UA76406C2 - Use of 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a or monophosphoryl lipid a in combination with gm-csf or il-12 as adjuvant combination in antigenic composition for enhancing immune response in vertebrate - Google Patents

Use of 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a or monophosphoryl lipid a in combination with gm-csf or il-12 as adjuvant combination in antigenic composition for enhancing immune response in vertebrate Download PDF

Info

Publication number
UA76406C2
UA76406C2 UA2001128558A UA2001128558A UA76406C2 UA 76406 C2 UA76406 C2 UA 76406C2 UA 2001128558 A UA2001128558 A UA 2001128558A UA 2001128558 A UA2001128558 A UA 2001128558A UA 76406 C2 UA76406 C2 UA 76406C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antigen
mri
peptide
mice
cells
Prior art date
Application number
UA2001128558A
Other languages
English (en)
Original Assignee
White Holdings Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by White Holdings Corp filed Critical White Holdings Corp
Publication of UA76406C2 publication Critical patent/UA76406C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Description

Опис винаходу
Даний винахід відноситься до застосування 3-0-дезацильованого монофосфорильованого ліпіду А або 2 монофосфорильованого ліпіду А і їх похідних і аналогів в комбінації з цитокіном або лімфокіном, зокрема, з гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором або інтерлейкіном-12, як ад'ювантною композицією в антигенній композиції для посилення імунної відповіді у хребетного господаря на вибраний антиген.
Імунна система використовує різноманітні механізми для боротьби з патогенами. Однак не всі ці механізми 70 обов'язково активуються після імунізації. Захисний імунітет, що викликається імунізацією, залежить від здатності вакцини індукувати відповідну імунну відповідь для опору або знищення патогену. В залежності від виду патогену це може вимагати клітинної і/або гуморальної імунної відповіді.
Сучасне уявлення про роль Т-хелперних клітин в імунній відповіді полягає в тому, що Т-клітини можуть бути поділені на субпопуляції по цитокінам, які вони продукують, і цей індивідуальний цитокіновий профіль, що 12 спостерігається у таких клітин, визначає їх функцію. Дана Т-клітинна модель включає дві головні субпопуляції: клітини ТН-1, які продукують інтерлейкін-2 (1/-2) і гамма-інтерферон, що посилюють як клітинну, так і гуморальну (антитільну) імунні відповіді; і клітини ТН-2, які продукують інтерлейкін-4, інтерлейкін-5 і інтерлейкін-10О (11/-4, 1/-5 ії 1Ї/-10, відповідно), що посилюють гуморальні імунні відповіді (бібліографічне посилання 11. 20 Часто бажано посилити імуногенну ефективність антигенна для отримання більш сильної імунної відповіді в імунізованому організмі і посилити стійкість господаря до агента, несучого антиген. У деяких випадках, бажано змінити імунну відповідь від переважаючої гуморальної відповіді (ТН-2) на більш збалансовану клітинну (ТН-1) і гуморальну (ТН-2) відповідь.
Клітинна відповідь включає індукцію відповіді, опосередкованої СО8ВАСТІ. (цитотоксичними Т-лімфоцитами). с 25 Така відповідь бажана при розробці вакцин проти внутрішньоклітинних патогенів. Захист проти різноманітних (3 патогенів вимагає сильних імунних відповідей слизової оболонки, високих сироваткових титрів, індукції СТІ і сильних клітинних відповідей. Такі відповіді не індукуються більшістю антигенних препаратів, включаючи традиційні субодиничні вакцини. Одним з таких патогенів є вірус імунодефіциту людини (ВІЛ).
Таким чином, існує потреба в розробці складів антигенних композицій, які здатні індукувати як гуморальну, ее, 30 такі клітинну імунні відповіді у хребетного господаря. ав
Відповідно, метою даного винаходу є використання ад'ювантних комбінованих композицій в складі антигенних композицій, що містять 3-0-дезацдильований монофосфорильований ліпід А (МРІ тм) або З монофосфорильований ліпід А і їх похідні і аналоги в комбінації з цитокіном або лімфокіном, зокрема, «ОО гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором (ЗМ-С5Е) або інтрелейкіном (ІІ/-12), або 32 агоністом або антагоністом вказаного цитокіна або лімфокіна. Ад'ювант являє собою речовину, яка посилює т імунну відповідь при спільному введенні з імуногеном або антигеном. Ад'ювантна композиція по даному винаходу вводиться разом з вибраним антигеном в антигенній композиції. Антигенні композиції по даному винаходу посилюють імунну відповідь у хребетного господаря на вибраний антиген. Вибраний антиген може бути «К поліпептидом, пептидом або фрагментом, отриманим |1) з патогенного вірусу, бактерії, гриба або паразита, або З7З (2) із злоякісної клітини або пухлинної клітини або |З| з алергену, який впливає на продукцію ІДЕ, для с ослаблення алергічних реакцій на алерген або |4| з амілоїдного пептидного білка для профілактики або "з лікування захворювання, яке характеризується відкладенням амилоїда у хребетного господаря. У першому втіленні винаходу, вибраний антиген є антигеном ВІЛ. Вибраний антиген ВІЛ може бути білком ВІЛ, поліпептидом, пептидом або фрагментом, отриманим з вказаного білка. У конкретному втіленні винаходу, 75 антиген ВІЛ являє собою специфічний пептид. В інших втіленнях винаходу, вибраний антиген є антигеном - Меїззегіа допогпоеае або респіраторного синцитіального вірусу.
Ге») МРІ тм може знаходитися у вигляді водного розчину або у вигляді стабілізованої емульсії "масло у воді" 1» (стабільна емульсія, або СЕ). У переважному втіленні винаходу, емульсія "масло у воді" містить сквален, гліцерин і фосфатидилхолін. У СЕ композиції МРітм є змішаним з цитокіном або лімфокіном з утворенням (ав) 50 антигенної композиції до введення. Цитокін або лімфокін не обов'язково додають в емульсію. У переважному
Ф втіленні винаходу, МРі тм знаходиться в формі СЕ. Антигенна композиція, крім того, може включати в себе розріджувач або носій.
Винахід також відноситься до способів підвищення здатності антигенної композиції, що містить вибраний антиген з (1 антигена патогенного вірусу, бактерії, гриба або паразита індукувати імунну відповідь у хребетного господаря, або з |) антигена злоякісної клітини або з асоційованого з пухлиною антигена (Ф) злоякісної або пухлинної клітини, викликати терапевтичний або профілактичний протираковий ефект у
ГІ хребетного господаря, або з |З| алергену, який впливає на продукцію ІДЕ, ослабляти алергічні реакції на алерген, або з |4)| антигена амилоїдного білка для профілактики або лікування захворювання, що бо Характеризується відкладенням амилоїда, у хребетного господаря, введенням ефективної ад'ювантної (що посилює) кількості в комбінації з цитокіном або лімфокіном, зокрема, МРІ тм з СМ-С5Е або 1-12, або агоністом або антагоністом вказаного цитокіна або лімфокіна.
Винахід, крім того, відноситься до способів підвищення здатності антигенної композиції, що містить антиген, вибраний з антигена патогенного вірусу, бактерії, гриба або паразита, активувати цитотоксичні 65 Т-лімфоцити у хребетного господаря шляхом введення ефективної ад'ювантної (що посилює) кількості в комбінації з цитокіном або лімфокіном, зокрема, МРіІ тм з (ЗМ-СЗЕ або 1-12, або агоністом або антагоністом вказаного цитокіна або лімфокіна.
На Фіг.1 зображені реципрокні кінцеві точки титрувань, визначені у груп з п'яти самиць мишей Ваїр/с, імунізованих 25мкг ТІЗРІОМІМЩАХ-Суз), мультиепітопним пептидом з 39 амінокислот, в складі з СЕРА або ІБА (трикутники), або 5Омкг 2906 стабільною емульсією (СЕ) МРІ тм (квадрати). Мишей імунізували на 0 день і повторно імунізували на 28 день. Титри пептид-специфічних Ідс, Ідс1 і |Їд02а визначали в сироватках, зібраних на 42 день з допомогою ЕГГ ІА.
На Фіг.2 проілюстрований ефект одного СЕ, один МРітм або СЕ МРІ тм на посилення впливу СМ-С5Е на титри анти-ТІЗРІОММ(А)Х-Суз) Ід. Групи з п'яти самиць ВаїБр/с імунізували 25мкг ТІЗРТОММ (А) (-Сув) в 0 день 70 і повторно імунізували на 28 день вказаними ад'ювантними композиціями. СЕРА і ІРА емульгували у водному розчині пептиду у відношенні 111. 5М-С5Е використали в концентрації ТОмкг/доза. МРІ тм вводили мишам у вигляді водної композиції в кінцевій концентрації 5Омкг або як компонент стабільної емульсії в концентрації 25мкг с 196 СЕ. Титри визначали через дві тижні після повторної імунізації. Дані являють собою окремі титри, визначені у п'яти мишей.
На Фіг.3 приведені результати аналізу вірусної нейтралізації. Об'єднану сироватку, взяту на 42 день у мишей, імунізованих на 0 і 28 дні вказаними композиціями, розбавляли (1/1600) і додавали до розведень НІМ мм адаптованих Т-клітин перед додаванням до клітин ААБб іп міго. Через сім днів культивування, супернатант клітинної культури аналізували на зворотну транскриптазу вірусу як індикатора вірусної реплікації.
На Фіг.4 проілюстрована проліферація клітин селезінки мишей, імунізованих ТІЗРІТОММ (А; і; -Сув) і різними адювантними композиціями. Клітини селезінки стимулювали іп мйго З,Змкг/мл ТІЗРІОМІЩАХ-Сув) протягом чотирьох днів. Результати показані як зміна впровадження міченого тимідину в результаті іп міго стимуляції
ТІЗРІОММ(А)Х-Суз) відносно впровадження при відсутності стимуляції (різниця кількості імпульсів на хвилину).
На Фіг.5 показана активність СТІ з селезінки, виділених у мишей через сім днів після повторної імунізації. Клітини селезінки збирали у груп з трьох мишей Ваїр/с, імунізованих на 0 і 21 дні 5Омкг. сЄМ ТІЗРІОМІЩА) (-Сув) включеним в композицію з 5Омкг МР! тм в 1956 СЕ з або без 1О0мкг ЗМ-С5Р. Клітини о культивували з пептидом НІМум, що містить епітоп СТІ, протягом семи днів. Протягом останніх п'яти днів в культуру додавали 1/-2. Ефекторні клітини селезінки додавали до мічених хромом клітинам Ра15, імпульсно-міченим НІМумю, іншим штамам, позначеним як НІМ му, або без пептиду, у вказаних пропорціях.
Процент активності СТІ. розраховували як: (Се) специфічне випромінювання (імп хві)- спонтанне випромінювання (мпихв) 100 " ЕТ означає су загальний максимуміімп/ хе)- спонтанне випромінювання Пмп/ хе) відношення ефекторних клітин до мічених. З
Ад'юванти, цитокіни і лімфокіни являють собою імуно-модулюючі сполуки, які володіють здатністю |се)
З5 посилювати і направляти розвиток і профіль імунних відповідей на різні антигени, які самі по собі є слабими їм імуногенами. Правильний вибір ад'ювантів, цитокінів або лімфокінів може індукувати сильну гуморальну і клітинну імунні відповіді, які не розвинулися б за відсутності ад'юванта, цитокіна або лімфокіна. Зокрема, ад'юванти, цитокіни і лімфокіни мають значні ефекти посилення імунної відповіді на субодиничні і пептидні антигени у вакцинах. їх стимулююча активність також корисна при розвитку антигенспецифічних імунних « 20 відповідей проти білкових антигенів. Для різних антигенів, проти яких потрібне створення сильних імунних - с відповідей слизової оболонки, високих сироваткових титрів, індукція СТІ і сильні клітинні відповіді, комбінації ад'юванта і цитокіна/лімфокіна забезпечують стимули, які не забезпечуються більшістю антигенних :з» препаратів.
У множині досліджень оцінювали різні ад'ювантні композиції на тваринних моделях, але в цей час єдиним ад'ювантом, дозволеним для широкого використання на людях, є алюм (гідроксид алюмінію або фосфат -1 алюмінію). Одна група ад'ювантів, стабільних емульсій, що містять різні комбінації "вода в маслі" і "масло у водії, привернула значну увагу внаслідок своєї імунопотенціювальної здатності. Ці композиції, як правило,
Ме, включають різні комбінації метаболізованих або інертних масел, чия дія полягає в стабілізації і депонуванні їх антигенів в місці введення. Одним з таких ад'ювантів є неповний адювант Фройнда (ІРА), який включає 20 мінеральне масло, воду і емульгатор. Повний ад'ювант Фройнда (СЕА) являє собою ІРА з додаванням убитих о нагріванням мікобактерій. Особливою проблемою при використанні цих типів ад'ювантів є подразнення в місці
Ф введення, часто в результаті інфільтрацій мононуклеарними клітинами, що приводить до утворення гранулематозних осередків. Отже, як можливі ад'юванти досліджуються інші сполуки і композиції.
Однією з таких сполук є 3-0О-дезацильований монофосфорильований ліпід А (МРІ тм), розповсюджуваний Кірі дв ІтипоСпет Кезеагесй Іпс. (Натійоп, МТ). МРІтм (описаний в патенті США Мо4912094 (2)), який включений сюди як посилання. іФ) Нещодавно, Ківі ІттипоСнпет Кезеагсі Іпс. розробила метаболізовану композицію "масло-в-воді", яка при ко об'єднанні з МРІ тм, приводить до утворення стабілізованої емульсії, позначеної як СЕ МРІ тм. Стабільну емульсію отримували шляхом мікрозріджування МРІ тм маслом сквалену, гліцерином і фосфатидилхоліном. Ця бо композиція являє собою характерну мікрозріджену емульсію категорії ЗМР. Емульсії, що містять 1 або 295 масла описані в експериментах нижче.
Підшкірне або внутрішньом'язове введення СЕ МРІ тм мишам Ваїр/с не приводило до тканинної патології, що визначається в місці введення. У порівняльних цілях також отримували стабільну емульсію що містить ті ж самі компоненти, але без МРІтм. Конкретно, підшкірна або внутрішньом'язова імунізація пептидом ВІЛ 65 ТІ5БРІОММАХтСув) з 40 амінокислот або пептидом з видаленим цистеїном ТІЗРІОММ(А)Х-Сувз) з 39 амінокислот (відсутність цистеїнового залишку в положенні 17 40-амінокислотного пептиду (ї«Сувг)) включеним в композицію з ад'ювантом СЕ МРІ тм і СМ-С5Е, не приводила до інфільтрації, що визначається, або до тканинних порушень через два тижні після імунізації.
Також даний винахід відноситься до застосування монофосфорильованого ліпіда А, попередника МРІ. м, який також (описаний в патенті США Мо4912094 (2)). Крім того, даний винахід відноситься до похідних і аналогів
МРІ тм ЇЇ монофосфорильованого ліпіда А.
Введення цитокінів і лімфокінов у вакцинні композиції свідчить про розширення і підвищення потенціалу вакцини ІЗ). Було показано, що цитокін інтерлейкін-12 (1-12) стимулює і посилює клітинний імунітет шляхом зсуву розмноження субпопуляції Т-хелперних клітин у бік ТНІ1 цитокінового профілю (тобто, підкласу Ід2 на 70 моделі миші) (4-6). На мишах було показано, що рекомбінантний мишачій 1-12 посилює перевагу ТН-1 профілю імунної відповіді ІЗ).
ІЇ-12 продукується різноманітними антиген-презентуючими клітинами, переважно макрофагами і моноцитами. Він є ключовим елементом індукції ТНІ1 клітин з нативних Т-клітин. Було показано, що продукція
І/-12 або властивість відповідати на нього є ключовими при розвитку захисних ТНІ1-подібних відповідей, 75 наприклад, при паразитарних інвазіях, особливо при лейшманіозі (71. Ефекти І/-12 опосередковані у великій мірі гамма-інтерфероном, продукованим МК-клітинами і Т-хелперними клітинами. Гамма-інтерферон є ключовим для індукції антитіл Ід2а проти Т-залежних білкових антигенів |8) і НасЗ-відповідей на Т-незалежні антигени
ІЗ). 1-12, спочатку названий як стимулюючий фактор натуральних кілерів, представляє собою гетеродимерний цитокін (10). Експресія і виділення білка ІЇ/-12 з рекомбінантних клітин-господарів (описані в опублікованій міжнародній патентній заявці УМО 90/05147 (11).
Іншим цитокіном, який є потенційним ад'ювантом, є ЗМ-С5Е. ОМ-С5Е являє собою особливий вигляд колонієстимулюючого фактора (С5Е). СЕ являють собою сімейство лімфокінів, які індукують диференціювання клітин-попередників в кістковому мозку в конкретні типи зрілих клітин крові. Як (описано в патенті США
Мо5078996 (12)), який включений сюди як посилання, ЗМ-С5ЗЕ активує макрофаги або попередники-моноцити с для опосередкування неспецифічної протипухлинної активності. Була описана нуклеотидна послідовність, що о кодує ген ОМ-С5Е людини (|12). Плазмідою, що містить КДНК ОМ-С5Е, трансформували Е.соїї і депонували в
Американській колекції типових культур (АТСС), 10801 Опімегейу Вошемага, Мапаззаз, МА 20110-2209, під номером 39900. Як (описано в патенті США Мо5229496 (13)), який включений сюди як посилання, ген СМ-С5Е також був вставлений в дріжджову експресруючу плазміду і депонований в АТСС під номером 53157. Крім того, «0 як описано в патенті США Мо5073627 (14)), який включений сюди як посилання, послідовність ДНК, що кодує
ОМ-С5Е з видаленими сайтами глікозилювання, була депонована в АТСС під номером 67231. о
Показано, що ЗМ-С5ЗЕ позитивно регулює білкові молекули на антиген-презентуючих клітинах, що явно чІ посилюють імунні відповіді (15) і що впливають на секрецію Ід в фракційно-очищених В-клітинах мишей (16).
Показано, що інші цитокіни або лімфокіни, включаючи, але не обмежуючись ними, інтерлейкіни 1-альфа, ї-о 1-бета, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 і 18, альфа-, бета- і гамма-інтерферони, гранулоцитарний ч- колонієстимулюючий фактор і фактори некрозу пухлини альфа і бета, мають імуномодулюючу активність.
При системному введенні будь-якого цитокіна або лімфокіна необхідно враховувати біологічні наслідки, пов'язані з активністю цитокіна або лімфокіна. Крім того, ефекти цитокіна або лімфокіна, пов'язані з « розвитком антигенспецифічних імунних відповідей, повинні бути посилені, при підтримці місцевих концентрацій 470 цитокінов або лімфокінов. - с У попередніх дослідженнях ЗМ-С5Е і 1-12 оцінювалися окремо один від одного; спостерігали посилення ц різних параметрів імунної відповіді. "» Описаний тут винахід демонструє, що при комбінуванні антигена, вибраного цитокінового або лімфокінового адюванта і другого адюванта, МРіІтм (переважно в стабільній метаболізованій емульсії), посилюються специфічні імунні відповіді на антиген. - і Антигени, вибрані для включення в антигенні композиції по даному винаходу, включають пептиди або бу поліпептиди, отримані з білків, а також фрагменти будь-якого з сахаридів, білків, полі- або олігонуклеотидів або інших макромолекулярних компонентів. Термін, що використовується тут "пептид" включає в себе ряд, ї принаймні, з шести амінокислот і містить, принаймні, одну антигенну детермінанту, в той час як "поліпептид" є о 50 більш довгою молекулою чим пептид, але все ж не складає повнорозмірний білок. Термін, що використовується тут "фрагмент" має на увазі частину, але меншу, цілого сахариду, білка, полі- або олігонуклеотида, або інших 4) макромолекулярних компонентів. У випадку ВІЛ, антигенні композиції по даному винаходу, крім того, включають повнорозмірні білки ВІЛ.
Винахід ілюструється модельною системою, що включає пептидні антигени, отримані з ВІЛ. Ці пептиди описані або взяті |з патентів Мо5013548 (17) і 5019387 (18)), які приведені тут як посилання, і тут о підсумовані. Ці пептиди включають амінокислотні послідовності, які відповідають області білка оболонки ВІЛ, проти яких продукуються нейтралізуючі антитіла і Т-клітинні відповіді. їмо) ВІЛ являє собою ретровірус людини, який є етіологічним агентом синдрому набутого імунодефіциту (СНІД).
ВІЛ інфікує Т-лімфоцити імунної системи шляхом приєднання свого глікопротеїну зовнішньої оболонки до 60 молекули СО4 (Т4) на поверхні Т-лімфоцитів, таким чином, використовуючи молекулу СО (Т4) як рецептор для проникнення і інфікування Т-клітин. Спроби стимулювати захисну імунну відповідь, специфічну для ВІЛ-інфекції, шляхом імунізації мали дуже обмежений успіх. У цей час розглядається ряд підходів з метою визначити ефективну і захисну стратегію вакцини. Вони включають використання ослабленого і рекомбінантного бактерійних векторів, які експресують антигенні епітопи ВІЛ (19), рекомбінантного аденовірусу |20)| або 65 векторів на основі вірусу коров'ячої віспи (21), ДНК-вакцин (22) і синтетичних пептидів, які містять різні Т- і В-клітинні епітопи ВІЛ (231.
Глікопротеїн др120 зовнішньої оболонки ВІЛ, як було показано, здатний індукувати нейтралізуючі антитіла у людини. Рекомбінантний білок РВІ, що становить приблизно третю частину всієї молекули др120, як було показано, включає частину білка оболонки, який стимулює утворення нейтралізуючих антитіл. Однак дослідження на шимпанзе показали, що ні інтактний одр120, ні РВІ, не здатні індукувати продукцію високих титрів нейтралізуючих антитіл.
