CN1222619C - 增强对单纯疱疹病毒疫苗应答的疫苗及其制药应用 - Google Patents

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Abstract

一种诱导和增强哺乳动物抗HSV的保护性和/或治疗性免疫的方法，该方法包括以下步骤：用有效量DNA疫苗组合物进行至少一次免疫，所述DNA疫苗组合物包含含有编码1型或2型HSV gD蛋白的DNA序列的第一种核酸分子和含有编码IL-12异二聚体两种亚单位的DNA序列的第二种核酸分子。该方法还包括用有效量的蛋白疫苗组合物进行至少一次后续免疫，所述蛋白疫苗组合物包含1型或2型HSV gD蛋白以及IL-12异二聚体。在DNA疫苗组合物中可包括一定量的局部麻醉剂，所述局部麻醉剂可与所述核酸分子形成一种或多种复合物。当将用于本方法的疫苗组合物按照本方案以合适有效剂量提供给哺乳动物时，其在免疫的哺乳动物中产生超乎想象好的保护性和/或治疗性抗HSV免疫应答。

Description

增强对单纯疱疹病毒免疫应答的疫苗及其制药应用
发明领域
本发明一般涉及疫苗领域，更具体地说涉及一种诱导抗单纯疱疹病毒免疫的疫苗方案，该方案既使用核酸疫苗，也使用蛋白疫苗，以及使用选定的佐剂。
发明背景
存在许许多多针对某些病原体(例如单纯疱疹病毒(HSV))诱导免疫应答的疫苗制剂。HSV疫苗的核心是1型HSV和2型HSV糖蛋白D(gD)基因。参见G.H.Cohen等， J.Virol.， 62(8)：1932-1940(1988)；H-Y.Chiang等， J.Viroi.， 68(4)：2529-2543(1994)；A.V.Nicola等， J. Virol.， 70(6)：3815-3822(1996)；和美国专利第5,654,174号。
已知的疫苗制剂使用了各种各样的传递载体，用于将如gD基因的抗原提呈至哺乳动物免疫系统，以便激发针对所述病原体的保护性免疫应答。这种“传递载体”包括作为疫苗组分的热灭活或化学灭活完整病毒、完整病毒的蛋白颗粒、病毒载体(如腺病毒或痘苗病毒等)以及基于DNA的载体或质粒。后一类型的HSV gD基因制剂的实例描述于1998年4月30日公开的国际专利申请WO98/17820号和美国专利第5,958,895号。另一方面，其它传递载体可以是例如质粒型载体的附加物，该附加物有助于将抗原传递或提呈至免疫系统。参见例如1998年11月5日公开的国际专利申请WO98/48780号。
针对众多病原体的疫苗的其它变化包括含其它载体的组合物和制剂，所述载体用于传递需要针对其的免疫反应的抗原。这些其它载体可以为通过其自身生物活性增加或增强抗所述抗原的免疫应答的类型。例如，已经发现某些细胞因子和白介素是疫苗组合物的理想“佐剂”。在这些佐剂中最令人感兴趣的是IL-12。参见例如美国专利第5,723,127号和5,571,515号。
作为再一个获得针对任何数量的抗病原体疫苗的合适保护性免疫应答的方法，已经提出了各种疫苗接种方案。例如，先前的研究已经证实，质粒型疫苗可用于激发免疫系统，用另一种形式的相同抗原(诸如蛋白质或重组病毒)进行第二次免疫[S.W.Barnett等，Vaccine， 15(80)：869-873(1997)；N.L.Letvin等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA， 94：9378-9383(1997)；R.A.Gramzinski等， Molecular Med.， 4：109-118(1998)；J.Schneider等， Nature Med..，4：397(1998)；和M.Sedeguh等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 95：7648(1998)]。
尽管有大量关于疫苗和疫苗制剂的信息，但仍旧需要有效的疫苗，特别是在人类诱导或产生足够的抗HSV保护性免疫的有效疫苗。
发明概述
在一个方面，本发明涉及诱导抗单纯疱疹病毒病原体的哺乳动物免疫的方法。该方法包括以下步骤：给予有效量的含第一种疫苗和第二种核酸分子的疫苗组合物，所述第一种疫苗含有包含1型或2型HSV gD蛋白的DNA编码序列的核酸分子，所述第二种核酸分子含有IL-12 p-35和p40异二聚体亚单位的DNA编码序列。所述第二种核酸分子最好含有含IL-12 p35 DNA编码序列的核酸分子和含IL-12 p40 DNA编码序列的核酸分子的均等混合物。
在用此DNA疫苗免疫哺乳动物至少一次之后，该方法还包括用有效量的第二种疫苗组合物免疫哺乳动物至少一次，所述第二种疫苗组合物在合适药用载体中包含蛋白、特别是1型或2型HSV gD蛋白和IL-12异二聚体蛋白。在选择实施方案中，第一种疫苗以含有一定量局部麻醉剂的制剂给予，局部麻醉剂可与第一种疫苗中的核酸分子形成一种或多种复合物。
再一方面，本发明包括HSV疫苗药盒，该药盒含有以上疫苗方法中详细列举的各种组分，以及说明书和适于混合和给予所述疫苗组分的任选装置。
本发明的其它方面和优势在以下的其优选实施方案的详述中进一步描述。
附图简述
图1图示了实施例2所述测定的实验动物的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。该图以特异性裂解百分率对效应细胞：靶细胞比值作图。以下的符号代表以下的实验组：
“○”代表接受“第一种疫苗”的两次相同免疫的动物，所述“第一种疫苗”含编码HSV gD2基因的DNA质粒和编码IL-12的两种异二聚体的DNA质粒(gDpl12pl)；
“□”代表用上述“第一种疫苗”进行一次免疫、然后仅用编码HSV gD2基因的DNA质粒进行一次免疫的动物(gDpl12pl/gDpl)；
“◇”代表接受“第一种疫苗”(gDpl12pl)之后用含gD亚单位蛋白和IL-12异二聚体蛋白(gDpr12pr)的“第二种”疫苗进行一次免疫的动物；
“X”代表接受第一种疫苗(gDpl12pl)之后仅用gD亚单位蛋白(gDpr)进行一次免疫的动物；
“+”代表仅接受活体HSV1病毒的对照动物；和
“△”代表仅接受活体HSV2病毒的对照动物。
发明详述
本发明提供一种有效预防或治疗哺乳动物感染单纯疱疹病毒的疫苗接种方案。此疫苗接种方法包括初免-加强免疫，在哺乳动物诱导针对1型或2型单纯疱疹病毒病原体的保护性和/或治疗性免疫。本发明证实，初免-加强疫苗接种方案增强了据认为是对治疗至关重要的细胞介导免疫，在所述接种方案中，HSV gD在DNA初免阶段、任选DNA加强阶段和使用与gD相同形式的IL-12的蛋白加强阶段给予。该方案证实的广谱免疫还增强抗HSV感染的保护性和/或治疗性免疫。因此，本发明提供了一种用于预防和治疗HSV感染的方法，例如用于HSV接触前和接触后的个体。
I.定义
术语“哺乳动物”包含其一般的含义。尽管本发明最理想的是指对人的效力，但其它灵长类动物以及驯养哺乳动物物种，包括但不限于狗、猫、母牛、马、猪、绵羊、山羊、小鼠、兔和大鼠等，也包含在此定义内。
作为术语在本文可交互使用的“免疫应答”或“免疫性”是指诱导体液(即B细胞)和/或细胞(即T细胞)应答。相应地通过检测将HSV gD抗原引至宿主中而免疫的动物血清中存在的抗原特异性抗体评价体液免疫应答。在以下的一个典型实施方案中，通过酶联免疫吸附测定免疫动物血清或如以下的实施例2所述通过微量中和测定免疫动物血清评价免疫应答。还可如下文所述用CTL测定检测分离自免疫动物脾的淋巴细胞的T细胞应答。
术语“初免”和“加强”具有其在本领域的通常含义。“初免”是指用第一种组合物免疫接种，其在随后用相同的或另一种组合物免疫(“加强”)时诱导的针对抗原的免疫应答水平高于用单一疫苗组合物(例如单独的初免组合物或单独的加强组合物)免疫获得的免疫应答。
本文使用的术语“同源”是指两个聚合分子的序列相似性，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)或两个多肽分子之间的序列相似性。当两个分子上的核苷酸或氨基酸位置都由相同的单体核苷酸或氨基酸占据时，例如两个DNA分子中每一个分子的某个位置都是腺嘌呤，那么它们在该位置同源。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数的正函数，例如如果两个化合物序列的一半位置(例如10个亚单位长度的聚合物中的5个位置)同源，那么两个序列50％同源，如果90％的位置(例如10个位置中的9个)匹配或同源，则两个序列具有90％同源性。举例来说，DNA序列3′ATTGCC5′和3′TATGCG5′具有50％同源性。本文使用的术语“大致同源”是指与目标核酸约50％同源的DNA或RNA，更优选约70％同源，甚至更优选约80％同源，最优选约90％同源。
本文论述的HSV gD或IL-12蛋白和/或DNA序列由其与鉴定序列的同源性或同一性百分比限定，用于计算同源性或同一性百分比的算法包括：Smith-Waterman算法[J.F.Collins等，1988， Comput.Appl.，Biosci.， 4∶67-72；J.F.Collins等，Molecular Sequence Comparison andAlignment，(M.J.Bishop等主编)，载于Practical Approach Series：Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII，IRL Press：Oxford，England，UK(1987)第417页]，以及BLAST和FASTA程序[E.G.Shpaer等，1996， Genomics， 38：179-191]。这些参考文献通过引用结合到本文中。
II.用gD和IL-12 DNA初免
按照本发明，所述方法的第一步或初免步骤包括用有效量的第一种“初免”疫苗免疫接种哺乳动物，所述“初免”疫苗包含含1型和2型HSV gD蛋白DNA编码序列的第一种核酸分子和含IL-12异二聚体每个亚单位的DNA编码序列的第二种核酸分子。此第二种核酸序列可包含两个单独核酸分子的组合物，其中每个核酸分子都编码不同的IL-12异二聚体，或者可以是含两个异二聚体亚单位的双顺反子或者为IL-12亚单位或其生物活性片段融合在一起成为单个分子的单一序列。gD1和gD2蛋白的编码序列是已知的(参见例如GenBank登录号K01408和以上背景技术中提及的文献)，还已知IL-12异二聚体的编码序列(参见例如美国专利第5,457,038号)。
