ES2299626T3

ES2299626T3 - Aumento de timosina para asegurar una inmunizacion genetica.

Info

Publication number: ES2299626T3
Application number: ES02795564T
Authority: ES
Inventors: Jack R. Wands
Original assignee: Rhode Island Hospital
Current assignee: Rhode Island Hospital
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2008-06-01
Anticipated expiration: 2022-10-28
Also published as: DE60224435T2; US20050054845A1; EA006743B1; CY1107371T1; MXPA04003867A; IL161603A0; DE60224435D1; DK1448223T3; EP1448223A2; NZ532863A; BR0213554A; CN1269524C; EP1448223B1; CA2464795A1; NO20042124L; KR20040089075A; KR100902197B1; JP2005506997A; CN1604789A; EA200400534A1

Abstract

Uso de un polinucleótido que codifica uno o más péptidos de virus de la hepatitis C, junto con una o más timosinas alfa, en la preparación de una combinación farmacéutica para inmunizar a un sujeto susceptible de infección por virus de la hepatitis C contra tal infección.

Description

Aumento de timosina para asegurar una inmunización genética.

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional 60/330.638, presentada el 26 de octubre de 2001.

Antecedentes

La infección crónica por el virus de la hepatitis C (VHC) es un problema médico importante que conduce a enfermedad hepática crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular. El virus de la hepatitis C es el supuesto agente en la mayoría de los casos de hepatitis adquirida después de una transfusión. A pesar de la mejora en la calidad del conjunto de donantes de sangre y de la implementación de ensayos en la sangre donada, la incidencia de infección aguda entre personas que reciben transfusiones sigue siendo significativa. La hepatitis crónica se desarrolla en al menos la mitad de los pacientes con infección aguda por VHC (lo cual representa aproximadamente el 90% de los pacientes con hepatitis no-A no-B (NANB) y al menos el 20% de este grupo desarrollan cirrosis.

Se han evaluado una variedad de fármacos con la intención de detener o ralentizar la progresión de enfermedades relacionadas con VHC. El tratamiento de referencia actual implica el uso de interferón alfa y ribavirina. No obstante, un número significativo de individuos no responden a tal terapia. Se ha demostrado que la inmunización genética aumenta respuestas inmunes celulares de amplia base a proteínas estructurales y no estructurales de VHC. No obstante, la actividad biológica de varias construcciones de VHC ha sido débil en varios modelos animales experimentales. Tokushige y col. (1996).

La inmunización genética es una emergente alternativa al uso de vacunas tradicionales basadas en antígenos tales como virus atenuados o vacunas de subunidades de proteínas. La inmunización genética usa ADN "desnudo" para inmunizar al receptor. El ADN está "desnudo" en el sentido de que está exento de cualquier vehículo de suministro infeccioso que pueda actuar para facilitar la entrada en la célula, tal como partículas virales. Cuando se administra ADN desnudo, el receptor es capaz de expresar las proteínas codificadas por el ADN plasmídico, que luego pueden estimular una respuesta inmune específica compuesta por células T citotóxicas, células T auxiliares y anticuerpos. El uso de vacunas de ADN elimina la necesidad de purificar el patógeno o antígeno inmunoprotector para la vacunación, y no hay ninguna posibilidad de reversión de la virulencia porque el ADN codifica una única proteína viral.

Hay numerosas ventajas para el uso de polinucleótidos para inmunización. Por ejemplo, la inmunización se puede llevar a cabo usando cualquier antígeno codificado por un polinucleótido. Además, los antígenos codificados por polinucleótidos se expresan como antígenos "puros" en sus estados nativos y han sufrido modificaciones normales por parte de la célula huésped. Los polinucleótidos también se manipulan de forma fácil y económica y son estables como producto seco o en solución a lo largo de un amplio intervalo de temperaturas. Por lo tanto, esta tecnología es valiosa para el desarrollo de vacunas de subunidades altamente eficaces.

