EA006743B1

EA006743B1 - Стимуляция тимозином генетической иммунизации

Info

Publication number: EA006743B1
Application number: EA200400534A
Authority: EA
Inventors: Джек Р. Уандс
Original assignee: Роуд Айлэнд Хоспитал
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2006-04-28
Also published as: MXPA04003867A; CY1107371T1; ES2299626T3; UA81613C2; EP1448223B1; BR0213554A; JP2005506997A; DE60224435D1; ATE382365T1; WO2003035010A3; IL161603A0; KR100902197B1; PL370453A1; DK1448223T3; CN1604789A; DE60224435T2; CA2464795A1; US20050054845A1; EP1448223A4; PT1448223E

Abstract

В изобретении описано применение α-тимозина для стимуляции клеточных иммунных ответов на вирус гепатита С. Описаны способы иммунизации индивидуума, чувствительного к инфекции, которая вызывается вирусом гепатита С, против указанной инфекции, отличающиеся тем, что индивидууму вводят один или несколько полинуклеотидов, кодирующих один или несколько пептидов вируса гепатита С, в сочетании с одним или несколькими тимозинами. Описаны также композиции для иммунизации против вируса гепатита С, которые содержат один или несколько полинуклеотидов, кодирующих один или несколько пептидов вируса гепатита С, в сочетании с одним или несколькими α-тимозинами.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент 60/330638, поданной 26 октября 2001 г.

Предпосылки создания изобретения

Хронический гепатит, который вызывается вирусом гепатита С (НСУ), представляет собой очень серьезную медицинскую проблему и приводит к хроническому заболеванию печени, циррозу и печеночно-клеточному раку. Предполагается, что в большинстве случаев вирус гепатита С является возбудителем приобретенного после перфузии гепатита. Несмотря на улучшение качества депо донорской крови и проведение тестирования крови доноров, после перфузии все еще часто встречаются случаи острой инфекции у людей. Хронический гепатит развивается, по меньшей мере, у половины пациентов, страдающих острой формой гепатита, вызываемого НСУ (примерно у 90% пациентов, страдающих гепатитом ни А, ни В (ВГНАНБ)), а цирроз развивается по меньшей мере у 20% представителей этой группы.

Для приостановления или замедления развития заболеваний, связанных с НСУ, был изучен целый ряд лекарственных средств. Современное стандартное лечение предусматривает применение интерферона альфа и рибавирина. Однако значительное количество пациентов нечувствительны к такому лечению. Было установлено, что генетическая иммунизация стимулирует широкий спектр клеточных иммунных ответов на структурные и неструктурные протеины НСУ. Однако с помощью нескольких моделей с использованием животных было установлено, что различные несущие НСУ конструкции обладают невысокой биологической активностью (ТокикЫде и др. (1996)).

Генетическая иммунизация является новой альтернативой применению традиционных основанных на использовании антигенов вакцин, таких как вакцины, включающие ослабленный вирус или субъединицы протеинов. При генетической иммунизации для иммунизации реципиента применяют «оголенную» ДНК. ДНК называют «оголенной» потому, что она не содержит никакого носителя для введения возбудителя инфекции, который может облегчать проникновение в клетку, такого как вирусные частицы. Когда вводят «оголенную» ДНК, организм реципиента может экспрессировать кодируемые плазмидной ДНК протеины, которые затем могут стимулировать специфический иммунный ответ, в котором принимают участие цитотоксические Т-клетки, Т-клетки-хелперы и антитела. Применение вакцин на основе ДНК устраняет необходимость в очистке патогена или иммунозащитного антигена для вакцинации и устраняет возможность реверсии вирулентности, поскольку ДНК кодирует индивидуальный вирусный протеин.

Применение для иммунизации полинуклеотидов имеет многочисленные преимущества. Например, иммунизацию клеток можно осуществлять с использованием любого антигена, кодируемого полинуклеотидом. Кроме того, колируемые полинуклеотидами антигены экспрессируются как «чистые» антигены в их нативном состоянии и подвержены обычным модификациям в клетке-хозяине. Полинуклеотиды также легко подвергать не дорогостоящим манипуляциям, и они стабильны в составе безводного продукта или в растворе в широком диапазоне температур. Таким образом, эта технология имеет большое значение для разработки высокоэффективных субъединичных вакцин.

