DE60224435T2

DE60224435T2 - Thymosin-augmentation bei genetischer immunisierung

Info

Publication number: DE60224435T2
Application number: DE60224435T
Authority: DE
Inventors: Jack R. Waban WANDS
Original assignee: Rhode Island Hospital
Current assignee: Rhode Island Hospital
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2009-01-02
Anticipated expiration: 2022-10-29
Also published as: CN1269524C; KR100902197B1; EA006743B1; EP1448223A4; DE60224435D1; PT1448223E; PL370453A1; US20050054845A1; JP2005506997A; ES2299626T3; ATE382365T1; EP1448223A2; DK1448223T3; WO2003035010A3; BR0213554A; NO20042124L; KR20040089075A; UA81613C2; MXPA04003867A; CA2464795A1

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der Teilanmeldung 60/330, 638, eingereicht am 26. Oktober 2001.
Hintergrund
Chronische Hepatitis C-Virus (HCV)-Infektion ist ein schwerwiegendes medizinisches Problem, das zu chronischer Lebererkrankung, Zirrhose und Leberkarzinom führt. Das Hepatitis C-Virus ist das vermutliche Agens für die meisten Fälle von Posttransfusionshepatitis. Trotz der Verbesserung bezüglich der Qualität des Blutspenderpools und der Testierung des Spenderbluts kommt es noch in erheblichem Maße zu akuten Infektionen bei Personen, die eine Bluttransfusion erhalten. Chronische Hepatitis entwickelt sich bei wenigstens der Hälfte der Patienten mit akuter HCV-Infektion (ca. 90% der Patienten mit Nicht-A und Nicht-B-Hepatitis (NANB)), und Zirrhose entwickelt sich bei mindestens 20% dieser Gruppe.
Es wurde eine Reihe von Arzneimitteln untersucht mit dem Zweck des Stillstands bzw. der Verlangsamung des Fortschreitens mit HCV in Zusammenhang stehender Erkrankungen. Der gegenwärtige Standard der medizinischen Fürsorge umfaßt die Verwendung von α-Interferon und Ribavirin. Eine erhebliche Zahl von Personen spricht jedoch auf diese Therapie nicht an. Es wurde festgestellt, daß die genetische Immunisierung zu einer Verstärkung der Immunreaktionen auf breiter zellulärer Basis gegenüber HCV-struktur- und Nichtstrukturproteinen führt. Die biologische Aktivität der einzelnen HCV-Konstrukte erwies sich jedoch bei einer Reihe von Tierversuchsmodellen als zu schwach (siehe Tokushige et al., (1996).
Die genetische Immunisierung ist eine Alternative, die gegenüber der Verwendung der traditionellen auf Antigenbasis hergestellten Impfstoffe wie von abgeschwächten Viren- oder Proteinuntereinheitsimpfstoffen zunehmend an Bedeutung gewinnt. Die genetische Immunisierung verwendet nackte DNA zur Immunisierung des Empfängers. Die DNA ist in dem Sinne „nackt", als sie frei ist von einem beliebigen infektiösen Zuführungsvehikel, welches den Eintritt in die Zelle zu erleichtern vermag, wie z. B. Viruspartikel. Bei Verabreichung der nackten DNA vermag der Empfänger die Plasmid DNA-codierten Proteine zu exprimieren, die dann eine spezifische Immunreaktion stimulieren, bestehend aus zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen und Antikörpern. Bei Verwendung von DNA-Impfstoffen kann auf die Reinigung des Pathogens bzw. des immunprotektiven Antigens für die Impfung verzichtet werden. Auch besteht keine Möglichkeit der Rückkehr der Virulenz, da die DNA ein einziges Virusprotein codiert.
Die Verwendung von Polynucleotiden für die Immunisierung weist eine Reihe von Vorteilen auf. So z. B. kann die Immunisierung unter Verwendung eines durch ein Polynucleotid codierten Antigens erfolgen. Ferner werden die durch ein Polynucleotid codierten Antigene als „reine" Antigene in ihrem nativen Zustand exprimiert und erfahren normale Modifizierungen in der Wirtszelle. Außerdem können Polynucleotide leicht und auf billige Weise eingesetzt werden und sind als Trockenprodukt oder in gelöster Form innerhalb eines weiten Temperaturbereichs beständig. Diese Technologie ist deshalb für die Entwicklung von hocheffektiven Untereinheitsimpfstoffen von Bedeutung.
