JP2003517042A

JP2003517042A - 単純ヘルペスウイルスワクチンに対する免疫応答を強化する方法

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Publication number: JP2003517042A
Application number: JP2001545554A
Authority: JP
Inventors: エリック・エム・ミシュキン; ロバート・ジェイ・ナトゥック; マイケル・ダブリュー・プライド; マニンダー・ケイ・シドゥ
Original assignee: アメリカン・サイアナミド・カンパニー
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2003-05-20
Also published as: ES2258987T3; EP1238086A1; EP1238086B1; IL149810A0; CN1434864A; DE60026588D1; KR100773390B1; WO2001044477A1; BR0016419A; CA2406678A1; AU2065101A; DK1238086T3; KR20020073348A; PT1238086E; ATE319833T1; CY1105604T1; AU783730B2; MXPA02005867A; DE60026588T2; CN1222619C

Abstract

(57)【要約】ＨＳＶに対する哺乳動物の保護的および/または治療的免疫を誘発および強化する方法は、ＨＳＶ１型または２型ｇＤタンパクをコードするＤＮＡ配列からなる第１の核酸分子と各インターロイキン-１２ヘテロダイマーサブユニットをコードするＤＮＡ配列からなる第２の核酸分子とからなる有効量のＤＮＡワクチン組成物による少なくとも１回の免疫化の工程を包含する。この方法はまた、ＨＳＶ１型または２型ｇＤタンパクとＩＬ-１２ヘテロダイマーとからなる有効量のタンパクワクチン組成物による少なくとも１回の後免疫化を包含する。このＤＮＡワクチン組成物には、局所麻酔薬を核酸分子と１種またはそれ以上の複合体を形成する量で含有させてもよい。このプロトコルに従って適当な有効用量で哺乳動物に与えた場合、この方法に用いたワクチン組成物は、免疫した哺乳動物におけるＨＳＶに対する予想外に良好な保護的および/または治療的免疫応答を生じる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般的にはワクチンの分野に関し、さらに詳しくは単純ヘルペスウ
イルスに対する免疫を誘発するワクチン投与計画に関する。かかるワクチン投与
計画は、核酸ワクチンおよびタンパクワクチンの両方を選択されたアジュバント
と共に採用する。

【０００２】（背景技術）いくつかの病原体、例えば、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)に対する免疫を誘
発するために様々なワクチン製剤が存在する。ＨＳＶワクチンの中心は、ＨＳＶ
１型およびＨＳＶ２型の糖タンパクＤ(ｇＤ)遺伝子である。ジー・エイチ・コー
エン(G.H. Cohen)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(J. Virol.),62(8):19
32-1940(1988)；エイチ-ワイ・チャン(H-Y. Chiang)ら、ジャーナル・オブ・ヴ
ァイロロジー(J. Virol.),68(4):2529-2543(1994)；エイ・ブイ・ニコラ(A.V. N
icola)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(J. Virol.),70(6):3815-3822(19
96)；および米国特許第5,654,174号を参照。

【０００３】ワクチン用の公知の製剤は、病原体に対する保護的免疫応答を惹起するように
、哺乳動物免疫系にｇＤ遺伝子などの抗原を与えるために様々な送達媒体を採用
している。かかる「送達媒体」は、ワクチン剤として、熱的または化学的に不活
化した全ウイルス、全ウイルスのタンパク粒子、ウイルスベクター(例えば、特
にアデノウイルスおよびワクシニア)、およびＤＮＡベースのベクターまたはプ
ラスミドを包含している。ＨＳＶｇＤ遺伝子の製剤の後者のタイプの例は、国
際特許出願第WO98/17820号(1998年4月30日付で公開)および米国特許第5,958,895
号に教示されている。あるいは、他の送達剤は、免疫系に抗原を送達または提出
するのを援助する添加剤、例えば、プラスミドベースの媒体でありうる。例えば
、国際特許出願第WO98/48780号(1998年11月5日付で公開)を参照。

【０００４】多数の病原体に対するワクチンのさらに他の変形物としては、免疫応答が望ま
れる抗原を送達する他の薬剤を含有する組成物および製剤が挙げられる。これら
の他の薬剤は、それら自体の生物活性により抗原に対する免疫応答を増大または
強化するタイプでありうる。例えば、いくつかのサイトカインおよびインターロ
イキンは、ワクチン組成物の望ましい「アジュバント」であることが見出されて
いる。これらの中でより興味深いのは、インターロイキン-１２である。例えば
、米国特許第5,723,127号および第5,571,515号を参照。

【０００５】病原体に対する多数のワクチンに対して適当な保護的免疫応答を得るさらに別
の手段として、ワクチン接種の様々なプロトコルが提案されている。例えば、従
来の研究は、プラスミドベースのワクチンは、同じ抗原の別形態、例えば、タン
パクまたは組換えウイルスで２回目の免疫化に対して免疫系を初回免疫するのに
採用することができることを立証した[エス・ダブリュー・バーネット(S.W. Bar
nett)ら、ワクチン(Vaccine),15(80):869-873(1997)；エヌ・エル・レトヴィン(
N.L. Letvin)ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA),94:9378-9383(1997)；アール・エイ・グラムジンスキ
ー(R.A. Gramzinski)ら、モレキュラー・メディスン(Molecular Med.),4:109-11
8(1998)；ジェイ・シュナイダー(J. Schneider)ら、ネイチャー・メディスン(Na
ture Med.),4:397(1998)；およびエム・セデグー(M. Sedeguh)ら、プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),95:76
48(1998)]。

【０００６】ワクチンおよびワクチン製剤に関する情報が豊富であるにもかかわらず、特に
ＨＳＶに対するヒトの適当な保護的免疫を誘発または付与する有効なワクチンが
必要とされ続けている。

【０００７】（発明の開示）ある態様では、本発明は、単純ヘルペスウイルス病原体に対する哺乳動物の免
疫性を誘発する方法に関する。この方法は、ＨＳＶ１型または２型ｇＤタンパク
をコードするＤＮＡ配列からなる核酸分子およびインターロイキン-１２ｐ３５
およびｐ４０ヘテロダイマーサブユニットをコードするＤＮＡ配列からなる第２
の核酸分子からなる第１のワクチンからなる有効量のワクチン組成物を投与する
工程を包含する。好ましくは、第２の核酸分子は、ＩＬ-３５ｐ３５をコードす
るＤＮＡ配列からなる核酸分子とＩＬ-２０ｐ４０をコードするＤＮＡ配列から
なる核酸分子との等量混合物からなる。

【０００８】このＤＮＡワクチンによる哺乳動物の少なくとも１回の免疫化の後、この方法
はさらに、適当な医薬用担体中におけるタンパク、特にＨＳＶ１型または２型ｇ
ＤタンパクとＩＬ-１２ヘテロダイマータンパクとからなる有効量の第２のワク
チン組成物による哺乳動物の少なくとも１回の免疫化を包含する。随意の具体例
では、第１のワクチンは、局所麻酔薬を第１のワクチンの核酸分子と１種または
それ以上の複合体を形成する量で含有する製剤で投与される。

【０００９】さらに別の態様では、本発明は、上記ワクチン方法に明細を記した様々な成分
と、指示書や、ワクチン成分を混合および投与するのに適当な随意の装置とを含
有するＨＳＶワクチンキットを包含する。

【００１０】本発明の他の態様および利点は、さらに、その好ましい具体例に関する以下の
詳細な説明に記載される。

【００１１】本発明は、単純ヘルペスウイルスによる哺乳動物の感染を予防または治療する
のに効果的なワクチンプロトコルを提供する。プライム-ブースト免疫化を伴う
このワクチン方法は、病原体である単純ヘルペスウイルス１型または２型に対す
る哺乳動物の保護的および/または治療的免疫を誘発する。本発明は、ＨＳＶｇ
ＤがＤＮＡプライミング段階、随意のＤＮＡブースティング段階およびタンパク
ブースティング段階(ｇｄと同じ形態のＩＬ-１２と共に)に投与されるプライム-
ブーストワクチン投与計画が、治療にとって非常に重大であると考えられる細胞
媒介性免疫を増大させることを示す。また、この投与計画により示される免疫の
広いスペクトルは、ＨＳＶ感染に対して強化された保護的および/または治療的
免疫を提供する。かくして、本発明は、例えば、曝露前後の患者に対して、ＨＳ
Ｖ感染の予防および治療の両方に有用な方法を提供する。

【００１２】Ｉ．定義「哺乳動物」および「哺乳動物の」なる用語は、それらの通常の意味を包含す
るように意図される。本発明が最も望ましくはヒトにおける効力を意図される場
合、他の霊長類ならびに飼育された哺乳動物種(イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ
、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、およびラットなどが非限定的に挙げられる)
もまた、この定義に包含される。

【００１３】「免疫応答」または「免疫」(これらの用語は本明細書では交換可能に用いら
れる)により、体液性(すなわち、Ｂ細胞)および/または細胞性(すなわち、Ｔ細
胞)応答の誘発を意味する。適当には、体液性免疫応答は、宿主へのＨＳＶｇＤ
抗原の導入に応答して免疫化された動物の血清中に存在する抗原特異的な抗体を
測定することにより評価すればよい。以下のある例示的な具体例では、免疫応答
は、免疫化された哺乳動物の血清の酵素結合免疫吸着検査法、または以下の実施
例２で考察されるように、免疫化された動物の血清のマイクロ中和法により評価
される。やはり以下に記載するように、免疫化された動物の脾臓から単離したリ
ンパ球からのＴ細胞応答を測定するのに、ＣＴＬアッセイを採用することができ
る。

【００１４】「プライム」および「ブースト」なる用語は、当該分野におけるそれらの通常
の意味を有することが意図される。「プライミング」は、第１の組成物で免疫化
することを意味し、単一のワクチン組成物、例えば、プライミング組成物単独ま
たはブースティング組成物単独による免疫化で得られる免疫応答に比べて、同一
または別の組成物による次の免疫化(「ブースティング」)で抗原に対するより高
い免疫応答を誘発する。

