JP2002528519A - 抗腫瘍効果を有する、抗原性タンパク質をコードしているｄｎａを含む医薬組成物 - Google Patents
抗腫瘍効果を有する、抗原性タンパク質をコードしているｄｎａを含む医薬組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
ここに提供されるのは、抗腫瘍Ａｇ−特異的免疫応答を誘導するための、腫瘍細胞中で過剰に発現されるタンパク質の断片をコードする１以上のＤＮＡ分子を含む、適当な賦形剤及びアジュバントと結合した医薬組成物である。
Description
【０００１】
本発明は、ヒトＭＵＣ−１をコードしている断片の配列を含むＤＮＡプラスミ
ド構築物のプール、及び該断片それ自体が、細菌性ＬａｃＩ断片に融合したヒト
ユビキチンからなるタンパク質をコードしている配列に先行されているＤＮＡプ
ラスミドのプールに関する。本発明は、さらに抗腫瘍ＤＮＡワクチンとしての使
用のための医薬組成物の調製におけるそれらの使用に関する。
ド構築物のプール、及び該断片それ自体が、細菌性ＬａｃＩ断片に融合したヒト
ユビキチンからなるタンパク質をコードしている配列に先行されているＤＮＡプ
ラスミドのプールに関する。本発明は、さらに抗腫瘍ＤＮＡワクチンとしての使
用のための医薬組成物の調製におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
本発明は、腫瘍の拒絶反応をもたらすことができる免疫応答の誘導又は活性化
に基づく抗腫瘍治療を提供する。このような考えの有効性は、最初の臨床試験結
果から証明される；例えば、癌胚抗原（ＣＥＡ）をコードしている配列を含むウ
イルス性ワクチンで処置した患者は、この抗原に対する免疫系活性化を示す（Ts
ang KY et al. J. Natl. Cancer. Inst. 87: 982, 1995）。
に基づく抗腫瘍治療を提供する。このような考えの有効性は、最初の臨床試験結
果から証明される；例えば、癌胚抗原（ＣＥＡ）をコードしている配列を含むウ
イルス性ワクチンで処置した患者は、この抗原に対する免疫系活性化を示す（Ts
ang KY et al. J. Natl. Cancer. Inst. 87: 982, 1995）。
【０００３】 免疫抗腫瘍応答の活性化は、４つの異なるアプローチ： ａ）それらがより免疫原性かつワクチンとして好ましくするための、患者の腫瘍
細胞のex vivoでの加工； ｂ）in vitro免疫応答の予備活性化をするための、患者の免疫細胞のex vivoで
の加工； ｃ）むき出しの又はリポソームカプセルに包まれた又はウイルス粒子に組み込ま
れた（レトロウイルス、アデノウイルス等）腫瘍関連抗原をコードしているＤＮ
Ａの接種； ｄ）アジュバントと接合又は混合された組換え又は合成の可溶性腫瘍抗原での処
置 を通じて達成され得る。
細胞のex vivoでの加工； ｂ）in vitro免疫応答の予備活性化をするための、患者の免疫細胞のex vivoで
の加工； ｃ）むき出しの又はリポソームカプセルに包まれた又はウイルス粒子に組み込ま
れた（レトロウイルス、アデノウイルス等）腫瘍関連抗原をコードしているＤＮ
Ａの接種； ｄ）アジュバントと接合又は混合された組換え又は合成の可溶性腫瘍抗原での処
置 を通じて達成され得る。
【０００４】 あらゆる単一の患者の細胞の加工からなる最初の２つのアプローチは、それら
がどうしても患者特異的である点で制限されているが、一方後者の２つは従来の
医薬と対比可能な生成物を得ることを目的としている。
がどうしても患者特異的である点で制限されているが、一方後者の２つは従来の
医薬と対比可能な生成物を得ることを目的としている。
【０００５】 該新規ワクチン接種法は新規技術の開発を反映している。持続性の抗体又は細
胞免疫応答を誘導するＤＮＡ露出ワクチンについての実験から得られた示唆は、
リンパ球集団を誘導する、従来の、ある特異的なペプチドからなるタンパク質サ
ブユニットワクチンを、時代遅れなものとする。露出ＤＮＡにコードされる、筋
肉内又は皮内注射されたタンパク質は、細胞毒特異的な反応並びにヘルパー応答
を誘導する。この強力な組合わせは、非常に効果的であるが、そこにある機構は
未だ完全には解明されていない。筋肉細胞は、クラスＩＭＨＣ抗原を低いレベル
のみで発現しており、そしてクラスII抗原又は共刺激性分子を発現していないら
しい。したがって、トランスフェクションされた筋肉細胞は、免疫応答自体の開
始においては重要な役割を果たしていることはありえない。最近のデータは、マ
クロファージ又は樹状細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、単球放出抗原の捕捉
及びそれに続く、クラスＩ及びクラスII分子の背景に関与するペプチドのプロセ
シング及び提示において基本的な役割を果たしていること、すなわち、抗体反応
の誘導における、細胞毒活性でのＣＤ＋細胞の活性化並びにＢリンパ球と協働す
るＣＤ４＋細胞の活性化を誘導していることを示している（Corr M et al J. EX
P. Med. 184: 1555, 1996）(Tighe, H. et al. Immunology Today 19:89, 1998)
。
胞免疫応答を誘導するＤＮＡ露出ワクチンについての実験から得られた示唆は、
リンパ球集団を誘導する、従来の、ある特異的なペプチドからなるタンパク質サ
ブユニットワクチンを、時代遅れなものとする。露出ＤＮＡにコードされる、筋
肉内又は皮内注射されたタンパク質は、細胞毒特異的な反応並びにヘルパー応答
を誘導する。この強力な組合わせは、非常に効果的であるが、そこにある機構は
未だ完全には解明されていない。筋肉細胞は、クラスＩＭＨＣ抗原を低いレベル
のみで発現しており、そしてクラスII抗原又は共刺激性分子を発現していないら
しい。したがって、トランスフェクションされた筋肉細胞は、免疫応答自体の開
始においては重要な役割を果たしていることはありえない。最近のデータは、マ
クロファージ又は樹状細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、単球放出抗原の捕捉
及びそれに続く、クラスＩ及びクラスII分子の背景に関与するペプチドのプロセ
シング及び提示において基本的な役割を果たしていること、すなわち、抗体反応
の誘導における、細胞毒活性でのＣＤ＋細胞の活性化並びにＢリンパ球と協働す
るＣＤ４＋細胞の活性化を誘導していることを示している（Corr M et al J. EX
P. Med. 184: 1555, 1996）(Tighe, H. et al. Immunology Today 19:89, 1998)
。
【０００６】 さらに、サイトカインの使用は、ＤＮＡでの免疫感作に由来する治療的効果を
改善することが知られている。Irvine et al., J. Immunol. 156: 238, 1996に
報告されているように、サイトカインは、外来のタンパク質の形成において処理
され得る。１つの別法的アプローチは、該腫瘍抗原又は望ましいサイトカインを
コードするプラスミドの同時接種によって、すなわちサイトカインをin situで
産生させることによって代表される（Kim JJ et al. Immunol 158: 816, 1997）
。
改善することが知られている。Irvine et al., J. Immunol. 156: 238, 1996に
報告されているように、サイトカインは、外来のタンパク質の形成において処理
され得る。１つの別法的アプローチは、該腫瘍抗原又は望ましいサイトカインを
コードするプラスミドの同時接種によって、すなわちサイトカインをin situで
産生させることによって代表される（Kim JJ et al. Immunol 158: 816, 1997）
。
【０００７】 本発明の活性免疫感作アプローチは、ＤＮＡベクターの、腫瘍細胞において過
剰発現されるＭＵＣ−１ヒト抗原又は多型性上皮ムチン（ＰＥＭ）に対するワク
チンとしての使用に基づいている。ＭＵＣ−１は、上皮内腔表面糖タンパク質で
ある（Patton S. et al. BBA 1241:407, 1995）。細胞形質転換プロセスにおい
て、この糖タンパク質は、先端局在化を失い、その発現レベルは劇的に増大する
。該タンパク質の機能は、例えば哺乳類の腺、卵巣、子宮内膜、結腸、胃、すい
臓、膀胱、腎臓等における内腔表面の保護からなる。グリコシル化の欠点は、腫
瘍細胞関連ＭＵＣ−１を正常細胞関連ＭＵＣ−１と、抗原的に異なるものにする
ことであると報告されている。この現象は、腫瘍ＭＵＣ−１を、正常細胞で発現
したＭＵＣ−１では通常糖部分によってマスクされている抗原エピトープを露出
させてしまう。この特徴が、腫瘍ＭＵＣ−１を、腫瘍特異的抗体反応の誘導にお
いて特に興味深いものにしている（Apostolopoulos V. et al. Crit. Rev. Immu
nol. 14:293, 1994）。
剰発現されるＭＵＣ−１ヒト抗原又は多型性上皮ムチン（ＰＥＭ）に対するワク
チンとしての使用に基づいている。ＭＵＣ−１は、上皮内腔表面糖タンパク質で
ある（Patton S. et al. BBA 1241:407, 1995）。細胞形質転換プロセスにおい
て、この糖タンパク質は、先端局在化を失い、その発現レベルは劇的に増大する
。該タンパク質の機能は、例えば哺乳類の腺、卵巣、子宮内膜、結腸、胃、すい
臓、膀胱、腎臓等における内腔表面の保護からなる。グリコシル化の欠点は、腫
瘍細胞関連ＭＵＣ−１を正常細胞関連ＭＵＣ−１と、抗原的に異なるものにする