Вызванный гуморальный и/или клеточно-опосредованный (клеточный) иммунный ответ может обеспечивать защиту или защитный иммунитет против инфекции, вызываемой патогенными агентами, такими как бактерии, вирусы и эукариотические организмы (например, паразиты). Затем защитные гуморальные и/или клеточные иммунные ответы оказывают воздействие на инфективность или активность патогена или ограничивают его распространение или рост, что приводит к защите от последующего заражения патогеном. Иммунный ответ может также обеспечивать защиту от заболеваний или нарушений, которые связаны с клетками, продуцирующими специфические протеины.

При оценке в опытах на различных животных установлено, что генетическая иммунизация посредством внутримышечной инъекции является эффективной в отношении многих вирусов (например, иммунизация морских свинок против инфекции, вызываемой вирусом герпеса простого (Н8У) типа 2 (Войте и др. (1996)); иммунизация мышей против вируса гриппа (Би и др. (1997)); вакцинация цыплят против вирусов гриппа (КобШаШ и др. (1997)); и млекопитающих и птиц против ротавирусов (Неггтапп и др. и.8. 5620896)). ИайекЫа с соавторами (1997) описали, что одна обработка роговицы животных, пораженной герпетическим стромальным кератитом, «оголенной» ДНК, кодирующей 1Ь-1, приводила к уменьшению повреждений у животных, вызывая ремиссию повреждений. Обсуждение генетической иммунизации в целом и ее применение см., например, в И8 5830876 (ХУешег и др.).

Было установлено, что представители класса полипептидов-иммуномодуляторов тимусного происхождения, т. е. тимозины, запускают процессы, связанные с созреванием лимфоцитов, стимулируют Тклеточную функцию и усиливают восстановление иммунных дефектов. Тимозин αι (ΤΒΝαι) представляет собой состоящий из 28 аминокислот кислотный полипептид с молекулярной массой 3100, который обладает выраженной иммунологической активностью, такой как стимуляция производства α- и γинтерферонов, повышение производства фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, индукция экспрессии Т-клеточных маркеров, рецепторов 1Ь-2 и повышение активности Т-клеток-хелперов. Выделение, характеристики и применение ΤΉΝα₁ описаны, например, в И8 4079127.

- 1 006743

Для лечения хронического гепатита, вызываемого НСУ, в качестве монотерапии применяют различные антивирусные агенты, такие как ацикловир, видарабин и аденинарабинозид. Монотерапия с использованием указанных антивирусных агентов, как правило, является неэффективной либо из-за высокой токсичности агента, либо из-за того, что агент сначала вызывает некоторое ингибирование репликации вируса, но не может поддерживать ингибирование репликации вируса в течение длительного времени (см., например, Л1ехалбег и др. (1988)).

Таким образом, сохраняется необходимость в разработке лечения опосредуемых НСУ заболеваний, которое сочетало бы эффективность в отношении вируса с меньшими побочными действиями, вызывало модуляцию ответов иммунной системы и приводило к снижению частоты рецидивов.

Краткое изложение сущности изобретения

В изобретении описано применение α-тимозина для стимуляции СЭ4+ - и СО8+-клетками иммунных ответов на иммуногенные пептиды НСУ, предпочтительно на протеин N85 НСУ. Стимуляция клеточных иммунных ответов на вирусные и клеточные протеины представляет собой трудную задачу. В изобретении описано применение ίη νΐνο α-тимозина для резкого усиления цитотоксического и пролиферативного Т-клеточных ответов на эпитопы протеинов НСУ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения тимозин представляет собой тимозин α₁. Сами по себе вакцины, основой которых является ДНК, представляют собой новую технологию и поэтому отличаются от ранее известных типов вакцинации (так, все вакцины, основой которых являются протеины, пептиды или убитые вирусы, вызывают гуморальный или опосредуемый антителом иммунитет, в то время как вакцины на основе ДНК обусловливают клеточный иммунитет), а тот факт, что α-тимозин повышает эффективность вакцины, обеспечивает новое и неожиданное преимущество при применении вакцин на основе ДНК для лечения и профилактики связанных с НСУ заболеваний.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано схематическое изображение механизма иммунизации с использованием вакцины на основе ДНК; на фиг. 2 - схематическое изображение генома вируса гепатита С (НСУ); на фиг. 3 - воздействие совместного введения 5 мкг тимозина α₁ (ί.ρ.) и кодирующего N85 полинуклеотида на Тклеточную пролиферацию при использовании трех концентраций для контрольного заражения (0,1, 0,5 и 1 мкг); на фиг. 4 - воздействие совместного введения 5 мкг тимозина α₁ (ί.ρ.) и кодирующего N85 полинуклеотида на цитотоксическую реакцию при двух соотношениях лимфоцит-эффектор/мишень (Ь/Т).