天然HSV gD1或gD2序列优选用于初免疫苗；但是，本发明考虑使用修饰的gD1和gD2序列，在本发明中，这样的核酸序列修饰增强了gD基因的体内免疫原性、稳定性或某些其它药理特性。已知众多的核苷酸序列修饰，下文进行概述。在所述修饰中包括截断或缺失/插入，以缩短或延长天然gD序列。可截断gD序列的5′末端，以除去信号序列或前导序列。或者，可截断gD序列的3′末端，以除去其跨膜结构域或其半胱氨酸富集区。另一个选择是gD分子的5′和3′末端都截断，以使信号序列和跨膜结构域都被去除。修饰的gD基因的再一个实例是缺失天然前导序列或信号序列而被另一个信号序列取代的序列。例如，可在gD的残基285或残基316的氨基酸编码密码子处截断所述序列，以提供可用于本发明的修饰的gD序列。其他修饰可能也有用(参见例如美国专利第5,958,895号描述的片段)。
本发明还包括gD核酸编码序列，该序列以相同读框融合至另一个有助于免疫宿主细胞表达和分泌多肽或有助于所述多肽在细胞中的稳定性的多核苷酸序列，例如，起控制细胞中的多肽转运的分泌序列作用的前导序列。
同样，几个哺乳动物物种(包括鼠和人)的IL-12 p35和p40异二聚体亚单位序列是本领域已知的。选择使用的IL-12亚单位序列最好为给予初免疫苗的哺乳动物物种的天然序列或等位基因序列。例如，最优选用于人类个体的是天然人IL-12异二聚体。而且，本发明考虑使用修饰的IL-12 p35和IL-12 p40序列，在本发明中，所述核酸序列修饰增强了IL-12亚单位基因的体内稳定性或某些其它药理特性。例如，可设计含有连接在一起的两个异二聚体或两个异二聚体的生物相关片段的单个基因。已知众多的核苷酸序列修饰，在下文概述。
编码HSV gD或编码IL-12异二聚体的核苷酸序列也可用于本发明方法的初免疫苗或加强疫苗，所述核苷酸序列具有的序列分别与gD抗原或IL-12细胞因子的氨基酸序列同源，其中所述同源抗原诱导抗HSV的免疫应答或诱导抗IL-12的适当应答。应当将与目标gD编码序列同源的基因看作包括在本发明中，只要它们编码的蛋白质或多肽诱导的抗HSV保护性免疫应答与天然或野生型HSV gD引起的免疫应答大致相似。
制备本发明初免疫苗步骤组分的方法在常规书刊(如Burger等，J.Gen.Virol.， 72：359-367(1991))中有描述，并且是本领域众所周知的。还参见Sambrook等，1989， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York；和Ausubel等，1997， Current Protocols in Molecular Biology，Green & Wiley，NewYork。另一方面，可由商业渠道购买含HSV gD核酸序列或IL-12亚单位核酸分子的合适质粒。
编码gD、IL-12 p35或IL-12 p40的每种核酸序列优选处于调节序列控制之下，所述调节序列控制哺乳动物细胞的每种核酸序列的复制和产物产生。所述术语“启动子/调节序列”是指表达与启动子/调节序列有效连接的核酸需要的DNA序列。在某些情况下，启动子/调节序列可以组织特异性方式起作用，即所述启动子/调节序列仅能在特定组织类型的细胞中驱动表达。在某些情况下，启动子/调节序列可以为核心启动子序列，而在其它情况下，该序列还可以包括增强子序列和以组织特异性方式表达需要的其它调节元件。
本文使用的描述“有效连接的”两个DNA是指含有所述两个DNA中的每一个的单链或双链DNA，并且所述两个DNA在所述单链或双链DNA中以以下方式排列：至少一个DNA序列能够对另一个序列施加其特征性生理效应。当编码gD或IL-12的核酸还含有启动子/调节序列时，该启动子/调节序列最好位于编码序列的5′末端，使得其驱动细胞中的gD或IL-12表达。
这样的调节序列包括但不限于启动子序列、增强子序列、聚腺苷酸序列、剪接供体序列和剪接受体序列。本领域提供大量的所述序列，由这些序列可设计用于本发明的DNA分子。本领域技术人员可容易地在所述已知调节序列中进行选择，以制备本发明分子，所述调节序列的选择对本发明无限制作用。例如，用于为初免疫苗组分的质粒或其它DNA分子的启动子可包括非特异性活性的组成型启动子。这样的启动子包括但不限于反转录病毒LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。也可以使用由外部施加的药物调节的诱导型启动子。诱导型启动子包括但不限于锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子和地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳瘤病毒(MMTV)启动子等等。可用于本发明的其它种类诱导型启动子是那些受特定生理状态(例如温度或急性期或仅在可复制细胞时)调节的启动子。
编码gD或IL-12异二聚体的核酸序列优选以载体或质粒给予。本文使用的术语“载体”是指各种病毒或细菌来源的DNA分子，这些DNA分子设计用来编码外源或异源核酸序列。因此，所述术语包括常规的细菌质粒。所述质粒或载体可包括病毒或噬菌体的质粒序列。所述载体包括染色体载体、游离型载体和病毒来源的载体，例如得自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件和病毒的载体；得自其组合的载体，如得自质粒和噬菌体遗传元件、粘粒和噬菌粒的载体。所述术语还包括将基因由一个细胞转移至另一个细胞的非复制型病毒。所述术语还应包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、痘病毒载体、反转录病毒载体等。细菌载体的实例包括但不限于得自卡介苗(BCG)、沙门氏菌、志贺氏菌和李斯特菌等的序列。因此，一个典型载体是单链或双链噬菌体载体。另一个典型载体是单链或双链RNA或DNA病毒载体。
除了以上提及的调节序列以外，质粒还可含有转录起始和终止位点以及转录区中用于翻译的核糖体结合位点。由构建物表达的成熟转录物的编码部分包括开始的翻译起始密码子和在所翻译多肽末端适当位置的终止密码子。
以上所有的质粒或载体组分都可由本领域已知的物质中选择，并可由药厂获得。不能把对质粒骨架和调节序列的选择看成对本发明是限制性的。
用于本发明初免疫苗接种步骤的gD基因和每个IL-12亚单位最好都存在于单独的质粒中。或者，这些核酸序列中的两个或三个可包含在多顺反子转录物中，即设计用来表达三种基因产物中的两种或全部三种基因产物的单个分子。
因此，初免疫苗在合适的药学或生理学可接受的载体(如等渗生理盐水或等渗盐溶液)中含有HSV gD及IL-12异二聚体核酸编码序列中的一种或多种序列。合适的载体对本领域人员而言是显而易见的，并且主要取决于给予途径。另一方面，由多核苷酸分子组成的所述初免疫苗最好含有任选多核苷酸促进剂或“辅助剂(co-agent)”，如局部麻醉剂、肽、脂质(包含阳离子脂质、脂质体或脂质颗粒)、聚阳离子(如聚赖氨酸)、支链三维聚阳离子(如树枝状晶体(dendrimer)、碳水化合物、阳离子两性分子、去污剂、卞铵表面活性剂)或其它促进多核苷酸转移至细胞的化合物。用于本发明的这种促进剂或辅助剂的非排他性实例描述于美国专利第5,593,972、5,703,055、5,739,118、5,837,533号；1996年4月4日公开的国际专利申请WO96/10038号和1994年8月8日公开的国际专利申请WO94/16737号，这些文献通过引用结合到本文中。
所述局部麻醉剂最优选以和所述核酸分子形成一种或多种复合物的量存在。当所述局部麻醉剂与DNA质粒混合时，其形成各种各样的包装DNA的均一小复合物或颗粒。因此，在本发明初免疫苗组合物的一个实施方案中，所述复合物通过混合局部麻醉剂和1至3种DNA质粒(含两种IL-12亚单位的质粒，或含gD的质粒和含一种或两种IL-12亚单位的质粒，或含gD的质粒和含两种IL-12亚单位的双顺反子质粒，或含gD序列和两种IL-12亚单位序列的单个多顺反子质粒)形成。任何由此混合物产生的单个复合物都可含有各种各样的不同质粒组合。或者，在本发明初免组合物的另一实施方案中，可将局部麻醉剂分别与每种gD质粒和IL-12亚单位质粒预混合，然后将单独的混合物组合成单一初免组合物，以保证在单个疫苗组合物中出现理想质粒比率，前提是所有质粒都以单剂大剂量快速给予。或者，局部麻醉剂和每种质粒可分别混合，并分别给予，以获得目标比率。下文中的术语“复合物”或“一种或多种复合物”用于定义初免疫苗组合物的实施方案，显然该术语包括一种或多种复合物，每种复合物含有含gD和IL-12亚单位质粒的混合物，或分别形成的复合物的混合物，其中每种复合物仅含有一种类型的质粒，或其中每种复合物都包含多顺反子DNA的一种复合物或复合物的混合物。
所述复合物的粒径最好为约50-约150nm。当使用的促进剂为局部麻醉剂(优选丁哌卡因)时，其量优选为占多核苷酸组合物总重的约0.1％-约1.0％(重量)。还参见国际专利申请PCT/US98/22841号，该文献通过引用结合到本文中，该文献讲述将苄铵表面活性剂作为辅助剂加入，优选以约0.001-0.03％(重量)的量给予。按照本发明，局部麻醉剂的量相对于所述核酸分子的存在比率为0.01-2.5％(w/v)与1-10μg/ml核酸。
所述药用组合物还可以含有适于该组合物的选定给予模式的其它添加剂。本发明的组合物还可以含有冻干多核苷酸，其可与其它药学上可接受的赋形剂一起用于开发粉剂、液体剂型或悬浮剂型。参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第2卷，第19版(1995)，例如第95章Aerosols；和国际专利申请PCT/US99/05547，其内容通过引用结合到本文中。如果需要的话，这些组合物的给予途径可以组合或进行调整。
因此，这些初免/加强DNA疫苗可含有适于通过任何常规给予途径给予的添加剂。在某些优选的实施方案中，制备用于给予哺乳动物个体的本发明初免组合物和任选DNA加强组合物的形式为例如液体、粉末、气溶胶、片剂、胶囊、肠溶包衣片剂或胶囊、或栓剂。给予途径包括但不限于胃肠外给予、腹膜内给予、静脉给予、肌内给予、皮下给予、皮内给予、口服给予、局部给予、鼻内给予、肺内给予、直肠给予、阴道给予等。所有这些途径都适于给予这些组合物，并可由主治医师根据治疗的患者和病症以及类似因素进行选择。
一般而言，根据哺乳动物生理状况选择本发明初免组合物的合适剂量，最特别地包括免疫哺乳动物的总体健康状况和体重。这种选择和有效剂量的上调或下调属于本领域的技术范围。