Die ausgelöste humorale und/oder zellvermittelte Immunantwort kann den Schutz bzw. die protektive Immunität gegen Infektion durch pathogene Agenzien wie Bakterien, Viren und eukaryotische Organismen (z. B. Parasiten) gewährleisten. Die protektiven humoralen und/oder zellvermittelten Immunantworten stören dann die Infektivität bzw. Aktivität des Pathogens bzw. begrenzen seine Ausbreitung oder sein Wachstum, was zum Schutz beim nachfolgenden Immunitätstest (Challenge) mit Hilfe des Pathogens führt. Die Immunantwort kann auch Krankheiten und Störungen, die Zellen umfassen, welche spezifische Proteine produzieren, bekämpfen.
Die genetische Immunisierung durch intramuskuläre Injektion erwies sich als wirksam bei verschiedenen Tieren gegen eine Reihe von Viren, (siehe z. B. Boume et al. 1996, The immunization of guinea pigs against Herpes simplex virus (HSV) type 2 infection; Fu et al., 1997, The immunization of mice against influenza virus; Kodihalli et al., 1997, The vaccination of chickens against influenza viruses und Herrmann et al., US-PS 5.620.896 , Mammals and avians against rotaviruses). Daheshia et al., 1997, offenbaren daß eine einzige Anwendung von nackter, IL-1 codierender DNA auf die Cornea der Tiere bei Herpes- Stromakeratitis die Läsionen bei diesen Tieren beseitigt und eine Remission der Läsionen bewirkt.
Eine Diskussion über die genetische Immunisierung im Allgemeinen und ihre Verwendung werden z. B. in der US-PS 5.830.876 , Weiner et al., beschrieben.
Eine Klasse von Polypeptideimmunmodifikatoren, gewonnen aus der Thymusdrüse, die sogenannten Thymosine, vermögen Reifungsprozesse bei Lymphozyten auszulösen, die T-Zellfunktion zu steigern und die Wiederherstellung der Immunfunktion zu begünstigen. Thymosin α₁ (THNα₁) ist ein saures, 28 Aminosäuren umfassendes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 3100, das starke immunologische Aktivität aufweist, einschließlich der Stimulierung der α- und γ-Interferonproduktion, der Steigerung der Produktion des die Makrophagenmigration inhibierenden Faktors, der Induzierung der Expression von T-Zellenmarkern, der IL-2-Rezeptoren und der Verbesserung der T-Zellhelferzellaktivität. Die Isolierung, Kennzeichnung und Verwendung von THNα₁ ist z. B. in der US-PS 4.079.127 beschrieben.
Verschiedene antivirale Agenzien, einschließlich Acyclovir, Vidarabin und Adeninarabinosid, wurden als einzige therapeutische Mittel beim Versuch der Behandlung chronischer HCV verwendet. Die ausschließliche Therapie mit diesen antiviralen Mitteln erwiesen sich im Allgemeinen als wenig erfolgreich entweder aufgrund der hohen Toxizität des Agens oder aufgrund der Inhibierung der Virusreplikation. Diese ist zwar gewiß anfänglich vorhanden, jedoch nicht dauerhaft (siehe z. B. Alexander et al., 1988).
Es besteht somit ein erheblicher Bedarf an therapeutischen Mitteln für HCV, die wirksam und bei geringeren Nebenwirkungen das Virus angreifen, das Immunantwortsystem modulieren und die Rückfallfrequenz vermindern.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von α-Thymosin zur Steigerung der zellulären CD4+ und CD8+ Immunantwort auf immunogene Peptide von HCV in einer bevorzugten Ausführungsform gegenüber dem NS5-Protein von HCV. Es erwies sich als schwierig, die zellulären Immunantworten auf Virus- und Zellproteine zu steigern. Die vorliegende Erfindung beschreibt nun die in vivo-Verwendung von α-Thymosin für eine überaus starke Steigerung der zytotoxischen und proliferativen T-Zell-Antworten auf die Epitope von HCV-Proteinen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Thymosin Thymosin α₁. Impfstoffe auf DNA-Basis stellen eine neue Technologie dar und unterscheiden sich in einem so erheblichen Maße von früheren Arten der Impfung (beruhend auf Proteinen, Peptiden oder abgetöteten Viren, die alle humorale oder Antikörper-vermittelte Immunität bewirken, wohingegen Impfstoffe auf DNA-Basis Zell-vermittelte Immunität verleihen), daß die Tatsache, daß α-Thymosin die Wirksamkeit des Impfstoffs erhöht, eine neue und unerwartete Verbesserung der Verwendung von Impfstoffen auf DNA-Basis bei der Behandlung und Prophylaxe von HCV bewirkt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 illustriert den Mechanismus der Impfstoffe auf DNA-Basis.