ことであると報告されている。この現象は、腫瘍ＭＵＣ−１を、正常細胞で発現
したＭＵＣ−１では通常糖部分によってマスクされている抗原エピトープを露出
させてしまう。この特徴が、腫瘍ＭＵＣ−１を、腫瘍特異的抗体反応の誘導にお
いて特に興味深いものにしている（Apostolopoulos V. et al. Crit. Rev. Immu
nol. 14:293, 1994）。
【０００８】 反論として、ワクチン接種は、ＭＵＣ−１を高レベルで発現している腫瘍細胞
に対する免疫応答を誘導、同時に低い発現レベルの上皮組織を保護することを目
的としている。ＤＮＡワクチン接種は、遺伝子が入ること又は体の細胞内のその
部分、それに引き続く、挿入配列の転写及び翻訳、そしてその結果の、相当する
タンパク質の細胞内合成に依存している。このシステムの重要な利点は、新規合
成されたタンパク質は、当然に細胞内でプロセスされ、生成したペプチドは主要
組織適合抗原クラスＩ分子（ＭＨＣ−Ｉ）に結び付いていることである。それゆ
え、ＭＨＣ／ペプチド複合体は、当然ながら免疫系ＣＤ８＋細胞傷害性細胞によ
って認識される細胞表面に暴露されるのである。細胞内で合成されたポリペプチ
ドだけが、次にプロセスされ、ＭＨＣクラスＩ分子に結び付けられて提示され、
それゆえに、それを特異的な細胞傷害性反応を刺激する唯一の機構にしているの
である。タンパク質又はペプチド処理に基づくワクチン接種システムは、たいて
いは、今日まで腫瘍細胞を拒絶することにおいて非効果的であると示されてきた
抗体免疫反応の刺激において、より効果的である。現在の遺伝子治療技術は、組
換えウイルスベクター（レトロウイルス及びアデノウイルス）へのＤＮＡパッケ
ージングに頼っている。露出ＤＮＡ処理は、ウイルスベクター治療に比較して効
果的であり安全であるという点で、より有利である（Kumar V and Sercarz E. N
ature Med. 2: 857, 1966; McDonnel WM et al., New England J. of Med. 334:
42, 1996）。事実、露出ＤＮＡは、複製も、宿主組織ＤＮＡへの組み込みもさ
れず、ウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導しない。
に対する免疫応答を誘導、同時に低い発現レベルの上皮組織を保護することを目
的としている。ＤＮＡワクチン接種は、遺伝子が入ること又は体の細胞内のその
部分、それに引き続く、挿入配列の転写及び翻訳、そしてその結果の、相当する
タンパク質の細胞内合成に依存している。このシステムの重要な利点は、新規合
成されたタンパク質は、当然に細胞内でプロセスされ、生成したペプチドは主要
組織適合抗原クラスＩ分子（ＭＨＣ−Ｉ）に結び付いていることである。それゆ
え、ＭＨＣ／ペプチド複合体は、当然ながら免疫系ＣＤ８＋細胞傷害性細胞によ
って認識される細胞表面に暴露されるのである。細胞内で合成されたポリペプチ
ドだけが、次にプロセスされ、ＭＨＣクラスＩ分子に結び付けられて提示され、
それゆえに、それを特異的な細胞傷害性反応を刺激する唯一の機構にしているの
である。タンパク質又はペプチド処理に基づくワクチン接種システムは、たいて
いは、今日まで腫瘍細胞を拒絶することにおいて非効果的であると示されてきた
抗体免疫反応の刺激において、より効果的である。現在の遺伝子治療技術は、組
換えウイルスベクター（レトロウイルス及びアデノウイルス）へのＤＮＡパッケ
ージングに頼っている。露出ＤＮＡ処理は、ウイルスベクター治療に比較して効
果的であり安全であるという点で、より有利である（Kumar V and Sercarz E. N
ature Med. 2: 857, 1966; McDonnel WM et al., New England J. of Med. 334:
42, 1996）。事実、露出ＤＮＡは、複製も、宿主組織ＤＮＡへの組み込みもさ
れず、ウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘導しない。
【０００９】 新規合成タンパク質のプロセシング及びすなわち細胞傷害性リンパ球の誘導を
増強させるためのユビキチンの使用は、最近報告された（Rodriguez F. et al.,
J. Virology 71: 8497, 1997）。それらを不安定にし、分解を促進しやすいＮ
末端アミノ酸を有するタンパク質を作るためノビキチンの使用は、以前に報告さ
れている（Bechmair A. et al., SCIENCE 234: 179, 1986）。これらのタンパク
質の高度な不安定は、引き続いてＭＨＣ−１によるモデルタンパク質の細胞内プ
ロセシング及び提示にかかわる（Grant E P et al., J. Immunol. 155: 3750, 1
995）(Wu Y and Kipps T.J., J. Imunol. 159: 6037, 1997)。
増強させるためのユビキチンの使用は、最近報告された（Rodriguez F. et al.,
J. Virology 71: 8497, 1997）。それらを不安定にし、分解を促進しやすいＮ
末端アミノ酸を有するタンパク質を作るためノビキチンの使用は、以前に報告さ
れている（Bechmair A. et al., SCIENCE 234: 179, 1986）。これらのタンパク
質の高度な不安定は、引き続いてＭＨＣ−１によるモデルタンパク質の細胞内プ
ロセシング及び提示にかかわる（Grant E P et al., J. Immunol. 155: 3750, 1
995）(Wu Y and Kipps T.J., J. Imunol. 159: 6037, 1997)。
【００１０】 ＤＮＡワクチン接種において、抗原性配列の全体での類似体に比べてより高い
高原提示効果を有する、抗原を部分的にコードしているＤＮＡ断片を含む単一構
築物（インフルエンザウイルス核タンパク質）の使用が報告されている（Anton
L.C. et al., J. Immunol. 158: 2535, 1997）。さらに、生理的条件での、細胞
内タンパク質のプロセシング及びＭＨＣクラスＩタンパク質によるそれぞれのペ
プチドの提示が、免疫的監視の機構の基礎にある。あるタンパク質と特異的なＭ
ＨＣの前後関係について、優性と呼ばれるペプチド断片があり（すなわちサブド
ミナントや潜在的なものよりも優勢である）、それらは、それらが「自己」と認
識されるために、いかなる免疫応答をも生じない。本発明の側面によれば、抗原
タンパク質断片の混合物の処理による、非優性エピトープ提示を支持することを
目的とするアプローチが、驚くべき細胞傷害性免疫応答を引出すことができると
いうことが、浮かび上がってきた。
高原提示効果を有する、抗原を部分的にコードしているＤＮＡ断片を含む単一構
築物（インフルエンザウイルス核タンパク質）の使用が報告されている（Anton
L.C. et al., J. Immunol. 158: 2535, 1997）。さらに、生理的条件での、細胞
内タンパク質のプロセシング及びＭＨＣクラスＩタンパク質によるそれぞれのペ
プチドの提示が、免疫的監視の機構の基礎にある。あるタンパク質と特異的なＭ
ＨＣの前後関係について、優性と呼ばれるペプチド断片があり（すなわちサブド
ミナントや潜在的なものよりも優勢である）、それらは、それらが「自己」と認
識されるために、いかなる免疫応答をも生じない。本発明の側面によれば、抗原
タンパク質断片の混合物の処理による、非優性エピトープ提示を支持することを
目的とするアプローチが、驚くべき細胞傷害性免疫応答を引出すことができると
いうことが、浮かび上がってきた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】 本発明の記載 腫瘍細胞中で過剰発現されるタンパク質の断片をコードしているＤＮＡ分子が
、抗原特異的抗腫瘍免疫応答を誘導するために便利に使用し得ることが今やわか
っている。
、抗原特異的抗腫瘍免疫応答を誘導するために便利に使用し得ることが今やわか
っている。
【００１２】 本発明は、特に、ムチン（ＭＵＣ−１）タンパク質断片をコードしている１つ
以上のＤＮＡを含む医薬組成物に関する。
以上のＤＮＡを含む医薬組成物に関する。
【００１３】 本発明で用いられるＤＮＡは、プラスミド又はウイルス性ＤＮＡ、好ましくは
、図１３に記載されるｐＭＲＳ３０発現ベクターを使って得られたプラスミドＤ
ＮＡであり得る。
、図１３に記載されるｐＭＲＳ３０発現ベクターを使って得られたプラスミドＤ
ＮＡであり得る。
【００１４】 本発明の組成物は、好ましくは、ムチン（ＭＵＣ−１）又は腫瘍細胞中で過剰
発現されている他のタンパク質の、少なくとも２つのＤＮＡ断片を含む。
発現されている他のタンパク質の、少なくとも２つのＤＮＡ断片を含む。
【００１５】 本発明の組成物は、好ましくは、それぞれが２００〜７００ヌクレオチドであ
って、それぞれの配列が並列されており、そして約５０〜約１５０ヌクレオチド
が、隣り合った３′及び／又は５′末端において、部分的に重なり合っていても
よい、少なくとも４つの断片を含む。
って、それぞれの配列が並列されており、そして約５０〜約１５０ヌクレオチド
が、隣り合った３′及び／又は５′末端において、部分的に重なり合っていても
よい、少なくとも４つの断片を含む。
【００１６】 本発明のＤＮＡ断片は、５′末端にユビキチンをコードしているＤＮＡが先行
していてもよく、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉのＬａｃＩ部分が先行し
ていてもよい。