在以下的实施例方法中，初免疫苗的组分同时给予哺乳动物。首先将含gD基因和每种IL-12亚单位的核酸分子混合在合适的药用载体中，然后以单剂一次给予。
或者，设想每种质粒可单独序贯给予。作为初免疫苗步骤的描述性实例，以下的实施例显示给予三种细菌质粒pMVgD2、pMVp35和pMVp40，它们混合并在盐水中肌内给予。还可考虑其它给予方式。
III.任选核酸加强剂
本发明方法还设想了一种任选加强疫苗，其含有的组分和制剂与上述“初免疫苗”相同。此核酸加强剂最好在给予初免疫苗后约4周至约32周给予患者。理想的是，所述核酸加强剂以和上述初免疫苗接种步骤相同的途径和相同的剂量给予。
IV.HSV gD和IL-12异二聚体蛋白加强剂
本发明方法进一步提供蛋白加强疫苗接种步骤。所述方法的该步骤优选包括在用上述“初免疫苗”或用一种或多种上述任选核酸加强剂免疫后约2周至32周，用有效量的蛋白疫苗组合物免疫哺乳动物，所述蛋白疫苗组合物含有1型或2型HSV gD蛋白或其类似物以及IL-12异二聚体或其类似物。
以上提及的HSV gD 1型和2型以及小鼠和人IL-12异二聚体亚单位的DNA序列和蛋白序列是本领域众所周知的。术语“类似物”当用来指本发明使用的gD或IL-12多肽时，意思是全长多肽或基本保留了与所述多肽相同的生物功能或活性的其片段，即起免疫原作用。gD和/或IL-12异二聚体多肽类似物可以为(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代的类似物，这种取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码；(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基的类似物；(iii)其中多肽与另一种化合物(如增加所述多肽半衰期的化合物，如聚乙二醇)融合的类似物；或(iv)其中另外的氨基酸与所述多肽融合的类似物，例如前导序列或分泌序列或用于纯化所述多肽的序列。这样的类似物被认为属于本文论述领域的技术人员的范围之内。本文描述的HSV gD或IL-12异二聚体类似物在保守氨基酸序列差异或不影响序列的修饰或这两方面可以不同于天然存在的蛋白或肽。例如，可以获得保守氨基酸改变，尽管这种氨基酸改变可以改变蛋白或肽的一级序列，但一般不改变其功能。
修饰(一般不改变一级序列)包括多肽的体内或体外化学衍生物，例如乙酰化或羧化。gD或IL-12类似物还包括那些通过糖基化修饰的蛋白，例如在其合成和加工过程中或在进一步加工步骤中改变多肽的糖基化形式获得的蛋白；例如通过将所述多肽暴露于影响糖基化的酶(例如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶)获得的蛋白。本发明类似物还包括氨基酸残基已磷酸化的HSV gD或IL-12序列，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸。类似物还包括已使用普通分子生物学技术修饰的gD或IL-12多肽，以提高对蛋白水解酶降解的抗性或优化溶解性。所述多肽的类似物包括那些含有非天然存在的L-氨基酸的残基的多肽，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。其它可存在于本发明多肽中的已知修饰为(不限于)酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价结合核黄素、共价结合血红素部分、共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、共价结合脂质或脂质衍生物、共价结合磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧化、形成GPI锚、羟化、碘化、甲基化、肉豆寇酰化、氧化、蛋白水解加工、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、t-RNA介导的蛋白氨基酸加成(如精氨酰化蛋白)或遍在蛋白化。
其它修饰(特别是gD蛋白)包括上述缺失gD N端的信号序列或前导序列和/或缺失gD C端的跨膜结构域和/或半胱氨酸富集区或二者均缺失。同样，修饰可包括用另一个信号或前导序列替代所述信号或前导序列。参见例如美国专利第5,958,895号。
获得所述修饰的方法对技术人员而言是众所周知的。参见例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；Wold，F.，“蛋白翻译后修饰：前景与展望”，1-12页，载于POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS，B.C.Johnson主编，Academic Press，New York，1983；Seifter等， Meth.Enzymol.， 182.：626-646(1990)，和Rattan等， Ann.N.Y.. Acad.Sci， 663.：48-62(1992)。
除了基本全长多肽以外，用于本发明的gD和/或IL-12蛋白包括这些多肽的免疫活性片段。本文使用的术语“片段”应用于多肽时，通常为至少约6个连续氨基酸长度，典型为至少约15个或约25个连续氨基酸长度，更典型为至少约40个连续氨基酸长度，经常至少约45个连续氨基酸长度，优选为至少约50个连续氨基酸长度。参见例如描述于美国专利第4,709,011号的gD多肽，该文献通过引用结合到本文中。如果gD蛋白、其类似物或其片段在受试哺乳动物诱导抗1型或2型HSV的保护性免疫应答，则可用于本发明方法。例如，在约残基285处截断的gD蛋白是需要的片段。同样，在约残基316处截断的gD蛋白也是需要的片段。可以选择其它的gD片段。如果IL-12蛋白、其类似物或其片段增强gD蛋白诱导的免疫应答，则可用于本发明方法。
用于本发明蛋白加强疫苗的gD蛋白和IL-12异二聚体不限于本文列举的任何具体示范性方法的产物。实际上，可通过以上引用书刊中的现存方法或通过以上初免疫苗部分引用书刊的方法制备gD蛋白和IL-12异二聚体蛋白。用于疫苗用途的蛋白组合物的分离和生产属于本领域技术范畴。或者，gD和IL-12蛋白可由商业渠道购买。
最好将蛋白加强组合物配制成药用组合物。这样的制剂包含gD蛋白和IL-12异二聚体和药学上可接受的载体(如无菌水或无菌等渗生理盐水)。合适的载体对本领域技术人员而言是显而易见的，并大部分依赖于给予途径。制剂包括但不限于悬浮剂、溶液、油性或水性溶媒的乳浊液、糊剂和植入性缓释制剂或生物降解制剂。所述制剂可进一步包含一种或多种其它成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在胃肠外给予制剂的一个实施方案中，以干燥形式(即粉末或颗粒)提供活性成分，以便在胃肠外给予配制的组合物之前用合适载体(例如无菌无热源水)配制。其它有用的胃肠外给予制剂包括含微晶形式、脂质体制剂或作为生物可降解聚合物系统组分的活性成分的制剂。缓释或植入组合物可包含药学上可接受的聚合物或疏水性物质，如乳浊液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
蛋白加强组合物中可存在的其它组分为佐剂、防腐剂、化学稳定剂或其它抗原性蛋白。通常要优化稳定剂、佐剂和防腐剂，以确定对目标人或动物有效的最佳制剂。合适的代表性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯酚。可使用的合适稳定剂成分包括例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、二磷酸氢钾、乳糖、乳白蛋白水解物和奶粉。常规佐剂用于吸引白细胞或增强免疫应答。这样的佐剂特别包括MPLTM(3-O-脱酰单磷酰脂A；RIBIImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)、矿物油和水、氢氧化铝、Amphigen、Avridine、L121/鲨烯、D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷、pluronicplyois、胞壁酰二肽、杀死的博德特氏菌、皂苷如Quil A或StimulonTMQS21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)和霍乱菌毒素(或者为野生型或者为突变型，例如其中按照国际专利申请PCT/US99/22520号用另一个氨基酸(优选组氨酸)取代氨基酸位置29的谷氨酸，该文献通过引用结合到本文中)。
在某些优选实施方案中，制备的用于给予哺乳动物个体的本发明加强组合物的形式为液体、粉末、气溶胶、片剂、胶囊、肠溶包衣片剂或胶囊、或栓剂。给予途径包括但不限于胃肠外给予、腹膜内给予、静脉给予、肌内给予、皮下给予、皮内给予、口服、局部给予、鼻内给予、肺内给予、直肠给予、阴道给予等。所有这些途径都适于给予这些组合物，并可由主治医师根据治疗的患者和病症以及类似因素进行选择。
一般而言，根据哺乳动物生理条件选择本发明蛋白加强组合物的合适剂量，最特别地包括免疫哺乳动物的总体健康状况和体重。这种对每个患者合适剂量的选择在本领域技术范围内。
在以下的实施例方法中，混合优选的蛋白加强疫苗的组分并以单次注射肌肉给予。还可以将均在合适药用载体中的gD蛋白和IL-12异二聚体分别给予。
V.本发明的药盒
本发明还包括用于诱导增强的HSV保护性和/或治疗性免疫应答的药盒。这样的药盒优选包含初免疫苗组分，即一种或多种如上所述的核酸分子，其含有1型或2型HSV gD基因的DNA编码序列和IL-12 p-35和p40亚单位的DNA编码序列，其中所述gD基因DNA编码序列和所述IL-12异二聚体DNA编码序列都处于控制其在哺乳动物细胞中表达的调节序列控制之下。所述药盒任选含有一定量的局部麻醉剂，所述局部麻醉剂可与这些核酸分子形成一种或多种复合物。所述药盒任选含有如上所述的DNA加强疫苗组分。所述药盒还含有蛋白加强疫苗组分，即在上述药学可接受载体中的1型或2型HSV gD蛋白和IL-12异二聚体。