Традиційними способами були синтезовані короткі пептиди, відповідні антигенним детермінантам одр120 і що генерують гуморальну відповідь проти др120, яка нейтралізує вірус і індукує відповіді Т-хелперів і СТІ проти вірусу. 70 Один такий пептид являє собою пептид НІМ-1 мм, що містить мультіепітоп С4/Л/3, позначений як
ТІЗРІОММ(АХ нСузвг), і його варіант з видаленим цистеїном, ТІЗРІОММ(А)(-Суз). Ці пептиди включають епітопи ТН,
Теті і В, але не індукують антитіла, які перешкоджають скріпленню з СО4. Раніше було показано, що ці пептиди
С4Л/З3 ВІЛ є можливими кандидатами для індукції імунних відповідей при спільному введенні з СЕРА або
СЕА-подібними ад'ювантами (24-29). Як попередньо було показано, ці пептиди містять епітопи, які викликають клітинні відповіді СО4ж- ТН-клітин як у мишей, так і у людей, і вони містять як головний нейтралізуючий епітоп, так і сайт пізнавання СО8- СТІ, і у мишей Ваїр/с, і в людей, яким є НІА В7ж. Нещодавно на
ВІЛ-інфікованих пацієнтах була показана як імуногенність, так і безпека пептиду, що складається з 39 амінокислот (28). ТІЗРІОММ(АХ їСуз) має наступну послідовність з 40 амінокислот:
Гуз біп Пе Це Ахп Меї Тгр Сіп Сім Маї Сіу Мув Аа Меї Тут Аїа Су5 Тіг Аге
Рго Авп Туг Авп Гуз Аге Гуз Аге Пе Ні Пе СІу Рго Сіу Аге Аа Рбе Туг ТІг
Тіг Гуз (5ЕО ІЮ МО. 1) (26). сч
ТІБРІОММ(А)Х-Сувз) був синтезований без цистеїну в положенні 17 і має наступну послідовність з 39 Ге) амінокислот:
Гле (БО Ір иИО:5у зо че А мг ре мів гла мій Це Ні Це ОТА Біо ОА лм ре АЮ Тр Тл. ій ге пу Це Пе ем удес І ото оп Ав ОА ле ув дес. мі Тр чів ро «
Цей залишок цистеїну розташований поза функціональними епітопами, розпізнаваними ТН-клітинами, СТІ з або В-клітинами. Інші пептиди ВІЛ з різних областей вірусного геному (описані в патенті США Мо5861243 (30), в М патенті США Мо5932218 (31), в патенті США Мо5939074 (32), в патенті США Мо5993819 (33), в патенті США
Мо6037135 (34), в опублікованій заявці на видачу європейського патенту Моб71947 (З35)), які також включені сюди як посилання.
Антиген ВІЛ може бути білком, поліпептидом, пептидом або фрагментом, отриманим з вказаного білка. Білок « 20 може бути глікопротеїном, таким як ор41, др120 або одр160. Альтернативно, білок може бути білком, що -в кодується такими генами як дад, рої, мії, гем, мрг, їаїб пеї або епу. Пептиди, отримані з таких білків, с містять, принаймні, одну антигенну детермінанту (епітоп) довжиною, принаймні, в шість амінокислот. :з» Імунна відповідь на пептид ВІЛ може бути посилена за допомогою ковалентного скріплення (кон'югування) пептиду з молекулою фармацевтично прийнятного носія. Приклади відповідних молекул носія включають 15 анатоксин правця, анатоксин дифтерії, гемоціанін морського блюдця і інші пептиди, відповідні епітопам -1 Т-клітини глікопротеїну др120 ВІЛ.
У цей час передбачається, що успішна стратегія вакцинації проти ВІЛ повинна викликати імунітет слизової
Ге) оболонки на ВІЛ, також як і сильну відповідь СТІ. У недавньому дослідженні на мишах, використовуючи їх мультіепітопний пептид ТІЗРІОММ(А) і холерний токсин як ад'ювант для відповіді слизової оболонки було показано, що інтраназальна імунізація індукує нейтралізуючі сироваткові антитіла Ід! |ІЗ6)Ї. Подальше (ав) дослідження, також при використанні пептидів петлі МЗ ВІЛ, виявило індукцію синтезу антитіл ІДА в слизовій і
Ф сильні клітинні відповіді, включаючи відповідь пептид-специфічних СТІ. |З37). Функціональна роль високих титрів системних і нейтралізуючих антитіл в профілактиці або стабілізації ВІЛ-інфекції невідома, хоч вважається, що високі титри вірус-специфічного антитіла важливі для запобігання поширенню вірусу. 5 У переважному втіленні винаходу отримували стабільну емульсію "масло у воді", утримуючу МРІ м, яку потім змішували з цитокінами І//-12 або ЗМ-С5Р. Дані, представлені нижче, демонструють, що ці комбінації (Ф) приводять до напрацювання високих титрів ВІЛ-нейтралізуючих сироваткових антитіл. Комбінація СЕ МРІ мі ка ОМ-С5Е індукує напрацювання високих титрів антиген-специфічних антитіл ІДС і ІдА в зведенні піхви в імунізованих самиць мишей. Імунізація мишей будь-яким з пептидів ТІЗРІОММ(А), включених в композицію з СЕ 60 МРІЇтм і ОМ-С5Е, індукувала сильну клітинну імунну відповідь, судячи з посиленої антиген-специфічної клітинної проліферації і секреції цитокінів в культурі, а також, індукції пептид-специфічних відповідей СТІ.
Звичайно антиген/ад'ювантна композиція МРІ тм або СЕ МРІ м, комбінована з ЗМ-С5Е або 1-12, і вибраним білком або пептидом, індукує напрацювання високих титрів антиген-специфічних і вірус-нейтралізуючих антитіл, істотна зміна в співвідношенні в підкласі до у бік більшої частки комплемент-зв'язуючих антитіл до (у мишей 65 в бік Ідс2а), посилення продукції цитокінів і клітинної проліферації мононуклеарних клітин у відповідь на антигенну стимуляцію іп міо. Ці властивості не спостерігалися у композицій з антигена і СЕ у відсутність
МРІ м, або з СМ-С5Е або 1І-12, або без них. Композиції по даному винаходу також індукують сильні клітинні відповіді, судячи з індукції СТІ.
Корисною властивістю СЕ МРІ тм є те, що композиція не індукує гранулематозне скупчення і запалення в місці введення; такі реакції в місці введення звичайно викликаються ад'ювантними композиціями "вода в маслі" або "масло у воді".
Здатність індукувати посилену імунну відповідь за допомогою стимулюючих ефектів МРі тм в поєднанні з
ОМ-С5БЕ або ІІ -12 у відсутність місцевого гранулематозного запалення не повідомлялася для інших ад'ювантних композицій, що пропонуються в цей час для лікування ВІЛ.
Проводилися ряд досліджень для порівняння МРІ тм (або з СЕ, або без неї) плюс ЗМ-С5Е або 1І-12 з кожним з МРІ зм, СЕ, (ЗМ-СЗЕ, 1-12 або СЕАЛЕА окремо або разом з пептидом ВІЛ. Результати будуть коротко представлені з більш докладним обговоренням надалі.
У першому експерименті, миші Ваїр/с, підшкірно імунізовані пептидом ТІЗРІОММ(АХ-Сув) ВІЛ, що містить
С4/Л/3, включеним в композицію з МРІ тм СЕ і ЗМ-СЗЕ, виявляли сироваткові титри ДО вище за 107 лише після 72 двох ін'єкцій. Гуморальна відповідь була ВІЛ-нейтралізуючою і характеризувалася істотним збільшенням титрів пептид-специфічних антитіл ІДдсІ, ІдсС2а і Ід02Б. Клітини селезінки, простимульовані в культурі пептидом, секретували підвищені кількості ІЇ/-4, І/-5 і гамма-інтерферону. Разом ці результати свідчать про індукцію збалансованої відповіді типу ТН-1/ТН-2. У промивних рідинах піхви мишей, імунізованих СЕ МРІ тм і (зЗМ-С5Е, напрацьовувалися антитіла Ідс і ІдДА, специфічні по відношенню до ТІЗРІОММА)-Суз). Ці результати показують, що комбінація СЕ МРІ тм ії ЗМ-С5Е з пептидним антигеном ВІЛ приводить до індукції сприятливого профілю імунної відповіді.
У цьому першому експерименті, миші ВаїБр/с, імунізовані пептидом ТІЗРІОМІЖАХ-Суз) ВІЛ і СЕ-утримуючою ад'ювантною композицією або ЗМ-С5Е, виявляли титри пептидспецифічних антитіл дос (таблиця 1). Стабільна емульсія (СЕ) "масло у воді", що складається з сквалену, гліцерину і емульгатора (фосфатидилхоліну), виявляла сч 29 здатність збільшувати титри пептидспецифічних Ід при змішуванні з ТІЗРІОММ(А) (-Сув). Титри дО, індуковані (9 імунізацією 25мкг ТІЗРІЛОММ(А)(-Сувз), включеного в композицію з СЕ, індукували титри повторної відповіді, які були рівні приблизно одній п'ятій таких, індукованих у мишей, імунізованих пептидом і СЕА і повторно імунізованих пептидом в ІРА. Реципієнти вакцини з СЕРАЛЕА звичайно у відповідь на первинну імунізацію формували ТІЗРІОММ(А)(-Суз)-специфічні титри до. Для порівняння, мишей імунізували тільки 25мкг пептиду іш ТІЗРІОММ(АХ-Суз). о
Водні і СЕ композиції МР тм порівнювали по відповідях, що індукуються при імунізації мишей з ад'ювантами
Фройнда або цитокінами 1-12 ії 5М-С5РЕ. Реципієнти ТІЗРІОМІЩАХ-Суз), змішаного з 1-12, як правило, не З виявляли титри пептидспецифічних антитіл в декількох повторних дослідженнях. Навпаки, реципієнти СОМ-С5Е (Се) або СЕ МРІ тм плюс ТІЗРІОММ(А)(-Суз) виявляли низькі, але такі, що легко виявляються титри антитіл до. У відповідь на імунізацію композицією, що містить СЕ МРІ тм разом з пептидом ТІЗРІОММА)(-Суз), з додаванням ї-
І--12 або ЗМ-С5БЕ, індукувалися значно більш високі титри дО. Дійсно, імунізація мишей поєднанням СЕ МРІ тм і ЗМ-С5Е давала титри повторної відповіді, які були відповідно більшими за такі, визначені у мишей, імунізованих будь-якою іншою дослідженою композицією. Титри пептидспецифічних дО були вищими від таких у « мишей, імунізованих навіть 125мкг ТІЗРІОММ(А)(-Суз), включених у композицію з ад'ювантами Фройнда. 2 с Бажаною особливістю ВІЛ-специфічної імунної відповіді є баланс між клітинним і гуморальним компонентами.
Встановлений взаємозв'язок індивідуальних підкласів ізотипів імуноглобуліну зі зсувом субпопуляції з Т-хелперних клітин у бік переважання або ТН-1, або ТН-2. Цитокіни, секретовані кожною з цих субпопуляцій
Т-хелперних клітин, виявляли активність в напрямі перемикання підкласів Ід. Кінцеві точки титрувань підкласу
Ід визначали з об'єднаних сироваток, зібраних через два тижні після другої імунізації (таблиця 2). -І Імунізація мишей тільки одним ТІЗРІОММ(А)Х-Сувз) або в складі або з ЗМ-С5Е, або з 1І/-12, приводила до відсутності або низьких титрів підкласу дб в декількох повторних дослідженнях. Антитіла ДОЗ не були ме) виявлені з допомогою ЕЇГ ІЗА. У групах мишей, імунізованих ТІЗРІОММ(А)(-Суз), емульгованим в СЕРА, і повторно їх імунізованих ІРА, розвивалася переважно гуморальна Ідсі імунна відповідь, специфічна для ТІБРІОММ(А) (-Сув).
Композиції пептиду з СЕ, СЕ МРІ тм, СЕ МРІ тм -12 або СЕ МРІ тмн(ЗМ-СЗЕ, також індукували високі титри о антитіла ІдСІ. Реципієнти, вакциновані СЕ композицією, неодноразово демонстрували високі титри ІдсіІ при
Ф невисоких титрах ІдбСга або ІдсС20. Включення МРІ тм в СЕ композиції приводило до збільшення
ТІБРІОММ(А)(-Суз)-специфічних титрів антитіл Ідсл2а і Ідс25. Включення або 1-12, або 3М-С5Е в СЕ МРІ м і
ТІЗРІОММ(А)Х-Суз) приводило до зсуву відношення титрів антитіл дО Ідсга. Без цитокінів вакцинна композиція
СЕ МРітм викликала схожі титри ІдсСіІ і Ідс2га. Як 1-12, так і ЗМ-С5Е збільшували відносні сироваткові о концентрації пептид-специфічного Ідо2а. Крім того, комбінація СЕ МРІ тм ії ЗМ-С5Е також спричинила істотне збільшення титрів антитіл Іде26Б, специфічних для ТІ5РІТОММ (А) (-Суз) (47-кратне в порівнянні з СЕ МРІ мі ю 74-кратне в порівнянні з СЕ). Титри, що напрацьовуються у мишей, імунізованих СЕ МРІ тм і ЗМ-С5Е, разом з пептидом ТІЗРІОММА)Х-Суз), були погоджено найвищими в будь-якій групі вакцинованих реципієнтів. 60 Визначення високих титрів, виміряних в об'єднаних сироватках мишей, імунізованих ТІЗРІОММ(А)Х-Суз),
МРІ м СЕ і ЗМ-СЗЕ, були характерними для окремих мишей в межах групи, титри окремих мишей в межах цієї групи порівнювали з такими у мишей, імунізованих пептидом з ад'ювантом Фройнда (на Фіг.1). Було показано, що в середньому окремі сироваткові титри ІдС, ІДС! ії дб2а були схожі з титрами, виміряними в об'єднаних сироватках (дані не показані). Співкомпозиція ТІБРТОММ (А) (-Сув) з СЕ МРІ тм Її ОМ-С5Е приводить до значного бо збільшення титрів дО, Ід і ІЇдС2а в порівнянні з титрами, індукованими у мишей, імунізованих СЕАЛЕА. Всі миші, імунізовані СЕ МРІ тм Її ЗМ-С5Е включеним в композицію з пептидом, індукували більш високі титри антитіл
ІдО чим, ті, які вимірювали у мишей, імунізованих композицією СЕАЛЕА. Ці результати показали, що комбінація
СЕ МРІ тм з СМ-С5Е генерує відповідний профіль гуморальної імунної відповіді, що визначається високими титрами пептид-специфічних антитіл, і відповідний розподіл підкласів ЇдД0. Ця композиція звичайно індукує самі високі ТІЗРІОММ(А)(-Суз)-специфічні титри будь-якої композиції вакцини, що використовується.
Проводили порівняння титрів (дб анти-ТІЗРІОММ(А)Х-Сувз) у мишей, імунізованих (3М-СЗЕ, включеним в композицію із водним МРІ тм, СЕ або СЕ МРІ м, для визначення ефектів ОМ-С5Е як додаткового ад'юванта (на
Фіг.2). Результати показали, що в цьому окремому втіленні комбінація СЕ МРІ з ОМ-С5Е і пептидом є 70 унікальною для індукції високого титру антитіл. МРІ тм плюс ЗМ-СЗЕ демонстрував титри порівнянні з СЕАЛЕА.
Таким чином, ад'ювантні властивості МР тм і (ЗМ-С5Е, виглядають синергічними, коли знаходяться в загальному складі, де МРІЇ тм знаходиться або у водній формі, або у вигляді стабільної емульсії.
Потім вимірювали ТІЗРІОМІЩА)(-Суз)-специфічні титри антитіл в об'єднаних промивних рідинах піхви, отриманих у мишей через чотири тижні після другої імунізації (таблиця 3). У мишей, імунізованих СЕ МРІ тм плюс 75 (ЗМ-С8Е, формувалися високі титри антитіл ІдА і дО. Титри антитіл у вагінальній промивній рідині, отриманої у мишей, імунізованих іншими композиціями, звичайно не виявлялися. Оскільки відношення ІдсС до з5ідА у вагінальній промивній рідині зсунуте в бік Ід, і оскільки (ДА не був виміряний, неможливо зробити висновок про те, що антитіло ІдДА, виявлене у вагінальній промивній рідині, є локально таким, що синтезується слизовою оболонкою. Дійсно, ймовірно, що виявлені титри ІДА і (дО є результатом транссудативної імуноглобулінової секреції плазматичних клітин, розташованих на периферії слизової оболонки піхви.
Ці результати показують, що миші, імунізовані пептидом ВІЛ ТІЗРІОММА) (-Сув) включеним в композицію з
СЕ МРІ тм в комбінації з або ІІ -12, або ЗМ-С5Е, мали високі титри пептид-специфічних сироваткових антитіл.
Щоб оцінити, чи були ці титри антитіл функціонально ефективними, сироватку аналізували на її здатність інгібувати інфекцію клітин іп мйго за допомогою лабораторного штаму ВІЛ. Аналіз вимірював активність с зворотної транскриптази вірусу, яка знижувалася в супернатанті культури клітин, інфікованих відповідним Ге) штамом ВІЛ. Сироватка мишей, імунізованих СЕ МРІ тм і (ЗМ-С5Е, або СЕ МРІ тм Її 1-12, в обох випадках значно зменшувала вірусну інфективність (на Фіг.3). Максимальні одиниці зворотної транскриптази вірусу знаходилися в області від 9481 до 10411. Сироватка мишей, імунізованих тією ж композицією, інгібувала вірусну реплікацію. Навіть при розведенні вірусу тільки 1/20, сироватка мишей, імунізованих СЕ МРІ тм Її М-С5Е разом з шо 3о ТІБРІОМІЩА)Х-Суз), інгібувала вірусну реплікацію приблизно на п'ятдесят процентів. Титри нейтралізуючої (ав) сироватки цієї композиції визначали як більше ніж 1600, в порівнянні з 71 для сироватки, отриманої від мишей, імунізованих композицією СЕ МРІ тм, || -12 і пептидом ВІЛ. т
Титри анти-ТІЗРІОММ(АХ-Сув) сироватки з цих груп мишей були схожі (хоч і трохи вище) з тими, які були (Се) з викликані у мишей, імунізованих СЕРА і ІРА. Сироватки мишей, імунізованих ТІЗРІОММ(А)(-Суз), емульговані з М
СЕАЛЕА, не демонстрували ВІЛ-нейтралізацію в цьому аналізі. Сироватки мишей, імунізованих пептидом і комбінацією СЕ МРІ "М плюс ЗМ/СЗЕ як ад'ювант, демонстрували більшу нейтралізуючу активність, чим будь-які інші сироватки. При еквівалентному розведенні, сироватки мишей, імунізованих СЕ МРІітм плюс ОМ-С5БЕ і пептидом ВІЛ, нейтралізували більш високі концентрації вірусу, чим сироватки реципієнтів інших вакцинних «
КОМПОЗИЦІЙ. шщ с Потім вимірювали ВІЛ-пептидспецифічну проліферацію в культурі клітин селезінки. Для вимірювання . клітинної реактивності на ТІБРІОММ(А)(-Суз), клітини селезінки культивували іп мйго з пептидом або "» контрольними білками. У аналізі вимірювали включення ЗН-тимідину в ДНК клітин, що діляться (таблиця 4). На відміну від клітин селезінки мишей, імунізованих без ад'юванта, клітини селезінки мишей, імунізованих ТІЗРІОМІЩА) (-Сув) включеним в композицію з СЕ, активно проліферували у відповідь на пептид. Клітини -І селезінки вакцинованих реципієнтів не відповідали в культурі на нерелевантний антиген (лізозим) або на безантигенну стимуляцію. На стимуляцію мітогеном СопА всі групи відповідали однаково. У межах більшості
Ф груп проліферативна відповідь залежала від вказаної антигенспецифічної дози. Всі три дози давали саму високу ьч міру проліферації в групах мишей, імунізованих (3М-СЗЕ, включеним в композицію з СЕ МРІ м, Самі низькі о 50 проліферативні відповіді були отримані у клітин селезінки груп мишей, імунізованих вакцинами з СЕАЛЕА або
І--12, включеним в композицію з пептидом ВІЛ. Клітини селезінки мишей, імунізованих пептидом і або СЕ, або 4) ОМ-С5РЕ, включали в себе схожі рівні тимідину в культурі. Ці результати показали, що співкомпозиції пептиду
ВІЛ з СЕ МРіІтм їі ЗМ-С5Е забезпечують саму високу проліферативну активність клітин селезінки мишей у відповідь на іп міго презентований антиген.
Культивовані клітини селезінки досліджували на їх можливість секретувати цитокіни І/-4 (таблиця 5) і о гамма-інтерферон (таблиця 6) в культурі супернатантів. Ці цитокіни вимірювали в культурах супернатантів, зібраних через три і шість днів іп міго після стимуляції антигеном або мітогеном. Вимірювання ІІ -4, цитокіна ко пов'язаного з Т-хелпером другого типу, показало, що не дивлячись на те, що всі групи продукували на З день рівні, що виявляються у відповідь на стимуляцію мітогеном СопА, тільки миші, імунізовані МР! тм СЕ або СЕ 60 МРІЇ тм плюс М-С5Е, продукували І! -4 у відповідь на стимуляцію пептидом. Тільки миші, імунізовані МР! тм СЕ плюс ЗМ-СЗ5Е і ТІЗРІОММА)(-Суз), секретували в культуру рівні, що виявляються ІІ -4 з всіма дозами пептиду, що використовуються для стимуляції клітин селезінки. На шостий день культивування, клітини селезінки мишей, імунізованих пептидом разом з СЕ МРітм плюс СОМ-С5Е, секретували більш високі рівні І/-4, ніж ті, що виявляються у мишей, імунізованих пептидом разом з СЕ МРІ тм, СЕ МРІ тм плюс 1І-12 або СЕ. Рівні ІІ -4 були бо навіть вищими ніж ті, що індукуються шляхом стимуляції цих клітин СопА. Клітини селезінки мишей, що культивуються, імунізованих СЕ МРІ тм плюс ЗМ-С5Е, також у відповідь на стимуляцію ТІЗРІОММ(А)Х-Сув) протягом шести днів секретували в культуру рівні, що виявляються ІІ -5 (інший цитокін Т-хелпера другого типу (не показано)). Клітини селезінки ні від яких інших груп не продукували ІІ -5, що виявляється в цих культурах.