Подробное описание изобретения

В изобретении описано применение α-тимозина в сочетании с основанной на использовании ДНК или «генетической» иммунизацией для резкого усиления клеточных иммунных ответов на НСУ. Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является стимуляция вакцин на основе ДНК с помощью тимозина α₁ (тималфасин). Изобретение может найти широкое применение для разработки профилактических и терапевтических вакцин и для значительного усиления клеточных иммунных ответов на вирусные и клеточные протеины после основанной на применении ДНК иммунизации. Полинуклеотид, кодирующий иммуногенный пептид, полипептид или протеин НСУ вводят непосредственно животному ίη νΐνο в сочетании с одним или несколькими α-тимозинами. Полинуклеотид кодирует полипептид, несущий по меньшей мере один эпитоп иммуногенного протеина НСУ, который является мишенью. Полинуклеотид экспрессируют с использованием клеток индивидуума для получения иммуногенных протеинов-мишеней, которые вызывают иммунный ответ широкого спектра против НСУ. Геном НСУ кодирует два протеина оболочки (Е1 и Е2) и шесть структурных протеинов (N82, N83, Ν84Α, Ν84Β, Ν85Α и Ν85Β) (фиг. 2). Согласно настоящему изобретению можно использовать полинуклеотиды, которые кодируют любой из этих вирусных протеинов или их комбинации или фрагменты. Под объем изобретения подпадают нативный (т.е. встречающийся в естественных условиях) α-тимозин, а также синтетический α-тимозин и рекомбинантный α-тимозин, которые имеют аминокислотную последовательность нативных α-тимозинов, аминокислотные последовательности, практически аналогичные ей, или полученные из нее укороченные последовательности и их биологически активные аналоги, имеющие последовательности, которые несут замены, делеции, удлинения, замещения или другие модификации, и активность которых практически аналогична активности нативного α-тимозина. Предпочтительный тимозин представляет собой тимозин «1.

Выделение, характеристики и применение α-тимозина описаны, например, в И8 4079127, И8 4353821, и8 4148788 и И8 4116951. Количество α-тимозина, необходимое для того, чтобы вызывать требуемую степень стимуляции действия вакцины на основе ДНК, можно определять с помощью стандартных экспериментов по типу «доза-титрование». Было установлено, что α-тимозин безопасен для людей при введении в дозах до 16 мг/кг веса тела/день. Предпочтительная доза α-тимозина составляет от 0,001 до 10 мг/кг веса тела/день, причем наиболее предпочтительной является доза примерно 0,02 мг/кг веса тела/день.

Полинуклеотидные последовательности, предлагаемые в изобретении, представляют собой последовательности ДНК или РНК, которые кодируют антигенные/иммуногенные полипептиды НСУ, функ

- 2 006743 ционально связанные с регулирующими транскрипцию последовательностями. Эти последовательности можно применять в сочетании с другими полинуклеотидными последовательностями, которые кодируют регуляторные протеины, контролирующие экспрессию этих полипептидов. Регуляторный протеин может действовать путем связывания с геномной ДНК таким образом, чтобы регулировать ее транскрипцию; в другом варианте он может действовать путем связывания с матричной РНК, повышая или понижая ее стабильность или эффективность трансляции.

Понятие «функционально связаны с регулирующими транскрипцию и трансляцию последовательностями» обозначает, что кодирующая полипептид последовательность и минимальные контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности связаны таким образом, чтобы обеспечивать экспрессию полипептида, когда соответствующие молекулы (например, протеины-активаторы транскрипции) связаны с регуляторной(ыми) последовательностью(ями). Полинуклеотид функционально кодирует полипептид, когда он несет всю генетическую информацию, необходимую для экспрессии в клеткемишени, такую как промоторы и т.п. Понятия «промотор» или «промоторная последовательность» в контексте настоящего описания относится к минимальной последовательности, достаточной для контроля транскрипции. Полинуклеотидная последовательность ДНК, как правило, ограничена сайтом инициации и сайтом терминации, т.е. представляет собой единицу транскрипции ДНК, и транскрибируется с образованием первичного транскрипта.

Полинуклеотидный продукт, введенный в клетки ίη νίνο, может иметь любое количество форм, и настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным полинуклеотидом, кодирующим какойлибо конкретный полипептид НСУ, хотя полинуклеотиды, кодирующие протеин N85 или его фрагмент, являются предпочтительными. Плазмиды, содержащие гены, которые кодируют антигены или иммуногены НСУ, описаны в литературе и специалисты в данной области легко могут их получать (см., например, ТокшЫде и др., 1996).