La respuesta inmune humoral y/o mediada por células desencadenada puede proporcionar protección o inmunidad protectora contra la infección por agentes patógenos tales como bacterias, virus y organismos eucarióticos (por ejemplo, parásitos). La respuesta inmune humoral y/o mediada por células protectora interfiere entonces con la capacidad infecciosa o actividad del patógeno, o limita su expansión o crecimiento, dando como resultado la protección contra subsiguientes ataques por parte del patógeno. La respuesta inmune también puede combatir enfermedades y trastornos que impliquen células que producen proteínas específicas.

Se ha demostrado que la inmunización genética por medio de inyección intramuscular es eficaz en varios animales contra muchos virus. Por ejemplo, la inmunización de cobayas contra la infección por virus del herpes simplex (VHS) de tipo 2 (Boume y col. (1996)), la inmunización de ratones contra virus de la gripe (Fu y col. (1997)), la vacunación de pollos contra virus de la gripe (Kodihalli y col. (1997)) y de mamíferos y de aves contra rotavirus (Herrmann y col., patente U.S. No. 5.620.896). Daheshia y col. (1997) describen que una única aplicación de ADN desnudo que codifica IL-1 a la córnea de animales que expresan queratitis estromal herpética resolvió las lesiones que afectaban a estos animales, causando la remisión de la lesión.

Se puede encontrar una discusión de la inmunización genética en general y su uso, por ejemplo, en la patente U.S. No. 5.830.876 (Weiner y col).

Se ha demostrado que una clase de modificadores inmunes polipeptídicos derivados de la glándula del timo, las timosinas, desencadenan sucesos de maduración en linfocitos, aumentan la función de células T y promueven la reconstitución de defectos inmunes. La timosina \alpha_{1} (THN\alpha_{1}) es un polipéptido ácido de 28 aminoácidos con un peso molecular de 3100 que tiene potente actividad inmunológica, incluyendo la estimulación de la producción de interferón \alpha y \gamma, aumento de la producción del factor inhibidor de la migración de macrófagos, inducción de la expresión de marcadores de células T, receptores de IL-2, y mejora de la actividad de células T auxiliares. El aislamiento, caracterización y uso de THN\alpha_{1} se describe, por ejemplo, en la patente U.S. No. 4.079.127.

\newpage

Se han usado varios agentes antivirales como agentes de terapia única en un intento de tratar VHC crónica, incluyendo aciclovir, vidarabina y arabinósido de adenina. La terapia única con estos ausentes antivirales generalmente no ha tenido éxito, bien porque el agente era altamente tóxico o bien daba como resultado cierta inhibición de la replicación viral inicialmente, pero no conseguía mantener la inhibición de la replicación viral a largo plazo. Véase por ejemplo Alexander y col. (1988).

Sigue habiendo una importante necesidad de terapia para VHC que ataque al virus de forma eficaz y con menos efectos secundarios y module el sistema de respuesta inmune y reduzca la frecuencia de recaída.

Resumen

Esta invención describe el uso de timosina \alpha para aumentar las respuestas inmunes celulares CD4+ y CD8+ a péptidos inmunogénicos de VHC, en una forma de realización preferida, a la proteína NS5 del VHC. Ha sido difícil aumentar las respuestas inmunes celulares a proteínas virales y celulares. Esta invención describe el uso in vivo de timosina \alpha para potenciar sorprendentemente las respuestas citotóxica y proliferativa de células T a epítopos de proteínas de VHC. En una forma de realización preferida, la timosina es timosina \alpha_{1}. Las vacunas basadas en ADN son una tecnología tan nueva y tan diferentes de todos los tipos de vacunación anteriores (todos aquellos basados en proteínas, péptidos o virus muertos crean inmunidad humoral o mediada por anticuerpos, mientras que las vacunas basadas en ADN crean inmunidad mediada por células) que el hecho de que la timosina \alpha incremente la eficacia de la vacuna proporciona una nueva e inesperada mejora para el uso de vacunas basadas en ADN en el tratamiento y profilaxis de VHC.