2 ist eine schematische Darstellung des Hepatitis C-Virus (HCV)-Genoms.
3 zeigt die Wirkung der gleichzeitigen Verabreichung von 5 μg Thymosin α₁ i. p. zusammen mit einem NS5 codierenden Polynucleotid auf die T-Zellen-proliferative Antwort bei drei Challenge-Konzentrationen (0,1 μg, 0,5 μg und 1 μg).
4 zeigt die Wirkung der gleichzeitigen Verabreichung von 5 μg Thymosin α₁ i. p. zusammen mit einem NS5-codierendem Polynucleotid auf die Zytotoxizitätsantwort bei zwei Lymphozyteneffektor/Target (L/T)-verhältnissen.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von α-Thymosin in einer Kombination mit „genetischer" Immunisierung auf DNA-Basis zu einer außerordentlich starken Verbesserung der zellulären Immunantworten auf HCV. Eine bevorzugte Ausführungsform bewirkt eine Verbesserung der Wirkung von Impfstoffen auf DNA-Basis mit Thymosin α₁ (Thymalfasin). Die Erfindung hat starke Konsequenzen für die prophylaktische und therapeutische Impfstoffentwicklung und gewährleistet eine erhebliche Verbesserung der zellulären Immunantworten auf Virus- und Zellproteine nach der Immunisierung auf DNA-Basis. Das ein immunogenes HCV-Peptid, -polypeptid oder -protein codierendes Polynucleotid wird unmittelbar einem Tier in vivo in Kombination mit einem oder mehreren α-Thymosinen verabreicht. Das Polynucleotid codiert ein Polypeptid, das wenigstens ein Epitop mit einem immunogenen HCV-Protein, welches das Target darstellt, gemeinsam hat. Das Polynucleotid wird durch die Zellen des Individuums unter Bildung von immunogenen Targetproteinen exprimiert, die eine Immunantwort gegen HCV auslösen, das auf einer breiten Basis beruht. Das HCV-Genom codiert zwei Envelopproteine (E1 und E2) und 6 Strukturproteine (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B). 2. Erfindungsgemäß können Polynucleotide verwendet werden, die beliebige der genannten Virusproteine oder Kombinationen oder Fragmente davon codieren, verwendet werden.
Die Erfindung ist auf natives, d. h. natürlich vorkommendes, α-Thymosin genauso wie auch auf synthetisches α-Thymosin und rekombinantes α-Thymosin mit der Aminosäuresequenz nativer α-Thymosine, mit im Wesentlichen ähnlichen Aminosäuresequenzen oder einer abgekürzten Sequenz davon sowie ihren biologisch aktiven Analoga mit substituierten, der Deletion unterworfenen, verlängerten, ersetzten oder auf andere Weise modifizierten Sequenzen anwendbar, deren Bioaktivität im Wesentlichen derjenigen eines nativen α-Thymosins ähnlich ist. Ein bevorzugtes Thymosin ist Thymosin α₁.
Die Isolierung, Kennzeichnung und Verwendung von α-Thymosin wird z. B. in den US-PS 4.079.127 , 4.353.821 , 4.148.788 und 4.116.951 beschrieben. Die Menge an α-Thymosin, die erforderlich ist, um den erwünschten Grad an Steigerung der Wirksamkeit eines Impfstoffs auf DNA-Basis auszulösen, kann durch Routineuntersuchungen auf der Basis von Dosistitrationsversuchen ermittelt werden. Bei so hohen Dosen wie 16 mg/kg Körpergewicht/Tag erweist sich α-Thymosin beim Menschen als sicher. Eine bevorzugte Dosis an α-Thymosin liegt in einem Bereich von 0,001 mg/kg Körpergewicht/Tag bis 10 mg/kg Körpergewicht/Tag, insbesondere bei ca. 0,02 mg/kg Körpergewicht/Tag.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotidsequenzen sind DNA- oder RNA-Sequenzen, die antigene/immunogene HCV-Polypeptide codieren, die mit Transkriptionsregulatorsequenzen operabel verknüpft sind. Diese Sequenzen können in Verbindung mit anderen Polynucleotidsequenzen, die Regulationsproteine codieren, die ihrerseits die Expression dieser Polypeptide steuern, verwendet werden. Das Regulationsprotein kann durch Bindung an die Genom-DNA wirken, und zwar zur Regulierung ihrer Transkription. Außerdem kann sie durch Bindung der m-RNA zur Steigerung bzw. Verminderung ihrer Beständigkeit bzw. der Translationseffizienz wirken.