所述药盒的其它组分包括给予每种组合物的给药器(applicator)。所述术语“给药器”当在本文中使用时，是指众多广为人知的药用组合物给予装置中的任何一种，包括但不限于皮下注射器、基因枪、喷雾器、点滴器、支气管镜、栓剂，用于通过任何合适途径给予人或兽医患者DNA疫苗组分和/或蛋白疫苗组分。其它组分包括所述药盒的使用说明书。
VI.实施例
通过以下的实验实施例进一步详述本发明。提供这些实施例仅用于阐述本发明，除非另有说明，否则没有限制作用。不应当将本发明理解为限于使用特定的DNA质粒和质粒组分，如用作初免DNA疫苗的启动子，也不应当将本发明理解为限于使用本文描述的特定局部麻醉剂。因此，本发明包括任何和所有本文提供内容的显而易见变化。
实施例1：HSV疫苗组分
A.初免疫苗
PMV质粒得自pCMV-β[Clontech，Inc.]，去除了β-半乳糖苷酶位点和SV40聚腺苷酸位点，并用分离自pcDNA3.1[Invitrogen，Inc.]的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸代替缺失的序列。PMV质粒的其它特征包括pUC复制起点、含有SV40剪接供体/受体的内含子和氨苄青霉素抗性基因。如下构建PMVgD质粒：由质粒pww65分离1.5kb的含2型HSV(HSV-2)病毒株186的gD基因的HindIII-BstXI片段[Eisenberg等， J.Virol..， 64∶8(1990)]。用Klenow片段补平5′突出端，然后克隆入PMV质粒的SmaI位点。获得的质粒由CMV启动子表达gD2，并用牛生长激素聚腺苷酸聚腺苷酸化。
包含IL-12异二聚体的质粒是PMVp35和PMVp40，这些质粒如下构建：由质粒pEDIL-12p35和质粒pEDIL-12p40[都得自GeneticsInstitute，Inc.，Cambridge，MA；还参见S.A.Wolf等，J.Immunol.，146.：3074-3081(1991)]分离出为单个SalI-XhoI片段的小鼠IL-12 p35cDNA(650bp)和p40 cDNA(1.0kb)。如上所述将这些片段克隆入各个PMV质粒的SalI-XhoI位点，产生PMVp35和PMVp40。每个质粒由巨细胞病毒启动子表达p35或p40IL-12异二聚体，并含有牛生长激素聚腺苷酸。
如以下实施例2和3的方法所阐述，优选的初免疫苗在0.06ml磷酸缓冲盐水溶液中包含35μg的每种质粒pMVgD、PMVp35和PMVp40。另一方面，在以下实施例的某些实施方案中，所述初免疫苗仅包含pMVgD、IL-12质粒或野生型HSV。含gD的质粒和含IL-12异二聚体的质粒优选以单一组合物肌内(i.m.)给予。然而，或者，所述质粒可序贯共同给予或经不同于以下方法例举途径的途径给予。
B.加强疫苗
配制的用于以下实验的优选加强疫苗包含2型HSV 186病毒株gD蛋白。以杆状病毒生产gD蛋白，然后如V.Landolfi等， Vaccine，11：407-414(1993)所述进行纯化。由Genetics Institute，Inc.，Cambridge，MA获得重组小鼠IL-12异二聚体蛋白。另一方面，可如美国专利第5,457,038号(通过引用结合到本文中)所述制备IL-12蛋白。优选将合适剂量的gD蛋白和IL-12蛋白混合在一起，并在单个部位进行免疫。或者，gD蛋白和IL-12蛋白可序贯共同给予或经不同于以下实施例2和3的方法例举的途径和部位给予。
加强疫苗的一个实施方案包含50μg gD蛋白/ml磷酸缓冲盐水(3μg/剂)、pH7.4。加强疫苗的另一个实施方案包含50μg gD蛋白/ml磷酸缓冲盐水(3μg/剂)和200弘g磷酸铝(Wyeth-Lederle Vaccines)/剂。加强疫苗的再一个实施方案包含50μg gD蛋白/ml磷酸缓冲盐水(3μg/剂)和200μg磷酸铝/剂以及1μg/剂的小鼠IL-12蛋白[Genetics Institute，Inc.]的磷酸缓冲盐水溶液pH7.4。
实施例2：多种疫苗接种方案对比
A. 接种方案
在本实验中使用14组(n＝5只/组)7周龄雌性Balb/c小鼠(CharlesRiver Laboratories)。在第0天，用以下的初免制剂给予各组：
第1-5组在第0天用实施例1描述的pMVgD质粒以25μg剂量和用以上实施例1描述的两种IL-12质粒以35μg/质粒的剂量肌内(i.m.)免疫。
第6-10组和第12组在第0天未接受免疫。
第11组仅在第0天肌内接受35μg/质粒剂量的以上实施例1描述的两种IL-12质粒。
第13组接受1×105pfu活体感染性野生型HSV1病毒NS株(得自费城儿童医院的H.Friedman医生)，在第0天以0.03ml体积经爪垫注射。
第14组接受2×103pfu活体感染性野生型HSV2病毒186株(美国典型培养物保藏中心)，在第0天以0.03ml体积经爪垫注射给予。
4周后，各组动物接受以下的“加强免疫”：
第1组和第6组接受第二次给予(相同剂量和途径)的含gD和IL-12的质粒。
第2组和第7组接受第二次给予(相同剂量和途径)的仅含gD2的质粒。
但是，第3组和第8组接受第二种疫苗组分。以3μg剂量肌内给予如实施例1所述产生和分离自杆状病毒的全长gD2蛋白，并以1μg/二聚体的剂量肌内给予重组小鼠IL-12(rmIL-12)异二聚体蛋白的PBS溶液。第4组和第9组仅接受以3μg剂量肌内给予的全长gD2蛋白的PBS溶液。
第5、10、13和14组未接受第二次给予。
第11组仅接受IL-12异二聚体质粒的第二次给予，给予途径和剂量和第一次给予相同；而第12组仅接受rmIL-12，给予途径和剂量与以上相同。
在最后免疫后4周由所述动物取血并去除脾，如York等， Vaccine，13：1706-1712(1995)所述进行ELISA和淋巴增殖测定。如York等所述(同上)进行CTL测定，该测定进行如下的改变：用HSV2病毒(M.O.I．4pfu/细胞)于37℃、5％CO2中感染A20细胞4小时，并用UV灯灭活。这些细胞以1∶20比率(HSV感染和UV灭活的A20细胞：脾细胞)用作刺激细胞。
另外，使用市售ELVISTM HSV细胞系[Biowhittaker，Inc.]进行HSV-1和HSV2的比色血清微量中和测定。简而言之，该测定包括于37℃、5％CO2下有或没有豚鼠补体的情况下温育预先确定量的所述病毒和各种稀释度的热灭活血清样品或仅仅培养基对照(病毒对照)1小时，接着平板接种在融合单层ELVIS HSV细胞上。在相同的条件下温育后，用ELVIS替换培养基再培养所述单层细胞，并再温育18个小时。去除培养基并加入1.5％NP40-MEM(0.05ml/孔)，每个微孔平板放置于-70℃至少4小时。于37℃融化裂解物之后加入等体积的β-半乳糖苷酶底物，并将所述平板于37℃温育40分钟。测定570nm的OD。中和滴度定义为使病毒对照OD下降50％的血清稀释度。
基本按照具有如下改变的She等， Intern’l Immunol.， 110.：845-957(1999)所述进行胞内细胞因子染色。将脾细胞与热灭活(56℃/30分钟)的HSV2(106pfu/2×106脾细胞)于37℃、5％CO2中温育3天。参比抗原为淋巴细胞标志(CD3、CD4或CD8)、活化抗原CD25和细胞因子(IFN-γ或IL-10)。
B.测定结果
下表1以IgG1、IgG2的几何平均滴度(GMT)和Neut GMT(血清中和活性的几何平均滴度)描述了ELISA和中和测定滴度获得的体液应答。这是测试血清体外中和病毒感染能力的对数转化表达。“上下95％CI”是检测变异性的统计学表述，包括平均限定范围左右的间隔，95％的观测结果都落在该范围内。
简而言之，在gD和IL-12质粒初免和无佐剂gD亚单位加强的小鼠血清中获得最大IgG1滴度。在接受gD和IL-12蛋白加强的小鼠中也发现IgG1滴度升高。接受gD亚单位蛋白和IL-12蛋白加强的gD质粒和IL-12质粒初免小鼠表现出极高的IgG2a抗体滴度。还在单独的gD亚单位加强小鼠中观测到高滴度的IgG2a。该观察结果提示，在用亚单位加强时保持和增强了质粒激发的Th1为主的抗体应答。血清中和滴度与在亚单位加强或亚单位gD和IL-12蛋白加强的质粒免疫小鼠观察到的很高滴度的ELISA相似。
在接受无佐剂gD亚单位(即传统制剂)的小鼠组中，如上所述给予的gD亚单位激发高滴度的IgG1ELISA抗体和中至高水平血清中和抗体。传统配制的亚单位一贯不能诱导IgG2a ELISA抗体或细胞介导(CMI)应答。相比之下，在本发明的实施方案中，与IL-12的联合制剂扩大了包括IgG2a和CMI的应答。DNA初免和亚单位加强使这种应答模式(称为1型应答模式)最大化。参见对比的实施例3的结果。
血清学数据的统计学(ANOVA)分析表明，gD DNA和IL-12 DNA初免和gD/IL12亚单位加强组(第3组)显然是实施例2中的最佳应答组。该组还包括第二高的IgG1抗-gD血清滴度，在这方面，除了gDDNA和IL-12 DNA初免和gD亚单位加强的第4组之外，在统计学上优于所有其它的组。根据血清抗-HSV中和滴度和IgG2a抗-gD滴度，gD DNA和IL-12 DNA初免和gD亚单位加强的第4组是第二佳应答组。第4组和最佳应答的第3组之间的唯一区别是在免疫方案的亚单位加强部分中没有IL-12，这导致IgG2a抗-gD抗体滴度和血清抗-HSV中和滴度较低。所有中和滴度及其对应的IgG1或IgG2a抗-gD抗体滴度的统计学分析表明，IgG2a抗-gD抗体滴度和抗-HSV中和活性之间存在正相关(P＝0.0001)，而在IgG1滴度和中和滴度之间未观察到相关性。
表1A-ELISA IgG1滴度
    组别   初免＝第0周   加强＝第4周     IgG1GMT     上95％CI     下95％CI
    1   gDDNA+IL12DNA   gDDNA+IL12DNA     1161     9772     138
    2   gDDNA+IL12DNA   gDDNA     2004     23933     168
    3   gDDNA+IL12DNA   gD亚单位+IL12蛋白     14825     45082     4875
    4   gDDNA+IL12DNA   gD亚单位     21627     78705     5943
    5   gDDNA+IL12DNA   无     916     13122     64
    6   无   gDDNA+IL12DNA     214     2917     16
