EA006233B1 - Комбинированные адъювантные композиции для усиления иммунного ответа у позвоночного животного - Google Patents

Комбинированные адъювантные композиции для усиления иммунного ответа у позвоночного животного Download PDF

Info

Publication number
EA006233B1
EA006233B1 EA200101198A EA200101198A EA006233B1 EA 006233 B1 EA006233 B1 EA 006233B1 EA 200101198 A EA200101198 A EA 200101198A EA 200101198 A EA200101198 A EA 200101198A EA 006233 B1 EA006233 B1 EA 006233B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antigen
peptide
mice
adjuvant
cells
Prior art date
Application number
EA200101198A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200101198A1 (ru
Inventor
Майкл Хэйджен
Original Assignee
Уайт Холдингз Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Уайт Холдингз Корпорейшн filed Critical Уайт Холдингз Корпорейшн
Publication of EA200101198A1 publication Critical patent/EA200101198A1/ru
Publication of EA006233B1 publication Critical patent/EA006233B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

Использование 3-O-деацилированного монофосфорилированного липида А или монофосфорилированного липида А в сочетании с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) или интерлейкином-12 (IL-12) может быть эффективно в качестве сочетания адъювантов в антигенной композиции для усиления иммунного ответа на выбранный антиген у позвоночного хозяина.