Breve descripción de las figuras

la fig. 1 es una ilustración del mecanismo de la inmunización basada en ADN

la fig. 2 es una representación esquemática del genoma del virus de la hepatitis C (VHC);

la fig. 3 muestra el efecto de la coadministración de 5 \mug de timosina \alpha_{1} i.p., con un polinucleótido que codifica NS5, sobre la respuesta proliferativa de células T a tres concentraciones de exposición (0,1 \mug, 0,5 \mug y 1 \mug).

la fig. 4 muestra el efecto de la coadministración de 5 \mug de timosina \alpha_{1} i.p., con un polinucleótido que codifica NS5 sobre la respuesta de citotoxicidad a dos proporciones de linfocitos efector/diana (L/T).

Descripción detallada

Esta invención describe el uso de timosina \alpha en combinación con inmunización basada en ADN o "genética" para potenciar sorprendentemente las respuestas inmunes celulares a VHC. Una forma de realización preferida proporciona aumento de vacunas basadas en ADN con timosina \alpha_{1} (timalfasina). La invención tiene amplias implicaciones en el desarrollo profiláctico y terapéutico de vacunas y proporciona una mejora significativa en respuestas inmunes celulares a proteínas virales y celulares después de la inmunización basada en ADN.

El polinucleótido que codifica un péptido, polipéptido o proteína de VHC inmunogénico se administra directamente a un animal in vivo en combinación con una o más timosinas \alpha. El polinucleótido codifica un polipéptido que comparte al menos un epítopo con una proteína de HVC inmunogénica frente a la que se va a dirigir. El polinucleótido es expresado por las células del individuo para formar proteínas diana inmunogénicas que desencadenan una respuesta inmune contra VHC que está ampliamente basada. El genoma de VHC codifica dos proteínas de cubierta (E1 y E2) y seis proteínas estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). Fig. 2. En la presente invención se pueden usar polinucleótidos que codifican cualquiera de estas proteínas virales, o combinaciones o fragmentos de los mismos.

La invención es aplicable a timosina \alpha nativa (es decir, de origen natural) así como a timosina \alpha sintética y timosina \alpha recombinante que tienen la secuencia de aminoácidos de timosinas \alpha nativas, secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a las mismas o una secuencia abreviada de las mismas y a sus análogos biológicamente activos que tienen secuencias sustituidas, eliminadas, alargadas, reemplazadas o modificadas de otra forma que poseen bioactividad sustancialmente similar a la de una timosina \alpha nativa. Una timosina preferida es timosina \alpha_{1}.

El aislamiento, caracterización y uso de timosina \alpha se describe, por ejemplo, en la patente U.S. No. 4.079.127, patente U.S. No. 4.353.821, patente U.S. No. 4.148.788 y patente U.S. No. 4.116.951. La cantidad de timosina \alpha necesaria para desencadenar el grado deseado de aumento del efecto de una vacuna basada en ADN se puede determinar mediante experimentos de titulación de dosis rutinarios. Se ha descubierto que la timosina alfa es segura para los seres humanos cuando se administra en dosis tan altas como 16 mg/kg de peso corporal/día. Una dosis preferida de timosina \alpha está en el intervalo de 0,001 mg/kg de peso corporal/día a 10 mg/kg de peso corporal/día, siendo la más preferida una dosis de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso corporal/día.

Las secuencias de polinucleótidos de la invención son secuencias de ADN o ARN que codifican polipéptidos de VHC antigénicos/inmunogénicos unidos de forma operable a secuencias reguladoras transcripcionales. Estas secuencias se pueden usar en asociación con otras secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas reguladoras que controlan la expresión de estos polipéptidos. La proteína reguladora puede actuar uniéndose a ADN genómico de forma que regula su transcripción, como alternativa, puede actuar uniéndose a ARN mensajero para aumentar o disminuir su estabilidad o eficacia de traducción.