Полинуклеотид может кодировать один или несколько антигенов, таких как антигены из двух или большего количества различных вирусных протеинов. В альтернативном варианте полинуклеотид может содержать две или большее количество различных последовательностей ДНК, при этом одна последовательность кодирует антиген, а другая(ие) кодирует(ют) полипептиды, которые могут обладать или могут не обладать антигенными свойствами. Например, вектор может кодировать два (или большее количество) антигена НСУ. Согласно другому варианту осуществления изобретения другой(ие) полипептид(ы) может(гут) способствовать усилению иммунного ответа против НСУ (например, эпитопы-хелперы, цитокины, полипептиды-носители, субъединицы холерного токсина или другие иммуностимуляторы).

Полинуклеотид дополнительно может быть встроен в вектор, который несет последовательности для экспрессии полинуклеотида. Когда в одном векторе присутствуют две или большее количество кодирующих полипептиды последовательностей ДНК, то транскрипция каждой кодирующей антиген последовательности ДНК может находиться под контролем ее собственного промотора для экспрессии двух или большего количества не слитых полипептидов. В другом варианте один промотор может контролировать экспрессию двух или большего количества кодирующих антиген последовательностей ДНК, слитых в рамке считывания друг с другом, для экспрессии слитого протеина. Применяемые в этих методах полинуклеотиды могут представлять собой последовательности, не интегрированные в геном клеткихозяина. Они могут представлять собой нереплицирующиеся последовательности ДНК или специфические реплицирующиеся последовательности, сконструированные с помощью методов генной инженерии таким образом, чтобы у них отсутствовала способность к интеграции в геном. Полинуклеотид можно вводить пациенту в присутствии адъювантов или других субстанций, которые могут повышать способность нуклеиновой кислоты к проникновению или повышать рекрутмент клеток иммунной системы в области инокуляции. Следует отметить, что сам полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине с помощью факторов транскрипции, присущими клетке-хозяину или единице транскрипции ДНК.

Согласно способам, предлагаемым в изобретении, в клетки для получения в них продукта трансляции в виде полипептида можно вводить как экспрессируемую ДНК, так и мРНК. Если нуклеиновые кислоты содержат соответствующие контролирующие последовательности, то они должны обеспечивать синтез относительно больших количеств кодируемого протеина.

Дозу иммуногенного полипептида легко может определить практикующий врач или ветеринар с использованием в качестве моделей животных или других систем для тестирования, которые хорошо известны в данной области. Композиции должны содержать эффективное количество ДНК в водном растворе. Подлежащее введению количество ДНК зависит от таких факторов, как возраст, вес и физиологическое состояние индивидуума, подлежащего вакцинации. Количество ДНК зависит также от способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела и от уровня требуемой защиты. Эффективные дозы может легко определить специалист в данной области с помощью обычных опытов, необходимых для построения графиков зависимости ответа от дозы. Предпочтительная доза составляет от 1 мкг/кг веса тела до 1 мг/кг веса тела индивидуума. Индивидуума можно иммунизировать путем однократного введения ДНК или с помощью нескольких введений. Несколько введений может потребоваться для поддержания состояния иммунитета индивидуума к конкретному патогену.

Композиции гетерологичных полинуклеотидов и метод их конструирования для успешной транс

- 3 006743 формации хорошо известны специалисту в данной области, и такие композиции и методы можно применять для получения полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении. Конкретная композиция полинуклеотидов не имеет решающего значения для настоящего изобретения, и изобретение не зависит от композиции конкретных применяемых для трансформации полинуклеотидов. Приемлемые компоненты полинуклеотида, такие как промоторы, последовательности для полиаденилирования, сигналы терминации, сигналы сплайсинга, селектируемые маркеры, репортерные гены, энхансеры, вирусные репликоны, интроны и бактериальные плазмидные последовательности, хорошо известны в данной области. У 8атЬгоок с соавторами (1989) описаны приемлемые методы конструирования гетерологичных полинуклеотидов.

Полинуклеотиды можно получать с помощью целого ряда известных методов. Например, ДНК, кодирующую предварительно отобранный антиген, можно встраивать в экспрессионный вектор (см., например, 8атЬгоок и др. (1989)). При наличии оборудования для автоматического синтеза нуклеиновых кислот ДНК можно синтезировать непосредственно, если нуклеотидная последовательность является известной, или с помощью сочетания методов ПЦР, клонирования и ферментации. Кроме того, если последовательность предварительно отобранного полипептида является известной, то можно предсказать приемлемую кодирующую последовательность полинуклеотида.