【００１５】本明細書で用いる「相同の」なる用語は、２つの重合分子間、例えば、２つの
核酸分子(例えば、２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子)間、または２つの
ポリペプチド分子間の配列類似性を意味する。２つの分子の両方におけるヌクレ
オチドまたはアミノ酸の位置が同じ単量体ヌクレオチドまたはアミノ酸で占有さ
れている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンで占有
されている場合、それらはその位置で相同である。２つの配列間の相同性は、一
致するまたは相同な位置の数の直接的な関数であり、例えば、２つの化合物配列
における位置の半分(例えば、長さが１０サブユニットのポリマーにおける５つ
の位置)が相同であれば、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％(例えば
、１０個のうち９個)が一致または相同であれば、２つの配列は９０％の相同性
を有する。例として、ＤＮＡ配列３'ＡＴＴＧＣＣ５'および３'ＴＡＴＧＣＧ５'
は５０％の相同性を有する。本明細書で用いる「実質的に相同な」なる用語によ
り、所望の核酸に対して約５０％相同な、より好ましくは約７０％相同な、さら
により好ましくは約８０％相同な、最も好ましくは約９０％相同なＤＮＡまたは
ＲＮＡを意味する。

【００１６】本明細書で考察するように、ＨＳＶｇＤまたはＩＬ-１２タンパクおよび/ま
たはＤＮＡ配列が同定された配列に対するそれらの％相同性または同一性で定義
される場合、％相同性または％同一性を計算するのに用いるアルゴリズムとして
は、以下のものが挙げられる：スミス-ウォーターマン・アルゴリズム[ジェイ・
エフ・コリンズ(J.F. Collins)ら、1988年、コンピューター・アプリケーション
ズ・イン・バイオサイエンシズ(Comput. Appl. Biosci.),4:67-72；ジェイ・エ
フ・コリンズ(J.F. Collins)ら、モレキュラー・シークエンス・コンパリズン・
アンド・アライメント(Molecular Sequence Comparison and Alignment),(エム
・ジェイ・ビショップ(M.J. Bishop)ら編)、プラクティカル・アプローチ・シリ
ーズ：ヌクレイック・アシッド・アンド・プロテイン・シークエンス・アナリシ
スＸＶIII(Practical Approach Series : Nucleic Acid and Protein Sequence
Analysis XVIII)中、ＩＲＬプレス：オックスフォード、イングランド、英国(19
87年)第417頁]およびＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡプログラム[イー・ジー・シュ
パエル(E.G. Shpaer)ら、1996年、ゲノミックス(Genomics),38:179-191]。これ
らの文献は出典を示すことにより本明細書の一部をなす。

【００１７】 II．ｇＤおよびＩＬ-１２ＤＮＡによるプライミング本発明によれば、この方法の第１またはプライミング工程は、ＨＳＶ１型また
は２型ｇＤタンパクをコードするＤＮＡ配列からなる第１の核酸分子を、インタ
ーロイキン-１２ヘテロダイマーの各サブユニットをコードするＤＮＡ配列から
なる第２の核酸分子と組み合わせて含有する有効量の第１「プライミング」ワク
チンで哺乳動物を免疫化することを必要とする。この第２の核酸配列は２つの別
々の核酸分子(各々は異なるＩＬ-１２ヘテロダイマーをコードする)の混合物を
包含することができるか、あるいは両方のヘテロダイマーサブユニットを含有す
るビシストロニック(bicistronic)分子または単一分子中に互いに連結または融
合されたＩＬ-１２サブユニットまたはその生物学的に活性な断片の単一配列で
あることができる。ｇＤ１およびｇＤ２タンパクをコードする配列は公知であり
(例えば、ジェンバンク(GenBank)受託番号第K01408号および上記背景技術で引用
した文献を参照)、ＩＬ-１２ヘテロダイマーの配列も公知である(例えば、米国
特許第5,457,038号を参照)。

【００１８】好ましくは、天然ＨＳＶｇＤ１またはｇＤ２配列がプライミングワクチンに
用いられる；しかし、本発明はｇＤ１およびｇＤ２の修飾配列の使用を意図して
いる。ここで、核酸配列のかかる修飾はｇＤ遺伝子の免疫原性、安定性、または
何らかの他の薬理学的性質をインビボで強化する。多数のヌクレオチド配列修飾
が公知であり、以下で一般的に考察されている。かかる修飾の中には、天然ｇＤ
配列を短くまたは長くする切断または欠失/挿入が含まれる。ｇＤ配列は、その
５'末端で切断して、シグナルまたはリーダー配列を除去してもよい。あるいは
、ｇＤ配列をその３'末端で切断して、その膜貫通領域またはそのシステインに
富む領域を除去してもよい。さらに別の代替物は、５'および３'末端の両方で切
断して、シグナルおよび膜貫通領域を除去したｇＤ分子である。修飾ｇＤ遺伝子
のさらに別の例は、天然リーダーまたはシグナル配列が欠失され、別のシグナル
配列で置き換わっている配列である。例えば、配列をｇＤの残基２８５または残
基３１６のアミノ酸をコードするコドンで切断して、本発明に有用な修飾ｇＤ配
列を与えてもよい。さらに他の修飾も有用であると思われる(例えば、米国特許
第5,958,895号記載の断片を参照)。

【００１９】また、本発明は、免疫化された宿主の細胞からのポリフクレオチドの発現およ
び分泌を援助するか、または細胞中におけるポリペプチドの安定性を援助する別
のポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からポリペプチドの輸送を制御する分泌
配列として機能するリーダー配列に同じリーディングフレームで融合した、ｇＤ
をコードする核酸配列を包含する。

【００２０】同様に、いくつかの哺乳動物種(例えば、ネズミおよびヒト)のＩＬ-１２ｐ３
５およびｐ４０ヘテロダイマーサブユニットの配列は当該分野で公知である。好
ましくは、採用した選択ＩＬ-１２サブユニット配列は、プライミングワクチン
を投与される哺乳動物種の天然または対立配列である。例えば、ヒト患者に用い
るのに最も好ましいのは、天然ヒトＩＬ-１２ヘテロダイマーである。さらに、
本発明は、ＩＬ-１２ｐ３５およびＩＬ-１２ｐ４０の修飾配列の使用を意図し
ている。核酸配列のかかる修飾は、ＩＬ-１２サブユニット遺伝子の安定性また
は何らかの他の薬理学的性質をインビボで強化する。例えば、両方のヘテロダイ
マーまたは生物学的に関連する断片または互いに連結した両方のヘテロダイマー
を含有する単一遺伝子を設計できるだろう。多数のヌクレオチド配列修飾が公知
であり、以下で一般的に考察されている。

【００２１】また、ＨＳＶｇＤをコードするか、あるいはＩＬ-１２ヘテロダイマーをコー
ドするヌクレオチド配列(それぞれｇＤ抗原またはＩＬ-１２サイトカインのアミ
ノ酸配列と相同である配列を有する；ここで、相同な抗原はＨＳＶに対する免疫
応答またはＩＬ-１２に対する適当な応答を誘発する)は、本発明の方法のプライ
ミングワクチンおよびブースティングワクチンに有用である。所望のｇＤコード
化配列に相同な遺伝子は、本発明に包含されるように構築すべきである。ただし
、それらは天然または野生型ＨＳＶｇＤのものと実質的に同様のＨＳＶに対す
る保護的免疫応答を誘発することができるタンパクまたはポリペプチドをコード
する。

【００２２】本発明のプライミングワクチン工程の成分を製造する方法は、従来の教科書、
例えば、バーガー(Burger)ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴァイロロジー
(J. Gen. Virol.),72:359-367(1991)に記載され、当該分野で公知である。また
、サムブルック(Sambrook)ら、1989年、モレキュラー・クローニング：ア・ラボ
ラトリー・マニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory
Press)、ニューヨーク；およびアウスベル(Ausubel)ら、1997年、カレント・プ
ロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecu
lar Biology)、グリーン・アンド・ワイリー(Green & Wiley)、ニューヨークを
参照。あるいは、ＨＳＶｇＤ核酸配列またはＩＬ-１２サブユニット核酸分子を
含有する適当なプラスミドは市販品を購入してもよい。

【００２３】ｇＤ、ＩＬ-１２ｐ３５またはＩＬ-１２ｐ４０をコードする各核酸配列は、
好ましくは哺乳動物細胞中の各核酸配列の産物の複製および生成を導く調節配列
の制御下にある。「プロモーター/調節配列」なる用語により、プロモーター/調
節配列に作動可能なように連結された核酸の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する
。いくつかの場合には、プロモーター/調節配列は、プロモーター/調節配列が特
定の組織タイプの細胞における発現を行うことができるだけであるという点で、
組織特異的な様式で機能しうる。いくつかの場合には、この配列はコアプロモー
ター配列であり、他の場合には、この配列はエンハンサー配列および組織特異的
な様式の発現に必要な他の調節要素を含有していてもよい。

【００２４】２つのＤＮＡが本明細書で用いる「作動可能なように連結された」と記載する
ことにより、一本鎖または二本鎖ＤＮＡが２つのＤＮＡの各々を含有し、２つの
ＤＮＡがＤＡＮ配列の少なくとも一方が他方により特徴付けられる生理学的な効
果を働かせることができるようにＤＮＡ内に配置されていることを意味する。好
ましくは、ｇＤまたはＩＬ-１２をコードする核酸がさらにプロモーター/調節配
列を含有する場合、プロモーター/調節配列は、それが細胞内でｇＤまたはＩＬ-
１２の発現を導くようにコード配列の５'末端に位置する。

【００２５】かかる調節配列としては、非限定的に、プロモーター配列、エンハンサー配列
、ポリアデニル化配列、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配
列が挙げられる。当該分野は、本発明に有用なＤＮＡ分子を設計する豊富なかか
る配列を提供する。当業者は、本発明の分子を調製するのに、かかる公知の調節
配列の中から容易に選択しうる。かかる調節配列の選択は本発明の限定ではない
。例えば、プライミングワクチンの一部であるプラスミドまたは他のＤＮＡ分子
に採用されたプロモーターは、活性が非特異的な構成的プロモーターを包含しう
る。かかるプロモーターとしては、非限定的に、レトロウイルスＬＴＲプロモー
ター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモータ
ー、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、およびホスホグリセロールキナーゼ(
ＰＧＫ)プロモーターが挙げられる。外部から適用された薬物により調節される
誘発性プロモーターを作用してもよい。これらとしては、非限定的に、特に、亜
鉛誘発性ヒツジメタロチオニン(ＭＴ)プロモーターおよびデキサメタゾン(Ｄｅ
ｘ)誘発性マウス哺乳動物腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)プロモーターが挙げられる。
これに関連して有用な他のタイプの誘発性プロモーターは、特定の生理学的状態
、例えば、温度または急性期により、または複製する細胞中でだけ調節されるも
のである。