Unter dem Ausdruck „mit Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen operabel verknüpft" versteht man, daß eine ein Polypeptid codierende Sequenz und minimale Transkriptions- und die Translation steuernde Sequenzen so miteinander verknüpft sind, daß sie eine Polypeptidexpression ermöglichen, wenn die entsprechenden Moleküle (z. B. Transkriptionsaktivatorproteine) mit der Regulationssequenz bzw. den Regulationssequenzen verbunden sind. Ein Polynucleotid codiert operativ ein Polypeptid, wenn es die gesamte genetische Information enthält, die für die Expression durch eine Target-Zelle wie z. B. Promotoren und dergleichen erforderlich sind. Die Termini „Promotor" bzw. „Promotorsequenz" bedeuten hier eine minimale Sequenz, die für die Steuerung der Transkription ausreichend ist. Eine DNA-Polynucleotidsequenz wird gewöhnlich durch eine Initiierungsstelle und eine Terminierungsstelle unter Bildung einer DNA-Transkriptionseinheit gebunden und wird unter Erzeugung eines primären Transkripts transkripiert.
Das in vivo den Zellen zugeführte Polynucleotidmaterial kann eine Reihe von Formen annehmen. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein bestimmtes Polynucleotid, das ein beliebiges konkretes HCV-Polypeptid codiert, beschränkt, obwohl das NS5-Protein codierende Polynucleotid bzw. ein Fragment davon bevorzugt sind. Plasmide, die Gene enthalten, die HCV-Antigene oder Immunogene codieren, sind aus der Literatur bekannt und können von einem Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet leicht erhalten werden (siehe z. B. Tokushige, et al., 1996).
Das Polynucleotid kann ein Antigen oder eine Reihe von Antigenen codieren, wie z. B. solche aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Virusproteinen. Das Polynucleotid kann aber auch zwei oder mehrere unterschiedliche DNA-Sequenzen enthalten, wobei eine Sequenz ein Antigen codiert und eine andere oder mehrere andere Polypeptide codieren, die gegebenenfalls Antigen sein können. So z. B. kann der Vektor zwei (oder mehrere) HCV-Antigene codieren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann bzw. können das andere bzw. die anderen Polypeptid(e) der Verstärkung einer Immunantwort gegen HCV (z. B. Helferepitope, Cytokine, Trägerpolypeptide, Choleratoxinuntereinheiten oder andere Immunostimulantien) dienen.
Das Polynucleotid kann außerdem in einen Vektor inseriert werden, der Sequenzen für die Expression des Polynucleotids umfaßt. Liegen zwei oder mehrere Polypeptid-codierende DNA-Sequenzen in einem Vektor vor, kann die Transkription jeder antigencodierenden DNA-Sequenz vom eigenen Promotor für die Expression von zwei oder mehreren nichtfusionierten Polypeptiden ausgehen. Ein Promotor kann jedoch auch die Expression zweier oder mehrerer antigencodierenden DNA-Sequenzen, die in einem Rahmen miteinander verknüpft sind, steuern, um ein Fusionsprotein zu exprimieren.
Die entsprechend diesen Methoden verwendeten Polynucleotide können Sequenzen sein, die in das Genom der Wirtszelle nicht integriert werden. Diese können nichtreplizierende DNA-Sequenzen oder spezifische replizierende Sequenzen sein, die gentechnisch so verändert sind, daß sie des Genomintegrationsvermögens entbehren. Das Polynucleotid kann dem Patienten in Anwesenheit von Adjuvantien oder anderen Substanzen verabreicht werden, welche die Nucleinsäureaufnahme zu begünstigen oder die Zellen des Immunsystems zur Impfungsstelle zu steuern vermögen. Es versteht sich von selbst, daß das Polynucleotid an sich in der Wirtszelle durch Transkriptionsfaktoren exprimiert wird, die von der Wirtszelle oder einer DNA-Transkriptionseinheit bereitgestellt werden.
Erfindungsgemäß kann sowohl die DNA als auch die mRNA Zellen zugeführt werden, damit darin ein Polypeptidtranslationsprodukt gebildet wird. Enthalten die Nucleinsäuren entsprechende Steuerungssequenzen, steuern diese die Synthese relativ großer Mengen an codiertem Protein.