していてもよく、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉのＬａｃＩ部分が先行し
ていてもよい。
【００１７】 本発明は、新規ＤＮＡ断片並びに医薬及び抗腫瘍ワクチン調製における上で定
義したムチン−１断片の使用にも関する。
義したムチン−１断片の使用にも関する。
【００１８】
発明の詳細な説明 真核細胞において、ＭＵＣ−１ヒトタンパク質抗原の断片をコードしているＤ
ＮＡプラスミドプールを調製した。構築物は、図１３に記載し、先に特許出願Ｗ
Ｏ９５／１１９８２の請求項に記載し、accession number Ｊ０５５８１でＥＭ
ＢＬデータベースに報告されているＭＵＣ−１ｃＤＮＡの部分配列を含んでいる
、ｐＭＲＳ３０と称する哺乳類発現ベクターに基づいている。ＭＵＣ−１をコー
ドしているＤＮＡを、それぞれの断片が別個の部分を表し、隣り合うものと部分
的に重なり合うように断片化した。このようなプラスミドの混合物の投与は、投
与部位の異なったＡＰＣ細胞をトランスフェクションするための異なったプラス
ミドを生じることができる。したがって、そのような細胞は、関連するペプチド
を与えるＭＵＣ−１タンパク質の別個の部分を産生しプロセスする。このような
条件で、生じたサブドミナントの及び潜在的なペプチドは、クラスＩＭＨＣ分子
と結び付いて提示されることができ、つまり、細胞傷害性免疫応答を作り出すこ
とができる。
ＮＡプラスミドプールを調製した。構築物は、図１３に記載し、先に特許出願Ｗ
Ｏ９５／１１９８２の請求項に記載し、accession number Ｊ０５５８１でＥＭ
ＢＬデータベースに報告されているＭＵＣ−１ｃＤＮＡの部分配列を含んでいる
、ｐＭＲＳ３０と称する哺乳類発現ベクターに基づいている。ＭＵＣ−１をコー
ドしているＤＮＡを、それぞれの断片が別個の部分を表し、隣り合うものと部分
的に重なり合うように断片化した。このようなプラスミドの混合物の投与は、投
与部位の異なったＡＰＣ細胞をトランスフェクションするための異なったプラス
ミドを生じることができる。したがって、そのような細胞は、関連するペプチド
を与えるＭＵＣ−１タンパク質の別個の部分を産生しプロセスする。このような
条件で、生じたサブドミナントの及び潜在的なペプチドは、クラスＩＭＨＣ分子
と結び付いて提示されることができ、つまり、細胞傷害性免疫応答を作り出すこ
とができる。
【００１９】 本発明は、すなわち、少なくとも２つのＭＵＣ−１ｃＤＮＡ部分断片を含む混
合物中のＭＵＣ−１部分配列を含む４つの構築物（図１〜４）の群、及び、別々
に又はＭＵＣ−１ｃＤＮＡ部分断片を含む混合物中で使用されるユビキチンを含
むタンパク質配列及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬａｃＩ部分（図６
）をコードするＤＮＡに先行されるＭＵＣ−１ｃＤＮＡ部分断片を含む４つの構
築物（図７〜１０）の群の使用に関する。
合物中のＭＵＣ−１部分配列を含む４つの構築物（図１〜４）の群、及び、別々
に又はＭＵＣ−１ｃＤＮＡ部分断片を含む混合物中で使用されるユビキチンを含
むタンパク質配列及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬａｃＩ部分（図６
）をコードするＤＮＡに先行されるＭＵＣ−１ｃＤＮＡ部分断片を含む４つの構
築物（図７〜１０）の群の使用に関する。
【００２０】 本発明は、ＭＵＣ−１ｃＤＮＡのほぼ完全な配列を含む構築物（図５）及びユ
ビキチン及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬａｃＩ部分を含むタンパク
質配列をコードしているＤＮＡに先行される、ＭＵＣ−１ｃＤＮＡのほぼ完全な
配列を含む構築物（図１１）の使用にも関する。
ビキチン及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬａｃＩ部分を含むタンパク
質配列をコードしているＤＮＡに先行される、ＭＵＣ−１ｃＤＮＡのほぼ完全な
配列を含む構築物（図１１）の使用にも関する。
【００２１】 ＭＵＣ−１ｃＤＮＡの部分配列を含む４つの構築物、並びに、ユビキチン及び
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬａｃＩ部分を含むタンパク質配列をコー
ドしているＤＮＡに先行される、ＭＵＣ−１ｃＤＮＡの部分配列を含む４つの構
築物の混合物の混合物は、本発明の好ましい実施態様を表す。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬａｃＩ部分を含むタンパク質配列をコー
ドしているＤＮＡに先行される、ＭＵＣ−１ｃＤＮＡの部分配列を含む４つの構
築物の混合物の混合物は、本発明の好ましい実施態様を表す。
【００２２】 本発明の構築物は、高ＭＵＣ−１発現によって特徴づけられる腫瘍に冒された
患者の抗腫瘍治療において使用することができる。
患者の抗腫瘍治療において使用することができる。
【００２３】 本発明に記載される構築物は、以下のようにして得た。
【００２４】 構築物の最初のシリーズの場合は、ＭＵＣ−１ＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって
ＢＴ２０細胞株から又はＤＮＡ部分的化学的合成によって得た。このような断片
をｐＭＲＳ３０発現ベクター中にクローン化し、シークエンシングによって確認
した。
ＢＴ２０細胞株から又はＤＮＡ部分的化学的合成によって得た。このような断片
をｐＭＲＳ３０発現ベクター中にクローン化し、シークエンシングによって確認
した。
【００２５】 構築物の第２のシリーズの場合は、ＰＣＲ再増幅によって、構築物の最初のシ
リーズから断片を得た。これらの断片は、ユビキチン（ＭＣＦ７細胞株のｍＲＮ
ＡからＲＴ−ＰＣＲによって得た）及び部分的ＬａｃＩ配列（市販のベクターｐ
ＧＥＸからのＰＣＲによって得た）に融合した。こうして得られたＤＮＡ配列を
、次にｐＭＲＳ３０発現ベクターにクローン化しシークエンシングで確認した。
目的とする治療又は予防の使用のため、例えばThe Immunologist, 1994, 2:1; W
O 90/11092, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 9551; US 5580859; I
mmunology today 19 (1998), 89-97; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90 (199
3), 11478-11482; Nat. Med. 3 (1997), 526-532; Vaccine 12 (1994), 1495-14
98; DNA Cell. Biol. 12(1993), 777-783に記載されるように、担体及び露出Ｄ
ＮＡワクチンに先に採用された方法を用いて、本発明の断片又は構築物は好まし
く形成される。用量は、臨床的及び薬学的−毒学的試験に基づいて決定されよう
。一般的には、０．００５μg／kg〜５μg／kgの断片混合物を含んでいてよい。
本発明の組成物は、サイトカイン又はサイトカインをコードしているプラスミド
をも含んでいてよい。
リーズから断片を得た。これらの断片は、ユビキチン（ＭＣＦ７細胞株のｍＲＮ
ＡからＲＴ−ＰＣＲによって得た）及び部分的ＬａｃＩ配列（市販のベクターｐ
ＧＥＸからのＰＣＲによって得た）に融合した。こうして得られたＤＮＡ配列を
、次にｐＭＲＳ３０発現ベクターにクローン化しシークエンシングで確認した。
目的とする治療又は予防の使用のため、例えばThe Immunologist, 1994, 2:1; W
O 90/11092, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 9551; US 5580859; I
mmunology today 19 (1998), 89-97; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90 (199
3), 11478-11482; Nat. Med. 3 (1997), 526-532; Vaccine 12 (1994), 1495-14
98; DNA Cell. Biol. 12(1993), 777-783に記載されるように、担体及び露出Ｄ
ＮＡワクチンに先に採用された方法を用いて、本発明の断片又は構築物は好まし
く形成される。用量は、臨床的及び薬学的−毒学的試験に基づいて決定されよう
。一般的には、０．００５μg／kg〜５μg／kgの断片混合物を含んでいてよい。
本発明の組成物は、サイトカイン又はサイトカインをコードしているプラスミド
をも含んでいてよい。
【００２６】
【実施例】 本発明は、以下の実施例によって、さらに説明される。 実施例１ プラスミドｐＭＲＳ１６６の構築 ＢＴ２０腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１９）を、１０％ウシ胎仔血清で補足
した最少必須イーグル培地中で培養した。１千万個の細胞をトリプシン処理し、
ＰＢＳで洗浄し、ｍＲＮＡを抽出した。
した最少必須イーグル培地中で培養した。１千万個の細胞をトリプシン処理し、
ＰＢＳで洗浄し、ｍＲＮＡを抽出した。
【００２７】 このＲＮＡのアリコートを、以下の合成オリゴヌクレオチド：
【００２８】
【化１】
【００２９】 の存在下でのＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応）反応に付した