Когда полинуклеотид представляет собой мРНК, то ее легко можно получать ίη уйго из соответствующей ДНК. Например, согласно общепринятым методикам фаговые РНК-полимеразы 8Р6, Т3 или Т7 применяют для получения мРНК на ДНК-матрице в присутствии индивидуальных рибонуклеозидтрифосфатов. Соответствующий промотор фага, такой как сайт инициации репликации фага Т7, помещают в ДНК-матрице непосредственно против хода транскрипции подлежащего транскрибированию гена. Системы, основанные на таком применении фага Т7, хорошо известны и описаны в литературе.

Еще одним объектом изобретения является иммунологическая композиция, которая после ее интродукции в организм индивидуума, который обладает способностью или должен индуцировать иммунный ответ, индуцирует иммунный ответ у такого индивидуума на кодируемый этой композицией протеин НСУ, причем композиция содержит полинуклеотид, который кодирует и экспрессирует один или несколько антигенов/иммуногенов НСУ, в сочетании с одним или несколькими α-тимозинами. Иммунный ответ можно применять в терапевтических или профилактических целях и можно применять для формирования связанного с антителами иммунитета или клеточного иммунитета, обусловленного, например, ЦТЛ (цитотоксическими Т-лимфоциты) или СЭ4+-Т-клетками.

Пример 1. Конструирование плазмид.

В качестве источника вирусных генов плазмиду, обозначенную как рВКЛМ/НСУ1-3011, несущую полноразмерную открытую рамку считывания (ОРС) НСУ, применяли для клонирования в экспрессионных векторах (Сгакош и др., 1993). Конструкцию рАр031-№5 клонировали с помощью ПЦР после встраивания созданных стартового и стоп-кодонов, а также сайтов, распознаваемых рестриктазами, с использованием следующих праймеров для N85: 5'-Т САС ТСТ АСА АТС ТСС ССС ТСС ТСС СТА АСС СА-3' (ХЬа1) |8ЕС ГО Νθ. 1] и 5'-А ССТ АСС ССТ ТСА ССС СТТ ССС САС САС СТ-3' (М1и1) |8ЕС ГО Νθ. 2]. После ПЦР-амплификации с использованием обеспечивающей высокую точность ПЦРсистемы (фирма Воейгшдег Маппйе1т, Индианаполис, шт. Индиана), фрагменты кДНК встраивали в плазмидный экспрессионный вектор рАр031, содержащий энхансерный элемент вируса саркомы Рауса и промотор СМУ. Конструкциями трансформировали клетки линии ЭН5а и плазмидную ДНК затем очищали либо двукратным центрифугированием в хлориде цезия, либо с помощью набора С1адеп С1да с использованием буферной системы Эндофри (ЕпйоЕгее) (Санта Клара, шт. Калифорния). Правильность инсерции кДНК, кодирующих неструктурные протеины, подтверждали секвенированием с использованием стандартных методов. Для создания линий клеток, стабильно экспрессирующих N85, которые использовали в качестве клеток-мишеней для анализов ЦТЛ, генные фрагменты, кодирующие неструктурные протеины, клонировали также в экспрессионных векторах ροΩΝΛ3 и рс^NА3.1/Ζео(-) (фирма 1пуйгодеп, Сан-Диего, шт. Калифорния) с использованием неомицина в качестве селектируемого маркера. ХЬа1- и М1и1-фрагмент N85 субклонировали в сайте М1е1/М1и1 вектора Ьйти5-38 (фирма №\ν Епд1апй Вю1аЬз, Беверли, шт. Массачусетс), расщепляли с помощью ЕеоК1 и 8а11 и встраивали путем лигирования в множественный сайт клонирования векторов ЕсоШ/ХМ рс^NА3 и рс^NА3,I/Ζео(-) соответственно. НЬа1- и ВатН1-фрагмент, содержащий N84, встраивали путем лигирования в вектор Ьйти5-29 (фирма №\ν Епд1а пй Вю1аЬз), повторно расщепляли с помощью Крп1 и ЕсоКЙ, и затем встраивали путем лигирования в вектор рс ^NА3. Плазмиды были обозначены как рс^NА3.1/Ζео(-)-N85. Экспрессирующую ДНК плазмиду, кодирующую мышиный 1Ь-2 (рсЭ/3-112), клонировали и очищали с помощью описанных ранее методов (Се15з1ег и др., 1997а, 1997б, 1997в).