【００２６】好ましくは、ｇＤまたはＩＬ-１２ヘテロダイマーをコードする核酸配列は、
ベクターまたはプラスミド中で投与される。本明細書で用いる「ベクター」なる
用語により、外生または異種の核酸配列をコードするように設計されている、ウ
イルスまたは細菌種から誘導されるＤＮＡ分子を意味する。かくして、この用語
は、従来の細菌プラスミドを包含する。かかるプラスミドまたはベクターは、ウ
イルスまたはファージ由来のプラスミド配列を含有することができる。かかるベ
クターとしては、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、
細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素および
ウイルスに由来するベクター、その組合せに由来するベクター、例えば、プラス
ミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するもの、コスミドおよびファー
ジミドが挙げられる。また、この用語は、ある細胞から別の細胞に遺伝子を移送
する非複製ウイルスを包含する。また、この用語は、例えば、ポリリジン化合物
など、細胞中への核酸の移送を促進する非プラスミド性および非ウイルス性の化
合物を包含すると解釈すべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウ
イルスベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙
げられるが、これらに限定されない。細菌ベクターの例としては、特に、カルメ
ット-ゲラン杆菌(ＢＣＧ)、サルモネラ、シゲラおよびリステリアが挙げられる
が、これらに限定されない。かくして、ある例示的なベクターは、一本鎖または
二本鎖のファージベクターである。別の例示的なベクターは、一本鎖または二本
鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターである。

【００２７】上記の調節配列に加えて、プラスミドは、転写の開始および終結のための部位
と、転写領域に、翻訳のためのリボソーム結合部位とを含有していてもよい。構
築物により発現される成熟転写物のコード部分は、最初の翻訳開始コドンと、翻
訳されるポリペプチドの最後の適当に位置する終結コドンとを含有する。

【００２８】上記プラスミドまたはベクターの全ての成分は、当該分野で公知の材料の中か
ら容易に選択し、医薬産業界から入手可能である。プラスミド本体および調節配
列の選択は、本発明の限定として考えられない。

【００２９】好ましくは、本発明のプライミングワクチン工程で用いるために、ｇＤ遺伝子
および各ＩＬ-１２サブユニットが別々のプラスミド中に存在する。あるいは、
これらの核酸配列の２つまたはそれ以上をポリシストロニック転写物、すなわち
３つのうち２つ、または３つすべての遺伝子産物を発現するように設計される単
一分子に含有させてもよい。

【００３０】プライミングワクチンは、かくして適当な医薬上または生理学上許容される担
体、例えば、等張性食塩水または等張性塩溶液中にＨＳＶｇＤをコードする１
種またはそれ以上の核酸配列とＩＬ-１２ヘテロダイマーとを含有する。適当な
担体は当業者に明らかであり、大部分は投与の経路に依存する。あるいは、ポリ
ヌクレオチド分子からなるかかるプライミングワクチンは、望ましくは随意のポ
リヌクレオチド促進剤または「協同剤」(co-agent)、例えば、局所麻酔薬、ペプ
チド、カリオン性脂質を含む脂質、リポソームまたは脂質粒子、ポリリジンなど
のポリカチオン、デンドリマーなどの枝分かれした３次元ポリカチオン、炭水化
物、カチオン性の両親媒性化合物、洗浄剤、ベンジルアンモニウム界面活性剤、
または細胞へのポリヌクレオチドの移送を促進する別の化合物を含有する。本発
明に有用なかかる促進剤または協同剤の非限定的な例は、米国特許第5,593,972
号；第5,703,055号；5,739,118号；5,837,533号；国際特許出願第WO96/10038号(
1996年4月4日付で公開)；および国際特許出願第WO94/16737号(1994年8月8日付で
公開)(これらは各々出典を示すことにより本明細書の一部をなす)に記載されて
いる。

【００３１】最も好ましくは、局所麻酔薬は、核酸分子と１種またはそれ以上の複合体を形
成する量で存在する。局所麻酔薬がＤＮＡプラスミドと混合される場合、それは
、ＤＮＡをパックし、相同である様々な小さい複合体または粒子を形成する。か
くして、本発明のプライミングワクチン組成物のある具体例では、複合体は局所
麻酔薬と１〜３つのＤＮＡプラスミド(２つのＩＬ-１２サブユニット含有プラス
ミド、またはｇＤ含有プラスミド、およびＩＬ-１２サブユニット含有プラスミ
ドの一方または両方、またはｇＤ含有プラスミドおよび両方のＩＬ-１２サブユ
ニットを含有するビシストロニックプラスミド、またはｇＤ配列および両方のＩ
Ｌ-１２サブユニット配列を含有する単一のポリシストロニックプラスミド)とを
混合することにより形成される。この混合物から生じる単一の複合体は、異なる
プラスミドの様々な組合せを含有しうる。あるいは、本発明のプライミング組成
物の別の具体例では、局所麻酔薬は、各ｇＤおよびＩＬ-１２サブユニットプラ
スミドと別々に事前に混合された後、すべてのプラスミドが単一のボーラス投与
で投与されるべきなら、所望の割合のプラスミドが単一のワクチン組成物中に存
在することを確実にするように、別々の混合物が単一のプライミング組成物に合
わせられる。あるいは、局所麻酔薬および各プラスミドは、別々に混合し、所望
の割合を得るように、別々に投与してもよい。以後、プライミングワクチン組成
物のこの具体例を定義するのに「複合体」または「１種またはそれ以上の複合体
」または「複合体(複数)」なる用語を用いる場合、この用語は１種またはそれ以
上の複合体(各複合体はｇＤとＩＬ-１２サブユニット含有プラスミドとの混合物
を含有する)または別々に形成された複合体の混合物(ここで、各複合体はただ１
つのタイプのプラスミドを含有する)または複合体の１つまたは混合物(ここで、
各複合体はポリシストロニックＤＮＡを含有する)を包含すると理解される。

【００３２】好ましくは、複合体は直径が約５０〜約１５０ｎｍである。用いた促進剤が局
所麻酔薬(好ましくは、ブピバカイン)である場合、ポリヌクレオチド組成物の全
重量に基いて、約０.１重量％〜約１.０重量％の量が好ましい。また、国際特許
出願第PCT/US98/22841(出典を示すことにより本明細書の一部をなす)を参照。こ
れは、好ましくは約０.００１〜０.０３重量％の量で投与された、協同剤として
のベンジルアンモニウム界面活性剤の導入を教示している。本発明によれば、局
所麻酔薬の量は、１〜１０μｇ/ｍｌ核酸に対して０.０１〜２.５％ｗ/ｖ局所麻
酔薬という該核酸分子に対する割合で存在する。別のかかる割合は、１００μｇ
/ｍｌ〜１ｍｌ/ｍｌ核酸に対して０.０５〜１.２５％ｗ/ｖ局所麻酔薬である。

【００３３】また、医薬組成物は、組成物の投与の選択された様式に適当な他の添加剤を含
有していてもよい。また、本発明の組成物は凍結乾燥されたポリヌクレオチドを
含有していてもよく、これは、粉剤、液剤または懸濁剤の剤形を展開するために
他の医薬上許容される補形剤と共に用いることができる。例えば、レミントン：
ザ・サイエンス・アンド・プラクティス・オブ・ファーマシー(Remington：The
Science and Practice of Pharmacy)、第2巻、第19版(1995年)、例えば、第95章
エアロゾル；および国際特許出願第PCT/US99/05547号(これらの教示内容は出典
を示すことにより本明細書の一部をなす)を参照。これらの組成物の投与の経路
は、必要なら、組み合わせるか、あるいは調節すればよい。

【００３４】かくして、これらのプライミング/ＤＮＡブースティングワクチン組成物は、
従来の投与経路を介した投与に適当な添加剤を含有することができる。いくつか
の好ましい具体例では、本発明のプライミング組成物および随意のＤＮＡブース
ティング組成物は、例えば、液剤、粉剤、エアロゾル、錠剤、カプセル剤、腸溶
コーティング錠剤もしくはカプセル剤、または坐剤の形態で哺乳動物患者に投与
するように製造される。投与の経路としては、非限定的に、非経口投与、腹腔内
投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻
腔内投与、肺内投与、直腸内投与、膣内投与などが挙げられる。すべてのかかる
経路は、これらの組成物の投与に適当であり、治療する患者および状態、担当医
師による同様の因子に依存して選択すればよい。

【００３５】一般的には、本発明のプライミング組成物の適当な用量の選択は、最も特に、
免疫化される哺乳動物の全身的な健康および体重を含めて、哺乳動物の身体的状
態に基づく。かかる選択および有効量の上方または下方調節は、当該分野の技術
範囲内である。

【００３６】以下の実施例の方法では、プライミングワクチンの成分は、哺乳動物に同時投
与された。ｇＤ遺伝子を含有する核酸分子および各ＩＬ-１２サブユニットは、
まず適当な医薬用担体と混合された後、共に単一のボーラスとして投与された。

【００３７】あるいは、各プラスミドは別々かつ逐次に投与してもよいことは意図される。
例示的なプライミングワクチン工程として、以下の実施例は、食塩水に混合され
、筋肉内に投与された３つの細菌プラスミド、ｐＭＶｇＤ２、ｐＭＶｐ３５およ
びｐＭＶｐ４０の送達を説明する。他の投与を意図してもよい。

【００３８】 III．随意の核酸ブーストさらに、本発明の方法は、上で「プライミングワクチン」として説明したのと
同じ成分および製剤からなる随意のブースティングワクチンを意図する。この核
酸ブーストは、望ましくはプライミングワクチンの投与後、約４週間〜約３２週
間で患者に投与される。望ましくは、核酸ブーストは、上記のプライミングワク
チン工程で提供されるのと同じ経路を介して、同じ用量で投与される。