。
。
【００３０】 精製し、制限酵素ＸｂａＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を、特許出願ＷＯ
９５１１９８２において請求項に記載した、ヒトサイトメガロウイルスプロモー
ター及びβグロビンポリアデニル化シグナルを含有するｐＭＲＳ−３０発現ベク
ターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１６６ベクターは、ＡＴＧコドン、ＥＭ
ＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜１３９位に相当する配列及び２つ
の終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図１に示した。
９５１１９８２において請求項に記載した、ヒトサイトメガロウイルスプロモー
ター及びβグロビンポリアデニル化シグナルを含有するｐＭＲＳ−３０発現ベク
ターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１６６ベクターは、ＡＴＧコドン、ＥＭ
ＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜１３９位に相当する配列及び２つ
の終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図１に示した。
【００３１】 実施例２ プラスミドｐＭＲＳ１６９の構築 実施例１で報告したように得られたＲＮＡのアリコートを、以下の合成オリゴ
ヌクレオチド：
ヌクレオチド：
【００３２】
【化２】
【００３３】 の存在下でのＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。
【００３４】 精製し、制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を、
完全に合成で構築されたＤＮＡ断片であって、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌク
レオチド４５７〜７２０位に部分的に相当する配列及び２つの終止コドンＴＧＡ
及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片にＳｍａＩ部位で融合した。すなわち、その断片全
体をｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂａＩ部位にクローン化した。生じたｐＭＲ
Ｓ１６９ベクターは、ＡＴＧコドン、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド
２０５〜７２０位に部分的に相当する配列２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを
含むＤＮＡを含有している。 この断片は、図２に示した。
完全に合成で構築されたＤＮＡ断片であって、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌク
レオチド４５７〜７２０位に部分的に相当する配列及び２つの終止コドンＴＧＡ
及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片にＳｍａＩ部位で融合した。すなわち、その断片全
体をｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂａＩ部位にクローン化した。生じたｐＭＲ
Ｓ１６９ベクターは、ＡＴＧコドン、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド
２０５〜７２０位に部分的に相当する配列２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを
含むＤＮＡを含有している。 この断片は、図２に示した。
【００３５】 実施例３ プラスミドｐＭＲＳ１６８の構築 実施例１で報告したように得られたＲＮＡのアリコートを、以下の合成オリゴ
ヌクレオチド：
ヌクレオチド：
【００３６】
【化３】
【００３７】 の存在下でのＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。
【００３８】 精製し、制限酵素ＸｂａＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を、ｐＭＲＳ−３
０発現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１６８ベクターは、ＡＴＧコ
ドン、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド６３１〜１２７５位に相当する
配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図３に示した。
０発現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１６８ベクターは、ＡＴＧコ
ドン、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド６３１〜１２７５位に相当する
配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図３に示した。
【００３９】 実施例４ プラスミドｐＭＲＳ１６７の構築 実施例１で報告したように得られたＲＮＡのアリコートを、以下の合成オリゴ
ヌクレオチド：
ヌクレオチド：
【００４０】
【化４】
【００４１】 の存在下でのＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。
【００４２】 精製し、制限酵素ＸｂａＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を、ｐＭＲＳ−３
０発現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１６７ベクターは、ＡＴＧコ
ドン、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１２２２〜１４９７位に相当す
る配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図４に示した。
０発現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１６７ベクターは、ＡＴＧコ
ドン、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１２２２〜１４９７位に相当す
る配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図４に示した。
【００４３】 実施例５ プラスミドｐＭＲＳ１７５の構築 プラスミドｐＭＲＳ１６６、１６９、１６８、１６７を以下のヌクレオチド対
：
：
【００４４】
【化５】
【００４５】 の存在下でのＰＣＲ反応に付した。
【００４６】 それぞれのＰＣＲ反応において得られた４つのＤＮＡ断片を等モルの量で混合
して、Ｖ１１及びＶ１０のオリゴヌクレオチドの存在下でＰＣＲ反応を行った。
して、Ｖ１１及びＶ１０のオリゴヌクレオチドの存在下でＰＣＲ反応を行った。
【００４７】 精製し制限酵素ＸｂａＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を、ｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７５ベクターは、ＡＴＧコドン
、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜１４９７位に相当する配列
及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図５に示した。
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７５ベクターは、ＡＴＧコドン
、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜１４９７位に相当する配列
及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図５に示した。
【００４８】 実施例６ プラスミドｐＭＲＳ１７１の構築 ＭＣＦ７腫瘍細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）を、１０％ウシ胎仔血清で補足
した最少必須イーグル培地中で培養した。１千万個の細胞をトリプシン処理し、
ＰＢＳで洗浄し、ｍＲＮＡを抽出した。
した最少必須イーグル培地中で培養した。１千万個の細胞をトリプシン処理し、
ＰＢＳで洗浄し、ｍＲＮＡを抽出した。
【００４９】 このＲＮＡのアリコートを、以下の合成オリゴヌクレオチド：
【００５０】
【化６】
【００５１】 の存在下でのＲＴ−ＰＣＲ反応に付した。
【００５２】 この反応は、断片１と称するＤＮＡ断片を生じた。
【００５３】 ｐＧＥＸ１１Ｔ（ファルマシア）からのＤＮＡを以下の合成オリゴヌクレオチ
ド：
ド：
【００５４】
【化７】
【００５５】 の存在下においてＰＣＲ反応に付した。 この反応により、断片２と称するＤＮＡ断片を得た。
【００５６】 それぞれのＰＣＲ反応で得たＤＮＡ断片１及び２を、等モルの量の混合し、Ｕ