Description

Данное изобретение относится к применению 3-О-дезацилированного монофосфорилированного липида А или монофосфорилированного липида А в сочетании с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором или интерлейкином-12, в качестве адъювантной композиции в антигенной композиции для усиления иммунного ответа у позвоночного хозяина на выбранный антиген.
Предпосылки изобретения
Иммунная система использует разнообразные механизмы для борьбы с патогенами. Однако не все эти механизмы обязательно активируются после иммунизации. Защитный иммунитет, вызываемый иммунизацией, зависит от способности вакцины индуцировать соответствующий иммунный ответ для сопротивления или уничтожения патогена. В зависимости от вида патогена это может потребовать клеточного и/или гуморального иммунного ответа.
Современное представление о роли Т-хелперных клеток в иммунном ответе состоит в том, что Тклетки могут быть подразделены на субпопуляции по цитокинам, которые они продуцируют, и этот индивидуальный цитокиновый профиль, наблюдаемый у таких клеток, определяет их функцию. Данная Тклеточная модель включает две главные субпопуляции: клетки ТН-1, которые продуцируют интерлейкин-2 (ГС-2) и гамма-интерферон, усиливающие как клеточный, так и гуморальный (антительный) иммунные ответы; и клетки ТН-2, которые продуцируют интерлейкин-4, интерлейкин-5 и интерлейкин-10 (1Ь-4, 1Ь-5 и ГС-10 соответственно), усиливающие гуморальные иммунные ответы (библиографическая ссылка 1).
Часто желательно усилить иммуногенную эффективность антигена для получения более сильного иммунного ответа в иммунизированном организме и усилить устойчивость хозяина к агенту, несущему антиген. В некоторых случаях желательно изменить иммунный ответ от преобладающего гуморального ответа (ТН-2) на более сбалансированный клеточный (ТН-1) и гуморальный (ТН-2) ответ.
Клеточный ответ включает индукцию ответа, опосредованного СИ8+ СТЬ (цитотоксичными Тлимфоцитами). Такой ответ желателен при разработке вакцин против внутриклеточных патогенов. Защита против разнообразных патогенов требует сильных иммунных ответов слизистой оболочки, высоких сывороточных титров, индукции СТЬ и сильных клеточных ответов. Такие ответы не индуцируются большинством антигенных препаратов, включая традиционные субъединичные вакцины. Одним из таких патогенов является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
Таким образом, существует потребность в разработке составов антигенных композиций, которые способны индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунные ответы у позвоночного хозяина.
Сущность изобретения
Соответственно целью настоящего изобретения является использование адъювантных комбинированных композиций в составе антигенных композиций, содержащих 3-О-дезацилированный монофосфорилированный липид А (МРЬ™) или монофосфорилированный липид А в сочетании с гранулоцитарно-макрофагальным колоннестимулирующим фактором (СМ-С8Р) или интерлейкином-12 (1Ь-12). Адъювант представляет собой вещество, которое усиливает иммунный ответ при совместном введении с иммуногеном или антигеном. Адъювантная композиция по данному изобретению вводится вместе с выбранным антигеном в антигенной композиции. Антигенные композиции по данному изобретению усиливают иммунный ответ у позвоночного хозяина на выбранный антиген. Выбранный антиген может быть полипептидом, пептидом или фрагментом, полученным (1) из патогенного вируса, бактерии, гриба или паразита, или (2) из злокачественной клетки или опухолевой клетки, или (3) из аллергена, который влияет на продукцию 1дЕ, для ослабления аллергических реакций на аллерген, или (4) из амилоидного пептидного белка для профилактики или лечения заболевания, характеризующегося отложением амилоида у позвоночного хозяина. В первом воплощении изобретения выбранный антиген является антигеном ВИЧ. Выбранный антиген ВИЧ может быть белком ВИЧ, полипептидом, пептидом или фрагментом, полученным из указанного белка. В конкретном воплощении изобретения, антиген ВИЧ представляет собой специфический пептид. В других воплощениях изобретения, выбранный антиген является антигеном Нелепа допоггНосас или респираторного синцитиального вируса.
МРЬ™ может находиться в виде водного раствора или в виде стабилизированной эмульсии масло в воде (стабильная эмульсия, или СЭ). В предпочтительном воплощении изобретения, эмульсия масло в воде содержит сквален, глицерин и фосфатидилхолин. В СЭ композиции МРЬ™ является смешанным с СМ-СР8 или 1Ь-12 с образованием антигенной композиции до введения. СМ-С8Р или 1Ь-12 не обязательно добавляют в эмульсию. В предпочтительном воплощении изобретения, МРЬ™ находится в форме СЭ. Антигенная композиция, кроме того, может включать в себя разбавитель или носитель.
Изобретение также относится к способам повышения способности антигенной композиции, содержащей выбранный антиген из (1) антигена патогенного вируса, бактерии, гриба или паразита индуцировать иммунный ответ у позвоночного хозяина, или из (2) антигена злокачественной клетки или ассоциированного с опухолью антигена злокачественной или опухолевой клетки, вызывать терапевтический или профилактический противораковый эффект у позвоночного хозяина, или из (3) аллергена, который влияет на продукцию 1дЕ, ослаблять аллергические реакции на аллерген, или из (4) антигена амилоидного белка для профилактики или лечения заболевания, характеризующегося отложением амилоида, у позво
- 1 006233 ночного хозяина, введением эффективного адъювантного (усиливающего) количества в комбинации с ОМ-С8Р или ГО-12.
Изобретение, кроме того, относится к способам повышения способности антигенной композиции, содержащей антиген, выбранный из антигена патогенного вируса, бактерии, гриба или паразита, активировать цитотоксичные Т-лимфоциты у позвоночного хозяина путем введения эффективного адъювантного (усиливающего) количества в комбинации с ОМ-С8Р или 1Ь-12.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 изображены реципрокные конечные точки титрований, определенные у групп из пяти самок мышей Ва1Ь/с, иммунизированных 25 мкг Т18Р10МЫ(А)(-Су5), мультиэпитопным пептидом из 39 аминокислот, в составе с СРЛ или ΙΡΆ (треугольники), или 50 мкг 2% стабильной эмульсией (СЭ) МРЬ™ (квадраты). Мышей иммунизировали на 0 день и повторно иммунизировали на 28 день. Титры пептид-специфических 1дС. 1дС 1 и 1дС2а определяли в сыворотках, собранных на 42 день с помощью ЕЫ8А.
На фиг. 2 проиллюстрирован эффект одного СЭ, одного МРЬ™ или СЭ МРЬ™ на усиление влияния ОМ-С8Р на титры анти-Т18Р10МЫ(Л)(-Су8) ΙβΟ. Группы из пяти самок Ва1Ь/с иммунизировали 25 мкг Т18Р10ММЛ)(-С.'у5) в 0 день и повторно иммунизировали на 28 день указанными адъювантными композициями. СРА и ΙΡΑ эмульгировали в водном растворе пептида в отношении 1:1. СМ-С8Р использовали в концентрации 10 мкг/доза. МРЬ™ вводили мышам в виде водной композиции в конечной концентрации 50 мкг или как компонент стабильной эмульсии в концентрации 25 мкг с 1% СЭ. Титры определяли через две недели после вторичной иммунизации. Данные представляют собой отдельные титры, определенные у пяти мышей.
На фиг. 3 приведены результаты анализа вирусной нейтрализации. Объединенную сыворотку, взятую на 42 день у мышей, иммунизированных на 0 и 28 дни указанными композициями, разбавляли (1/1600) и добавляли к разведениям Ηΐν^ адаптированных Т-клеток перед добавлением к клеткам АА5 ίη νίΐτο. Через семь дней культивирования супернатант клеточной культуры анализировали на обратную транскриптазу вируса в качестве индикатора вирусной репликации.
На фиг. 4 проиллюстрирована пролиферация клеток селезенки мышей, иммунизированных Т18Р10МЫ(А)(-Су5) и различными адъювантными композициями. Клетки селезенки стимулировали ίη νίΐτο 3,3 мкг/мл Т18Р10МЫ(А)(-Су5) в течение четырех дней. Результаты показаны как изменение внедрения меченого тимидина в результате ίη νίΐτο стимуляции Т18Р10МЫ(А)(-Су5) относительно внедрения при отсутствии стимуляции (разность количества импульсов в минуту).
На фиг. 5 показана активность СТЬ из селезенки, выделенных у мышей через семь дней после вторичной иммунизации. Клетки селезенки собирали у групп из трех мышей Ва1Ь/с, иммунизированных на 0 и 21 дни 50 мкг Т18Р10МЫ(А)(-Су5) включенным в композицию с 50 мкг МРЬ™ в 1% СЭ с или без 10 мкг ОМ-С8Р. Клетки культивировали с пептидом ШУмк, содержащим эпитоп СТЬ, в течение семи дней. В течение последних пяти дней в культуру добавляли 1Ь-2. Эффекторные клетки селезенки добавляли к меченым хромом клеткам Р815, импульсно-меченым НШмк, другим штаммам, обозначенным как ΗΐνΙΙΙΒ, или без пептида, в указанных пропорциях. Процент активности СТЬ рассчитывали как специфическое излучение(имп/мин)-спонтанное излучение(имп/мин) ----------------------------------------- хЮО общий максимум (имп/мин) - спонтанное излучение (имп/мин) «Е:Т» означает отношение эффекторных клеток к меченым.
Подробное описание изобретения
Адъюванты, цитокины и лимфокины представляют собой иммуно-модулирующие соединения, которые обладают способностью усиливать и направлять развитие и профиль иммунных ответов на различные антигены, которые сами по себе являются слабыми иммуногенами. Правильный выбор адъювантов, цитокинов или лимфокинов может индуцировать сильный гуморальный и клеточный иммунные ответы, которые не развились бы в отсутствие адъюванта, цитокина или лимфокина. В частности, адъюванты, цитокины и лимфокины имеют значительные эффекты усиления иммунного ответа на субъединичные и пептидные антигены в вакцинах. Их стимулирующая активность также полезна при развитии антигенспецифических иммунных ответов против белковых антигенов. Для различных антигенов, против которых требуется создание сильных иммунных ответов слизистой оболочки, высоких сывороточных титров, индукция СТЬ и сильные клеточные ответы, комбинации адъюванта и цитокина/лимфокина обеспечивают стимулы, которые не обеспечиваются большинством антигенных препаратов.
Во множестве исследований оценивали различные адъювантные композиции на животных моделях, но в настоящее время единственным адъювантом, разрешенным для широкого использования на людях, является алюм (гидроксид алюминия или фосфат алюминия). Одна группа адъювантов, стабильных эмульсий, содержащих различные комбинации «вода в масле» и «масло в воде», привлекла значительное внимание по причине своей иммунопотенцирующей способности. Эти композиции, как правило, включают различные комбинации метаболизируемых или инертных масел, чье действие заключается в стабилизации и депонировании антигенов в месте введения. Одним из таких адъювантов является неполный адъювант Фройнда (ГРА), который включает минеральное масло, воду и эмульгатор. Полный адъювант
- 2 006233
Фройнда (СЕЛ) представляет собой 1ЕА с добавлением убитых нагреванием микобактерий. Особой проблемой при использовании этих типов адъювантов является раздражение в месте введения, зачастую в результате инфильтраций мононуклеарными клетками, что приводит к образованию гранулематозных очагов. Следовательно, в качестве возможных адъювантов исследуются другие соединения и композиции.
Одним из таких соединений является 3-О-дезацилированный монофосфорилированный липид А (МРЬ™), распространяемый КтЫ 1тиииоСйет Кекеагсй 1пс. (Наш111ои, МТ). МРЬ™ описан в патенте США № 4912094 (2), который включен сюда в качестве ссылки.
Недавно К1Ы 1штииоСйеш Кекеагсй 1ис. разработала метаболизируемую композицию «масло-вводе», которая при объединении с МРЬ™ приводит к образованию стабилизированной эмульсии, обозначенной как СЭ МРЬ™. Стабильную эмульсию получали путем микроожижения МРЬ™ маслом сквалена, глицерином и фосфатидилхолином. Эта композиция представляет собой характерную микроожиженную эмульсию категории ОМР. Эмульсии, содержащие 1 или 2% масла, описаны в экспериментах ниже.
Подкожное или внутримышечное введение СЭ МРЬ™ мышам Ва1Ь/с не приводило к определяемой тканевой патологии в месте введения. В сравнительных целях также получали стабильную эмульсию, содержащую те же самые компоненты, но без МРЬ™. Конкретно, подкожная или внутримышечная иммунизация пептидом ВИЧ Т18Р10М^(А)(+Сук) из 40 аминокислот или пептидом с удаленным цистеином Т1§Р10МИ(А)(-Су8) из 39 аминокислот (отсутствие цистеинового остатка в положении 17 40аминокислотного пептида (+Сук)), включенным в композицию с адъювантом СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Е, не приводила к определяемой инфильтрации или к тканевым нарушениям через две недели после иммунизации.
Также данное изобретение относится к применению монофосфорилированного липида А, предшественника МРЬ™, который также описан в патенте США № 4912094 (2). Кроме того, данное изобретение относится к производным и аналогам МРЬ™ и монофосфорилированного липида А.
Введение цитокинов и лимфокинов в вакцинные композиции свидетельствует о расширении и повышении потенциала вакцины (3). Было показано, что цитокин интерлейкин-12 (1Ь-12) стимулирует и усиливает клеточный иммунитет путем сдвига размножения субпопуляции Т-хелперных клеток в сторону ТН1 цитокинового профиля (т.е. подкласса 1дС2 на модели мыши) (4-6). На мышах было показано, что рекомбинантный мышиный 1Ь-12 усиливает преобладание ТН-1 профиля иммунного ответа (3).
1Ь-12 продуцируется разнообразными антиген-презентирующими клетками, преимущественно макрофагами и моноцитами. Он является ключевым элементом индукции ТН1 клеток из наивных Т-клеток. Было показано, что продукция 1Ь-12 или свойство отвечать на него являются ключевыми при развитии защитных ТН1-подобных ответов, например, при паразитарных инвазиях, особенно при лейшманиозе (7). Эффекты 1Ь-12 опосредованы в большой степени гамма-интерфероном, продуцированным ΝΚклетками и Т-хелперными клетками. Гамма-интерферон является ключевым для индукции антител 1дС2а против Т-зависимых белковых антигенов (8) и 1дС3-ответов на Т-независимые антигены (9). 1Ь-12, первоначально названный как стимулирующий фактор натуральных киллеров, представляет собой гетеродимерный цитокин (10). Экспрессия и выделение белка 1Ь-12 из рекомбинантных клеток-хозяев описаны в опубликованной международной патентной заявке №О 90/05147 (11).
Другим цитокином, который является потенциальным адъювантом, является ОМ-С8Б. ОМ-С8Б представляет собой особый вид колониестимулирующего фактора (С8Б). С8Б представляют собой семейство лимфокинов, которые индуцируют дифференцировку клеток-предшественников в костном мозге в конкретные типы зрелых клеток крови. Как описано в патенте США № 5078996 (12), который включен сюда в качестве ссылки, ОМ-С8Б активирует макрофаги или предшественники-моноциты для опосредования неспецифической противоопухолевой активности. Была описана нуклеотидная последовательность, кодирующая ген ОМ-С8Б человека (12). Плазмидой, содержащей кДНК ОМ-С8Б, трансформировали Е.со11 и депонировали в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 Ишуеткйу Вои1еуатб, Маиаккак, УА 20110-2209, под номером 39900. Как описано в патенте США № 5229496 (13), который включен сюда в качестве ссылки, ген ОМ-С8Е также был вставлен в дрожжевую экспрессирующую плазмиду и депонирован в АТСС под номером 53157. Кроме того, как описано в патенте США № 5073627 (14), который включен сюда в качестве ссылки, последовательность ДНК, кодирующая ОМ-С8Е с удаленными сайтами гликозилирования, была депонирована в АТСС под номером 67231.
Показано, что ОМ-С8Е позитивно регулирует белковые молекулы на антиген-презентирующих клетках, заведомо усиливающие иммунные ответы (15) и влияющие на секрецию 1д в фракционноочищенных В-клетках мышей (16).
Показано, что другие цитокины или лимфокины, включая, но не ограничиваясь ими, интерлейкины 1-альфа, 1-бета, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 и 18, альфа-, бета- и гамма-интерфероны, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и факторы некроза опухоли альфа и бета, имеют иммуномодулирующую активность.
При системном введении любого цитокина или лимфокина необходимо учитывать биологические последствия, связанные с активностью цитокина или лимфокина. Кроме того, эффекты цитокина или
- 3 006233 лимфокина, связанные с развитием антигенспецифических иммунных ответов, должны быть усилены, при поддержании местных концентраций цитокинов или лимфокинов.
В предшествующих исследованиях СМ-С8Р и 1Ь-12 оценивались отдельно друг от друга; наблюдали усиление различных параметров иммунного ответа.
Описанное здесь изобретение демонстрирует, что при комбинировании антигена, СМ-С8Р или 1Ь12, и второго адъюванта, МРЬ™ (предпочтительно в стабильной метаболизируемой эмульсии), усиливаются специфические иммунные ответы на антиген.
Антигены, выбранные для включения в антигенные композиции по данному изобретению, включают пептиды или полипептиды, полученные из белков, а также фрагменты любого из сахаридов, белков, поли- или олигонуклеотидов или других макромолекулярных компонентов. Используемый здесь термин «пептид» включает в себя ряд по крайней мере из шести аминокислот и содержит по крайней мере одну антигенную детерминанту, в то время как «полипептид» является более длинной молекулой, чем пептид, но все же не составляет полноразмерный белок. Используемый здесь термин «фрагмент» подразумевает часть, но меньшую, целого сахарида, белка, поли- или олигонуклеотида или других макромолекулярных компонентов. В случае ВИЧ антигенные композиции по данному изобретению, кроме того, включают полноразмерные белки ВИЧ.
Изобретение иллюстрируется модельной системой, включающей пептидные антигены, полученные из ВИЧ. Эти пептиды описаны или взяты из патентов № 5013548 (17) и 5019387 (18), которые приведены здесь в качестве ссылки и здесь суммированы. Эти пептиды включают аминокислотные последовательности, которые соответствуют области белка оболочки ВИЧ, против которых продуцируются нейтрализирующие антитела и Т-клеточные ответы.
ВИЧ представляет собой ретровирус человека, который является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). ВИЧ инфицирует Т-лимфоциты иммунной системы путем присоединения своего гликопротеина внешней оболочки к молекуле СГО4 (Т4) на поверхности Тлимфоцитов, таким образом, используя молекулу СЭ4 (Т4) в качестве рецептора для проникновения и инфицирования Т-клеток. Попытки стимулировать защитный иммунный ответ, специфический для ВИЧинфекции, путем иммунизации имели очень ограниченный успех. В настоящее время рассматривается ряд подходов с целью определить эффективную и защитную стратегию вакцины. Они включают использование ослабленного и рекомбинантного бактериальных векторов, которые экспрессируют антигенные эпитопы ВИЧ (19), рекомбинантного аденовируса (20) или векторов на основе вируса коровьей оспы (21), ДНК-вакцин (22) и синтетических пептидов, которые содержат различные Т- и В-клеточные эпитопы ВИЧ (23).
Гликопротеин др 120 внешней оболочки ВИЧ, как было показано, способен индуцировать нейтрализующие антитела у человека. Рекомбинантный белок РВ1, составляющий приблизительно третью часть всей молекулы др 120, как было показано, включает часть белка оболочки, который стимулирует образование нейтрализирующих антител. Однако исследования на шимпанзе показали, что ни интактный др120, ни РВ1, не способны индуцировать продукцию высоких титров нейтрализирующих антител.
Традиционными способами были синтезированы короткие пептиды, соответствующие антигенным детерминантам др120 и генерирующие гуморальный ответ против др120, который нейтрализует вирус и индуцирует ответы Т-хелперов и СТЬ против вируса.
Один такой пептид представляет собой пептид Н1У-1ММ, содержащий мультиэпитоп С4/У3, обозначенный как Т18Р10МЫ(А)(+Су8), и его вариант с удаленным цистеином, Т18Р10МЫ(А)(-Су5). Эти пептиды включают эпитопы ТН, ТСТЪ и В, но не индуцируют антитела, которые препятствуют связыванию с СГО4. Ранее было показано, что эти пептиды С4/У3 ВИЧ являются возможными кандидатами для индукции иммунных ответов при совместном введении с СРА или СРА-подобными адъювантами (24-29). Как предварительно было показано, эти пептиды содержат эпитопы, которые вызывают клеточные ответы СЭ4+ ТН-клеток как у мышей, так и у людей, и они содержат как главный нейтрализующий эпитоп, так и сайт узнавания СГО8+ СТЬ, и у мышей Ва1Ь/с, и у людей, которым является НЬА В7+. Недавно на ВИЧинфицированных пациентах была показана как иммуногенность, так и безопасность пептида, состоящего из 39 аминокислот (28).
Т18Р10МЫ(А)(+Су5) имеет следующую последовательность из 40 аминокислот:
Ьук С1п 11е 11е Акп Мс1 Тгр С1п С1и Уа1 С1у Ьук А1а Мс1 Туг А1а Сук Тйт Агд Рго Акп Туг Акп Ьук Агд Ьук Агд 11е Н1к 11е С1у Рго С1у Агд А1а Рйе Туг Тйт Тйт Ьук (8ЕО ГО N0: 1) (26).
Т18Р10МЫ(А)(-Сук) был синтезирован без цистеина в положении 17 и имеет следующую последовательность из 39 аминокислот: Ьук С1п 11е 11е Акп Ме1 Тгр С1п С1и Уа1 С1у Ьук А1а Ме1 Туг А1а Тйт Агд Рго Акп Туг Акп Ьук Агд Ьук Агд 11е Н1к 11е С1у Рго С1у Агд А1а Рйе Туг Тйт Тйт Ьук (8ЕС ГО N0: 2).
Этот остаток цистеина расположен вне функциональных эпитопов, распознаваемых ТН-клетками, СТЬ или В-клетками. Другие пептиды ВИЧ из различных областей вирусного генома описаны в патенте США № 5861243 (30), в патенте США № 5932218 (31), в патенте США № 5939074 (32), в патенте США № 5993819 (33), в патенте США № 6037135 (34), в опубликованной заявке на выдачу европейского патента № 671947 (35), которые также включены сюда в качестве ссылок.
- 4 006233
Антиген ВИЧ может быть белком, полипептидом, пептидом или фрагментом, полученным из указанного белка. Белок может быть гликопротеином, таким как др41, др 120 или др160. Альтернативно, белок может быть белком, кодируемым такими генами как дад, ροϊ, νί£, геу, ург, 1а1, ие£ или еиу. Пептиды, полученные из таких белков, содержат по крайней мере одну антигенную детерминанту (эпитоп) длиной по крайней мере в шесть аминокислот.
Иммунный ответ на пептид ВИЧ может быть усилен с помощью ковалентного связывания (конъюгирования) пептида с молекулой фармацевтически приемлемого носителя. Примеры подходящих молекул носителя включают анатоксин столбняка, анатоксин дифтерии, гемоцианин морского блюдечка и другие пептиды, соответствующие эпитопам Т-клетки гликопротеина др 120 ВИЧ.
В настоящее время предполагается, что успешная стратегия вакцинации против ВИЧ должна вызывать иммунитет слизистой оболочки на ВИЧ, также как и сильный ответ СТЬ. В недавнем исследовании на мышах, используя мультиэпитопный пептид Τ18Ρ10ΜΝ(Α) и холерный токсин в качестве адъюванта для ответа слизистой оболочки, было показано, что интраназальная иммунизация индуцирует нейтрализующие сывороточные антитела 1дС1 (36). Последующее исследование также при использовании пептидов петли У3 ВИЧ выявило индукцию синтеза антител 1дА в слизистой и сильные клеточные ответы, включая ответ пептид-специфических СТЬ (37). Функциональная роль высоких титров системных и нейтрализующих антител в профилактике или стабилизации ВИЧ-инфекции неизвестна, хотя считается, что высокие титры вирус-специфического антитела важны для предотвращения распространения вируса.
В предпочтительном воплощении изобретения получали стабильную эмульсию «масло в воде», содержащую МРЬ™, которую затем смешивали с цитокинами 1Ь-12 или ОМ-С8Р. Данные, представленные ниже, демонстрируют, что эти комбинации приводят к наработке высоких титров ВИЧнейтрализующих сывороточных антител. Комбинация СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р индуцирует наработку высоких титров антиген-специфических антител 1дС и 1дА в своде влагалища у иммунизированных самок мышей. Иммунизация мышей любым из пептидов Τ18Ρ10ΜΝ(Α), включенных в композицию с СЭ МРЬ™ и СМ-С8Р, индуцировала сильный клеточный иммунный ответ, судя по усиленной антигенспецифической клеточной пролиферации и секреции цитокинов в культуре, а также индукции пептидспецифичных ответов СТЬ.
Обычно антиген/адъювантная композиция МРЬ™ или СЭ МРЬ™, комбинированная с ОМ-С8Р или 1Ь-12 и выбранным белком или пептидом, индуцирует наработку высоких титров антигенспецифических и вирус-нейтрализующих антител, существенное изменение в соотношении в подклассе 1дО в сторону большей доли комплемент-связывающих антител 1дО (у мышей в сторону 1дО2а), усиление продукции цитокинов и клеточной пролиферации мононуклеарных клеток в ответ на антигенную стимуляцию ίη νίίτο. Эти свойства не наблюдались у композиций из антигена и СЭ в отсутствие МРЬ™, либо с ОМ-С8Р или 1Ь-12, либо без них. Композиции по данному изобретению также индуцируют сильные клеточные ответы, судя по индукции СТЬ.
Полезным свойством СЭ МРЬ™ является то, что композиция не индуцирует гранулематозное скопление и воспаление в месте введения; такие реакции в месте введения обычно вызываются адъювантными композициями «вода в масле» или «масло в воде».
Способность индуцировать усиленный иммунный ответ с помощью стимулирующих эффектов МРЬ™ в сочетании с ОМ-С8Р или 1Ь-12 в отсутствие местного гранулематозного воспаления не сообщалась для других адъювантных композиций, предлагаемых в настоящее время для лечения ВИЧ.
Проводились ряд исследований для сравнения МРЬ™ (любо с СЭ, либо без нее) плюс ОМ-С8Р или 1Ь-12 с каждым из МРЬ™, СЭ, ОМ-С8Р, 1Ь-12 или СРА/1РА по отдельности или вместе с пептидом ВИЧ. Результаты будут вкратце представлены с более подробным обсуждением в дальнейшем.