У відповідь на триденну стимуляцію культури СопА, клітини селезінки всіх груп мишей секретували рівні гамма-інтерферону, що виявляються в культурі (таблиця 6). Тільки клітини мишей, імунізованих СЕ МРІ тм або
СЕ МРІ тм плюс СМ-С5Е, або СЕ МРІ тм плюс СМ-С5Е, продукували рівні гамма-інтерферону, що виявляються, у відповідь на триденну стимуляцію пептидом ВІЛ. По завершенню шестиденної стимуляції культури спостерігалися більш високі концентрації інтерферону гамма у відповідь і на СопА, і на пептид. Важливими були 70 рівні гамма-інтерферону, виміряні в культурі супернатантів клітин селезінки мишей, імунізованих СЕ МРІ тм або
СЕ МРІтм плюс ОМ-С5Е. Клітини селезінки цих двох груп реципієнтів виділяли помітно більш високі концентрації гамма-інтерферону в культурі супернатантів, ніж клітини селезінки мишей, імунізованій пептидом разом з СЕ МРІ тм плюс 1І-12 або СЕ.
Результати першого експерименту демонструють, що введення МРІ тм в стабільну емульсію "масло у воді" 75 і потім, поєднання емульсії з пептидом ВІЛ ТІЗРІОММ(А)(-Суз) і ОМ-СЗЕ, приводили до індукції нейтралізуючих антитіл. Крім того, співкомпозиція (ЗМ-СЗЕ разом з СЕ МРІ тм і антигеном вакцини приводили до збільшення рівнів 1/-4, 1-5 і гамма-інтерферону, що секретуються в супернатантах культури, і до посилення проліферативної відповіді клітин селезінки, стимульованих в культурі імунізуючим антигеном. Така композиція також індукує самий високі титри Ідс, ІдС2а, і (90526 при введенні будь-якої з перелічених вище вакцинних композицій. Тільки групи мишей, імунізовані комбінацією СЕ МРІ тм і (ЗМ-СЗЕ разом з пептидом, мали титри, що виявляються Ідс і ІдА в промивних рідинах піхви згідно з числом повторних досліджень. Комбінація СЕ МРІ м,
І--12 ії пептиду також призводила до збільшення рівнів титрів ІдсІ і ІЇд02а, збільшенню вірусної нейтралізації, збільшенню проліферації клітин селезінки і секреції ІІ -4 і гамма інтерферону.
Імунізація мишей будь-яким окремим ад'ювантом, включеним в композицію з пептидом ВІЛ, не давала імунну сч 29 відповідь з виявленням нейтралізуючих антитіл. Ге)
Часто спостерігалося, що імунізація мишей ТІЗРІОМІЩА)Х-Суз), разом з СЕ МРІ тм або МРІ тм у вигляді водної композиції, індукувала високі титри антитіл. Ці композиції, однак, не індукують імунну відповідь з титрами вагінальних антитіл, титрами нейтралізуючих антитіл (або сильні відповіді СТІ, описані нижче в с 20 експерименті 8). Іноді, МРітм або СЕ МРІ тм в комбінації з пептидом індукували вимірні титри ІдА і дО в промивних рідинах піхви. У деяких дослідженнях, комбінація композиції вакцини МРІ тм або з 1/-12, або з (ав)
СМ-С5Е, приводила до титрів, які були схожі з тими, які продукувалися мишами, імунізованими СЕАЛЕА, або «Е будь-якими з композицій СЕ МРІ тм з або без цитокіну. Це спостереження показує, що форма СЕ МРІ тм не обов'язкова для високих титрів антисироватки, специфічної для пептиду ВІЛ. Додавання ОМ-СЗЕ в СЕ носій ісе)
Зз5 приводило до збільшення пептид-специфічних титрів в порівнянні з мишами, імунізованими тільки СЕ або СЕ і че
І/-12. Звичайно, однак, індукція високих титрів антитіл Їд052а і І(д0205 залежала від композиції пептиду з СЕ МРІ тм і ЗМ-С5Р. Цікаво помітити, що ця композиція індукували титри дос, які були сходні з титрами, індукованими шляхом імунізації іншими композиціями, такими як СЕАЛРЕА і пептид. Комбінацію СЕ МРІ тм з (ЗМ-СЗЕ і пептидом « складали тільки для демонстрації індукції як високих титрів антитіл, що нейтралізуються, так і СТІ. (див. експеримент 8). Включення 1І-12 разом з СЕ МРІ тм і пептидом, також індукувало сприятливий профіль імунної лей с відповіді. Результати показали, що співкомпозиція СЕ МРІ тм і цитокінів СМ-С5Е або 1-12 давала якісну ч відмінність в гуморальній відповіді в порівнянні з імунізацією СЕА і ІРА. Ця відмінність, як вважають, я відноситься до підвищених рівнів Ідо2а і ІдДО26.
У другому експерименті використали протоколи першого експерименту з ВаїЇр/с-пептид ВІЛ, але з невеликими змінами. МРІ тм також вводили у водній формі з або без цитокіну. і Імунізація мишей ВаЇр/с пептидом ВІЛ ТІЗРІОММ(А)Х-Сувз) без адюванта не індукувала істотних титрів
Ф антитіл. Навпаки, склад пептидного антигена з різноманітними композиціями ад'ювант/цитокін приводив до індукції високих титрів антитіл після другої імунізації. - Імунізація пептидом і 1//-12, або тільки СЕ приводила до титрів, які були невідмітні від титрів, о 250 індукованих композицією без ад'юванта (таблиця 7). Реципієнти пептидної співкомпозиції з СМ-С5Е мали обмежені збільшення титрів. У порівнянні з реципієнтами, що отримували вакцину, що містить СЕАЛЕА, ії; мікрозріджена СЕ МРІтм демонструвала схожі пептид-специфічні титри. У порівнянні з реципієнтами, що отримували вакцину СЕАЛЕА, СЕ МРІ тм індукувала високі рівні пептид-специфічного ІдОС2а. Підходи, що використовуються при імунізації можуть впливати на титри антитіл, що спостерігаються. Однак, імунізація мишей 29 Мрітм (водний) включеним в композицію з пептидом, індукувала високі титри пептид-специфічних антитіл.
ГФ) Додавання ОМ-С5Е або 1І-12 в ці композиції приводило до збільшення титрів більше ніж 10 6. Таким чином,
ГФ комбінація пептиду ВІЛ з МРІ тм і цитокінами, ІЇ/-12 або СМ-С5БЕ, індукувала високі титри антитіл, специфічних для пептиду. во Тільки групи мишей, імунізовані пептидом і або МРІ , або 1-12, або МРІ тм і ЗМ-С5Е, розвивали відносно високі титри антитіл, що виявляються в рідинах, отриманих з промивної рідини піхви (таблиця 8). Дійсно, тільки та група мишей, яка була імунізована МРІ тм і Ії -12 з пептидом, продукувала пептид-специфічний ІдА.
Проліферативну здатність клітин селезінки в культурі у відповідь на іп мійго стимуляцію пептидом визначали шляхом введення тимідину. Дані в таблиці У представлені таким способом, щоб нормувати 65 проліферацію, стандартизувати по відношенню до максимальної проліферації, отриманої при стимуляції СопА.
Клітини селезінки мишей, імунізованих СЕ МРІ тм разом або з СМ-С5РЕ, або з ІІ -12, а також мишей, імунізованих тільки ЗМ-СЗЕ, демонстрували низькі рівні пептид-асоційованої проліферації. Навпаки, клітини селезінки мишей, імунізованих пептидом в комбінації з МРІ тм ії ЗМ-С5Е, демонстрували значну проліферацію.
Також вимірювали продукцію цитокіну культивованими іп міго клітинами селезінки. Для ІІ -4, тільки миші, імунізовані СЕ МРІ тм в комбінації з ЗМ-СЗЕ і ТІЗРІОММ(АХ-Суз), секретували високі рівні ІІ-4 у відповідь на стимуляцію пептидом (таблиця 10). Для гамма-інтерферону, миші, імунізовані СЕ МРІ тм і або зМ-СЗЕ, або
І/-12, або водним МРІтм з ЗМ-С5Е або з 1-12, продукували рівні, що легко виявляються цього цитокіну в супернатанті культури (таблиця 11).
Таким чином, комбінація цитокінів (3М-СЗЕ або І/-12 з МРІ тм або СЕ МРІ тм індукувала високі титри 70 антитіл, специфічних для пептидного антигена. Титри були подібні тим, які індукувалися при імунізації мишей пептидом і СЕАЛЕА. Дані показують, що ці комбінації також індукували самі високі проліферативні відповіді в клітинах селезінки в культурі і стимулювали популяції клітин селезінки, які секретували самі високі рівні гамма-інтерферону у відповідь на стимуляцію пептидом.
Результати цього другого експерименту показують, що співкомпозиції ТІЗРІОМІЩА)Х-Суз) з МРІ м і 72 цитокінами ОМ-С5БЕ або ІІ -12 індукують профіль імунної відповіді, подібний викликаному у мишей, імунізованих пептидом і СЕА і повторно імунізованих пептидом і ІРА або перевершуючий його.
Гістологічна оцінка (не показана) місця введення через два тижня після другої імунізації показала, що миші, імунізовані мікрозрідкеним СЕ МРІ м, не розвивали або не підтримували інфільтрацію мононуклеарних клітин в дермі шкіри. Забарвлені гематоксиліном/еозином тканини були такими ж, як отримані у реципієнтів без адююванта. Навпаки, миші ВаїБ/с, імунізовані СЕРА ії ІРА як ад'юванти (емульсія "вода в маслі"), мали значне скупчення мононуклеарних клітин в цій області. Реципієнти СЕ МРІ тм з СМ-С5Е і пептидом показували помітне, але мінімальне збільшення мононуклеарних клітин в порівнянні з реципієнтами СЕ МРІ тм без ЗМ-С5Р. Тканини мишей, імунізованих тільки (з3М-СЗЕ і пептидом, не досліджувалися.
Протоколи другого експерименту використали в третьому експерименті з мишами Зм/ізв-УУервіег, що с 29 використовуються замість мишей Ваїр/с. Миші Зм/ізв-МУервіег використовувалися для визначення ефектів Ге) ад'ювантов з пептидним антигеном ВІЛ, де МНО-пов'язаний Т-хелперний епітоп не впливав на імунну відповідь.
Миші Зм/ізз-УМУервіег являють собою аутбридінговий штам мишей; і, отже, ніяких клітинних досліджень не проводили. У цьому експерименті вимірювали тільки реципрокні кінцеві точки титрування антитіл їдДО проти пептиду ВІЛ і кінцеві точки титрування антитіл дос і ІДА з промивної рідини піхви. Як видно з таблиці 12 і ї-оі 13, профіль відповіді був таким, що його можна зіставити з виміряним в першому і другому експериментіу мишей «3
Ваїр/с.
У четвертому експерименті використовувалися протоколи другого експерименту з невеликими змінами і т використовувалися миші Ваїр/с. Як показано в таблиці 14, ад'ювантні композиції МРІ тм разом з або З3М-СЗЕ,або со
І--12, викликали значно більш високі відповіді Ід (ЗМТ, чим один МРІ м, Як показано в таблиці 15, ад'ювантна | ! ! 2, | ! М і - композиція СЕ МРІ тм разом з ЗМ-СЗ5Е, викликала істотну відповідь підкласу ІдДО2Б5. Ад'ювантні композиції МРІ тм разом або з (3М-С5Е, або з ІІ-12, викликали помітно більш високі відповіді підкласу ІдДС2а, чим один МРІ м, в той час як композиції СЕ МРІ тм разом або з (3ЗМ-СЗЕ, або з 1-12, викликали більш високі відповіді підкласу
Ідо2а, ніж один МРІ мм, Як показано в таблиці 16, ад'ювантні композиції МРІ тм разом або з (3М-С5Е, або з 1ЇІ -12, « викликали помітно більш високі титри Ідс у вагінальній промивній рідині, ніж один МРІ тм. Нарешті, як показано й с на Фіг.4, ад'ювантні композиції МРіІ тм разом або з СМ-С5БЕ, або з ІІ -12, також як і композиції СЕ МРІ тм разом и або з ОМ-С5Е, або з 1-12, демонстрували більш активну проліферацію клітин селезінки, чим один МРі тм або и? й . одним СЕ МРІ м, відповідно.
У п'ятому експерименті використовувалися протоколи другого експерименту з невеликими змінами і використовувалися миші Ваїр/с; І/-12 не входив в композиції ад'юванта. Як показано в таблиці 17, композиції - ад'юванта, що містять як МРІ тпм, так і (ЗМ-С5ЗЕ, викликали помітно більш високі відповіді Ідс2а і 9026, чим
Ге» один МРІ м, Крім того, композиції ад'юванта, що містять як МРІ тм, так і СМ-С5Е, викликали помітно більш високі відповіді для всіх підкласів Ід, чим один МРІ м, е У шостому експерименті використовувалися протоколи другого експерименту з невеликими змінами і ав | 20 використовувалися миші Ваїр/с; ІІ -12 не входив в композиції ад'юванта. Пептид ВІЛ являв собою 40 амінокислот через присутність цистеїну в позиції 17 амінокислоти. Як показано в таблиці 18, ад'ювантні композиції, що щи містять як СЕ МРІ тм, так і ЗМ-С5Е, викликали значно більш високі відповіді всіх підкласів (ДО, чим один МРІ м, і помітно більш високі відповіді всіх підкласів, чим один СЕ МРІ мм,
У сьомому експерименті використовувалися протоколи шостого експерименту з невеликими змінами і використовувалися миші Ваїр/с; ІЇ/-12 не входив в композиції ад'юванта. Як показане в таблиці 19, ад'ювантні
ГФ) композиції, що містять як СЕ МРІ тм, так і ЗМ-С5Е, викликали помітно більш високі відповіді для всіх
ГІ підкласів (ДО, чим один СЕ МРІ м, і композиції ад'юванта, що містять як МРІ тпм, так і ЗМ-С5Е, викликали помітно більш високі відповіді для всіх підкласів (дО, чим один МРІ м, 60 У восьмому експерименті для вимірювання імунітету, опосередкованого функціональними клітинами, оцінювали здатність клітин селезінки мишей, імунізованих СЕ МРІ тм або СЕ МРІ тм плюс ЗМ-С5Е, включеним в композицію з мультіепітопним пептидом ТІЗРІОММ(АХ Суз), генерувати відповіді НІМую-специфічних СТІ.
Як показано на малюнку 5, клітини селезінки мишей, імунізованих СЕ МРІ тм або СЕ МРІ тм плюс (ЗМ-С5Е, демонстрували низьку активність відносно клітин-мішеней, які були або немічені, або імпульсно-мічені, з 65 епітопом ІВ СТІ. Клітини селезінки мишей, імунізованих ТІЗРІОММ(АХ «Сувз), включеним в композицію СЕ МР тм і з ОМ-С5Е, разом індукували високу активність НіІМую-специфічних СТІ опісля одиничної імунізації.
НіІМмк-специфічний СТІ -опосередкований лізис клітин-мішеней був помітно збільшений при вимірюванні через сім днів після повторної імунізації (на Фіг.5). В окремих експериментах, миші, імунізовані без ад'юванта, не стимулювали відповіді СТІ. Миші, імунізовані водним МРІ тм і пептидом, генерували низькі («3090) відповіді пептид-специфічних СТІ.
Єдиною трудністю в оцінці потенційної ефективності імуногенних композицій проти ВІЛ, було те, що примати (не люди), інфіковані ВІЛ, не розвивали СНІД-подібних симптомів. Таким чином, можлива модель тварини не відтворює симптоматику людини, викликану ВІЛ. На щастя, примати (не люди), інфіковані вірусом імунодефіциту мавпи (ВІМ), близько родинним ВІЛ, дійсно можуть розвивати СНІД-подібні симптоми. 70 Це дозволяє антигенам ВІМ бути оціненим у приматів (не людей). Антиген ВІМ може бути білком, поліпептидом, пептидом або фрагментом, отриманим з вказаного білка. Білок може бути глікопротеїном, таким як ар41, др120 або др160. Альтернативно, білок може бути білком, що кодується такими генами, як дад, рої, мії, гем, мрг, їаїй пеї або епу. Пептиди, отримані з таких білків, містять, принаймні, одну антигенну детермінанту (епітоп) довжиною, принаймні, шість амінокислот.
Аналогічно з ВІЛ, у приматів (не людей) використовується мультіепітопні пептиди ВІМ. Вивчення проводилося для оцінки можливості викликати відповідь СТІ різними пептидами в поєднанні з СЕ МРІ тм і ЗМ-С5Р. Резус макаки були підшкірно імунізовані на 0, 4, 8 і 18 тижні СЕ МРІ тм ії ЗМ-С5Е, разом з будь-яким з наступних трьох пептидів (див. таблицю 20): (1) Кожний пептид містив наступний епітоп СТІ. в контексті Мапи А"О1:
Суз Тк Рго Туг Азр Пе Азп Сп Меф(5ЕО І МО:3) (рар) (38,39) 5ег ТП Рго Рго ГІ.еи Маї! Аге Геи Ма! (5ЕО ІЮ МО:4) (рої) (40) с ; .
Туг Аа Рго Рго Пе бег С1у Сп Пе (5ЕО ІЮ МО:5) (епу) (40) о (2) Альтернативно, кожний з цих трьох пептидів був пов'язаний зі змішаним епітопом Т-хелпера, що має наступну послідовність: «со зо Сп Мем Туг бух Туг Гуз Ма! Уа! Гуз Пе Си Рго Гей Сіу Ма! Аа Рто ТНг Гу о
Аа (5ЕО ІЮ МО:6) (пристосований з 41). -
Таким чином, ці три пептиди мали наступні послідовності: со бій Геи Туг суз Тут був Ма! Ма! Гуз Пе Сім Рго Ген Сіу Ма! АїЇа Рго Тік Гуз ї-
Аа Суз Тк Рго Тут Авр Пе Азп Сіп Ме (5ЕО І МО: 7) « ю Січ Ге Туг Гуз Туг Гуз Ма! Ма! був Це См Рго ЇГеч СЛу Уа! Аа Рго Тіг Гу З с Аа бег Тнг Рго Рго І еи Уаї Аго І.еи Ма! (5ЕО ІР МО: 8) . » п
ОСїш без Туг Муз Тут був Ма! Ма! Гуз Пе Сім Рго Ге Сіу МУаії Аа Рго Тік Гуз «1.7 Аа Туг Аа Рго Рго Пе Зег СІу Сіп Пе (5ЕО ІЮ МО:9) б Гепаринізовану кров збирали кожні два тижні, і мононуклеарні клітини периферичної крові аналізували на
СТІ за допомогою тесту з вивільненням Ст, тетрамерного фарбування свіжих мононуклеарних клітин о периферичної крові (РВМС) і тетрамерного фарбування культивованих РВМС. Тетрамерне фарбування свіжого ав | 20 РВМСі цитолітичний лізис, визначений вивільненням з1Ст, не виявляли ніякої активності. Однак, імунізація резус макаки в контексті Мати А"01 ТН/СТІ. пептидними коктейлями включеними в композицію з СЕ МРІ м і 42) : .
ОМ-С5Е, приводила до виявлення тетрамер-позитивних СО8- Т-клітин. Результати, представлені в таблицях 21-24, показують, що процент позитивних, тетрамер-позитивних СО8-- (таблиці 21-23) або СО4-- (таблиця 24)
Т-клітин виявляється у РВМС, культивованих з відповідним пептидом протягом 11 днів. 59 Загалом, всі чотири Мати А" 01 позитивних тварин, імунізованих або епітопами СТІ (КА 55, КА 142), або без
ГФ) епітопів ТА (КА 13, КА 80), демонстрували СО8-- тетрамер-позитивні клітини, специфічні для або дад, рої, або епу. Як очікувалося, ніяких тетрамер-позитивних СОВ8 клітин не було виявлено у Мати А"01 негативних тварин іме) с, х. о, . : й ій - (КА 41, Кп47). Імунні відповіді, специфічні дад і епм ВІМ, спостерігали після праймування, в той час як рої! специфічну тетрамер-позитивність спостерігали після повторної імунізації. Оскільки заключна повторно 60 імунізуюча доза, що вводиться на 18 тижні, не давала подальшого підвищення відповіді, дані в таблицях 21-24 після 14 тижня не представлені.
У результаті, імунізація резус макак в контексті Мати А"01 пептидними коктейлями, що містять ТП/ВІМ дад, рої! і епм СТІ -епітопи, включеними в композицію з СЕ МРІ тм і лодським М-С5Е, викликала клітинні відповіді, в як було показано за допомогою чутливого і тетрамерним аналізом.
Білок порин В Меїіззегпіа допогтпоеає, також відомий як РІВ білок, був рекомбінантно експресований (42,
приведений тут як посилання) і є кандидатом на роль антигена для профілактики або лікування інфекцій, викликаних Меїззегіа допогтпоеаеє.
Проводили ряд досліджень для порівняння МРІ тм (або з, або без СЕ) плюс ЗМ-С5Е або 1І-12, з одиночним
МР м (або з, або без СЕ), разом з модифікованою формою білка порина В Меїіззегіа допогтпоеа, в якому 16 амінокислот на М-кінці є фаговими, а потім зрілою формою білка порина В. Короткий виклад результатів представлений далі.
У першому експерименті мишей Зм/ізз-М/ервіег підшкірно імунізували в сідничну область рекомбінантним білком порином В, що генерує титри антиген-специфічних антитіл, демонструючи, що білок порин В є 70 життєздатним кандидатом на роль антигена. Додавання ЗМ-С5Е в МРІ тм і білка порина В приводило до підвищення сироваткових титрів антитіл до і Ід02, в порівнянні з реципієнтами МРІ тм і білка порина В (див.
Таблиці 25 і 26).
У другому експерименті мишей Зм/ізз-М/ерзіег підшкірно імунізували в сідничну область білком порином В плюс 1-12 і МРІ тм або СЕ МРІ м, що викликало більш високі титри антиген-специфічних антитіл (особливо Ідс) в порівнянні з реципієнтами білка порина В плюс МРІ тм або СЕ МРІ м. Більш високі титри спостерігали після обох, як первинної, так і повторної імунізації. Введення в композицію ІЇ/-12 приводило до приблизно десятиразового збільшення титрів Ід, виміряних у вагінальній промивній рідині (див. таблиця 27).