Die Dosierung des immunogenen Polypeptids kann von einem Kliniker oder einem Veterinär anhand von Tiermodellen oder anderen Testsystemen, die aus dem Stand der Technik allgemein bekannt sind, leicht ermittelt werden. Die Formulierungen enthalten eine wirksame Menge an DNA in einer wäßrigen Lösung. Die zu verabreichende DNA-Menge hängt von Faktoren wie dem Alter, dem Körpergewicht und dem Gesundheitszustand des für die Impfung bestimmten Patienten ab. Die DNA-Menge hängt außerdem vom Vermögen des Immunsystems des Patienten ab, Antikörper zu synthetisieren, sowie vom erwünschten Schutzgrad. Die wirksamen Dosierungen können von einem Durchschnittsfachmann auf dem vorliegenden Gebiet durch Routineversuche anhand von Dosis-Antwort-Kurven leicht festgestellt werden. Ein bevorzugter Dosisbereich liegt zwischen 1 μg/kg Körpergewicht und 1 mg/kg Körpergewicht. Der Patient kann durch einmalige Verabreichung der DNA oder durch mehrfache Verabreichungen immunisiert werden. Mehrfachverabreichungen können erforderlich sein, um einen bestimmten Immunitätszustand des Patienten im Hinblick auf ein konkretes Pathogen aufrechtzuerhalten.
Die Zusammensetzungen und die Methode für die Konstruktion heterologer Polynucleotide für erfolgreiche Umwandlungen sind dem Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet bekannt, und dieselben Zusammensetzungen und Konstruktionsmethoden können auch zur Herstellung der hier geeigneten Polynucleotide verwendet werden. Die spezifische Polynucleotidzusammensetzung ist erfindungsgemäß nicht von entscheidender Bedeutung, d. h. die Erfindung hängt nicht von der Zusammensetzung des verwendeten spezifischen Umwandlungspolynucleotids ab. Geeignete Komponenten des Polynucleotids einschließlich Promotoren, Polyadenylierungssequenzen, Terminations- und Splicingsignale, selektierbare Marker, Reportergene, Enhancer, virale Replicons, Introns und bakterielle Plasmidsequenzen sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt. Sambrook et. al. (1989) stellen geeignete Methoden für die Konstruktion heterologer Polynucleotide bereit.
Polynucleotide können nach einer Reihe bekannter Methoden hergestellt werden. So z. B. kann eine, ein im Voraus gewähltes Antigen codierende DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden [siehe z. B. Sambrook et. al, (1989)]. Steht eine automatisierte Nucleinsäuresynthese-Anlage zur Verfügung, kann die DNA unmittelbar bei Bekanntheit der Nucleotidsequenz oder durch Kombination von PCR, Klonen und Fermentation synthetisiert werden. Außerdem kann, wenn die Sequenz des vorgewählten Polypeptids bekannt ist, eine geeignete Codierungssequenz für das Polynucleotid abgeleitet werden.
Ist das Polynucleotid mRNA, kann es aus der entsprechenden DNA in vitro leicht hergestellt werden. So z. B. verwenden die üblichen Techniken die Phagen-RNA-Polymerasen SP6, T3 oder T7 zur Herstellung von mRNA aus DNA-Templaten in Anwesenheit der individuellen Ribonucleosidtriphosphate. Ein geeigneter Phagenpromotor wie eine T7-Replikationsursprungsstelle wird in das DNA-Templat unmittelbar oberhalb des zu transkribierenden Gens angeordnet. Systeme, die T7 auf diese Weise verwenden, sind allgemein bekannt und werden in der Literatur beschrieben.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt eine immunulogische Zusammensetzung, die bei Verabreichung an ein Individuum, das zu einer immunologischen Antwort befähigt ist, oder bei dem diese induziert werden kann, eine immunulogische Antwort auf ein daraus codiertes HCV-Protein induziert, wobei die Zusammensetzung ein Polynucleotid umfaßt, das ein oder mehrere Antigene/Immunogene des HCV im Gemisch mit einem oder mehreren α-Thymosinen enthält. Die immunologische Antwort kann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden und kann die Form der Antikörperimmunität bzw. der zellulären Immunität annehmen, wie sie sich z. B. aus CTL- oder CD4+ T-Zellen ergibt.