Генетическая иммунизация.

Для повышения проникновения в клетку плазмидной ДНК в несколько областей на четырехглавой мышце мышей линии Ва1Ь/с инъецировали всего 100 мкл 0,25% гупивакаина (1шр1уасаше). Через 4 дня плазмидные конструкции инъецировали в эту же область в 5 различных мест в конечном объеме 100 мкл 0,9% №С1. Через 2 недели мышей подвергали бустер-инъекции, вводя в противоположную ногу плаз

- 4 006743 мидную ДНК. Через 10 дней после последней иммунизации мышей умерщвляли. Для опыта использовали три группы мышей по 5 особей в каждой. Группа 1 - мыши, которых иммунизировали 100 мкг ДНКимитатора; группа 2 - мыши, которых иммунизировали 50 мкг ρΑρ031Ν§5 и 50 мкг ДНК-имитатора; группа 3 - мыши, которых иммунизировали 50 мкг рАр031 N85 и 50 мкг ДНК-имитатора и которым вводили 5 мкг тимозина α.| (ί.ρ.) дважды в неделю. Животных иммунизировали три раза через 2 недели и исследования проводили через 10 дней после последней иммунизации.

Анализ Т-клеточной пролиферации.

Мышей анестезировали изофлураном (фирма Аеггапе, Анаквест, шт. Нью-Джерси), брали кровь с помощью ретробульбарной пункции и собирали клетки селезенки. Эритроциты удаляли инкубацией в 8,3% ΝΗ·|ί.Ί/0.17 моля/л Трис (рН 7,4) в течение 10 мин при 37°С. Клетки селезенки культивировали в трех повторностях с использованием 96-луночных плоскодонных планшетов с плотностью 5х10⁵ клеток на лунку в 100 мкл полной среды (модифицированной по способу Дульбекко среды Игла, фирма Меб1а1ес1г Вашингтон, федеральный округ Колумбия), содержащей 10% ФТС. Клетки селезенки стимулировали рекомбинантным N85 в различных концентрациях (1; 5; 10 мкг/мл). И, наконец, добавляли 2меркаптоэтанол до конечной концентрации 50 мкмолей/л. В качестве контроля антигенной специфичности эффекторные клетки стимулировали 10 мкг/мл рекомбинантной β-субъединицы человеческого хорионического гонадотропина, который секретируется из клетки и, как было установлено, является сильным Т-клеточным иммуногеном (Ое1зз1ег, и др., 1997г). Клетки селезенки стимулировали в течение 3 дней. После добавления [³ Н]-тимидина (1 мкКи /лунку) клетки инкубировали в течение 18 ч. Включение [³Н]-тимидина в ДНК оценивали после сбора (фиг. 3). Включение радиоактивности корректировали с учетом фоновой активности (Δ срт (число импульсов в мин)).

Анализ цитотоксичности.

Клетки селезенки из организма иммунизированных мышей суспендировали в полной среде ЭМЕМ, содержащей 10% ФТС и 50 мкмолей/л 2-меркаптоэтанола; затем через 5 дней после стимуляции ίη νίίτο клетки анализировали в отношении цитотоксической активности. Добавляли рекомбинантный мышиный 1Ь-2 в виде одной порции в концентрации 5 ед./мл и клетки-респондеры (4х10⁷ ) совместно культивировали с 6,25 х10⁶ сингенных клеток, стабильно экспрессирующих N85 после обработки 20000 рад. Популяции цитотоксических эффекторных лимфоцитов собирали после 5-дневной инкубации. В течение 4 ч в 96-луночных круглодонных планшетах осуществляли анализ высвобождения ⁵¹ Сг, используя в качестве клеток-мишеней меченную с помощью ⁵¹Сг линию 8Ρ2-Ν8. ЦТЛ-анализы осуществляли при соотношениях лимфоцитов-эффекторов:клеток-мишеней (Ь/Т) 1:10 и 1:100. Цитотоксичность (в процентах) оценивали следующим образом:

Высвобождение в эксперименте - спонтанное высвобождение

Максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение

Высвобождение в эксперименте обозначает среднее количество импульсов в минуту, которые высвобождаются клетками-мишенями в присутствии клеток-эффекторов. Общее высвобождение обозначает радиоактивность, которая высвобождается после общего лизиса клеток-мишеней 5% ΤπΐοηΧ-100 (фиг. 4).