В первом эксперименте, мыши Ва1Ь/с, подкожно иммунизированные пептидом Т18Р10М^(А)(-Су§) ВИЧ, содержащим С4/У3, включенным в композицию с МРЬ™ СЭ и ОМ-С8Р, проявляли сывороточные титры 1дО выше 107 всего лишь после двух инъекций. Гуморальный ответ являлся ВИЧнейтрализующим и характеризовался существенным увеличением титров пептид-специфических антител 1дО1, 1дО2а и 1дО2Ь. Клетки селезенки, простимулированные в культуре пептидом, секретировали повышенные количества ГЬ-4, 1Ь-5 и гамма-интерферона. Вместе эти результаты свидетельствуют об индукции сбалансированного ответа типа ТН-1/ТН-2. В промывных жидкостях влагалища мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р, нарабатывались антитела 1дО и 1дА, специфичные по отношению к Т18Р10ММА)(-Су5). Эти результаты показывают, что комбинация СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р с пептидным антигеном ВИЧ приводит к индукции благоприятного профиля иммунного ответа.
В этом первом эксперименте мышь Ва1Ь/с, иммунизированные пептидом Т18Р10М^А)(-Су§) ВИЧ и СЭ-содержащей адъювантной композицией или ОМ-С8Р, проявляли титры пептидспецифических антител 1дО (табл. 1). Стабильная эмульсия (СЭ) «масло в воде», состоящая из сквалена, глицерина и эмульгатора (фосфатидилхолина), проявляла способность увеличивать титры пептидспецифических 1дО при смешивании с Т18Р10М^(А)(-Су§). Титры 1дО, индуцированные иммунизацией 25 мкг Т18Р10М^(А)(-Су§), включенного в композицию с СЭ, индуцировали титры вторичного ответа, которые были равны приблизительно одной пятой таковых, индуцированных у мышей, иммунизированных пептидом и СРА и повторно иммунизированных пептидом в 1РА. Реципиенты вакцины с СРА/1РА обычно в
- 5 006233 ответ на первичную иммунизацию формировали Т18Р10МЫ(А)(-Сук)-специфические титры 1дС. Для сравнения мышей иммунизировали только 25 мкг пептида Т18Р10МЫ(А)(-Сук).
Водные и СЭ композиции МРЬ™ сравнивали по ответам, индуцируемым при иммунизации мышей с адъювантами Фройнда или цитокинами 1Ь-12 и ОМ-С8Р. Реципиенты Т18Р10МЫ(А)(-Сук), смешанного с 1Ь-12, как правило, не проявляли титры пептидспецифических антител в нескольких повторных исследованиях. Напротив, реципиенты ОМ-С8Р или СЭ МРЬ™ плюс Т18Р10МЫ(А)(-Сук) проявляли низкие, но легко обнаруживаемые титры антител 1дС. В ответ на иммунизацию композицией, содержащей СЭ МРЬ™ вместе с пептидом Т18Р10МЫ(А)(-Сук), с добавлением 1Ь-12 или ОМ-С8Р, индуцировались значительно более высокие титры 1дС. Действительно, иммунизация мышей сочетанием СЭ МРЬ™ и СМ-С8Р давала титры вторичного ответа, которые были соответственно больше таковых, определенных у мышей, иммунизированных любой другой исследованной композицией. Титры пептидспецифических 1дС были выше таковых у мышей, иммунизированных даже 125 мкг Т18Р10МЫ(А)(-Сук), включенные в композицию с адъювантами Фройнда.
Желательной особенностью ВИЧ-специфического иммунного ответа является баланс между клеточным и гуморальным компонентами. Установлена взаимосвязь индивидуальных подклассов изотипов иммуноглобулина со сдвигом субпопуляции Т-хелперных клеток в сторону преобладания либо ТН-1, либо ТН-2. Цитокины, секретируемые каждой из этих субпопуляций Т-хелперных клеток, проявляли активность в направлении переключения подклассов 1дС. Конечные точки титрований подкласса 1дС определяли из объединенных сывороток, собранных через две недели после второй иммунизации (табл. 2). Иммунизация мышей только одним Т18Р10МЫ(А)(-Сук) или в составе либо с ОМ-С8Р, либо с 1Ь-12, приводила к отсутствию или низким титрам подкласса 1дС в нескольких повторных исследованиях. Антитела 1дС3 не были обнаружены с помощью ЕЬ18Л. В группах мышей, иммунизированных Т18Р10МЫ(А)(-Сук), эмульгированным в СР А, и повторно иммунизированных 1РА, развивался преимщественно гуморальный 1дС1 иммунный ответ, специфический для Т18Р10МЫ(А)(-Сук). Композиции пептида с СЭ, СЭ МРЬ™, СЭ МРЬ™ + 1Ь-12 или СЭ МРЬ™ + ОМ-С8Р, также индуцировали высокие титры антитела 1дС1. Реципиенты, вакцинированные СЭ композицией, неоднократно демонстрировали высокие титры 1дС1 при невысоких титрах 1дС2а или 1§С2Ь. Включение МРЬ™ в СЭ композиции приводило к увеличению Т18Р10ММ(А)(-Сук)-специфических титров антител 1дС2а и 1§С2Ь. Включение либо 1Ь-12, либо ОМ-С8Р в СЭ МРЬ™ и Т18Р10МЫ(А)(-Сук) приводило к сдвигу отношения титров антител 1дС1:1дС2а. Без цитокинов вакцинная композиция СЭ МРЬ™ вызвала сходные титры 1дС 1 и ЦС2а. Как 1Ь-12, так и СМ-С8Р увеличивали относительные сывороточные концентрации пептидспецифического ЦС2а. Кроме того, комбинация СЭ МРЬ™ и СМ-С8Р также вызвала существенное увеличение титров антител ЦС2Ь. специфических для Т18Р10МЫ(А) (-Сук) (47-кратное по сравнению с СЭ МРЬ™ и 74-кратное по сравнению с СЭ). Титры, нарабатывающиеся у мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р, вместе с пептидом Т18Р10МЫ(А)(-Сук), были согласованно наивысшими в любой группе вакцинированных реципиентов.
Определения высоких титров, измеренных в объединенных сыворотках мышей, иммунизированных Т18Р10МЫ(А)(-Сук), МРЬ™ СЭ и ОМ-С8Р, были характерными для отдельных мышей в пределах группы, титры отдельных мышей в пределах этой группы сравнивали с таковыми у мышей, иммунизированных пептидом с адъювантом Фройнда (на фиг. 1). Было показано, что в среднем отдельные сывороточные титры 1дС, ЦС1 и 1дС2а были сходны с титрами, измеренными в объединенных сыворотках (данные не показаны). Сокомпозиция Т18Р10МЫ(А)(-Сук) с СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р приводит к значительному увеличению титров 1дС, ЦС1 и 1дС2а по сравнению с титрами, индуцированными у мышей, иммунизированных СРА/1РА. Все мыши, иммунизированные СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р, включенным в композицию с пептидом, индуцировали более высокие титры антител 1дС, чем те, которые измеряли у мышей, иммунизированных композицией СРА/1РА. Эти результаты показали, что комбинация СЭ МРЬ™ с ОМ-С8Р генерирует подходящий профиль гуморального иммунного ответа, что определяется высокими титрами пептид-специфических антител, и подходящее распределение подклассов 1дС. Эта композиция обычно индуцирует самые высокие Т18Р10ММ(А)(-Сук)-специфические титры любой используемой композиции вакцины.
Проводили сравнение титров 1дС анти-Т18Р10МЫ(А)(-Сук) у мышей, иммунизированных ОМ-С8Р, включенным в композицию с водным МРЬ™, СЭ или СЭ МРЬ™, для определения эффектов ОМ-С8Р в качестве дополнительного адъюванта (на фиг. 2). Результаты показали, что в этом отдельном воплощении комбинация СЭ МРЬ™ с ОМ-С8Р и пептидом является уникальной для индукции высокого титра антител. МРЬ™ плюс ОМ-С8Р демонстрировал титры, сравнимые с СРА/1РА. Таким образом, адъювантные свойства МРЬ™ и ОМ-С8Р, выглядят синергичными, когда находятся в общем составе, где МРЬ™ находится либо в водной форме, либо в виде стабильной эмульсии.
Затем измеряли Т18Р10МЫ(А)(-Сук)-специфические титры антител в объединенных промывных жидкостях влагалища, полученных у мышей через четыре недели после второй иммунизации (табл. 3). У мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ плюс ОМ-С8Р, формировались высокие титры антител 1дА и 1дС. Титры антител во влагалищной промывной жидкости, полученной у мышей, иммунизированных другими композициями, обычно не обнаруживались. Так как отношение 1дС к к1дА во влагалищной про
- 6 006233 мывной жидкости сдвинуто в сторону 1дС. и так как 1дА не был измерен, невозможно сделать вывод о том, что антитело 1дА, обнаруженное во влагалищной промывной жидкости, является локально синтезируемым слизистой оболочкой. Действительно вероятно, что выявленные титры 1дА и 1дС являются результатом транссудативной иммуноглобулиновой секреции плазматических клеток, расположенных на периферии слизистой оболочки влагалища.
Эти результаты показывают, что мыши, иммунизированные пептидом ВИЧ Т18Р10МИ(А)(-Су8), включенным в композицию с СЭ МРЬ™ в комбинации либо с 1Ь-12, либо с СМ-С8Р, имели высокие титры пептид-специфических сывороточных антител.
Чтобы оценить, были ли эти титры антител функционально эффективными, сыворотку анализировали на ее способность ингибировать инфекцию клеток ίη νίίτο с помощью лабораторного штамма ВИЧ. Анализ измерял активность обратной транскриптазы вируса, которая снижалась в супернатанте культуры клеток, инфицированных соответствующим штаммом ВИЧ. Сыворотка мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ и 6М-С8Р или СЭ МРЬ™ и 1Ь-12, в обоих случаях значительно уменьшала вирусную инфективность (на фиг. 3). Максимальные единицы обратной транскриптазы вируса находились в области от 9481 до 10411. Сыворотка мышей, иммунизированных той же композицией, ингибировала вирусную репликацию. Даже при разведении вируса только 1/20, сыворотка мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ и 6М-С8Р вместе с Т18Р10МЫ(А)(-Су5), ингибировала вирусную репликацию приблизительно на пятьдесят процентов. Титры нейтрализующей сыворотки этой композиции определяли как больше чем 1600, по сравнению с 71 для сыворотки, полученной от мышей, иммунизированных композицией СЭ МРЬ™, 1Ь-12 и пептидом ВИЧ.
Титры анти-Т18Р10МЫ(А)(-Су8) сыворотки из этих групп мышей были сходны (хотя и несколько выше) с теми, которые были вызваны у мышей, иммунизированных СРА и 1РА. Сыворотки мышей, иммунизированных Т18Р10МЫ(А)(-Су5), эмульгированные с СРА/1РА, не демонстрировали ВИЧнейтрализацию в этом анализе. Сыворотки мышей, иммунизированных пептидом и комбинацией СЭ МРЬ™ плюс СМ-С8Р в качестве адъюванта, демонстрировали большую нейтрализующую активность, чем любые другие сыворотки. При эквивалентных разведениях, сыворотки мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ плюс СМ-С8Р и пептидом ВИЧ, нейтрализовали более высокие концентрации вируса, чем сыворотки реципиентов других вакцинных композиций.
Затем измеряли ВИЧ-пептидспецифическую пролиферацию в культуре клеток селезенки. Для измерения клеточной реактивности на Т18Р10МИ(А)(-Су8), клетки селезенки культивировали ίη νίίτο с пептидом или контрольными белками. В анализе измеряли включение 3Н-тимидина в ДНК делящихся клеток (табл. 4). В отличие от клеток селезенки мышей, иммунизированных без адъюванта, клетки селезенки мышей, иммунизированных Т18Р10МИ(А)(-Су8), включенным в композицию с СЭ, активно пролиферировали в ответ на пептид. Клетки селезенки вакцинированных реципиентов не отвечали в культуре на нерелевантный антиген (лизозим) или на безантигенную стимуляцию. На стимуляцию митогеном СопА все группы отвечали одинаково. В пределах большинства групп пролиферативный ответ зависел от указанной антигенспецифической дозы. Все три дозы давали самую высокую степень пролиферации в группах мышей, иммунизированных СМ-С8Р, включенным в композицию с СЭ МРЬ™. Самые низкие пролиферативные ответы были получены у клеток селезенки групп мышей, иммунизированных вакцинами с СРА/1РА или 1Ь-12, включенным в композицию с пептидом ВИЧ. Клетки селезенки мышей, иммунизированных пептидом и либо СЭ, либо СМ-С8Р, включали в себя сходные уровни тимидина в культуре. Эти результаты показали, что сокомпозиции пептида ВИЧ с СЭ МРЬ™ и СМ-С8Р обеспечивают самую высокую пролиферативную активность клеток селезенки мышей в ответ на ίη νίίτο презентированный антиген.
Культивированные клетки селезенки исследовали на их возможность секретировать цитокины 1Ь-4 (табл. 5) и гамма-интерферон (табл. 6) в культуре супернатантов. Эти цитокины измеряли в культурах супернатантов, собранных через три и шесть дней ίη νίίτο после стимуляции антигеном или митогеном. Измерение 1Ь-4, цитокина связанного с Т-хелпером второго типа, показало, что, несмотря на то, что все группы продуцировали на 3 день обнаруживаемые уровни в ответ на стимуляцию митогеном СопА, только мыши, иммунизированные МРЬ™ СЭ или СЭ МРЬ™ плюс 6М-С8Р, продуцировали 1Ь-4 в ответ на стимуляцию пептидом. Только мыши, иммунизированные МРЬ™ СЭ плюс СМ-С8Р и Т18Р10МИ(А)(-Су8), секретировали в культуру обнаружимые уровни 1Ь-4 со всеми дозами пептида, использующимися для стимуляции клеток селезенки. На шестой день культивирования, клетки селезенки мышей, иммунизированных пептидом вместе с СЭ МРЬ™ плюс СМ-С8Р, секретировали более высокие уровни 1Ь-4, чем обнаруживаемые у мышей, иммунизированных пептидом вместе с СЭ МРЬ™, СЭ МРЬ™ плюс 1Ь-12 или СЭ. Уровни 1Ь-4 были даже выше, чем индуцируемые путем стимуляции этих клеток СопА. Культивируемые клетки селезенки мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ плюс СМ-С8Р, также в ответ на стимуляцию Т18Р10МИ(А)(-Су5) в течение шести дней секретировали в культуру обнаруживаемые уровни 1Ь-5 (другой цитокин Т-хелпера второго типа (не показано)). Клетки селезенки ни от каких других групп не продуцировали обнаруживаемого 1Ь-5 в этих культурах.
В ответ на трехдневную стимуляцию культуры СопА, клетки селезенки всех групп мышей секретировали обнаружимые уровни гамма-интерферона в культуре (табл. 6). Только клетки мышей, иммунизи
- 7 006233 рованных СЭ МРЬ™ или СЭ МРЬ™ плюс ОМ-С8Р, или СЭ МРЬ™ плюс ОМ-С8Р, продуцировали обнаружимые уровни гамма-интерферона в ответ на трехдневную стимуляцию пептидом ВИЧ. По завершению шестидневной стимуляции культуры наблюдались более высокие концентрации интерферона гамма в ответ и на СопА, и на пептид. Важными были уровни гамма-интерферона, измеренные в культуре супернатантов клеток селезенки мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ или СЭ МРЬ™ плюс ОМ-С8Р. Клетки селезенки этих двух групп реципиентов выделяли заметно более высокие концентрации гаммаинтерферона в культуре супернатантов, чем клетки селезенки мышей, иммунизированных пептидом вместе с СЭ МРЬ™ плюс 1Ь-12 или СЭ.
Результаты первого эксперимента демонстрируют, что введение МРЬ™ в стабильную эмульсию «масло в воде» и затем совмещение эмульсии с пептидом ВИЧ Т18Р10МИ(А)(-Су5) и ОМ-С8Р, приводили к индукции нейтрализующих антител. Кроме того, сокомпозиция СМ-С8Р вместе с СЭ МРЬ™ и антигеном вакцины приводили к увеличению уровней 1Ь-4, 1Ь-5 и гамма-интерферона, секретируемых в супернатантах культуры, и к усилению пролиферативного ответа клеток селезенки, стимулированных в культуре иммунизирующим антигеном. Такая композиция также индуцирует самый высокие титры 1дС. 1дС2а. и 1дС2Ь при введении любой из вышеперечисленных вакцинных композиций. Только группы мышей, иммунизированные комбинацией СЭ МРЬ™ и СМ-С8Р вместе с пептидом, имели обнаруживаемые титры 1дС и 1дА в промывных жидкостях влагалища согласно числу повторных исследований. Комбинация СЭ МРЬ™, 1Ь-12 и пептида также приводила к увеличению уровней титров 1дС1 и 1дС2а, увеличению вирусной нейтрализации, увеличению пролиферации клеток селезенки и секреции 1Ь-4 и гамма-интерферона.
Иммунизация мышей любым отдельным адъювантом, включенным в композицию с пептидом ВИЧ, не давала иммунный ответ с обнаружением нейтрализующих антител.
Часто наблюдалось, что иммунизация мышей Т18Р10МИ(А)(-Су5), вместе с СЭ МРЬ™ или МРЬ™ в виде водной композиции, индуцировала высокие титры антител. Эти композиции, однако, не индуцируют иммунный ответ с титрами вагинальных антител, титрами нейтрализующих антител (или сильные ответы СТЬ, описанные ниже в эксперименте 8). Иногда, МРЬ™ или СЭ МРЬ™ в комбинации с пептидом индуцировали измеримые титры 1дА и 1дС в промывных жидкостях влагалища. В некоторых исследованиях, комбинация композиции вакцины МРЬ™ либо с 1Ь-12, либо с ОМ-С8Р, приводила к титрам, которые были сходны с теми, которые продуцировались мышами, иммунизированными СРА/1РА, или любой из композиций СЭ МРЬ™ с или без цитокина. Это наблюдение показывает, что форма СЭ МРЬ™ не обязательна для высоких титров антисыворотки, специфичной для пептида ВИЧ. Добавление СМ-С8Р в СЭ носитель приводило к увеличению пептид-специфических титров по сравнению с мышами, иммунизированными только СЭ или СЭ и 1Ь-12. Обычно, однако, индукция высоких титров антител 1дС2а и 1дС2Ь зависела от композиции пептида с СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р. Интересно заметить, что эта композиция индуцировала титры 1дО, которые были сходны с титрами, индуцированными путем иммунизации другими композициями, такими как СРА/1РА и пептид. Комбинацию СЭ МРЬ™ с ОМ-С8Р и пептидом составляли только для демонстрации индукции как высоких титров нейтрализируемых антител, так и СТЬ (см. эксперимент 8). Включение 1Ь-12 вместе с СЭ МРЬ™ и пептидом, также индуцировало благоприятный профиль иммунного ответа. Результаты показали, что сокомпозиция СЭ МРЬ™ и цитокинов ОМС8Р или 1Ь-12 давала качественное различие в гуморальном ответе по сравнению с иммунизацией СРА и 1РА. Это различие, как полагают, относится к повышенным уровням 1дС2а и 1дС2Ь.
Во втором эксперименте использовали протоколы первого эксперимента с Ва1Ь/с-пептид ВИЧ, но с небольшими изменениями. МРЬ™ также вводили в водной форме с или без цитокина.
Иммунизация мышей Ва1Ь/с пептидом ВИЧ Т18Р10МИ(А)(-Су5) без адъюванта не индуцировала существенных титров антител. Напротив, состав пептидного антигена с разнообразными композициями адъювант/цитокин приводил к индукции высоких титров антител после второй иммунизации.
Иммунизация пептидом и 1Ь-12, или только СЭ приводила к титрам, которые были неотличимы от титров, индуцированных композицией без адъюванта (табл. 7). Реципиенты пептидной сокомпозиции с ОМ-С8Р имели ограниченные увеличения титров. По сравнению с реципиентами, получавшими вакцину, содержащую СРА/1РА, микрофлуидированная СЭ МРЬ™ демонстрировала сходные пептидспецифические титры. По сравнению с реципиентами, получавшими вакцину СРА/1РА, СЭ МРЬ™ индуцировала высокие уровни пептид-специфического 1дС2а. Используемые подходы при иммунизации могут влиять на наблюдаемые титры антител. Однако иммунизация мышей МРЬ™ (водный) включенным в композицию с пептидом, индуцировала высокие титры пептид-специфических антител. Добавление ОМС8Р или 1Ь-12 в эти композиции приводило к увеличению титров больше чем 106. Таким образом, комбинация пептида ВИЧ с МРЬ™ и цитокинами, 1Ь-12 или ОМ-С8Р, индуцировала высокие титры антител, специфических для пептида.
Только группы мышей, иммунизированные пептидом и либо МРЬ™, либо 1Ь-12, либо СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р, развивали относительно высокие титры антител, обнаруживаемые в жидкостях, полученных из промывной жидкости влагалища (табл. 8). Действительно, только та группа мышей, которая была иммунизирована МРЬ™ и 1Ь-12 с пептидом, продуцировала пептид-специфический 1дА.
- 8 006233
Пролиферативную способность клеток селезенки в культуре в ответ на ίη νίίτο стимуляцию пептидом определяли путем введения тимидина. Данные в табл. 9 представлены таким способом, чтобы нормировать пролиферацию, стандартизировать по отношению к максимальной пролиферации, полученной при стимуляции СопА. Клетки селезенки мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ вместе либо с ОМ-С8Р, либо с 1Ь-12, а также мышей, иммунизированных только ОМ-С8Р, демонстрировали низкие уровни пептид-ассоциированной пролиферации. Напротив, клетки селезенки мышей, иммунизированных пептидом в комбинации с МРЬ™ и СМ-С8Р. демонстрировали значительную пролиферацию.
Также измеряли продукцию цитокина культивированными ίη νίίτο клетками селезенки. Для 1Ь-4, только мыши, иммунизированные СЭ МРЬ™ в комбинации с ОМ-С8Р и Т18Р10МИ(А)(-Су8), секретировали высокие уровни 1Ь-4 в ответ на стимуляцию пептидом (табл. 10). Для гамма-интерферона, мыши, иммунизированные СЭ МРЬ™ и либо ОМ-С8Р, либо 1Ь-12, или водным МРЬ™ с ОМ-С8Р или с 1Ь12, продуцировали легко обнаруживаемые уровни этого цитокина в супернатанте культуры (табл. 11).
Таким образом, комбинация цитокинов ОМ-С8Р или 1Ь-12 с МРЬ™ или СЭ МРЬ™ индуцировала высокие титры антител, специфических для пептидного антигена. Титры были подобны тем, которые индуцировались при иммунизации мышей пептидом и СРА/1РА. Данные показывают, что эти комбинации также индуцировали самые высокие пролиферативные ответы в клетках селезенки в культуре и стимулировали популяции клеток селезенки, которые секретировали самые высокие уровни гаммаинтерферона в ответ на стимуляцию пептидом.
Результаты этого второго эксперимента показывают, что сокомпозиции Т18Р10МЫ(А)(-Су5) с МРЬ™ и цитокинами СМ-С8Р или 1Ь-12 индуцируют профиль иммунного ответа, подобный вызванному у мышей, иммунизированных пептидом и СРА и повторно иммунизированных пептидом и 1РА или превосходящий его.
Гистологическая оценка (не показана) места введения через две недели после второй иммунизации показала, что мыши, иммунизированные микроожиженным СЭ МРЬ™, не развивали или не поддерживали инфильтрацию мононуклеарных клеток в дерме кожи. Окрашенные гематоксилином/эозином ткани были такими же, как полученные у реципиентов без адъюванта. Напротив, мыши Ва1Ь/с, иммунизированные СРА и 1РА в качестве адъювантов (эмульсия «вода в масле»), имели значительное скопление мононуклеарных клеток в этой области. Реципиенты СЭ МРЬ™ с ОМ-С8Р и пептидом показывали заметное, но минимальное увеличение мононуклеарных клеток по сравнению с реципиентами СЭ МРЬ™ без ОМ-С8Р. Ткани мышей, иммунизированных только ОМ-С8Р и пептидом, не исследовались.
Протоколы второго эксперимента использовали в третьем эксперименте с мышами 8\\'155-\УеЬ51ег используемыми вместо мышей Ва1Ь/с. Мыши 8\\355-\УеЬЧег использовались для определения эффектов адъювантов с пептидным антигеном ВИЧ, где МНС-связанный Т-хелперный эпитоп не влиял на иммунный ответ. Мыши 8\\'155-\УеЬЧег представляют собой аутбридинговый штамм мышей; и, следовательно, никаких клеточных исследований не проводили. В этом эксперименте измеряли только реципрокные конечные точки титрования антител 1дС против пептида ВИЧ и конечные точки титрования антител 1дС и 1дА из промывной жидкости влагалища. Как видно из табл. 12 и 13, профиль ответа был сопоставим измеренным в первом и втором эксперименте у мышей Ва1Ь/с.
В четвертом эксперименте использовались протоколы второго эксперимента с небольшими изменениями и использовались мыши Ва1Ь/с. Как показано в табл. 14, адъювантные композиции МРЬ™ вместе либо с ОМ-С8Р, либо с 1Ь-12, вызывали значительно более высокие ответы 1дС ОМТ, чем один МРЬ™. Как показано в табл. 15, адъювантная композиция СЭ МРЬ™ вместе с ОМ-С8Р вызывала существенный ответ подкласса 1дС2Ь. Адъювантные композиции МРЬ™ вместе либо с ОМ-С8Р, либо с 1Ь-12 вызывали заметно более высокие ответы подкласса 1§С2а, чем один МРЬ™, в то время как композиции СЭ МРЬ™ вместе либо с ОМ-С8Р, либо с 1Ь-12 вызывали более высокие ответы подкласса 1§С2а, чем один МРЬ™. Как показано в табл. 16, адъювантные композиции МРЬ™ вместе либо с ОМ-С8Р, либо с 1Ь-12 вызывали заметно более высокие титры 1дС во влагалищной промывной жидкости, чем один МРЬ™. Наконец, как показано на фиг. 4, адъювантные композиции МРЬ™ вместе либо с ОМ-С8Р, либо с 1Ь-12, так же как и композиции СЭ МРЬ™ вместе либо с ОМ-С8Р, либо с 1Ь-12 демонстрировали более активную пролиферацию клеток селезенки, чем один МРЬ™ или один СЭ МРЬ™ соответственно.
В пятом эксперименте использовались протоколы второго эксперимента с небольшими изменениями и использовались мыши Ва1Ь/с; 1Ь-12 не входил в композиции адъюванта. Как показано в табл. 17, композиции адъюванта, содержащие как МРЬ™, так и ОМ-С8Р, вызывали заметно более высокие ответы 1дС2а и 1дО2Ь, чем один МРЬ™. Кроме того, композиции адъюванта, содержащие как МРЬ™, так и ОМС8Р, вызвали заметно более высокие ответы для всех подклассов 1дО, чем один МРЬ™.
В шестом эксперименте использовались протоколы второго эксперимента с небольшими изменениями и использовались мыши Ва1Ь/с; 1Ь-12 не входил в композиции адъюванта. Пептид ВИЧ представлял собой 40 аминокислот из-за присутствия цистеина в позиции 17 аминокислоты. Как показано в табл. 18, адъювантные композиции, содержащие как СЭ МРЬ™, так и ОМ-С8Р, вызывали значительно более высокие ответы всех подклассов 1дО, чем один МРЬ™, и заметно более высокие ответы всех подклассов, чем один СЭ МРЬ™.
- 9 006233
В седьмом эксперименте использовались протоколы шестого эксперимента с небольшими изменениями и использовались мыши Ва1Ь/с; 1Ь-12 не входил в композиции адъюванта. Как показано в табл. 19, адъювантные композиции, содержащие как СЭ МРЬ™, так и СМ-С8Р, вызывали заметно более высокие ответы для всех подклассов 1дС, чем один СЭ МРЬ™, и композиции адъюванта, содержащие как МРЬ™, так и СМ-С8Р, вызывали заметно более высокие ответы для всех подклассов 1дС. чем один МРЬ™.
В восьмом эксперименте для измерения иммунитета, опосредованного функциональными клетками, оценивали способность клеток селезенки мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ или СЭ МРЬ™ плюс СМ-С8Р, включенным в композицию с мультиэпитопным пептидом Т18Р10МЫ(А)(+Су8), генерировать ответы Н1У-,|\-специфических СТЬ.
Как показано на фиг. 5, клетки селезенки мышей, иммунизированных СЭ МРЬ™ или СЭ МРЬ™ плюс СМ-С8Р, демонстрировали низкую активность в отношении клеток-мишеней, которые были либо немеченые, либо импульсно-меченые, с эпитопом ΙΙΙΒ СТЬ. Клетки селезенки мышей, иммунизированных Т18Р10МЫ(А)(+Су5), включенным в композицию СЭ МРЬ™ и с СМ-С8Р, вместе индуцировали высокую активность ШУ^-специфических СТЬ после единичной иммунизации. Н1УММ-специфический СТЬ-опосредованный лизис клеток-мишеней был заметно увеличен при измерении через семь дней после вторичной иммунизации (на фиг. 5). В отдельных экспериментах мыши, иммунизированные без адъюванта, не стимулировали ответа СТЬ. Мыши, иммунизированные водным МРЬ™ и пептидом, генерировали низкие (<30%) ответы пептидо-специфичных СТЬ.
Единственной трудностью в оценке потенциальной эффективности иммуногенных композиций против ВИЧ, было то, что приматы (не люди), инфицированные ВИЧ, не развивали СПИД-подобных симптомов. Таким образом, возможная модель животного не воспроизводит симптоматику человека, вызванную ВИЧ. К счастью, приматы (не люди), инфицированные вирусом иммунодефицита обезьяны (ВИО), близкородственным ВИЧ, действительно могут развивать СПИД-подобные симптомы.