Beispiel 1
Plasmidkonstruktion
Als Quelle für Virusgene wurde ein Plasmid (pBRTM/HCV1-3011) ausgewählt, welches den offenen Leserahmen in voller Länge (ORF) des HCV abdeckt, um in Expressionsvektoren zu klonen (Grakoui, et. al. 1993). Das Konstrukt pAp031-Ns5 wurde nach Insertion von gentechnisch veränderten Start- und Stopcodons durch PCR geklont, wobei als Restriktionsenzymstellen folgende Primer verwendet wurden: für NS5: 5'-T CAG TCT AGA ATG TCC GGC TCC TGG CTA AGG GA-3' (XbaI) [SEQ ID No. 1] und 5'-A GCT ACG CGT TCA CCG GTT GGG GAG GAG GT-3' (MluI) [Seq ID No. 2]. Nach der PCR-Amplifizierung unter Verwendung eines in hohem Maße zuverlässigen PCR-Systems (Bochringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurden die cDNA-Fragmente in den Plasmidexpressionsvektor pAp031 inseriert, der ein Rous-Sarcomvirus-Enhancerelement und einen CMV-Promotor enthielt. Die Konstrukte wurden dann in DH5α-Zellen transformiert, wonach die Plasmid-DNA entweder durch 2-malige Zentrifugierung mit Cäsiumchlorid oder mit Hilfe eines Qiagen Giga-Kits unter Verwendung des Endofree-Puffersystems (Santa Clara, CA) gereinigt wurde. Die korrekte Insertion der cDNA's, die nichtstrukturelle Proteine codieren, wurde durch Sequenzierungsanalyse unter Verwendung der üblichen Methoden überprüft. Zur Feststellung beständiger NS5 exprimierender Zelllinien als Targetzellen für die CTL-Versuche wurden außerdem die Nichtstrukturproteine codierenden Genfragmente mit einem selektierbaren Neomycinmarker in pcDNA3 und pcDNA3. 1/Zeo(–) Expressionsvektoren geklont (Invitrogen, San Diegeo, CA). Ein XbaI- und MluI-Fragment NS5 wurde dann in die NheI/MluI-Stelle des Litmus-38-Vektors subgeklont (New England Biolabs, Beverly, MA), mit EcoR1 und SalI zerschnitten und in den EcoRI/XhoI-Mehrfachklonungssite von pcDNA3 und pcDNA3 bzw. I/Zeo(–) ligiert. Ein HbaI- und ein BamHI-Fragment enthaltendes NS4 wurde in Litmus-29 (New England Biolabs) ligiert, mit KpnI und EcoRI geschnitten und dann in den pc DNA 3-Vektor ligiert. Die Plasmide wurden als pcDNA3.1/Zeo(–)-NS5 bezeichnet. Das Mäuse-IL-2 codierende DNA-Expressionsplasmid (pcD/3-Il2) wurde geklont und wie oben beschrieben gereinigt (Geissler, et. al., 1997a, 1997b, 1997c).
Genetische Immunisierung
Zur Verstärkung der zellulären Aufnahme von Plasmid-DNA wurde in den Quadricepsmuskel von Balb/c-Mäusen an einer Reihe von Stellen eine Gesamtmenge von 100 μl 0,25% Hupivacain injiziert. Vier Tage später wurden die Plasmidkonstrukte in denselben Bereich an 5 unterschiedlichen Stellen in einem Endvolumen von 100 μl 0,9% NaCl eingespritzt. Zwei Wochen später wurde den Mäusen in das gegenüberliegende Bein eine Booster-Injektion von Plasmid-DNA eingespritzt. 10 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse getötet. Diese wurden in 3 Gruppen zu jeweils 5 Tieren eingeteilt:

Gruppe 1 = mit 100 μg Mock-DNA immunisierte Mäuse,
Gruppe 2 = mit 50 μg pAp031NS5 und 50 μg Mock-DNA immunisierte Mäuse und
Gruppe 3 = mit 50 μg pAp031 NS5 und 50 μg Mock-DNA immunisierte Mäuse, die zusätzlich noch 5 μg Thymosin α₁ i. p. zweimal die Woche erhielten. Die Tiere wurden 3 mal zwei Wochen nacheinander gesondert immunisiert. Nach der letzten Immunisierung wurden dann die Untersuchungen durchgeführt.