【００３９】 IV．ＨＳＶｇＤおよびＩＬ-１２ヘテロダイマータンパクブースト本発明の方法によりさらに提供されるのは、タンパクブースティングワクチン
工程である。方法のこの工程は、好ましくは哺乳動物を有効量のタンパクワクチ
ン組成物(ＨＳＶ１型または２型ｇＤタンパクまたはその類似体とＩＬ-１２ヘテ
ロダイマーまたはその類似体とからなる)で、上記の「プライミングワクチン」
による免疫化後、または、上記の１種またはそれ以上の随意の核酸ブーストによ
る免疫化後、約２週間〜３２週間で免疫化することを包含する。

【００４０】上記したように、ＨＳＶｇＤ１型または２型のＤＮＡおよびタンパク配列、
ならびにネズミおよびヒトＩＬ-１２ヘテロダイマーサブユニットは、当該分野
で公知である。本発明に有用なｇＤまたはＩＬ-１２ポリペプチドに言及する場
合、「類似体」なる用語は、かかるポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能ま
たは活性を保持している、すなわち免疫原として機能する全長ポリペプチドまた
はその断片を意味する。ｇＤおよび/またはＩＬ-１２ヘテロダイマーポリペプチ
ドの類似体は、(ｉ)１個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存のア
ミノ酸残基(好ましくは、保存アミノ酸残基)で置換され、かかる置換アミノ酸残
基が場合によっては遺伝コードでコードされるものであるもの；(ii)１個または
それ以上のアミノ酸残基が置換基を有するもの；(iii)ポリペプチドが別の化合
物、例えば、ポリペプチドの半減期を上昇させる化合物(例えば、ポリエチレン
グリコール)と融合しているもの；または(iv)付加的なアミノ酸(例えば、リーダ
ーもしくは分泌配列またはポリペプチドの精製に採用される配列)がポリペプチ
ドに融合しているものでありうる。かかる類似体は、本明細書の教示内容から当
業者の範囲内であると思われる。本明細書に記載したＨＳＶｇＤまたはＩＬ-１
２ヘテロダイマーの類似体は、保存的なアミノ酸配列の差により、または、配列
に影響を与えない修飾により、または、両方により、天然に存在するタンパクま
たはペプチドと異なることができる。例えば、タンパクまたはペプチドの１次配
列を変更するが、通常、その機能は変更しない保存的なアミノ酸の変化を行いう
る。

【００４１】修飾(通常、１次配列を変化させない)としては、ポリペプチドのインビボまた
はインビトロでの化学的誘導体化、例えば、アセチル化またはカルボキシル化が
挙げられる。また、ｇＤまたはＩＬ-１２の類似体として包含されるのは、グリ
コシル化により修飾されたこれらのタンパク、例えば、その合成およびプロセッ
シングの間に、または、さらなるプロセッシング工程(例えば、グリコシル化に
影響を与える酵素(例えば、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素)
にポリペプチドを曝露することにより)で、ポリペプチドのグリコシル化パター
ンを変更することにより製造されるものである。また、本発明による類似体とし
て包含されるのは、ホスホリル化されたアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン
、ホスホセリンまたはホスホトレオニンを有するＨＳＶｇＤまたはＩＬ-１２配
列である。また、類似体として包含されるのは、それらの耐タンパク分解性を向
上させるか、または溶解性を最適化するように、通常の分子生物学的技術を用い
て、修飾されているｇＤまたはＩＬ-１２ポリペプチドである。かかるポリペプ
チドの類似体としては、天然に存在するＬ-アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ-ア
ミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含有するものが挙げられる。本発
明のポリペプチドに存在していてもよい他の公知の修飾の中には、非限定的に、
アシル化、ＡＤＰ-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共
有結合、ヌクレオチドまたはフクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘
導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフ
ィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログル
タミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒド
ロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解プロセ
ッシング、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などの
タンパクへのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる
。

【００４２】特にｇＤタンパクのさらに他の修飾としては、ｇＤのＮ末端におけるシグナル
またはリーダー配列の上記欠失、および/またはｇＤのＣ末端における膜貫通ド
メインおよび/またはシステインに富む領域の欠失、または両方が挙げられる。
同様に、修飾は、シグナルまたはリーダー配列を別のシグナルまたはリーダー配
列で置き換えることを包含することができる。例えば、米国特許第5,958,895号
を参照。

【００４３】かかる修飾を行う方法は当業者に公知である。例えば、プロテインズ-ストラ
クチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ(PROTEINS-STRUCTURE AND MO
LECULAR PROPERTIES)、第2版、ティー・イー・クレイントン(T.E. Creighton)、
ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W.H. Freeman and Comp
any)、ニューヨーク、1993年；ウォールド，エフ(Wold, F.)、「ポストトランス
レーショナル・プロテイン・モディフィケーションズ：パースペクティブズ・ア
ンド・プロスペクツ(Posttranslational Protein Modifications : Perspective
s and Prospects)」、第1〜12頁、ポストトランスレーショナル・コバレント・
モディフィケーション・オブ・プロテインズ(POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODI
FICATION OF PROTEINS)中、ビー・シー・ジョンソン(B.C. Johnson)編、アカデ
ミック・プレス(Academic Press)、ニューヨーク、1983年；サイフター(Seifter
)ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Meth. Enzymol.),182:626-646(1990)
、およびラタン(Rattan)ら、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・
オブ・サイエンシズ(Ann. N.Y. Acad. Sci.),663:48-62(1992)。

【００４４】実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明に有用なｇＤおよび/またはＩ
Ｌ-１２タンパクは、これらのポリペプチドの免疫学的に活性な断片を包含する
。本明細書で用いるように、ポリペプチドに適用される「断片」なる用語は、普
通は、長さが少なくとも約６個の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約１
５個または約２５個の連続したアミノ酸、より典型的には少なくとも約４０個の
連続したアミノ酸、通常は少なくとも約４５個の連続したアミノ酸および好まし
くは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸である。例えば、米国特許第4,709,
011号(出典を示すことにより本明細書の一部をなす)に記載されているｇＤポリ
ペプチドを参照。患者の哺乳動物においてＨＳＶ１型または２型に対する保護的
免疫応答を誘発するなら、ｇＤタンパク、その類似体または断片は、本発明の方
法に有用である。例えば、ほぼ残基２８５で切断されたｇＤタンパクが望ましい
断片である。同様に、ほぼ残基３１６で切断されたｇＤタンパクが望ましい断片
である。ｇＤのさらに他の断片を選択してもよい。ｇＤタンパクにより誘発され
る免疫応答を強化するなら、ＩＬ-１２タンパク、その類似体または断片は、本
発明の方法に有用である。

【００４５】本発明のタンパクブースティングワクチンに用いられるｇＤタンパクおよびい
Ｌ-１２ヘテロダイマーは、本明細書に列挙した特定の例示的な方法のいずれか
の産物に限定されない。実際、ｇＤタンパクおよびＩＬ-１２ヘテロダイマータ
ンパクは、直前に引用した教科書に記載されている方法により、または、上記の
プライミングワクチンの部で引用された教科書の方法により製造すればよい。ワ
クチン用途のタンパク組成物を単離し製造することは、当該分野の技術範囲内で
ある。さらにあるいは、ｇＤおよびＩＬ-１２タンパクは、市販品を購入しても
よい。

【００４６】タンパクブースティング組成物は、望ましくは医薬組成物に製剤される。かか
る製剤は、医薬上許容される担体、例えば、滅菌水または滅菌した等張性食塩水
と組み合わせたｇＤタンパクおよびＩＬ-１２ヘテロダイマーからなる。適当な
担体は、当業者に明らかであり、大部分は投与の経路に依存する。製剤としては
、懸濁剤、液剤、油性または水性の媒体中の乳剤、パスタ剤、および移植可能な
徐放性または生物分解性の製剤が挙げられるが、それらに限定されない。かかる
製剤は、さらに１種またはそれ以上の付加的な成分(例えば、懸濁化剤、安定剤
または分散剤が挙げられるが、それらに限定されない)を含有していてもよい。
非経口的な投与用の製剤のある具体例では、有効成分は、再構成した組成物の非
経口投与前に適当な媒体(例えば、滅菌した発熱原を含まない水)で再構成するた
めの乾燥した(すなわち、粉末または顆粒)形態で提供される。有用な他の非経口
的に投与可能な製剤としては、有効成分を微結晶の形態で、リポソーム調製物で
、または生物分解性のポリマー系の成分として含有するものが挙げられる。徐放
性または移植用の組成物は、医薬上許容されるポリマーまたは疎水性材料、例え
ば、エマルジョン、イオン交換樹脂、乏しい溶解性のポリマーまたは乏しい溶解
性の塩を含有しうる。

【００４７】タンパクブースティング組成物中に存在しうるさらなる付加的な成分は、アジ
ュバント、保存剤、化学的安定剤、または他の抗原性タンパクである。典型的に
は、安定剤、アジュバント、および保存剤は、目標のヒトまたは動物での効率に
ついて最良の製剤を決定するように最適化される。適当な例示的な保存剤として
は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子
酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラ
クロロフェノールが挙げられる。使用しうる適当な安定化成分としては、例えば
、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ-Ｚアミン、モノ
カリウム二リン酸、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物、および乾燥乳が
挙げられる。従来のアジュバントは、白血球を誘引するか、または免疫応答を強
化するのに用いられる。かかるアジュバントとしては、特に、ＭＰＬ^ＴＭ(３-Ｏ
-脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；ＲＩＢＩイムノケム・リサーチ・インク(RI
BI ImmunoChem Research, Inc.)、モンタナ州ハミルトン)、鉱油および水、水酸
化アルミニウム、アンフィゲン(Amphigen)、アブリジン(Avridine)、Ｌ１２１/
スクアラン、Ｄ-ラクチド-ポリラクチド/グリコシド、プルロニック・プリオイ
ス(pluronic plyois)、ムラミルジペプチド、死滅したボルデテラ属、サポニン
、例えば、クイル(Quil)Ａまたはスティムロン(Stimulon^TM)ＱＳ-２１(アクイラ
・バイオファーマシューティカルズ・インク(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.
)、マサチューセッツ州フレーミングハム)およびコレラ毒素(野生型または変異
体(例えば、国際特許出願第PCT/US99/22520(出典を示すことにより本明細書の一
部をなす)に従って、アミノ酸位置２９のグルタミン酸が別のアミノ酸、好まし
くはヒスチジンで置き換わっている)のいずれか)が挙げられる。