Это позволяет антигенам ВИО быть оцененным у приматов (не людей). Антиген ВИО может быть белком, полипептидом, пептидом или фрагментом, полученным из указанного белка. Белок может быть гликопротеином, таким как др41, др 120 или др 160. Альтернативно, белок может быть белком, кодирующимся такими генами, как дад, ро1, νί£, геу, ург, 1а1, пе£ или еиу. Пептиды, полученные из таких белков, содержат по крайней мере одну антигенную детерминанту (эпитоп) длинной по крайней мере шесть аминокислот.
Аналогично с ВИЧ, у приматов (не людей) используется мультиэпитопные пептиды ВИО. Изучение проводилось для оценки возможности вызывать ответ СТЬ различными пептидами в сочетании с СЭ МРЬ™ и СМ-С8Р. Резус-макаки были подкожно иммунизированы на 0, 4, 8 и 18 неделе СЭ МРЬ™ и СМ-С8Р вместе с любым из следующих трех пептидов (см. табл. 20):
(1) . Каждый пептид содержал следующий эпитоп СТЬ в контексте Мати А*01:
Суз ТЬг Рго Туг Азр Не Азп О1п Ме1 (8Е6) ΙΌ N0: 3) (дад) (38, 39)
8ег ТЬг Рго Рго Ьеи Уа1 Агд Ьеи Уа1 (8ЕУ) ΙΌ N0: 4) (ро1) (40)
Туг А1а Рго Рго Йе 8ег 61у 61п Йе (8В6) ΙΌ N0: 5) (епу) (40) (2) . Альтернативно, каждый из этих трех пептидов был связан со смешанным эпитопом Т-хелпера, имеющим следующую последовательность:
С1и Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуз Уа1 Уа1 Ьуз Не С1и Рго Ьеи С1у Уа1 А1а Рго ТЬг Ьуз А1а (8ЕЦ ΙΌ N0: 6) (приспособленный из 41).
Таким образом, эти три пептида имели следующие последовательности:
С1и Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуз Уа1 Уа1 Ьуз Не С1и Рго Ьеи С1у Уа1 А1а Рго ТЬг Ьуз А1а Суз ТЬг Рго Туг Азр Не Азп С1п Ме1 (8Е6) ΙΌ N0: 7)
С1и Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуз Уа1 Уа1 Ьуз Не С1и Рго Ьеи С1у Уа1 А1а Рго ТЬг Ьуз А1а 8ег ТЬг Рго Рго Ьеи Уа1 Агд Ьеи Уа1 (8ЕУ) ΙΌ N0: 8)
С1и Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуз Уа1 Уа1 Ьуз Не С1и Рго Ьеи С1у Уа1 А1а Рго ТЬг Ьуз А1а Туг А1а Рго Рго Не 8ег С1у 01п Не (8ЕУ) ΙΌ N0: 9)
Гепаринизированную кровь собирали каждые две недели и мононуклеарные клетки периферической крови анализировали на СТЬ с помощью теста с высвобождением 51 Сг, тетрамерного окрашивания свежих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) и тетрамерного окрашивания культивированных РВМС. Тетрамерное окрашивание свежего РВМС и цитолитический лизис, определенный высвобождением 51 Сг, не обнаруживали никакой активности. Однако иммунизация резус-макаки в контексте Мати А*01 ТН/СТЬ пептидными коктейлями включенным в композицию с СЭ МРЬ™ и СМ-С8Р, приводила к обнаружению тетрамер-положительных СЭ8+ Т-клеток. Результаты, представленные в табл. 21-24, показывают, что процент положительных, тетрамер-положительных СЭ8+ (табл. 21-23) или СЭ4+ (табл. 24) Т-клеток обнаруживается у РВМС, культивированных с соответствующим пептидом в течение 11 дней.
В целом, все четыре Мати А*01 положительных животных, иммунизированных либо эпитопами СТЬ (НЬ 55, НЬ 142), либо без эпитопов ТЬ (НЬ 73, НЬ 80), демонстрировали СЭ8+ тетрамерположительные клетки, специфические для либо дад, ро1, либо епу. Как ожидалось, никаких тетрамерположительных СЭ8 клеток не было обнаружено у Мати А*01 негативных животных (НЬ 41, НЬ47).
- 10 006233
Иммунные ответы, специфические дад и сну ВИО, наблюдали после праймирования, в то время как ро1 специфическую тетрамер-позитивность наблюдали после повторной иммунизации. Поскольку заключительная повторно иммунизирующая доза, вводимая на 18 неделе, не давала дальнейшего повышения ответа, данные в табл. 21-24 после 14 недели не представлены.
В итоге, иммунизация резус-макак в контексте Мати*А01 пептидными коктейлями, содержащими Т11/ВИО дад, ро1 и сну СТЬ-эпитопы, включенными в композицию с СЭ МРЬ™ и человеческим СМ-С8Р, вызывала клеточные ответы, как было показано с помощью чувствительного и тетрамерным анализом.
Белок порин В №к§епа допоггйоеае, также известный как РГО белок, был рекомбинантно экспрессирован (42, приведен здесь в качестве ссылки) и является кандидатом на роль антигена для профилактики или лечения инфекций, вызванных №к§епа допоттйоеае.
Проводили ряд исследований для сравнения МРЬ™ (либо с, либо без СЭ) плюс СМ-С8Р или ГО-12, с одиночным МРЬ™ (либо с, либо без СЭ), вместе с модифицированной формой белка порина В Меккепа допоттйоеае, в котором 16 аминокислот на Ν-конце являются фаговыми, а затем зрелой формой белка порина В. Краткое изложение результатов представлено далее.
В первом эксперименте мышей 8^1кк-^еЬк1ег подкожно иммунизировали в ягодичную область рекомбинантным белком порином В, генерирующим титры антиген-специфических антител, демонстрируя, что белок порин В является жизнеспособным кандидатом на роль антигена. Добавление СМ-С8Р в МРЬ™ и белка порина В приводило к повышению сывороточных титров антител ΙβΟ и ΙβΟ2, по сравнению с реципиентами МРЬ™ и белка порина В (см. табл. 25 и 26).
Во втором эксперименте мышей 8\ук5-\УеЬ51ег подкожно иммунизировали в ягодичную область белком порином В плюс ГО-12 и МРЬ™ или СЭ МРЬ™, что вызывало более высокие титры антигенспецифических антител (особенно ΙβΟ) по сравнению с реципиентами белка порина В плюс МРЬ™ или СЭ МРЬ™. Более высокие титры наблюдали после обеих, как первичной, так и вторичной иммунизации. Введение в композицию ГО-12 приводило к приблизительно десятикратному увеличению титров ЦС, измеренных во влагалищной промывной жидкости (см. табл. 27).
Очищенный нативный белок слияния (Р) человеческого респираторного синцитиального вируса (Κδν) в нативной димерной форме является кандидатом на роль антигена для профилактики инфекций, вызванных Κδν (43, включен сюда в качестве ссылки).
Проводили ряд исследований для сравнения МРЬ™ (либо с, либо без СЭ) плюс СМ-С8Р или ГО-12, с каждым из МРЬ™ (либо с, либо без СЭ), фосфатом алюминия или 8йти1оп™ 08-21 по отдельности, вместе с очищенным нативным Р-белком Κδν. Краткое описание результатов представлено далее.
В первом эксперименте мыши Ва1Ь/с, внутримышечно иммунизированные нативным Κδν Рбелком, генерировали титры антиген-специфических антител, демонстрируя, что Р-белок является жизнеспособным кандидатом на роль антигена. Добавление СМ-С8Р в МРЬ™ индуцировало повышение конечных точек титрования, по сравнению с ответом на Р-белок одного МРЬ™, после как первичной, так и вторичной иммунизации (см. табл. 28), а также вызвало усиление клеточного ответа на ίη νίΙΐΌ стимуляцию клеток селезенки по сравнению с одним МРЬ™ (см. табл. 29). Добавление СМ-С8Р в СЭ МРЬ™ приводило к усилению первичного ЦС ответа на Р-белок, по сравнению с одним СЭ МРЬ™ (см. табл. 28).
Во втором эксперименте использовали протокол первого эксперимента. Добавление СМ-С8Р в МРЬ™ индуцировало более высокие конечные точки титрования, чем в случае единственного МРЬ™, в ответ на Р-белок после как первичной, так и вторичной иммунизации (см. табл. 30). Добавление СМ-С8Р к СЭ МРЬ™ также вызвало увеличение конечных точек титрования, по сравнению с одним СЭ МРЬ™, в ответ на Р-белок после первичной иммунизации (см. табл. 30). Добавление СМ-С8Р в композиции Рбелка плюс МРЬ™ или СЭ МРЬ™, вызвало более высокий процент Κδν-специфической СТЬ активности селезенки, чем вызванное композициями в отсутствие СМ-С8Р, как показано на клетках селезенки иммунизированных мышей (см. табл. 31).
В третьем эксперименте СМ-С8Р заменяли на ГО-12. Сокомпозиция ГО-12 с МРЬ™ вызывала более высокие титры ЦС после первичной иммунизации по сравнению с введением Р-белка только с МРЬ™ (см. табл. 32). Однако добавление ГО-12 к МРЬ™ или СЭ МРЬ™ не имело никакого эффекта на Κδνспецифическую активность СТЬ, измеренную после ίη у11го стимуляции эффекторных клеток (см. табл. 33).
Одно из исследований проводилось для сравнения МРЬ™ (либо с, либо без СЭ) плюс СМ-С8Р и отдельного МРЬ™ (либо с, либо без СЭ), вместе с белком Ν₽ (нуклеокапсидный белок) вируса гриппа. Имелись недостаточные количества Ν₽ для проведения эксперимента по измерению титров антител. Мышей, иммунизированных Ν₽ пептидом вместе или без адъювантов, анализировали на ответы клеток селезенки при стимуляции антигеном на 14 день после окончательной иммунизации. Введение СМ-С8Р в композиции, содержащие МРЬ™ или СЭ МРЬ™, приводило к заметному сокращению СТЬ активности (данные не показаны).
Непонятно, почему был получен этот аномальный результат. Возможно, имелись технические проблемы при проведении анализа.
- 11 006233
Антигенные композиции по настоящему изобретению модулируют иммунный ответ, улучшая гуморальный ответ и клеточный иммунитет позвоночного хозяина после введения антигенной композиции, включающей выбранный антиген патогенного вируса, гриба, бактерии или паразита, и эффективное количество адъюванта МРЬ™ (в водной или в форме стабильной эмульсии), комбинированное с цитокином или лимфокином, в частности, СМ-С8Р или 1Ь-12. Другие цитокины или лимфокины, как было показано, имеют иммуномодулирующую активность, включая, но ими не ограничиваясь, интерлейкины 1-альфа, 1-бета, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 и 18, интерфероны альфа, бета и гамма, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и фактор некроза опухоли альфа и бета.
Агонисты или антагонисты указанных цитокинов или лимфокинов также находятся в пределах данного изобретения. Как используется здесь, агонист обозначает молекулу, которая усиливает активность или функционирует таким же образом, как указанные цитокины или лимфокины. Примером такого агониста является миметик указанных цитокинов или лимфокинов. Как используется здесь, термин антагонист обозначает молекулу, которая ингибирует или препятствует активности указанных цитокинов или лимфокинов. Примерами таких антагонистов являются растворимый рецептор 1Ь-4 и растворимый рецептор ΤΝΡ.
Как используется здесь, термин эффективное количество адъюванта обозначает дозу комбинации адъювантов, описанных здесь, которые являются подходящими для увеличения иммунного ответа у позвоночных животных. Индивидуальная доза зависит, в частности, от возраста, массы и медицинского состояния хозяина, а также способа введения и антигена. В предпочтительном воплощении, адъювантные комбинации МРЬ™ используются в области от 1-100 мкг/доза. Подходящие дозы могут быть легко определены специалистами в данной области. Антигенные композиции по данному изобретению могут также быть смешаны с иммунологически приемлемыми разбавителями или носителями обычными способами для получения жидкого раствора для введения или суспензий.
Антигенные композиции по данному изобретению вводятся человеку или другому позвоночному различными путями, включающими, но ими не ограничивающимися, интраназальный, пероральный, вагинальный, ректальный, парентеральный, кожный, чрезкожный (см., например, международную публикацию \νϋ 98/20734 (44), которая включена здесь в качестве ссылки), внутримышечный, внутрибрюшинный, подкожный, внутривенный и внутриартериальный. Количество антигенного компонента или компонентов антигенной композиции зависит, в частности, от индивидуального антигена, а также от возраста, массы и медицинского состояния хозяина, а также от способа введения. И снова подходящие дозы могут быть легко определены специалистами в данной области. Предпочтительно, хотя не обязательно, антиген и комбинацию адъювантов вводят в одно и то же время. Число доз и режим дозировки антигенной композиции также может быть легко определены специалистами в данной области. В некоторых случаях свойства адъюванта в адъювантной комбинации могут уменьшать число необходимых доз или время курса режима дозировки.
Комбинации адъювантов по данному изобретению являются подходящими для использования антигенных композиций, содержащих широкое разнообразие антигенов из широкого круга патогенных микроорганизмов, включая, но ими не ограничиваясь, вирусы, бактерии, грибы или паразитные микроорганизмы, которые инфицируют людей и других позвоночных, или антигены раковых клеток или опухолевых клеток. Антигены могут включать пептиды или полипептиды, полученные из белков, а также фрагментов, любого из перечисленных: сахариды, белки, поли- или олигонуклеотиды, раковые клетки или опухолевые клетки, аллергены, амилоидный пептидный белок или другие макромолекулярные компоненты. В некоторых случаях в антигенную композицию может быть включено больше чем один антиген.
Желательные вирусные вакцины, содержащие композиции адъюванта по данному изобретению, представляют собой такие вакцины, которые направлены на предотвращение или/и лечение заболевания, вызванного, но ими не ограничивающимися, вирусом иммунодефицита человека, вирусом иммунодефицита обезьян, респираторным синцитиальным вирусом, вирусом парагриппа типов 1-3, вирусом гриппа, вирусом простого герпеса, человеческим цитомегаловирусом, вирусом гепатита А, вирусом гепатита В, вирусом гепатита С, вирусом человеческой папилломы, полиовирусом, ротавирусом, каликовирусомами, вирусом кори, вирусом свинки, вирусом краснухи, аденовирусом, вирусом бешенства, вирусом собачьей чумки, вирусом чумы рогатого скота, коронавирусом, парвовирусом, инфекционным ринотрахеальным вирусом, вирусом лейкемии кошек, вирусом инфекционного перитонита кошек, вирусом инфекционного бурсита у птиц, вирусом болезни Ньюкасла, вирусом болезни Марека, вирусом респираторного и репродуктивного синдрома у свиней, вирусом лошадиного артерита и различными энцефалопатическими вирусами.
Желательные бактериальные вакцины, содержащие адъювантную композицию по данному изобретению, представляют собой такие вакцины, которые направлены на предотвращение и/или лечение заболеваний, вызванных, но ими не ограничиваясь, НаешорШик 1пГ1испхас (как типичный, так и нетипичный), НаешорШик кошпик, Могахе11а саИптНаКк, 81гер1ососсик рпеишошае, 81гер1ососсик руодепек, 81герЮсоссик ада1асйае, 81герЮсоссик Гаесайк, НейсоЬасЮг ру1оп. №1ккепа шептдШФк, №1ккепа допоггйоеае, СЫатуШа (гасНотабк, СЫашуЛа рпеишошае, СЫашуЛа ркИ1асг Вогйе1е11а репикык, 8а1шопе11а 1ур1и,
- 12 006233
8а1топе11а Ινρΐιίιηιιπιιιη. 8а1топе11а сйо1сгасзшз, ЕзсНспсЫа сой, 8Ыдс11а, УФпо с1ю1сгас. СогупсЬас1спшп άίρΗΐΗοΓίαο. МусоЬас1спит !иЬсгси1оз1з, МусоЬас1спит аушт-МусоЬас1спит 1п1гасс11и1агс сотр1сх, Рго1снз тйаЬШз, Рго!сиз уи1дапз, 81ар11у1ососсиз аигсиз, С1оз!п4шш 1с1ат, Ьсрйзрта Ыстгодапз, ВоггсИа ЬигдбогГсгт Раз!сигс11а 11асто1уРса. Раз!сигс11а тнИосИа. АсйпоЬасШиз р1сигорпситошас и Мусор1азта даШверйсит.
Желательные вакцины против грибковых патогенов, содержащие адъювантную композицию по данному изобретению, представляют собой такие вакцины, которые направлены на предотвращение и/или лечение заболеваний, вызванных, но ими не ограничиваясь, Азрстд1Шз, В1а81отусс8. Сапб1ба, СоссИюбез, Стур!ососсиз и Н1з!ор1азюа.
Желательные вакцины против паразитов, содержащие адъювантную композицию по данному изобретению, представляют собой такие вакцины, которые направлены на предотвращение и/или лечение заболеваний, вызванных, но ими не ограничиваясь, Ьшзйташа та) о г, Азсапз, Тпсйштз, С1атб1а, 8сЫз!озота, Стур1о8рот1б1ит, Тпсйотопаз, Тохор1азта допбн и РпсшпосузРз саппн.
Желательные вакцины, вызывающие терапевтическую или профилактическую противораковую активность у позвоночного хозяина, которые содержат комбинации адъюванта по данному изобретению, включают использование таких раковых антигенов или опухолево-ассоциированных антигенов, которые включают, но ими не ограничиваются, специфический антиген простаты, карцино-эмбриональный антиген, МИС-1, Нсг2, СА-125 и МАСЕ-3.
Желательные вакцины для уменьшения ответов на аллергены у позвоночного хозяина, которые содержат комбинации адъюванта по данному изобретению, включают эти аллергены или их фрагмент. Примеры таких аллергенов описаны в патенте США № 5830877 (45) и опубликованной международной патентной заявке XVО 99/51259 (46), которые включены здесь в качестве ссылки, и включают пыльцу, яды насекомого, животную перхоть, споры грибов и лекарства (такие как, пенициллин). Вакцины препятствуют производству антител 1дЕ, которые, как известно, вызывают аллергические реакции.
Желательные вакцины для предотвращения или лечения болезни, характеризующейся отложением амилоида у позвоночного хозяина, которые содержат комбинации адъюванта по изобретению, включают композиции, содержащие дозы этого амилоидного пептидного белка (АРР). Данная болезнь упоминается под разными названиями, например, болезнь Альцгеймера, амилоидоз или амилоидная болезнь. βАмилоидный пептид (также известный как пептид Ав) представляет собой 42 аминокислотных фрагмента АРР, которые образуются при процессинге АРР β и γ секреторных ферментов, и имеет следующую последовательность:
Азр А1а С1и Р1с Агд Н1з Азр 8ст С1у Туг С1и Уа1 Н1з Н1з С1п Ьуз Ьеи Уа1 Р1с Р1с А1а С1и Азр Уа1 С1у 8ст Азп Ьуз С1у А1а 11с 11с С1у Ьеи Мс! Уа1 С1у С1у Уа1 Уа1 11с А1а (8ЕО ГО N0: 10).
У некоторых пациентов отложение амилоида принимает форму агрегированного пептида Ав. Неожиданно, в настоящее время обнаружено, что введение выделенного пептида Ав стимулирует иммунный ответ против пептидного компонента Ав отложения амилоида позвоночного хозяина (47). Таким образом, вакцины по данному изобретению включают комбинации адъюванта по данному изобретению вместе с пептидом Ав, а также фрагменты пептида Ав и антитела к пептиду Ав или его фрагментам. Один такой фрагмент пептида Ав представляет собой 28-аминокислотный пептид, имеющий следующую последовательность (48):
Азр А1а С1и Р1с Агд Н1з Азр 8ст С1у Туг С1и Уа1 Н1з Н1з С1п Ьуз Ьеи Уа1 Р1с Р1с А1а С1и Азр Уа1 С1у 8ст Азп Ьуз (8ЕО ГО N0: 11).
В случае ВИЧ и ВИО антигенные композиции включают по крайней мере один белок, полипептид, пептид или фрагмент, полученный из указанного белка. В некоторых случаях, разнообразные ВИЧ или ВИО белки, полипептиды, пептиды и/или фрагменты включены в антигенную композицию.
Комбинации адъювантных композиций по данному изобретению также являются подходящими для введения в качестве адъюванта в полинуклеотидные вакцины (также известны как ДНК-вакцины). Такие вакцины могут, кроме того, включать облегчающие средства, такие как бупивикаин (см. патент США № 5593972 (49), который включен сюда в качестве ссылки).
Для того чтобы лучше понять данное изобретение, предлагаются следующие примеры. Примеры приведены только с целью иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничение возможностей изобретения.
Примеры
Эксперимент 1. Иммунизация мышей Ва1Ь/с пептидом ВИЧ и различными адъювантами.
Пример 1. Материалы и Методы.
Животные.
Самки мышей Ва1Ь/с, в возрасте 7-9 недель, были куплены у Тасошс Еаттз, 1пс. (Ссттап!отеп, ΝΥ). Все мыши были взяты при одобрении Ашепсап Аззошайоп Еот Асстсбйайоп о£ ЬаЬота!огу-Ашта1 Саге. Мыши постепенно акклиматизировались на новом месте в течение одной недели до начала исследований.
- 13 006233
Пептиды.
Последовательность пептида Т18Р10М^(А)(-Сук) с мультиэпитопом Н1У-1-М·...· представляет собой:
Ьук 61η 11е 11е Акп Ме! Тгр 61η 61и Уа1 61у Ьук А1а Ме! Туг А1а ТЬг Агд Рго Акп Туг Акп Ьук Агд Ьук Агд 11е Ηίκ 11е 61у Рго 61у Агд А1а РЬе Туг ТЬг ТЬг Ьук (8Е6 ГО N0: 2). Этот пептид был предварительно описан (28, 29) и содержит последовательности ВИЧ-1 др120М·, которые вызывают ответы СГО4' ТЬ клеток как у людей, так и у мышей, главный нейтрализующий детерминант и сайт узнавания СГО8' СТЬ у мышей Ва1Ь/с. Пептид был предоставлен Όγ. К. 8сеагсе (Пике Ишуегкйу, ЬигЬат. •С). Для анализа СТЬ, пептиды, соответствующие эпитопу СТЬ в У3 петле Н1У-1-111В (Агд 61у Рго 61у Агд А1а РЬе Уа1 ТЬг 11е (8Е6 ГО N0: 12), Η-2Ω'1 рестрикция или Н1У-1-М· (11е 61у Рго 61у Агд А1а РЬе Туг ТЬг ТЬг (8Е6 ГО N0: 13), Η-2Ω'1 рестрикция, были куплены у 6епокук Вю!есЬпо1од1ек 1пс. (ТЬе \Уоой1апйк, ТХ). Перед использованием пептиды были солюбилизированы в стерилизованной воде и разбавлены в соответствующих буферах или питательной среде для клеток.
Адъюванты.
Все препараты, содержащие адъювант МРЬ™, были получены от К1Ь1 1ттипоСЬет КекеагсЬ, 1пс. (НатП!оп, МТ). МРЬ™ готовили в виде водной композиции с использованием триэтаноламина (81дта, 8!. Ьошк, МО). После солюбилизации МРЬ™ разрушали ультразвуком согласно инструкциям изготовителя с получением опалесцирующего/прозрачного раствора, который стерильно отфильтровывали. СЭ МРЬ™ представлял собой предварительно приготовленную на основе сквалена эмульсию «масло в воде» (масло 1-2%), имеющую концентрацию МРЬ™ в пределах от 0-2500 мкг/мл. Фосфат алюминия получали на месте. Полный адъювант Фройнда (СРА) и неполный адъювант (1РА) были куплены у ЭКсо ЬаЬога!опек, Ое!го1!_ М1. Пептиды Т18Р10М^А) и адъюванты Фройнда эмульгировали в отношении 1:1, используя два связанных шприца. Экспрессируемый рекомбинантный мышиный 1Ь-12 был предоставлен 6епейск 1пк!1!и!е (СатЬпйде, МА). Рекомбинантный мышиный 6М-С8Р был получен от 1ттипех (8еа!!1е, \УА), предоставленный Κ&Ό 8ук!етк (М1ппеароЬк, М·) или был куплен у Вюкоигсе 1п!ета!юпа1 (СатагШо, СА) в виде лиофилизированного порошка без носителя.
Иммунизация.
Мышей подкожно иммунизировали в ягодичную область в полном объеме 0,2 мл, эквивалентно разделенным на каждую сторону относительно хвоста. Иммунизации проводили с различными временными интервалами, как обозначено ниже. Антигены и цитокины разбавляли фосфатным солевым буфером до соответствующих концентраций и смешивали с адъювантами меньше чем за 16 ч до иммунизации в стерильных условиях. Вакцины смешивали при слабом перемешивании и хранили при 4°С. Композиции смешивались на вортексе непосредственно перед иммунизацией.
Получение образцов.
У животных забирали кровь до начала иммунизации и указанных временных точках. Сыворотку от отдельной мыши анализировали и объединяли у мышей в пределах групп. Для оценки уровней антител выполняли влагалищную промывную жидкость на умерщвленных мышах. Он выполнялся путем вливания 75:1 КРМ1-10 в свод влагалища самок мышей, используя 200:1 пипетку. Свод промывали повторным вливанием и удалением жидкости, которую затем добавляли в 10:1 РВ8. Анализировали объединенную влагалищную промывную жидкость.
Препараты клеток.
Для анализа пролиферации и анализа цитокинов ш уйго получали клетки селезенки мышей в определенные временные точки. При объединении 3-5 мышей получали единичную клеточную суспензию, указанную в результатах. Для анализа пролиферации и цитокинов, клетки суспендировали в круглодонных 96 ячеечных плашках, предварительно покрытых в течение ночи антигенами пептида ВИЧ, контрольными белками или только КРМ1-10. Клетки селезенки добавляли в 5х105 клеток/ячейку, используя культуральную среду с 2 добавками. Супернатанты клеточной культуры собирали из трех ячеек для анализа цитокинов через три или шесть дней после введения культуры.
Немедленно после получения супернатанта, культуры импульсно метили 3Н-тимидином в течение 18-24 ч и собирали для определения количества клеточной пролиферации.
Ферментный иммуносорбентный анализ (ЕЫ8А).
Для анализа пептидспецифического ВИЧ антитела и распределения подкласса, пептид суспендировали либо карбонатном буфере (15 мМ •а2С03, 35 мМ •аНС03, рН 9,6) либо в РВ8 в концентрации 1 мкг/мл и помещали на 96 луночные плашки микропипеткой (Мшс) в объеме 100:1. После инкубации в течение ночи при 37°С, чашки промывали и блокировали (0,1% желатин/РВ8) при комнатной температуре в течение 2-4 ч. Перед добавлением последовательно разведенной сыворотки (РВ8, желатин 0,1%, 0,05% Т^ееп™20, 0,02% азида натрия) чашки для анализа ЕЫ8А промывали буфером (РВ8, 0,1% Тетееп™20). После инкубации в течение 4 ч, ячейки промывали и добавляли соответствующие разведенные биотинилированные антиизотипы/подклассы антител для инкубации при 4°С в течение ночи. Ячейки промывали и культивировали с стрепавидинсвязанной пероксидазой хрена. После инкубации ячейки промывали и выявляли АВТ8. Ячейки анализировали при 405 нм. Титры стандартизировали с использованием контрольной сыворотки.
- 14 006233
Для анализа цитокина супернатант клеточной культуры добавляли в ячейки, покрытые ВУЭ611В11 (в случае анти-1Ь4) или К4-6А2 (в случае гамма-интерферона). После инкубации и промывки ячейки исследовали с помощью биотин-меченного ВУО6-24С2 (для 1Ь4) или ХМО 1,2 (для гаммаинтерферона). Концентрацию цитокинов определяли, используя калибровочную кривую, полученную из рекомбинантного мышиного гамма-интерферона или интерлейкина-4. Все цитокиновые реагенты были получены от Рйагшшдеи (8аи О|едо. СА).
Анализы нейтрализации НГУ-Ι^.
Анализы нейтрализации проводились в лаборатории Όγ. Тйошак МаИНехгк в университете Пике. Коротко, кодовая сыворотка обеспечивала нейтрализацию лабораторного изолированного вируса НЕУ-1^ (ΝΙΗ). Анализ проводили, по существу, так же, как описано ранее (25). Кратко, разбавленные тестируемые сыворотки были разделены на 96-ячеечных титрационных микроплашках (25:1/ячейка). Эквивалентный объем последовательно разведенного вирусного материала добавляли в каждую ячейку. После инкубации смесь вирус/антитело добавляли к АА5 меченым клеткам. Клетки культивировали в 96ячеечных титрационных микроплашках, добавляя через день свежую среду. Через семь дней после заражения супернатант оценивали на присутствие вирусной обратной транскриптазы для измерения вирусной репликации и успешного заражения или его ингибирования.
Пример 2. Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10М^А) 1дО.