T-Zellen-Proliferationstest
Die Mäuse wurden mit Isofluran (Aerrane, Anaquest, NJ) anästhetisiert, anschließend wurde durch retrobulbäre Punktion Blut entnommen, wonach Milzzellen entnommen wurden. Danach wurden Erythrozyten durch Inkubation in 8,3% NH₄Cl/0,17 mol/l Tris (pH 7,4) während 10 Min. bei 37°C entfernt. Die Milzzellen wurden 3-fach gezüchtet, und zwar unter Verwendung von Petrischalen mit 96 Vertiefungen (5 × 105 Zellen pro Vertiefung in 100 μl vollständigem Dulbeccos Modified Eagle's Medium (Mediatech, Washington, DC)), das 10% FCS enthielt. Die Milzzellen wurden dann mit rekombinantem NS5 bei unterschiedlichen Konzentrationen (1, 5, 10 μg/ml) stimuliert. Schließlich wurde 2-Mercaptoethanol bis zu einer Endkonzentration von 50 μmol/l zugesetzt. Als Kontrolle auf Antigenspezifizität wurden Effektorzellen mit 10 μg/ml der rekombinanten β-Untereinheit von Humanchoriongonadotropin stimuliert, wobei letzteres aus der Zelle ausgeschieden wurde und sich als starkes T-Zellenimmunogen erwies (Geissler, et. al., 1997d). Die Milzzellen wurden 3 Tage lang stimuliert. Nach Zugabe von [³H]-Thymidin (1 μg/Vertiefung) wurden die Zellen 18 Stunden lang inkubiert. Die [³H]-Thymidinaufnahme in die DNA wurde nach der Ernte gemessen. 3. Die Aufnahme der Radioaktivität wurde auf die Untergrundaktivität (Δ cpm) hin korrigiert.
Zytotoxizitätstest
Milzzellen aus immunisierten Mäusen wurden in vollständigem DMEM, enthaltend 10% FCS und 50 μmol/l 2-Mercaptoethanol suspendiert. Die Zellen wurden dann 5 Tage nach der in vitro-Stimulation auf cytotoxische Aktivität analysiert. Rekombinante Mäuse-IL-2 wurde dann einmal bei einer Konzentration von 5 E/ml zugegeben und Responderzellen (4 × 10⁷) wurden gleichzeitig mit 6,25 × 10⁶ syngenen Zellen, die nach Behandlung mit 20.000 rad beständig NS5 exprimierten, gleichzeitig gezüchtet. Nach 5 Tagen Inkubation wurden zytotoxische Effektorlymphocytenpopulationen geerntet. Ein 4-ständiger ⁵¹CR-Release-Test wurde dann in einer Petrischale mit 96 Vertiefungen unter Verwendung einer Targetzelllinie von ⁵¹Cr-markierten PS2-NS5 Zellen durchgeführt. Die CTL Tests wurden bei einem Verhältnis Lymphocyteneffektor:Target (L/T) von 1:10 und 1:100 durchgeführt. Der Prozentanteil an Zytotoxizität errechnete sich wie folgt:
Die experimentielle Freisetzung stellt die durchschnittlichen Zählungen pro Minute, freigesetzt von den Targetzellen in Anwesenheit der Effektorzellen, dar. Die Gesamtfreisetzung stellt die Radioaktivität dar, freigesetzt nach der Gesamtlyse der Targetzellen mit 5% TritonX-100. 4.
Die spontane Freisetzung stellt die Radioaktivität in einem Medium dar, das lediglich aus den Targetzellen besteht.
Statistische Analyse
Zum Vergleich der Ergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen wurde ein nichtparametrischer Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Ein Wert P < .05 wurde als statistisch signifikant erachtet. Die Zahl der P-Werte entsprechend den CD4+ und CD8+ T-Zell-Antworten ergab sich aus sämtlichen rekombinanten NS5-Konzentrationen wie sie für die Stimulierung verwendet wurden, und aus den E:T Verhältnissen.
Die Ergebnisse, wie sie in 3 und 4 dargestellt sind, zeigen die starke Verbesserung der Immunantwort, die bei der gleichzeitigen Verabreichung von α-Thymosin bei einer Immunisierungsbehandlung auf DNA-Basis erzielt werden kann. Die gleichzeitige Verabreichung von α-Thymosin erhöhte die CD4-proliferative Antwort um ca. 100% gegenüber sämtlichen drei Challengekonzentrationen. 3. Der Prozentanteil an Zytotoxizität wurde ebenso durch gleichzeitige Verabreichung von α-Thymosin um 100% oder mehr gesteigert. 4.
Literatur

Alexander, G. J. M., et. al., (1988), American J. Med. 85–2A: 143–146.
Boume, N., L. R. Stanberry, D. I. Bernstein, D. Lew (1996), DNA immunization against experimental genital herpes simplex virus infection, J. Infect. Dis. 173: 800–807.
Daheshia, M., N. Kuklin, S. Kanangat, E. Manickan, B. T. Rouse (1997), Suppression of ongoing ocular inflammatory disease by topical administration of plasmid DNA encoding IL-10, J. Immunol. 159: 1945–1952.