【００４８】いくつかの好ましい具体例では、本発明のブースティング組成物は、哺乳動物
の患者への投与用に、例えば、液剤、粉剤、エアロゾル、錠剤、カプセル剤、腸
溶性コーティング錠剤もしくはカプセル剤、または坐剤の形態で製造される。投
与の経路としては、非限定的に、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内
投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸
内投与、膣内投与などが挙げられる。すべてのかかる経路は、これらの組成物の
投与に適当であり、治療する患者および状態、担当医師による同様の因子に依存
して選択すればよい。

【００４９】一般的には、本発明のタンパクブースティング組成物の適当な用量の選択は、
最も特に、免疫化される哺乳動物の全身的な健康および体重を含めて、哺乳動物
の身体的状態に基づく。患者ごとの有効量のかかる選択は、当該分野の技術範囲
内である。

【００５０】以下の実施例の方法では、好ましいタンパクブーストワクチンの成分は混合さ
れ、１回の注射で筋肉内投与された。ｇＤタンパクは、ＩＬ-１２ヘテロダイマ
ーと、各々適当な医薬用担体中で、別々に投与することもできる。

【００５１】Ｖ．本発明のキットまた、本発明に包含されるのは、強化されたＨＳＶ保護的および/または治療
的免疫応答を誘発するキットである。かかるキットは、好ましくはプライミング
ワクチンの成分、すなわちＨＳＶ１型または２型ｇＤ遺伝子をコードするＤＮＡ
配列およびインターロイキン-１２ｐ３５およびｐ４０サブユニットをコードす
るＤＮＡ配列からなる上記の１種またはそれ以上の核酸分子を含有する。ここで
、ｇＤ遺伝子をコードするＤＮＡ配列および該ＩＬ-１２ヘテロダイマーをコー
ドするＤＮＡ配列は、各々、哺乳動物細胞におけるその発現を導く調節配列下に
ある。随意により、キットは、局所麻酔薬を、これらの核酸分子と１種またはそ
れ以上の複合体を形成する量で含有する。随意により、キットは、上記のＤＮＡ
ブースティングワクチンの成分を含有する。また、キットは、上記の医薬上許容
される担体中に、タンパクブースティングワクチンの成分、すなわちＨＳＶ１型
または２型ｇＤタンパクおよびＩＬ-１２ヘテロダイマーを含有する。

【００５２】キットの他の成分としては、各組成物を投与するためのアプリケーターが挙げ
られる。「アプリケーター」なる用語により、この用語を本明細書で用いるよう
に、ヒトまたは動物の患者に適当な経路によりＤＮＡワクチン成分および/また
はタンパクワクチン成分を投与するのに有用な医薬組成物の投与用の多くの公知
のタイプの中の任意の装置(例えば、皮下注射用シリンジ、遺伝子ガン、噴霧器
、滴瓶、気管支鏡、坐剤が挙げられるが、これらに限定されない)を意味する。
さらに別の成分は、キットを用いるための指示書を包含する。

【００５３】 VI．実施例以下の実験的な実施例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する
。これらの実施例は、単なる例示の目的で与えられており、特に断らない限り、
限定することを意図しない。本発明は、プライミングＤＮＡワクチンとして採用
した特定のＤＮＡプラスミドおよびプラスミド成分(例えば、プロモーター)の使
用だけでなく、本明細書に記載した特定の局所麻酔薬に限定されると解釈すべき
ではない。かくして、本発明は、本明細書に与えた教示内容の結果として明らか
になる、いかなるおよびすべての変化を包含する。

【００５４】実施例１：ＨＳＶワクチン成分Ａ．プライミングワクチンＰＭＶプラスミドは、ｐＣＭＶ-β[クローンテック・インク(Clontech, Inc.)
]から、β-ガラクトシダーゼおよびＳＶ４０ポリＡ部位を除去し、欠失した配列
をｐｃＤＮＡ３.１[インビトロジェン・インク(Invitrogen, Inc.)]から単離し
たウシ成長ホルモン(ｂＧＨ)ポリＡで置き換えることにより誘導した。ＰＭＶプ
ラスミドの他の特徴としては、ｐＵＣ複製起点、ＳＶ４０スプライスドナー/ア
クセプターを含むイントロン、およびアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。Ｐ
ＭＶｇＤプラスミドは、以下のようにして構築された：ＨＳＶ２型(ＨＳＶ-２)
１８６株からのｇＤ遺伝子を含有する１.５ｋｂＨｉｎｄIII-ＢｓｔＸ１断片を
プラスミドｐｗｗ６５[アイゼンバーグ(Eisenberg)ら、ジャーナル・オブ・ヴァ
イロロジー(J. Virol.),64:8(1990)]から単離した。５'突出部をクレノー断片で
充填した後、ＰＭＶプラスミドのＳｍａＩ部位にクローニングした。得られたプ
ラスミドは、ＣＭＶプロモーターからｇＤ２を発現し、ウシ成長ホルモンポリＡ
でポリアデニル化する。

【００５５】ＩＬ-１２ヘテロダイマー含有プラスミドはＰＭＶｐ３５およびＰＭＶｐ４０
であり、これらのプラスミドは以下のようにして構築した：ｐ３５のマウスＩＬ
-１２ｃＤＮＡ(６５０ｂｐ)およびｐ４０のマウスＩＬ-１２ｃＤＮＡ(１.０ｋ
ｂ)をプラスミドｐＥＤＩＬ-１２ｐ３５およびｐＥＤＩＬ-１２ｐ４０[両方はジ
ェネティックス・インスティチュート・インク(Genetic Institute, Inc.)、マ
サチューセッツ州ケンブリッジ；また、エス・エイ・ボルフ(S.A. Wolf)ら、ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunol.),146:3074-3081(1991)を参照]から
各々ＳａｌＩ-ＸｈｏＩ断片として単離した。これらの断片を、上記した各々の
ＰＭＶプラスミドのＳａｌＩ-ＸｈｏＩ部位にクローニングして、ＰＭＶｐ３５
およびＰＭＶｐ４０を生成した。各プラスミドは、サイトメガロウイルスプロモ
ーターからｐ３５またはｐ４０ＩＬ-１２ヘテロダイマーを発現し、ウシ成長ホ
ルモンポリＡを含有する。

【００５６】以下の実施例２および３のプロトコルに例示するように、好ましいプライミン
グワクチンは、０.０６ｍｌのリン酸緩衝食塩水中に、プラスミドｐＭＶｇＤ、
ｐＭＶｐ３５およびｐＭＶｐ４０の各々を３５マイクログラム含有する。あるい
は、以下の実施例におけるいくつかの具体例では、プライミングワクチンは、ｐ
ＭＶｇＤだけ、ＩＬ-１２プラスミドだけ、または野生型ＨＳＶを含有していた
。ｇＤ含有プラスミドおよびＩＬ-１２ヘテロダイマー含有プラスミドは、好ま
しくは単一の組成物で筋肉内(ｉ.ｍ.)投与される。しかし、あるいは、プラスミ
ドは、逐次に同時投与するか、あるいは以下のプロトコルに例示されるものとは
異なる経路を介して投与してもよい。

【００５７】Ｂ．ブースティングワクチン以下の実験に用いた好ましいブースティングワクチンは、ＨＳＶ２型１８６株
ｇＤタンパクを含有するように製剤された。ｇＤタンパクは、バキュロウイルス
で製造された後、ヴィ・ランドルフィ(V. Landolfi)ら、ワクチン(Vaccine),11:
407-414(1993)に記載されているように精製した。組換えネズミＩＬ-１２ヘテロ
ダイマータンパクは、ジェネティックス・インスティチュート・インク(Genetic
Institute, Inc.)、マサチューセッツ州ケンブリッジから得た。あるいは、Ｉ
Ｌ-１２タンパクは、米国特許第5,457,038号(出典を示すことにより本明細書の
一部をなす)に記載されているように製造することができる。好ましくは、適当
量のｇＤタンパクおよびＩＬ-１２タンパクを互いに混合し、単一部位で免疫化
した。あるいは、ｇＤおよびＩＬ-１２タンパクを逐次に同時投与するか、ある
いは以下の実施例２および３のプロトコルに例示されるものとは異なる経路およ
び部位を介して投与してもよい。

【００５８】ブースティングワクチンのある具体例は、リン酸緩衝食塩水(ｐＨ７.４)１ｍ
ｌあたり５０μｇのｇＤタンパク(３μｇ/用量)を含有していた。ブースティン
グワクチンの別の具体例は、リン酸緩衝食塩水１ｍｌあたり５０μｇのｇＤタン
パク(３μｇ/用量)および１用量あたり２００マイクログラムのリン酸アルミニ
ウム(ワイス-レダリー・ワクチンズ(Wyeth-Lederle Vaccines))を含有していた
。ブースティングワクチンのさらに別の具体例は、リン酸緩衝食塩水１ｍｌあた
り５０μｇのｇＤタンパク(３μｇ/用量)、１用量あたり２００マイクログラム
のリン酸アルミニウム、およびリン酸緩衝食塩水(ｐＨ７.４)中における１μｇ/
用量のネズミＩＬ-１２タンパク[ジェネティックス・インスティチュート・イン
ク(Genetic Institute, Inc.)]を含有していた。