ＢＩｕｐ及びＬａｃＩｄｏｗｎオリゴヌクレオチドの存在下においてＰＣＲ反応
に付した。
ＢＩｕｐ及びＬａｃＩｄｏｗｎオリゴヌクレオチドの存在下においてＰＣＲ反応
に付した。
【００５７】 精製し制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を
、ｐＵＣ１８という市販のプラスミドにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１５６
ベクターは、細菌性βガラクトシダーゼ部分をコードする配列に融合した、ユビ
キチンをコードする配列を含むＤＮＡ断片を包含する。 このＵＢＩＬａｃＩと称する断片は、図６に示した。
、ｐＵＣ１８という市販のプラスミドにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１５６
ベクターは、細菌性βガラクトシダーゼ部分をコードする配列に融合した、ユビ
キチンをコードする配列を含むＤＮＡ断片を包含する。 このＵＢＩＬａｃＩと称する断片は、図６に示した。
【００５８】 プラスミドｐＭＲＳ１６６のＤＮＡを以下の合成オリゴヌクレオチド配列：
【００５９】
【化８】
【００６０】 の存在下でのＰＣＲ反応に付した。
【００６１】 精製し、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７１ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜３３９位に相当する
配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図７に示した。
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７１ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜３３９位に相当する
配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図７に示した。
【００６２】 実施例７ プラスミドｐＭＲＳ１７４の構築 プラスミドｐＭＲＳ１６９のＤＮＡを以下の合成オリゴヌクレオチド配列：
【００６３】
【化９】
【００６４】 の存在下でのＰＣＲ反応に付した。
【００６５】 精製し、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７４ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド２０５〜７２０位に相当する
配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図８に示した。
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７４ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド２０５〜７２０位に相当する
配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図８に示した。
【００６６】 実施例８ プラスミドｐＭＲＳ１７３の構築 プラスミドｐＭＲＳ１６８のＤＮＡを以下の合成オリゴヌクレオチド配列：
【００６７】
【化１０】
【００６８】 の存在下でのＰＣＲ反応に付した。
【００６９】 精製し、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７３ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド６３１〜１２７５位に相当す
る配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図９に示した。
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７３ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド６３１〜１２７５位に相当す
る配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図９に示した。
【００７０】 プラスミドｐＭＲＳ１６７のＤＮＡを以下の合成オリゴヌクレオチド配列：
【００７１】
【化１１】
【００７２】 の存在下でのＰＣＲ反応に付した。
【００７３】 精製し、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７２ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１２２２〜１４９７位に相当
する配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図１０に示した。
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７２ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１２２２〜１４９７位に相当
する配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図１０に示した。
【００７４】 実施例１０ プラスミドｐＭＲＳ１７６の構築 プラスミドｐＭＲＳ１６７のＤＮＡを以下の合成オリゴヌクレオチド配列： Ｖ３（実施例６参照） Ｖ１０（実施例４参照） の存在下でのＰＣＲ反応に付した。
【００７５】 精製し、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した、生成したＤＮＡ断片を
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７６ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜１４９７位に相当す
る配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図１１に示した。
、ｐＭＲＳ１５６プラスミド由来のＵＢＩＬａｃＩ断片に、２つのＢａｍＨＩ部
位にライゲーションすることによって融合した。生成した断片をｐＭＲＳ３０発
現ベクターにクローン化した。生じたｐＭＲＳ１７６ベクターは、ＵＢＩＬａｃ
Ｉ配列、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜１４９７位に相当す
る配列及び２つの終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを含むＤＮＡ断片を包含する。 この断片は、図１１に示した。
【００７６】 実施例１１ 真核細胞のトランスフェクション及び転写試験 ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞を、トランスフ
ェクション時にリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで補足したαＭ
ＥＭ中で培養した。
ェクション時にリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで補足したαＭ
ＥＭ中で培養した。
【００７７】 血清なしの、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ４、ＣＳＦ、Ｆｌｔ３及びＴＮＦαで補足し
たＩＭＤＭ中で培養したＣＤ３４＋造血前駆細胞から樹状細胞を得た。
たＩＭＤＭ中で培養したＣＤ３４＋造血前駆細胞から樹状細胞を得た。
【００７８】 ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−４で補足したＲＰＭＩ中で培養したＰＢＭ
Ｃ（末梢血単核細胞）から単離した単球から、樹状細胞を得た。
Ｃ（末梢血単核細胞）から単離した単球から、樹状細胞を得た。
【００７９】 それぞれの場合において、約１００万個の細胞を、実施例１〜１０中に記載し
たプラスミドの１つでトランスフェクションした。トランスフェクションはプラ
スミドＤＮＡ３μg及びＤＭＲＩＥ（ギブコ）４μlを用いてリポフェクションに
よって行った。
たプラスミドの１つでトランスフェクションした。トランスフェクションはプラ
スミドＤＮＡ３μg及びＤＭＲＩＥ（ギブコ）４μlを用いてリポフェクションに
よって行った。
【００８０】 ２４時間後、細胞を収獲し、ＰＢＳで洗浄して、ｍＲＮＡを抽出するために溶
解した。
解した。
【００８１】 ｍＲＮＡアリコートをトランスフェクションされたＤＮＡプラスミドに特異的
なオリゴヌクレオチド対の存在下でのＲＴ−ＰＣＲに付した。
なオリゴヌクレオチド対の存在下でのＲＴ−ＰＣＲに付した。
【００８２】 この実験は、以下のオリゴヌクレオチド：ｐＭＲＳ１６６についてはＶ１１／
Ｖ４、ｐＭＲＳ１６９についてはＶ１２／Ｖ６、ｐＭＲＳ１６８についてはＶ１
３／Ｖ８、ｐＭＲＳ１６７についてはＶ４／Ｖ１０、ｐＭＲＳ１７５については
Ｖ４／Ｖ１０、ｐＭＲＳ１７１についてはＵＢＩｕｐ／Ｖ４、ｐＭＲＳ１７４に
ついてはＵＢＩｕｐ／Ｖ６、ｐＭＲＳ１７３についてはＵＢＩｕｐ／Ｖ８、ｐＭ
ＲＳ１７２についてはＵＢＩｕｐ／Ｖ１０、ｐＭＲＳ１７６についてはＶ４／Ｖ
１０、を用いて実施例１〜１０に記載したそれぞれのプラスミドについて行った
。
Ｖ４、ｐＭＲＳ１６９についてはＶ１２／Ｖ６、ｐＭＲＳ１６８についてはＶ１
３／Ｖ８、ｐＭＲＳ１６７についてはＶ４／Ｖ１０、ｐＭＲＳ１７５については
