem TBE-Vlrus abgeleitet sind. 



   Bel einem Verfahren zur Herstellung dieser subviralen Partikel wurden in einem ersten Schritt die Kodierungssequenzen für die aus dem TBE-Virus abgeleiteten Proteine prM/M und E in ein   Zellkultursy-   stem eingeführt, worauf dann das Protein E In seiner   vollständidigen,   nativen Form exprimiert wird und 
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 Protein E in nativer Form dem Immunsystem präsentiert werden, so dass eine effiziente Vakzinierung gegen TBEV-Infektion möglich ist. 



   Es wurde nunmehr im Zuge weitergehender Forschungsarbeiten überraschenderweise gefunden, dass die Nukleinsäure, welche die erwähnten Kodierungssequenzen umfasst, als solche zur Immunisierung gegen   TBE-Vlrusinfektionen   verwendet werden kann. 



   Es ist im Stand der Technik bekannt, dass das Einbringen   von"nackter"DNA   in Mäusen eine Immunantwort auslösen kann. Beispielsweise können Mäuse, denen ein Plasmid, enthaltend eine genomseche Kopie des menschlichen Wachstumshormons (hGH) Injiziert wurde, Antikörper gegen menschliches hGH entwickeln (Nature, 356 (1992), 152-154). 



   Weiters sind einige   erfolgreiche"genetische Immunisierungen"durch   nackte DNA beschrieben worden. 



  Bel dieser genetischen Immunisierung wurde DNA, welche für ein oder mehrere Antigene eines Virus kodiert, verabreicht, worauf in vivo die entsprechenden viralen Antigene synthetisiert worden sind, welche separat jedes für sich eine Immunantwort auslösen und damit in weiterer Folge einen Schutz vor Virusinfektionen bewirken kann. Erfolgreiche protektive Immunität In Mäusen durch   Intramuskuläre Injektion   von   Influenza-Vlrus-DNA   wurde m PNAS 91 (1994), Seiten 9519-9523 (Raz et al.) beschrieben.

   Eine ebenfalls erfolgreiche Immunisierung von Ratten und Mäusen gegen das Hepatitis B-Virus   (HBV)-Obedlä-   chenantigen durch intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA, welche für das   HBV-Oberflächenantigen   kodierende Sequenzen enthält, wurde in Vaccine 12 (16), (1994), Seiten 1503-1509 (Davis et al.) beschrieben. Viele Versuche zur Immunisierung mit nackter DNA kodierend für Pathogen-Antigene blieben aber erfolglos. Beispielsweise wurden Versuche zur Immunisierung gegen HIV mittels direktem DNA-Transfer in Körperzellen zwar beschrieben (WO 93/17706), eine erfolgreiche Vakzine konnte bisher mit dieser Methodik jedoch nicht erhalten werden.

   Insbesondere scheint es, dass es für eine erfolgreiche immunisierende Wirkung der reinen   DNA-Vakzine-neben   dem Einbringen der DNA in die Zelle - besonders vorteilhaft ist, dass das die Immunantwort auslösende Antigen m der nativen Form dem Immunsystem präsentiert wird. Die exakte Struktur der nativen Form bzw. die biosynthetischen Vorgänge, die zur Bildung der nativen Form und Struktur erforderlich sind, sind nur für wenige Pathogene gesichert, so dass eine effektive Immuniserung mit nackter Nukleinsäure sich in vielen Fällen äusserst schwierig gestaltet, wenn nicht-aufgrund von mangelnden genauen Kenntnissen der Antigenstruktur - gar unrealisierbar ist mit dem   gegenwärtigen   Wissensstand. 



   Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, dass eine Immunisierung mit einer Nukleinsäuresequenz, welche ausschliesslich für das die wesentliche Immunantwort bei TBE-Infektionen auslösende Protein E kodiert, nicht ausreicht, um eine Immunantwort zu erhalten, die vor einer Erkrankung schützt. 



   Überraschenderweise konnte eine erfolgreiche Immunantwort nur durch Verabreichung von Nukleinsäuresequenzen erhalten werden, welche neben der Kodierungssequenz für das Protein E in seiner   vollständi-   

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   Die erfindungsgemässe Vakzine hat den wesentlichen Vorteil, dass keine Zellkultursysteme zur Herstellung der   subviralen   Partikel eingesetzt werden müssen, sondern dass die Partikel in vivo gebildet werden und so direkt eine Immunantwort auslösen können. 



     Die erfindungsgemässe   Vakzine hat weiterhin im Gegensatz zu Vakzinen, welche auf der Grundlage von Proteinen beruhen, den Vorteil, dass sie eine grosse Stabilität aufweist, insbesondere, wenn die Nukleinsäure eine DNA ist. Damit ist es   möglich,   Vakzinen auch ohne grossen Kühlungsaufwand für sehr lange Zelt zu lagern, wobei durch diese Lagerung keine wesentlichen Aktivitätsverluste zu erwarten sind. Insbesondere in Iyophilisierter Form kann die Nukleinsäure für eine praktisch unbegrenzte Zeitdauer unbeschadet sogar bei Raumtemperatur gelagert werden.