【００５９】実施例２：ワクチンプロトコルの比較Ａ．プロトコルこの実験には、７週齢の雌Ｂａｌｂ/ｃマウス(チャールズ・リバー・ラボラト
リーズ(Charles River Laboratories))の１４グループ(ｎ＝５/グループ)を利用
した。第０日目に、これらのグループに以下のプライミング製剤を投与した：グループ１〜５は、第０日目に筋肉内(ｉ.ｍ.)に、実施例１記載のｐＭＶｇＤ
プラスミドを２５μｇの用量で、また、実施例１に上記した２つのＩＬ-１２プ
ラスミドを３５μｇ/プラスミドの用量でｉ.ｍ.免疫化した。グループ６〜１０および１２には、第０日目に免疫化を行わなかった。グループ１１には、第０日目に、実施例１に上記した２つのＩＬ-１２プラス
ミドだけを３５μｇ/プラスミドの用量でｉ.ｍ.投与した。グループ１３には、第０日目に、肉趾への注射により、容量０.０３ｍｌ中に
おける１×１０^５ｐｆｕの生きた感染性の野生型ＨＳＶ１ウイルスＮＳ株(フィ
ラデルフィアのチルドレンズ・ホスピタル(Children's Hospital)のエイチ・フ
リードマン(H. Friedman)博士から入手)を投与した。グループ１４には、第０日目に、肉趾への注射により、容量０.０３ｍｌ中に
おける２×１０^３ｐｆｕの生きた感染性の野生型ＨＳＶ２ウイルス１８６株(ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collect
ion))を投与した。

【００６０】４週間後、動物のグループに以下の「ブースト」を投与した：グループ１および６には、ｇＤ２およびＩＬ-１２含有プラスミドの２回目の
投与(同じ用量および経路)を行った。グループ２および７には、ｇＤ２プラスミドだけの２回目の投与(同じ用量お
よび経路)を行った。しかし、グループ３および８には、第２のワクチン成分を投与した。実施例１
記載のバキュロウイルスから製造し精製された全長ｇＤ２タンパクを、３μｇの
用量でｉ.ｍ.投与し、ＰＢＳ中における組換えネズミＩＬ-１２(ｒｍＩＬ-１２)
ヘテロダイマータンパクを１μｇ/ダイマーの用量でｉ.ｍ.投与した。グループ４および９には、全長ｇＤ２タンパクだけをＰＢＳ中に３μｇの用量
でｉ.ｍ.投与した。グループ５、１０、１３および１４には、２回目の投与を行わなかった。グループ１１には、１回目の投与と同じ経路および用量で、ＩＬ-１２ヘテロ
ダイマープラスミドだけの２回目の投与を行った。グループ１２には、上記と同じ経路および用量でｒｍＩＬ-１２だけを投与し
た。

【００６１】最後の免疫化から４週間後に、動物から血液を採取し、脾臓を取り出し、ヨー
ク(York)ら、ワクチン(Vaccine),13:1706-1712(1995)に記載されているように、
ＥＬＩＳＡおよびリンパ増殖アッセイに付した。以下のように変更したが、上記
のヨーク(York)に記載されているように、ＣＴＬアッセイを行った。Ａ２０細胞
に、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間、ＨＳＶ２ウイルス(Ｍ.Ｏ.Ｉ. ４ｐｆｕ/細胞
)を感染させ、ＵＶ光で不活化した。これらの細胞を刺激細胞として１：２０の
割合(ＨＳＶ２感染およびＵＶ不活化Ａ２０細胞：脾臓細胞)で採用した。

【００６２】さらに、市販されているエルビス(ELVIS^TM)ＨＳＶ細胞系[バイオホイッテカー
・インク(Biowhittaker, Inc.)]を用いて、ＨＳＶ-１およびＨＳＶ-２の非色定
量血清マイクロ中和法を行った。簡単に説明すると、このアッセイは所定量のウ
イルスを、様々な希釈度の熱不活化血清試料または媒体だけの対照(ウイルス対
照)と、３７℃、５％ＣＯ_２で、必要に応じて、モルモットの補体と共に、イン
キュベートした後、エルビス(ELVIS)ＨＳＶ細胞の集密単層上にプレートするこ
とを包含する。同じ条件下でインキュベートした後、単層にエルビス(ELVIS)置
換培地を再度供給し、さらに１８時間インキュベートした。培地を除去し、１.
５％ＮＰ４０-ＭＥＭ(０.０５ｍｌ/ウェル)を加え、各マイクロウェルプレート
を−７０℃で少なくとも４時間放置した。溶解物を３７℃で解凍した後、等量の
β-ガラクトシダーゼ基質を加え、プレートを３７℃で４０分間インキュベート
した。５７０ｎｍにおけるＯＤを測定した。中和力価を、ウイルス対照のＯＤを
５０％だけ減少させる血清希釈度として定義した。

【００６３】以下のように変更したが、シー(She)ら、インターナショナル・イムノロジー(
Intern'l Immunol),110:845-957(1999)に本質的に従って、内部サイトカイン染
色を行った。脾臓細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で３日間、熱不活化(５６℃/３０分
間)したＨＳＶ２(１０^６ｐｆｕ/２×１０^６脾臓細胞)と共にインキュベートした
。参照抗原は、リンパ球マーカー(ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８)、活性化抗原Ｃ
Ｄ２５、およびサイトカイン(ＩＦＮ-γまたはＩＬ-１０)であった。

【００６４】Ｂ．アッセイの結果ＥＬＩＳＡおよび中和法の力価により与えられる体液性応答を、ＩｇＧ_１、Ｉ
ｇＧ_２の幾何平均力価(ＧＭＴ)およびＮｅｕｔＧＭＴ(血清中和活性の幾何平均
力価)として、以下の表１に示す。これは、ウイルス感染性をインビトロで中和
する試験血清の能力を対数に変換して表現したものである。「９５％以上および
以下のＣＴ」は、観測値の９５％が入るべき範囲を画する平均値のまわりの間隔
を包含する測定の変化性の統計的表現である。

【００６５】簡単に説明すると、最大のＩｇＧ_１力価は、ｇＤおよびＩＬ-１２プラスミド
でプライムされ、非アジュバント性のｇＤサブユニットでブーストされたマウス
に由来する血清で達成された。また、ＩｇＧ_１力価の上昇は、ｇＤおよびＩＬ-
１２タンパクブーストを行ったマウスで生じた。ｇＤプラスミドおよびＩＬ-１
２プラスミドでプライムされ、ｇＤサブユニットタンパクおよびＩＬ-１２タン
パクでブーストされたマウスは、ＩｇＧ_２ａの極めて高い力価を示した。また、
ＩｇＧ_２ａの高い力価は、サブユニットｇＤだけでブーストしたマウスで見られ
た。この観察は、Ｔｈ１優性抗体応答のプラスミドプライミングは、サブユニッ
トでブーストした場合に、維持され増大されることを示唆している。血清中和力
価は、プラスミドで免疫化され、サブユニットで、または、サブユニットｇＤお
よびＩＬ-１２タンパクでブーストしたマウスで見られた非常に高い力価を有す
るＥＬＩＳＡのものと匹敵した。

【００６６】マウスのグループがアジュバントを用いずにｇＤサブユニットを投与された場
合(すなわち、伝統的な製剤)、上記のように投与されたｇＤサブユニットは、高
い力価のＩｇＧ_１ＥＬＩＳＡ抗体および中程度から高レベルの血清中和抗体を
惹起した。伝統的に投与されたサブユニットは、一貫して、ＩｇＧ_２ａＥＬＩＳ
Ａ抗体または細胞媒介性(ＣＭＩ)応答を誘発しなかった。対照的に、本発明の具
体例では、ＩＬ-１２と同時に製剤すると、ＩｇＧ_２ａおよびＣＭＩを含むよう
に応答を広げた。この応答プロファイル(タイプ１応答プロファイルと呼ばれる)
は、ＤＮＡプライミングおよびサブユニットブーストで最大であった。比較のた
めに実施例３の結果を参照。

【００６７】血清学的データの統計学的(ANOVA)分析は、ｇＤＤＮＡおよびＩＬ-１２ＤＮ
Ａでプライムし、ｇＤ/ＩＬ-１２サブユニットでブーストしたグループ(グルー
プ３)は、明らかに実施例２の中で最もよく応答したグループであった。また、
このグループは、２番目に高いＩｇＧ_１抗ｇＤ血清力価を有し、この点に関して
は、ｇＤＤＮＡおよびＩＬ-１２ＤＮＡでプライムし、ｇＤサブユニットでブ
ーストしたグループ４を除いて、すべての他のグループより統計学的に優れてい
た。ｇＤＤＮＡおよびＩＬ-１２ＤＮＡでプライムし、ｇＤサブユニットでブ
ーストしたグループ４は、血清抗ＨＳＶ中和およびＩｇＧ_２ａ抗ｇＤ力価に関し
て、２番目によく応答したグループであった。グループ４とグループ３(最良の
応答グループ)との間の唯一の差は、免疫化計画のサブユニットブースティング
部分におけるＩＬ-１２の非存在であり、これは低いＩｇＧ_２ａ抗ｇＤ抗体力価
および血清抗ＨＳＶ中和力価をもたらした。対応するＩｇＧ_１またはＩｇＧ_２ａ抗ｇＤ抗体力価を用いたすべての中和力価の統計学的分析は、抗ＨＳＶ中和活性
を有するＩｇＧ_２ａ抗ｇＤ抗体力価の間に正の相関(Ｐ＝０.０００１)が存在す
るが、ＩｇＧ_１力価と中和力価との間には相関が観察されないことを示した。

【００６８】

【表１】

【００６９】

【表２】

【００７０】

【表３】

【００７１】リンパ増殖アッセイ結果の細胞性応答を表２に示す。このアッセイは免疫細胞
の抗原特異的な幼若化の評価を可能にし、細胞性応答の第１レベル近似として役
立った。このアッセイは、試験抗原の存在下における約５日間の脾臓細胞(また
はリンパ節)の再刺激を包含した。次いで、細胞をトリチウム化チミジンでパル
スした後、採取し、同位元素取り込み、ＤＮＡ合成と細胞分割との相関について
アッセイした。このアッセイのアウトプットの単位は、カウント/分(ＣＰＭ)、
同位元素取り込みの直接的な相関であった。所定の細胞集団に見られる非特異的
な活性を示すために、対照媒体のＣＰＭを表に含めた(すなわち、ＨＳＶ１集団
は、試験抗原に対する応答の明白な大きさに影響を与えるかもしれない比較的高
いレベルのバックグラウンド活性を有していた)。