Ｖ４／Ｖ１０、ｐＭＲＳ１７１についてはＵＢＩｕｐ／Ｖ４、ｐＭＲＳ１７４に
ついてはＵＢＩｕｐ／Ｖ６、ｐＭＲＳ１７３についてはＵＢＩｕｐ／Ｖ８、ｐＭ
ＲＳ１７２についてはＵＢＩｕｐ／Ｖ１０、ｐＭＲＳ１７６についてはＶ４／Ｖ
１０、を用いて実施例１〜１０に記載したそれぞれのプラスミドについて行った
。
【００８３】 代表的な例として、図１２は、ｐＭＲＳ１６９プラスミドでトランスフェクシ
ョンされた３つの細胞集団のｍＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって得られたＤＮ
Ａ断片の電気泳動解析を示す。この場合において、オリゴヌクレオチド対Ｖ１２
／Ｖ６を使用した。
ョンされた３つの細胞集団のｍＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって得られたＤＮ
Ａ断片の電気泳動解析を示す。この場合において、オリゴヌクレオチド対Ｖ１２
／Ｖ６を使用した。
【００８４】 実施例１２ ｉｎ ｖｉｖｏ研究の結果 ｉｎ ｖｉｖｏ研究においては、４つの断片の混合物及びｐＭＲＳ３０プラス
ミド（インサートなしのベクターであり、つまり陰性対照として用いた）を用い
た。免疫化が起こったことを試験するため、ＥＬＩＳＡ試験を用いてヒトムチン
特異的抗原を示した。
ミド（インサートなしのベクターであり、つまり陰性対照として用いた）を用い
た。免疫化が起こったことを試験するため、ＥＬＩＳＡ試験を用いてヒトムチン
特異的抗原を示した。
【００８５】 ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ヒトＭＵＣ１トランスジェニックＣ５７ＢＬマウスを
用いて行った。その結果、これらの動物においては、ＭＵＣ１タンパク質は、自
己のタンパク質を示した。適用したワクチン接種スケジュールは、プラスミドＤ
ＮＡ１００μgの、３つの皮内（背中側の部位、それぞれの側に５０μgのＤＮＡ
）投与（第０日、１４日、２８日）からなる。最後の投与後第１４日において、
動物を虐殺し、血清を抗ヒトムチン抗体について試験した。
用いて行った。その結果、これらの動物においては、ＭＵＣ１タンパク質は、自
己のタンパク質を示した。適用したワクチン接種スケジュールは、プラスミドＤ
ＮＡ１００μgの、３つの皮内（背中側の部位、それぞれの側に５０μgのＤＮＡ
）投与（第０日、１４日、２８日）からなる。最後の投与後第１４日において、
動物を虐殺し、血清を抗ヒトムチン抗体について試験した。
【００８６】 アッセイした断片混合物、すなわち本発明の目的は、処理した動物において免
疫応答を良好に刺激した。
疫応答を良好に刺激した。
【００８７】 他方、図２に示された、位置８６〜位置１０５の２０アミノ酸の３回反復に相
当する６０アミノ酸のペプチド（このペプチドは３ＸＴＲと称する）でのワクチ
ン接種実験も行った。
当する６０アミノ酸のペプチド（このペプチドは３ＸＴＲと称する）でのワクチ
ン接種実験も行った。
【００８８】 この２つのタイプのワクチン接種は、引出された抗体反応のタイプにおいて異
なる。抗体力価は、３ＸＴＲでのワクチン接種においてより高かった。さらに、
気付いたＩｇＧサブタイプは、３ＸＴＲでのワクチン接種の場合において、基本
的に体液性の（抗体）反応を支持し、ＤＮＡでのワクチン接種の場合においては
細胞性反応（細胞傷害性）を支持した。抗腫瘍治療のためには、原理的に細胞傷
害性免疫応答の方が好ましい。ヒトムチンが「自己」であるトランスジェニック
マウスで実験したため、我々はヒトでの同様の反応を予見することができる。こ
の反応は、ＭＵＣ１過剰発現ヒト腫瘍の処置における、ＤＮＡワクチンとしての
、本発明の化合物使用を根拠づけるものである。
なる。抗体力価は、３ＸＴＲでのワクチン接種においてより高かった。さらに、
気付いたＩｇＧサブタイプは、３ＸＴＲでのワクチン接種の場合において、基本
的に体液性の（抗体）反応を支持し、ＤＮＡでのワクチン接種の場合においては
細胞性反応（細胞傷害性）を支持した。抗腫瘍治療のためには、原理的に細胞傷
害性免疫応答の方が好ましい。ヒトムチンが「自己」であるトランスジェニック
マウスで実験したため、我々はヒトでの同様の反応を予見することができる。こ
の反応は、ＭＵＣ１過剰発現ヒト腫瘍の処置における、ＤＮＡワクチンとしての
、本発明の化合物使用を根拠づけるものである。
【配列表】
【図１】 ｐＭＲＳ１６６発現ベクターのＸｂａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド
配列（それぞれのアミノ酸配列と共に）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドン
ＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜３３９位に相当する配列を含
む。つまり、コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の１
３６〜１３９断片によってコードされているアミノ酸が後に続くメチオニンを含
んでいる。
配列（それぞれのアミノ酸配列と共に）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドン
ＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜３３９位に相当する配列を含
む。つまり、コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の１
３６〜１３９断片によってコードされているアミノ酸が後に続くメチオニンを含
んでいる。
【図２】 ｐＭＲＳ１６９発現ベクターを得るための、ｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂ
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドンＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳
終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオ
チド２０５〜７２０位に相当する配列を含む。つまり、コードされているポリペ
プチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の２０５〜７２０断片によってコードされ
ているアミノ酸が後に続くメチオニンを含んでいる。
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドンＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳
終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオ
チド２０５〜７２０位に相当する配列を含む。つまり、コードされているポリペ
プチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の２０５〜７２０断片によってコードされ
ているアミノ酸が後に続くメチオニンを含んでいる。
【図３】 ｐＭＲＳ１６８発現ベクターを得るための、ｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂ
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドンＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳
終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオ
チド６３１〜１２７５位に相当する配列を含む。つまり、コードされているポリ
ペプチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の６３１〜１２７５断片によってコード
されているアミノ酸が後に続くメチオニンを含んでいる。
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドンＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳
終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオ
チド６３１〜１２７５位に相当する配列を含む。つまり、コードされているポリ
ペプチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の６３１〜１２７５断片によってコード
されているアミノ酸が後に続くメチオニンを含んでいる。
【図４】 ｐＭＲＳ１６７発現ベクターを得るための、ｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂ
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドンＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳
終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオ
チド１２２２〜１４９７位に相当する配列を含む。つまり、コードされているポ
リペプチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の１２２２〜１４９７断片によってコ