   Auch die Rekonstitution einer   Iyophilisierten erfindungsgemässen   Vakzine kann viel einfacher erfolgen als die Rekonstitution einer)   yophilisierten Proteinlösung, welche erfahrungsge-   mäss oft auf Grund der Natur des Proteins Probleme aufwerfen kann. 



   Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemässen Vakzine   ist, dass im   Gegensatz zu konventionellen Totimpfstoffsystemen, das immunisierende Antigen In vivo synthetisiert wird und zur Ausbildung einer effizienten zellulären Immunantwort führt (Sclence, Vol. 259,19. März 1993, S. 1691-1692, Research News : Naked DNA Points Way to Vaccines). 



   Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Nukleinsäuresequenzen, insbesondere Nukleinsäurevektoren, umfassend die gesamte Kodierungssequenz der vom TBE-Virus abgeleiteten Proteine E und prM/M als Arzneimittel. Bisher konnte Im Stand der Technik noch über keine einzige erfolgreiche Nuklein-   säureimmunisierung   mit Flavi-Vlrus-DNA benchtet werden. Die medizinische Verwendung dieser Nukleinsäure (-vektoren) stellt daher eine überraschende neue Verwendungsmöglichkeit dar. Unter Vektor wird   erfindungsgemäss   jegliches   Nukleinsäurevehikel   verstanden, also insbesondere Plasmide, Viren oder Transposons. 



   Bisher wurde lediglich ein von SV40 abgeleiteter Plasmidvektor, welcher die Proteinsequenz der von TBE-Virus abgeleiteten Proteine prM/M und E enthält, beschrieben (Allison et al., Virus-Genes 8 (3), (1994), Seiten 187-198). Für diese   SV40-Plasmlde   wurde jedoch die Möglichkeit einer Immunisierungswirkung nicht diskutiert. 



   Die erfindungsgemässen Plasmidvektoren unterscheiden sich vor allem von den bisher beschriebenen Plasmidvektoren durch ihre Eignung zur Immunisierung. Daher liegen die   erfindungsgemässen   Plasmidvektoren insbesondere als verabrelchungsfertige Lösungen oder Lyophilisat in einer zur Verabreichung geeigneten Spntze bzw. Ampulle vor. 



   Bel Plasmidvektoren haben sich erfindungsgemäss Promotoren als wirksam herausgestellt, welche aus der Gruppe CMV-, HSV-, RSV-, EBV-, ss-Actin-, Adeno-, MMTV-, hsp-und hGH-Promotor ausgewählt sind, wobei sich insbesondere der CMV-"Immediate   Early"-Promotor als   besonders effizient erwiesen hat. 



   Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, umfassend die gesamte Kodierungssequenz der vom TBE-Virus abgeleiteten Proteine prM/M und E zur Herstellung einer Vakzine. 



   Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der dazugehörigen Zeichnungsfigur, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, noch weiter erläutert. 



   Es zeigen :
Fig. 1 die verwendeten Inserts ; Fig. 2a, b, c eine vollständige Nukleotid- und Aminosäuresequenz des
Proteins prM/M und E des Inserts des Plasmids CMV-PEwt. 



  Beispiel : Zur Immunisierung mit nackter DNA wurden Plasmide verwendet, welche die in Fig. 1 dargestellten Inserts unter der Kontrolle des   CMV-"tmmediate     Early"-Promotors   enthielten. Diese Plasmide (CMV-PE wt, CMVPEst, CMV-Ewt, CMV-Est) wurden durch Umklonierung der Inserts aus den in Allison et al. beschriebenen Plasmiden SV-PEwt, SV-PEst, SV-Ewt und SV-Est in das Plasmid pCMVss   (Clontech)   gewonnen (Mac 
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 that express E. coli ss-galactosidase in mammalian cells") und durch   CsCI-Dichtegradientenzentrifugation   gereinigt (Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1982)
CMV-PEwt enthält die Sequenzen für die Wild-Typ-Proteine prM und E. 



   CMV-PEst enthält die Sequenzen für das Wild-Typ-Protein prM und eine deletierte Sequenz des Proteins E, wobei die Codons für 61 carboxyterminale Aminosäuren, welche den Membrananker des Proteins E bilden, fehlen. 



   In CMV-Ewt Ist der Grossteil der prM-Sequenz nicht vorhanden, jedoch die vollständige Sequenz des   Wild-Typ-Proteins E.    

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   CMV-Est enthält keine prM-Sequenz und die deletierte Protein E-Sequenz aus CMV-PEst. 



   Jedes dieser vier Plasmide wurde in zwei Konzentrationen (60  g/ml und 300  g/ml in PBS) zur Immunisierung von Mäusen (Swiss albino) eingesetzt, wobei für jede   Plasmidpräparation   10 Mäuse (5 Weibchen und 5 Männchen) verwendet wurden. Jeder Maus wurden 2 mal 100   u. 1 der Jeweiligen   DNA-   Präparation Im   Abstand von 2 Wochen intradermal injiziert. Als Kontrollen wurden das   P ! asmid pCMVss m   einer Konzentration von 300  g/ml sowie PBS in gleicher Welse verwendet.