Спонтанное высвобождение обозначает присутствующую в среде радиоактивность, полученную только из клеток-мишеней.

Статистический анализ.

Для сравнения результатов, полученных для различных групп, применяли непараметрический Икритерий Манна-Уитни. Значение Р<0,05 рассматривали как статистически значимое. Значения Р для СЭ4+- и СЭ8+- Т-клеточных ответов выводили из результатов, полученных при использовании всех концентраций рекомбинантного N85, которые применяли для стимуляции, и соотношений Ь:Т соответственно.

Результаты, представленные на фиг. 3 и 4, демонстрируют очень резкое усиление иммунного ответа, которое можно достигать при введении α-тимозина одновременно с иммунизацией вакциной на основе ДНК. Одновременное введение α-тимозина увеличивало пролиферацию СΌ4-клеток примерно на 100% по сравнению с результатами, полученными при использовании трех концентраций, применяемых для контрольного заражения (фиг. 3). При одновременном введении α-тимозина процент цитотоксичности также увеличивался на 100% или более (фиг. 4).

Ссылки

А1ехапбег О.1.М. и др., Ашепсап 1. Меб. 85-2А,1988, сс.143-146.

Войте К, Ь.В. 81апЬепу, Ό.Ι. Ветз1еш, Ό. Ье\\'. ^NΑ ίιηιηιιπίζαΐίοη адатз! ехрептеп1а1 депба1 йегрез З1тр1ех νίιυδ шГесйоп, 1. 1пГес1. Όίδ. 173, 1996, сс. 800-807.

Эайез1иа М., N. Кик1ш, 8. Капапда!, Е. Машскап, В.Т. Воизе. 8ирргезз1оп оГ опдотд оси1аг тПатта1огу б1зеазе Ьу 1орка1 абтйизПакоп оГ р1азт1б ^NΑ епсобтд ΙΠ-10, 1. 1ттипо1. 159,1997, сс. 1945-1952.

Ей Т.М., А. Епебтап 1.В. И1тег М.А. Ьш 1.1. Эоппе1у. РгсТесОте се11и1аг 1ттиш1у: су!о1охк Т1утрйосу1е гезропзез адатз! бот1пап1 апб гесеззте ерйорез оГ тПие^а νίιυδ пис1еорго!ет шбисеб Ьу ^NΑ ^ттишζаί^οη, 1. У1го1. 71, 19967, сс. 12715-2721.

Сгакот А., \Уусйо\\'зк| С, Ьт С, Еетз!опе 8.М., В1се СМ. Ехргеззюп апб 1беп!1Г1са11оп оГ йераккз С

- 5 006743

У1Ш8 ро1урго1с1п с1еауаде ргойис!з. к У1го1., 67, 1993, сс. 1385.

Се1зз1ег М., ТокизЫде К., Уапйз кВ Се11и1аг апй 11итога1 1ттипе гезропзе 1о Нераййз В тпиз з!гис1ига1 рго!етз ίη писе Го11о\утд ΌΝΑ-Ьазей титпихаРоп Саз1гоейего1оду, 112, 1997а, сс. 1307-1320.

Се1зз1ег М., Сез1еп А., ТокизЫде К., Уапйз кВ. Епйапсетей оГ се11и1аг апй Нитога1 1ттипе гезропзез 1о йера1Ыз С тпиз (НСУ) соге рго1еш пз1пд ΟΝΑ-Ьазей тассшез аидтейей \νίΐ1ι су1окше ехргеззшд р1аз1шйз. 1. 1ттипо1. 258, 19976, сс. 1231-1237.

Се1зз1ег М., Сезюп А., Уапйз ЕВ. . СНгойс е!йапо1 еГГейз оп се11и1аг 1ттипе гезропзез 1о йераНгз В У1гиз епуе1оре рго1еш; ап 1ттипо1од1с тескашзт Гог тйисйоп оГ регз1з1еп1 νίπ·ι1 шГейюп ίη а1сойойсз. Нера1о1оду 26, 1997в., сс. 764-770.

Се1зз1ег М., Уапйз С., Сез1еп А., йе 1а Мойе 8., Ве11е1 Ό., Уапйз 1.В. СепеОс 1ттишха0оп \νίΐ1ι (Не Ггее Нитап сНопошс допайо!горт Р-зиЬиш1 еПсНз су!о1ох1с Т 1утр1юсу1е гезропзез апй рго1ес1з адатз! 1итог ГогтаОоп ш тке. ЬаЬ. 1пуез1. 76, 1997г., сс. 859-871.