Реципрокные конечные точки титрования анти-пептид ВИЧ-специфического 1дС измеряли в объединенной сыворотке (п=5 Ва1Ь/с) в определенные временные точки после начальной иммунизации. Мышей иммунизировали подкожно в ягодичную область 25 мкг Т18Р10М^(А)(-Сук), если не обозначено иначе, на 0 день и 27 день. В случае реципиентов адъювантов Фройнда, мышей праймировали пептидом, эмульгированным в СЕ А, и повторно иммунизировали 1ЕА. СЭ МРЬ™ представляет собой эмульсию, содержащую в дозе 2% масло сквалена и 50 мкг МРЬ™. СЭ представляет собой транспортную эмульсию «масло в воде», содержащую сквален, глицерин и эмульгирующий агент. Рекомбинантный мышиный 1Ь12 вводился в дозе 50 нг/мышь. Рекомбинантный мышиный ОМ-С8Е вводили в дозе 10 мкг/мышь. Результаты приводятся в табл. 1.
Таблица 1
Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10М^(А)(-Сук) 1§О
Пограничные титры
Адъювант мкг ВИЧ пептида 4 неделя 6 неделя 8 неделя
без адъюванта 25 <100 <100 <100
СРА/1ЕА 25 23998 137683 313200
г11_-12 25 <100 <100 <100
СМ-С8Р 25 <100 17579 12537
СЭ 25 <100 171923 76479
МРЬ|мСЭ 25 <100 104331 79021
МРЬ'мСЭ + г1Ь-12 25 <100 131330 631688
МР!,м СЭ + СМ-С8Е- 25 14,824 >10000000 3752870
Пример 3. Реципрокные конечные точки титрования подкласса анти-Т18Р10М^(А)(-Сук) 1дС.
Реципрокные конечные точки титрования подклассов Т18Р10ММА)(-Сук) 1дО измеряли в объединенной сыворотке (п=5 Ва1Ь/с) через шесть недель после начальной иммунизации, через две недели после вторичной иммунизации. Мышей иммунизировали подкожно в ягодичную область 25 мкг пептидом, если не обозначено иначе. В случае реципиентов адъювантов Фройнда, мышей праймировали пептидом, эмульгированным в полном адъюванте Фройнда и повторно иммунизировали неполным адъювантом Фройнда на четвертую и шестую недели. СЭ МРЬ™ представляет собой эмульсию, содержащую в дозе 2% масло сквалена и 50 мкг МРЬ™. СЭ представляет собой транспортную эмульсию «масло в воде», содержащую сквален, глицерин и эмульгирующий агент. Рекомбинантный мышиный 1Ь-12 вводился в дозе 50 нг/мышь. Рекомбинантный мышиный ОМ-С8Е вводили в дозе 10 мкг/мышь. Результаты приводятся в табл. 2.
- 15 006233
Таблица 2
Реципрокные конечные точки титрования подкласса анти-Т18Р10ММ(А)(-Су 8) 1дС
Пограничные титры
Адъювант мкг ВИЧ пептида 1д61 1д62а 1дО2Ь
без адъюванта 25 <100 <100 <100
СЕА/1ЕА 25 29907 143 798
гИ-12 (0,05) 25 <100 <100 <100
ΘΜ-СЗЕ (10) 25 1783 <100 <100
СЭ (2%) 25 74293 <100 3331
МР1™ (50) СЭ (2%) 25 11441 10176 5280
МРЬ™ (50) СЭ + гИ-12 (2%) 25 169278 27161 2303
ΜΡΙ.™ СЭ + ОМ-СЗГ (2%) 25 3494862 954707 245828
Пример 4. Титры антител Т18Р10МЫ(А)(-Су8) 1дС и 1дА промывной жидкости влагалища.
Титры антипептидных антител 1дС и 1дА измеряли во влагалищной промывной жидкости, полученной через 2 недели после заключительной иммунизации. Группу из 5 самок мышей Ва1Ь/с иммунизировали 25 мкг Т18Р10МЫ(А)(-Су8) и обозначенными композициями адъюванта на 0, 28, и 42 дни. Титры антител определяли в объединенной влагалищной промывной жидкости. Результаты приводятся в табл. 3.
Таблица 3
Титры антител анти-Т18Р10МЫ(А)(-Су8) 1§С и 1дА промывной жидкости влагалища
Адъювант !д6 1дА
Нет адъюванта <20 <20
СРА/1РА 20 <20
г(Ь-12 (0,05) <20 <20
СМ-СЗР (10) <20 <20
МРЬ™ (50) СЭ (2%) <20 <20
МРЬ™ (50) СЭ + гИ-12 (2%)+ гИ-12 (0,05) 24 <20
МРЬ™ СЭ + ΘΜ-СЗР (2%)+ СМ-С8Е (10) 1125 113
СЭ (2%) <20 <20
Пример 5. Пролиферация клеток селезенки.
Измеряли пролиферацию клеток селезенки мышей, иммунизированных Т18Р10МЫ(А)(-Су8) и различными композициями адъюванта. Группы из пяти самок мышей Ва1Ь/с иммунизировали 25 мкг Т1§Р10МЫ(А)(-Су8) и обозначенными адъювантами на 0 и 28 дни. Клетки селезенки вносили в культуру на 56 день и собирали для измерения введенного 3Н-тимидина через 96 ч после этого. Мышей иммунизировали 50 нг 1Ь-12, 10 мкг СМ-С8Р, 50 мкг МРЬ™ в виде водной смеси или в виде стабильной эмульсии с 2% СЭ. Данные представляют собой дельта срт значения относительно пролиферирующих значений, измеренных у растущих клеток в культуре без стимуляции. Фоновые суммарные значения стимуляции были <800 срт. Результаты приведены в табл. 4.
- 16 006233
Таблица 4
Пролиферация клеток селезенки
Адъювант ВИЧ пептид ВИЧ пептид ВИЧ пептид Соп А Лизозим Среда
10 мкг/мл 3,3 мкг/мл 1,1 мкг/мп 1 мкг/мл 30 мкг/мл Омкг/мл
нет адъюванта 2065 2373 801 50019 628 *
СЕА/1РА 1236 878 641 53781 -
1И2 809 692 308 42612 -
6М-С8Р 25821 19784 14249 55578 -
МР|_,МСЭ 46275 41675 40998 45443 413
МРЬ,М СЭ + Ιί-12 26560 19907 9600 38989 934
МР1|м СЭ + СМ-С8Е 74909 66257 62798 37775 366 -
СЭ 31327 23396 20480 66949 •
Пример 6. Секреция 1Ь-4 клетками селезенки.
Измеряли интерлейкин-4, секретируемый в культуре клеток селезенки, стимулированных 25 мкг Т18Р10М^А)(-Сук). Клетки селезенки собирали из пяти самок мышей Ва1Ь/с и культивировали с обозначенными антигенными стимулами (50 нг 1Ь-12, 10 мкг СМ-С8Р, 50 мкг МРЬ™, как обозначено) в течение либо трех, либо шести дней. Уровни интерлейкина-4 определяли с помощью ЕЫ8А и сравнивали со стандартом, имеющим известную концентрацию. Пустые ячейки показывали, что анализ не обнаружил интерлейкин-4 при этих условиях культивирования. Нижний предел определяемой чувствительности был 22 единиц/мл. Результаты приведены в табл. 5.
Таблица 5 Секреция 1Ь-4 клетками селезенки
Трехдневные культуры:
Антиген
Адъювант ВИЧ пептид 10 мкг/мл ВИЧ пептид 3,3 мкг/мл ВИЧ пептид 1,1 мкг/мл Соп А 1 мкг/мл Лизозим 30 мкг/мл Среда Омкг/мл
нет адъюванта 149
СРА/1РА 156
И--12 156
СМ-С5Р 159
МР1'“ СЭ 297 79 90 134
МР1|мСЭ + 11-12 77
мрь|Мсэ + ем-С8Р 142 151 102 149
СЭ 197
- 17 006233
Шестидневные культуры:
Антиген
Адъювант ВИЧ пептид 10 мкг/мл ВИЧ пептид 3,3 мкг/мл ВИЧ пептид 1,1 мкг/мл СопА 1 мкг/мл Лизозим 30 мкг/мл Среда Омкг/мл
нет адъюванта 124
СЕА/1ЕА 204
ΙΙ.-12 146
6М-С8Е 143
МРЬ“СЭ 163 96 57 63
МР1'м СЭ + 1С12 55 76
МРС“ СЭ + 6М-С5Е 511 457 204 76
СЭ 41 36 88
Пример 7. Секреция гамма-интерферона клетками селезенки.
Измеряли гамма-интерферон, секретируемый в культуре клеток селезенки, стимулированных 25 мкг Т1§Р10МЫ(А)(-Су8). Клетки селезенки собирали из пяти самок мышей Ва1Ь/с и культивировали с обозначенными антигенными стимулами (такие же, как примере 6) в течение либо трех, либо шести дней. Уровни гамма-интерферона определяли с помощью ЕЬ18А и сравнивали со стандартом, имеющим известную концентрацию. Пустые ячейки показывали, что анализ не обнаружил гамма-интерферон при этих условиях культивирования. Нижний предел определяемой чувствительности был 4 пикограмм/мл. Результаты приведены в табл. 6.
Таблица 6 Секреция гамма-интерферона клетками селезенки
Трехдневные культуры:
Антиген
Адъювант ВИЧ пептид 10 мкг/мл ВИЧ пептид 3,3 мкг/мл ВИЧ пептид 1,1 мкг/мл Соп А 1 мкг/мл Лизозим 30 мкг/мл Среда Омкг/мл
нет адъюванта 23,0
СЕА/1ЕА 5,0
||_-12 5,9
СМ-СЗЕ 17,6
МР1-'мСЭ 6,6 4,2 4,3 18,2
ΜΡΐ|Μ03 + Ιί-12 9,2
МР1,мСЭ + 6М-С8Е 11,5 5,1 5,3 14,6
СЭ 8
- 18 006233
Шестидневные культуры:
Эксперимент 2. Иммунизация мышей Ва1Ь/с пептидом ВИЧ и различными адъювантами.
Пример 8. Материалы и методы.
Животные.
Использовались самки мышей Ва1Ь/с в возрасте 7-9 недель, согласно примеру 1 выше.
Пептиды.
Использовали пептид Н1У-1-МЫ Т18Р10МЫ(А), описанный в примере 1. Пептид регидратировали в солевом растворе с концентрацией 1 мг/мл.
Адъюванты.
Используемые адъюванты были такими, как описаны в примере 1, за исключением того, что в некоторых случаях МРЬ™ использовался в виде водной композиции, вместо стабильной эмульсионной формы.
Иммунизации.
Мыши были иммунизированы подкожно в ягодичную область, в полном объеме 0,2 мл, одинаково разделенном на каждую сторону относительно хвоста. Иммунизации пептидом ВИЧ (25 мкг) проводили на 0 и 21 дни вместе с обозначенным количеством адъюванта(ов). Мыши, получающие СРА/1РА, получили СРА на 0 день и 1РА на 21 день. Разбавления и смешивание проводили в соответствии с описанными в примере 1.
Получение образцов.
Получение образцов у животных проводили в соответствии с протоколом примера 1 за день до каждой иммунизации и через 14 дней после второй иммунизации.
Препараты клеток.
Полученные препараты клеток проводили и контролировали в соответствии с протоколом примера 1.
Ферментный иммуносорбентный анализ (ЕЬ18А).
ЕЬ18А проводили в соответствии с протоколом примера 1.
Анализ нейтрализации Н1У-1-М·.
Анализы нейтрализации снова проводили в лаборатории Университета Пике в соответствии с протоколом примера 1.
Пример 9. Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10МЫ(А)(-Сук) 1дО.
Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10ММ(А) (-Сук) 1дС измеряли либо как среднее геометрическое отдельных мышей (ОМТ) или в объединенной сыворотке (п=5 Ва1Ь/с), полученной через 14 дней после второй иммунизации. Пограничные титры подклассов 1дО1 и 1дО2а также измеряли в объединенной сыворотке. В случае реципиентов адъювантов Фройнда мышей праймировали 25 мкг пептида, эмульгированного в СРА, и повторно иммунизировали 1РА. СЭ МРЬ™ представляет собой эмульсию, содержащую в дозе 1% масло сквалена и 50 мкг МРЬ™. Водный МРЬ™ вводили в количестве 50 мкг в дозе. Рекомбинантный мышиный 1Ь-12 вводили в дозе 40 нг/мышь. Рекомбинантный мышиный СМ-С8Р вводили в дозе 10 мкг/мышь. Результаты приводятся в табл. 7.
- 19 006233
Таблица 7 Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10МЫ(А)(-Су8) 1дС
Пограничные титры
Адъювант 1дО 1дО 1д61 1дС2а
мкг/доза (общий) (6МТ) (общий) (общий)
без адъюванта <1000 720 <1000 <1000
СЕА/1ЕА 72387 135740 126433 9023
МР|_™ СЭ 183802 197808 162480 98342
СЭ 2426 6029 1859 <1000
МР1|м СЭ + СМ-С8Е 148139 133171 103298 50415
МР1_|м СЭ + гИ-12 182852 611076 6610 111662
6М-С8Е 27333 1756 14538 4864
Γΐί-12 <1000 500 <1000 <1000
ΜΡί™ 219705 241918 134428 7127
ΜΡίΙΜ + СМ-С8Е 946695 1101449 545444 12291
МР11Л + N1-12 377972 2378702 204334 12795
Пример 10. Реципрокные конечные точки титрования подкласса анти-Т1§Р10МЫ(А)(-Су8) 1дС.
Реципрокные конечные точки титрования ВИЧ-пептид-специфических 1дС и 1дА антител из промывной жидкости влагалища измеряли в объединенной сыворотке (п=5 Ва1Ь/с) через 15 дней после вторичной иммунизации. Мышей иммунизировали так же, как описано в примере 9. СЭ МРВ™ представляла собой эмульсию, содержащую в дозе 1% масла сквалена и 50 мкг МРВ™. Водный МРВ™ вводили в количестве 50 мкг в дозе. Рекомбинантный мышиный В-12 вводили в концентрации 40 нг/мышь. Рекомбинантный мышиный СМ-С8Р вводили в концентрации 10 мкг/мышь. Результаты представлены в табл. 8.
Таблица 8 Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10МЫ(А)(-Су8) 1дС и 1дА
Пограничные титры
Адъюванты 1дО 1дА
без адъюванта <10 <10
СЕА/1ЕА <10 <10
МРЬ™ СЭ(1%) 32 <10
СЭ <10 <10
МРЬ'м СЭ (1%) + СМ-С8Е 129 <10
МРЬ|МСЭ (1%)+г1Ь-12 40 <10
вМ-С8Г 26 <10
γΙΒ-12 <10 <10
МРЬ™ <10 <10
МРЬШ + СМ-СЗЕ <10 <10
МР1|м +гВ-12 260 197
Пример 11. Пролиферация клеток селезенки.
Измеряли пролиферацию клеток селезенки в ответ на стимуляции ίη νίίτο Т18Р10МЫ(А)(-Су8) и различными композициями адъюванта (теми же, что и в примере 10). Клетки селезенки культивировали всего в течение 96 ч. В культуру в последние 18 ч вносили 3Н-тимидин. Данные представлены как пролиферационный индекс, нормализованный относительно клеточной стимуляции в культуре СопА ([среднее срт антигена/среднее срт СоА)] - [среднее срт среды/среднее срт СопА]) х 100. В качестве результата клетки, культивированные в среде, имели фоновую пролиферацию, равную 0. Результаты приведены в табл. 9. Пролиферационные значения ниже, чем клеточный рост в культуре без стимуляции, представлены в скобках.
- 20 006233
Таблица 9 Пролиферация клеток селезенки
Адъювант ВИЧ-пептид 10 мкг/мл ВИЧ-пептид 3,3 мкг/мл ~..... 0,2 ВИЧ-пептид 1,1 мкг/мл СопА 5 мкг/мл Лизозим 10 мкг/мл
Без адъюванта 0,1 0.1 98,3 0,4
СЕА/1ЕА 2,0 0,8 0,4 98,0 0,9
СЭ МРЬ™ 0,7 0,4 (0,2) 99,2 0,4
СЭ 0,5 0,3 0,1 99,0 0,4
СЭ МРЬ™ + ОМ-С8Е 4,3 2,7 2,3 99,1 0,8
СЭ МРЬ“ + 1Ь-12 6,6 4,9 (1,3) 83,8 17,4
6М-С8Е 6,8 2,7 1,6 99,0 0,1
1Ь-12 0,2 0,2 ................1,4 .......~ 0,5 99,1 0,2
МРЬ™ 1,0 0,5 99,2 0,4
мрь™ + ем-сзр 27,5 19,2 13,3 97,5 0,5
МРЬ™+ 1Ь-12 2,3 1,5 1,3 99,4 (0,0)
Пример 12. Секреция 1Ь-4 клетками селезенки.
Измеряли интерлейкин-4, секретируемый в культуре клеток селезенки, стимулированных Т18Р10МЫ(А)(-Су5). Общее время культивирования составляло 96 ч. Супернатант клеточной культуры анализировали на 1Ь-4 с помощью ЕЬ18А. Все значения были получены после вычитания из значений, определенных в супернатантах клеток, стимулированных 10 мкг нерелевантного белка (лизозима). Результаты приведены в табл. 10 в пг/мл. Результаты, которые были ниже предела обнаружения после вычитания из стимулированных лизозимом, обозначены как «нпо». Адъюванты представляли собой 40 нг Ш-12, 10 мкг 6М-С8Р и 50 мкг МРЬ™.
Таблица 10 Секреция ГЬ-4 клетками селезенки
Антиген
Адъювант ВИЧ-пептид 10 мкг/мл ВИЧ-пептид 3,3 мкг/мл ВИЧ-пептид 1,1 мкг/мл СопА 5мкг/мл
без адъюванта НПО НПО НПО 336
СЕА/1ЕА НПО НПО НПО 117
СЭ МРЬ™ НПО НПО НПО 187
СЭ НПО НПО НПО 450
СЭ МРЬ™ + 6М-СЗЕ 40 42 24 214
СЭ МРЬ™ + 1Ь-12 5 НПО НПО 266
(ЗМ-СЗЕ НПО 9 36 226
1Ь-12 НПО НПО 15 411
МРЬ™ 5 НЛО 17 286
МРЬ™ + СМ-СЗЕ НПО НПО НПО 241
МРЬ'м + 1Ь12 НПО НПО НПО 665
Пример 13. Секреция гамма-интерферона клетками селезенки.
Измеряли гамма-интерферон, секретируемый в культуре клеток селезенки, стимулированных Т18Р10МЫ(А)(-Су5). Общее время культивирования клеток равнялось 96 ч. Супернатант культуры клеток анализировали на гамма-интерферон с помощью ЕЬ18А. Все значения были получены после вычитания из значений, определенных из супернатантов клеток, стимулированных 10 мкг лизозима. Результаты приводятся в табл. 11 в ед./мл. Результаты, которые были ниже предела обнаружения после вычитания из стимулированных лизозимом, обозначены как «нпо». Адъюванты были те же, что и в примере 12.
- 21 006233
Таблица 11
Секреция гамма интерферона клетками селезенки
Эксперимент 3. Иммунизация мышей 8^188-^еЬ81ег ВИЧ-пептидоми различными адъювантами.
Использовались протоколы эксперимента 2, кроме того, что 8\\'185-\УеЬ81ег мышей использованных вместо мышей Ва1Ь/с. В данном эксперименте измеряли только реципрокные конечные точки титрования антипептидного 1дС и реципрокные конечные точки титрования антител 1дС и 1дА из промывной жидкости влагалища.
Пример 14. Реципрокные конечные точки титрования анти-ВИЧ-пептидного 1с.|С.
Реципрокные конечные точки титрования Т18Р10МИ(А)(-Су8) 1дС измеряли как среднее геометрическое отдельных мышей 8\\'185-\УеЬ81ег (СМТ), полученное через 14 дней после второй иммунизации. Пограничные титры подклассов 1дС1 и 1дС2а также измеряли в объединенной сыворотке. В случае реципиентов адъювантов Фройнда, мышей праймировали пептидной эмульсией в СРА и повторно иммунизировали 1РА. СЭ МРЬ™ представляет собой эмульсию, содержащую в дозе 1% масло сквалена и 50 мкг МРЬ™. Водный МРЬ™ вводили в количестве 50 мкг на дозу. Рекомбинантный мышиный 1Ь-12 вводился в дозе 40 нг/мышь. Рекомбинантный мышиный СМ-С8Р вводили в дозе 10 мкг/мышь. Результаты приводятся в табл. 12.
Таблица 12
Реципрокные конечные точки титрования анти-ВИЧ-пептида
Пограничные титры
Адъювант 1до 1дО1 1дО2а
мкг/доза (ΘΜΤ) (общий) (общий)
без адъюванта 500 <1000 <1000
СРА/1РА 9038 62358 54053
МРЬ™ СЭ 15831 3835 8872
СЭ 625 <1000 <1000
МРЬ™ СЭ + 6М-С8Р 1374 <1000 1328
МРЬ™ СЭ + г!Ь-12 6142 <1000 2170
СМ-С8Р 500 <1000 <1000
г1Ь-12 500 <1000 <1000
МРЬ™ 1960 <1000 <1000
МРЬ™ + СМ-СЗР 58211 35724 37959
МРЬ™ + г1Ь-12 5489 8535 17769
Пример 15. Реципрокные конечные точки титрования подкласса анти-ВИЧ-пептидного 1дС.
Реципрокные конечные точки титрования ВИЧ-пептид-специфических антител 1дС и 1дА из промывной жидкости влагалища измеряли в объединенной сыворотке (п=5 8^188-^еЬ81ег) через 15 дней после вторичной иммунизации. Мышей иммунизировали так же, как описано в примере 14. СЭ МРЬ™ представляла собой эмульсию, содержащую в дозе 1% масла сквалена и 50 мкг МРЬ™. Водный МРЬ™
- 22 006233 вводился в количестве 50 мкг на дозу. Рекомбинантный мышиный ГО-12 вводили в количестве 40 нг/мышь. Рекомбинантный мышиный СМ-С8Р вводили в количестве 10 мкг/мышь. Результаты представлены в табл. 13.
Таблица 13 Реципрокные конечные точки титрования анти-ВИЧ-пептидных ЦС и ЦА
Пограничные титры
Адъюванты 1д6 1дА
без адъюванта <10 <10
СЕА/1ЕА 118 <10
МРЬ™ СЭ (1%) <10 <10
СЭ <10 <10
мрь™ сэ(1%) + ем-сзЕ <10 <10
МРЬ|МСЭ(1%) + 1Ь-12 <10 <10
СМ-СЗЕ <10 <10
гИ-12 <10 <10
МРЬ™ <10 <10
мрь1М + см-сзё 25 <10
МРЬ|йл + 1Ь-12 <10 <10
Эксперимент 4. Иммунизация мышей Ва1Ь/с ВИЧ-пептидом и различными адъювантами.
Использовали протоколы эксперимента 2, за исключением того, что мышей иммунизировали на 0 и 28 дни и собирали у них кровь для серологической оценки на 0, 27 и 41 день. СРА/ГРА смешивали с СРА на 0 день, ГОА на 28 день. СЭ МРЬ™ смешивали 50 мкг МРЬ™ 2% СЭ, в то время как использовались 50 нг ГО-12 и 10 мкг СМ-С8Р.
Пример 16. Реципрокные конечные точки титрования анти-ВИЧ-пептидного к|С.
Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10ММ(А)(-Су§) ЦС измеряли для отдельных мышей и как их среднее геометрическое значение (η=5 Ва1Ь/с) через 41 день после первоначальной иммунизации, через 13 дней после вторичной иммунизации. Результаты приводятся в табл. 14. В день 0 отдельные титры были все меньше 50. Обозначение «нет данных» означает, что животное умерло до завершения эксперимента. «СО» обозначает стандартное отклонение.
Таблица 14 Индивидуальные и геометрические средние значения сывороточных титров ЦС, специфических для Т18 Р10ММ(А)(-Сук)
Адъювант Мышь #1 Мышь #2 Мышь #3 Мышь #4 Мышь «5 ΘΜΤ 5Э
СЕА/1ЕА 2806160 4856380 148038 172947 972484 805599 2025740
ΙΕ-12 594 50 50 50 50 82 243
СМ-С8Е 50 50 50 50 50 50 0
СЭ 11469 [нет данных] 5519 12620 50 2514 5813
СЭ + 1Ь-12 38042 8030 35081 50 37932 7271 18320
СЭ + СМ-С8Е 485985 223518 63,377 38050 1857860 217494 761374
МРЬ™ 50 151846 249054 436378 1246470 63452 490091
МРЬ™ +1Ь-12 1855170 1117800 1255290 692219 7001540 1660297 2614417
МРЬ™ + СМ-С8Е 115527 1049310 301636 316223 736959 385568 380380
СЭ МРЬ™ 904947 5805010 291382 346835 354449 716000 2396968
СЭ МРЬ™ + 1Ь-12 244171 8545550 455380 377697 1095650 829707 3593727
СЭ МРЬ’м + СМ-С8Е 3016000 724940 1718590 1483990 28,259 691033 1124414
- 23 006233
Пример 17. Реципрокные конечные точки титрования подкласса анти-ВИЧ-пептидных 1дС.
Реципрокные конечные точки титрования анти-ВИЧ-пептидных 1дС измеряли в объединенной сыворотки (п=5 Ва1Ь/с) через 41 день после начальной иммунизации, через 13 дней после вторичной иммунизации. Результаты приведены в табл. 15.
Таблица 15
Реципрокные конечные точки титрования подкласса анти-Т18Р10МЫ(А)(-Су8)
Адъюванты |дв1
СЕА/1ЕА 359238
К-12 <100
6М-С8Е 5514
СЭ 5011
СЭ +1012 7331
СЭ + ЭМ-СЗЕ 67111
МРЬ™ 33544
МР1_™ + ||_-12 608163
ΜΡί™ + ЭМ-СЗЕ 114959
СЭ МРЬ™ 142404
СЭ ΜΡί™ + 1012 164866
СЭ МРЬ™ + ΘΜ-СЗЕ 274241
Точки титрования
1дС2а 1дО2Ь
122107 155877
<100 <100
<100 <100
<100 <100
<100 <100
<100 <100
212 <100
6019 <100
8000 <100
29141 1564
34439 558
33843 29965
Пример 18. Титры антител анти-ВИЧ-пептидных 1дС и 1дА промывной жидкости влагалища.
Титры анти-ВИЧ-пептидных антител 1дС и 1дА промывной жидкости влагалища измеряли через 41 день после начальной иммунизации, через 13 дней после вторичной иммунизации. Результаты приведены в табл. 16.
Таблица 16
Титры антител анти-Т18Р10МЫ(А)(-Су8) 1§С и 1дА из промывной жидкости влагалища
Адъювант |до 1дА
СЕА/1ЕА 464 13
И-12 <10 <10
ΘΜ-СЗЕ <10 <10
СЭ <10 <10
СЭ + И-12 <10 <10
СЭ + ЭМ-СЭЕ 32 14
ΜΡΙ-™ 12 <10
МРк™ + К-12 643 44
МРЬ™ + СМ-С8Е 211 65
СЭ ΜΡί™ 153 16
СЭ МР(_™ + К-12 88 30
СЭ МРБ™ + ОМ-С8Е 190 53
Пример 19. Пролиферация клеток селезенки.
Измеряли пролиферацию клеток селезенки мышей, иммунизированных Т18Р10МЫ(А)(-Су8) и различными композициями адъюванта. Клетки селезенки стимулировали ίη νίΐτο в течение четырех дней 3,3 мкг/мл Т18Р10МЫ(А)(-Су8). Результаты показаны на фиг. 4, как изменение включения меченного тимидина в результате ίη νίίτο стимуляции 3,3 мкг/мл Т18Р10МЫ(А)(-Су8) относительно включения в отсутствие стимуляции (дельта срт).
Эксперимент 5. Иммунизация мышей Ва1Ь/с ВИЧ-пептидом и различными адъювантами.
- 24 006233
Использовали протоколы эксперимента 2 за исключением того, что мышей иммунизировали подкожно на 0 и 22 дни и брали кровь для серологической оценки на 42 день. СЭ МРЬ™ получали с 50 мкг МРЬ™ и 1% СЭ, наряду с использованием 10 мкг СМ-С8Р.
Пример 20. Реципрокные конечные точки титрования анти-ВИЧ-пептидного к|С.
Реципрокные конечные точки титрования антипептидных ЦС измеряли в объединенной сыворотке (п=5 Ва1Ь/с) через 42 дня после начальной иммунизации, через 13 дней после вторичной иммунизации. Также для ЦС измеряли средние геометрические величины с допустимым отклонением. Результаты представлены в табл. 17.
Таблица 17
Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10МN(А)(-Суз) ЦС
Адъювант 1д<5 1дС1 1д62а |д<32Ь 1дС ΘΜΤ
Без адъюванта <1000 <1000 <1000 <1000 <1000 -
СРАЛРА 390931 144564 33137 13134 741966 834567
6М-СЗР 11639 3815 <1000 <1000 5133 32762
СЭ <1000 <1000 <1000 <1000 <1000 -
СЭ + 6М-СЗР 84965 55998 <1000 <1000 28247 165628
МРЬ™ 2635118 1314771 9688 13716 2032441 5638450
мрь™ + ам-сзр 835218 322441 26976 35697 1133423 881331
СЭ МРЬ™ 1577357 642436 113917 45025 1450821 5876690
СЭ МРЬ™ + 6М-СЗР 6598573 1212160 238440 214570 6418920 2925687
Эксперимент 6. Иммунизация мышей Ва1Ь/с ВИЧ-пептидом и различными адъювантами.
Использовали протоколы эксперимента 2, за исключением того, что ВИЧ-пептид содержал цистеин в положении 17 аминокислоты и мышей (п=3 Ва1Ь/с) иммунизировали подкожно на 0 и 21 дни и собирали кровь для серологической оценки на -1 (день перед первой иммунизацией), 13, 20 и 28 дни. СЭ МРЬ™ получали из 50 мкг МРЬ™ и 1% СЭ наряду с использованием 10 мкг СМ-С8Р. ВИЧ-пептид ТИЗРЮМ^АД+Суз) (26) содержит цистеин в положении 17 аминокислоты и представляет собой в длину 40 остатков. ТШРЮМ^АД+Суз) был получен от Сепозуз Вю1есЬпо1од1ез (ТЬе \Уоой1апйз, ТХ).
Пример 21. Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10МN(А) к|С.
Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10МХ(А) ЦС измеряли для отдельных мышей и как их средние геометрические величины (п=3 Ва1Ь/с) через 28 дней после начальной иммунизации. Результаты приведены в табл. 18.
Таблица 18
Эффект СЭ МРЬ™ + СМ-С8Р на ЦС ответ на ВИЧ-пептид (+Суз)
Адъювант |д<э ОМТ |д(31 емт 1д62а емт 1д62Ь емт
СЭ МРЬ'“ + ОМ- 14275585 8942480 2097104 1437319 251235 239615 210746 210178
СЭР 13618523 2484849 225253 296429
3678324 569823 243103 148621
СЭ МРЬ™ 1913110 5206349 644377 990194 22557 114913 23141 70632
11405649 1937492 152430 127600
6467553 777643 441326 119338
МРЬ™ 91728 350486 23249 84978 500 2859 500 2906
529663 155199 1628 1102
886156 170071 28722 44531
Без адъюванта <500 - <500 - <500 - <500 -
<500 <500 <500 <500
<500 <500 <500 <500
- 25 006233
Эксперимент 7. Иммунизация мышей Ва1Ь/с ВИЧ-пептидом и различными адъювантами.
Использовали протоколы эксперимента 6 за исключением того, что мышей (п=3 Ва1Ь/с) иммунизировали подкожно на 0 и 32 дни и умерщвляли для серологической оценки на 38 день. СЭ МРЬ™ получали из 50 мкг МРЬ™ и 1% СЭ наряду с использованием 10 мкг ОМ-С8Р.
Пример 22. Реципрокные конечные точки титрования анти-ВИЧ-пептидного 1дС.
Реципрокные конечные точки титрования анти-Т18Р10ММЛ)(+С.'ук) 1дС измеряли для отдельных мышей и как их средние геометрические величины (п=3 Ва1Ь/с) через 38 дней после начальной иммунизации. Результаты приведены в табл. 19.
Таблица 19
Эффект СЭ МРЬ™ + СМ-С8Р на 1дО ответ на ВИЧ-пептид (+Сук)
Адъювант 1д6 6МТ 1дС1 СМТ |дО2а \ ΘΜΤ |дС2Ь Г (ЗМТ |
МИ, 8В + 4,144,648 4,782,117 922,507 1,090,760 115,290 328,097 74,130 64,521
ОМ-СЗР
МРЬ* ЗВ
МРЬ + ам-сзр
МРЬ™ ев №пе
5,055,375
5,219,387
736,325
696,393
340,712
444,774
3,993,897
1,439,116
404,755
446,952
478,163 <1,000 <1,000
1,214 <1,000 <1,000 <1,000 ♦/472,745
559,033 +/177,831
1,367,343 +/1,494,876
442,259 +/30,080 <1,000 <1,000
985,180
1,427,916
288,659
809,341
107,844
V224,940
293,160 +/297,378
146,146 611,040
3,568,052 +/437,511 1,549,005
148,818 115,544
90,380 +/114,686 23,969 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000
629,615
486,563
58,506
244,559
76,951
3,342
17,469
10,691
11,874
1,674
2,028 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <-/216,753
103,260 +/83,698
8,546 +/5,769
3,429 +/4,727 <1,000
76,257
47,515
ЗЗТ047
46,703
13,010
2,155
14,130
11,590
9,685
3,605
3,538 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 <1,000 +/13,077 27,180’ +/13,837 7,067 +/5,152 4,980 +/2,882 <1,000 <1,000
Эксперимент 8. Анализ СТЬ у мышей Ва1Ь/с.
Иммунизация мышей проводилась с использованием протоколов эксперимента 6. Оценивалась активность СТЬ клеток селезенки, выделенных у мышей через семь дней после вторичной иммунизации. СЭ МРЬ™ получали из 50 мкг МРЬ™ и 1% СЭ с или без 10 мкг ОМ-С8Р плюс 50 мкг Т18Р10М^А)(+Сук).
Пример 23. Анализ СТЬ у мышей Ва1Ь/с.
Для анализа СТЬ клетки селезенки выделяли у иммунизированных мышей через 14 дней после первичной и через семь дней после вторичной иммунизации. По существу использовали ранее описанный протокол (34). Кратко, объединяли эритроцит-истощенные клетки селезенки у трех мышей в группе. Эффекторные клетки селезенки (4х106/мл) повторно стимулировали в 24-ячеечных культуральных плашках в объеме 1,5-2 мл в течение семи дней 1 мкг/мл либо «М№>, либо «111В» 10 тег пептидами с эпитопами СТЬ. Оба эпитопа СТЬ были рестриктированы Н-2Э'1. В культуры добавляли 10 Ед/мл рекомбинантного мышиного 1Ь-2 (Вюкоигсе) в течение последних пяти дней культивирования. Для анализа цитотоксической активности, Р815 клетки были мечены Сг51 и импульсно-мечены 5 мкг/мл пептидом (111В или МN) в течение 4 ч и добавлены к культивированным эффекторным клеткам селезенки. Использовали три разведения пропорций эффекторные клетки - меченые клетки, от 100:1 до 3,7:1. Процент СТЬ активности рассчитывали как процент высвобождения используемого хрома ((специфическое высвобождение хрома - спонтанное высвобождение хрома)/(максимальное высвобождение хрома - спонтанное высвобождение хрома)) х 100. Высвобождение хрома оценивали после шестичасового инкубационного периода. Среднее спонтанное высвобождение хрома было всегда меньше чем 15% максимального выпуска. Результаты данных с 28 дня показаны на фиг. 5.