Fu, T. M., A. Friedman, J. B. Ulmer, M. A. Liu, J. J. Donnely (1997), Protective cellular immunity: cytotoxic T-lymphocyte responses against dominant and recessive epitopes of influenza virus nucleoprotein induced by DNA immunization, J. Virol. 71: 2715–2721.
Grakoui A, Wychowski C, Lin C, Feinstone SM, Rice CM (1993) Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. J. Virol. 67: 1385.
Geissler M, Tokushige K, Wands JR. Cellular and humoral immune response to hepatitis B virus structural proteins in mice following DNA-based immunization (1997a), Gastroenterology 112: 1307–20.
Geissler M, Gesien A, Tokushige K, Wands JR (1997b), Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus (HCV) core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine expressing plasmids. J. Immunol. 258: 1231–7.
Geissler M, Cesion A, Wands JR (1997c), Chronic ethanol effects on cellular immune responses to hepatitis B virus envelope protein; an immunologic mechanism for induction of persistent viral infection in alcoholics. Hepatology 26: 764–70.
Geissler M, Wands G, Gesien A, de la Monte S, Bellet D, Wands JR (1997d), Genetic immunization with the free human chorionic gonadotropin β-subunit elicits cytotoxic T lymphocyte responses and protects against tumor formation in mice. Lab. Invest. 76: 859–71.
Kodihalli, S., J. R. Hayes, H. L. Robinson, R. G. Webster (1997), Cross-protection among lethal H5N2 influenza viruses induced by DNA vaccine to the hemagglutinin, J. Virol. 71: 3391–3396.
Sambrook, et. al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2d, Cold Spring Habor Press (1989).
Tokushige, et. al., (1996), Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine, Hepatology 24: 14–20.
US-PS Nr. 4.079.127 (Goldstein, et. al.)
US-PS Nr. 4.116.951 (Wang)
US-PS Nr. 4.148.788 (Wang)
US-PS Nr. 4.353.821 (Birr, et. al.)
US-PS Nr. 5.620.896 (Herrmann, et. al.)
US-PS Nr. 5.830.876 (Weiner, et. al.)

Claims

Verwendung eines ein oder mehrere Hepatitis C-Virus-Peptide codierenden Polynucleotids zusammen mit einem oder mehreren α-Thymosinen für die Herstellung eines pharmazeutischen Gemisches für die Immunisierung eines für Hepatitis C-Virusinfektion anfälligen Patienten gegen eine solche Infektion.
Verwendung nach Anspruch 1, bei dem das Polynucleotid ein oder mehrere Hepatitis C-Virus-Envelopeproteine codiert.
Verwendung nach Anspruch 1, bei dem das Polynucleotid ein oder mehrere Hepatitis C-Virus-Proteine codiert, ausgewählt aus der Gruppe NS3-Protein, NS4A-Protein, NS4B-Protein, NS5A-Protein und NS5B-Protein.
Verwendung nach Anspruch 3, bei dem das Polynucleotid ein oder mehrere NS5-Proteine codiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–4, bei der das α-Thymosin Thymosin α1 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–4, bei der das Thymosin in einer Dosis von 0,001 mg/kg Körpergewicht/Tag und 10 mg/kg Körpergewicht/Tag vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 6, bei der das Thymosin in einer Dosis von ca. 0,02 mg/kg Körpergewicht/Tag vorliegt.
Pharmazeutisches Gemisch zur Immunisierung eines für Hepatitis C-Virus-Infektion anfälligen Patienten, das ein Polynucleotid, das ein oder mehrere Hepatitis C-Virus-Peptide codiert, zusammen mit einem oder mehreren α-Thymosinen umfaßt.
Gemisch nach Anspruch 8, worin das Polynucleotid ein oder mehrere Hepatitis C-Virus-Envelopeproteine codiert.
Gemisch nach Anspruch 8, worin das Polynucleotid ein oder mehrere Hepatitis C-Virus-Proteine codiert, ausgewählt aus der Gruppe NS3-Protein, NS4A-Protein, NS4B-Protein, NS5A-Protein und NS5B-Protein.
Gemisch nach Anspruch 10, worin das Polynucleotid ein oder mehrere NS5-Proteine codiert.
Gemisch nach einem der Ansprüche 8–11, worin das α-Thymosin Thymosin α1 ist.
Gemisch nach einem der Ansprüche 8–11, worin das Thymosin in einer Dosis von 0,001 mg/kg Körpergewicht/Tag und 10 mg/kg Körpergewicht/Tag vorliegt.
Gemisch nach Anspruch 13, worin das Thymosin in einer Dosis von ca. 0,02 mg/kg Körpergewicht/Tag vorliegt.