【００７２】結果は、試験抗原で再刺激された所定の免疫原を投与されたマウスの脾臓細胞
の活性を対照(媒体、ベロ細胞培養物上澄み液(sup.)または無関係なウイルス(Ａ
/Ｔｘ-インフルエンザ株))で再刺激された「同一」の細胞集団の活性で割った刺
激指数として表した。ベロsup.の有意性は、すべての結果が約１.０であり、対
照細胞上澄み液と媒体再刺激との間に差がないはずであることであった。特に興
味深いカラムは、細胞をｇＤ、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２(特異的な抗原)で再刺激
したものであった。体液性応答と一致して、最大の増殖活性はｇＤおよびＩＬ-
１２プラスミドプライミングワクチンを与え、ｇＤおよびＩＬ-１２タンパクブ
ーストしたマウスで観察された。

【００７３】

【表４】

【００７４】ＣＴＬアッセイおよび内部サイトカイン染色アッセイの結果を図１および以下
の表３および４に示す。繰り返しの測定をすることなくプールした試料を用いた
ので、これらのデータについて統計学的な分析を行わなかった。しかし、当業者
は、以下で考察するように、正の結果を示すべき広範囲のエフェクター細胞：標
的比について示される応答の大きさおよび活性レベルの相対的な上昇を見出す。

【００７５】図１は、グループ１(ｇＤｐｌ１２ｐｌ/(２))、グループ２(ｇＤｐｌ１２ｐｌ
/ｇＤｐｌ)、グループ３(ｇＤｐｌ１２ｐｌ/ｇＤｐｒ１２ｐｒ)、グループ４(ｇ
Ｄｐｌ１２ｐｌ/ｇＤｐｒ)、グループ１３(生きたＨＳＶ１)およびグループ１４
(生きたＨＳＶ２)のＣＴＬ活性をグラフ形式で示す。これらのグループは、すべ
て他のグループとは対照的にかなりのＣＴＬ活性を与えた。しかし、ｇＤおよび
ＩＬ-１２プラスミドによるプライミングの後、ｇＤサブユニットおよびＩＬ-１
２タンパクによるブーストは、より高いエフェクター：標的比で匹敵する高レベ
ルのＣＴＬ活性をもたらしたが、ウイルス対照動物に死亡が見られた。

【００７６】表３および４は、インターフェロン-γおよびインターロイキン-４の内部サイ
トカイン染色を示す。内部サイトカインデータは、特異的な表現型マーカー(Ｃ
Ｄ３＝パン-Ｔ細胞；ＣＤ４＝ヘルパーＴ細胞；ＣＤ８＝細胞毒性Ｔ細胞)、細胞
活性化のマーカー(ＣＤ２５)およびインターフェロン-γ(ＩＦＮ-γ、タイプ１
応答の相関)またはＩＬ-４(タイプ２応答の相関)の内部表現を同時に有する細胞
の相対的頻度に関係した。これらのアッセイは、免疫化計画に起因するサイトカ
イン分泌細胞の活性化状態および表現型をより良く定義するために行い、図１の
ＣＴＬ結果の補強データとして役立った。抗原カラム(Ａｇ)の参照は、熱不活化
ＨＳＶ２ウイルス(ＨＳＶ２)およびＨＳＶ感染Ａ２０細胞(Ａ２０)であった。内
部ＩＦＮ-γ、ＣＤ４またはＣＤ同時レセプターおよびＣＤ２４Ｔ細胞活性化マ
ーカーの配位染色は、ｇＤＤＮＡおよびＩＬ-１２ＤＮＡによる免疫化後、ｇ
ＤサブユニットおよびＩＬ-１２タンパクによるブーストがＩＦＮ-γ産生細胞の
上昇レベルを発生させたことを示唆した。これらは、ウイルス対照に匹敵するレ
ベルで観察され、ＣＤ４＋表現型プロファイルにより特徴付けられる同様のパタ
ーンに従った。存在すれば、わずかなＩＬ-活性がどの処理グループについても
検出された。一般的には、対照に対して細胞の頻度が約２倍上昇することは、生
物学的に関連する変化を示唆している。

【００７７】

【表５】

【００７８】

【表６】

【００７９】実施例３：ワクチンプロトコルの比較Ａ．プロトコルこの実験には、Ｂａｌｂ/Ｃマウスの１５グループ(ｎ＝５/グループ)を利用し
た。グループ１〜５は、第０日目に筋肉内(ｉ.ｍ.)に、実施例１記載のｐＭＶｇ
Ｄプラスミドを２５μｇの用量で、また、実施例１に上記した２つのＩＬ-１２
プラスミドを３５μｇ/プラスミドの用量でｉ.ｍ.免疫化した。グループ６〜７
には、第０日目に、実施例１に上記した２つのＩＬ-１２プラスミドだけを３５
μｇ/プラスミドの用量でｉ.ｍ.投与した。グループ８〜１５には、第０日目に
免疫化を行わなかった。

【００８０】４週間後、動物のグループに以下の「ブースト」を投与した：グループ１〜５
には、同じ用量および経路を用いて、ｇＤ２およびＩＬ-１２プラスミドの繰り
返し投与を行った。また、グループ６〜７には、それらの最初のプライミング組
成物の繰り返し用量を投与した。グループ８には、肉趾への注射により、容量０
.０３ｍｌ中における１×１０^５ｐｆｕの生きた感染性の野生型ＨＳＶ１ウイル
スＮＳ株を投与した。グループ９には、肉趾への注射により、容量０.０３ｍｌ
中における２×１０^３ｐｆｕの生きた感染性の野生型ＨＳＶ２ウイルス１８６株
を投与した。グループ１０には、４週間目に投与は行わなかった。グループ１１
には、全長ｇＤ２タンパクを３μｇの用量でｉ.ｍ.投与した。グループ１２には
、２００μｇ/用量のリン酸アルミニウムでアジュバントした全長ｇＤ２タンパ
ク(３μｇ/用量)をｉ.ｍ.投与した。グループ１３には、全長ｇＤ２タンパクを
３μｇの用量で、また、ＰＢＳ中におけるｒｍＩＬ-１２ヘテロダイマータンパ
クを１μｇ/ダイマーの用量で、互いにＰＢＳ中で混合し、ｉ.ｍ.投与した。グ
ループ１４には、リン酸アルミニウムでアジュバントしたｇＤ２タンパク(０.３
μｇ/用量)およびｍＩＬ-１２タンパクヘテロダイマータンパク(１.０μｇ/用量
)を互いにＰＢＳ中で混合し、ｉ.ｍ.投与した。グループ１５には、ｍＩＬ-１２
タンパクだけを１μｇ/ダイマーでｉ.ｍ.投与した。

【００８１】８週間の時点で、同じグループの実験動物を以下のように処理した：グループ１および８〜１０には何も与えなかった。グループ２には、第１およ
び第２の用量からなる第３の用量のｇＤ２/ＩＬ-１２プラスミドを与えた。グル
ープ３には、別の用量のｇＤプラスミドだけを与えた。グループ４および１３に
は、全長ｇＤ２タンパクを３μｇの用量で、また、ｒｍＩＬ-１２ヘテロダイマ
ータンパクを１μｇ/ダイマーの用量で、互いにＰＢＳ中で混合し、ｉ.ｍ.投与
した。グループ５および１１には、全長ｇＤ２サブユニットだけを与えた。グル
ープ６には、ＩＬ-１２プラスミドだけを与えた。グループ７には、ＩＬ１２-タ
ンパクだけを与えた。グループ１２には、第２用量のミョウバンでアジュバント
したｇＤサブユニットを与えた。グループ１４には、第２用量のミョウバンでア
ジュバントしたｇＤサブユニットおよびｍＩＬ-１２ヘテロダイマータンパクを
与えた。グループ１５には、第２用量のｍＩＬ-１２ヘテロダイマータンパクだ
けを与えた。

【００８２】１２週間目に、動物から血液を採取し、上記実施例２で説明したＥＬＩＳＡ、
中和アッセイおよびリンパ増殖アッセイに付した。

【００８３】Ｂ．アッセイの結果この実験におけるグループのＥＬＩＳＡおよび中和アッセイ力価を以下の表５
に示す。この実験の結果は上記実施例２の結果と対照的であった。差異はｇＤお
よびＩＬ-１２プラスミドの２回の免疫化の後、アジュバントしていないｇＤサ
ブユニットブースト(グループ３)を与えたグループで最も顕著である。ＥＬＩＳ
Ａおよび中和力価は、タンパクブースティングを行わずに、２つの用量のｇＤプ
ラスミドおよびＩＬ-１２プラスミドにより誘発されたものと有意に異なってい
た。このタイプの観察は、以前、ｇＤおよびＩＬ-１２プラスミドを用いた繰り
返し免疫の場合に見られた。対照的に、ｇＤおよびＩＬ-１２プラスミドによる
２回の免疫化後のｇＤおよびＩＬ-１２タンパクブースト(グループ４)は、ＩＬ-
１２タンパクと共に製剤したリン酸アルミニウムでアジュバントしたサブユニッ
トｇＤからなる２つの接種原(グループ１４)と比較した場合でさえ、極めて高い
ＩｇＧ_２ａＥＬＩＳＡおよび中和力価をもたらした。表１の下の考察を参照。

【００８４】血清学的データの統計学的(ＡＮＯＶＡ)分析は、ｇＤＤＮＡおよびＩＬ-１２
ＤＮＡによる２回の免疫化を行い、ｇＤ/IL-１２タンパクでブーストしたグルー
プ４が、最大の血清抗ＨＳＶ中和力価およびＩｇＧ_２ａ抗ｇＤ力価に関して、他
のすべてのグループよりはるかに優れていることを示した。

【００８５】

【表７】

【００８６】

【表８】

【００８７】

【表９】

【００８８】同じグループのリンパ増殖アッセイ結果を表６に示す。これらの応答は、実施
例２におけるグループのものと類似していた。しかし、付加的な免疫化の後、す
べてｇＤワクチンで３回の免疫化を行ったグループ２、３、４および５は、グル
ープ１４の刺激指数より大きいリンパ増殖応答を示した。これは、伝統的なサブ
ユニット/ＡｌＰＯ_４免疫スキームと比較した場合、混合投与計画プライム/ブー
ストの効果に関する。