Очищений нативний білок злиття (Р) людського респіраторного синцитіального вірусу (КЗМ) в нативній димерній формі є кандидатом на роль антигена для профілактики інфекцій, викликаних КЗМ (43, включений сюди як посилання).
Проводили ряд досліджень для порівняння МРІ. тм (або з, або без СЕ) плюс ОМ-С5Е або 1І-12, з кожним з
МРІ тм (або з або без СЕ), фосфатом алюмінію або Біітціоптм С)5-21 по окремості, разом з очищеним нативним
Е-білком КЗМ. Короткий опис результатів представлений далі.
У першому експерименті миші Ваїр/с, внутрішньом'язово імунізовані нативним К5М Р-білком, генерували с 22 титри антиген-специфічних антитіл, демонструючи, що Е-білок є життєздатним кандидатом на роль антигена. Го)
Додавання ЗМ-С5Е в МРІ тм індукувало підвищення кінцевих точок титрування, в порівнянні з відповіддю на
Е-білок одного МРІ тм, після як первинної, так і повторної імунізації (див. таблицю 28), а також спричинило посилення клітинної відповіді на іп міго стимуляцію клітин селезінки в порівнянні з одним МРІ. пм (див. таблицю с 20 29). Додавання ЗМ-С5Е в СЕ МРІ тм приводило до посилення первинної дО відповіді на Е-білок, в порівнянні з одним СЕ МРІ тм (див. таблицю 28). о
У другому експерименті використали протокол першого експерименту. Додавання ОМ-С5Е в МРІ тпм «Е індукувало більш високі кінцеві точки титрування, чим у випадку єдиного МРІ тм, у відповідь на Е-білок після як первинної, так і повторної імунізації (див. таблицю 30). Додавання ЗМ-С5ЗЕ до СЕ МРІ тм також спричинило о
Збільшення кінцевих точок титрування, в порівнянні з одним СЕ МРІ тм, у відповідь на Е-білок після первинної /-|ч« імунізації (див. Таблицю 30). Додавання ЗМ-С5Е в композиції Е-білка плюс МРІ тм або СЕ МРІ м, викликало більш високий процент К5М-специфічної СТІ. активності селезінки, чим викликане композиціями у відсутність
СМ-С5РЕ, як показано на клітинах селезінки імунізованих мишей (див. таблицю 31). «
У третьому експерименті ЗМ-С5Е замінювали на 1І-12. Співкомпозиція 1-12 з МРІ тм викликала більш високі титри до після первинної імунізації, в порівнянні з введенням Е-білка тільки з МРІ тм (див. таблицю 32). Однак З с додавання 1-12 до МРІ тм або СЕ МРІ тм не мало ніякого ефекту на К5М-специфічну активність СТІ, виміряну з» після іп міго стимуляції ефекторних клітин (див. таблицю 33).
Одне з досліджень проводилося для порівняння МРІ. тм (або з, або без СЕ) плюс ЗМ-С5Е і окремого МРІ тм (або з, або без СЕ), разом з білком МР (нуклеокапсидний білок) вірусу грипу. Були недостатні кількості МР для проведення експерименту по вимірюванню титрів антитіл. Мишей, імунізованих МР пептидом разом або без 7 ад'ювантів, аналізували на відповіді клітин селезінки при стимуляції антигеном на 14 день після остаточної
Ге) імунізації. Введення (ЗМ-СЗЕ в композиції, що містять МРІ тм або СЕ МРІ тм приводило до помітного скорочення
СТІ активності (дані не показані). е Незрозуміло, чому був отриманий цей аномальний результат. Можливо, були технічні проблеми при (ав) 50 проведенні аналізу.
Ф Антигенні композиції по даному винаходу модулюють імунну відповідь, поліпшуючи гуморальну відповідь і клітинний імунітет хребетного господаря після введення антигенної композиції, що включає вибраний антиген патогенного вірусу, гриба, бактерії або паразита, і ефективну кількість ад'юванта МР тм (у водній або в формі стабільної емульсії), комбінована з цитокіном або лімфокіном, зокрема, ЗМ-С5Е або 1І-12. Інші цитокіни або лімфокіни, як було показано, мають імуномодулюючу активність, включаючи, але ними не обмежуючись,
ГФ) інтерлейкіни 1-альфа, 1-бета, 2, 4, 5,6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 і 18, інтерферони альфа, бета і гамма, з гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор і фактор некрозу пухлини альфа і бета.
Агоністи або антагоністи вказаних цитокінів або лімфокінів також знаходяться в межах даного винаходу. Як во використовується тут, "агоніст" означає молекулу, яка посилює активність або функціонує таким же чином, як вказані цитокіни або лімфокіни. Прикладом такого агоніста є міметик вказаних цитокінів або лімфокінів. Як використовується тут, термін "антагоніст" означає молекулу, яка інгібує або перешкоджає активності вказаних цитокінів або лімфокінів. Прикладами таких антагоністів є розчинний рецептор ІІ -4 і розчинний рецептор ТЕ.
Як використовується тут, термін "ефективна кількість ад'юванта" означає дозу комбінації ад'ювантів, описаних тут, які є відповідними для збільшення імунної відповіді у хребетних тварин. Індивідуальна доза б5 залежить зокрема, від віку, маси і медичного стану господаря а також способу введення і антигена. У переважному втіленні, ад'ювантні комбінації МРіІ тм використовуються в області від 1-10Омкг/доза. Відповідні дози можуть бути легко визначені фахівцями в даній області. Антигенні композиції по даному винаходу можуть також бути змішані з імунологічно прийнятними розріджувачами або носіями звичайними способами для отримання рідкого розчину для введення або суспензій.
Антигенні композиції по даному винаходу вводяться людині або іншому хребетному різними шляхами, що включають, але ними що не обмежуються, інтраназальний, пероральний, вагінальний, ректальний, парентеральний, шкіряний, крізьшкірний |див., наприклад міжнародну публікацію УМО 98/20734 (44)), (яка включена тут як посилання), внутрішньом'язовий, внутрішньочеревний, підшкірний, внутрішньовенний і 7/0 Ввнутрішньоартеріальний. Кількість антигенного компонента або компонентів антигенної композиції залежить зокрема, від індивідуального антигена, а також від віку, маси і медичного стану господаря, а також від способу введення. І знов, відповідні дози можуть бути легко визначені фахівцями в даній області. Переважно, хоч не обов'язково, антиген і комбінацію ад'ювантів вводять в один і той самий час. Число доз і режим дозування антигенної композиції також може бути легко визначені фахівцями в даній області. У деяких випадках, /5 властивості ад'юванта в ад'ювантній комбінації можуть зменшувати число необхідних доз або час курсу режиму дозування.
Комбінації ад'ювантів по даному винаходу є відповідними для використання антигенних композицій, що містять широку різноманітність антигенів з широкого кола патогенних мікроорганізмів, включаючи, але ними не обмежуючись, віруси, бактерії, гриби або паразитні мікроорганізми, які інфікують людей і інших хребетних, або 2о антигени ракових клітин або пухлинних клітин. Антигени можуть включати пептиди або поліпептиди, отримані з білків, а також фрагментів, будь--ого з перерахованих: сахариди, білки, полі- або олігонуклеотиди, ракові клітини або пухлинні клітини, алергени, амилоїдний пептидний білок або інші макромолекулярні компоненти. У деяких випадках, в антигенну композицію може бути включено більше ніж один антиген.
Бажані вірусні вакцини, що містять композиції ад'юванта по даному винаходу, являють собою такі вакцини, с
Які спрямовані на запобігання або/і лікування захворювання, викликаного, але ними не обмежуючись, вірусом імунодефіциту людини, вірусом імунодефіциту мавп, респіраторним синцитіальним вірусом, вірусом парагрипу о типів 1-3, вірусом грипу, вірусом простого герпеса, людським цитомегаловірусом, вірусом гепатиту А, вірусом гепатиту В, вірусом гепатиту С, вірусом людської папіломи, поліовірусом, ротавірусом, каліковірусомами, вірусом кору, вірусом свинки, вірусом краснухи, аденовірусом, вірусом сказу, вірусом собачої чуми, вірусом «о зо чуми рогатої худоби, коронавірусом, парвовірусом, інфекційним ринотрахеальним вірусом, вірусом лейкемії кішок, вірусом інфекційного перитоніту кішок, вірусом інфекційного бурситу у птахів, вірусом хвороби -
Ньюкасла, вірусом хвороби Марека, вірусом респіраторного і репродуктивного синдрому у свиней, вірусом /«ф кінського артериту і різними енцефалопатичними вірусами.
Бажані бактерійні вакцини, що містять ад'ювантну композицію по даному винаходу, являють собою також о
Зз5 вакцини, які спрямовані на запобігання і/або лікування захворювань, викликаних, але ними не обмежуючись, че
Наеторпйиз Іпйцепгае (як типовий, так і нетиповий), НаеторНпіиз зотпиз, МогахеїІа саїйагтпнаїв,
Зігеріососсивз рпецтопіає, Зігеріососсив руодепе5, Зігеріососсиз ада|асіаеє, Зперіососсив Таесаїів,
Неїїсорасіег руогі, Меівзега тепіпойідів, Меівззегіа допогпіпоеае, СПпіатудіа (гаспотаїйіз, Спіатуаіа рпештопіае, Спіатуадіа рзіцасі, ВогадейфеНйа репизвів, ЗаЇІтопейїМйа (урпі, ЗаІтопеїа (Урпітигішт, ЗаїІтопейа « споЇегаезців, ЕвсПпегіспіа сої, ЗпідеМйа, Мірпіо споіегае, Согуперасіепчт аїірнп(фегіає, Мусобвасіегічт шщ с Імрегсціовії, Мусорасіегішт амішт-Мусобасіегіцт іпігасеПШаге сотріех, Ргоїеив тігарійїв, Ргоїеив уцшідагів, й ебарпуюсоссив ацгеив5, Сіовсгідішт їейапі Іеріозріга іпізвггодапз, Вогтейа Бигддопегі, Равзіешгеїйїа «» Наетоїуїіса, Разіешгейа тийосіда, Асііпорасзіїиз ріеигорпетопіае і Мусоріазта даїзеріісит.
Бажані вакцини проти грибкових патогенів, що містять ад'ювантну композицію по даному винаходу, являють собою такі вакцини, які спрямовані на запобігання і/або лікування захворювань, викликаних, але ними не -і обмежуючись, АзрегаїїІв, Віазіотусез, Сапаїда, Соссідіодев, Стуріососсиз і Нізіоріазта.
Бажані вакцини проти паразитів, утримуючі ад'ювантну композицію по даному винаходу, являють собою такі б вакцини, які спрямовані на запобігання і/або лікування захворювань, викликаних, але ними не обмежуючись, ї» І еевптапіа тайог, Авсагів, Тгіспигів, Сіагаіа, Зспівіозота, Стгуріозрогідійт, Тгіспотопавз, Тохоріазта допаії і Рпеитосузівв сагіпії. о Бажані вакцини, що викликають терапевтичну або профілактичну протиракову активність у хребетного
Ф господаря, які містять комбінації адюванта по даному винаходу, включають використання таких ракових антигенів або пухлинно-асоційованих антигенів, які включають, але ними не обмежуються, специфічний антиген простати, карцино-ембріональний антиген, МОС-1, Нег2, СА-125 і МАСЕ-3.
Бажані вакцини для зменшення відповідей на алергени у хребетного господаря, які містять комбінації ад'юванта по даному винаходу, включають ці алергени або їх фрагмент. Приклади таких алергенів |описані в іФ) патенті США Мо5830877 (45) і опублікованій міжнародній патентній заявці МО 99/51259 (46)), які включені тут як ко посилання, і включають пилок, отрути комах, тваринну лупу, спори грибів і ліків (такі як, пеніцилін). Вакцини перешкоджають виробництву антитіл ІЧЕ, які, як відомо, викликають алергічні реакції. во Бажані вакцини для запобігання або лікування хвороби, що характеризується відкладенням амилоїда у хребетного господаря, які містять комбінації ад'юванта по винаходу, включають композиції, що містять дози цього амилоїдного пептидного білка (АРР). Дана хвороба згадується під різними назвами наприклад, хвороба
Альцгеймера, амилоїдоз або амилоїдна хвороба. В-Амилоїдний пептид (також відомий як пептид АВ) являє собою 42 амінокислотних фрагмента АРР, які утворюються при процессінгу АРР В і у секреторних ферментів, і б5 має наступну послідовність:
АврАа СП Рбе Аве Ніз-Авр ЗБг СТУ ТУ бій Уві нії Нів Сіп Гув рей ува! РН ; Ве Ай Сію Авр Ма! СПу.бег Ака Ту СТУ. Аа Те Не Оіу Тева Меє і Оу Су
Уа Уа пе Аа 5БОО МО), 70 шт шо ня о. Я-- Я
У деяких пацієнтів відкладення амилоїда приймає форму агрегованого пептида АВ. Несподівано, в цей час виявлено, що введення виділеного пептида АВ стимулює імунну відповідь проти пептидного компонента АВ відкладення амилоїда хребетного господаря |47|Ї. Таким чином, вакцини по даному винаходу включають комбінації ад'юванта по даному винаходу разом з пептидом АВ, а також фрагменти пептида АВ і антитіла до 75 пептиду АВ або його фрагментам. Один такий фрагмент пептида АВ являє собою 28-амінокислотний пептид, що має. наступну послідовність (481:
Дер дід Са Рре:Ате, Ні Авв вес Спу тує Сів. Уві.Нів Нів біл був Сер уві РЕ х ВВЕ Аа Аер'Уві СПу'бег Ав ув (ЗБОТО МОУ.
У випадку ВІЛ і ВІМ антигенні композиції включають, щонайменше, один білок, поліпептид, пептид або фрагмент, отриманий з вказаного білка. У деяких випадках, різноманітних ВІЛ або ВІМ білки, поліпептиди, пептиди і/або фрагменти включені в антигенну композицію.
Комбінації ад'ювантних композицій по даному винаходу також є відповідними для введення як ад'ювант в сем полінуклеотидні вакцини (також відомі як ДНК-вакцини). Такі вакцини можуть, крім того, включати полегшуючі о засоби, такі як бупивикаїн див. патент США Мо5593972 (49)), який включений сюди як посилання).
Для того щоб краще зрозуміти даний винахід, пропонуються наступні приклади. Приклади приведені тільки з метою ілюстрації і не повинні розглядатися як обмеження можливостей винаходу.
Приклади (се)
Експеримент 1 о
Імунізація мишей Ваїр/с пептидом ВІЛ і різними ад'ювантами
Приклад 1 «І
Матеріали і Методи с
Тварини
Самиці мишей Ваїр/с, у віці 7-9 тижнів, були куплені у Тасопіс Багтв, Іпс. (Сегтапіомуп, МУ). Всі миші їч- були взяті при схваленні Атегісап Авзосіайоп їог Ассгеді(айоп ої І арогаїогу Апіта! Саге. Миші поступово акліматизувалися на новому місці протягом одного тижня до початку досліджень.
Пептиди «
Послідовність пептиду ТІЗРІОММА)Х-Сувз) з мультіепітопом НІМ-1-уу являє собою: З с 70 Гуз Сіп Пе Пе Азп Меї Ттр Сіп Сію Маї С1у Гуз АІа Меї Туг Аа Тік Аге Рго. з» Авп Туг Авп Гуз Аге Гуз Аге Пе Ні Пе СІу Рго Сіу Аге Аа Ріє Тут ТНг Тег
Гуз (6ЕО ІЮ МО: 2). -І Цей пептид був заздалегідь описаний (28,29) і містить послідовності ВІЛ-1 ор120ум, які викликають
Ф відповіді СО4"ТА клітин, як у людей, так і у мишей, головний нейтралізуючий детермінант і сайт впізнавання
СО8 сті у мишей ВаїБ/с. Пептид був наданий Ог. В. Зсеагсе (ЮОике Опімегейу, Оигпат, МС). Для аналізу СТІ, т» пептиди, відповідні епітопу - о СТІ, в УЗ петлі НІМУ-1-мм (Агр, СОІУ Рго Су Аге Аа Ріє Уаї Тіт Пе (5ЕО ІЮ 4) а .
МО: 12), Н-20 рестрикція) або НІМ-1-мю Ше СпПу Рго Сіу Аге Аа Ре Туг ТНг й ря Тш (5БО І МО:13), Н-20 о рестрикція), були куплені у Сепозуз Віоїесппоіодієз Іпс. (Те Ууоодіапаз, ТХ). Перед використанням пептиди були солюбілізовані в стерилізованій воді і розбавлені у відповідних буферах або поживному середовищі для ко клітин.
Ад'юванти 60 Всі препарати, що містять ад'ювант МРІ тм, були отримані від Кірі ІттипоСНпет Кезеагсй, Іпс. (Натіоп,
МТ). МРІ м готували у вигляді водної композиції з використанням триетаноламіну (бЗідта, 51. І оців, МО). Після солюбілізації МРІтм руйнували ультразвуком згідно з інструкціями виробника з отриманням опалесцуючого/прозорого розчину, який стерильно відфільтровували. СЕ МРІ тм являв собою заздалегідь приготовану на основі сквалену емульсію "масло у воді" (масло 1-295), що мала концентрацію МРІ тм в межах бо від 0-2500мкг/мл. Фосфат алюмінію отримували на місці. Повний ад'ювант Фройнда (СЕА) і неповний ад'ювант
(ІРА) були куплені у Оіїсо І арогайогіез, ЮОейгоїї, МІ. Пептиди ТІЗРІОММА) і ад'юванти Фройнда емульгували у відношенні 1:11, використовуючи два пов'язаних шприци. Експресований рекомбінантний мишачий 1-12 був наданий Сепеїйісвз Іпвзійше (Сатрбгідде, МА). Рекомбінантний мишачий ЗМ-СЗЕ був отриманий від Іттипех (Зеаше, МА), наданий КУО Зузіетвз (Міппеароїїз, ММ) або був куплений у Віозоигсе Іпіегпайопа! (Сатапгіо,
СА) у вигляді ліофілізованого порошку без носія.
Імунізація
Мишей підшкірно імунізували в сідничну область в повному об'ємі О,2мл, еквівалентно розділеним на кожну сторону відносно хвоста. Імунізації проводили з різними часовими інтервалами, як визначено нижче. Антигени і 7/0 цитокіни розбавляли фосфатним сольовим буфером до відповідних концентрацій і змішували з ад'ювантами менше ніж за 16 годин до імунізації, в стерильних умовах. Вакцини змішували при слабкому перемішуванні і зберігали при 42С. Композиції змішувалися на вортексі безпосередньо перед імунізацією.
Отримання зразків
У тварин забирали кров до початку імунізації і вказаних часових точках. Сироватку від окремої миші 7/5 аналізували і об'єднували у мишей в межах груп. Для оцінки рівнів антитіл виконували вагінальну промивну рідину на мертвих мишах. Він виконувався шляхом вливання 75:11 КРМІ-1О в звід піхви самиць мишей, використовуючи 200:1 піпетку. Звід промивали повторним вливанням і видаленням рідини, яку потім додавали в 10:1 ЕВ5. Аналізували об'єднану вагінальну промивну рідину.
Препарати клітин
Для аналізу проліферації і аналізу цитокінів іп міго отримували клітини селезінки мишей в певні часові точки. При об'єднанні 3-5 мишей отримували одиничну клітинну суспензію, вказану в результатах. Для аналізу проліферації і цитокінів, клітини суспендували в круглодонних 96 лункових плашках, заздалегідь покритих протягом ночі антигенами пептиду ВІЛ, контрольними білками або тільки КРМІ-10. Клітини селезінки додавали в
Бх105клітин/лунка, використовуючи культуральне середовище з 2-ма добавками. Супернатанти клітинної с
Культури збирали з трьох лунок для аналізу цитокінів через три або шість днів після введення культури. о
Негайно після отримання супернатанту, культури імпульсно мітили ЗН-тимідином протягом 18-24 годин і збирали для визначення кількості клітинної проліферації.
Ферментний імуносорбентний аналіз (ЕГ ІЗА)
Для аналізу пептидспецифічного ВІЛ антитіла і розподілу підкласу, пептид суспендували або в карбонатному «( буфері (15мМ Ма»СОз, З5мМ Мансо»з, рНеО,б) або в РВ5 в концентрації тмкг/мл і вміщували на 96 лункові о плашки мікропіпеткою (Мипс) в об'ємі 100:1. Після інкубації протягом ночі при 372С, чашки промивали і блокували (0,196 желатин/РВ5) при кімнатній температурі протягом 2-4 годин. Перед додаванням послідовно розведеної - сироватки (РВ5, желатин 0,195, 0,0590 ПГлиеептм20, 0,02906 азиду натрію) чашки для аналізу ЕГІЗБА промивали «о буфером (РВ5, 0,195 Тмеептм20). Після інкубації протягом чотирьох годин, лувки промивали і додавали відповідні розведені біотинільовані антіїззотипи/підкласи антитіл для інкубації при 49 протягом ночі. Лунки - промивали і культивували із стрепавідин пов'язаною пероксидазою хрону. Після інкубації, лунки промивали і виявляли АВТ5. Лунки аналізували при 405нм. Титри стандартизували з використанням контрольної сироватки.
Для аналізу цитокіну, супернатант клітинної культури додавали в лунки, покриті ВМО6-11811 (у випадку « анти-І.4) або К4-6А? (у випадку гамма інтерферону). Після інкубації і промивки, лунки досліджували за - 70 допомогою біотин-міченого ВМОб6-24(52 (для І 4) або ХМО 1,2 (для гамма інтерферону). Концентрацію цитокінів с визначали, використовуючи калібрувальну криву, отриману з рекомбінантного мишачого гамма інтерферону або з» інтерлейкіну-4. Всі цитокінові реагенти були отримані від Ріагтіпдеп (Зап Оіедо, СА).