ードされているアミノ酸が後に続くメチオニンを含んでいる。
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドンＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳
終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオ
チド１２２２〜１４９７位に相当する配列を含む。つまり、コードされているポ
リペプチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の１２２２〜１４９７断片によってコ
ードされているアミノ酸が後に続くメチオニンを含んでいる。
【図５】 ｐＭＲＳ１７５発現ベクターを得るための、ｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂ
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドンＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳
終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオ
チド１３６〜１４９７位に相当する配列を含む。つまり、コードされているポリ
ペプチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の１３６〜１４９７断片によってコード
されているアミノ酸が後に続くメチオニンを含んでいる。
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、翻訳開始コドンＡＴＧに先行され、かつ、２つの翻訳
終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１のヌクレオ
チド１３６〜１４９７位に相当する配列を含む。つまり、コードされているポリ
ペプチドは、ＥＭＢＬ配列Ｊ０５５８１の１３６〜１４９７断片によってコード
されているアミノ酸が後に続くメチオニンを含んでいる。
【図６】 ＵＢＩＬａｃＩと称するＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と
共に）である。コードされているポリペプチドは、Chau V. et al. Science 243
: 1576, 1989に記載されているように、細菌タンパク質β-ガラクトシダーゼの
部分配列に融合したユビキチン配列を含んでいる。
共に）である。コードされているポリペプチドは、Chau V. et al. Science 243
: 1576, 1989に記載されているように、細菌タンパク質β-ガラクトシダーゼの
部分配列に融合したユビキチン配列を含んでいる。
【図７】 ｐＭＲＳ１７１発現ベクターを得るための、ｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂ
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜３３９位に相当する配列と
融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがって、
コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の１３６〜３３
９断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６に示した
アミノ酸配列を含む。
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜３３９位に相当する配列と
融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがって、
コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の１３６〜３３
９断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６に示した
アミノ酸配列を含む。
【図８】 ｐＭＲＳ１７４発現ベクターを得るための、ｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂ
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド２０５〜７２０位に相当する配列と
融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがって、
コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の２０５〜７２
０断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６に示した
アミノ酸配列を含む。
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド２０５〜７２０位に相当する配列と
融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがって、
コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の２０５〜７２
０断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６に示した
アミノ酸配列を含む。
【図９】 ｐＭＲＳ１７３発現ベクターを得るための、ｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂ
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド６３１〜１２７５位に相当する配列
と融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがって
、コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の６３１〜１
２７５断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６に示
したアミノ酸配列を含む。
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド６３１〜１２７５位に相当する配列
と融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがって
、コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の６３１〜１
２７５断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６に示
したアミノ酸配列を含む。
【図１０】 ｐＭＲＳ１７３発現ベクターを得るための、ｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂ
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１２２２〜１４９７位に相当する配
列と融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがっ
て、コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の１２２２
〜１４９７断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６
に示したアミノ酸配列を含む。
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１２２２〜１４９７位に相当する配
列と融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがっ
て、コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の１２２２
〜１４９７断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６
に示したアミノ酸配列を含む。
【図１１】 ｐＭＲＳ１７６発現ベクターを得るための、ｐＭＲＳ３０発現ベクターのＸｂ
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜１４９７位に相当する配列
と融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがって
、コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の１３６〜１
４９７断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６に示
したアミノ酸配列を含む。
ａＩ部位に挿入されたＤＮＡヌクレオチド配列（それぞれのアミノ酸配列と共に
）である。このＤＮＡは、２つの翻訳終止コドンＴＧＡ及びＴＡＡが後に続く、
ＥＭＢＬの配列Ｊ０５５８１のヌクレオチド１３６〜１４９７位に相当する配列
と融合したＵＢＩＬａｃＩと称する（図６参照）配列を含んでいる。したがって
、コードされているポリペプチドは、ＥＭＢＬの配列Ｊ０５８８１の１３６〜１
４９７断片によってコードされているアミノ酸を含む配列と融合した、図６に示