    7   无   gDDNA     3155     7145     1396
    8   无   gD亚单位+IL12蛋白     6152     6982     5433
    9   无   gD亚单位     2786     3556     2183
    10   无   无     25     25     25
    11   IL12 DNA   IL12 DNA     25     25     25
    12   无   IL12蛋白     25     25     25
    13   HSV11×105pfu   无     2518     10000     632
    14   HSV22×103pfu   无     126     2388     7
表1B-ELISA IgG2滴度
    组别     初免＝第0周    加强＝第4周     IgG2aGMT     上95％CI     下95％CI
    1     gDDNA+IL12DNA    gDDNA+IL12DNA     6412     11298     3639
    2     gDDNA+IL12DNA    gDDNA     14125     42073     4742
    3     gDDNA+IL12DNA    gD亚单位+IL12蛋白     114551     199986     65615
    4     gDDNA+IL12DNA    gD亚单位     65766     205116     21135
    5     gDDNA+IL12DNA    无     1213     18923     78
    6     无    gDDNA+IL12DNA     181     1824     18
    7     无    gDDNA     2018     3614     1127
    8     无    gD亚单位+IL12蛋白     3069     3890     2427
    9     无    gD亚单位     158     1337     19
    10     无    无     25     25     25
    11     IL12 DNA    IL12 DNA     25     25     25
    12     无    IL12蛋白     25     25     25
    13     HSV11×105pfu    无     4285     5420     3388
    14     HSV22×103pfu    无     14488     69502     3027
表1C-中和滴度
    组别   初免＝第0周   加强＝第4周   中和GMT     上95％CI   下95％CI
    1   gDDNA+IL12DNA   gDDNA+IL12DNA   70     398   12
    2   gDDNA+IL12DNA   gDDNA   243     1230   48
    3   gDDNA+IL12DNA   gD亚单位+IL12蛋白   2594     4256   1581
    4   gDDNA+IL12DNA   gD亚单位   1236     21577   71
    5   gDDNA+IL12DNA   无   17     70   4
    6   无   gDDNA+IL12DNA   5     6   5
    7   无   gDDNA   9     23   3
    8   无   gD亚单位+IL12蛋白   35     101   12
    9   无   gD亚单位   5     5   5
    10   无   无   5     5   5
    11   IL12 DNA   IL12 DNA   5     5   5
    12   无   IL12蛋白   5     5   5
    13   HSV11×105pfu   无   618     1358   281
    14   HSV22×103pfu   无   145     205   103
在表2中显示了淋巴增殖测定的细胞应答结果。该测定列举了免疫细胞的抗原特异性母细胞化，并用作细胞应答的一级近似值。该测定包括存在测试抗原时再刺激脾(或淋巴结)细胞约5天。然后用氚化胸苷脉冲所述细胞，接着收获细胞并测定同位素摄取，同位素摄取与DNA合成和细胞分裂相关。该测定的计量单位是每分钟的脉冲数(CPM)，CPM与同位素摄取直接相关。对照培养基的CPM包括在表2中，以显示在给定的细胞群中观察到的任何非特异性活性(即HSV1群具有相对高的背景活性水平，这可能影响对测试抗原的表观应答程度)。
结果以刺激指数表示，刺激指数即为用测试抗原再刺激的给予特定免疫原的小鼠的脾细胞活性除以用对照再刺激的“相同”细胞群的活性，所述对照包括培养基、Vero细胞培养上清液(sup.)或不相关病毒(A/Tx-一种流感病毒株)。Vero sup.的意义在于所有结果应当为约1.0，对照细胞上清液和培养基再刺激之间没有差异。特别令人感兴趣的列是用gD、HSV1或HSV2(特异性抗原)再刺激的细胞的列。与体液应答相一致，在接受gD和IL-12质粒初免疫苗以及gD和IL-12蛋白加强的小鼠观察到最大增殖活性。
表2-淋巴增殖
 组别     初免   加强   GD   HSV1   HSV2   A/Tx   Verosup.   培养基(CPM)
 1     gDDNA/IL12 DNA   gDDNA/IL12 DNA   4.9   5.0   5.0   1.3   1.0   5540
 2     gDDNA/IL12 DNA   gD DNA   4.0   4.0   3.2   1.4   0.9   3515
 3     gDDNA/IL12 DNA   gD/IL12   8.1   7.2   11.0   1.4   1.0   3576
 4     gDDNA/IL12 DNA   gD   4.7   4.9   7.5   1.7   1.0   5744
 5     gDDNAIL12 DNA   无   3.0   4.1   4.5   1.4   0.9   5070
 6     无   gD DNA/IL12 DNA   1.9   2.1   3.1   1.1   0.8   7551
 7     无   gD DNA   2.9   3.4   4.1   1.6   0.7   3452
 8     无   gD/IL12   2.3   2.0   3.4   2.0   0.8   3873
 9     无   gD   2.8   2.3   1.2   1.2   0.9   5780
 10     无   无   0.6   1.5   1.7   1.3   0.8   4491
 11     IL12 DNA   IL12 DNA   0.7   1.5   1.8   1.7   0.8   2491
 12     无   IL12   0.8   1.5   1.3   1.4   0.7   2802
 13     HSV1   无   0.9   4.6   3.4   0.8   0.9   20025
 14     HSV2   无   1.7   7.1   9.8   1.2   0.8   9050
图1以及下表3和表4报告了CTL测定和胞内细胞因子染色测定的结果。未对这些数据进行统计学分析，因为使用了未重复检测的合并样品。然而，本领域技术人员应当发现，在大范围的效应细胞：靶比值内表现出的应答程度和活性水平相对提高，预示了积极的结果(如下文论述)。
图1以图解形式显示了第1组(gDpl12pl(2))、第2组(gDpl12pl/gDpl)、第3组(gDpl12pl/gDpr12pr)、第4组(gDpl12pl/gDpr)、第13组(活体HSV1)和第14组(活体HSV2)的CTL活性。这些组相比于其它组都产生了可观测的CTL活性。然而，用gD和IL-12质粒初免然后用gD亚单位和IL-12蛋白加强产生高水平的CTL活性，与在病毒对照动物于致死的较高效应物：靶比值观察到的CTL活性相当。
表3和4显示了γ-干扰素和IL-4的胞内细胞因子染色。胞内细胞因子数据与同时携带特异性表型标志(CD3＝全T细胞；CD4＝辅助T细胞；CD8＝细胞毒性T细胞)、细胞活化标志(CD25)和γ-干扰素(IFN-γ与1型应答相关)或IL-4(与2型应答相关)的胞内表达标志的细胞相对频率相关。进行这些测定，以更好地界定可归因于免疫方案的细胞因子分泌性细胞的活性状态和表型，并用作图1的CTL结果的确证数据。抗原列(Ag)的参比是热灭活HSV2病毒(HSV2)和HSV感染的A20细胞(A20)。胞内IFN-γ、CD4或CD共受体和CD24 T细胞活化标志的协同染色提示，用gD DNA和IL-12 DNA免疫然后用gD亚单位和IL-12蛋白加强导致IFN-γ生产细胞的水平提高。这些观测结果水平与病毒对照相当，并符合特征为CD4+表型分布的相似模式。任何处理组都未检测到IL-4活性，即便有也非常少。一般来说，细胞频率相对于对照增加约2倍提示发生了生物相关性变化。
表3-IFNr的活化淋巴细胞群胞内细胞因子染色
    组别    初免     加强   抗原                   染色％
    CD3/IFNγ/CD25     CD4/IFNγ/CD25    CD8/IFNγ/CD25
    1    gDDNA/IL12 DNA     gDDNA/IL12 DNA   HSV2     13.9     14.0    9.3
    2    gDDNA/IL12 DNA     gD DNA   HSV2     11.1     11.7    7.5
    3    gDDNA/IL12 DNA     gD/IL12   HSV2     17.3     24.7    7.9
    4    gDDNA/IL12 DNA     gD   HSV2     10.9     13.9    5.7