Con el término "unido de forma operable a secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales", se denota que una secuencia que codifica un polipéptido y secuencias de control transcripcional y traduccional mínimas están conectadas de tal forma que permiten la expresión de polipéptidos cuando se unen las moléculas apropiadas (por ejemplo proteínas activadoras transcripcionales) a la(s) secuencia(s) reguladora(s). Un polinucleótido codifica de forma operativa un polipéptido cuando tiene toda la información genética necesaria para la expresión por parte de una célula diana, tal como promotores y similares. Los términos "promotor" o "secuencia promotora" en el presente documento se refieren a una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. Una secuencia de polinucleótido de ADN se une normalmente por un sitio de iniciación y un sitio de terminación para formar una unidad de transcripción de ADN y se transcribe para producir un transcrito primario.

El material de polinucleótidos suministrado a las células in vivo puede tomar cualquier número de formas, y la presente invención no se limita a cualquier polinucleótido particular que codifica cualquier polipéptido de VHC particular, aunque se prefieren polinucleótidos que codifican la proteína NS5 o un fragmento de la misma. En la bibliografía se han notificado plásmidos que contienen genes que codifican antígenos o inmunógenos de VHC y los expertos en la materia pueden obtenerlos fácilmente (véase, por ejemplo, Tokushige y col. 1996).

El polinucleótido puede codificar uno o múltiples antígenos, tales como antígenos de dos o más proteínas virales diferentes. Como alternativa, el polinucleótido puede contener dos o más secuencias de ADN, una secuencia que codifique un antígeno y la otra(s) que codifiquen polipéptidos que pueden ser o no antigénicos. Por ejemplo, el vector puede codificar dos (o más) antígenos de VHC. En otra forma de realización, los otros polipéptido(s) pueden servir para potenciar una respuesta inmune contra VHC (por ejemplo, epítopos auxiliares, citocinas, polipéptidos vehículo, subunidades de la toxina del cólera u otros inmunoestimulantes).

El polinucleótido puede insertarse adicionalmente en un vector que incluye secuencias para la expresión del polinucleótido. Cuando están presentes dos o más secuencias de ADN que codifican polipéptidos en un vector, la transcripción de cada secuencia de ADN que codifica un antígeno se puede dirigir desde su propio promotor para la expresión de dos o más polipéptidos no fusionados. Como alternativa, un promotor puede dirigir la expresión de dos o más secuencias de ADN que codifican antígenos unidas en marco entre sí para expresar una proteína de fusión.

Los polinucleótidos usados en estos procedimientos pueden ser secuencias que no se integran en el genoma de la célula huésped. Estas pueden ser secuencias de ADN no replicante o secuencias replicantes específicas modificadas genéticamente para que carezcan de la capacidad de integrarse en el genoma. El polinucleótido se puede administrar al sujeto en presencia de adyuvantes u otras sustancias que tienen la capacidad de promover la captación de ácidos nucleicos o reclutar células del sistema inmune al sitio de la inoculación. Debe entenderse que el propio polinucleótido se expresa en la célula huésped mediante factores de transcripción proporcionados por la célula huésped o proporcionados por una unidad de transcripción de ADN.

Según la invención, se pueden suministrar tanto ADN como ARNm expresable a células para formar un producto de traducción polipeptídico en las mismas. Si los ácidos nucleicos contienen las secuencias de control apropiadas, dirigirán la síntesis de cantidades relativamente grandes de la proteína codificada.

La dosificación del polipéptido inmunológico se puede determinar fácilmente por parte de un médico o un veterinario empleando modelos animales o sistemas de ensayo que son bien conocidos en la técnica. Las formulaciones contendrán una cantidad eficaz del ADN en una solución acuosa. La cantidad de ADN que se va a administrar depende de factores tales como la edad, el peso y el estado físico del objeto considerado para la vacunación. La cantidad de ADN depende también de la capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos y del grado de protección deseado. Pueden establecerse dosificaciones adecuadas fácilmente por parte de un experto habitual en la materia mediante estudios rutinarios estableciendo curvas de dosis-respuesta. Un intervalo de dosis preferido es entre 1 \mug/kg de peso corporal del sujeto y 1 mg/kg de peso corporal del sujeto. El sujeto puede inmunizarse mediante la administración de ADN de una vez o mediante administraciones múltiples. Pueden requerirse múltiples administraciones para mantener un estado de inmunidad por parte del sujeto a un patógeno particular.