したアミノ酸配列を含む。
【図１２】 １×ＴＢＥ中の１％アガロースゲルでの電気泳動解析である。それぞれｐＭＲ
Ｓ１６９でトランスフェクションされ、逆転写酵素と一緒に（レーン４、８、１
２）又は逆転写酵素なしで（レーン５、９、１３）ＲＴ−ＰＣＲ反応に付した、
ＣＨＯ、ＣＤ３４＋樹状細胞及びＰＢＭＣ由来の樹状細胞から抽出したｍＲＮＡ
である。分子量ＤＮＡマーカー（レーン１）；内製陰性対照（レーン２、６）；
内製陽性対照（レーン３、７、１０、１１）；プロメガキットの陽性対照（レー
ン１４）。
Ｓ１６９でトランスフェクションされ、逆転写酵素と一緒に（レーン４、８、１
２）又は逆転写酵素なしで（レーン５、９、１３）ＲＴ−ＰＣＲ反応に付した、
ＣＨＯ、ＣＤ３４＋樹状細胞及びＰＢＭＣ由来の樹状細胞から抽出したｍＲＮＡ
である。分子量ＤＮＡマーカー（レーン１）；内製陰性対照（レーン２、６）；
内製陽性対照（レーン３、７、１０、１１）；プロメガキットの陽性対照（レー
ン１４）。
【図１３】 ｐＭＲＳ３０発現ベクターのヌクレオチド配列である。１〜２８６２位の領域
は、ｐＳＶ２ＣＡＴベクター（ＥＭＢＬ Ｍ７７７８８）のＡｃｃＩ（位置５０
４）〜ＢａｍＨＩ（位置３３６９）領域に相当する；該２８６３〜３７２１領域
は、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ヒトサイトメガロウイルス主要極
初期遺伝子エンハンサー）を含む；該３７２２〜４９０５領域は、ＸｂａＩ（位
置３７２７）を含む、複数のクローニング部位及びウサギβグロビン遺伝子のプ
ロセシングシグナルを含む。
は、ｐＳＶ２ＣＡＴベクター（ＥＭＢＬ Ｍ７７７８８）のＡｃｃＩ（位置５０
４）〜ＢａｍＨＩ（位置３３６９）領域に相当する；該２８６３〜３７２１領域
は、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ヒトサイトメガロウイルス主要極
初期遺伝子エンハンサー）を含む；該３７２２〜４９０５領域は、ＸｂａＩ（位
置３７２７）を含む、複数のクローニング部位及びウサギβグロビン遺伝子のプ
ロセシングシグナルを含む。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月２６日（２００１．１．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デサンティス，リタ イタリア国、イ−50131 フィレンツェ、 ヴィア・リズモンド Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA31 CA04 DA03 EA04 GA11 HA17 4C084 AA02 AA03 AA06 AA13 BA01 BA02 BA21 BA22 BA23 BA44 DA01 DA27 NA14 ZB26 4C085 AA03 AA32 BB01 CC21 DD86 EE01 EE06 4C087 AA01 AA02 BB65 BC83 NA01 NA14 ZB26
Claims (20)
- 【請求項１】 抗腫瘍Ａｇ−特異的免疫応答を誘導するための腫瘍細胞中で
過剰発現されるタンパク質の断片をコードする１つ以上のＤＮＡ分子を、適当な
賦形剤及びアジュバントと組合わせて含む医薬組成物。 - 【請求項２】 過剰発現されるタンパク質がＭＵＣ−１である、請求項１記
載の医薬組成物。 - 【請求項３】 ムチン断片（ＭＵＣ−１）をコードするｃＤＮＡ配列をそれ
ぞれ含む少なくとも２つのＤＮＡ分子を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成
物。 - 【請求項４】 ムチン断片（ＭＵＣ−１）をコードするｃＤＮＡ配列をそれ
ぞれ含む少なくとも３つのＤＮＡ分子を含む、請求項３記載の組成物。 - 【請求項５】 ムチン断片（ＭＵＣ−１）をコードするｃＤＮＡ配列をそれ
ぞれ含む少なくとも４つのＤＮＡ分子を含む、請求項４記載の組成物。 - 【請求項６】 ＤＮＡ配列が、約２００〜約７００ヌクレオチドを含み、そ
れぞれの配列が連続的であって、隣り合うものと３′及び／又は５′末端で約５
０〜約１５０ヌクレオチド部分的に重なり合っていてもよい、請求項３〜５のい
ずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項７】 用いられる混合物が、その配列が図１〜４に記載されたもの
から選択されるＤＮＡ断片をそれぞれ含む、少なくとも２つのプラスミドＤＮＡ
分子からなる、請求項２〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。 - 【請求項８】 用いられる混合物が、その配列が図１〜４に記載されたもの
から選択されるＤＮＡ断片をそれぞれ含む、プラスミドＤＮＡ分子のプールから
なる、請求項７記載の医薬組成物。 - 【請求項９】 図５に記載された配列を含むプラスミドＤＮＡ分子が用いら
れる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。 - 【請求項１０】 用いられるプラスミドＤＮＡが、図１３のｐＭＲＳ３０発
現ベクターと図１〜５に記載されたそれぞれの配列との融合に由来する、請求項
７〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。 - 【請求項１１】 該タンパク質の単一断片に相当する用いられる配列が、５
′末端において、エシェリヒア コリからのユビキチン及びＬａｃＩ部分をコー
ドする、図６に記載された配列に先行されている、請求項２〜６のいずれか１項
に記載の医薬組成物。 - 【請求項１２】 混合物が、図１３に記載されたｐＭＲＳ３０と図７〜１０
に記載されたものから選択されたＤＮＡ配列との結合に由来する１つ以上の配列
からなる、請求項１１記載の医薬組成物。 - 【請求項１３】 混合物が、図１３に記載されたｐＭＲＳ３０と図７〜１０
に記載されたものから選択されたＤＮＡ配列との結合に由来する配列の全体から
なる、請求項１１記載の医薬組成物。 - 【請求項１４】 混合物が、ｐＭＲＳ３０発現ベクターと図１１に記載され
た配列との結合に由来する配列からなる、請求項１１記載の医薬組成物。 - 【請求項１５】 サイトカイン又はサイトカインをコードするプラスミドを
さらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。 - 【請求項１６】 ＭＵＣ−１タンパク質断片をコードし、その配列が図１〜
５に記載されたものの群から選択されるＤＮＡ配列と結合されたｐＭＲＳ３０発
現ベクターからなる、プラスミドＤＮＡ分子。 - 【請求項１７】 その５′末端が、図６に記載された配列によって先行され
ている、タンパク質ＭＵＣ−１断片をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項１８】 図７〜１１に記載されたものから選択される、請求項１７
記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項１９】 ｐＭＲＳ３０発現ベクターと、請求項１７又は１８に記載
のものから選択されるＤＮＡ分子との結合によって得られるプラスミドＤＮＡ分
子。 - 【請求項２０】 抗腫瘍効果を有する組成物の調製における、請求項１６〜
１９のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子の使用。
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|---|---|---|---|
| IT98A002330 | 1998-10-30 | ||
| IT1998MI002330A IT1303683B1 (it) | 1998-10-30 | 1998-10-30 | Composizione farmaceutiche ad azione antitumorale contenente dnacodificante per frammenti di una proteina antigenica. |
| PCT/EP1999/007874 WO2000025827A2 (en) | 1998-10-30 | 1999-10-18 | Dna molecules encoding muc-1 and use thereof in tumor vaccination |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000579265A Pending JP2002528519A (ja) | 1998-10-30 | 1999-10-18 | 抗腫瘍効果を有する、抗原性タンパク質をコードしているｄｎａを含む医薬組成物 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003533181A (ja) * | 2000-02-01 | 2003-11-11 | ジ・オースティン・リサーチ・インスティテュート | ムチン−１誘導抗原および免疫療法におけるその使用 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR20030068536A (ko) * | 2000-09-11 | 2003-08-21 | 다나-파버 캔서 인스티튜트 | Ｍｕｃ1 세포외 도메인 및 이로부터 유래된 암 치료조성물과 방법 |
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