    5    gDDNAIL12 DNA     无   HSV2     9.5     14.2    6.2
    6    无     gD DNA/IL12 DNA   HSV2     10.0     7.9    6.0
    7    无     gD DNA   HSV2     8.2     11.8    6.8
    8    无     gD/IL12   HSV2     5.7     7.6    9.8
    9    无     gD   HSV2     2.0     1.3    5.3
    10    无     无   HSV2     4.1     3.5    7.0
    11    IL12 DNA     IL12 DNA   HSV2     2.8     3.0    8.2
    12    无     IL12   HSV2     2.3     2.2    6.1
    13    HSV1     无   HSV2     16.6     19.5    7.2
    14    HSV2     无   HSV2     22.6     27.5    9.8
    3a    gD DNA/IL12DNA     gD/IL2   A20     17.3     25.6    5.0
    对照    HSV1     无   A20     16.4     20.5    6.5
    对照    无     无   A20     6.5     9.4    3.2
表4-IL4的活化淋巴细胞群胞内细胞因子染色
    组别     初免     加强  抗原                 染色％
  CD3/IFNγ/CD25     CD4/IFNγ/CD25    CD8/IFNγ/CD25
    1     gDDNA/IL12 DNA     gDDNA/IL12 DNA  HSV2   1.5     2.7    2.1
    2     gDDNA/IL12 DNA     gD DNA  HSV2   1.3     3.0    3.4
    3     gDDNA/IL12 DNA     gD/IL12  HSV2   2.0     1.7    2.7
    4     gDDNA/IL12 DNA     gD  HSV2   1.9     3.4    1.1
    5     gDDNAIL12 DNA     无  HSV2   1.5     2.4    3.2
    6     无     gD DNA/IL12 DNA  HSV2   1.5     2.4    1.9
    7     无     gD DNA  HSV2   1.1     1.8    3.7
    8     无     gD/IL12  HSV2   1.8     3.1    3.6
    9     无     gD  HSV2   1.6     2.2    3.3
    10     无     无  HSV2   0.5     2.1    1.5
    11     IL12 DNA     IL12 DNA  HSV2   0.9     1.7    2.4
    12     无     IL12  HSV2   0.7     1.6    2.0
    13     HSV1     无  HSV2   0.6     0.2    1.8
    14     HSV2     无  HSV2   0.2     1.6    0.2
    3a     gDDNA/IL12DNA     gD/IL2  A20   0.1     0.6    0.5
    对照     HSV1     无  A20   0.8     0.4    0.0
    对照     无     无  A20   0.0     nd    nd
实施例3：疫苗接种方案比较
A.接种方案
在本实验中使用15组(n＝5只/组)Balb/C小鼠。第1-5组在第0天用实施例1描述的pMVgD质粒以25μg剂量肌内(i.m.)免疫和用以上实施例1描述的两种IL-12质粒以35μg/质粒的剂量肌内免疫。第6-7组在第0天仅肌内接受35μg/质粒剂量的以上实施例1描述的两种IL-12质粒。第8-15组在第0天未接受免疫。
4周后，各组动物接受以下的“加强免疫”：第1-5组使用相同剂量和途径重复给予gD2和IL-12质粒。第6-7组还接受重复剂量的其初免组合物。第8组接受1×105pfu活体感染性野生型HSV1病毒NS株，在第0天以0.03ml/体积经爪垫注射给予。第9组接受2×103pfu活体感染性野生型HSV2病毒186株，在第0天以0.03ml/体积经爪垫注射给予。第10组在第4周未接受给予。第11组接受以3μg剂量肌内给予的全长gD2蛋白。第12组肌内给予全长gD2蛋白(3μg剂量)，佐剂为200μg/剂的磷酸铝。第13组肌内接受全长gD2蛋白(3μg剂量)和以1μg/二聚体剂量和PBS混合在一起的rmIL-12异二聚体蛋白。第14组肌内接受以磷酸铝为佐剂的gD2蛋白(0.3μg/剂)和与PBS混合在一起的mIL-12蛋白异二聚体蛋白(1.0μg/剂)。第15组仅接受1μg/二聚体肌内给予的mIL-12蛋白。
在第8周的时间点，对相同组的实验动物进行如下处理：
第1组和第8-10组未接受给予。第2组接受第三剂gD2/IL-12质粒(第一剂和第二剂包含gD2/IL-12质粒)。第3组仅接受另一剂gD质粒。第4和13组肌内接受3μg剂量的全长gD2蛋白和以1μg/二聚体剂量和PBS混合在一起的rmIL-12异二聚体蛋白。第5和11组仅接受全长gD2亚单位。第6组仅接受IL-12质粒。第7组仅接受IL-12蛋白。第12组接受第二剂铝佐剂化gD亚单位。第14组接受第二剂铝佐剂的gD亚单位和mIL-12异二聚体蛋白。第15组仅接受第二剂mIL-12异二聚体蛋白。
在第12周由所述动物取血并如以上的实施例2所述进行ELISA、中和测定和淋巴增殖测定。
B.测定结果
下表5显示了本实验中各组的ELISA和中和测定滴度。本实验的结果与以上实施例2的结果相反。接受gD和IL-12质粒两次免疫然后用无佐剂的gD亚单位加强的组(第3组)的反差最引人注目。由两剂无蛋白加强的gD质粒和IL-12质粒诱导的ELISA和中和滴度无显著差异。先前用gD和IL-12质粒重复免疫已观察到这种类型的观测结果。相反，用gD和IL-12质粒两次免疫然后用gD和IL-12蛋白加强(第4组)产生极高的IgG2aELISA和中和滴度，甚至在与用IL-12蛋白配制的磷酸铝佐剂亚单位gD两次接种(第14组)相比时也如此。参见表1后的讨论。
血清学数据的统计学(ANOVA)分析表明，接受gD DNA和IL-12DNA两次免疫并用gD/IL-12蛋白加强的第4组，在最高血清抗-HSV中和滴度和IgG2a抗-gD滴度方面远优于所有其它组。
表5A-ELISA IgG1滴度
    组别     初免＝第0周   第一次加强＝第4周   第二次加强＝第8周     IgG1GMT     上95％CI     下95％CI
    1     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   无     2636     9419     736
    2     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA     2851     21979     370
    3     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gDDNA     1374     7780     243
    4     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gD亚单位+12蛋白     4395     5395     3589
    5     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gD亚单位     2173     3311     1426
    6     IL12 DNA   IL12 DNA   IL12 DNA     101     161     64
    7     IL12 DNA   IL12 DNA   IL12蛋白     94     139     64
    8     无   HSV11×105pfu   无     499     2323     107
    9     无   HSV22×103pfu   无     769     1710     347
    10     无   无   无     70     126     39
    11     无   gD亚单位   gD亚单位     5572     7079     4375
    12     无   gD/AlPO4   gD/AlPO4     58479     122462     27990
    13     无   gD+IL12   gD+IL12     9162     11668     7194
    14     无   gD/AlPO4+IL12   gD/AlPO4+IL12     12162     16181     9120
    15     无   IL12   IL12     99     416     24
表5B-ELISA IgG2滴度
    组别     初免＝第0周   第一次加强＝第4周   第二次加强＝第8周     IgG1GMT     上95％CI     下95％CI
    1     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   无     2642     4775     1462
    2     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA     2399     3162     1824
    3     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gDDNA     3548     7745     1626
    4     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gD亚单位+12蛋白     92045     121619     69823
    5     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gD亚单位     3899     18793     809
    6     IL12 DNA   IL12 DNA   IL12 DNA     73     249     21
    7     IL12 DNA   IL12 DNA   IL12蛋白     25     25     25
    8     无   HSV11×105pfu   无     3155     56494     176
    9     无   HSV22×103pfu   无     1986     7211     547
    10     无   无   无     47     97     23
    11     无   gD亚单位   gD亚单位     44     115     17
    12     无   gD/AlPO4   gD/AlPO4     78     312     19
    13     无   gD+IL12   gD+IL12     2891     4667     1795
    14     无   gD/AlPO4+IL12   gD/ALPO4+IL12     22387     39355     12764
    15     无   IL12   IL12     40     93     17
表5C-中和滴度
    组别     初免＝第0周   第一次加强＝第4周   第二次加强＝第8周     中和GMT     上95％CI     下95％CI
    1     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   无     21     105     4
    2     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA     80     473     14
    3     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gDDNA     102     242     43
    4     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gD亚单位+12蛋白     4955     9162     2679
    5     gDDNA+IL12 DNA   gDDNA+IL12 DNA   gD亚单位     266     1919     37
    6     IL12 DNA   IL12 DNA   IL12 DNA     5     5     5
    7     IL12 DNA   IL12 DNA   IL12蛋白     5     5     5
    8     无   HSV11×105pfu   无     708     1462     344
    9     无   HSV22×103pfu   无     136     617     30
    10     无   无   无     5     5     5
    11     无   gD亚单位   gD亚单位     163     558     48
    12     无   gD/AlPO4   gD/AlPO4     365     1778     75
    13     无   gD+IL12   gD+IL12     875     3133     244
    14     无   gD/AlPO4+IL12   gD/AlPO4+IL12     2037     3199     1297
    15     无   IL12   IL12     5     5     5
在表6中显示了上述各组的淋巴增殖测定结果。这些反应与实施例2中各组的反应相似。然而，在再次免疫之后，所有接受3次gD疫苗免疫的第2、3、4和5组都证实淋巴增殖反应高于第14组的刺激指数。与传统亚单位/AlPO4免疫方案相比，该结果与混合方案初免/加强的作用有关。
表6-淋巴细胞增殖
    组别  初免  加强-1     加强-2     gD     HSV1     HSV2     A/Tx     Vero上清液     培养基(CPM)
    1  gDDNA/IL12 DNA  gDDNA/IL12 DNA     无     7.0     1.6     3.8     1.1     1.0     3187
    2  gDDNA/IL12 DNA  gDDNA/IL12 DNA     gDDNA/IL12 DNA     14.1     3.1     7.0     2.2     0.8     1165
    3  gDDNA/IL12 DNA  gDDNA/IL12 DNA     gDDNA     16.9     5.1     10.4     3.5     1.7     1431
    4  gDDNA/IL12 DNA  gDDNA/IL12 DNA     gD/IL12     31.6     5.7     12.7     2.0     0.7     2119
    5  gDDNA/IL12 DNA  gDDNA/IL12 DNA     gD     23.3     3.2     9.5     1.8     1.5     2543
    6  IL12 DNA  IL12 DNA     IL12 DNA     0.5     1.8     3.0     2.5     1.5     1306
    7  IL12 DNA  IL12 DNA     IL12     1.7     2.5     3.8     3.6     2.5     1153
    8  无  HSV1     无     1.5     4.1     4.6     1.6     1.5     9688
    9  无  HSV2     无     5.2     10.4     25.3     2.7     2.3     2485
    10  无  无     无     2.4     2.0     4.1     4.5     1.7     1082
    11  无  gD     gD     11.0     1.9     2.9     2.1     1.0     2793
    12  无  gD/AlPO4     gD/AlPO4     10.8     2.4     4.1     2.8     1.7     2280
    13  无  gD/IL12     gD/IL12     6.7     1.8     5.3     2.2     3.3     8126
    14  无  gD/AlPO4/IL12     gD/AlPO4/IL12     4.5     2.2     4.6     1.5     1.1     4854
    15  无  IL12     IL12     1.9     1.0     1.9     1.4     1.1     4734
表7显示了这些组的CTL活性。列举的这些实验组的CTL活性包括完整细胞群分析以及选择性缺失的CD4+或CD8+细胞。表7表明，在得自gD和IL-12质粒两次免疫并用gD亚单位和IL-12蛋白加强的小鼠的细胞观察到峰值活性。缺失分析表明，所有组的细胞溶解几乎都完全归因于CD4+群，只有观察到混合表型的HSV2对照例外。缩写“nd”表示未进行。
这些数据的生物意义在于和传统治疗相比，活性相对提高见于混合方案初免-加强免疫动物。而且，在Balb/C小鼠模型中实际上所有CTL活性都与CD4+细胞群无关的事实与上述胞内细胞因子数据密切相关。因此，初免-加强方案的治疗在于CD4/CD25/IFNγ细胞率增加。
表7A-CTL活性
    初免  加强#1   加强#2                   效应物：靶比值率
    50     25     12.5     6.25     3.125     1.5     0.75
 gDDNA+IL12DNA  gDDNA+IL12DNA   无  未缺失     19.8     16.8     15.8     12.7     8.9     5.6     1.7
 CD4缺失     0     0     0     0     0     0.2     0
 CD8缺失     19     16     11     9.5     9     7.4     12.4
 gDDNA+IL12DNA  gDDNA+IL12DNA   gDDNA+IL12DNA  未缺失     15.3     16.9     13.2     13.9     11.5     8.3     1.7
 CD4缺失     0     0     0     0     0     0     0
 CD8缺失     18     17.6     14.3     6     4.4     5.1     1.5
 gDDNA+IL12DNA  gDDNA+IL12DNA   gDDNA  未缺失     12.8     16.4     14.4     11     11.2     9.1     4.6
 CD4缺失     0     2.4     0     0     0     0
 CD8缺失     15.2     13     10     6.5     2     3.8     0
 gDDNA+IL12DNA  gDDNA+IL12DNA   gD亚单位IL12蛋白  未缺失     33.9     27.4     25.1     18     16.5     15     6.5
 CD4缺失     0     0     0     0     0     0     1.9
 CD8缺失     43.8     42.6     39.4     24.9     17.7     10     1.6
 gDDNA+IL12DNA  gDDNA+IL12DNA   gD亚单位  未缺失     4     5.5     4.6     5.9     2.7     0     0
 CD4缺失     0     3.4     5     6.4     4.8     2.5     2.7
 CD8缺失     19.1     14.7     10     11.2     3.6     3.3     1.3
 IL12 DNA  IL12 DNA   IL12 DNA  未缺失     4.9     5     4.7     1.3     2.3     1.7     0
 CD4缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
 CD8缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
 IL12 DNA  IL12 DNA   IL12蛋白  未缺失     2.4     3.5     8.4     0.4     1.1     0.4     0.1
 CD4缺失     0.9     2.5     2.7     4.3     3.5     1.3     0.5
 CD8缺失     8.9     7.7     8.6     7.9     9.7     8     3.7
表7B-CTL活性
    初免   加强#1   加强#2                                   效应物：靶比值
    50     25     12.5     6.25     3.125     1.5     0.75
    无   HSV1   无   未缺失     34.5     32.6     43.6     32.3     21.1     11.2     7.7
  CD4缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
  CD8缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
    无   HSV2   无   未缺失     42.2     38.1     36.7     34.9     22     18.7     11.9
  CD4缺失     37.8     29.1     29.7     24.4     16.3     13.4     8.6
  CD8缺失     25.3     22.7     15.7     13.2     12.7     9.1     0
    无   无   无   未缺失     4.8     7.4     0.1     8.9     6.6     4     0.2
  CD4缺失     0.6     0.4     1.4     2.9     3.5     2.7     5
  CD8缺失     9.2     6.8     6.2     2.8     5.2     5     0
    无   gD亚单位   gD亚单位   未缺失     6.6     8.1     9.2     7.8     5.1     4.6     3.1
  CD4缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
  CD8缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
    无   gD-AlPO4   gD-AlPO4   未缺失     6.1     4.9     4.7     9.3     0     0     0
  CD4缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
  CD8缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
    无   gD亚单位IL12蛋白   gD亚单位IL12蛋白   未缺失     22.1     17.8     13.7     10.5     2.5     0.2     0
  CD4缺失     0     0     0     0     0     0     0
  CD8缺失     21.4     15.8     13.3     7.8     3.8     8.7     5.5
    无   gD/AlPO4+IL12蛋白   gD/AlPO4+IL12蛋白   未缺失     0     1.9     7     2.4     3.1     1.4     1.5
  CD4缺失     0     0     0     0     0     0     0
CD8缺失 10.3 11.3 9 8.6 6.9 63     0.4
    无   IL12蛋白   IL12蛋白   未缺失     0.7     1.8     4.9     5.9     5.8     0     0.5
  CD4缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
  CD8缺失     nd     nd     nd     nd     nd     nd     nd
以上实施例2和3描述的结果表明了HSV疫苗程序的初免-加强方案的优势，其中表达gD2基因和IL-12细胞因子的质粒用于激发免疫应答，然后用由gD2亚单位和IL-12蛋白组成的加强制剂加强。该方案似乎激发Th1为主的应答模式，该应答模式被蛋白加强制剂显著增强。此外，还增强了该类方案对体液应答和细胞应答作用的数量和质量。
HSV gD亚单位疫苗和IL-12的制剂的引人注目之处在于该细胞因子调节通常与亚单位疫苗相关的应答模式由2型主要应答(特征为出现IL-4、IL-5、IL-10和主要诱导体液应答)向1型主要模式(具有高水平的IL-2和IFN-γ，与细胞应答以及补体结合IgG亚型有关)转变的能力。1型应答模式与对许多细胞内病原体的保护性免疫密切相关，据认为是HSV感染的治疗性标志中的重要元素。本发明利用了DNA(HSV gD抗原+IL-12)有效激发免疫系统的能力，然后通过给予蛋白HSV gD糖蛋白和IL-12显著加强免疫系统。
本文援引的每个专利、专利申请和出版物的公开内容都通过应用整体结合到本文中。尽管已通过具体的实施方案公开了本发明，但显然本领域其他技术人员可在不偏离本发明的真正精神和范围的情况下，设计出本发明的其它实施方案和改变。应当将所附的权利要求书理解为包括所有这些实施方案和等同变化。

Claims (12)

1.DNA疫苗组合物和蛋白疫苗组合物在制备用于诱导哺乳动物抗单纯疱疹病毒病原体的保护性免疫的疫苗药盒中的应用，其中所述DNA疫苗组合物包括：
(i)含有编码1型或2型HSV gD蛋白的DNA序列的第一种核酸分子，和
(ii)含有编码IL-12异二聚体两种亚单位的DNA序列的第二种核酸分子；以及
所述蛋白疫苗组合物包括：
(i)1型或2型HSV gD蛋白；和
(ii)IL-12异二聚体。
2.按照权利要求1的应用，其中所述DNA疫苗组合物还包含可与所述核酸分子(i)和(ii)形成复合物的一定量的局部麻醉剂。
3.按照权利要求1的应用，其中DNA疫苗组合物的(i)中编码HSV gD蛋白的所述DNA序列为编码2型HSV gD蛋白的DNA序列，而蛋白疫苗组合物的(i)中的所述HSV gD蛋白为2型HSV gD蛋白。
4.按照权利要求1的应用，其中DNA疫苗组合物的(i)中编码HSV gD蛋白的所述DNA序列为编码1型HSV gD蛋白的DNA序列，而蛋白疫苗组合物的(i)中的所述HSV gD蛋白为1型HSV gD蛋白。
5.按照权利要求1的应用，其中所述第二种核酸分子包括含IL-12 p35序列的DNA编码序列的第一种质粒和含IL-12 p40序列的DNA编码序列的第二种质粒，其中所述IL-12 p35序列的DNA编码序列与在哺乳动物细胞中控制所述p35蛋白表达的合适启动子有效连接，所述IL-12 p40序列的DNA编码序列与在哺乳动物细胞中控制所述p40蛋白表达的合适启动子有效连接。
6.按照权利要求1的应用，其中所述第一种核酸分子包含与在哺乳动物细胞中控制所述gD蛋白表达的合适启动子有效连接的所述编码gD的DNA序列。
7.按照权利要求2的应用，其中所述复合物的直径在约50nm至约150nm之间。
8.按照权利要求2的应用，其中所述局部麻醉剂为丁哌卡因。
9.按照权利要求2的应用，其中所述DNA疫苗组合物还包含一种或多种选自以下的化合物：阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质、阳离子表面活性剂、中性表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子去污剂、中性去污剂和阴离子去污剂。
10.按照权利要求1的应用，其中所述IL-12异二聚体亚单位包含p35亚单位和p40亚单位。
11.一种HSV疫苗药盒，其包含：
(a)一种DNA疫苗组合物，其包含：
(i)含有编码1型或2型HSV gD蛋白的DNA序列的第一种核酸分子，和
(ii)含有编码IL-12异二聚体两种亚单位的DNA序列的第二种核酸分子；以及
(b)一种蛋白疫苗组合物，其包含：
(i)1型或2型HSV gD蛋白；和
(ii)IL-12异二聚体。
12.按照权利要求11的药盒，其中所述DNA疫苗组合物还包含可与所述核酸分子(i)和(ii)形成复合物的一定量的局部麻醉剂。
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