КойШаШ 8., кВ. Науез, Н.Ь. ВоЬшзоп, В.С. \УеЬз1ег. Сгозз-рго1есИоп атопд 1е(На1 Η5Ν2 тПиепха νίгизез шйисей Ьу ΌΝΑ тассте 1о Не йетаддййшп, 1. У1го1. 71, 1997, сс. 3391-3396.

8атЬгоок и др., Мо1еси1аг с1ошпд, а 1аЬога1огу тапиа1, 2-е изд. Со1й 8рппд НагЬог Ргезз (1989).

ТокизЫде и др. Ехргеззюп апй 1ттипе гезропзе 1о НераООз С тйнз соге ΌΝΑ-Ьазей тассте, Нера1о1оду 24, 1996, сс. 14-20.

Патент И8 № 4079127 (на имя Со1йз1ет и др.).

Патент И8 № 4116951 (на имя Уапд).

Патент И8 № 4148788 (на имя Уапд).

Патент И8 № 4353821 (на имя Вит и др.).

Патент И8 № 5620896 (на имя Неггтапп и др.).

Патент И8 № 5830876 (на имя ХУетег и др.).

Claims

1. Способ иммунизации индивидуума, чувствительного к инфекции, которая вызывается вирусом гепатита С, против указанной инфекции, отличающийся тем, что индивидууму вводят полинуклеотид, который кодирует один или несколько пептидов вируса гепатита С, в сочетании с одним или несколькими α-тимозинами.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полинуклеотид кодирует один или несколько протеинов оболочки вируса гепатита С.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что полинуклеотид кодирует один или несколько протеинов вируса гепатита С, выбранных из группы, включающей протеин N83, протеин Ν84Α, протеин Ν84Β, протеин Ν85Α и протеин Ν85Β.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что полинуклеотид кодирует один или несколько протеинов Ν85.

5. Способ по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что α-тимозин представляет собой тимозин α₁.

6. Способ по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что тимозин вводят в дозе от 0,001 до 10 мг/кг веса тела/день.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что тимозин вводят в дозе примерно 0,02 мг/кг веса тела/день.

8. Применение полинуклеотида, кодирующего один или несколько пептидов вируса гепатита С, в сочетании с одним или более α-тимозинами для приготовления фармацевтической комбинации для иммунизации субъекта, восприимчивого к вирусу гепатита С, против этой инфекции.

9. Применение по п.8, где полинуклеотид кодирует один или несколько протеинов оболочки вируса гепатита С.

10. Применение по п.8, где полинуклеотид кодирует один или несколько протеинов вируса гепатита С, выбранных из группы, включающей протеин Ν83, протеин Ν84Α, протеин Ν84Β, протеин Ν85Α и протеин Ν85Β.

11. Применение по п.10, где полинуклеотид кодирует один или несколько протеинов Ν85.

12. Применение по одному из пп.8-11, где α-тимозин представляет собой тимозин α₁.

13. Применение по одному из пп.8-11, где тимозин вводят в дозе от 0,001 до 10 мг/кг веса тела/день.

14. Применение по п.13, где тимозин вводят в дозе примерно 0,02 мг/кг веса тела /день.

15. Фармацевтическая комбинация, включающая полинуклеотид, который кодирует один или несколько пептидов вируса гепатита С, в сочетании с одним или несколькими α-тимозинами.

16. Фармацевтическая комбинация по п.15, отличающаяся тем, что полинуклеотид кодирует один или несколько протеинов оболочки вируса гепатита С.

17. Фармацевтическая комбинация по п.15, отличающаяся тем, что полинуклеотид кодирует один или несколько протеинов вируса гепатита С, выбранных из группы, включающей протеин Ν83, протеин Ν84Α, протеин Ν84Β, протеин Ν85Α и протеин Ν85Β.

18. Фармацевтическая комбинация по п.17, отличающаяся тем, что полинуклеотид кодирует один или несколько протеинов Ν85.

- 6 006743

19. Фармацевтическая комбинация по одному из пп.15-18, отличающаяся тем, что α-тимозин представляет собой тимозин α₁.

20. Фармацевтическая комбинация по одному из пп.15-18, отличающаяся тем, что тимозин вводят в дозе от 0,001 до 10 мг/кг веса тела/день.

21. Фармацевтическая комбинация по п.20, отличающаяся тем, что тимозин вводят в дозе примерно 0,02 мг/кг веса тела /день.