【００８９】

【表１０】

【００９０】これらのグループのＣＴＬ活性を表７に示す。これらの実験グループのＣＴＬ
活性の評価は、全集団分析およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の選択的な減少を
包含する。表７は、ｇＤおよびＩＬ-１２プラスミドで２回免疫化し、ｇＤサブ
ユニットおよびＩＬ-１２タンパクでブーストしたマウス由来の細胞でピーク活
性が生じることを示している。減少分析は、細胞溶解が、ほとんど排他的に、混
合表現型が見られたＨＳＶ２対照を除くすべてのグループにおけるＣＤ４＋集団
に起因することを示した。略語「ｎｄ」は非実施を意味する。

【００９１】これらのデータの生物学的な重要性は、伝統的な処理と比較した場合に、混合
投与計画プライム-ブースト動物に帰属する活性の相対的な上昇にある。さらに
、Ｂａｌｂ/Ｃマウスモデルにおいて、実質的にすべてのＣＴＬ活性がＣＤ４＋
細胞集団を分離するという事実は、上記の内部サイトカインデータと密接に相関
する。かくして、プライム-ブースト投与計画は、ＣＤ４/ＣＤ２５/ＩＦＮγ細
胞の頻度における処理に関連した上昇をもたらす。

【００９２】

【表１１】

【００９３】

【表１２】

【００９４】実施例２および３で上記した結果は、ｇＤ２遺伝子およびＩＬ-１２サイトカ
インを発現するプラスミドを用いて免疫応答をプライムした後、ｇＤ２サブユニ
ットＩＬ-１２タンパクからなるブースティング製剤を投与する、ＨＳＶワクチ
ンプロトコル用のプライム-ブースト投与計画の利点を示している。この投与計
画は、タンパクブーストにより有意に増大される優性Ｔｈ１プロファイルをプラ
イムすると思われる。さらに、体液性および細胞性の両方の応答に対するこのタ
イプの投与計画の定性的および定量的な効果が強化される。

【００９５】ＩＬ-１２を用いたＨＳＶｇＤサブユニットワクチンの製剤の魅力は、典型的
にはサブユニットワクチンに関連する、タイプ２優性応答(ＩＬ-４、ＩＬ-５、
ＩＬ-１０の存在および体液性応答の１次誘発により特徴付けられる)からタイプ
１優性プロファイル(細胞性応答の誘発に関連する高レベルのＩＬ-２およびＩＦ
Ｎ-γだけでなく、ＩｇＧサブタイプを固定化する補体を有する)への応答プロフ
ァイルのシフトを調節するこのサイトカインの能力にある。タイプ１応答プロフ
ァイルは、多数の細胞内病原体に対する保護的免疫と密接に関連しており、ＨＳ
Ｖ感染に対する治療的徴候の重要な要素であると考えられている。本発明は、免
疫系を効果的にプライムするＤＮＡ(ＨＳＶｇＤ抗原＋ＩＬ-１２)の能力を活用
する。ここで、免疫系は、次いで、タンパクＨＳＶｇＤ糖タンパクおよびＩＬ-
１２の投与により、有意にブーストされる。

【００９６】本明細書で引用された各々およびすべての特許、特許出願および刊行物の開示
内容は、出典を示すことにより全体として本明細書の一部をなす。本明細書は特
定の具体例に関して開示されているが、当業者が本発明の真の精神および範囲を
逸脱することなく本発明の他の具体例および変形例を案出しうることは明らかで
ある。添付の特許請求の範囲は、すべてのかかる具体例および等価な変形例を包
含すると解釈されることを意図する。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２に記載したアッセイの実験動物に対する細胞毒性Ｔリン
パ球(ＣＴＬ)活性を示すグラフである。このグラフは、エフェクター：標的の割
合に対する特異的溶解率(％)をプロットしたものである。以下の記号は以下の実
験グループを表す：「○」はＨＳＶｇＤ２遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドとＩＬ-１２の２
つのヘテロダイマーをコードするＤＮＡプラスミドとを含有する「第１」のワク
チン(ｇＤｐｌ１２ｐｌ)による２回の同一免疫化を受けた動物を表す。「□」は上記の「第１」のワクチンによる１回の免疫化を受けた後、ＨＳＶ
ｇＤ２遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドだけによる１回の免疫化を受けた(
ｇＤｐｌ１２ｐｌ/ｇＤｐｌ)動物を表す。「◇」は「第１」のワクチン(ｇＤｐｌ１２ｐｌ)を投与された後、ｇＤサブユ
ニットタンパク(ｇＤｐｒ)とＩＬ-１２ヘテロダイマータンパクを含有する「第
２」のワクチン(ｇＤｐｒ１２ｐｒ)による１回の免疫化を受けた動物を表す。「×」は第１のワクチン(ｇＤｐｌ１２ｐｌ)を投与された後、ｇＤサブユニッ
トタンパク(ｇＤｐｒ)だけによる１回の免疫化を受けた動物を表す。「＋」は生ウイルスＨＳＶ１だけを投与された対照動物を表す。「△」は生ウイルスＨＳＶ２だけを投与された対照動物を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マイケル・ダブリュー・プライドアメリカ合衆国10471ニューヨーク州ニューヨーク、アパートメント１ブイ、ブラックストーン・アベニュー3950番 (72)発明者マニンダー・ケイ・シドゥアメリカ合衆国10956ニューヨーク州ニュー・シティ、ローウェル・ドライブ35番Ｆターム(参考） 4C084 AA13 MA13 MA17 MA35 MA37 MA43 MA52 MA59 MA60 MA66 ZB332 4C085 AA03 BA78 BB12 CC08 DD62 DD86 EE01 EE03 EE06 FF13 GG02 GG03 GG04 GG06 GG08

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単純ヘルペスウイルス病原体に対する哺乳動物の保護的免疫
を誘発する方法であって、 (ａ)(ｉ)ＨＳＶ１型または２型ｇＤタンパクをコードするＤＮＡ配列からなる
第１の核酸分子、および (ii)各インターロイキン-１２ヘテロダイマーサブユニットをコードする
ＤＮＡ配列からなる第２の核酸分子からなる有効量のＤＮＡワクチン組成物による少なくとも１回の免疫化；および (ｂ)(ｉ)ＨＳＶ１型または２型ｇＤタンパク；および (ii)ＩＬ-１２ヘテロダイマーからなる有効量のタンパクワクチン組成物による少なくとも１回の後免疫化；の工程からなる方法。
【請求項２】工程(ａ)のＤＮＡワクチン組成物による２回の免疫化が存在
する請求項１記載の方法。
【請求項３】前記ＤＮＡワクチン組成物がさらに局所麻酔薬を前記核酸分
子(ｉ)および(ii)と複合体を形成する量で含有する請求項１記載の方法。
【請求項４】工程(ａ)(ｉ)のＨＳＶｇＤタンパクをコードする前記ＤＮ
Ａ配列がＨＳＶ２型ｇＤタンパクをコードするＤＮＡ配列であり、工程(ｂ)(ｉ)
の前記ＨＳＶｇＤタンパクがＨＳＶ２型ｇＤタンパクである請求項１記載の方
法。
【請求項５】工程(ａ)(ｉ)のＨＳＶｇＤタンパクをコードする前記ＤＮ
Ａ配列がＨＳＶ１型ｇＤタンパクをコードするＤＮＡ配列であり、工程(ｂ)(ｉ)
の前記ＨＳＶｇＤタンパクがＨＳＶ１型ｇＤタンパクである請求項１記載の方
法。
【請求項６】前記第２の核酸分子が、哺乳動物細胞で該ｐ３５タンパクの
発現を導く適当なプロモーターに作動可能なように連結されたＩＬ-１２ｐ３５
配列をコードするＤＮＡ配列からなる第１のプラスミドと、哺乳動物細胞で該ｐ
４０タンパクの発現を導く適当なプロモーターに作動可能なように連結されたＩ
Ｌ-１２ｐ４０配列をコードするＤＮＡ配列からなる第１のプラスミドとを含有
する請求項１記載の方法。
【請求項７】前記第１の核酸分子が哺乳動物細胞で該ｇＤタンパクの発現
を導く適当なプロモーターに作動可能なように連結された前記ｇＤコード化ＤＮ
Ａ配列を含有する請求項１記載の方法。
【請求項８】前記複合体の直径が約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍである請求項
３記載の方法。
【請求項９】前記局所麻酔薬がブピバカインである請求項３記載の方法。
【請求項１０】前記ＤＮＡワクチン組成物がさらにカチオン性脂質、中性
脂質、アニオン性脂質、カチオン性界面活性剤、中性界面活性剤、アニオン性界
面活性剤、カチオン性洗浄剤、中性洗浄剤およびアニオン性洗浄剤からなる群か
ら選択される１種またはそれ以上の化合物を含有する請求項３記載の方法。
【請求項１１】前記ＩＬ-１２ヘテロダイマーサブユニットがｐ３５サブ
ユニットおよびｐ４０サブユニットからなる請求項１記載の方法。
【請求項１２】前記ＤＮＡワクチンが前記タンパクワクチンを投与する２
〜３２週間前に投与される請求項１記載の方法。
【請求項１３】ＨＳＶワクチンキットであって、 (ａ)(ｉ)ＨＳＶ１型または２型ｇＤタンパクをコードするＤＮＡ配列からなる
第１の核酸分子、および (ii)各インターロイキン-１２ヘテロダイマーサブユニットをコードする
ＤＮＡ配列からなる第２の核酸分子からなるＤＮＡワクチン組成物；および (ｂ)(ｉ)ＨＳＶ１型または２型ｇＤタンパク；および (ii)ＩＬ-１２ヘテロダイマーからなるタンパクワクチン組成物からなるキット。
【請求項１４】前記ＤＮＡワクチン組成物がさらに局所麻酔薬を前記核酸
分子(ｉ)および(ii)と複合体を形成する量で含有する請求項１３記載のキット。