Las composiciones de y procedimiento para construir polinucleótidos heterólogos para transformaciones con éxito son bien conocidos para los expertos en la materia y se pueden usar las mismas composiciones y procedimientos de construcción para producir los polinucleótidos útiles en el presente documento. La composición específica del polinucleótido no es fundamental para la presente invención y la invención no es dependiente de la composición del polinucleótido de transformación específico usado. En la técnica son bien conocidos componentes adecuados del polinucleótido incluyendo promotores, secuencias de poliadenilación, señales de terminación, señales de corte y empalme, marcadores seleccionables, genes informadores, potenciadores, replicones virales, intrones y secuencias plasmídicas bacterianas. Sambrook y col. (1989) proporcionan procedimientos adecuados para la construcción de polinucleótidos heterólogos.

Se pueden producir polinucleótidos mediante una serie de procedimientos conocidos. Por ejemplo, se puede insertar ADN que codifica un antígeno preseleccionado en un vector de expresión (véase, por ejemplo, Sambrook y col. (1989)). Con la disponibilidad de equipamiento automatizado de síntesis de ácidos nucleicos, se puede sintetizar ADN directamente cuando se conoce la secuencia de nucleótidos, o mediante una combinación de PCR, clonación y fermentación. Además, cuando la secuencia del polipéptido preseleccionado es conocida, se puede inferir una secuencia codificante adecuada para el polinucleótido.

Cuando el polinucleótido es ARNm, se puede preparar fácilmente a partir del ADN correspondiente in vitro. Por ejemplo, las técnicas convencionales usan polimerasas de ARN de fago SP6, T3 o T7 para preparar ARNm a partir de moldes de ADN en presencia de los ribonucleósidostrifosfato individuales. Se dispone un promotor de fago apropiado, tal como un sitio de origen de replicación T7 en el molde de ADN inmediatamente aguas arriba del gen que se va a transcribir. Los sistemas que usan T7 de esta forma son bien conocidos y están descritos en la bibliografía.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que, cuando se introduce en un individuo capaz de o en el que se ha inducido una respuesta inmune, induce una respuesta inmune en tal individuo a una proteína de VHC codificada a partir de la misma, en la que la composición comprende un polinucleótido que codifica y expresa uno o más antígenos/inmunógenos de VHC, en combinación con una o más timosinas \alpha. La respuesta inmunológica se puede usar terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad por anticuerpos o inmunidad celular tal como la que se origina a partir de CTL o células T CD4+.

Ejemplo 1

Construcción de plásmidos

Se usó como fuente de genes virales un plásmido designado como pBRTM/HCV1-3011 que cubría la totalidad el marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés) del VHC para clonarse en vectores de expresión (Grakoui y col., 1993). Se clonó por PCR la construcción pAp031-Ns5 después de insertar codones de inicio y parada modificados así como sitios de restricción enzimática usando los siguientes cebadores: para NS5, 5'-T CAG TCT AGA ATG TCC GGC TCC TGG CTA AGG GA-3' (XbaI) [ID SEC No. 1] y 5'-A GCT ACG CGT TCA CCG GTT GGG GAG GAG GT-3' (MluI) [ID SEC No. 2]. Después de la amplificación por PCR usando un sistema de PCR de alta fidelidad (Bochringer Mannheim, Indianápolis, IN), los fragmentos de ADNc se insertaron en el vector de expresión plasmídico pAp031 que contenía un elemento potenciador de virus de sarcoma de Rous y un promotor de CMV. Se transformaron las construcciones en células DH5\alpha y a continuación se purificó ADN plasmídico mediante 2x centrifugación en cloruro de cesio o con un kit Quiagen Giga usando el sistema de tampón Endofree (Santa Clara, CA). Se verificó la correcta inserción de ADNc que codificaban proteínas no estructurales mediante análisis de secuenciación usando procedimientos convencionales. Para establecer líneas celulares estables que expresasen NS5 como células diana para los ensayos de CTL, se clonaron también los fragmentos génicos que codificaban proteínas no estructurales en los vectores de expresión pcDNA3 y pcDNA3.1/Zeo(-) (Invitrogen, San Diego, CA) con un marcador seleccionable de neomicina. Se subclonó un fragmento XbaI y MluI NS5 en el sitio NheI/MluI del vector Litmus-38 (New England Biolabs, Beverly, MA), se cortó con EcoRI y SalI y se ligó en el sitio de clonación múltiple EcoRI/XhoI de pcDNA3 y pcDNA3.1/Zeo(-), respectivamente. Se ligó un fragmento HbaI y BamHI que contenía NS4 en Litmus-29 (New England Biolabs), recortado con KpnI y EcoRI, y a continuación se ligó en el vector pcDNA 3. Los plásmidos se designaron como pcDNA3.1/Zeo(-)-NS5. Se clonó el plásmido de expresión de ADN que codificaba IL-2 murina (pcD/3-Il2) y se purificó como se ha descrito anteriormente (Geissler y col., 1997a, 1997b, 1997c).