Аналізи нейтралізації НІМ-1Мм
Аналізи нейтралізації проводилися в лабораторії Ог. Тпотаз Майнемуз в університеті биКе. Коротко, кодова сироватка забезпечувала нейтралізацію лабораторного ізольованого вірусу НІМ-1уу (МІН). Аналіз проводили по і суті так само, як описано раніше |25). Стисло, розбавлені сироватки, що тестуються були розділені на
Ге») 9б-лункових титраційних мікроплашках (25:1/лунка). Еквівалентний об'єм послідовно розведеного вірусного матеріалу додавали в кожну лунку. Після інкубації суміш вірус/антитіло додавали до ААБ мічених клітин. е Клітини культивували в 96-лункових титраційних мікроплашках, додаючи через день свіже середовище. Через ав | 20 сім днів після зараження супернатант оцінювали на присутність вірусної зворотної транскриптази для вимірювання вірусної реплікації і успішного зараження або його інгібування. що Приклад 2
Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ТІЗРІОММ)А) дО
Реципрокні кінцеві точки титрування анти-пептид ВІЛ-специфічного (ДО вимірювали в об'єднаній сироватці (п-5 Ваїр/с) в певні часові точки після початкової імунізації. Мишей імунізували підшкірно в сідничну область
ГФ) 25мкг ТІБРІОМІМАХ-Сувз), якщо не визначено інакше, на 0 день і 27 день. У випадку реципієнтів ад'ювантів кю Фройнда, мишей праймували пептидом, емульгованим в СЕА, і повторно імунізували ІБ А. СЕ МРІ тм являє собою емульсію, що містить в дозі 295 масло сквалена і 5Омкг МРІ тм, СЕ являє собою транспортну емульсію "масло в воді", що містить сквален, гліцерин і емульгуючий агент. Рекомбінантний мишачий 1-12 вводився в 60 й й й їй й дозі 5Онг/миша. Рекомбінантний мишачий ЗМ-С5Е вводили з дозі 1Омкг/миша. Результати приводяться в таблиці 1. б5
Таблиця 1
ВРеципрокні кінцеві точки титрування анти-ТІБРІОММ(АЗС-СУВ) ТР
Прикордонні титри
Ад'ювант МКГ ВІЛ | 4 тиждень | б тиждень. | тиждень пептиду її шк 9 (|безад'ювантаї | 25 | «100 | «100 | «100
СЕАЛЕА Ї 25 | 23998 | 137683 | 313200 р-р | 25 | 00 | «юю | «100 з ІБМ-С5Е 25 | 5-00 | 17579 | 12537. 171923 | 76479
МРіНев 3012501 50 | абз: | 79021
МРІЛМСЕНЙ 12 131330 / 631688 700 ДМвілм СЕ ОМУСВЕ 14824 | 10000000 | 3752870
Приклад З
Реципрокні кінцеві точки титрування підкласу анти-ТІЗРІОММА)(-Сув) ДО
Реципрокні кінцеві точки титрування підкласів ТІЗРІОМІЩА)Х-Суз) (90 вимірювали в об'єднаній сироватці с (п-5 Ваїр/с) через шість тижнів після початкової імунізації через два тижні після повторної імунізації. г)
Мишей імунізували підшкірно в сідничну область 25мкг пептидом, якщо не визначено інакше. У випадку реципієнтів ад'ювантів Фройнда, мишей праймували пептидом, емульгованим в повному ад'юванті Фройнда і повторно імунізували неповним ад'ювантом Фройнда на четвертий і шостий тижні. СЕ МРІ тм являє собою емульсію, що містить в дозі 2906 масло сквалену і 5Омкг МРІ тм, СЕ являє собою транспортну емульсію "масло у о воді, що містить сквален, гліцерин і емульгуючий агент. Рекомбінантний мишачий І/-12 вводився в дозі о
Б5онг/миша. Рекомбінантний мишачий ЗМ-С5Е вводили в дозі ТОмкг/миша. Результати приводяться в таблиці 2. ч зл Веципрокні кінцеві точки титрування підкласу анти ГІБРІОММ СУТ о
ГП ЖШрикордоннітитриї 00010111
ГО Адіовант | мкг ВМТ | 180 1 5 120025) 00. 1.95. | «00 | 00 | «00 з 7 ОМВК)... 030.03 625 | 83 | 00 | хо у о БОМ» 26 А... 0.10 0-75 293 «0 | 331 в ПМРІтм(З0)СЕО) | 25 | ША ЇЇ 10176 | 5980 сою ЗМРІИМ(50)СВ УА (9У5)| 25 | 169978| 27161 | 9303.
Приклад 4
Титри антитіл ТІЗРІОМЖА)Х-Смв) до і ІдДА промивной рідини піхви 22 Титри анти-пептидних антитіл Іде і ІдДА вимірювали у вагінальній промивній рідині, отриманій через 2 тижні
Ге! після заключної імунізації. Групу з 5 самиць мишей Ваїр/с імунізували 25мкг ТІЗРІОММАХ-Суз) і позначеними композиціями ад'юванта на 0, 28, і 42 дні. Титри антитіл визначали в об'єднаній вагінальній промивній рідині. де Результати приводяться в таблиці 3. 60 б5
"Таблиця З
Титри антитіот анти ПІЗРЮМНСАХ Сув) 18611 ІВА промивної рідним піхви т ШНемає ад юванта В. Б.1..50..Д16ЮДфю «0
СЕАЛЕА 00000000 001050,
ПІА12(0,05). (50 | 0 я БМВ 71001011 10
МмМРІлмІБОСвОМ) 011110
ІМРІМ (50) СЕ зе хП-12 (20) ЯК НИ,-19 (0,05)
МРІЛМСВ ОМВК ОИОМСВЕ(О) | 195 Го З3 у ю (БОЮ у... 43501 0
Приклад 5
Проліферація клітин селезінки
Вимірювали проліферацію клітин селезінки мишей, імунізованих ТІЗРІОММА)Х-Суз) і різними композиціями с ад'юванта. Групи з п'яти самиць мишей Ваїбр/с імунізували 25мкг ТІЗРІОММ(А) (-Сув) і позначеними ад'ювантами г) на 0 і 28 дні. Клітини селезінки вносили в культуру на 56 день і збирали для вимірювання введеного ЗН-тимідану через 96 годин після цього. Мишей імунізували 5Онг 1-12, 1Омкг ЗМ-С5Е, 5Омкг МРІ тм у вигляді водної суміші або у вигляді стабільної емульсії з 295 СЕ. Дані являють собою дельта срт значення відносно проліферуючих со значень, виміряних у зростаючих клітин в культурі без стимуляції. Фонові сумарні значення стимуляції були «800срт. Результати приведені в таблиці 4. ав)
Таблиця 4 Пропіферація клітин ' селезінки. ч т рити свв нев пр потен нтн-я.. (У ждювант ВІД пептид! ВІЛ невтид ВОрпецтих! Селі |Лівозим-| Середовище: з | ломк/нлоі З мкуми | БІ | міш/ма | 30 | Омжема івд'ювантв --фйх ся 1 інт я 2 сестра не ян. со й-е? 3030/1899 | 869 | 8 | 463 ехо з» МВВ 1 51 | 1976 1 лймю | ов 1-15
Гмримск 146275 | бу5 1 068 1 ЯМИ) 1 41-30
Фо |мМвІлеСвя | Я Зя | З66 со ІСБ у 0 | 3397 | 5396 | ооо | бою |. - о
Ф Приклад 6
Секреція ІІ -4 клітинами селезінки
Вимірювали інтерлейкін-4, секретований в культурі клітин селезінки, стимульованих /25Ммкг
ТІБРІОММ(А)(-Сув). Клітини селезінки збирали з п'яти самиць мишей ВаїЇр/с і культивували з позначеними антигенними стимулами (5Онг 1-12, 1Омкг ЗМ-С5Е, 5Омкг МРІ м, як визначено) протягом або трьох, або шести (Ф, днів. Рівні інтерлейкіну-4 визначали за допомогою ЕЇІЗА і порівнювали зі стандартом, що має відому ка концентрацію. Пусті осередки показували, що аналіз не виявив інтерлейкін-4 при цих умовах культивування.
Нижня межа чутливості, що визначається була 22 одиниці/мл. Результати приведені в таблиці 5. 60 б5
Таблиця 5 Секреція .-4 клітинами селезінки.
Й Триденні культури: 0000 днтивно 70110011
Ад'ювинт ВІЛ | ВЛ ВІЛ | Сов А | Лізозім | Середовище пептид. | пептид (пептид 1,1|./1 30 | Омкгумя "МКг/Мл . й ше 1 ув ЮаД'ЮВЙНТа ісБАЛЕА 173311 1561 1 ш-ш | Її ЇЇ |5:56їЇ ЇЇ смс | | ЇЇ | :"9| |/ » |МРІЛМ СЕ | 297 1 729 | 90 |134 а ія я 51
ШІ що еай а ія НЕ Я НИ НИ сЕ | ЇЇ її 1959 ЇЇ зо Таблиця 5 (продовження) Секреція П 4 клітинами селезінки ій
Шестиденні культури. « 010 Авніен!////011711111111111111111111 зе ІАд'ювант ВІЛ ВІЛ ВІЛ | Соп А.І Лізозим Середовище! (7 пептид | пептид | пептид | 1 30 Омкг/мл 10 мкг/млі 3,3 | 101 мкг/мл|мкг/мл! мкг/мл « м | | мкг/мл Її (БІ - с немає: Іза ще 01111
САЛА | ЇЇ 77777 р24| | г гщ(У « ША. ЇЇ 1 || 1 вив Її 71771711 113 11 " |МВІлеСЕ | 163 | 96 | 57 | 63 | |.
Я ви НШ ШИ В.Я Ши НИ о П-12
ШО чай БАЛИ ВБій Ши По ПН ННЯ
СМ-С5Е з | | й | | 36 | 81 Щ / і) Приклад 7 іме) Секреція гамма-інтерферону клітинами селезінки.
Вимірювали гамма інтерферон, секретований в культурі клітин селезінки, стимульованих 25мкг 6о ТІЗБРІОМІЩАХ-Сувз). Клітини селезінки збирали з п'яти самиць мишей Ваїр/с і культивували з позначеними антигенними стимулами (такі ж, як прикладі 6) протягом або трьох, або шести днів. Рівні гамма-інтерферону визначали за допомогою ЕЇІЗА і порівнювали зі стандартом, що має відому концентрацію. Пусті лунки показували, що аналіз не виявив гамма інтерферон при цих умовах культивування. Нижня межа чутливості, що визначається була 4 пікограм/мл. Результати приведені в таблиці 6. б5
Таблиця 6 Секреція гамма-інтерферону клітинами селезінки
Триденні культури: й : . Й 00000 дАнтижн/////7711111111.11111111111111с1сС
Адювант | ВІЛ ВІЛ | ВІЛ | Соп А | Лізозим | Середовище пептид пептид | пептид |1 мкг/мліЗ0 мкг/млі 0 мкг/мл т 10 38 1 мкг/мл| мкг/мл | мкг/мл шт 8 ад'юванта
СЕАЛЕА | | | |5:01 2 Щ ш-2 | ЇЇ ЇЇ 1,591
ОМС | | ! |п6 2 |МРІЛМСЕ | 66 | 42 | 43 182 очній НИ НИНІ ННЯ о АНЯ НОЯ п-12 віків 1711 7 |ОМ-С8Е о
СЕ ЇЇ 01 71777718 111 зю. Таблиця 6 (продовження) Єекрація тамма-інтерферону клітинами селезінки ій
Шестиденні кулютури: ч
Го дЖиенвий077111111111111у11їуїллуїуїууї011о з |Адіюванто 0 ВІЛОЇ ОВІЛОЇ ВІЯ 1 СепА | Лізозим (Середовище ую 83 й
ТГикг/маж! мкома | меми | і
ЯМИ МИ МО пос МОНО ПОН . Тад'ованта | сш з ОМеВЕ Її. 0.00 1101 є ЇМРІМСЕ 11901) 8515 | 390 | І 77111 ее ША Гр 2-1 - Б. 0. 1838. | |56| |... о Експеримент 2
Імунізація мишей Ваїр/с пептидом ВІЛ і різними ад'ювантами де Приклад 8
Матеріали і методи 60 Тварини
Використовувалися самиці мишей Ваїр/с у віці 7-9 тижнів згідно з прикладом 1 вище.
Пептиди
Використовували пептид НІМ-1-ММ ТІЗРІОММ(А), описаний в прикладі 1. Пептид регідратували в сольовому розчині з концентрацією мг/мл. 65 Ад'юванти
Ад'юванти, що використовувалися були такими, як описані в прикладі 1, за винятком того, що в деяких випадках МРІ тм використовувався у вигляді водної композиції, замість стабільної емульсійної форми.
Імунізації
Миші були імунізовані підшкірно в сідничну область, в повному об'ємі 0,2мл, однаково розділеному на кожну сторону відносно хвоста. Імунізації пептидом ВІЛ (25мкг) проводили на 0 і 21 дні разом із означеною кількістю ад'юваната(ів). Миші, що отримували СЕАЛЕА, отримували СЕА на 0 день і ІРА на 21 день. Розбавлення і змішування проводили відповідно до описаних в прикладі 1.
Отримання зразків
Отримання зразків у тварин проводили у відповідності до протоколу прикладу 1 за день до кожної імунізації 70 і через 14 днів після другої імунізації
Препарати клітин
Отримували препарати клітин проводили і контролювали відповідно до протоколу прикладу 1.
Ферментний імунносорбентний аналіз (Е!Г ІЗА)
ЕСІЗА проводили відповідно до протоколу прикладу 1.
Аналіз нейтралізації НІМ-1-мМ
Аналізи нейтралізації знову проводили в лабораторії Університету биКке відповідно до протоколу прикладу 1.
Приклад 9
Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ТІЗРІОМЩА)(-Сувг) ІдДО
Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ТІЗРІОМЩА)Х-Суз) ІД вимірювали або як середнє геометричне окремих мишей (МТ) або в об'єднаній сироватці (п-5 Ваїр/с), отриманій через 14 днів після другої імунізації.
Граничні титри підкласів ІДС! ії ІдсСг2га також вимірювали в об'єднаній сироватці У випадку реципієнтів ад'ювантів Фройнда, мишей праймували 25мкг пептиду, емульгованого в СЕА, і повторно імунізували ІРА. СЕ
МРІ тм являє собою емульсію, що містить в дозі 195 масло сквалену і 5Омкг МРІ тм. Водний МРІ тм вводили в кількості 5О0мкг в дозі. Рекомбінантний мишачий І/-12 вводили в дозі 4Онг/миша. Рекомбінантний мишачий с ОМ-С5БЕ вводили в дозі 1Омкг/миша. Результати приводяться в таблиці 7. о
Реципрокні кінцеві точки титрування анти- ТІЗРІВМ(А Су) ес с зо тт ВЕ тент т «о ні о туру
Адчовант с ів Іщу ЇВ | бвбба | о безал'юванта | 000 | 0 | 00 | «000 з |МРІЛМСЕ. «5 183802 / 49У805 | 1624380 | 983425 | з ї» |МРІЛЄСЕЖОМАСВЕІ ЯВіз9 | 133171 | 103298 | 50415. . Мрілибв исію | 10853 | 611076 | біб | 665 з ом 00771 97333 1755. 1 14538.
Ф ШІ 00 | .500. | жЩНЮЮ | «0 то |МРІЛМ 0001 219705 | одІ9В 134498 707. со 2 |ІМРІЛЄТОМСВЕ |) 946695 | 1101449 | вада ОО во (МРІЄ ій | о377975 | 9378702 | 204354 1 9795.
Приклад 10
Реципрокні кінцеві точки титрування підкласу анти-ТІЗРІОММА)(-Смв) ІдДО
Реципрокні кінцеві точки титрування ВІЛ-пептид-специфічних ІДС і ІдДА антитіл з промивної рідини піхви
ГФ) вимірювали в об'єднаній сироватці (п-5 Ваїр/с) через 15 днів після повторної імунізації. Мишей імунізували з так само, як описано в прикладі 9. СЕ МРІ тм являла собою емульсію, що містить в дозі 195 масла сквалену і
БОмкг МРІЇ! тм, Водний МРІтм вводили в кількості 5бОмкг в дозі. Рекомбінантний мишачий 1/-12 вводили в во концентрації 4Онг/миша. Рекомбінантний мишачий ЗМ-С5ЗЕ вводили в концентрації 1Омкг/миша. Результати представлені в таблиці 8. б5
Таблиця 8 ; Регпипрокні кінцеві точки титрування. анти ТРЮМО СУВІТО ГІвА. ІАджвантй | що її ТА
ПМРІЛМСВ С І 3 | «юю
Б. 4101 0. с " МР ЄСвОо ОМВК | 129 | «0 | о
ІМрілисво уки | йо | 0) зд я Героя пастнні гас риси ли Я тля ра се н Е лег " імя тм : «я шен 77 «кб 1 сю | -
Мріє 000300 0 МО С умРілм ьо фр о6б 1 197 | -
Приклад 11 в с Проліферація клітин селезінки "з Вимірювали проліферацію клітин селезінки у відповідь на стимуляції іп міго ТІЗРІОММ(А)Х-Сувз) і різними " композиціями ад'юванта (тими ж, що і в прикладі 10). Клітини селезінки культивували всього протягом 96 годин.
У культуру в останні 18 годин вносили ЗН-тимідин. Дані представлені як проліфераційний індекс, нормалізований - 45 відносно клітинної стимуляції в культурі СопА (Ісереднє срт антигена/середнє срт СоА)|-|Ісереднє срт середовища/середнє срт СопАЇх100. Як результат, клітини, культивовані в середовищі, мали фонову (о) проліферацію рівну 0. Результати приведені в таблиці 9. Проліфераційні значення, нижче ніж клітинне зростання їз в культурі без стимуляції, представлені в дужках. о 50 42)
Ф) іме) 60 б5
Таблиця 9 Проліферація клітин селезінки мкг/мл | 3,3 мкг/мл | 1,1 мкг/мл | 5 мкг/мл 19 мкг/мл ад'юванта
Я
СЕ 1 05 | 03 | 01 | 990 | о04 з» ДОМАСБЕ | І вер я ря вк т
Ш-12 й го мріє 1101 141051 9921 04 о з |9М-СВЕ | | Її о ц-12 (Се)
Приклад 12 (ав)
Секреція ІІ -4 клітинами селезінки
Вимірювали інтерлейкін-4, що секретується в культурі клітин селезінки, стимульованих ТІЗРІОММ(А)-Суз). -
Загальний час культивування становив 96 годин. Супернатант клітинної культури аналізували на //-4 за со допомогою ЕЇГ ІЗА. Всі значення були отримані після віднімання із значень, визначених в супернатантах клітин, стимульованих 1Омкг нерелевантного білка (лізозима). Результати приведені в таблиці 10 в пг/мл. Результати, ї- які були нижчими за межу виявлення після віднімання з стимульованих лізозимом позначені як "нмв". Ад'юванти являли собою 40Онг ІІ -12, 1Омкг ЗМ-С5Е і БОмкг МРІ м,
Таблиця ТО « в Хекреція П.Я клітинами селезінки щ
ГГ АННо - о ш ос: 1 ЗО мюумло) 3,3 мкр/мло| Бісмюсмло | Ямкг/мл,
ФО в» о СБАДЕА 7 нМВ | НМВ | НМВ | 17 о» СЕМРІм 0000 | НМ | нМмВ | НМ | 187.
Ф сеМмрілєзоМоВкІ 61745014 24 з о ю
МР | з. | НМ | 17. | 986 " фМрілмЖОМеВЕ | НМВ | НМ | нм | й
Приклад 13 65 Секреція гамма-інтерферону клітинами селезінки
Вимірювали гамма-интерферон, що секретується в культурі клітин селезінки, стимульованих
ТІЗРІОММА)Х-Суз). Загальний час культивування клітин дорівнював 96 годинам. Супернатант культури клітин аналізували на гамма-інтерферон за допомогою ЕП І5А. Усі значення були отримані після віднімання із значень, визначених з супернатантів клітин, стимульованих 1Омкг лізозиму. Результати приводяться в таблиці 11 в од./мл. Результати, які були нижчими за межу виявлення після віднімання з стимульованих лізозимом, позначені як "нмв". Ад'юванти були ті ж, що і в прикладі 12.
Таблиця 11 б Секрешя гамма інтерферону клітинами велезінки
Адювант "ВіЛюпептид | ВІЛ-пептид | ВІД-пептид) СбопА
Ібезад'юванта | НМВ | НМВ | 1 | 189
СЕ МР дю
ІСЕМРЬЧОМСВЕ| 412 0003
ІСВ МР Пн19 о
ІМРІМеОоМеВЕ | НМВ | 020 | 19 | 3 | ою зо ММ ПАТ | 160 1 я я 1 мч о
Експеримент З чЕ
Імунізація мишей Зм/ізз-М/ерзіег ВІЛ-пептидом і різними ад'ювантами
Використовувалися протоколи експерименту 2, крім того, що мишей Змізвз-УУерзіег використали замість іш мишей Ваїр/с. У даному експерименті вимірювали тільки реципрокні кінцеві точки титрування анти-пептидкого -
ІдО і реципрокні кінцеві точки титрування антитіл дос і ІдДА з промивної рідини піхви.
Приклад 14
Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ВІЛ-пептидного Дб Реципрокні кінцеві точки титрування «
ТІБРІОММ(А)(-Сувз) дО вимірювали як середнє геометричне окремих мишей Зм/ізз-М/ервіег (СМТ), отримане 470 Через 14 днів після другої імунізації. Граничні титри підкласів ДС! і їдб2а також вимірювали в об'єднаній - с сироватці. У випадку реципієнтів ад'ювантів Фройнда, мишей праймували пептидною емульсією в СЕРА і повторно ц імунізували ІРА. СЕ МРІ тм являє собою емульсію, що містить в дозі 195 масло сквалену і 5Омкг МРІ тм, Водний ,» МРІ! тм вводили в кількості 5Омкг на дозу. Рекомбінантний мишачий 1//-12 вводився в дозі 4Онг/миша.