   Zum Vergleich mit der konventionellen Immunisierung wurden Gruppen von je 10 Mäusen mit dem   Formalin-Inaktivierten   Virus in Konzentrationen von 1  g/ml und 5   u. g/ml ebenfalls   2 mal im Abstand von 2 Wochen immunisiert, wobei 0, 2 ml pro Maus subkutan injiziert und   0,   2   % Al (OH) 3 als   Adjuvans verwendet wurden Eine Woche nach der zweiten Immunisierung wurde den Mäusen zum Nachweis spezifischer Antikörper   ! m EDSA Btut   abgenommen, und gleichzeitig erfolgte eine intraperitoneale Challenge-Infektion mit 500   LDso   des   TBE-Vlrus.   Die Beobachtungszeit betrug 3 Wochen. Die Ergebnisse des Antikörpernachweises und des Schutzversuchs sind in der Tabelle 1 zusammengefasst.

   Wie daraus hervorgeht, konnte bel der DNA-Immunisierung ein Schutz gegen eine tödliche Infektion mit dem TBE-Virus nur mit jenem Plasmid erreicht werden, das die Gene für die vollständigen prM-und E-Proteine enthält. Dies Ist wahrscheinlich dahingehend zu   Interpretie-   
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 ! raien Part ! ke) n. m weichenProtein E in immunogener Form vorliegt, notwendig ist. 



   Tabelle 1 
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<tb> 
<tb> Ergebnisse <SEP> des <SEP> Mäuseschutzversuches
<tb> Immunogen <SEP> Schutz <SEP> Antikörper-positiv
<tb> Plasmide
<tb> PE-wt <SEP> 60 <SEP> g/ml <SEP> 6a/1 <SEP> "1 <SEP> C/1 <SEP> od <SEP> 
<tb> PE-wtSOOtig/m) <SEP> 9/10 <SEP> 5/10
<tb> E-wt <SEP> 60 <SEP> ug/ml <SEP> 0/10 <SEP> 0/10
<tb> E-wt <SEP> 300 <SEP> ig/ml <SEP> 0/10 <SEP> 0/10
<tb> PE-st <SEP> 60 <SEP> u. <SEP> g/ml <SEP> 0/10 <SEP> 0/10
<tb> PE-st <SEP> 300 <SEP>  g/ml <SEP> 0/10 <SEP> 0/10
<tb> E-st <SEP> 60 <SEP>  g/ml <SEP> 0/10 <SEP> 0/10
<tb> E-st <SEP> 300 <SEP> u.

   <SEP> glml <SEP> 0/10 <SEP> 0/10
<tb> CMV-ss <SEP> 300 <SEP> ug/ml <SEP> 0/10 <SEP> 0/10
<tb> Kontrollen
<tb> HCOH <SEP> Virus <SEP> 1 <SEP>  g/ml <SEP> 4/10 <SEP> 4/10
<tb> HCOH <SEP> Virus <SEP> 5 <SEP> tig/ml <SEP> 10/10 <SEP> 10/10
<tb> PBS <SEP> 0/10 <SEP> 0/10
<tb> 
 
Anzahl der geschützten Mäuse b Anzahl der untersuchten Mäuse c Anzahl der ELISA-positiven Mäuse d Anzahl der untersuchten Mäuse Patentansprüche 1. Vakzine zur Immunisierung gegen Tick-Bome-Enzephalitis-Virus (TBE-Virus)-Infektionen, umfassend eine Nukleinsäure, welche für Protein E und Protein prM/M, abgeleitet aus dem TBE-Virus, In deren zumindest   im wesentlichen vollständiger,   nativer Form kodiert.

Claims

2. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die für Protein E und prM/M kodierende Sequenz aus dem europäischen oder fernöstlichen Subtyp des TBE-Virus abgeleitet ist.

3. Vakzine nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Plasmidvektor ist. <Desc/Clms Page number 5>

4. Vakzine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Plasmidvektor ein von CMVss abgeleite- ter Plasmidvektor ist.

5. Nukleinsäurevektor, umfassend die gesamte Kodierungssequenz der vom TBE-Virus abgeleiteten Proteine E und prM/M, als Arzneimittel.

6. Nukleinsäurevektor, umfassend die gesamte Kodierungssequenz der vom TBE-Virus abgeleiteten Proteine prM/M und E, ausgenommen ein von SV 40 abgeleiteter Plasmidvektor.

7. Nukleinsäurevektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Plasmidvektor ist.

8. Plasmidvektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor des Plasmidvektors ausgewählt ist aus der Gruppe CMV-, HSV-, RSV-, EBV-, ss-Actm-, Adeno-, MMTV-, hsp-und hGH- Promotor 9. Plasmidvektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor des Plasmidvektors ein CMV-Promotor ist.

10. Verwendung einer Nukleinsäure, umfassend die gesamte Kodierungssequenz der vom TBE-Virus abgeleiteten Proteine prM/M und E, zur Herstellung einer Vakzine.