Inmunización genética

Para potenciar la captación celular de ADN plasmídico se inyectó en múltiples sitios del músculo cuadriceps de ratones Balb/c un total de 100 \mul de hupivacaína al 0,25%. Cuatro días después, se inyectaron las construcciones de plásmidos en la misma región en cinco sitios diferentes en un volumen final de 100 \mul de NaCl al 0,9%. Dos semanas después, se inyectó a los ratones en la pata contraria ADN plasmídico. Los ratones se sacrificaron diez días después de la última inmunización. Había tres grupos de ratones, conteniendo cada uno cinco animales. Grupo 1 = ratones inmunizados con 100 \mug de ADN de control; Grupo 2 = ratones inmunizados con 50 \mug de pAp031NS5 y 50 \mug de ADN de control; Grupo 3 = ratones inmunizados con 50 \mug de pAp031 NS5 y 50 \mug de ADN de control, y recibieron 5 \mug de timosina \alpha_{1} i.p. dos veces por semana. Los animales se inmunizaron tres veces con dos semanas de diferencia, y se realizaron estudios diez días después de la última inmunización.

Ensayo de proliferación de células T

Los ratones se anestesiaron con isoflurano (Aerrane, Anaquest, NJ), se extrajo sangre mediante punción retrobulbar y se recolectaron células del bazo. Se extrajeron las células sanguíneas mediante incubación en NH_{4}Cl al 8,3%/Tris 0,17 mol/l (pH 7,4) durante 10 minutos a 37º C. Las células del bazo se cultivaron por triplicado usando placas de fondo plano de 96 pocillos a 5 x 10 ^{5} células por placa en 100 \mul de solución completa (medio de Eagle modificado de Dulbecco, Mediatech, Washington, DC) que contenía SBF (Suero Bovino Fetal) al 10%. Las células del bazo fueron estimuladas con NS5 recombinante a diferentes concentraciones (1, 5, 10 \mug/ml). Finalmente se añadió 2-mercaptoetanol hasta una concentración final de 50 \mumol/l. Como un control para la especificidad antigénica se estimularon células efectoras con 10 \mug/ml de subunidad \beta recombinante de gonadotropina coriónica que es secretada a partir de la célula y se ha demostrado que es un potente inmunógeno de células T (Geissler y col., 1997d). Las células del bazo se estimularon durante 3 días. Después de añadir timidina-[^{3}H] (1 \muCi/pocillo), se incubaron las células durante 18 horas. Después de la recolección se midió la incorporación de timidina-[^{3}H] en el ADN. Fig. 3. La incorporación de radiactividad se corrigió respecto la actividad de fondo (\Delta cpm).