Рекомбінантний мишачий ЗМ-СЗЕ вводили в дозі 1Омкг/миша. Результати приводяться в таблиці 12. -І (22) щ» о 50 42)
Ф) іме) 60 б5
Таблядя ях я Реципрокніжінценві точки титрування анти-ВІЛ-пентиду ТВО:
Ммеснск 73371 5831771. 38351887
ШЕ у... .....1 0655. 3 «О00. | «000
ІШМУСВЕ 0/0 43500... «000 |. «1000, я ше 725 5ю | юю 1 лою з
МРІЛМ 0... 1960 | «ЮЮЮ. | «1000.
ІМРІМСМАСЬЕ | 58211 | 35/24 | 37959 » |МРІЛМ нет? 01 О5И89 | 8535 | 17/69
Приклад 15 «І
Реципрокні кінцеві точки титрування підкласу анти-ВІЛ-пептидного до | що | с
Реципрокні кінцеві точки титрування ВІЛ-пептид-специфічних антитіл ДС і ІДА з промивної рідини піхви вимірювали в об'єднаній сироватці (п-5 Зм/із5з-УМУерзіегї) через 15 днів після повторної імунізації. Мишей ї- імунізували так само як описано в прикладі 14. СЕ МРІ тм являла собою емульсію, що містить в дозі 196 масла сквалену і 5Омкг МРІ тм. Водний МРІтм вводився в кількості бОмкг на дозу. Рекомбінантний мишачий 1І-12 вводили в кількості 4О0нг/миша. Рекомбінантний мишачий ЗМ-С5Е вводили в кількості їОмкг/миша. Результати « представлені в таблиці 13. яко сі те ші е Таблиня 13: ї» Репинрокні кінцеві точки титрування анти ВІЛ-пеютидних ТВО ї ТА, 47
Ф їх е
Ф з о з ЯМВЕ 00014001
МРІЛМ Ж ОМВЕ 010. 25. | кю
Експеримент 4
Імунізація мишей Ваїр/с ВІЛ-пептидом і різними ад'ювантами
Використовували протоколи експерименту 2, за винятком того, що мишей імунізували на 0 і 28 дні і збирали у них кров для серологічної оцінки на 0, 27 і 41 день. СЕАЛЕА змішували з СЕА на 0 день, ІЕ А на 28 день. СЕ
МР тм змішували 5Омкг МРІ тм 295 СЕ, в той час як використовувалися 5Онг ІІ -12 і 10мкг ЗМ-С5Е.
Приклад 16
Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ВІЛ-пептидного ІЇДО
Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ТІЗРІОММ(А)(-Сувз) (дО вимірювали для окремих мишей і як їх 70 середнє геометричне значення (п-5 Ваїр/с) через 41 днів після первинної імунізації, через 13 днів після повторної імунізації. Результати приводяться в таблиці 14. У день 0 окремі титри були все меншими 50.
Позначення "немає даних" означає, що тварина померла до завершення експерименту. "СВ" означає стандартне відхилення. ів Таблиця ІЯ
Індивідуальні і геометричні середні значення сироваткових титрів ІеО, епецифічних для ТІ5РІОММ(АЗ(-СУЄ) 20 ТІАдіювант |Мишайі ІМешай? |МишайЗ|(Мишани ІМищай» |(ЮМТ 150 1
СЕАЛЕА | 3806160) 4856380) 148038| 172947, 972284) 805599| 2025740 пня 0 17594771111501. 50,3 507,77 50,17. 89, в оМ5Е 15075071 50,50р.150,. 50)... 0) сч свейов 138042, охо, з5ові, 0050, 37932) 727) 18320)
СЕ--ОМАСЯК | 485985 223818 63,377 38050, 18578601 217494) 761374. Ге) зо 151846) 249054, 436378| 1246470, 63452) 4900911 с меілмят-і9| 4855170, 1117800) 1255290) 692219), 7001540| 1660297) З6І4Я17
МРІТМ КОМА 115527, 10493101 301636, 316223, 7369591 3855681 380380). сВЕ (| ши ше ЩІ | о зе |СВМРЕЬТМ | 904947) 5805010, 291382| 346835! 354449| 716000| 2396968) ов-
СЕ МмРрІлмМ | 244171) 8545550 455350 377697) 10956501 8297071 3593727)
СЕ МРЕТМ я 3016000 тн 1718590, 14839901 28,2591 691033) 124414) С с Приклад 17 Реципрокні кінцеві точки титрування підкласу анти-ВІЛ-пептидних до :з» Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ВІЛ-пептидних Ід вимірювали в об'єднаній сироватці (п-5 Ваїр/с) через 41 день після початкової імунізації, через 13 днів після повторної імунізації. Результати приведені в таблиці 15. в таблиця 15 в "Реципрокні кінцеві точки титрування підкласу анти ТІЗРІОМКА Су ес
Ф дованти 0 3000 ЛЕОІ 1 ЛвОба | БОБ
СЕАЛЕА 0010 359938. | 122107 155877. зв свій с. 0. | 8, е СЕ ОМеВЕ 017 6. дл ЇМРІЛМЖОМАСЯЕ | 134959 | 8000 | юю
БМР ем | 560.
ІСБМРІЛЄ нт» 0 164866 я |сСВМРІЛЄЖОМ ВЕ | ом | ЗзаиЗ | 29565
Приклад 18
Титри анти-ВІЛ-пептидних ІДС і ІДА промивної рідини піхви Титри анти-ВІЛ-пептидних антитіл Ід і ЗДА промивної рідини піхви вимірювали через 41 день після початкової імунізації, через 13 днів після повторної 70 імунізації. Результати приведені в таблиці 16.
Таблиця 16
Тавра знтитисанти ПЗРІОММАХ-СУЄ ТВО БА з промивної Бідйни піхви
ШЕАЛЕА | 7 аб |В я 30001006
Беж ж ин ! тя : руни
ІЄМ-СВЕ Го 7к«ю 07071785
ММрим 10000140...
ІМремепню 068.1 ю МРІМЖОМСВЕ 77772111 65110
МвМмМвимМ 000400 018300 |0001166 0
СЕМРІМЖОМеСВЕ | - що 83 35 . : : ; і. ; ; м
Приклад 19
Проліферація клітин селезінки
Вимірювали проліферацію клітин селезінки мишей, імунізованих ТІЗРІОММА)Х-Суз) і різними композиціями ад'юванта. Клітини селезінки стимулювали іп мійго протягом чотирьох днів З,Змкг/мл ТІЗРІОММ(А)-Суз). «
Результати показані на малюнку 4, як зміна включення міченого тимідину в результаті іп міго стимуляції 3,3 -о с мкг/мл ТІЗРІОМЖА)(-Суз) відносно включення у відсутність стимуляції (дельта срт).
Експеримент 5 :з» Імунізація мишей Ваїр/с ВІЛ-пептидом і різними ад'ювантами Використовували протоколи експерименту 2, за винятком того, що мишей імунізували підшкірно на 0 і 22 дні і брали кров для серологічної оцінки на 42 день.
СЕ МРІЇ лм отримували з 50мкг МРІ тм і 195 СЕ, нарівні з використанням ТОмкг ЗМ-СЗЕ. -І Приклад 20
Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ВІЛ-пептидного Дб Реципрокні кінцеві точки титрування
Ме анти-пептидних (ДО вимірювали в об'єднаній сироватці (п-5 Ваїр/с) через 42 дні після початкової імунізації, ї» через 13 днів після повторної імунізації. Також для до вимірювали середні геометричні величини з допустимим о 5р Відхиленням. Результати представлені в таблиці 17. 42)
Ф) іме) 60 б5
Таблиця 17 ; Реципрокні кінцеві точки титрування анти- ТІЗРІОММ(АХСув) ІРО вбзь І вбомт | 551
ІБезад'юванта. | 21000 | 51000 | «1000 | «006 1 «000 17-31
СРАЛЕА 390531 | 144564 | 33137 | 13134 | 741966 | 834567 тю |БМОСВЕ | 11639, | 3815 | «1000 | «1000 | 5133 | 32763 -ОбЮ 1 1000 | 10001 хі000 0001 17-
СЕ ОМВК | 84965 | 55998 728247 | 165628.
МРілє- 00196518 ПІЯТ І3Мі6 | 2032441 5638450 т |МРІЛИСМ-СВЕ | 835218 | 322441 | 26976 | 35697 | 1133423 | 881331
СЕМРІЛМ 11577357 | 642436 | 1139171 45025 | 1450821 | 5876690
СЕ МРІЛМ я ОМ 6598573 | 1212160 | 238440 | 214570 | 6415920 | 2925687.
Експеримент 6
Імунізація мишей Ваїр/с ВІЛ-пептидом і різними ад'ювантами Використовували протоколи експерименту 2, за винятком того, що ВІЛ-пептид містив цистеїн в положенні 17 амінокислоти і мишей (п-3 Ваїр/с) імунізували підшкірно на 0 їі 21 дні і збирали кров для серологічної оцінки на -1 (день перед першою імунізацією), 13, 20 і 28 дні. СЕ МРІ тм отримували з 5Омкг МРІ тм і 195 СЕ нарівні з використанням 1ТОмкг ЗМ-С5РЕ. ВІЛ-пептид с
ТІБРІОММ(АХ «Сувз) (26) містить цистеїн в положенні 17 амінокислоти і являє собою в довжину 40 залишків. Ге)
ТІЗРІОММАХ «Сувз) був отриманий від Сепозуз Віоїесппоіодієз (Те Ууоодіапав, ТХ).
Приклад 21
Реципрокні кінцеві точки титрування антнН-ТІЗРІОММ(А) дО Реципрокні кінцеві точки титрування антн-тІЗРІОММ(А) Ід вимірювали для окремих мишей і як їх середні геометричні величини (п-З Ваїр/с) через ее, 28 днів після початкової імунізації. Результати приведені в таблиці 18. ав
Таблиця 18 « "Ефект СЕ МРІЛМ 5 ЗМ-СБЕ на ро відповідь на ВІЛ-пептид (Сув) і
Хдювант | во | ОМ | їв01 | МТ | вода | СМТ І ї8б25 | СМТ
СЕ МРІлМ | 14275585 | 8942480 | 2097104 |(1437319| 251235 | 239615 | 210746 | 210178: -ОМ-СЯЕ і «
Й 13618523 2484849 205253. 296429 - 4 (1 3878324| 569893| . |243103| | 148611 й СЕМРІЛМ | 1913110 |5206349| 644377 | 990194 | 22557 | 114913 | 23141 | 70632 о 11405649 1937492 152430 127600. 6467553) Ющ-| 777643 | І 441326. |19338|. 7 ЇМРІлм о | 91728 | 350486 | 23249 | 84978 | 500. | 2859 | 500 | 2906 529663 155199 1628 102
Ф 886156 | 170071 | 28723. 44531
С Бе «500 «500 «500 500 с 20 0 |вд'юванта т «500 «500 «500 «500 ож «500 «500 . «500
Експеримент 7 99 Імунізація мишей Ваїр/с ВІЛ-пептидом і різними ад'ювантами Використовували протоколи експерименту 6, за
ГФ) винятком того, що мишей (п-З Ваїр/с) імунізували підшкірно на 0 і 32 дні і умертвляли для серологічної оцінки з на З8 день. СЕ МРІЇ тм отримували з 5Омкг МРІ тм і 195 СЕ, нарівні з використанням 1Омкг ЗМ-С5Е.
Приклад 22
Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ВІЛ-пептидного ІДО 60 Реципрокні кінцеві точки титрування анти-ТІЗРЛОМАХ Сувг) ДО вимірювали для окремих мишей і як їх середні геометричні величини (п-3 Ваїр/с) через 38 днів після початкової імунізації. Результати приведені в таблиці 19. б5
Тайзиця 19 факт СБ.МРСЛМ ж ОМ-АСБЕ на Туб відповідь на ВІЛ-пештид СЕСуЄ) дюнат | 80 | ОМ | любі | ОМТ у ївоба | МІ о двов | ОМ мли св ааа вав ви 522507 109060) 115996 325097 МіО ба шо | 5.218,387 472,745, 1427916 204940, 486,563 216,53, 47515 13077
МІ СВ | 736,325 559,33 88,59 29300 веб 103600 0307 0027480 тю | 6о6ло3 які 809яді 00оня 44585 я авлОЗ Не
Ї заб» 7783 оіотяйє бео7375 ЗБЯ5. 83бовІ 13010 13837
МмРЕтМ р яйат 1367349 6БЯЄ біо 00349 000 ББИЯБ 00555 0067
ІСМОБЕ р 5,093,897 іх, ЗББВОБ оз 11469 че МИЗО я я. | ЩзО116 бив иЗ7я ворів 16691 8005760) 11590 5452 75 |МРІИМ Го йб4лу55 445,59 лаві 15,44 1174 0003429 009685 4980 ! о ввовх т а яВо ще Іва щ- ВО те 4 вав Збово 4686 о3ю691 2028 ля 03,538 ВО
СЕ ОО еОбЮ єО00р Од 000 1000 «БО00І жО0Ю 0000
Код ї жо 1 ЦО ДЮ пн. НН НИ МНН НС 2 НН В ше
Немає ТОБОЮ є БО0б 000 «Од є БО0О «000 10006 00 БОТЮ ро жов т -«ЦОцо. ! 1000 Ї ОВО. си 5000, шик НН с о ЗИ М т АН
Експеримент 8 сч
Аналіз СТІ у мишей Ваїр/с (о)
Імунізація мишей проводилася з використанням протоколів експерименту 6. Оцінювалася активність СТІ. клітин селезінки, виділених у мишей через сім днів після повторної імунізації. СЕ МРІ тм отримували з 50мкг
МРІ тм і 195 СЕ, з або без 10мкг ЗМ-С5Е плюс 50мкг ТІЗРІЛОММАХ Суз). «о зо Приклад 23
Аналіз СТІ у мишей Ваїр/с о
Для аналізу СТІ. клітини селезінки виділяли у імунізованих мишей через 14 днів після первинної і через сім «г днів після повторної імунізації. По суті використовували раніше описаний протокол (34). Стисло, об'єднували еритроцит-виснажені клітини селезінки у трьох мишей в групі. Ефекторні клітини селезінки (4х10б/мл) повторно о стимулювали в 24 лункових культуральних плашках в об'ємі 1,5-2мл протягом семи днів Імкг/мл або "ММ", або - "ПІВ" 10тег пептидами з епітопами СТІ. Обидва епітопи СТІ були рестриктовані Н-209, У культури додавали 1бод./мл рекомбінантного мишачого 1-2 (Віозоцгсе) протягом останніх п'яти днів культивування. Для аналізу цитотоксичної активності, РВ15 клітини були мічені Сг?! і імпульсно-мічені мкг/мл пептидом (ПВ або ММ) « протягом чотирьох годин і додані до культивованих ефекторних клітин селезінки. Використовували три розведення пропорцій ефекторні клітини - мічені клітини, від 100.1 до 3,7:1. Процент СТІ активності т с розраховували як процент вивільнення хрому, що використовується (специфічне вивільнення хрому - спонтанне ч» вивільнення хрому)(максимальне вивільнення хрому - спонтанне вивільнення хрому) х100. Вивільнення хрому " оцінювали після шестигодинного інкубаційного періоду. Середнє спонтанне вивільнення хрому було завжди меншим ніж 159о максимального випуску. Результати даних з 28 дня показані на Фіг.5.
Експеримент 9 - Імунізація резус макак різними ВІМ-пептидами і ад'ювантами б СЕ МРІ тм ії ОМ-С5Е композицію ад'юванта тестували на резус макаках (Масаса тпшиацо.) на її здатність стимулювати антиген-специфічні СТІ. У цьому експерименті ад'ювантну композицію тестували з тривалентним о імуногенним пептидом, що містить три окремих епітопи СТІ в контексті Мати А"О1 (кожний з дад, рої і епу), о 20 кожний синтезується хімічно з або без змішаного ВІМ епу епітопа Т-хелпера в лабораторії Ог. Вапоп Наупез, університет Юике. щи Пептиди, що містять СТІ. епітоп в контексті Мати А"01 були наступні:
ЯДептиди, що містяте СТІ. епітоп в контексті Мати АУОІ були наступні! о Су Те Рго ТугАкр Це Ав Сів Мес(8ЕОЛУ МОЗ) (вару де Вег тертю Рго тен Ма! Ате Бе Ма (5601 МО (рої) до ТуєДІВ Ріо Риб Пе ВЕ Оу бів ПЕ(ВО ЛО МОХ
Кожний з цих СТІ -утримуючих епітопів був також пов'язаний з епітопом Т-хелпера, що має наступну послідовність: б5
СП тен Тук ув Тут ув Ма Уві бує Пе Пл Рго Бе Су Ма Аза Рео Те Ту:
Ав (8ЕО о МО);
Таким чином, три мультіепітопних пептиди мали наступні послідовності: іх бем/ тує Мув'Тує Шув Маї Уа! Муз Пе бій Рів Бе. СПУ Уві лів рю ть Гуз. о Жвбув ТНЕ Ріо ТУ: Авр Пе Авй бій Мец(5БОТо МО: 7у
Сію Тем. Тук Суб Тут був Мвї Ма) Пух Пе Сім Рео Тем СТу У аї Аа. Рго Тв Гув:
Аа Заг Те Реб Ргобей УВІ Ав ей Уа! (550 МО: 8 з бі рев тує Був тує Був Уві Ма! Пув Це Єв Ріо ви СПУ Ма) Ата рео ТНЕ Гув; дів Туг- Дій Ріо' Ріо Пе Вбг СУ СТВ Лео МО МО: 9)
Аналіз ЦТК проводили за допомогою аналізу тетрамерного ланцюга в контексті Мати А"01 в лабораторії Ог.
Могтап ГІ еїміп, Нагмага Медіса! Зспсої.
Тварини, дози і імуногени
Резус макаки експресу вали НІ А-А гомологічну молекулу Мати А" 01 і був ідентифікований підтип ОКрО201 за допомогою ПЛР і вміщений в колонію Мему Ірегіа, І А.
Вивчення включало три групи з двох юних резус макак (Масаса тиацо), кожна описана в таблиці 20. Група 1 с об складалася з двох Мати А" 01 позитивних, ОК.рО201 негативних тварин Ки 73 і КА 80. Цих тварин імунізували в контексті Мати А" 01 пептидами, що містять епітоп ВІМ дад, епм і епітоп рої СТІ (короткий пептидний (8) коктейль), разом з СЕ МРІ тм і ЗМ-СЗР. Група 2 складалася з двох Мати А"01 позитивних, ОКВО201 позитивних макак, які отримували пептиди, що містять епітопи ТИ/ЗІМСТІ. дав, рої! і епм (довгий пептидний коктейль), разом з СЕ МРІСтм ії 6М-СЗЕ. Група З включала двох Мати А"01 негативних, ОКВО201 позитивних тварин, імунізованих («о пептидами ТП/ЗІМСТІ. дад, рої і епм (довгий пептидний коктейль). Таблиця 20 представляє групи по типу НІА і імунногенних пептидів, що використовуються. о
Таблиця 20
Тварина! Тип НЬА | / Пептидні імуногени 1 1 Ка73, Машиаео1 ІСП/ВІМ ви рРИС(БЕО УМОВІ З «
Же80 І виш оошщ шш вщо жя Ії з с І ШВОМ. /|ІСТ/ВІМ рої ревА5вОЮ МО) 1 х» І | : ІСТС/ВІМ епх раТА ВО 10 140:5). |! 11111111 Оу5мекожногоценидуїд -/-/:/:/ 2003000 вв /РВЯВОЗОТ я. ЇТН-ИСТЬ/ВІМ рої рова (50 19 МОВ) в | ІТНАУСТІВІМ воу ра1А (58079 МОЮ) ри ншш шН Я (мамгкожноголептиду 0 т | вка? ЮвеВозоія. ТНА/СТІ/ВІМ рої рбвА (БО ПО МОУ
І ТИЧИСТІ/ВІМ вих реТАБЕО Тр МО) 5, 1... ЗА Ме кожного пейтиду - іФ) Всі групи були імунізовані підшкірно Тмл відповідного пептидного коктейлю в складі з бОмкг СЕ МРІ тм в 195 ко маслі і 250мкг людського (ЗМ-СЗЕ на 0, 4 і 8 тижні. Дозу СЕ МРІ тм збільшували до 125мкг в 195 маслі на 18 тиждень імунізації. Для всіх груп, 2,4мг кожного з довгих пептидів і 0,75 мг кожного з коротких пептидів 60 розчиняли в О9ООмкл дистильованої, деіонізованої води. Пептидний розчин потім використовували для розбавлення ЗМ-С5Е і додавали 100мкл композиції СЕ МРІ тм,
Приклад 24
Аналіз СТІ у резус макак
У тварин збирали кров кожні два тижні і гепаринізована кров аналізувалася на СТІ в контексті Мати А"О1 за 65 допомогою тетрамерного фарбування мононуклеарних клітин (РВМС) свіжої або культивованої периферичної крові (50). РВМС стимулювали або рііе, рб8А, ратА, або р46 на 0 день і потім культивували в присутності 1-2 і аналізували на 11 день. Стандартний метод вивільнення 7'Сг також проводили на культивованих РВМС (50).