Эксперимент 9. Иммунизация резус-макак различными ВИО-пептидами и адъювантами.
СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р композицию адъюванта тестировали на резус-макаках (Масаса ши1айа) на ее способность стимулировать антиген-специфические СТЬ. В этом эксперименте адъювантную композицию тестировали с трехвалентным иммуногенным пептидом, содержащим три отдельных эпитопа СТЬ в контексте Маши А*01 (каждый из дад, ро1 и епу), каждый синтезируемый химически с или без смешенного ВИО епу эпитопа Т-хелпера в лаборатории Эг. Вайоп Наупек, университет Энке.
Пептиды, содержащие СТЬ эпитоп в контексте Маши А*01 были следующие:
Сук ТЬг Рго Туг Акр 11е Акп О1п Ме1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3) (дад)
8ег ТЬг Рго Рго Ьеи Уа1 Агд Ьеи Уа1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4) (ро1)
Туг А1а Рго Рго 11е 8ег О1у О1п 11е (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5)(епу)
- 26 006233
Каждый из этих СТЬ-содержащих эпитопов был также связан с эпитопом Т-хелпера, имеющим следующую последовательность: О1и Ьеи Туг Ьук Туг Ьук Уа1 Уа1 Ьук 11е О1и Рго Ьеи О1у Уа1 А1а Рго ТНг Ьук А1а (81 У) ГО N0: 6)
Таким образом, три мультиэпитопных пептида имели следующие последовательности:
О1и Ьеи Туг Ьук Туг Ьук Уа1 Уа1 Ьук 11е О1и Рго Ьеи О1у Уа1 А1а Рго ТНг Ьук А1а Сук ТНг Рго Туг Акр 11е Акп (..Ии \1е1 (81 У) ГО N0: 7)
О1и Ьеи Туг Ьук Туг Ьук Уа1 Уа1 Ьук 11е О1и Рго Ьеи О1у Уа1 А1а Рго ТНг Ьук А1а 8ег ТНг Рго Рго Ьеи Уа1 Агд Ьеи Уа1 (81 У) ГО N0: 8)
О1и Ьеи Туг Ьук Туг Ьук Уа1 Уа1 Ьук 11е О1и Рго Ьеи О1у Уа1 А1а Рго ТНг Ьук А1а Туг А1а Рго Рго 11е 8ег О1у О1п 11е (81 У) ГО N0: 9)
Анализ ЦТК проводили с помощью анализа тетрамерной цепи в контексте Мати А*01 в лаборатории Όγ. №гтап Ье1у|п, Нагуагй Мей1са1 8сНоо1.
Животные, дозы и иммуногены.
Резус-макаки экспрессировали НЬА-А гомологичную молекулу Мати А*01 и был идентифицирован подтип ΌΚβ0201 с помощью ПЦР и помещен в колонию №\ν 1Ьепа, ЬА.
Изучение включало три группы из двух юных резус-макак (Масаса ти1айа), каждая описана в табл. 20. Группа 1 состояла из двух Мати А*01 положительных, ΌΚβ0201 негативных животных КН 73 и КН 80. Этих животных иммунизировали в контексте Мати А*01 пептидами, содержащими эпитоп ВИО дад, епу и эпитоп ро1 СТЬ (короткий пептидный коктейль), вместе с СЭ МРЬ™ и ОМ-С8Р. Группа 2 состояла из двух Мати А*01 положительных, ΌΚβ0201 положительных макак, которые получали пептиды, содержащие эпитопы ТН/81УСТЬ дад, ро1 и епу (длинный пептидный коктейль), вместе с СЭ МРЬ™ и ОМС8Р. Группа 3 включала два Мати А*01 негативных, ΌΚβ0201 положительных животных, иммунизированных пептидами ТН/81УСТЬ дад, ро1 и епу (длинный пептидный коктейль). Табл. 20 представляет группы по типу НЬА и используемых иммунногенных пептидов.
Таблица 20
Животные, дозы и иммуногены
Г руппа Животное # Тип НЬА Пептидные иммуногены
1 РН 73, ЕН 80 Мати А*01 + ϋΡ*β0201 - СТЬ/ВИО дад р11С (ЗЕО Ю N0:3) СТЬ/ВИО ροΙ р68А (ЗЕО Ю N0:4) СТЬ/ВИО епу р41А (ЗЕО Ю N0:5) 0,75 мг каждого пептида
2 ЕН 55, ЕН 142 Мати А*01 + ΟΕ*β0201 + ТН-1/СТЬ/ВИО дад р11С (ЗЕО Ю N0:7) ТН-1/СТЬ/ВИО ροΙ р68А (ЗЕО Ю N0:8) ТН-1/СТЬ/ВИО епу р41А (ЗЕО Ю N0:9) 2,4 мг каждого пептида
3 РН41, ЕН 47 Мати А*01 ϋΕ*βΟ2Ο1 + ТН-1/СТЬ/ВИ0 дад р11С (ЗЕО Ю N0:7) ТН-1/СТЬ/ВИО ροΙ р68А (ЗЕО Ю N0:8) ТН-1/СТЬ/ВИО βην р41А (ЗЕО Ю N0:9) 2,4 мг каждого пептида
Все группы были иммунизированы подкожно 1 мл соответствующего пептидного коктейля с составе с 50 мкг СЭ МРЬ™ в 1% масле и 250 мкг человеческого ОМ-С8Р на 0, 4 и 8 неделе. Дозу СЭ МРЬ™ увеличивали до 125 мкг в 1% масле на 18 неделю иммунизации. Для всех групп 2,4 мг каждого из длинных пептидов и 0,75 мг каждого из коротких пептидов растворяли в 900 мкл дистиллированной, деионизированной воды. Пептидный раствор затем использовали для разбавления ОМ-С8Р и добавляли 100 мкл композиции СЭ МРЬ™.
Пример 24. Анализ СТЬ у резус-макак.
У животных собирали кровь каждые две недели и гепаринизированная кровь анализировалась на СТЬ в контексте Мати А*01 с помощью тетрамерного окрашивания мононуклеарных клеток (РВМС) свежей или культивированной периферической крови (50). РВМС стимулировали либо р11е, р68А, р41А, либо р46 на 0 день и затем культивировали в присутствии 1Ь-2 и анализировали на 11 день. Стандартный метод высвобождения 51Сг также проводили на культивированных РВМС (50).
Тетрамерный анализ проводили следующим образом. Пептиды, содержащие эпитопы р11с из дад, р68А из ро1 или р68А из ро1 или р41А из епу инкубировали с очищенным биотинилированным Мати А*01 в присутствии β2 микроглобулина, затем присоединяли к авидину и конъюгировали с РЕ (фикоэритрин). Этот тетрамер затем использовался для окрашивания СГО8+ клеток макак с Т-клеточными рецепторами, которые узнают эпитопы р11с, р68А или р41А. Различные ΌΚβ0201 тетрамеры образовывали
- 27 006233 петли вокруг доминирующего епу р46 эпитопа, что позволяет контрастировать 0Ό4+ клетки, которые узнают эпитоп р46 ТЕ. Результаты представлены в табл. 21-24.
Таблица 21
Процент р11с/ВИОдад тетрамер-позитивных 0Ό8+ клеток
Недели 0 2 4 6 8 9 10 14
Г руппа 1 РЬ73 0,1 3,9 5,1 4,2 2,7 2,6 0,1 2,7
РЬ 80 0,1 0,4 0,1 0,6 0,2 0,2 1,4 0,2
Г руппа 2 РЬ 55 0,1 3,1 4,5 5,9 4,0 4,0 4,1 2,7
РЬ 142 0,2 4,7 2,5 5,4 3,9 3,9 2,5 4,1
Группа 3 РЬ 41 0 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1
РЬ 47 0,1 0,3 0,1 0,2 0,1 0,1 0,0 0,1
Таблица 22
Процент р68А/ВИО СТЬ ро1 тетрамер-позитивных 0Ό8+ клеток
Недели 0 2 4 6 8 9 10 14
Группа 1 РЬ 73 0,1 0,4 0,1 10,1 2,5 0,5 1.8 1,5
РЬ 80 0,2 0,2 0,6 2,3 0,5 0,1 0,1 0,1
Группа 2 РЬ 55 0,1 1,1 1,1 5,5 5,6 1,5 11,7 6,4
РЬ 142 0,2 0,6 0,2 1,0 1,8 о,з 2,3 1,2
Группа 3 РЬ41 0,1 0,2 0,1 0,3 0,1 0,1 0,1 0,3
РЬ 47 0,1 0,1 0,1 0,3 0,3 0,1 0,1
Таблица 23
Процент р41А/ВИО епу тетрамер-позитивных 0Ό8+ клеток
Недели 0 2 4 6 8 9 10 14
Г руппа 1 РЬ 73 0,8 3,5 2,5 2,0 3,5 1,7 1,5 1,6
РЬ 80 0,2 0,2 3,4 0,5 0,1 0,0 0,2 0,2
Г руппа 2 РН 55 0,2 1,1 0,4 0,6 0,4 0,2 0,1 0,6
РЬ 142 0,3 0,5 0,4 0,6 0,3 0,3 0,2 0,4
Группа 3 РЬ41 0 0,2 0,1 0,3 0,0 0,0 0,2
РЬ 47 0,1 0,2 0,1 0,2 0,2 0,1 0,0 0,2
Таблица 24
Процент р46/ВИО Т-хелперов ΌΚβ0201 тетрамер-позитивных 0Ό4+ клеток
Недели 0 2 4 6 8 9 10 14
Группа 1 РЬ 73 0,2 0,0 0,0 о,о о,о о,о
РЬ 80 0,2 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0
Группа 2 РЬ 55 0,2 0,5 0,7 0,4 о,з 0,3
РЬ 142 0,2 0,9 0,6 1.0 0,6 0,5
Группа 3 РЬ 41 0,6 0,4 0,3 0,3
РЬ 47 1,2 0,8 1,6 1,2
Эксперимент 10. Иммунизация мышей 8\\'1кк-\УеЬк1ег белком порином В №1ккепа допоггйоеае и различными адъювантами.
Аутбридных мышей 8\\'1кк-\УеЬк1ег разделяли на пять групп по десять мышей в каждой. Каждая группа получала 1 мкг рекомбинантного белка порина В (с цепочкой РА1090 из 16 аминокислот на Νконце фага, а потом зрелой формой белка порина В). Первая группа не получала адъювант; вторая группа получала 50 мкг МРЬ™; третья группа получала МРЬ™ плюс 5 мкг СМ-С8Р; четвертая группа получала 25 мкг СЭ МРЬ™; пятая группа получала СЭ МРЬ™ 8Е плюс 5 мкг СМ-С8Р. Мышей иммунизировали подкожно в ягодичную область полным объемом 0,2 мл, равно разделенными на каждую сторону относительно области хвоста/крестца. Иммунизацию проводили на 0 и 4 неделю.
Пример 25. Реципрокные конечные точки титрования 1дС в ответ на белок антипорин В.
Мышей обескровливали за день до каждой иммунизации и на 13 день после окончательной иммунизации. Сыворотку анализировали как объединенную от мышей в пределах групп. Реципрокные конечные точки титрования 1дС в ответ на белок антипорин В измеряли в объединенной сыворотке (п=10
- 28 006233
8^1кк-^еЬк!ег) промывной жидкости влагалища на 3 и 6 недели. Результаты приведены в табл. 25. Все титры до иммунизации на 0 день были ниже 50.
Таблица 25
Реципрокные конечные точки титрования подклассов 1д6 в ответ на антипориновый В белок
3-ая неделя 6-ая неделя
Адъювант |дс |дб1 1д62а 1дС 1д61 1дС2а
Без адъюванта 4146 531 293 157203 4467 9782
МРЬ™ 3381 171 318 431529 23465 20422
МРЬ™ + 7895 50 980 790193 2478 82690
6М-С8Е
СЭ МРЬ™ 135016 297 13339 3945614 10805 342322
СЭ МРЬ™ + 106008 725 8772 3304231 31920 201787
θμ-сэр
Также определяли среднегеометрические отдельные титры 1д6 на 6 недели против рекомбинантного белка порина В. Результаты приведены в табл. 26.
Таблица 26
Отдельные титры 1д6
Адъювант Среднее геометрическое Стандартная ошибка
Без адъюванта 100089 63467
МРЬ™ 217114 451611
МРЬ™ + СМ-С5Р 649801 353863
СЭ МРЬ™ 1917908 1478357
СЭ МРЬ™ + СМ-СЗР 2144567 858184
Эксперимент 11. Иммунизация мышей 8\\ткк-\УеЬк!ег белком порином В №1ккепа допоггЬоеае и различными адъювантами.
Аутбридных мышей 8\\ткк-\УеЬк!ег разделяли на шесть групп по пять мышей в каждой. Каждая группа получала 1 мкг рекомбинантного белка порина В (с цепочкой РА1090 из 16 аминокислот на Νконце фага, а потом зрелой формой белка порина В). Первая группа не получала адъювант (белок был включенным в композицию с РВ8); вторая группа получала 40 нг ГЬ-12; третья группа получала 50 мкг МРЬ™; четверная группа получала МРЬ™ плюс 40 нг 1Ь-12; пятая группа получала 25 мкг СЭ МРЬ™; шестая группа получала СЭ МРЬ™ 8Е плюс 40 нг 1Ь-12. Мышей иммунизировали подкожно в ягодичную области полным объемом 0,2 мл. Иммунизацию проводили на 0 и 4 неделю.
Пример 26. Реципрокные конечные точки титрования подкласса 1д6 в ответ на белок антипорин В и 1д6 и 1дА из промывной жидкости влагалища.
Мышей обескровливали за день до каждой иммунизации и на 13 день после окончательной иммунизации. Сыворотку анализировали как объединенную от мышей в пределах групп. Реципрокные конечные точки титрования подкласса 1д6 в ответ на белок антипорин В измеряли в объединенной сыворотке (п=5 8\\ткк-\УеЬк!ег) промывной жидкости влагалища и 1д6 и 1дА вагинальных промывок на 3 недели и 6 недели. Результаты приведены в табл. 27. Все титры до иммунизации на 0 день были ниже 50. Стандартная ошибка при анализе промывной жидкости влагалища была 1/5.
- 29 006233
Таблица 27 Реципрокные конечные точки титрования субкласса 1дО в ответ на антипориновый В белок и 1§О и 1дА вагинальной промывной жидкости
Неделя 3 Неделя 6 Вагинальная промывка
Адъювант |д<з 1дС1 1д62а 1д<3 1д61 1дС2а 1дО 1дА
Без адъюванта 9084 1872 2872 408944 8314 64500 80 5
1Ь-12 7266 2578 2071 571325 6278 58552 93 5
МРЬ™ 5656 500 1925 265127 76640 60910 54 5
МРЬ,м + 1Ь-12 28274 1442 11348 3747987 120112 44997 88 5
СЭ МРЬ™ 53056 8543 17550 5133154 513236 622514 338 5
СЭ МРЬ™ + 1Ь-12 757133 5622 33259 10935000 210478 471552 3036 5
Эксперимент 12. Иммунизация мышей Ва1Ь/с белком респираторного синциального вируса Е и различными адъювантами.
Мышей Ва1Ь/с разделяли на семь групп из пяти мышей в каждой. Каждая группа получала 3 мкг очищенного нативного белка человеческого респираторного синциального вируса (К8У) Е (в димерной форме). Первая группа не получала адъювант (белок был включенным в композицию с РВ8); вторая группа получала 100 мкг фосфата алюминия (алюм); третья группа получала 20 мкг 811ши1ои™ 08-21 (Ас.|ш1а Вюрйагтасеийсак, 1ис., Егаттдйат, МА); четвертая группа получала 50 мкл МРЬ™; пятая группа получала МРЬ™ плюс 5 мкг ОМ-С8Е; шестая группа получала 25 мкг СЭ МРЬ™; седьмая группа получала СЭ МРЬ™ 8Е плюс 5 мкг ОМ-С8Е. Мышей иммунизировали подкожно в ягодичную область полным объемом 0,2 мл в верхнюю часть бедра. Иммунизацию проводили на 0 и 4 неделю.
Пример 27. Реципрокные конечные точки титрования подкласса 1дО в ответ на белок анти-К8У Е.
Мышей обескровливали за день до каждой иммунизации и на 13 день после окончательной иммунизации. Сыворотку анализировали как объединенную от мышей в пределах групп. Пограничные титры подклассов 1дО реципрокные белку анти-К8У Е измеряли в объединенной сыворотке (и=5 Ва1Ь/с). Результаты приведены в табл. 28. Все титры до иммунизации на 0 день были ниже 50.
Таблица 28 Реципрокные конечные точки титрования субклассов 1§О в ответ на анти-К8У белок
Неделя 3 Неделя 6
Адъювант 1дС 1д61 1дО2а 1д6 1дС1 1дС2а
Без адъюванта 18452 3698 319 539156 3119905 80855
Алюм 66710 35839 4321 5417001 3226833 291474
Стимулон1” 08-21 313665 150988 176080 12113156 2902521 4324004
МРЬ™ 124197 28134 11882 3310838 900863 1057108
МРЬ|м + СЗМ-С8Р 419873 91649 65453 10343803 753890 688554
СЭ МРЬ™ 374992 44115 147366 19333189 1493284 6314264
СЭ МРЬ™ + СМ-С8Р 1748272 51966 267265 30816193 1716850 2641258
Пример 28. Пролиферация клеток селезенки.
Измеряли пролиферацию клеток селезенки в ответ на стимуляцию 1и νίΙΐΌ 2,5 мкг/мл белком К8У Е и различными композициями адъюванта (те же самые, что и в примере 27). Клетки селезенки собирали на 14 дней после вторичной иммунизации и помещали в культуру с плотностью 5х105 клеток. Клетки культивировали в общего количестве 96 ч. В последние 18 ч в культуру добавляли 3Н-тимидин. Данные представлены как индекс пролиферации нормализованных относительно клеток стимулированных в культуре СоиА ([среднее срт антигена/среднее срт СоиА]-[среднее срт среды/среднее срт СоиА])х100. В результате культивированные в среде клетки имеют фоновую пролиферацию 0. Результаты приведены в табл. 29.
- 30 006233
Таблица 29
Пролис зерация клеток селезенки
Адъювант Нормализованный индекс пролиферации
Без адьюванта 18,1
Алюм 13,1
3(1ти1оп'м 05-21 0,8
МРЬ™ 0,4
МРЬ'м + ЭМ-СЭЕ 20,0
СЭ МРЬ™ 17,8
СЭ МРЬ|м+СМ-С8Е 16,3
Эксперимент 13. Иммунизация мышей Ва1Ь/с белком респираторно-синцитиального вируса Р и различными адъювантами.
Использовали протокол эксперимента 12 (иммунизации на 0 и 4 недели белком К8У Р с или без различных адъювантов).
Пример 29. Реципрокные конечные точки титрования подклассов 1дС анти-КБУ Р в ответ на белок.
Мышей обескровливали за день до каждой иммунизации и на 13 день после окончательной иммунизации. Сыворотку анализировали как объединенную от мышей в пределах групп. Пограничные титры подклассов 1дС реципрокные белку анти-КБУ Р измеряли в объединенной сыворотке (п=5 Ва1Ь/с). Результаты приведены в табл. 30. Все титры до иммунизации на 0 день были ниже 50.
Таблица 30 Реципрокные конечные точки титрования субклассов 1§С в ответ на анти-КБУ белок
Неделя 3 Неделя 6
Адъювант 1дЭ 1д61 1д62а 1дЭ 1д61 1дЭ2а
Без адъюванта 6442 2808 713 5195059 963203 38791
Алюм 128695 36841 1975 4285993 567972 27668
Стимулом' 05-21 528036 296292 176703 37221721 1823402 1724319
ΜΡί™ 104702 21930 61253 6153833 1384927 955685
ΜΡΙ ιμ + СМ-С5Е 262128 79888 55249 21054796 3412710 2070305
СЭ МРЬ™ 184246 47194 180932 31731335 4376601 6406591
СЭ МРЬ™ + ЭМ-С5Е 375575 70422 289542 27079086 2124043 6341497
Пример 30. Активность СТЬ клетки селезенки.
Активность СТЬ (цитотоксический Т-лимфоцит) клетки селезенки как результат иммунизации белком-К§У и обозначенными адъювантами оценивали через две недели после заключительной иммунизации. Данные представляют процент активности специфических СТЬ клеток селезенки, культивированных мечеными клетками зараженными К8У, на эффективные меченые клетки в отношении 33:1. Процент специфической активности СТЬ определяли как в примере 24, вычитая активность СТЬ незаряженных меченых клеток из активности, специфической для меченых клеток, инфицированных К8У. Наивные клетки селезенки инфицировали К8У в МО1 (разнообразие инфекции) в 1,5 в течение двух часов как источник ίη νίίτο стимулирующих клеток. Отвечающие клетки селезенки иммунизированных мышей добавляли к стимуляторным клеткам в отношении 5:1 и культивировали в течение шести дней. На 5 день меченые клетки (Ва1Ь/с МНС-Н-26 клеточная линия) инфицировали К8У в МО1 10 в течение двух часов и культивировали в течение ночи. На 6 день инфицированные и неинфицированные меченые клетки собирали и импульсно метили 51 Сг. Затем ίη νίίτο к меченым клеткам добавляли эффекторные клетки в отношении Е:Т в области от 100:1 до 3:1. Высвобождение хрома измеряли через 4 ч инкубации. Результаты приведены в табл. 31.
- 31 006233
Таблица 31
Активность СТЬ клеток селезенки
Эксперимент 14. Иммунизация мышей Ва1Ь/с белком респираторного синциального вируса Р и различными адъювантами.
Мышей Ва1Ь/с разделяли на шесть групп из пяти мышей в каждой. Каждая группа получала 3 мкг очищенного нативного белка человеческого респираторного синциального вируса (К8 V) Р (в димерной форме). Первая группа не получала адъювант (белок был включенным в композицию с РВ8); вторая группа получала 40 нг 1Ь-12; третья группа получала 50 мкл МРЬ™; четвертая группа получала МРЬ™ плюс 40 нг 1Ь-12; пятая группа получала 25 мкг СЭ МРЬ™; шестая группа получала СЭ МРЬ™ плюс 40 нг 1Ь-12. Мышей иммунизировали подкожно в ягодичную область полным объемом 0,2 мл, разделяя на равное количество на каждую сторону от хвоста. Иммунизацию проводили на 0 и 4 неделю.
Пример 31. Реципрокные конечные точки титрования подклассов 1дС в ответ на белок ΒΜΗ-Κ.8ν Р.
Мышей обескровливали за день до каждой иммунизации и на 13 день после окончательной иммунизации. Сыворотку анализировали как объединенную от мышей в пределах групп. Пограничные титры подклассов 1дС. реципрокные белку анти-К8 V Р, измеряли в объединенной сыворотке (п=5 Ва1Ь/с). Результаты приведены в табл. 32. Все титры до иммунизации на 0 день были ниже 50.
Таблица 32 Реципрокные конечные точки титрования субклассов 1дС в ответ на анти-К8V белок
Пример 32. Активность СТЬ клетки селезенки.
Активность СТЬ (цитотоксический Т-лимфоцит) клетки селезенки как результат иммунизации белком-К.8V и обозначенных адъювантов оценивали через две недели после заключительной иммунизации. Данные представляют процент активности специфических СТЬ клеток селезенки, культивированных мечеными клетками зараженными Κ8ν, на эффективные меченые клетки в отношении 33:1. Процент специфической активности СТЬ определяли как в примере 24, вычитая активность СТЬ незаряженных меченых клеток из активности, специфической для меченых клеток, инфицированных Κ8ν. Наивные клетки селезенки инфицировали Κ8ν в МО1 1,5 в течение 2 ч как источник ίη νίίτο стимулирующих клеток. Отвечающие клетки селезенки иммунизированных мышей добавляли к стимуляторным клеткам в отношении 5:1 и культивировали в течение шести дней. На 5 день меченые клетки (Ва1Ь/с МНС-Н-26 клеточная линия) инфицировали Κ8ν в МО1 10 в течение 2 ч и культивировали в течение ночи. На 6 день инфицированные и неинфицированные меченые клетки собирали и импульсно метили 51 Сг. Затем ίη νίίτο к меченым клеткам добавляли эффекторные клетки в отношении Е:Т в области от 100:1 до 3:1. Высвобождение хрома измеряли через 4 ч инкубации. Результаты приведены в табл. 33.
- 32 006233
Таблица 33
Активность СТЬ клеток селезенки
Адъювант Процент активности СТЬ
Без адьюванта 6
1Ь-12 22
МРЬ™ 15
МРЬ™+ 1Ь-12 13
СЭ МРЬ™ 33
СЭ МРЬ™ +1Б-12 28
Эксперимент 15. Иммунизация мышей Ва1Ь/с нуклеокапсидным белком вируса гриппа и различными адъювантами.
Мышей Ва1Ь/с разделяли на шесть групп из пяти мышей в каждой. Каждая группа получала 1 мкг нуклеокапсидного (ΝΓ) белка вируса гриппа из штамма А/йогп/307/72. [Исследование групп]. Первая группа не получала адъюванта (пептид был включенным в композицию с РВ8); вторая группа получала 100 мкг фосфата алюминия; третья группа получала 50 мкл МРЬ™; четвертая группа получала МРЬ™ плюс 5 мкг СМ-С8Р; пятая группа получала 25 мкг СЭ МРЬ™; шестая группа получала СЭ МРЬ™ плюс 5 мкг СМ-С8Р. Мышей иммунизировали подкожно в ягодичную область полным объемом 0,2 мл. Иммунизацию проводили на 0 и 4 неделю.
Пример 33. Активность СТЬ клеток селезенки.
Активность СТЬ клеток селезенки как результат иммунизации ΝΈ вируса гриппа и обозначенных адъювантов оценивали через две недели после заключительной иммунизации. Оценку проводили, используя процедуру примера 32, используя пептид-импульсно меченые клетки р815 (пептид соответствует аминокислотам 147-155 ΝΈ и имеет последовательность: ТНг Туг О1п Агд ТНг Агд А1а Ьеи Уа1 (8ЕО Ш N0: 14). Включение ОМ-С8Р в составы, содержащие МРЬ™ или СЭ МРЬ™, приводило к заметному снижению активности СТЬ (данные не показаны).
Библиография
1. Мокктапп, Т.К., а! а1., 1. 1ттипо1., 136, 2348-2357 (1986).
2. Патент США № 4912094.
3. АЫегк, ΙΌ., е! а1., 1. 1ттипо1., 158, 3947-3958 (1997).
4. 8сйаг1оп-Кегк!еп, Т., е! а1., 1. 1ттипо1., 154, 5320-5330 (1995).
5. 0На11Ь, Н.'М., е! а1., 1. 1ттипо1., 154, 4623-4629 (1995).
6. Мшгау, Н.\У. апб НапргакНай, 1., 1. Ехр. Мей., 181, 387-391 (1995).
7. Патент США № 5571515.
8. Р1пке1тап, Ρ.Ό. апй Но1тек, 1., Апп. Кеу. 1ттипо1., 8, 303-333 (1990).
9. 8паррег, СМ., е! а1., 1. Ехр. Мей., 175, 1367-1371 (1992).
10. КоЬауакЫ, М., е! а1., 1. Ехр. Мей., 170, 827-845 (1989).
11. Международная патентная публикация № \¥0 90/05147.
12. Патент США № 5078996.
13. Патент США № 5229496.
14. Патент США № 5073627.
15. А1йегкоп, М.К., е! а1., 1. Ехр. Мей., 178, 669-674 (1993).
16. 8паррег, СМ., е! а1., 1. 1ттипо1., 154, 5842-5850 (1995).
17. Патент США № 5013548.
18. Патент США № 5019387.
19. СНагЬй, А., е! а1., Уассте, 11, 1221-1228 (1993).
20. №1ик. К.Т, е! а1., АШ8 Кек. Нит. Ке!гоуиикек, 9, 395-404 (1993).
21. ЗоНакоп, К.Р., е! а1., 1. У1го1., 68, 3145-3153 (1994).
22. Ри11ег, ΌΉ., е! а1., АШ8 Кек. Нит. Ке!гоуникек, 10, 1433-1441 (1994).
23. ВегхоГкку, ЬА., е! а1., Ь С1т. 1пуек!., 88, 876-884 (1991).
24. Ра1кег, Т.Ь, е! а1., Ь 1ттипо1., 142, 3612-3619 (1989).
25. НаП, М.К., е! а1., Ь 1ттипо1., 145, 2677-2685 (1990).
26. Наупек, В.Р., е! а1., Ь 1ттипо1., 151, 1646-1653 (1993).
27. Най, М.К., е! а1., Ргос. Νίώ. Асай. 8οΐ., И8А, 88, 9448-9452 (1991).
28. ВагИей, ЬА., е! а1., АТО8, 12, 1291-1300 (1998).
29. Наупек, В.Р., е! а1., АШ8 Кек. Нит. Ке!гоу1гикек, 11, 211-221 (1998).
30. Патент США № 5861243.
31. Патент США № 5932218.
32. Патент США № 5939074.
- 33 006233
33. Патент США № 5993819.
34. Патент США № 6037135.
35. Опубликованная заявка на Европейский патент № 671947.
36. 8!аак, Н.Р., е! а1., 1. Iттиηο1., 157, 462-472 (1996).
37. Рогдабог, А., е! а1., 1. Iттиηο1., 158, 834-841 (1997).
38. А11сп, Т.Н., е! а1., 1. ^тигок, 160, 6062-6071 (1998).
39. М111ег, М.Б., е! а1., 1. Iттиηο1., 147, 320-329 (1991).
40. Едав. Н.А., е! а1., 1. νΐΐΌ1., 13, 5466 (1999).
41. Наг!, и.К., 1. Iттиηο1., 145, 2677-2685 (1990).
42. Патент США № 5736361.
43. Патент США № 5223254.
44. Международная патентная публикация № \¥О 98/20734.
45. Патент США № 5830877.
46. Международная патентная публикация № \¥О 99/51259.
47. Международная патентная публикация № \¥О 99/27944.
48. Патент США № 4666829.
49. Патент США № 5593972.
50. Кцгоба, М.1, е! а1., 1. Ехр. Ме±, 187, 1373-1381 (1998).
Перечень последовательностей <110> АгаеНсап суапаюШ Сотрапу <120> Композиции комбинированного адъюванта <130> 33482-00/РСТ <140>
<141>
<160> 14 <170> РасепР1п Уех. 2.1 <210> 1 <211> 40 <212> РАТ <213> Вирус иммунодефицита мелована <400> 1
Ьуз С1п Не 11е Азп Мер Тгр С1п С1и Уа1 С1у Ьуз А1а Мер Туг А1а 15 10 15
Суз ТЬг Агд Рго Азп Тут Азп Ьуз Агд Ьуз Агд 11е НЬз 11е С1у Рго
20 25 30
С1у Агд А1а РЬе Туг ТЬг ТЬг Ьуз
35 40
<210> 2 <211> 39 <212> РНТ <213> Вирус иммунодефицита человена <400> 2
Ьуз <31п 11е 11е Азп Мер Тгр С1п С1и Уа1 С1у Ьуз А1а Мер Туг А1а 15 10 15
ТЬг Агд Рго Азп Туг Азп Ьуз Агд Ьуз Агд 11е Н1з 11е С1у Рго С1у 20 25 30
Агд А1а РЬе Туг ТЬг ТЬг Ьуз <210> 3
- 34 006233 <211> 9 <212> РЕТ <213> Вирус иммунодефицита обезьяны <400> 3
Суз ТЬг Рго Туг Азр 11е Аэп С1п Мее
5 <210> 4 <211> 9 <212> РЕТ <213> Вирус иммунодефицита обезьяны <400> 4
5ег ТЬг Рго Рго Ьеи Уа1 Агд Ьеи Уа1
5 <210> 5 <211> 9 <212> РЕТ <213> Вирус иммунодефицита обезьяны <400> 5
Туг А1а Рго Рго Не Зег С1у 61η Не
5 <210> 6 <211> 20 <212> РЕТ <213> Вирус иммунодефицита обезьяны <400> 6 <31и Ьеи Туг Ьуз Тух Ьуз νβΐ νοί Ьуз Не С1и Рго Ьеи С1у Уа1 А1а 15 Ю 15
Рго ТАг Ьуз А1а <210> 7 <211> 29 <212> РЕТ <213> Вирус иммунодефицита обезьяны <400> 7
- 35 006233
С1и Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуз Уа1 Уа1 Ьуз Пе С1и Рго Ьеи О1у Уа1 А1а
1 5 10 15
Рго ТЬг Ьуз А1а Суз ТЫ Рго Туг Азр 11е Азп С1п Мес
20 25
<210> β <211;» 29 <212> РКТ <213> Вирус иммунодефицита обезьяны <400> 8
С1и Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуз Уа1 Уа1 Ьуз Не С1и Рго Ьеи С1у Уа1 А1а 15 10 15
Рго ТНг Ьуз А1а Зег ТЬг Рго Рго Ьеи Уа1 Агд Ьеи Уа1
25 <210> 9 <211> 29 <212> РКТ <213> Вирус иммунодефицита обезьяны <400> 9
61и Ьеи Туг Ьуз Туг Ьуа Уа1 Уа1 Ьуз 11е 61и Рго Ьеи С1у Уа1 А1а 15 10 15
Рго ТЬг Ьуз А1а Туг А1а Рго Рго 11е Зег 01 у С1п 11е
25 <210> 10 <211> 42 <212;» РКТ <213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: человеческий пептидный ам<илоидный белой <400> 10
Азр А1а <31 и РЬе Агд Нтз Азр Зег С1у Тух С1и Уа1 Нхз Нхз С1п Ьуз 15 10 15
Ьеи Уа1 РЬе РЬе А1а С1и Азр Уа1 С1у Зег Азп Ьуз 01у А1а 11е 11е
25 30
- 36 006233
С1у Ьеи Μβΐ νβΐ 61у 61у Уа1 Уа1 Не А1а 35 40 <210> 11 <211> 2Θ <212> РКТ <213 > Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: человеческий пептидный ам^-илоидный белок <400> 11
Азр А1а С1и РЬе Агд Н1а Азр Зег 61у Туг 61ц Уа1 ΗΪ5 Н1з 61п Ьув
10 15
Ьеи Уа1 РЬе РЬе А1а 61 и Азр Уа1 61у Зег Азп Ьуа
25 <210> 12 <211> 10 <212> РКТ <213> Вирус иммунодефицита человека <400> 12
Αι-д С1у Рго 61у Агд А1а РЬе Уа1 ТЬг Не 15 10 <210> 13 <211> 10 <212> РКТ <213> Вирус иммунодефицита человека <400> 13
Не С1у Рго 61 у Агд А1а РЬе Туг ТЬг ТЬг 15 10 <210> 14 <211> 9 <212> РКТ <213> Вирус гриппа <400> 14
ТЬг Туг 61п Агд ТЬг Агд А1а Ьеи Уа1
5