Ensayo de citotoxicidad

Se suspendieron células del bazo de ratones inmunizados en DMEM completo que contenía SBF al 10% y 50 \mumol/l de 2-mercaptoetanol; después las células se analizaron en cuanto a su actividad citotóxica 5 días después de la estimulación in vitro. Se añadió una vez IL-2 recombinante murina a una concentración de 5 U/ml y se cocultivaron células respondedoras (4 x 10^{7}) con 6,25 x 10^{6} células singénicas que expresaban de forma estable NS5 después del tratamiento con 20.000 rad. Se recolectaron poblaciones de linfocitos citotóxicos efectores después de 5 días de incubación. Se llevó a cabo un ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4 horas en una placa de fondo redondo de 96 pocillos usando como línea celular diana células SP2-NS5 marcadas con ^{51}Cr. Se llevaron a cabo ensayos de CTL con proporciones de linfocito efector:diana (L/T) de 1:10 y 1:100. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como:

\frac{\text{Liberación experimental - liberación espontánea}}{\text{Liberación máxima - liberación espontánea}}

La liberación experimental representa las cuentas medias por minuto liberadas por las células diana en presencia de células efectoras. La liberación total representa la radiactividad liberada después de la lisis total de las células diana con TritonX-100 al 5%. Fig. 4

La liberación espontánea representa la radiactividad presente en el medio derivada de células diana únicamente.

Análisis estadístico

Para comparar los resultados entre los diferentes grupos, se usó una prueba U no paramétrica de Mann-Whitney. Se consideró que p < 0,5 era estadísticamente significativo. Los números para los valores de P según las respuestas de células T CD4+ y CD8+ se derivan a partir de todas las concentraciones de NS5 recombinante usadas para la estimulación y las proporciones de E:T, respectivamente.

Los resultados mostrados en las figuras 3 y 4 demuestran la espectacular mejora de la respuesta inmune que se puede lograr mediante la coadministración de timosina \alpha en un tratamiento de inmunización basado en ADN. La coadministración de timosina \alpha aumentó la respuesta proliferativa de CD4 aproximadamente un 100% frente a las tres concentraciones de estímulo. Fig. 3. El porcentaje de citotoxicidad aumentó también en un 100% o más mediante la coadministración de timosina \alpha. Fig. 4.

Referencias

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United States Patent No. 5,620,896 (Herrmann, et al.)

United States Patent No. 5,830,876 (Weiner, et al.).

Claims

1. Uso de un polinucleótido que codifica uno o más péptidos de virus de la hepatitis C, junto con una o más timosinas \alpha, en la preparación de una combinación farmacéutica para inmunizar a un sujeto susceptible de infección por virus de la hepatitis C contra tal infección.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica una o más proteínas de la cubierta de virus de la hepatitis C.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica una o más proteínas de virus de la hepatitis C seleccionadas del grupo constituido por la proteína NS3, la proteína NS4A, la proteína NS4B, la proteína NS5A y la proteína NS5B.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que el polinucleótido codifica una o más proteínas NS5.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la timosina \alpha es timosina \alpha1.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la timosina está a una dosis de 0,001 mg/kg de peso corporal/día y 10 mg/kg de peso corporal/día.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que la timosina está a una dosis de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso corporal/día.

8. Una combinación farmacéutica para inmunizar a un sujeto susceptible de infección por virus de la hepatitis C contra tal infección, que comprende un polinucleótido que codifica uno o más péptidos de virus de la hepatitis C junto con una o más timosinas \alpha.

9. La combinación de la reivindicación 8, en la que el polinucleótido codifica una o más proteínas de la cubierta de virus de la hepatitis C.

10. La combinación de la reivindicación 8, en la que el polinucleótido codifica una o más proteínas de virus de la hepatitis C seleccionadas del grupo constituido por la proteína NS3, la proteína NS4A, la proteína NS4B, la proteína NS5A y la proteína NS5B.

11. La combinación de la reivindicación 10, en la que el polinucleótido codifica una o más proteínas NS5.

12. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en la que la timosina \alpha es timosina \alpha1.

13. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en la que la timosina está a una dosis de 0,001 mg/kg de peso corporal/día y 10 mg/kg de peso corporal/día.

14. La combinación de la reivindicación 13, en la que la timosina está a una dosis de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso corporal/día.