Тетрамерний аналіз проводили таким чином:
Пептиди, що містять епітопи ріїс з дад, рбвА з рої або рбвА з рої! або раТА з епум інкубували з очищеним біотинільованим Мати А"01 в присутності В2 мікроглобуліну, потім приєднували до авідину і кон'югували з РЕ (фікоеритрин). Цей тетрамер потім використовувався для фарбування СО8я- клітин макак з Т-клітинними рецепторами, які впізнають епітопи рііє, рб8А або ралА. Різні ОК 80201 тетрамери утворювали петлі навколо домінуючого епм р46б епітопа, що дозволяє контрастувати СО4-- клітини, які впізнають епітоп р4б6 ТИ. Результати представлені в Таблицях 21-24. й Габтиця лі;
Процент Р) Те/ВІМенр тетрамер-позитивних СТВ клітин
А (М |ВБ8О 0 04 0106102, 02/14 09 --- ж А 01 09115 ви 3913905 А
Грушіз | вв | 0 021 02103102 0210101
ГГ. / вв 101103 056102 |01|01 | 00101 сі
Таблиця 22
Процент реЗА/ВІМО СТІ рої тетрамер-позйтивних СПІВУ клітин о "Голів 121116І1818| 61) о
Сбрупії | Ва би фо 01251058 51 я » н 7 4 с -ЕК Іво ооо 1 -т--- пи т я "Табциця 23
Процент РА А/ВІМ епу тетрамер-позитивних СПІВ клітин. ч г... (|Тжі( 07218685
Ф Група! | Ви | 08 35135 201351 17) 15) 6 ех Група | ки 102| міо |о6 би 02161106
Груша | вва | о | 021021 |оз1001 0005
Ф) іме) 60 б5
Праценг рЯб/ВІМ Т-хелперів ПЕВОЗОЇ тетрамер-козитивних СПК клітив
Її | Ти) 0 а | ж б | 8 | 9 / о
Група! | вв | 1 1021001 00100 001001
Шрупа? | Вня5 | 02105107 041031 о)
ІГрупаз | ВА | | | | |061|04|031|05)
Експеримент 10
Імунізація мишей Зм/ізз-УУерзіег білком порином В Меїіззегіа допоітпоеає і різними ад'ювантами
Аутбрідних мишей Зм/ізз-УУерзіег розділяли на п'ять груп по десять мишей в кожній. Кожна група отримувала мкг рекомбінантного білка порина В (з ланцюжком ЕА1090 з 16 амінокислот на М-кінці фага, а потім зрілою формою білка порина В). Перша група не отримувала ад'ювант; друга група отримувала 5Омкг МРІ м; третя група отримувала МРІтм плюс бмкг ЗМ-С5Е; четверта група отримувала 25мкг СЕ МРІтм; п'ята група отримувала СЕ МРІ тм ЗЕ плюс 5мкг ЗМ-С5Е. Мишей імунізували підшкірно в сідничну область повним об'ємом в 0,2мл, рівно розділеними на кожну сторону відносно області хвоста/хрестця. Імунізацію проводили на 0 і 4 сч тиждень. о
Приклад 25
Реципрокні кінцеві точки титрування Ідс у відповідь на білок анти-порин В Мишей знекровлювали за день до кожної імунізації і на 13 день після остаточної імунізації. Сироватку аналізували як об'єднану від мишей в с зо межах груп. Реципрокні кінцеві точки титрування Ідс у відповідь на білок анти-порин В вимірювали в об'єднаній сироватці (п-10 Зм/ізз-УМУерзіег) промивної рідини піхви на З і 6 тижні. Результати приведені в таблиці 25. Всі «з титри до імунізації на 0 день були нижче за 50. «
Таблиця 25
Ренипрокні кінцеві точки титрування підкласів Іс у відповідьсна анти» м пориновий В білок
Зий бий оч - ІДдювняе | ЩО | бі | Ібба | 180 | 1601 бо г» Без 141461 8531 1 293 157203 | аб | 979 зад'юванта., - соні я уст -пінні- інтен жіно ню ект нний онікс нні нні інків «і - |МрРілм | 3О8І | 17. |. 318 )и31529.| 23465 | 90422
Ф Мрілм о | 7895 | 50 | 980 17901951 9475 | 82690. в мая 101.01 со » |СЕМРІЛМ 1350161! 297 | 13339 з9а5614. 342329
Ф СЕ МРІМ ІТО6008! 725 От | 33049231 | 31920 | 201787
Також визначали середньогеометричні окремі титри Ід на 6 тижні проти рекомбінантного білка порина В. 59 Результати приведені в таблиці 26.
Ф) іме) 60 б5
"Таблиця 26. ; Окремі титри БО іАд'ювант 00000000 | Середнегеометричне | Ставдартнапомилка
Безад'ованта 001... 00089... - 83467... о ММ 0 и ВЗ. 4 М ЙК ІЛІЯ 176
Ме оМоЕЕ 1 669801 001 3538031
ІСЕМРОМ 00000001. 19БОЮВ 000000 10000 2148357
ІС Мр ОМА | 1па567 858154 І
Експеримент 11
Імунізація мишей Зм/ізз-УУерзіег білком порином В Меїіззегіа допоітпоеає і різними ад'ювантами
Аутбрідних мишей Зм/ізз-М/ерзіег розділяли на шість груп по п'ять мишей в кожній. Кожна група отримувала 1мкг рекомбінантного білка порина В (з ланцюжком ЕРА1090 з 16 амінокислот на М-кінці фага, а потім зрілою формою білка порина В). Перша група не отримувала ад'ювант (білок був включеним в композицію з РВ5); друга група отримувала 4Онг 1-12; третя група отримувала 5Омкг МРІ мм; четверта група отримувала МРітм плюс 4Онг
І/-12; п'ята група отримувала 25мкг СЕ МРІ тм; шоста група отримувала СЕ МРІ тм 5Е плюс 40Онг 1-12. Мишей імунізували підшкірно в сідничну область повним об'ємом 0,2мл. Імунізацію проводили на 0 і 4 тиждень.
Приклад 26
Реципрокні кінцеві точки титрування підкласу дб у відповідь на білок анти-порин В і дос і ІЗА з с 29 промивної рідини піхви Ге)
Мишей знекровлювали за день до кожної імунізації і на 13 день після остаточної імунізації. Сироватку аналізували як об'єднану від мишей в межах груп. Реципрокні кінцеві точки титрування підкласу ІдС у відповідь на білок анти-порин В вимірювали в об'єднаній сироватці (п-5 Зм/ізвз-Мерзвіег) промивної рідини піхви і дос і со
ІДА вагинальних промивок на З тижні і 6 тижні. Результати приведені в таблиці 27. Всі титри до імунізації на
О день були нижчими за 50. Стандартна помилка при аналізі промивної рідини піхви була 1/5. (ав) рецхипрокні ківцеві точки титрування субкласу ТВО угвідновідь найнти- їі лорйновий В білокі б ТРА вагінальної промивної рідини ! С Тижденьа 00700000 ижденьб | Набнельне! у ! шодо) коп шиї що доня шо. 04 промивка. |. я Без ООва | 1872 1 28725 | 48944 | 8314 | 64500 801 5 но івд'юванта ССС.
Шьчо 7266 | 9578 |. 9071 | 571325 | 6278 58555931 5,
Ф МРІЄ 198274 1443 Іза | 3747987 0 Яавюу В І5
ІСБ Мрія у5у7133| 5622 1 33059 |10935000|210478 471552 130361 5 1 о -- | ши ни ЗЕ ИН І І
Експеримент 12
Імунізація мишей Ваїр/с білком респіраторного синціального вірусу Е і різними ад'ювантами о Мишей Ваїр/с розділяли на сім груп з п'яти мишей в кожній. Кожна група отримувала Змкг очищеного нативного білка людського респіраторного синціального вірусу (КЗМ) Е (в димерній формі). Перша група не їмо) отримувала ад'ювант (білок був включеним в композицію з РВ5); друга група отримувала 100мкг фосфату алюмінію (алюм); третя група отримувала 20мкг Зітиціоптм 05-21 (Адиїйа Віорпагтасецііса!в5, Іпс., Егатіпоанат, 60 МА); четверта група отримувала 5Омкл МРІ тм; п'ята група отримувала МРІ тм плюс 5мкг ЗМ-С5Е; шоста група отримувала 25мкг СЕ МРІ тм; сьома група отримувала СЕ МРітм ЗЕ плюс 5мкг зЗМ-СЗЕ. Мишей імунізували підшкірно в сідничну область повним об'ємом 0,2мл у верхню частину стегна. Імунізацію проводили на 0 і 4 тиждень.
Приклад 27 б5 Реципрокні кінцеві точки титрування підкласу Ід у відповідь на білок анти-Кк5М ЕЕ
Мишей знекровлювали за день до кожної імунізації і на 13 день після остаточної імунізації. Сироватку аналізували як об'єднану від мишей в межах груп. Граничні титри підкласів Ід реципрокні до білка анти-К5М ЕЕ вимірювали в об'єднаній сироватці (п-5 Ваїр/с). Результати приведені в таблиці 28. Всі титри до імунізації на
О день були нижчими за 50.
Веципрокні. кінцеві тоніки титрування субкнасів ТО: у відповідь на анти в то білок
ГО 1 лижденьї 10 тижденьб СО. їйлюм о 1 66740 1358391 4321 | 5417001 13226833! 91474
ІСтимулон!М 05-21 1.313665 1150988) 176080. 12113156129025211 4324004. о ІМРІТМ. 124197 28134) 11882 | 3310838 900863 | 1057108.
ЇМРІМ ЄОМАСВЕ | 419873 91649 65455 (10343803) 753590 688554
ІСВ МРІЯМ 1374995 | 44115 114730611933318911493284) 6314264.
СЕМРІЛМ-НОМ» 11748275 51966 1267265130816193|17168501 26412584 сч
Приклад 28
Проліферація клітин селезінки
Вимірювали проліферацію клітин селезінки у відповідь на стимуляцію іп мйго 2,5мкг/мл білком К5М Е і (Се) різними композиціями ад'юванта (ті ж самі, що і в прикладі 27). Клітини селезінки збирали на 14 день після о повторної імунізації і вміщували в культуру з щільністю 5х109 клітин. Клітини культивували в загальній кількості 96 годин. В останні 18 годин в культуру додавали ЗН-тимідин. Дані представлені як індекс в проліферації нормалізованих відносно клітин стимульованих в культурі СопА (середнє срт антигена/середнє «(о срт СопА1)-Ісереднє срт середовища/середнє срт СопАЇх100. У результаті культивовані в середовищі клітини 32 мають фонову проліферацію 0. Результати приведені в таблиці 29. т "Таблиця 29 пн: шин и « ю Нропіверація ютин селозінки - с Ї ппинтстлниви пили - шинка п о сп и пса а р во п и а а и ТИН - -- |йдювант 0000000 | Нормалізований індекс проліферації
ІБезад'юванта 00022010 0018 а фалюмо 110 ВИС. с ше М ОВО! 00008 во МРШИМ 8000 00.. 00 004... о "7 зМрРЕЛеєюаМ-сСВе Ї 20,0 щ --В т СЕ МРІМ 00.0 00002080 івМРімУоМВЕ | ба
Експеримент 13 і) Імунізація мишей Ваїр/с білком респіраторно-синцитіального вірусу Е і різними ад'ювантами ко Використали протокол експерименту 12 (імунізації на 0 і 4 тижні білком К5М Е з або без різних ад'ювантов).
Приклад 29 60 Реципрокні кінцеві точки титрування дос анти-К5М Е у відповідь на білок
Мишей знекровлювали за день до кожної імунізації і на 13 день після остаточної імунізації. Сироватку аналізували як об'єднану від мишей в межах груп. Прикордонні титри підкласів (дО реципрокні до білку анти-к5М
Е вимірювали в об'єднаній сироватці (п-5 ВаїЇр/с), Результати приведені в таблиці 30. Всі титри до імунізації на 0 день були нижчими за 50. б5
- ВБеципрокні кінцеві очки титрування субкласів 180 у відповідь на вити ВУ білок.
Го Тиждень3 | 00000 Лижленьбї СО 1
Безад'юванта 3 бЯМ2 ЗВО 713) 51950591 963203) З8791(Алюм у КК ДІЯВБО5 З6841) 19751 4285993, 567972, 27668
ІСтимулонім 05-2115280361296292) 176703) 37221731 1823402 1724319, з |мфіли 0104702) 21930) 61253| 6153833) 1384927| 955585,
МЛМ: ОМ СЯК 1262128) 79888) 55249 21054796 34197101 2070305,
СЕМРІЄ 0 пейсЯб| 47194, 160932) 31731335 4376601) 6405591 тю СЕ МРІЯМ Кк ОМ375575 70122, 289545 27079086 З124043| 6341457
Приклад 30
Активність СТІ. клітини селезінки с
Активність СТІ (цитотоксичний Т-лімфоцит) клітини селезінки як результат імунізації білком-К5М і позначені ад'ювантами оцінювали через дві тижні після заключної імунізації. Дані представляють процент о активності специфічних СТІ. клітин селезінки, культивованих міченими клітинами зараженими К5ЗУ, на ефективні мічені клітини у відношенні 33:11. Процент специфічної активності СТІ визначали як в прикладі 24, віднімаючи активність СТІ незаражених мічених клітин з активності, специфічної для мічених клітин інфікованих КМ. «о зо Нативні клітини селезінки інфікували КМ в МОЇ (різноманітність інфекції) в 1,5 протягом двох годин як джерело іп мйго стимулюючих клітин. Відповідаючі клітини селезінки імунізованих мишей додавали до о стимуляторних клітин у відношенні 5:1 і культивували протягом шести днів. На 5 день мічені клітини (ВаІр/С «Е
МНО-Н-2а клітинна лінія) інфікували КЗМ в МОЇ 10 протягом двох годин і культивували протягом ночі. На 6 день інфіковані і неінфіковані мічені клітини збирали і імпульсно мітили 9'Сг, Потім іп мйго до мічених клітин ее,
Зз5 додавали ефекторні клітини у відношенні Е:Т в області від 100:1 до 31. Вивільнення хрому вимірювали через ча чотирьох часів інкубації. Результати приведені в таблиці 31.
Таблиця 31 щи « з Активність СТІ; юптин селезики 2 55 ПО ОО ОО їх я стр є я "ери дна желе пннажяжояжоязєдЗОЄЄОниниииинннннни ще Я тп лить Є е 7 |МРІмМЖОМеВЕ 118 сЕМмМрИМ 0100830 т нн ни и тити жзнжж нжжжжжжджюжюжажжчажажанииеи и ча п пнеаплиИОИСИИИНИТЯ - 1 пил поро н - що
Ге! Експеримент 14
Імунізація мишей Ваїр/с білком респіраторного синціального вірусу Е і різними ад'ювантами де Мишей Ваїр/с розділяли на шість груп з п'яти мишей в кожній. Кожна група отримувала Змкг очищеного нативного білка людського респіраторного синціального вірусу (КЗМ) Е (в димерній формі). Перша група не 60 отримувала ад'ювант (білок був включеним в композицію з РВ5З); друга група отримувала 40Онг ІІ -12; третя група отримувала 5Омкл МРІ тм; четверта група отримувала МРІ тм плюс 40Онг 1-12; п'ята група отримувала 25мкг СЕ
МРІ тм; шоста група отримувала СЕ МРІ тм плюс 40Онг 1-12. Мишей імунізували підшкірно в сідничну область повним об'ємом 0,2мл, розділяючи на рівну кількість на кожну сторону від хвоста. Імунізацію проводили на 0 і 4 тиждень. бо Приклад 31
Реципрокні кінцеві точки титрування підкласів Іде у відповідь на білок анти-К5М Е
Мишей знекровлювали за день до кожної імунізації і на 13 день після остаточної імунізації. Сироватку аналізували як об'єднану від мишей в межах груп. Граничні титри підкласів дО, реципрокні до білка анти-к5М
Е, вимірювали в об'єднаній сироватці (п-5 Ваїр/с). Результати приведені в таблиці 32. Всі титри до імунізації на 0 день були нижче за 50. ю Реципрокні кінцеві точки титрування субкласів1вО у відповідь на анти КВУ нн с І Тиждень 6 В;
ІБезад'ювантй | 9332112925) 500) 2381899, 977782) 70926) ю НАЇЙ | 13557) 34421 500, 4459059) 1345099) 65951)
ІМРртМм 0000000 951У9) 855767) 8397) 3460971 492128) 10255.
ММРІЛЄІт» | 186516) 29321) 10800) 1546413) 420322| 253465)
ІСЕМРІмМ 11708358) 53608, 144576, 90754801 565403 1000459 са з |СЕ МР Пп 12 | 399050) 15788, 697941109350001 366639І ІЗВЯ27ЯСО
Приклад 32 Що
Активність СТІ. клітини селезінки
Активність СТІ (цитотоксичний Т-лімфоцит) клітини селезінки як результат імунізації білком-К5М і (Те) позначених ад'ювантів оцінювали через дві тижні після заключної імунізації. Дані представляють процент активності специфічних СТІ. клітин селезінки, культивованих міченими клітинами зараженими К5ЗУ, на ефективні о мічені клітини у відношенні 33:11. Процент специфічної активності СТІ визначали як в прикладі 24, віднімаючи «І активність СТІ незаражених мічених клітин з активності, специфічної для мічених клітин, інфікованих КМ.
Наївні клітини селезінки інфікували КМ в МОЇ 1,5 протягом двох годин як джерело іп міго стимулюючих клітин. о Відповідаючі клітини селезінки імунізованих мишей додавали до стимуляторних клітин у відношенні 5:1 і - культивували протягом шести днів. На 5 день мічені клітини (Ваір/С МНО-Н-2а клітинна лінія) інфікували К5М в
МОЇ 10 протягом двох годин і культивували протягом ночі. На 6 день інфіковані і неінфіковані мічені клітини збирали і імпульсно мітили Сг. Потім іп міго до мічених клітин додавали ефекторні клітини у відношенні Е:Т « в області від 100:1 до 3:1. Вивільнення хрому вимірювали через чотири години інкубації. Результати приведені в таблиці 33. - с «абниня 55 понести скл вв. ПИ о ие НН вип яти шия В маги:
Бажані НИ ШК НІ Б аьх кг ' стик - Активніеть СЯ; ЮИТИн селезінки. (є) Ко но тя ї се "пить рило ск пити ники 7 т ре шт н їн жо тт 7 т тя т ЕЕ та ри ; сДИко ня т в іАлювант 000 Процентактивності СТ,
Дія. онов даю й | І | ож, п ав) ЛЕ. й ШИ ній г 7 А . Е ЩІ що й
Безад'юванта 16 ю МРІЙ
Експеримент 15 65 Імунізація мишей Ваїр/с нуклеокапсидним білком вірусу грипу і різними ад'ювантами
Мишей ВаїЇр/с розділяли на шість груп з п'яти мишей в кожній. Кожна група отримувала мкг нуклеокапсидного (МР) білка вірусу грипу з штаму А/догп/307/72. |Дослідження груп| Перша група не отримувала ад'юванту (пептид був включеним в композицію з РВ5); друга група отримувала 100мкг фосфату алюмінію; третя група отримувала 5Омкл МРІ м; четверта група отримувала МРІ тм плюс 5мкг ЗМ-С5Е; п'ята група отримувала 25Мкг СЕ МР! м; шоста група отримувала СЕ МРІ тм плюс 5мкг ЗМ-СЗРЕ. Мишей імунізували підшкірно в сідничну область повним об'ємом 0,2мл. Імунізацію проводили на 0 і 4 тиждень.
Приклад 33
Активність СТІ. клітин селезінки
Активність СТІ клітин селезінки як результат імунізації МР вірусу грипу і позначених ад'ювантів оцінювали 70 через два тижні після заключної імунізації. Оцінку проводили, використовуючи процедуру прикладу 32, використовуючи пептид-імпульсно мічені клітини р815 (пептид відповідає амінокислотам 147-155 МР і має послідовність: Тиг Туг Сіп Агу Тниг Ага Аа Геи Ма! (ЗЕО ІЮО МО: 14). Включення СМ-С5Е в склади, що містять
МРІ тм або СЕ МРІ тм приводило до помітного зниження активності СТІ (дані не показані).
Бібліографія 1. Моззтапп, Т.К., еї аї., У.Іттипої., 136, 2348-2357 (1986). 2. Патент США Мо4912094.,
З. АПіегв, .О., еї аї., У.Іттипої., 158, 3947-3958 (1997). 4. 5спапоп-Кегвгеп, Т., еї а!., 9У.Іттипої., 154, 5320-5330 (1995). 5. спаїїб, Н.МУ., еї аї., У.Іттипої., 154, 4623-4629 (1995). 6. Митау, Н.МУ. апа Нагіргазнаад, ., У. Ехр. Меад., 181, 387-391 (1995). 7. Патент США Мо5571515. 8. РіпКеІтап, Р.О. апа Ноїтевз, .)., Апп. Кеу. Іттипої., 8, 303-333 (1990). 9. Зпаррег, СМ,., еї аї., 9. Ехр. Меад., 175, 1367-1371 (1992). 10. Корауазпї, М., еї аї., У. Ехр. Мед., 170, 827-845 (1989). Ге! 11. Міжнародна патентна публікація МОУУО 90/05147. о 12. Патент США Мо5078996. 13. Патент США Мо5229496. 14. Патент США Мо5073627. 15. АІдегзоп, М.К., еї а!., У. Ехр. Мед., 178, 669-674 (1993). (Се) 16. Зпаррег, СМ.., еї аї., У. Іттипої., 154, 5842-5850 (1995). 17. Патент США Мо5013548. о 18. Патент США Мо5019387. ЧІ 19. Спагрії, А., еї аі., Массіпе, 11, 1221-1228 (1993). 20. Мматшк, К.У., еї аІ., АІО5 Кез. Нит. Кеїгомігизевз, 9, 395-404 (1993). ї-оі 21. доппзоп, Р.Р., еї аї., у. Мігої., 68, 3145-3153 (1994). - 22. Ешег, О.Н., ев аіІ., АІОЗ Кезв. Нит. Кеїгомігизев. К), 1433-1441 (1994). 23. ВеггоїзкКу, 9.А., еї аї., 9. Сііп. Іпмеві., 88, 876-884 (1991). 24. Раїкег, Т.., еї аї., У.Іттипої., 142, 3612-3619 (1989). « 25. Наїї, М.К., еї аї., У.Іттипої., 145, 2677-2685 (1990). 26. Наупез, В.Р., еї аї., У.Іттипої., 151, 1646-1653 (1993). - с 27. Най, М.К,, еї аї., Ргос.Маї)!. Асад. Зсі., ОБА, 88, 9448-9452 (1991). ц 28. Вашей, .А., еї а!., АЮ, 12, 1291-1300 (1998). "» 29. Наупез, В. Р., ев аІ., АІОЗ Кез. Нит. Кеїгомігизев. 11, 211-221 (1998). 30. Патент США Мо5861243. 31. Патент США Мо5932218. -і 32. Патент США Мо5939074. б» 33. Патент США Мо5993819. 34. Патент США МобОо37135.