Claims (16)

1. Антигенная композиция, содержащая антиген, выбранный из группы, включающей патогенные вирусы, бактерии, грибы, паразитические организмы, антигены опухолевых клеток, в том числе злокачественных, и эффективное количество адъювантной комбинации из 3-О-дезацилированного монофосфорилированного липида А или монофосфорилированнного липида А и СМ-С8Р или 1Ь-12, усиливающей иммунный ответ на указанный антиген у позвоночного животного.
2. Антигенная композиция по п.1, где выбранный антиген представляет собой антиген вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
3. Антигенная композиция по п.1, где выбранный антиген представляет собой антиген вируса иммунодефицита обезъяны (ВИО).
4. Антигенная композиция по п.1, где выбранный антиген представляет собой антиген №188епа допоггйоеае.
5. Антигенная композиция по п.1, где выбранный антиген представляет собой антиген человеческого респираторно-синцитиального вируса (К.8У).
- 37 006233
6. Антигенная композиция, содержащая антиген, выбранный из группы, включающей аллерген или полипептид, пептид или фрагмент амилоидного белка, и эффективное количество адъювантной комбинации из 3-О-дезацилированного монофосфорилированного липида А или монофосфорилированнного липида А и СМ-С8Р или 1Ь-12. усиливающей иммунный ответ на указанный антиген у позвоночного животного.
7. Антигенная композиция по любому из пп.1-6, дополнительно содержащая разбавитель или носитель.
8. Применение эффективного количества адъювантной комбинации из 3-О-дезацилированного монофосфорилированного липида А или монофосфорилированнного липида А и СМ-С8Р или 1Ь-12 для приготовления антигенной композиции, содержащей антиген, выбранный из группы, включающей патогенные вирусы, бактерии, грибы или паразитические организмы, причем данная адъювантная комбинация усиливает иммунный ответ на указанный антиген у позвоночного животного.
9. Применение по п.8, согласно которому иммунный ответ определяется цитотоксическими Тлимфоцитами.
10. Применение по п.8 или 9, где указанный антиген представляет собой антиген ВИЧ.
11. Применение по п.8 или 9, где указанный антиген представляет собой антиген ВИО.
12. Применение по п.8 или 9, где указанный антиген представляет собой антиген №В5Спа допоггРоеае.
13. Применение по п.8 или 9, где указанный антиген представляет собой антиген К8У человека.
14. Применение эффективного количества адъювантной комбинации из 3-О-дезацилированного монофосфорилированного липида А или монофосфорилированнного липида А и СМ-С8Р или 1Ь-12 для приготовления антигенной композиции для лечения или профилактики рака у позвоночного животного, содержащей антиген опухолевых клеток, в том числе злокачественных.
15. Применение эффективного количества адъювантной комбинации из 3-О-дезацилированного монофосфорилированного липида А или монофосфорилированнного липида А и СМ-С8Р или 1Ь-12 для приготовления антигенной композиции, содержащей выбранный аллерген, причем данная адъювантная комбинация усиливает способность организма позвоночного ослаблять реакцию на указанный аллерген.
16. Применение эффективного количества адъювантной комбинации из 3-О-дезацилированного монофосфорилированного липида А или монофосфорилированнного липида А и СМ-С8Р или 1Ь-12 для приготовления антигенной композиции для лечения или профилактики заболевания, характеризующегося отложением амилоидного белка в организме позвоночного хозяина, содержащей полипептид, пептид или фрагмент амилоидного белка или антитело против него.
EA200101198A 1999-05-13 2000-05-12 Комбинированные адъювантные композиции для усиления иммунного ответа у позвоночного животного EA006233B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13396399P 1999-05-13 1999-05-13
PCT/US2000/013156 WO2000069456A2 (en) 1999-05-13 2000-05-12 Adjuvant combination formulations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200101198A1 EA200101198A1 (ru) 2002-04-25
EA006233B1 true EA006233B1 (ru) 2005-10-27