ЧК» 35. Опублікована заявка на Європейський патент Моб71947. о 50 36. Біааїйв, Н.Р., еї аі., У. Іттипої., 157, 462-472 (1996). 37. Рогдадог, А., еї аї., 9У.Іттипо)!., 158, 834-841 (1997). 42) 38. Айеп, Т.Н., еї аї., 9У.Іттипо)!., 160, 6062-6071 (1998). 39. МійМег, М.О., еї аї., УІттипо)ї., 147, 320-329 (1991). 40. Едап, Н.А., еї а/., 9. Мігої., 13, 5466 (1999). 41. Нап, О.К., У.Іттипої., 145, 2677-2685 (1990). 42. Патент США Мо5736361. о 43. Патент США Мо5223254. іме) 44. Міжнародна патентна публікація МоМУуО 98/20734. 45. Патент США Мо5830877. 60 46. Міжнародна патентна публікація МоОУУ/О 99/51259. 47. Міжнародна патентна публікація МОУ 99/27944. 48. Патент США Мо4666829. 49. Патент США Мо5593972. 50. Кигода, М..)., ег а!., У. Ехр. Меа., 187, 1373-1381 (1998). 65 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «110» Атегісап Суапатій Сотрапу
«120» Композиції комбінованого ад'юванту «130233482-00/РСТ «160514 «170»Раїепііп Мег.2.1 «21021 «211540 «212»РАТ 70 «213» Вірус імунодефіциту людини «40021
Ту Сп Пе Ше Авп Ме Тефосбів біб Ма сіх тв Ада Меєтук АВ. 1 х Іб 15
Оу Те Атв Ріо Азп Тує йзп Був Атв БУВ АТ Ле Ні Ле у Р
Су Ак Аа РБе Тут Те Чат Цув 35 аб «21052 с «211239 «212»РЕТ о «213» Вірус імунодефіциту людини «400252 зо ув Сх Ше Лю во Меб Тер Сів. Сів Маї Су Був Ав Меб тує дій ій
Те Ат Ріо дви ТУ Аяа Пує Ат Бух Ав Пе Мія Пе СИу Ре бі з 29 25 За | Фо зл АЖЩЕ Ай Ра Тук ТИ ТИЕ уз м «21053 ч «21129 о) с «212»РВТ "» «213» Вірус імунодефіциту мавпи " «40053 г» «21054 «21129
ФО о2Урнт 4) «213» Вірус імунодефіциту мавпи «40054 з Ва ТЕ рю Р гео У Або сь Ма о 1 8 іме) «21055 «21129 «212»РАТ «213» Вірус імунодефіциту мавпи «40055 б5
Туг Ав о рю о Вю Пе бебі бів Пв
Ї 5 «211520 «212»РАТ «213» Вірус імунодефіциту мавпи сів ваг тує Цув Тук мук Ма) Мі Туз Ме бів Рео Тед Сіу Уві Ав "7 рю Тве Га АВ. «21057 «211229 «2122 РАКТ «213» Вірус імунодефіциту мавпи «400257 сч
Дйш Сена Гук був ТУЄ Гу М Ма був Пе бій Рг Сеоз біу Маї Ав. о
Ре Тег отв Ав Сув Ти Ро Тук Аер Пе Аби бій Ме Ф т, 26 75 о «21058 « «211229 со «212»РАТ
Зо «213» Вірус імунодефіциту мавпи - , к-10058
Сію цей тує Мув ТУк ув Уві МАІ Ту ПЕ біо Рго Тез Сіу Ма! Аа. юю 1 5 їй ів 2 :» Рюю Те Був АЦа бек ТБе Руб Ре Те Ма! Аке Гей Ма 20 25 -і «21059 «211529 б «212»РВТ ї» «213» Вірус імунодефіциту мавпи о 50 «40059
Ф ФІ Гео Тух Мув Туг Гук Мі МА) ув пе ОВ Р Тет Су Ме Ав.
І 5 ЩШ 15 со Вів Те Був Ав Тук Аіа Ріо Ріо Це Вег Сбіу бін Пе 60 «210210 «211542 «212»РАТ «213» Невідомий організм «220» б5 «223» Опис невідомого організму: людський пептидний амілоїдний білок «400510
Авр Аіїа Сій Ріре Агр Ніз Авзр бег Сіу Тут Сі Маї Ніз Ніз ОСЇп Гуз
ІЗ
Теп Ма! Рбе Рпе АЇа ОСОЇш Авр Ма! СіПу оБег Авзп Суз Сіу Аа Пе Ле 20 25 30 т» Сіу Гео Меї Уа! СІу Сіу Ма! Ма! Пе Аїа 35 40 «210511 «211228 «212»РАТ «213» Невідомий організм «220» «223» Опис невідомого організму: людський пептидний амілоїдний білок «400511
Азр Аа Сіш Ре Аге Ніз Ар Бех СіІу Туг СіЇмш Маі Ніз Ніз Сіп Гув 1 5 10 15 см о
Ти Уві Ррбе РН Аа со Аве Уа! Су ес Ав ув зо 20 25 о «210512 в «211210 (Се) «212»РАТ «213» Вірус імунодефіциту людини те «400512 дв бу РЮ бу Або АФ РП Мао ТЕ (6 « 1 Ж й - » «210213 «2112510 «212»РАТ «213» Вірус імунодефіциту людини і «400513
Ф Те бу бю бу о Абф о Ав РБе о Тубо Тео Тв
РА 1 З то
Фо «210514 «21129 «212»РАТ 99 «213» Вірус грипу
ГФ) «400514 іме)

Claims (16)

Формула винаходу
1. Антигенна композиція, що містить антиген, вибраний з групи, що включає патогенні віруси, бактерії, гриби, паразитичні організми, антигени пухлинних клітин, в тому числі злоякісних, і ефективну кількість ад'ювантної комбінації з 3-О-дезацилованого монофосфорилованого ліпіду А або монофосфорилованого ліпіду А у комбінації з ЗМ-С5Е або 1І -12, що посилює імунну відповідь на вказаний антиген у хребетної тварини. бо 2. Антигенна композиція за п. 1, де вибраний антиген являє собою антиген вірусу імунодефіциту людини
(ВІЛ).
3. Антигенна композиція за п. 1, де вибраний антиген являє собою антиген вірусу імунодефіциту мавпи (ВІМ).
4. Антигенна композиція за п. 1, де вибраний антиген являє собою Меїіззегіа допоггпоеаве.
5. Антигенна композиція за оп. 71, де вибраний антиген являє собою антиген людського респіраторно-синцитіального вірусу (КМ).
6. Антигенна композиція, що містить антиген, вибраний з групи, що включає алерген або поліпептид, пептид або фрагмент амілоїдного білка і ефективну кількість ад'ювантної комбінації з 3-О-дезацилованого монофосфорилованого ліпіду А або монофосфорилованого ліпіду А у комбінації з ЗМ-С5Е або 1І/-12, що 7/0 посилює імунну відповідь на вказаний антиген у хребетної тварини.
7. Антигенна композиція за будь-яким з пп. 1 - б, яка додатково містить розріджувач або носій.
8. Застосування ефективної кількості ад'ювантної комбінації з 3-О-дезацилованого монофосфорилованого ліпіду А або монофосфорилованого ліпіду А у комбінації з 3М-С5Е або 1-12 для приготування антигенної композиції, яка містить антиген, вибраний з групи, що включає патогенні віруси, бактерії, гриби або /5 паразитичні організми, причому дана ад'ювантна комбінація посилює імунну відповідь на вказаний антиген у хребетної тварини.
9. Застосування за п. 8, де імунна відповідь визначається цитоксичними Т-лімфоцитами.
10. Застосування за п. 8 або 9, де вказаний антиген являє собою антиген ВІЛ.
11. Застосування за п. 8 або 9, де вказаний антиген являє собою антиген ВІМ.
12. Застосування за п.8 або 9, де вказаний антиген являє собою антиген Меїіззегіа допоггпоеае.
13. Застосування за п. 8 або 9, де вказаний антиген являє собою антиген К5М людини.
14. Застосування ефективної кількості ад'ювантної комбінації з 3-О-дезацилованого монофосфорилованого ліпіду А або монофосфорилованого ліпіду А у комбінації з 3М-С5Е або 1-12 для приготування антигенної композиції для лікування або профілактики раку у хребетної тварини, що містить антиген пухлинних клітин, в сч ов Тому числі злоякісних.
15. Застосування ефективної кількості ад'ювантної комбінації з 3-О-дезацилованого монофосфорилованого і) ліпіду А або монофосфорилованого ліпіду А у комбінації з 3М-С5Е або 1-12 для приготування антигенної композиції, яка містить вибраний алерген, причому дана ад'ювантна комбінація посилює здатність організму хребетного послаблювати реакцію на вказаний алерген. «о зо
16. Застосування ефективної кількості ад'ювантної комбінації з 3-О-дезацилованого монофосфорилованого ліпіду А або монофосфорилованого ліпіду А у комбінації з 3М-С5Е або 1-12 для приготування антигенної о композиції для лікування або профілактики захворювання, яке характеризується відкладенням амілоїдного білка «г в організмі хребетного хазяїна, що містить поліпептид, пептид або фрагмент амілоїдного білка або антитіло проти нього. ісе) і -
- . и? -і (о) щ» («в) 4) іме) 60 б5
UA2001128558A 1999-05-13 2000-12-05 Use of 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a or monophosphoryl lipid a in combination with gm-csf or il-12 as adjuvant combination in antigenic composition for enhancing immune response in vertebrate UA76406C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13396399P 1999-05-13 1999-05-13
PCT/US2000/013156 WO2000069456A2 (en) 1999-05-13 2000-05-12 Adjuvant combination formulations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA76406C2 true UA76406C2 (en) 2006-08-15

Family

ID=22461127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2001128558A UA76406C2 (en) 1999-05-13 2000-12-05 Use of 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a or monophosphoryl lipid a in combination with gm-csf or il-12 as adjuvant combination in antigenic composition for enhancing immune response in vertebrate

Country Status (28)

Country Link
US (2) US7611721B1 (uk)
EP (1) EP1178825B1 (uk)
JP (2) JP4974414B2 (uk)
KR (1) KR100863367B1 (uk)
CN (1) CN1192799C (uk)
AT (1) ATE516046T1 (uk)
AU (1) AU781469B2 (uk)
BG (1) BG106094A (uk)
BR (1) BR0010539A (uk)
CA (2) CA2767116A1 (uk)
CZ (1) CZ20013916A3 (uk)
EA (1) EA006233B1 (uk)
EE (1) EE200100597A (uk)
ES (1) ES2367625T3 (uk)
GE (1) GEP20053446B (uk)
HR (1) HRP20010839A2 (uk)
HU (1) HUP0201220A3 (uk)
ID (1) ID30407A (uk)
IL (2) IL146382A0 (uk)
IS (1) IS6156A (uk)
MX (1) MXPA01011499A (uk)
NO (1) NO20015523L (uk)
NZ (1) NZ515322A (uk)
PL (1) PL352312A1 (uk)
SK (1) SK16022001A3 (uk)
TR (1) TR200103266T2 (uk)
UA (1) UA76406C2 (uk)
WO (1) WO2000069456A2 (uk)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9326174D0 (en) * 1993-12-22 1994-02-23 Biocine Sclavo Mucosal adjuvant
TR200103266T2 (tr) 1999-05-13 2002-01-21 American Cyanamid Company Yardımcı kombinasyon formülasyonları
DE60117164T2 (de) 2000-11-07 2006-08-03 Immuno Vaccine Technologies Inc., Halifax Impfstoffe mit erhöhter immunantwort und verfahren zur deren herstellung
EE200300172A (et) 2000-11-10 2003-06-16 Wyeth Holdings Corporation Antigeenne kompositsioon ja adjuvantsegu
JP5731198B2 (ja) 2007-09-27 2015-06-10 イムノバクシーン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． インビボでのポリヌクレオチドの送達のための連続疎水相を含む担体におけるリポソームの使用
KR101655487B1 (ko) * 2007-10-08 2016-09-08 인트렉손 코포레이션 가공된 수지상 세포 및 암의 치료를 위한 이의 용도
JP5715051B2 (ja) 2008-06-05 2015-05-07 イムノバクシーン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． リポソーム、抗原、ポリヌクレオチド及び疎水性物質の連続相を含む担体を含む組成物
EP3187585A1 (en) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
DK2691530T3 (en) 2011-06-10 2018-05-22 Univ Oregon Health & Science CMV GLYCOPROTEIN AND RECOMBINANT VECTORS
GB201113570D0 (en) * 2011-08-05 2011-09-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US10105435B2 (en) 2011-10-06 2018-10-23 Immunovaccine Technologies Inc. Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of TLR2 and uses thereof
RU2496149C1 (ru) * 2012-06-19 2013-10-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") Способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов
WO2016210292A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
EP4049665A1 (en) 2016-03-15 2022-08-31 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5391485A (en) 1985-08-06 1995-02-21 Immunex Corporation DNAs encoding analog GM-CSF molecules displaying resistance to proteases which cleave at adjacent dibasic residues
US5078996A (en) 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US6294322B1 (en) 1988-01-26 2001-09-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Multideterminant peptides that elicit helper T-lymphocyte cytotoxic T-lymphocyte and neutralizing antibody responses against HIV-1
US5939074A (en) 1986-12-30 1999-08-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Multideterminant peptide antigens
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5013548A (en) 1987-09-08 1991-05-07 Duke University Production of antibodies to HIV
US5993819A (en) * 1987-09-08 1999-11-30 Duke University Synthetic vaccine for protection against human immunodeficiency virus infection
US5019387A (en) 1987-09-08 1991-05-28 Duke University Production of antibodies to HIV
US5223254A (en) 1987-09-29 1993-06-29 Praxis Biologics, Inc. Respiratory syncytial virus: vaccines
CA1340506C (en) * 1987-11-24 1999-04-20 Nicholas H. Carbonetti Production of gonorrheal pi proteins and vaccines
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
WO1990005147A1 (en) 1988-11-10 1990-05-17 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
DE3934366A1 (de) 1989-10-14 1991-04-18 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Vakzine zum schutz vor hiv-virusinfektionen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als diagnostikum und immuntherapeutikum
EP0526511B1 (en) * 1990-04-27 1997-05-28 MCMICHAEL, John Method and composition for treatment of central nervous systems disease states associated with abnormal amyloid beta protein
SE502569C2 (sv) * 1991-05-31 1995-11-13 British Tech Group Användning av en immunologiskt inert matris av en sterol och saponiner som kan bilda sfäriska nanopartiklar med snäv storleksfördelning som läkemedelsbärare, partiklar, komposition samt kit
DK0671947T3 (da) 1991-12-02 2000-07-24 Univ Texas Præparater til udløsning af cytotoksisk T-lymfocyt-responser mod virus
US6037135A (en) 1992-08-07 2000-03-14 Epimmune Inc. Methods for making HLA binding peptides and their uses
US5679356A (en) 1992-07-08 1997-10-21 Schering Corporation Use of GM-CSF as a vaccine adjuvant
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
HU219056B (hu) 1993-03-23 2001-02-28 Smithkline Beecham Biologicals Sa 3-O-Dezacilezett monofoszforil-lipid A-t tartalmazó vakcinakészítmény
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
US5723130A (en) 1993-05-25 1998-03-03 Hancock; Gerald E. Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus
US5830877A (en) 1993-08-26 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
EP0762895B1 (en) 1994-04-29 2002-08-07 Duke University Synthetic vaccine for protection against human immunodeficiency virus infection
AUPM543894A0 (en) 1994-05-04 1994-05-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation An adjuvant
AU3735095A (en) 1994-09-30 1996-04-26 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing a p53 derived protein or peptide, an adjuvant, and interleukin-12 and uses thereof
ES2257744T3 (es) 1994-10-05 2006-08-01 Vanderbilt University Interleuquina-12 como adyuvante para vacunas contra paramyxoviridae.
JP3958360B2 (ja) * 1995-02-24 2007-08-15 キャンタブ ファーマシューティカルズ リサーチ リミティド 免疫治療剤として役立つポリペプチド及びポリペプチド調製の方法
US6613337B1 (en) 1997-02-12 2003-09-02 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
EP0877816A1 (en) 1996-02-01 1998-11-18 North American Vaccine, Inc. Expression of group b neisseria meningitidis outer membrane (mb3) protein from yeast and vaccines
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
US5762943A (en) * 1996-05-14 1998-06-09 Ribi Immunochem Research, Inc. Methods of treating type I hypersensitivity using monophosphoryl lipid A
AU724743B2 (en) 1996-05-31 2000-09-28 Genetics Institute, Llc IL-12 as an adjuvant for Bordetella Pertussis vaccines
US6024965A (en) 1996-10-18 2000-02-15 Erasums University Rotterdam Induction of REV and TAT specific cytotoxic T-cells for prevention and treatment of human immunodeficiency virus (HIV) infection
BR9712852A (pt) * 1996-10-23 1999-11-16 Univ Pennsylvania Plasmìdeo, composição, processo de imunização de um indivìduo contra um patógeno, vacina recombinante, patógeno vivo atenuado, proteìna bl-1 substancialmente pura, vetor recombinante de expressão, e, anticorpo isolado
US6797276B1 (en) * 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US6350456B1 (en) * 1997-03-13 2002-02-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9711990D0 (en) * 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
WO1998056415A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Purified saponins as oral adjuvants
GB9712347D0 (en) * 1997-06-14 1997-08-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1006999A2 (en) 1997-07-08 2000-06-14 Chiron Corporation Use of submicron oil-in-water emulsions with dna vaccines
IS4518A (is) 1997-07-09 1999-01-10 Lyfjathroun Hf, The Icelandic Bio Pharmaceutical Group Nýtt lyfjaform fyrir bóluefni
GB9717953D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6488936B1 (en) 1998-02-12 2002-12-03 Wyeth Immunogenic composition of interleukin-12 (IL-12), alum, herpes simplex viral (HSV) antigen, and method thereof
KR20010040932A (ko) 1998-02-12 2001-05-15 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 인터루킨-12 및 호흡기 합포체 바이러스 항원을 포함하는백신
AU760549B2 (en) 1998-04-03 2003-05-15 University Of Iowa Research Foundation, The Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
GB9907860D0 (en) 1999-04-07 1999-06-02 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
TR200103266T2 (tr) 1999-05-13 2002-01-21 American Cyanamid Company Yardımcı kombinasyon formülasyonları

Also Published As

Publication number Publication date
JP5230780B2 (ja) 2013-07-10
CA2767116A1 (en) 2000-11-23
JP4974414B2 (ja) 2012-07-11
JP2012006949A (ja) 2012-01-12
US20100233117A1 (en) 2010-09-16
AU781469B2 (en) 2005-05-26
EA006233B1 (ru) 2005-10-27
KR100863367B1 (ko) 2008-10-13
US7611721B1 (en) 2009-11-03
HUP0201220A2 (en) 2002-08-28
GEP20053446B (en) 2005-02-25
MXPA01011499A (es) 2002-06-04
NZ515322A (en) 2004-03-26
WO2000069456A2 (en) 2000-11-23
EP1178825B1 (en) 2011-07-13
CA2372181A1 (en) 2000-11-23
IL146382A0 (en) 2002-07-25
JP2004504260A (ja) 2004-02-12
CA2372181C (en) 2012-04-17
IS6156A (is) 2001-11-12
CZ20013916A3 (cs) 2002-06-12
CN1354675A (zh) 2002-06-19
BR0010539A (pt) 2002-02-19
ATE516046T1 (de) 2011-07-15
HRP20010839A2 (en) 2003-02-28
WO2000069456A3 (en) 2001-02-08
ID30407A (id) 2001-11-29
KR20020001873A (ko) 2002-01-09
TR200103266T2 (tr) 2002-01-21
HUP0201220A3 (en) 2004-07-28
EP1178825A2 (en) 2002-02-13
CN1192799C (zh) 2005-03-16
IL146382A (en) 2007-07-04
NO20015523D0 (no) 2001-11-12
SK16022001A3 (sk) 2002-09-10
EA200101198A1 (ru) 2002-04-25
NO20015523L (no) 2002-01-02
ES2367625T3 (es) 2011-11-07
BG106094A (en) 2002-05-31
EE200100597A (et) 2003-02-17
AU4847300A (en) 2000-12-05
PL352312A1 (en) 2003-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8216595B2 (en) Powerful vaccine composition comprising lipopeptide and poly I:C as an adjuvant
JP4362049B2 (ja) Ｄｎａ転写ユニットの接種による免疫化
JP5230780B2 (ja) アジュバント混合製剤
US7981428B2 (en) Flu vaccines and methods of use thereof
WO1998022145A1 (en) Immunization of infants
JP5265545B2 (ja) 免疫応答を誘発または誘導する方法
KR20120131725A (ko) 고병원성 조류인플루엔자 ａ ｈ５ｎ１ 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 가금용 백신
Fairman et al. Enhanced in vivo immunogenicity of SIV vaccine candidates with cationic liposome-DNA complexes in a rhesus macaque pilot study
EP2632487A2 (en) Viral vaccine and process for preparing the same
US20090087456A1 (en) Adjuvanted vaccine
EP1250933A1 (en) Vaccines including as an adjuvant high dose type I IFN
AU675703B2 (en) Stimulation of immune response by viral protein
JP4091152B2 (ja) 金コロイドを含む核酸調製物
Rehmani et al. The influence of adjuvants on oral vaccination of chickens against Newcastle disease
Uchida et al. Application of surface-linked liposomal antigens to the development of vaccines that induce both humoral and cellular immunity
US20060110740A1 (en) Use of sendai virus as a human parainfluenza vaccine
Ishihara et al. Use of low toxicity adjuvants and killed virus to induce protective immunity against the Friend murine leukaemia retrovirus-induced disease
Morein et al. New ISCOMs meet unsettled vaccine demands
US20230390384A1 (en) Recombinant covid-19 vaccine composition comprising lipopeptide and poly (i:c) adjuvant, and use thereof
Singh et al. Immunogenicity and protective efficacy of virosome based vaccines against Newcastle disease
WO2023230479A1 (en) Combined vaccine containing infectious bronchitis virus attenuated massachusetts and recombinant lasota virus expressing arkansas spike
US20150174236A1 (en) Viral vaccine and process for preparing the same
Hsieh Approaches to enhance protection against infectious bursal disease in chickens conferred by DNA-mediated vaccination
UA79426C2 (en) Combined adjuvant compositions