Family

ID=22461127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200101198A EA006233B1 (ru) 1999-05-13 2000-05-12 Комбинированные адъювантные композиции для усиления иммунного ответа у позвоночного животного

Country Status (28)

Country Link
US (2) US7611721B1 (ru)
EP (1) EP1178825B1 (ru)
JP (2) JP4974414B2 (ru)
KR (1) KR100863367B1 (ru)
CN (1) CN1192799C (ru)
AT (1) ATE516046T1 (ru)
AU (1) AU781469B2 (ru)
BG (1) BG106094A (ru)
BR (1) BR0010539A (ru)
CA (2) CA2372181C (ru)
CZ (1) CZ20013916A3 (ru)
EA (1) EA006233B1 (ru)
EE (1) EE200100597A (ru)
ES (1) ES2367625T3 (ru)
GE (1) GEP20053446B (ru)
HR (1) HRP20010839A2 (ru)
HU (1) HUP0201220A3 (ru)
ID (1) ID30407A (ru)
IL (2) IL146382A0 (ru)
IS (1) IS6156A (ru)
MX (1) MXPA01011499A (ru)
NO (1) NO20015523L (ru)
NZ (1) NZ515322A (ru)
PL (1) PL352312A1 (ru)
SK (1) SK16022001A3 (ru)
TR (1) TR200103266T2 (ru)
UA (1) UA76406C2 (ru)
WO (1) WO2000069456A2 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2496149C1 (ru) * 2012-06-19 2013-10-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов
RU2711606C2 (ru) * 2007-10-08 2020-01-17 Интрексон Корпорейшн Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9326174D0 (en) * 1993-12-22 1994-02-23 Biocine Sclavo Mucosal adjuvant
HUP0201220A3 (en) 1999-05-13 2004-07-28 Wyeth Holdings Corp Madison Adjuvant combination formulations
DE60117164T2 (de) * 2000-11-07 2006-08-03 Immuno Vaccine Technologies Inc., Halifax Impfstoffe mit erhöhter immunantwort und verfahren zur deren herstellung
CZ20031225A3 (cs) 2000-11-10 2003-10-15 Wyeth Holdings Corporation Adjuvantní kombinované prostředky
ES2588705T3 (es) 2007-09-27 2016-11-04 Immunovaccine Technologies Inc. Uso de liposomas en un vehículo que comprende una fase hidrófoba continua para la entrega de polinucleótidos in vivo
ES2524699T3 (es) 2008-06-05 2014-12-11 Immunovaccine Technologies Inc. Composiciones que comprenden liposomas, un antígeno, un polinucleótido y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba
CA2793959C (en) 2010-03-25 2019-06-04 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
SI2691530T1 (en) 2011-06-10 2018-08-31 Oregon Health & Science University CMV glycoproteins and recombinant vectors
GB201113570D0 (en) * 2011-08-05 2011-09-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US10105435B2 (en) 2011-10-06 2018-10-23 Immunovaccine Technologies Inc. Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of TLR2 and uses thereof
WO2016210292A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
EP3429603B1 (en) 2016-03-15 2021-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5391485A (en) 1985-08-06 1995-02-21 Immunex Corporation DNAs encoding analog GM-CSF molecules displaying resistance to proteases which cleave at adjacent dibasic residues
US5078996A (en) 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US6294322B1 (en) 1988-01-26 2001-09-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Multideterminant peptides that elicit helper T-lymphocyte cytotoxic T-lymphocyte and neutralizing antibody responses against HIV-1
US5939074A (en) 1986-12-30 1999-08-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Multideterminant peptide antigens
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5019387A (en) 1987-09-08 1991-05-28 Duke University Production of antibodies to HIV
US5993819A (en) * 1987-09-08 1999-11-30 Duke University Synthetic vaccine for protection against human immunodeficiency virus infection
US5013548A (en) 1987-09-08 1991-05-07 Duke University Production of antibodies to HIV
US5223254A (en) 1987-09-29 1993-06-29 Praxis Biologics, Inc. Respiratory syncytial virus: vaccines
CA1340506C (en) 1987-11-24 1999-04-20 Nicholas H. Carbonetti Production of gonorrheal pi proteins and vaccines
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
WO1990005147A1 (en) 1988-11-10 1990-05-17 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
DE3934366A1 (de) 1989-10-14 1991-04-18 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Vakzine zum schutz vor hiv-virusinfektionen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als diagnostikum und immuntherapeutikum
ATE153534T1 (de) 1990-04-27 1997-06-15 John Mcmichael Verfahren und zusammensetzung zur behandlung von erkrankungen des zns hervorgerufen durch abnormales beta-amyloid-protein
SE502569C2 (sv) * 1991-05-31 1995-11-13 British Tech Group Användning av en immunologiskt inert matris av en sterol och saponiner som kan bilda sfäriska nanopartiklar med snäv storleksfördelning som läkemedelsbärare, partiklar, komposition samt kit
EP0671947B1 (en) 1991-12-02 2000-03-08 The Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions for eliciting cytotoxic t-lymphocyte responses against viruses
US6037135A (en) 1992-08-07 2000-03-14 Epimmune Inc. Methods for making HLA binding peptides and their uses
EP0651656A1 (en) 1992-07-08 1995-05-10 Schering Corporation Use of gm-csf as a vaccine adjuvant
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
DE69405551T3 (de) * 1993-03-23 2005-10-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
CA2163550A1 (en) * 1993-05-25 1994-12-08 Gerald E. Hancock Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus
US5830877A (en) 1993-08-26 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
DK0762895T3 (da) 1994-04-29 2002-09-02 Univ Duke Syntetisk vaccine til beskyttelse mod infektion med human immundefektvirus
AUPM543894A0 (en) 1994-05-04 1994-05-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation An adjuvant
WO1996010423A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 Ludwig Institute For Cancer Research COMPOSITIONS CONTAINING A p53 DERIVED PROTEIN OR PEPTIDE, AN ADJUVANT, AND INTERLEUKIN-12 AND USES THEREOF
EP0784486B1 (en) 1994-10-05 2006-04-05 Vanderbilt University Interleukin-12 as an adjuvant for paramyxoviridae vaccines
WO1996026277A1 (en) * 1995-02-24 1996-08-29 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
US6613337B1 (en) 1997-02-12 2003-09-02 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
KR19990082265A (ko) 1996-02-01 1999-11-25 다니엘 제이. 압둔-나비 효모중에서 b군 나이세리아 멘인기티디스 외막(mb３)단백질을 발현시키는 방법 및 백신
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
US5762943A (en) * 1996-05-14 1998-06-09 Ribi Immunochem Research, Inc. Methods of treating type I hypersensitivity using monophosphoryl lipid A
EP1649868A1 (en) 1996-05-31 2006-04-26 National University of Ireland, Maynooth IL-12 as an adjuvant for Bordetella pertussis vaccines
US6024965A (en) 1996-10-18 2000-02-15 Erasums University Rotterdam Induction of REV and TAT specific cytotoxic T-cells for prevention and treatment of human immunodeficiency virus (HIV) infection
KR20070108418A (ko) * 1996-10-23 2007-11-09 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 면역 치료법 및 개량 백신
US6797276B1 (en) * 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US6350456B1 (en) * 1997-03-13 2002-02-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9711990D0 (en) * 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
WO1998056415A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Purified saponins as oral adjuvants
GB9712347D0 (en) * 1997-06-14 1997-08-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1006999A2 (en) 1997-07-08 2000-06-14 Chiron Corporation Use of submicron oil-in-water emulsions with dna vaccines
IS4518A (is) 1997-07-09 1999-01-10 Lyfjathroun Hf, The Icelandic Bio Pharmaceutical Group Nýtt lyfjaform fyrir bóluefni
GB9717953D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
CN1295480A (zh) * 1998-02-12 2001-05-16 美国氰胺公司 含有白细胞介素－12和呼吸道合胞病毒抗原的疫苗
DE69919984T2 (de) 1998-02-12 2005-11-17 Wyeth Holdings Corp. Interleukin-12 und herpes simplex virusantigen enthaltende impfstoffe
ES2284247T3 (es) 1998-04-03 2007-11-01 University Of Iowa Research Foundation Metodos y productos para estimular el sistema inmunitario usando oligonucleotidos y citoquinas inmunoterapeuticos.
GB9907860D0 (en) 1999-04-07 1999-06-02 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
HUP0201220A3 (en) 1999-05-13 2004-07-28 Wyeth Holdings Corp Madison Adjuvant combination formulations

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2711606C2 (ru) * 2007-10-08 2020-01-17 Интрексон Корпорейшн Модифицированные дендритные клетки и их применение в лечении злокачественных опухолей
RU2496149C1 (ru) * 2012-06-19 2013-10-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов

Also Published As

Publication number Publication date
AU4847300A (en) 2000-12-05
ES2367625T3 (es) 2011-11-07
BR0010539A (pt) 2002-02-19
WO2000069456A3 (en) 2001-02-08
SK16022001A3 (sk) 2002-09-10
ATE516046T1 (de) 2011-07-15
ID30407A (id) 2001-11-29
MXPA01011499A (es) 2002-06-04
BG106094A (en) 2002-05-31
WO2000069456A2 (en) 2000-11-23
EA200101198A1 (ru) 2002-04-25
EP1178825A2 (en) 2002-02-13
US7611721B1 (en) 2009-11-03
NO20015523D0 (no) 2001-11-12
JP5230780B2 (ja) 2013-07-10
CA2372181C (en) 2012-04-17
KR100863367B1 (ko) 2008-10-13
IL146382A0 (en) 2002-07-25
CA2372181A1 (en) 2000-11-23
CA2767116A1 (en) 2000-11-23
EP1178825B1 (en) 2011-07-13
CN1192799C (zh) 2005-03-16
GEP20053446B (en) 2005-02-25
UA76406C2 (en) 2006-08-15
US20100233117A1 (en) 2010-09-16
PL352312A1 (en) 2003-08-11
JP2004504260A (ja) 2004-02-12
JP4974414B2 (ja) 2012-07-11
HRP20010839A2 (en) 2003-02-28
AU781469B2 (en) 2005-05-26
NZ515322A (en) 2004-03-26
HUP0201220A2 (en) 2002-08-28
EE200100597A (et) 2003-02-17
CZ20013916A3 (cs) 2002-06-12
IL146382A (en) 2007-07-04
JP2012006949A (ja) 2012-01-12
TR200103266T2 (tr) 2002-01-21
KR20020001873A (ko) 2002-01-09
NO20015523L (no) 2002-01-02
CN1354675A (zh) 2002-06-19
IS6156A (is) 2001-11-12
HUP0201220A3 (en) 2004-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5230780B2 (ja) アジュバント混合製剤
EP1611897A2 (en) Whole or disrupted insect cells as adjuvant for antigens
HU220295B (hu) Antigénkészítmények és ezek alkalmazása citotoxikus T-limfocita reakciók indukálására
Kataoka et al. Nasal Flt3 ligand cDNA elicits CD11c+ CD8+ dendritic cells for enhanced mucosal immunity
HUT65366A (en) Expression of specific immunogens using viral antigens
CN101198353A (zh) 免疫调节组合物和其应用
EP1757615B1 (en) Fusion protein for inhibiting cervical cancer
CN1322250A (zh) 呼吸合胞病毒的吸附(g)蛋白衍生的肽
Shiau et al. Vaccination with the glycoprotein D gene of pseudorabies virus delivered by nonpathogenic Escherichia coli elicits protective immune responses
CN1434864A (zh) 增强对单纯疱疹病毒疫苗的免疫应答的方法
JP2013545735A (ja) インフルエンザウィルスの組換えヘマグルチニン蛋白質及びそれを含むワクチン
Hsieh et al. The effect of co-administration of DNA carrying chicken interferon-γ gene on protection of chickens against infectious bursal disease by DNA-mediated vaccination
EP1250933A1 (en) Vaccines including as an adjuvant high dose type I IFN
AU675703B2 (en) Stimulation of immune response by viral protein
CN101951928B (zh) 多聚γ谷氨酸在制备增强细胞免疫性的组合物中的用途
AU700104B2 (en) Prolactin as a vaccine adjuvant
EA004744B1 (ru) Комбинированные композиции адъювантов
EP0711564A1 (en) Cross-reactive influenza A immunization
EP1082011B1 (en) Avian polyomavirus vaccines in psittacine birds
KR20200076345A (ko) 결핵 2가 항원을 발현하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스 및 이를 포함하는 결핵 예방용 조성물
Becker et al. The immune modulator adamantylamide dipeptide stimulates efficient MHC class I restricted responses in mice
Madaan Heplisav V
UA79426C2 (en) Combined adjuvant compositions

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU