KR100863367B1 - 보조제 배합 제형물 - Google Patents

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Abstract

과립구 대식세포 콜로니 자극인자 또는 인터류킨-12와 같은 시토킨 또는 림포카인과 배합된, 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 지질 A와 이의 유도체 및 동족체의 사용은 척추동물 숙주에서 선택된 항원에 대한 면역반응을 증대시키는 항원 조성물의 보조제 배합물로서 유용하다.
3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A, 모노포스포릴 지질 A, 보조제, 시토킨, 림포카인

Description

보조제 배합 제형물{ADJUVANT COMBINATION FORMULATIONS}
본 발명은 척추동물 숙주에서 선택된 항원에 대한 면역반응을 증대시키기 위한 항원 조성물내 보조제 제형물로서 시토킨 또는 림포카인, 특히 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 또는 인터류킨-12와 배합된, 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 지질 A와 이의 유도체 및 동족체의 용도에 관한 것이다.
면역체계는 병원체를 공격하기 위해 다수의 메카니즘을 사용한다. 그러나, 이러한 메카니즘이 면역화 후에 모두 활성화되는 것은 아니다. 면역화에 의해 유도되는 방어면역은 병원체에 저항하거나 병원체를 제거하기 위한 적당한 면역반응을 도출하는 백신의 능력에 따라 좌우된다. 병원체에 따라, 이는 세포-매개 및/또는 체액성 면역반응을 요할 수 있다.
면역반응에서 헬퍼 T 세포의 역할에 대한 현 패러다임은 T 세포가 이들이 생성하는 시토킨을 근거로 하여 서브세트로 분류될 수 있고, 이들 세포에서 관찰되는 독특한 시토킨 프로파일이 이들의 기능을 결정한다는 것이다. 이 T 세포 모델은 두 가지의 주요 서브세트를 포함한다: 세포성 및 체액성(항체) 면역반응을 모두 증대시키는, 인터류킨-2(IL-2)와 인터페론 감마를 생성하는 TH-1 세포; 및 체액성 면역반응을 증대시키는, 인터류킨-4, 인터류킨-5 및 인터류킨-10(각각, IL-4, IL-5 및 IL-10)을 생성하는 TH-2 세포(관계서적 목록 1).
면역화된 유기체에서 더욱 강력한 면역반응을 일으키고 항원을 지니는 제제에 대한 숙주의 내성을 증가시키기 위해 항원의 면역원성 효능을 증가시키는 것이 종종 바람직하다. 일부 상황에서, 면역반응을 우세한 체액성(TH-2) 반응에서 더욱 균형잡힌 세포성(TH-1) 및 체액성(TH-2) 반응으로 변화시키는 것이 바람직하다.
세포 반응은 CD8+ CTL(세포독성 T-림프구) 반응의 유발을 포함한다. 이러한 반응은 세포내 병원체에 대한 백신의 개발을 위해 바람직하다. 다양한 병원체에 대한 방어는 강력한 점막 반응, 고 혈청 역가, CTL의 유도 및 활발한 세포 반응을 요한다. 이러한 반응은 통상의 서브유니트 백신을 포함하는, 대부분의 항원 제제에 의해서는 제공되지 않았다. 이러한 병원체 중에는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)가 있다.
따라서, 척추동물 숙주에서 체액성 및 세포성 면역반응을 모두 유발할 수 있는 항원 조성물 제형을 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 시토킨 또는 림포카인, 특히 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF) 또는 인터류킨-12(IL-12), 또는 시토킨 또는 림포카인에 대한 작용제 또는 길항제와 배합된, 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A(MPLTM) 또는 모노포스포릴 지질 A와 이의 유도체 및 동족체를 함유하는 항원 조성물에 보조제 배합 제형물을 이용하는 것이다. 보조제는 면역원 또는 항원과 함께 투여되면 면역반응을 증대시키는 물질이다. 본 발명의 보조제 제형물은 항원 조성물 중의 선택된 항원과 함께 투여된다. 본 발명의 항원 조성물은 척추동물 숙주에서 선택된 항원에 대한 면역반응을 증대시킨다. 선택된 항원은 (1) 병원성 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충, 또는 (2) 암 세포 또는 종양 세포, 또는 (3) 알레르겐에 대한 알레르기 반응을 완화시키기 위해 IgE의 생성을 방해하도록 알레르겐, 또는 (4) 척추동물 숙주에서 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질환을 예방하거나 치료하도록 아밀로이드 베타 단백질(Aβ 단백질) 또는 그것의 펩타이드로부터 유도된 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 선택된 항원은 HIV로부터의 항원이다. 선택된 HIV 항원은 HIV 단백질, 이 단백질로부터 유도된 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, HIV 항원이 특정 펩타이드이다. 본 발명의 다른 양태에서, 선택된 항원은 임균 또는 호흡기 합포체 바이러스로부터의 항원이다.
MPLTM은 수용액으로 또는 안정화된 수중유 에멀션(안정한 에멀션 또는 SE)으로 존재할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 수중유 에멀션은 스쿠알렌, 글리세롤 및 포스파티딜 콜린을 함유한다. SE 제형물에서, MPLTM은 투여 전에 시토킨 또는 림포카인과 혼합되어 항원 조성물을 형성한다. 시토킨 또는 림포카인은 에멀션에 진입하기 위해 필요한 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 양태에서, MPLTM은 SE 형태이다. 항원 조성물은 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 시토킨 또는 림포카인의 배합물, 특히 MPLTM과 GM-CSF 또는 IL-12, 또는 시토킨 또는 림포카인에 대한 작용제 또는 길항제 배합물의 유효 보조량을 포함함으로써, (1) 척추동물 숙주의 면역반응을 도출하는 병원성 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충, 또는 (2) 척추동물 숙주에서 치료적 또는 예방적 항암 효과를 도출하는 암 세포 또는 종양 세포로부터의 암 항원 또는 종양-관련 항원, 또는 (3) 알레르겐에 대한 알레르기 반응을 완화시키기 위해 IgE의 생성을 방해하게 하는 알레르겐, 또는 (4) 척추동물 숙주에서 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질환을 예방하거나 치료하게 하는 Aβ 단백질 또는 그것의 펩타이드 중에서 선택된 항원을 함유하는 항원 조성물의 능력을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 시토킨 또는 림포카인의 배합물, 특히 MPLTM과 GM-CSF 또는 IL-12, 또는 시토킨 또는 림포카인에 대한 작용제 또는 길항제 배합물의 유효 보조량을 포함함으로써, 척추동물 숙주에서 세포독성 T 림프구를 도출하는 병원성 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충 중에서 선택된 항원을 함유하는 항원 조성물의 능력을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 CFA 또는 IFA(삼각형) 또는 MPLTM 2% 안정한 에멀션(SE) 50 ㎍(사각형)과 함께 제형된, T1SP10MN(A)(-Cys)(멀티에피토프 39 아미노산 펩타이드) 25 ㎍으로 면역화된 5 마리의 Balb/c 암컷 마우스 그룹으로 측정된 상호적인 종점 역가를 나타낸다. 마우스는 0일에 면역화되고 28일 째에 부스팅된다. 펩타이드-특이적 IgG, IgG1 및 IgG2a 역가는 ELISA에 의해 42일 째에 수집된 혈청으로 측정된다.
도 2는 SE 단독, MPLTM 단독 또는 MPLTM SE가 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 역가에 대한 GM-CSF의 보조성에 끼치는 영향을 나타낸다. 5 마리의 암컷 Balb/c 마우스 그룹이 0일에 T1SP10MN(A)(-Cys) 25 ㎍으로 면역화되고, 28일 째에 명시된 보조제 제형물로 부스팅된다. CFA 및 IFA는 1:1의 비로 수성 펩타이드로 유화된다. GM-CSF는 10 ㎍/투여량으로 사용된다. MPLTM은 수성 제형물로서 50 ㎍의 최종 농도, 또는 1% SE로 안정한 에멀션의 일부로서 25 ㎍이 마우스에 전달된다. 역가는 2차 면역화 2주 후에 측정된다. 데이타는 5 마리의 마우스로 측정된 각 역가를 나타낸다.
도 3은 바이러스 중화 분석의 결과를 나타낸다. 명시된 제형물로 0 및 28일 째에 면역화된 마우스로부터 42일 째에 취한 풀링 혈청을 희석하고(1/1600) 시험관내 AA5 세포에 첨가하기 전에 T 세포-적응 HIVMN의 희석액에 첨가한다. 배양 7일 후에, 세포 배양 상등액을 바이러스 복제의 표지로서 바이러스 역전사효소에 대해 분석한다.
도 4는 T1SP10MN(A)(-Cys) 및 다양한 보조제 제형물로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포의 증식을 나타낸다. 비장 세포가 T1SP10MN(A)(-Cys) 3.3 ㎍/㎖로 4일간 시험관내 자극된다. 결과는 자극의 부재시 도입에 대한 T1SP10MN(A)(-Cys)로의 시험관내 자극의 결과로, 표지된 티미딘 도입의 변화로 나타난다(델타 cpm).
도 5는 2차 면역화 7일 후에 마우스로부터 분리된 비장 세포의 CTL 활성을 나타낸다. 비장 세포는 GM-CSF 10 ㎍과 함께 또는 GM-CSF 없이 1% SE중 MPLTM 50 ㎍ 과 제형된 T1SP10MN(A)(-Cys) 50 ㎍으로 0 및 21일 째에 면역화된 3 마리의 Balb/c 마우스 그룹으로부터 수확된다. 세포는 7일간 HIVMN CTL 에피토프 펩타이드와 함께 배양된다. IL-2가 마지막 5일간 배양액에 첨가된다. 작동 비장 세포가 명시된 비로 HIVMN, HIVIIIB로 명명되는 또다른 계통으로 펄싱되거나 펩타이드 없이 크롬-표지된 P815 세포에 첨가된다. CTL 활성 %은 하기와 같이 계산된다:
특이적으로 방출되는 cpm - 자연 방출되는 cpm ×100
전체 최고 cpm - 자연 방출되는 cpm
"E:T"는 작동 세포 대 표적 세포의 비를 의미한다.
보조제, 시토킨 및 림포카인은 자체가 약한 면역원성인 다양한 항원에 대한 면역반응의 유발 및 프로파일을 증대시키고 조정하는 능력을 가지는 면역 조절 화합물이다. 보조제, 시토킨 및 림포카인의 적당한 선택은 보조제, 시토킨 또는 림포카인의 부재하에서는 유발되지 않을 양호한 체액성 및 세포성 면역반응을 유도할 수 있다. 특히, 보조제, 시토킨 및 림포카인은 백신내 서브유니트 및 펩타이드 항원에 대한 면역반응을 증대시키는 데 있어서 상당한 효과가 있다. 이들의 자극 활성 또한 단백질 항원에 대한 항원-특이적 면역반응의 유발에 유리하다. 강력한 점막 반응, 고 혈청 역가, CTL의 유도 및 활발한 세포 반응을 요하는 다양한 항원을 위해, 보조제 및 시토킨/림포카인 배합물이 대부분의 항원 제제에 의해서는 제공되지 않는 자극을 제공한다.
다양한 연구가 동물 모델에서 상이한 보조제 제형물을 평가하였지만, 알룸(알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트)이 인간에게 널리 사용되도록 허가받은 현재 유일한 보조제이다. 보조제의 일 그룹인 다양한 유중수 또는 수중유 배합물로 이루어진 안정한 에멀션이 이들의 면역 효능 증가력 때문에 상당한 주목을 받게 되었다. 이러한 제형물은 일반적으로 주사 부위에 항원을 안정화시키고 유지하도록 작용하는, 물질대사가능하거나 불활성인 오일의 다양한 배합으로 이루어진다. 이러한 보조제는 미네럴 오일, 물 및 유화제를 포함하는, 불완전한 프로인트 보조제(IFA)이다. 완전한 프로인트 보조제(CFA)는 IFA와 열-사멸 미코박테리아이다. 이러한 유형의 보조제 사용에서 특정 관심사는 종종 육아종성 병변을 초래하는 단핵세포 침윤의 결과인, 주사 부위-관련 자극이었다. 따라서, 다른 화합물 및 제형물이 잠재적인 보조제로서 연구되어 왔다.
이러한 화합물은 Ribi ImmunoChem Research Inc.(Hamilton, MT)로부터 시판되는, 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A(MPLTM)이다. MPLTM은 본원에 참조로 인용되는, U.S. 특허 제4,912,094호(2)에 설명되어 있다.
최근에, Ribi ImmunoChem Research Inc.는 MPLTM과 배합되면, MPLTM SE로 명명되는 안정화된 에멀션의 형성을 초래하는, 물질대사가능한 수중유 제형물을 제형하였다. 안정화된 에멀션은 스쿠알렌 오일, 글리세롤 및 포스파티딜 콜린으로의 MPLTM의 마이크로유동화를 통해 생성된다. 현재의 제형물은 GMP-특성 마이크로유동화 에멀션이다. 1 또는 2% 오일을 함유하는 에멀션이 하기 실험에 설명되어 있다.
MPLTM SE는 Balb/c 마우스에 피하로 또는 근육내로 투여되었을 때 식별가능한 주사-부위 관련 조직 병리학을 초래하지 않는다. 동일한 성분을 함유하지만, MPLTM은 함유하지 않는 안정화된 에멀션 또한 비교 목적으로 생성되었다. 특히, 보조제 MPLTM SE 및 GM-CSF와 배합되어 제형된, 40개 아미노산의 HIV 펩타이드 T1SP10MN(A)(+Cys) 또는 시스테인-결실된 39개 아미노산의 펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys) 펩타이드(40개 아미노산 펩타이드(+Cys)의 아미노산 17번에서 시스테인 잔기가 결실)로의 피하 또는 근육내 면역화는 면역화 2주 후에 식별가능한 세포 침윤 또는 조직 이상을 초래하지 않았다.
또한 U.S. 특허 제4,912,094호(2)에 설명되어 있는, MPLTM의 전구체 형태인 모노포스포릴 지질 A의 사용 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 추가로 MPLTM의 유도체 및 동족체와 모노포스포릴 지질 A도 본 발명의 범위 내에 있다.
시토킨 및 림포카인의 백신 제형물로의 도입은 백신 잠재력의 증가 및 증대를 위한 가망성을 보였다(3). 시토킨 인터류킨-12(IL-12)는 T 헬퍼 세포 서브세트 증가의 Th1 시토킨 프로파일(즉, 마우스 모델에서 IgG2 서브클래스에 대한)로의 변동을 통해, 세포 매개 면역을 유발하고 증대시키는 것으로 입증되었다(4-6). 마우스에서, 재조합 쥐 IL-12는 Th1 우세 면역반응 프로파일을 증대시키는 것으로 나타났다(3).
IL-12는 다양한 항원-부가 세포, 주로 대식세포 및 단핵세포에 의해 생성된 다. 이는 나이브(naive) T-세포로부터 TH1 세포의 유도에서 중요한 요소이다. IL-12의 생성 또는 이에 반응하는 능력은, 예를 들면 기생충 감염, 가장 두드러지게는 레이슈마니아증에서, 방어 TH1-유사 반응의 전개에서 중요한 것으로 보인다(7). IL-12의 효과는 대부분 NK 세포 및 T 헬퍼 세포에 의해 생성된 인터페론-감마에 의해 매개된다. 인터페론-감마는 T-의존성 단백질 항원에 대한 IgG2a 항체(8) 및 T-독립성 항원에 대한 IgG3 반응(9)의 유도를 위해 중요하다. 원래 천연 살세포 자극인자라고 불리는, IL-12는 헤테로이량체 시토킨이다(10). 재조합 숙주세포에서 IL-12 단백질의 발현 및 분리는 공개 국제 특허 출원 WO90/05147(11)에 설명되어 있다.
보조제로서의 잠재적인 가망성을 보유하는 또다른 시토킨은 GM-CSF이다. GM-CSF는 콜로니 자극인자(CSF)의 특정 유형이다. CSF는 특정 유형의 성숙한 혈액세포로 분화되는 골수에서 발견되는 선조 세포를 유도하는 림포카인 부류이다. 본원에 참조로 인용되는 U.S. 특허 제5,078,996호(12)에 설명되어 있는 것처럼, GM-CSF는 비-특이적 종양 활성을 매개하기 위해 대식세포 또는 전구체 단핵세포를 활성화한다. 인간 GM-CSF 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 설명되었다(12). GM-CSF cDNA를 함유하는 플라스미드는 대장균에 형질전환되고 수탁번호 39900으로, American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209에 기탁되었다. 본원에 참조로 인용되는, U.S. 특허 제5,229,496호(13)에 설명되어 있는 것처럼, GM-CSF 유전자 또한 효모 발현 플라스미드로 삽입되어 수탁번호 53157로, ATCC에 기탁되었다. 추가로, 본원에 참조로 인 용되는 U.S. 특허 제5,073,627호(14)에 설명되어 있는 것처럼, 글리코실화 부위가 제거된 GM-CSF를 암호화하는 DNA 서열은 수탁번호 67231로, ATCC에 기탁되었다.
GM-CSF는 면역반응을 증대시키는 것으로 알려진 항원 부가 세포 상에서 단백질 분자를 상향조절하고(15), 분류-정제된 쥐 B 세포에서 Ig 분비에 영향을 끼치는(16) 것으로 나타났다.
인터류킨 1-알파, 1-베타, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 및 18, 인터페론-알파, 베타 및 감마, 과립구 콜로니 자극인자 및 종양 괴사인자 알파 및 베타를 포함하는(이에 한정되지 않음), 다른 시토킨 또는 림포카인이 면역 조절 활성을 가지는 것으로 나타났다.
시토킨 또는 림포카인의 전신 투여와 관련있는 관심사는 시토킨 또는 림포카인 활성과 관련있는 생물학적 결과이다. 아울러, 항원-특이적 면역반응의 전개와 관련있는 시토킨 또는 림포카인 효과는 시토킨 또는 림포카인의 국소 농도가 유지되면 증대되어야 한다.
선행 연구에서는, GM-CSF 및 IL-12가 개별적으로 평가되었는데; 다양한 면역반응 파라미터의 증대가 관찰되었다.
본원에 설명된 발명은 항원, 선택된 시토킨 또는 림포카인 보조제 및 제 2 보조제인 MPLTM의 배합을 통해(바람직하게는 안정한 물질대사가능한 에멀션), 항원에 대해 특이적인 면역반응이 증대됨을 입증한다.
본 발명의 항원 조성물에 포함되는 선택된 항원은 다음 중 임의의 단백질로 부터 유도된 펩타이드 또는 폴리펩타이드와, 단편을 포함한다: 사카라이드, 단백질, 폴리- 또는 올리고뉴클레오타이드, 또는 다른 대식세포 성분. 본원에 사용된 것처럼, "펩타이드"는 일련의 적어도 6 개의 아미노산을 포함하고 적어도 하나의 항원 결정기를 함유하며, 반면 "폴리펩타이드"는 펩타이드보다 더 긴 분자이지만, 전체-길이의 단백질을 구성하지는 않는다. 본원에 사용된 것처럼, "단편"은 일부를 포함하지만, 모든 사카라이드, 단백질, 폴리- 또는 올리고뉴클레오타이드, 또는 다른 대식세포보다 적은 일부를 포함한다. HIV의 경우에, 본 발명의 항원 조성물은 추가로 전체-길이의 HIV 단백질을 포함한다.
본 발명은 HIV로부터 유도된 펩타이드 항원을 사용하는 모델 시스템으로 예시된다. 이러한 펩타이드는 본원에 참조로 인용되는, U.S. 특허 제5,013,548호(17) 및 제5,019,387호(18)에 설명되어 있거나 이로부터 유도되고 본 발명에 이르러 요약되었다. 이러한 펩타이드는 중화 항체 및 T 세포 반응이 유발되는 HIV 엔벌로프(envelop) 단백질의 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
HIV는 후천성 면역결핍증(AIDS)의 원인이 되는 제제인 인간 레트로바이러스이다. HIV는 T 림프구 표면의 CD4(T4) 분자에 외부 엔벌로프 당단백질을 접합시켜, T 세포에 진입하여 감염시키기 위한 수용체로서 CD4(T4) 분자를 사용함으로써 면역계의 T 림프구를 감염시킨다. 면역화를 통해 HIV-감염에 특이적인 방어 면역반응을 유도하고자 하는 매우 제한적인 성공으로 시행되었다. 다수의 접근법이 효과적이고 방어적인 백신 전략을 결정하기 위해 현재 수행되고 있다. 이들은 HIV(19), 재조합 아데노바이러스(20) 또는 백시니아 바이러스 벡터(21), DNA 백신(22) 및 HIV의 다 양한 T 및 B 세포 에피토프를 포함하는 합성 펩타이드(23)로부터 항원 에피토프를 발현하는 약독화 및 재조합 박테리아 벡터의 사용을 포함한다.
HIV 외부 엔벌로프 당단백질 gp120은 인간에서 중화 항체를 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 전체 gp120 분자의 대략 1/3을 암호화하는, 재조합 단백질 PB1은 중화 항체의 형성을 유도하는 엔벌로프 단백질의 일부를 포함하는 것으로 나타났다. 그러나, 침팬지로의 연구가 온전한 gp120 또는 PB1은 고 역가의 중화 항체 생성을 유도할 수 없음을 입증하였다.
gp120의 항원 결정기에 상응하는 짧은 펩타이드가 통상의 방법으로 합성되고 바이러스를 중화하고 T-헬퍼를 유도하는 gp120에 대한 항체 반응 및 바이러스에 대한 CTL 반응을 유발한다.
이러한 펩타이드는 T1SP10MN(A)(+Cys)라고 명명되는 C4/V3 멀티에피토프-함유 HIV-1MN 펩타이드 및 시스테인-결실 변이체 T1SP10MN(A)(-Cys)이다. 이러한 펩타이드는 Th, TCTL 및 B 에피토프를 포함하지만, CD4 결합을 방해하는 항체는 유도하지 않는다. 이미, 이러한 C4/V3 HIV 펩타이드가 CFA 또는 CFA-유사 보조제와 함께 투여되었을 때 면역반응의 유도를 위한 유망한 후보임이 입증되었다(24-25). 이러한 펩타이드는 마우스와 인간 모두에게 CD4+ Th 세포 반응을 일으키는 것으로 이미 알려진 에피토프를 포함하고, 이는 HLA B7+인 Balb/c 마우스와 인간 모두에세 CD8+ CTL에 의해 인식되는 주요 중화 결정기 및 부위를 모두 포함한다. 39개의 아미노산 펩타이드는 최근에 HIV-감염 환자로 면역원성과 안정성을 모두 입증하였다(28).
T1SP10MN(A)(+Cys)는 40개 아미노산의 하기 서열을 가진다:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met
Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile
His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(서열번호 1)(26).
T1SP10MN(A)(-Cys)는 17 위치에 시스테인 없이 합성되었고 39개 아미노산의 하기 서열을 가진다:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met
Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His
Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(서열번호 2).
이 시스테인 잔기는 Th 세포, CTL 또는 B 세포에 의해 인식되는 기능성 에피토프의 외측에 위치한다. 바이러스 게놈의 다양한 영역으로부터의 다른 HIV 펩타이드는 또한 본원에 참조로 인용되는, U.S. 특허 제5,861,243호(30), U.S. 특허 제5,932,218호(31), U.S. 특허 제5,939,074호(32), U.S. 특허 제5,993,819호(33), U.S. 특허 제6,037,135호(34) 및 공개 유럽 특허 출원 제671,947호(35)에 설명되어 있다.
HIV 항원은 단백질, 이 단백질로부터 유도된 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편일 수 있다. 단백질은 gp41, gp120 또는 gp160과 같은 당단백질일 수 있다. 이와 달리, 단백질은 gag, pol, vif, rev, vpr, tat, nef 또는 env와 같은 유전자에 의해 암호화되는 단백질일 수 있다. 이러한 단백질로부터 유도된 펩타이드는 적어도 하나의 항원 결정기(에피토프)를 포함하고 적어도 6개 아미노산의 길이일 것이 다.
HIV 펩타이드에 대한 면역반응은 펩타이드를 약학적으로 허용가능한 담체 분자에 공유결합(접합)시킴으로써 증대될 수 있다. 적당한 담체 분자의 예는 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 HIV gp120 당단백질의 T 세포 에피토프에 상응하는 다른 펩타이드를 포함한다.
HIV에 대한 성공적인 백신 전략은 HIV에 대한 점막 면역 및 양호한 CTL 반응을 도출할 필요가 있을 것이라고 현재 감지되고 있다. T1SP10MN(A) 멀티-에피토프 펩타이드 및 점막 보조제, 콜레라 독소를 사용하는 최근의 쥐 연구에서, 비강내 면역화가 중화 혈청 IgG1 항체를 유도함이 나타났다(36). HIV-V3 루프 펩타이드를 사용하는 후속 연구 또한 점막 합성된 IgA 항체 및 펩타이드-특이적 CTL을 포함하는, 강력한 세포 매개 반응의 유도를 입증하였다(37). HIV-감염된 개체의 예방 또는 안정화에서 고 역가의 전신성 및 중화 항체의 기능적인 역할은 알려져 있지 않지만, 고 역가의 바이러스-특이적 항체는 바이러스 확산 방지에 중요하다고 생각된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, MPLTM을 함유하는 안정한 수중유 에멀션이 제형된 다음, 시토킨 IL-12 또는 GM-CSF와 혼합된다. 하기에 제시된 데이타는 이러한 배합이 고 역가의 HIV-중화 혈청 항체를 초래함을 입증한다. MPLTM SE와 GM-CSF의 배합은 면역화된 암컷 마우스의 질구개에서 고 역가의 항원-특이적 IgG 및 IgA 항체를 유도한다. MPLTM SE 및 GM-CSF와 함께 제형된 T1SP10MN(A) 펩타이드로의 마우스의 면역화는 증가된 항원 특이적 세포 증식 및 시토킨의 배양액으로의 분비와, 펩타이드-특이적 CTL 반응의 유도에 의해 측정되는 것처럼 강력한 세포성 면역반응을 유도한다.
일반적으로, GM-CSF 또는 IL-12 및 선택된 단백질 또는 펩타이드와 배합된 MPLTM 또는 MPLTM SE의 항원/보조제 제형물은 고 역가의 항원-특이적 및 바이러스 중화 항체, IgG 서브클래스 비의 완전한-고정 IgG 항체의 더 큰 비율로의 상당한 변동(마우스에서 IgG2a를 위해), 시험관내 항원 자극에 대해 반응하여 단핵세포로부터의 시토킨의 생성 및 세포 증식의 증가를 유도한다. 이러한 성질은 GM-CSF 또는 IL-12와 함께 또는 없이, MPLTM의 부재하에 항원과 SE의 제형물로는 관찰되지 않는다. 본 발명의 제형물은 또한 CTL의 유도를 통해 측정되는 것처럼 양호한 세포 반응을 유도한다.
MPLTM SE의 이점은 제형물이 주사 부위에 육아종 축적 및 염증을 유도하지 않는다는 것이고; 이러한 주사 부위 반응은 통상적으로 유중수 또는 수중유 보조제 제형물에 의해 유도된다.
국소적 육아종성 염증의 부재하에 GM-CSF 또는 IL-12와 배합된 MPLTM의 자극 효과를 통해 증대된 면역반응을 유도하는 능력은 HIV의 치료를 위해 현재 제안된 다른 보조제 제형물로는 보고되지 않았다.
MPLTM(SE와 함께 또는 SE 없이)과 GM-CSF 또는 IL-12를 개별적으로 MPLTM, SE, GM-CSF, IL-12 또는 CFA/IFA 각각과, 또는 HIV 펩타이드와 함께 비교하기 위한 일련의 연구가 수행되었다. 결과의 요약은 하기의 더욱 상세한 설명으로 이제 제시될 것이다.
첫번째 실험에서, MPLTM SE 및 GM-CSF와 함께 제형된, C4/V3 HIV 펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys)로 피하 면역화된 Balb/c 마우스는 단지 2회 주사 후에 107 이상의 혈청 IgG 역가를 초래하였다. 항체 반응은 HIV-중화이고, IgG1, IgG2a 및 IgG2b 펩타이드-특이적 항체 역가의 상당한 증가를 보인다. 배양액에서 펩타이드로 자극된 비장 세포는 상승된 수준의 IL-4, IL-5 및 인터페론-감마를 분비한다. 총괄하여, 이러한 발견은 균형잡힌 Th1/Th2형 반응 유도의 지표이다. MPLTM SE 및 GM-CSF로 면역화된 마우스의 질 세척액에서 T1SP10MN(A)(-Cys)에 대해 특이적인 IgG 및 IgA 항체가 생성되었다. 이러한 발견은 MPLTM SE 및 GM-CSF와 HIV-펩타이드 항원의 배합이 알맞은 면역반응 프로파일의 유도를 초래함을 의미한다.
이 첫번째 실험에서, HIV-펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys) 및 SE-함유 보조제 제형물, 또는 GM-CSF로 면역화된 Balb/c 마우스는 펩타이드 특이적 IgG 항체 역가를 초래하였다(표 1). 스쿠알렌, 글리세롤 및 유화제(포스파티딜 콜린)로 구성된 수중유 안정한 에멀션(SE)은 T1SP10MN(A)(-Cys)와 혼합되면 펩타이드-특이적 IgG 역가를 증가시키는 능력을 보인다. SE와 함께 제형된 T1SP10MN(A)(-Cys) 25 ㎍으로의 면역화를 통해 유도된 IgG 역가는 펩타이드와 CFA로 면역화되고, IFA 중의 펩타이드로 부스팅된 마우스에서 유도된 역가의 대략 1/5인 2차 반응 역가를 유도한다. CFA/IFA 제형된 백신의 수용자는 일상적으로 1차 면역화에 반응하여 T1SP10MN(A)(-Cys)-특이적 IgG 역가를 초래한다. 비교 목적으로, 마우스를 T1SP10MN(A)(-Cys) 펩타이드 25 ㎍ 단독으로 면역화한다.
MPLTM의 수성 및 SE 제형물을 프로인트 보조제 또는 시토킨 IL-12 및 GM-CSF로의 마우스의 면역화를 통해 유도된 반응과 비교한다. IL-12와 혼합된 T1SP10MN(A)(-Cys)의 수용자는 일반적으로 수차례 반복 연구에서 펩타이드-특이적 항체 역가를 초래하지 않았다. 반대로, GM-CSF 또는 MPLTM SE와 T1SP10MN(A)(-Cys)의 수용자는 낮지만, 용이하게 검출가능한 IgG 항체 역가를 초래하였다. MPLTM SE와 T1SP10MN(A)(-Cys) 펩타이드를 함유하는 제형물에 IL-12 또는 GM-CSF의 첨가는 면역화에 대해 반응하여 IgG의 상당한 고 역가를 유도하였다. 실제로, 배합된 MPLTM SE 및 GM-CSF로의 마우스의 면역화는 시험된 다른 제형물로 면역화된 마우스로부터 측정된 역가보다 일관되게 더 큰 2차 반응 역가를 초래하였다. 펩타이드-특이적 IgG 역가는 프로인트 보조제와 함께 제형된 T1SP10MN(A)(-Cys) 125 ㎍으로 면역화된 마우스의 역가보다 크다.
HIV-특이적 면역반응의 목적하는 특징은 세포성 및 체액성 성분 간의 균형이다. 특정 면역글로불린 동종형 서브클래스는 T 헬퍼 세포 서브세트 유형의 Th1 또는 Th2 우세로의 비대칭과 상관관계가 있다. 이들 T 헬퍼 세포 서브세트가 각각 분비하는 시토킨은 IgG 서브클래스 전환을 유도하는 활성을 보였다. IgG 서브클래스 종점 역가는 2차 면역화 2주 후에 수집된 풀링 혈청으로 측정된다(표 2). T1SP10MN(A)(-Cys) 단독 또는 GM-CSF 또는 IL-12와 함께 제형된 T1SP10MN(A)(-Cys)로의 마우스의 면역화는 수차례 반복 연구에서 0 또는 낮은 IgG 서브클래스 역가를 초래하였다. IgG3 항체는 ELISA에 의해 검출될 수 없다. CFA로 유화된 T1SP10MN(A)(-Cys)로 면역화되고 IFA로 부스팅된 마우스 그룹은 T1SP10MN(A)(-Cys)에 대해 특이적인 IgG1 항체 반응을 주로 유발한다. 펩타이드의 SE, MPLTM SE, MPLTM SE와 IL-12 또는 MPLTM SE와 GM-CSF와의 제형물 또한 고 역가의 IgG1 항체를 초래하였다. SE-제형된 백신의 수용자는 반복하여 상당한 IgG1 역가를 보였지만, 상당한 IgG2a 또는 IgG2b 역가는 보이지 않는다. MPLTM의 SE 제형물로의 도입은 증가된 IgG2a 및 IgG2b T1SP10MN(A)(-Cys)-특이적 항체 역가를 초래한다. MPLTM SE 및 T1SP10MN(A)(-Cys)와 함께 IL-12 또는 GM-CSF의 도입은 IgG1:IgG2a 항체 역가 비의 변동을 초래한다. 시토킨 없이, MPLTM SE 제형된 백신은 IgG1과 IgG2a의 유사한 역가를 유도하였다. IL-12와 GM-CSF는 모두 펩타이드-특이적 IgG2a의 상대적인 혈청 농도를 증가시킨다. 게다가, MPLTM SE와 GM-CSF의 배합은 또한 T1SP10MN(A)(-Cys)에 대해 특이적인 IgG2b 항체 역가의 상당한 증가를 유도하였다(MPLTM SE와 비교하여 47배 및 SE와 비교하여 74배). T1SP10MN(A)(-Cys) 펩타이드와 함께 MPLTM SE 및 GM-CSF로 면역화된 마우스에서 초래된 역가가 일관되게 임의의 백신 수용자 그룹 중에서 가장 높다.
T1SP10MN(A)(-Cys), MPLTM SE 및 GM-CSF로 면역화된 마우스로부터의 풀링 혈청으로 측정된 고 역가가 그룹 내의 각 마우스의 대표인지를 결정하기 위해, 그 그룹 내의 각 마우스의 역가를 프로인트 보조제 제형된 펩타이드로 면역화된 마우스의 역가와 비교한다(도 1). IgG, IgG1 및 IgG2a에 대한 각 혈청 역가의 평균은 혈청 풀로 측정된 역가와 유사함이 판명되었다(데이타 비도시). T1SP10MN(A)(-Cys)의 MPLTM SE 및 GM-CSF와의 동시-제형이 CFA/IFA로 면역화된 마우스에서 유도된 역가보다 상당히 큰 IgG, IgG1 및 IgG2a의 역가를 초래한다. MPLTM SE 및 GM-CSF 제형된 펩타이드로 면역화된 모든 마우스는 CFA/IFA 제형물로 면역화된 마우스로 측정된 역가보다 큰 역가의 IgG 항체를 초래하였다. 이러한 결과는 MPLTM SE와 GM-CSF의 배합이 펩타이드-특이적 항체의 고 역가에 의해 결정되는 것처럼 알맞은 항체 반응 프로파일 및 알맞은 IgG 서브클래스 분포를 초래함을 나타낸다. 이러한 제형물은 일상적으로 사용된 임의의 백신 제형물의 최고 T1SP10MN(A)(-Cys)-특이적 역가를 유도한다.
보조제 보강제로서의 GM-CSF 효과를 측정하기 위해, 수성 MPLTM, SE 또는 MPLTM SE와 함께 제형된 GM-CSF로 면역화된 마우스의 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 역가를 비교한다(도 2). 결과는 이 특정 양태에서 MPLTM SE의 GM-CSF 및 펩타이드와의 배합이 고 역가 항체의 유도에 있어서 특이함을 설명해준다. MPLTM과 GM-CSF는 CFA/IFA와 비교되는 역가를 도출한다. 따라서, MPLTM과 GM-CSF의 보조 성질은 MPLTM이 수성 형태이거나 안정한 에멀션으로 존재하여 함께 제형되면 상승효과가 있는 것 같다.
이어서, T1SP10MN(A)(-Cys)-특이적 항체 역가를 2차 면역화 4주 후에 마우스로부터 수득한 풀링 질 세척액으로 측정한다(표 3). MPLTM SE와 GM-CSF로 면역화된 마우스는 고 역가의 IgA 및 IgG 항체를 모두 초래한다. 다른 제형물로 면역화된 마우스로부터 수득된 질 세척액의 항체 역가는 일상적으로 검출되지 않는다. 질 세척액의 IgG 대 IgA의 비가 IgG를 장려하고, sIgA가 측정되지 않기 때문에, 질 세척액에서 검출되는 IgA 항체가 점막 조직에서 국소적으로 합성된다고는 결론내릴 수 없다. 실제로, 검출된 IgA 및 IgG 역가는 질 점막 말단에 위치하는 혈장 세포로부터 분비된 스며나오는 면역글루불린의 결과인 것 같다.
이러한 결과는 IL-12 또는 GM-CSF와 배합된 MPLTM SE와 함께 제형된, HIV-펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys)로 면역화된 마우스가 고 역가의 펩타이드-특이적 혈청 항체를 가짐을 나타낸다.
이러한 항체 역가가 기능적으로 효과적인지를 평가하기 위해, 혈청을 HIV의 실험실 적응된 계통으로 시험관내 세포의 감염을 억제하는 능력에 대해 분석한다. 평가는 적당한 HIV 계통으로 감염된 세포로부터의 배양 상등액으로 흐르는 바이러 스의 역전사효소 활성을 측정한다. MPLTM SE와 GM-CSF, 또는 MPLTM SE와 IL-12로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 모두 바이러스 감염성을 상당히 감소시켰다(도 3). 최고 바이러스 역전사효소 단위는 9,481 내지 10,411의 범위이다. 이 제형물로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 바이러스 복제를 억제한다. 단지 1/20의 바이러스 희석으로도, T1SP10MN(A)(-Cys)와 함께 MPLTM SE 및 GM-CSF로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 바이러스 복제를 대략 50% 억제한다. 이 제형물의 경우 혈청 중화 역가는 MPLTM SE, IL-12 및 HIV 펩타이드 제형물로 면역화된 마우스로부터 수득된 혈청의 71과 비교하여 1600 이상인 것으로 측정되었다.
마우스 그룹으로부터의 혈청 항-T1SP10MN(A)(-Cys) 역가는 CFA 및 IFA로의 마우스의 면역화를 통해 도출되는 역가와 유사하다(다소 높다). CFA/IFA로 유화된 T1SP10MN(A)(-Cys)로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 이 분석에서 HIV-중화를 보이지 않았다. 펩타이드 및 보조제로서 MPLTM SE와 GM-CSF의 배합물로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 다른 혈청보다 큰 중화 활성을 보인다. 등가의 희석으로, MPLTM SE와 GM-CSF 및 HIV 펩타이드로 면역화된 마우스로부터의 혈청은 다른 백신 제형물의 수용자로부터의 혈청보다 높은 바이러스 농도를 중화시킨다.
이어서 배양액내 HIV 펩타이드-특이적 비장 세포 증식이 측정되었다. T1SP10MN(A)(-Cys)에 대한 세포 반응성의 측정으로, 비장 세포를 펩타이드 또는 대 조 단백질과 함께 시험관내 배양한다. 이 분석은 분열하는 세포의 DNA에 도입된 3H-티미딘을 측정한다(표 4). 보조제 없이 면역화된 마우스로부터의 비장 세포와 달리, SE와 함께 제형된 T1SP10MN(A)(-Cys)로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포는 펩타이드에 반응하여 활발히 증식한다. 백신 수용자로부터의 비장 세포는 배양액에서 무관한 항원(라이소자임)과는 반응하지 않거나 항원 자극도 없었다. 모든 그룹이 유사분열물질 ConA로의 자극에 유사하게 반응한다. 대부분의 그룹에서, 항원-특이적 투여량 의존성 증식 반응의 지표가 있다. 펩타이드의 모든 3 가지 투여량으로, 최고 증식 정도는 MPLTM SE와 함께 동시-제형된 GM-CSF로 면역화된 마우스 그룹에서 측정되었다. 최저 증식 반응은 CFA/IFA, 또는 IL-12와 HIV-펩타이드 제형된 백신으로 면역화된 마우스 그룹의 비장 세포로 측정되었다. 펩타이드 및 SE 또는 GM-CSF로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포는 배양액에서 유사한 수준의 티미딘을 도입하였다. 이러한 결과는 GM-CSF와 함께 HIV 펩타이드의 MPLTM SE와의 동시-제형이 항원의 시험관내 부가에 반응하여 증식의 최고 잠재력을 가지는 쥐 비장 세포를 제공함을 나타낸다.
배양된 비장 세포를, 시토킨 IL-4(표 5) 및 인터페론-감마(표 6)를 배양 상등액으로 분비하는 이들의 잠재력에 대해 시험한다. 이러한 시토킨은 항원 또는 유사분열물질로의 시험관내 자극 3일 및 6일 후에 수확된 배양 상등액에서 측정된다. IL-4(T 헬퍼 2형 관련 시토킨)의 측정은 모든 그룹이 3일 째에 유사분열물질 ConA 로의 자극에 반응하여 검출가능한 수준을 초래하지만, MPLTM SE, 또는 MPLTM SE와 GM-CSF로 면역화된 마우스만이 펩타이드 자극에 반응하여 IL-4를 생성함을 나타낸다. MPLTM SE와 GM-CSF 및 T1SP10MN(A)(-Cys)로 면역화된 마우스만이 배양액으로 비장 세포를 자극하는 데 사용된 펩타이드의 모든 투여량으로 IL-4를 검출가능한 수준으로 분비한다. 배양 6일 째에, MPLTM SE와 GM-CSF와 함께 펩타이드로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포는 MPLTM SE, MPLTM SE와 IL-12, 또는 SE와 함께 펩타이드로 면역화된 마우스로부터 검출된 수준보다 높은 수준으로 IL-4를 분비한다. IL-4의 수준은 배양액에서 이러한 세포의 ConA로의 자극을 통해 유도되는 수준보다 훨씬 높다. MPLTM SE와 GM-CSF로 면역화된 마우스로부터 배양된 비장 세포 또한 T1SP10MN(A)(-Cys)로의 자극에 반응하여 6일 째에 검출가능한 수준으로 IL-5(또다른 T 헬퍼 2형 시토킨(비도시))를 배양액으로 분비한다. 다른 그룹으로부터의 비장 세포는 이들 배양액에서 검출가능한 IL-5를 생성하지 않았다.
배양액에서 ConA로의 자극에 반응하여 3일 째에, 모든 마우스 그룹으로부터의 비장 세포가 배양액으로 검출가능한 수준의 인터페론-감마를 분비한다(표 6). MPLTM SE 또는 MPLTM SE와 GM-CSF로 면역화된 마우스로부터의 세포만이 HIV 펩타이드로의 자극에 반응하여 3일 째에 검출가능한 인터페론-감마를 생성하였다. 배양액 자극 6일 후반에, 더욱 고농도의 인터페론-감마가 ConA와 펩타이드 모두에 반응하 여 관찰되었다. 관심사는 MPLTM SE, 또는 MPLTM SE와 GM-CSF로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포의 배양 상등액으로 측정된 인터페론-감마 수준이다. 두 수용자 그룹으로부터의 비장 세포는 배양 상등액으로 MPLTM SE와 IL-12, 또는 SE와 함께 펩타이드로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포보다 현저하게 높은 농도의 인터페론-감마를 분비한다.
첫번째 실험의 결과는 안정한 수중유 에멀션에 MPLTM을 도입한 다음, 에멀션을 HIV 펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys) 및 GM-CSF와 배합하면, 중화 항체의 유도를 초래함을 나타낸다. 게다가, GM-CSF의 MPLTM SE 및 백신 항원과의 동시-제형이 배양 상등액으로 분비되는 IL-4, IL-5 및 인터페론-감마의 증가된 수준 및 배양액에서 면역화 항원으로 자극된 비장 세포 증식 반응의 증대를 초래한다. 이 제형은 또한 조사되는 백신 제형물의 최고 IgG, IgG2a 및 IgG2b 역가를 유도한다. 펩타이드와 함께 MPLTM SE와 GM-CSF의 배합물로 면역화된 마우스 그룹만이 수차례 반복 연구에서 일관되게 질 세척액의 검출가능한 IgG 및 IgA 역가를 가진다. MPLTM SE, IL-12 및 펩타이드의 배합물 또한 증가된 수준의 IgG1 및 IgG2a 역가, 증가된 바이러스 중화, 증가된 비장 세포 증식 및 IL-4와 인터페론-감마의 분비를 초래한다.
HIV 펩타이드와 함께 제형된 단독 보조제로의 마우스의 면역화는 중화 항체를 도출하는 성질로 면역반응을 유발하지 않았다.
수성 제형물로 MPLTM SE 또는 MPLTM과 함께, T1SP10MN(A)(-Cys)로의 마우스의 면역화는 양호한 역가의 항체를 유도함이 종종 관찰된다. 그러나, 이러한 제형물은 일관되게 질 항체 역가, 중화 항체 역가를 가지는 면역반응(또는 실험 8에서 하기에 설명된 것처럼 강력한 CTL 반응)을 유도하지 않는다. 때때로, 펩타이드와 배합된 MPLTM 또는 MPLTM SE는 질 세척액에서 IgA 및 IgG의 측정가능한 역가를 유도한다. 일부 연구에서, 백신 제형물내 MPLTM에 IL-12, 또는 GM-CSF의 첨가는 CFA/IFA, 또는 시토킨과 함께 또는 시토킨 없이 MPLTM SE 제형물로 면역화된 마우스에서 초래되는 역가와 유사한 역가를 초래한다. 이 관찰은 MPLTM의 SE 형태가 HIV-펩타이드에 대해 특이적인 고 역가 항혈청을 위해 필요하지 않음을 설명해준다. SE 비히클에 GM-CSF의 첨가는 SE 단독, 또는 SE와 IL-12로 면역화된 마우스와 비교하여 펩타이드-특이적 역가의 증가를 확인해준다. 그러나, 일반적으로, 양호한 IgG2a 및 IgG2b 항체 역가의 유도는 펩타이드의 MPLTM SE 및 GM-CSF와의 제형에 따라 좌우된다. 이 제형물이 CFA/IFA 및 펩타이드같은 다른 제형물로의 면역화를 통해 유도되는 역가와 유사한 IgG 역가를 유도함을 언급하는 것이 흥미롭다. MPLTM SE와 GM-CSF 및 펩타이드와의 배합은 고 역가 중화 항체 및 CTL을 모두 유도함을 입증하는 유일한 제형물이다(참조: 실험 8). IL-12의 MPLTM SE 및 펩타이드와의 배합 또한 알맞은 면역반응 프로파일을 유도한다. 결과는 시토킨 GM-CSF 또는 IL-12와 동시-제형된 MPLTM SE가 CFA 및 IFA로의 면역화와 비교하여 항체 반응에 있어서 정성적 차이를 제공함을 나타낸다. 그 차이는 IgG2a 및 IgG2b의 상승된 수준에 기인한다고 생각된다.
두번째 실험에서, 첫번째 Balb/c-HIV 펩타이드 실험의 프로토콜을 약간 수정하여 수행한다. MPLTM 또한 수성 형태로, 시토킨과 함께 또는 시토킨 없이 투여된다.
보조제 없이 Balb/c 마우스의 HIV 펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys)로의 면역화는 상당한 역가의 항체를 유도하지 않는다. 반대로, 펩타이드 항원의 다양한 보조제/시토킨 배합물과의 제형은 2회 면역화 후에 고 항체 역가의 유도를 초래한다.
펩타이드와 IL-12, 또는 SE만으로의 면역화는 보조제 없이 유도된 것과 구분할 수 없는 역가를 초래한다(표 7). GM-CSF와 동시-제형된 펩타이드의 수용자는 역가를 적당히 증가시킨다. CFA/IFA를 함유하는 백신의 수용자와 비교하여, 마이크로유동화 MPLTM SE는 유사한 펩타이드-특이적 역가 발달을 보인다. CFA/IFA 백신의 수용자와 비교하여, MPLTM SE는 높은 수준의 펩타이드-특이적 IgG2a를 유도한다. 사용된 면역화 계획은 관찰되는 항체 역가에 영향을 줄 수 있다. 그러나, MPLTM(수성) 제형된 펩타이드로의 마우스의 면역화는 고 역가의 펩타이드-특이적 항체를 유도한다. 이 제형물에 GM-CSF 또는 IL-12의 첨가는 106 이상의 증가된 역가를 초래한다. 따라서, HIV 펩타이드의 MPLTM 및 시토킨 IL-12 또는 GM-CSF와의 배합은 펩타이드에 대해 특이적인 고 역가의 항체를 유도한다.
펩타이드 및 MPLTM과 IL-12, 또는 MPLTM SE와 GM-CSF로 면역화된 마우스 그룹만이 질 세척으로 수득된 유체로 검출되는 항체의 비교적 고 역가를 발달시킨다(표 8). 실제로, 펩타이드와 함께 MPLTM 및 IL-12로 면역화된 마우스 그룹만이 펩타이드-특이적 IgA를 생성한다.
배양액에서 비장 세포의 증식능은 펩타이드로의 시험관내 자극에 반응하는 티미딘의 도입을 통해 측정된다. 표 9의 데이타는 ConA로의 자극을 통해 측정된 것처럼 최고 증식으로 표준화되는, 증식을 정상화하는 방식으로 제시되었다. GM-CSF 또는 IL-12와 함께 MPLTM SE로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포와, GM-CSF만으로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포는, 낮은 수준의 펩타이드-관련 증식을 보인다. 반대로, MPLTM 및 GM-CSF와 배합된 펩타이드로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포는 상당한 증식을 보인다.
시험관내 배양된 비장 세포로부터의 시토킨 생성 또한 측정된다. IL-4의 경우, GM-CSF와 배합된 MPLTM SE 및 T1SP10MN(A)(-Cys)로 면역화된 마우스만이 펩타이드로의 자극에 반응하여 양호한 수준의 IL-4를 분비한다(표 10). 인터페론-감마의 경우, MPLTM SE와 GM-CSF 또는 IL-12, 또는 GM-CSF 또는 IL-12와 함께 수성 MPLTM으 로 면역화된 마우스가 용이하게 검출가능한 수준의 이 시토킨을 배양 상등액으로 생성한다(표 11).
따라서, 시토킨 GM-CSF 또는 IL-12의 MPLTM 또는 MPLTM SE와의 배합이 펩타이드 항원에 대해 특이적인 고 역가의 항체를 유도한다. 역가는 펩타이드 및 CFA/IFA로의 마우스의 면역화를 통해 유도된 역가와 유사하다. 데이타는 이러한 배합이 또한 배양액에서 비장 세포의 최고 증식 반응, 및 펩타이드 자극에 반응하여 최고 수준의 인터페론-감마를 분비하는 비장 세포의 정착 개체군을 유도한다.
이 두번째 실험의 결과는 T1SP10MN(A)(-Cys)의 MPLTM 및 시토킨 GM-CSF 또는 IL-12와의 동시제형이 펩타이드와 CFA로 면역화되고, 펩타이드와 IFA로 부스팅된 마우스에서 유도된 것과 유사하거나, 더욱 양호한 면역반응 프로파일을 유도함을 나타낸다.
2차 면역화 2주 후에 주사 부위의 조직학적 평가(비도시)는 마이크로유동화된 MPLTM SE로 면역화된 마우스가 진피로의 단핵세포 침윤을 일으키거나 유지하지 않음을 나타낸다. 헤마톡실린/에오신 염색된 조직은 보조제를 투여받지 않은 수용자로부터 제조된 것과 유사하게 보인다. 반대로, 보조제로서 CFA 및 IFA(유중수 에멀션)로 면역화된 Balb/c 마우스는 이 부위에 단핵세포의 다량 축적을 가진다. GM-CSF 및 펩타이드와 함께 MPLTM SE의 수용자는 GM-CSF 없이 MPLTM SE 수용자와 비교하여 단핵세포의 주목할만 하지만, 근소한 증가를 보인다. GM-CSF 및 펩타이드로 면 역화된 마우스로부터의 조직만이 시험되지 않았다.
두번째 실험의 프로토콜이 Balb/c 마우스 대신 Swiss-Webster 마우스를 사용하여 세번째 실험에서 수행된다. Swiss-Webster 마우스는 MHC-제한 헬퍼 T 세포 에피토프가 면역반응에 영향을 주지 않는 HIV 펩타이드 항원으로의 보조제 효과를 측정하는 데 사용된다. Swiss-Webster 마우스는 마우스의 무작위교배 계통이고; 마찬가지로, 세포 연구는 수행되지 않았다. 상호적인 항-HIV 펩타이드 IgG 종점 역가 및 질 세척 종점 상호적인 IgG 및 IgA 항체 역가만이 이 실험에서 측정된다. 표 12 및 13에 나타나는 것처럼, 반응 프로파일은 첫번째 및 두번째 실험에서 측정된 Balb/c 마우스로 수집된 결과에 상당한다.
네번째 실험에서, 두번째 실험의 프로토콜을 Balb/c 마우스를 사용하여 약간 수정하여 수행한다. 표 14에 나타나 있는 것처럼, GM-CSF 또는 IL-12를 지니는 MPLTM의 보조제 제형물은 MPLTM 단독보다 상당히 강력한 IgG GMT 반응을 도출한다. 표 15에 나타나 있는 것처럼, GM-CSF를 지니는 MPLTM SE의 보조제 제형물은 상당한 IgG2b 서브클래스 반응을 도출한다. GM-CSF 또는 IL-12를 지니는 MPLTM의 보조제 제형물은 MPLTM 단독보다 상당히 강력한 IgG2a 서브클래스 반응을 도출하고, 반면 GM-CSF 또는 IL-12를 지니는 MPLTM SE 제형물은 MPLTM 단독보다 강력한 IgG2a 서브클래스 반응을 도출한다. 표 16에 나타나 있는 것처럼, GM-CSF 또는 IL-12를 지니는 MPLTM의 보조제 제형물은 질 세척액에서 MPLTM 단독보다 상당히 큰 IgG 역가를 도출한다. 최종적으로, 도 4에 나타나 있는 것처럼, GM-CSF 또는 IL-12를 지니는 MPLTM의 보조제 제형물, 및 GM-CSF 또는 IL-12를 지니는 MPLTM SE의 제형물은 각각 MPLTM 단독보다 또는 MPLTM SE 단독보다 많은 비장 세포의 증식을 보인다.
다섯번째 실험에서, 두번째 실험의 프로토콜을 Balb/c 마우스를 사용하여 약간 수정하여 수행하고; IL-12는 보조제 제형물에 포함되지 않는다. 표 17에 나타나 있는 것처럼, MPLTM과 GM-CSF를 모두 함유하는 보조제 제형물은 MPLTM 단독보다 상당히 강력한 IgG2a 및 IgG2b 반응을 도출한다. 추가로, MPLTM과 GM-CSF를 모두 함유하는 보조제 제형물은 모든 IgG 서브클래스에 대해 MPLTM 단독보다 상당히 강력한 반응을 도출한다.
여섯번째 실험에서, 두번째 실험의 프로토콜을 Balb/c 마우스를 사용하여 약간 수정하여 수행하고; IL-12는 보조제 제형물에 포함되지 않는다. HIV 펩타이드는 아미노산 17 위치에 시스테인이 존재하기 때문에, 40개 아미노산의 길이이다. 표 18에 나타나 있는 것처럼, MPLTM SE와 GM-CSF를 모두 함유하는 보조제 제형물은 모든 IgG 서브클래스에 대해 MPLTM 단독보다 상당히 강력한 반응을 도출하고 모든 서브클래스에 대해 MPLTM SE 단독보다 상당히 강력한 반응을 도출한다.
일곱번째 실험에서, 여섯번째 실험의 프로토콜을 Balb/c 마우스를 사용하여 약간 수정하여 수행하고; IL-12는 보조제 제형물에 포함되지 않는다. 표 19에 나타나 있는 것처럼, MPLTM SE와 GM-CSF를 모두 함유하는 보조제 제형물은 모든 IgG 서브클래스에 대해 MPLTM SE보다 상당히 강력한 반응을 도출하고, MPLTM과 GM-CSF를 모두 함유하는 보조제 제형물은 모든 IgG 서브클래스에 대해 MPLTM 단독보다 상당히 강력한 반응을 도출한다.
여덟번째 실험에서, 기능성 세포 매개 면역의 측정으로서, HIVMN-특이적 CTL 반응을 유발하는 멀티-에피토프 펩타이드 T1SP10MN(A)(+Cys)와 함께 제형된 MPLTM SE, 또는 MPLTM SE와 GM-CSF로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포의 능력이 평가되었다.
도 5에 나타나 있는 것처럼, MPLTM SE, 또는 MPLTM SE와 GM-CSF로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포는 비표지 또는 IIIB CTL 에피토프로 펄스-표지된 표적 세포에 대해 낮은 활성을 보였다. MPLTM SE 및 GM-CSF와 함께 제형된 T1SP10MN(A)(+Cys)로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포는 단독 면역화 후에 양호한 HIVMN-특이적 CTL 활성을 유도한다. HIVMN-특이적 CTL-매개 표적 세포 용해는 2차 면역화 7일 후에 측정할 때 현저하게 증가하였다(도 5). 별도의 실험에서, 보조제 없이 면역화된 마우스는 CTL 반응을 유도하지 않았다. 수성 MPLTM 및 펩타이드로 면역화된 마우스는 약한(<30%) 펩타이드-특이적 CTL 반응을 유발하였다.
한 가지 어려움은, HIV로 감염된 비-인간 영장류에서 AIDS-유사 증상이 발병되지 않는 HIV에 대한 면역원성 조성물의 잠재적인 효과를 평가하는 것이다. 따라서, 잠재적 동물 모델은 HIV에 의해 야기되는 인간 증후학을 모방하지 않는다. 다행히도, HIV와 밀접하게 관련있는, 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)로 감염된 비-인간 영장류는 AIDS-유사 증상을 유발하였다.
이는 SIV 항원이 비-인간 영장류에서 평가됨을 가능하게 한다. SIV 항원은 단백질, 단백질로부터 유도된 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편일 수 있다. 단백질은 gp41, gp120 또는 gp160과 같은 당단백질일 수 있다. 이와 달리, 단백질은 gag, pol, vif, rev, vpr, tat, nef 또는 env와 같은 유전자에 의해 암호화되는 단백질일 수 있다. 이러한 단백질로부터 유도된 펩타이드는 적어도 하나의 항원 결정기(에피토프)를 포함할 것이고 적어도 6개 아미노산의 길이이다.
HIV와 유사하게, 멀티에피토프 SIV 펩타이드가 비-인간 영장류에서 사용된다. MPLTM SE 및 GM-CSF와 배합된 다양한 펩타이드가 CTL 반응을 도출할 수 있는지를 평가하기 위한 연구가 수행되었다. 리서스(Rhesus) 짧은 꼬리 원숭이가 하기 세트의 3 펩타이드와 함께 MPLTM SE 및 GM-CSF로 0, 4, 8 및 18주 째에 피하 면역화된다(참조: 표 20).
(1) 각 펩타이드는 하기와 같은 Mamu A*01 제한된 CTL 에피토프를 포함한다:
Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met(서열번호 3)(gag)(38, 39)
Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val(서열번호 4)(pol)(40)
Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile(서열번호 5)(env)(40)
(2) 이와 달리, 이러한 3 펩타이드는 각각 하기 서열을 가지는 무차별 T-헬퍼 에피토프에 결합된다:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly
Val Ala Pro Thr Lys Ala(서열번호 6)(41로부터 변이).
따라서, 3 펩타이드는 하기 서열을 가진다:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly
Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln
Met(서열번호 7)
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly
Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu
Val(서열번호 8)
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly
Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln
Ile(서열번호 9).
헤파린 첨가 혈액을 2주 마다 수집하고 말초 혈액 단핵세포를 51Cr 방출 분 석, 신선한 말초 혈액 단핵세포(PBMC)의 테트라머 염색 및 배양된 PBMC의 테트라머 염색으로 CTL에 대해 분석한다. 신선한 PBMC의 테트라머 염색 및 51Cr 방출에 의한 세포용해 사멸은 어떤 활성도 보이지 않았다. 그러나, MPLTM SE 및 GM-CSF와 함께 제형된 MamuA *01 제한된 Th/CTL 펩타이드 칵테일로의 리서스 짧은 꼬리 원숭이의 면역화는 테트라머 양성 CD8 양성 T 세포의 검출을 초래한다. 표 21-24에 제시된 결과는 양성 %로, 11일간 각 펩타이드와 함께 배양된 PBMC에서 검출된 테트라머 양성 CD8+(표 21-23) 또는 CD4+(표 24) T 세포를 나타낸다.
종합하면, Th 에피토프와 함께(Rh 55, Rh 142) 또는 Th 에피토프 없이(Rh 73, Rh 80) CTL 에피토프로 면역화된 모든 4 마리의 Mamu A*01 양성 동물은 gag, pol 또는 env에 대해 특이적인 CD8 양성 테트라머 양성 세포를 보인다. 예상한 바와 같이, 테트라머 양성 CD8 세포는 Mamu A*01 음성 동물(Rh 41, Rh 47)에서는 검출되지 않는다. SIV gag 및 env 특이적 면역 반응은 프라이밍 후에 관찰되고 반면 pol 특이적 테트라머 양성은 부스팅 후에 관찰된다. 18주 째에 최종 부스터 투여량이 반응을 추가로 증대시키지 않기 때문에, 표 21-24에서 데이타는 14주 후는 나타나 있지 않다.
요약하면, MPLTM SE 및 인간 GM-CSF로 보조화된 Mamu *A01 제한된 Th/SIV gag, pol 및 env CTL 에피토프 펩타이드 칵테일로의 리서스 짧은 꼬리 원숭이의 면 역화는 민감하고 특이적인 테트라머 분석에 의해 입증되는 것처럼 세포 반응을 도출한다.
또한 PIB 단백질이라고 알려진, 임균의 포린 B 단백질이 재조합으로 발현되고(본원에 참조로 인용되는 42), 이는 임균에 의해 야기되는 감염의 예방 또는 치료를 위한 후보 항원이다.
아미노-말단의 16개 아미노산이 파지로부터 아미노산인 임균의 포린 B 단백질의 변형된 버전, 이어서 포린 B 단백질의 성숙한 형태와 함께, MPLTM(SE와 함께 또는 SE 없이)과 GM-CSF 또는 IL-12를, MPLTM(SE와 함께 또는 SE 없이) 단독과 비교하기 위한 일련의 연구가 수행되었다. 결과의 요약은 이제 제시될 것이다.
첫번째 실험에서, 재조합 포린 B 단백질로 둔부에서 피하 면역화된 Swiss-Webster 마우스는 포린 B 단백질이 생존가능한 후보 항원임을 입증하는, 항원-특이적 항체 역가를 초래한다. GM-CSF의 MPLTM 및 포린 B 단백질에의 첨가는 MPLTM 및 포린 B 단백질의 수용자와 비교하여 증가한 혈청 항체 IgG 및 IgG2a 역가를 초래한다(참조: 표 25 및 26).
두번째 실험에서, 포린 B 단백질과 IL-12 및 MPLTM 또는 MPLTM SE로 둔부에서 피하 면역화된 Swiss-Webster 마우스는 포린 B 단백질과 MPLTM 또는 MPLTM SE의 수용자와 비교하여 더 많은 항원-특이적 항체(특히 IgG)를 유도하였다. 고 역가가 1차 및 2차 면역화 후에 모두 관찰되었다. 제형물에 IL-12의 포함은 질 세척액에서 측 정된 IgG 역가의 대략 10배 증가를 초래한다(참조: 표 27).
네이티브 이량체 형태의 인간 호흡기 합포체 바이러스(RSV)의 정제된 네이티브 융합(F) 단백질은 RSV에 의해 야기되는 감염의 예방을 위한 후보 항원이다(본원에 참조로 인용되는 43).
RSV의 정제된 네이티브 F 단백질과 함께, MPLTM(SE와 함께 또는 SE 없이)과 GM-CSF 또는 IL-12를 MPLTM(SE와 함께 또는 SE 없이), 알루미늄 포스페이트 또는 StimulonTM QS-21 각각과 비교하기 위한 일련의 연구가 수행되었다. 결과의 요약은 이제 제시될 것이다.
첫번째 실험에서, 네이티브 RSV F 단백질로 근육내 면역화된 Balb/c 마우스는 F 단백질이 생존가능한 후보 항원임을 입증하는, 항원-특이적 항체 역가를 초래하였다. MPLTM에 GM-CSF의 첨가는 1차 및 2차 면역화 후에 모두 F 단백질에 대해 MPLTM 단독보다 큰 종점 역가를 유도하고(참조: 표 28), 또한 비장 세포의 시험관내 자극에 대해 MPLTM 단독보다 증가한 세포 반응을 유도한다(참조: 표 29). MPLTM SE에 GM-CSF의 첨가는 F 단백질에 대해 MPLTM SE 단독보다 증가한 1차 IgG 반응을 초래한다(참조: 표 28).
두번째 실험은 첫번째 실험의 프로토콜을 반복한다. MPLTM에 GM-CSF의 첨가는 1차 및 2차 면역화 후에 모두 F 단백질에 대해 MPLTM 단독보다 큰 종점 역가를 유도한다(참조: 표 30). MPLTM SE에 GM-CSF의 첨가는 또한 1차 면역화 후에 F 단백질에 대해 MPLTM SE 단독보다 큰 종점 역가를 유도한다(참조: 표 30). F 단백질과 MPLTM 또는 MPLTM SE의 제형물에 GM-CSF의 첨가는 면역화된 마우스의 비장 세포로 측정된 것처럼, GM-CSF가 결여된 제형물에 의해 유도되는 활성보다 높은 %의 RSV-특이적 비장 CTL 활성을 유도한다(참조:표 31).
세번째 실험은 GM-CSF를 IL-12로 대체한다. MPLTM과 함께 IL-12의 동시-제형은 MPLTM 단독으로의 F 단백질 전달과 비교하여, 프라이밍 면역화 후에 IgG의 고 역가를 유도한다(참조: 표 32). 그러나, MPLTM 또는 MPLTM SE에 IL-12의 첨가는 작동 세포의 시험관내 자극 후에 측정되는 RSV-특이적 CTL 활성에는 영향을 주지 않았다(참조: 표 33).
인플루엔자 바이러스 NP(뉴클레오캡시드) 단백질과 함께, MPLTM(SE와 함께 또는 SE 없이)과 GM-CSF를 개별적으로 MPLTM(SE와 함께 또는 SE 없이)과 비교하기 위한 일 연구가 수행되었다. 항체 역가를 측정하기 위한 실험을 수행하기에 불충분한 양의 NP가 있었다. 보조제와 함께 또는 보조제 없이 NP 펩타이드로 면역화된 마우스를 최종 면역화 14일 후에 항원 자극에 대한 비장 세포의 반응에 대해 분석한다. MPLTM 또는 MPLTM SE를 함유하는 제형물에 GM-CSF의 포함은 CTL 활성의 현저한 감소를 초래한다(데이타 비도시).
왜 이러한 예외의 결과가 얻어졌는지는 불확실하다. 분석의 수행에서 기술적인 문제가 있었을 수 있다.
본 발명의 항원 조성물은 병원성 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충으 중에서 선택된 항원 및 시토킨 또는 림포카인, 특히 GM-CSF 또는 IL-12와 배합된 MPLTM(수성 또는 안정한 에멀션 형태)의 유효 보조량을 포함하는 항원 조성물의 투여 후에 척추동물 숙주의 항체 반응 및 세포-매개 면역을 증대시킴으로써 면역반응을 조절한다. 인터류킨 1-알파, 1-베타, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 및 18, 인터페론-알파, 베타 및 감마, 과립구 콜로니 자극인자 및 종양 괴사인자 알파 및 베타를 포함하는(이에 한정되지 않음), 다른 시토킨 또는 림포카인도 면역 조절 활성을 가지는 것으로 나타났다.
시토킨 또는 림포카인에 대한 작용제 또는 길항제 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 사용되는 것처럼, 용어 "작용제"는 시토킨 또는 림포카인과 동일한 방식으로 활성 또는 기능을 증진시키는 분자를 의미한다. 이러한 작용제의 예는 시토킨 또는 림포카인의 모조물이다. 본원에 사용되는 것처럼, 용어 "길항제"는 시토킨 또는 림포카인의 활성을 억제하거나 방해하는 분자를 의미한다. 이러한 길항제의 예는 가용성 IL-4 수용체 및 가용성 TMF 수용체이다.
본원에 사용되는 것처럼, 용어 "유효 보조량"은 척추동물 숙주에서 증대된 면역 반응을 도출하기에 적당한, 본원에 설명된 보조제의 배합물 투여량을 의미한다. 특정 투여량은 부분적으로 숙주의 연령, 체중 및 의학적 상태와, 투여방법 및 항원에 따라 좌우될 것이다. 바람직한 양태에서, 보조제의 배합물은 1-100 ㎍/투여량 범위로 MPLTM을 이용할 것이다. 적당한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 본 발명의 항원 조성물은 또한 주사액 또는 현탁액을 제조하기 위한 통상의 방법으로 면역학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합될 수 있다.
본 발명의 항원 조성물은 비강내, 경구, 질, 직장, 비경구, 피내, 경피(참조: 예를 들면, 본원에 참조로 인용되는, 국제 출원 WO 98/20734(44)), 근육내, 복막내, 피하, 정맥내 및 동맥내를 포함하는(이에 한정되지 않음), 다양한 경로로 인간 또는 비-인간 척추동물에게 투여된다. 항원 성분 또는 항원 조성물 성분의 양은 부분적으로 항원의 동정 및 숙주의 연령, 체중 및 의학적 상태와, 투여 방법에 따라 다양할 것이다. 반복하여 설명하면, 적당한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 필요하지는 않아도, 항원 및 보조제 배합물이 동시에 투여되는 것이 바람직하다. 항원 조성물의 투여 횟수 및 투여 방법 또한 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 일부 예에서, 보조제 배합물의 보조제 성질은 필요한 투여 횟수 및 투여 방법에 걸리는 시간을 단축할 수 있다.
본 발명의 보조제 배합물은 인간 및 비-인간 척추동물을 감염시키는 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충 미생물 또는 암 세포 또는 종양 세포로부터 유도된 것들을 포함하는(이에 한정되지 않음), 다양한 병원성 미생물로부터의 다양한 항원을 함유하는 항원 조성물에 사용하기에 적당하다. 항원은 다음 중 임의의 단백질로부터 유도된 펩타이드 또는 폴리펩타이드와, 단편을 포함할 수 있다: 사카라이드, 단백질, 폴리- 또는 올리고뉴클레오타이드, 암 또는 종양 세포, 알레르겐, Aβ 단백질 또는 그것의 펩타이드 또는 다른 거대분자 성분. 일부 예에서, 1 이상의 항원이 항원 조성물에 포함된다.
본 발명의 보조제 배합물을 함유하는 목적하는 바이러스 백신은 인간 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 유형 1-3, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 유두종바이러스, 폴리오바이러스, 로타바이러스, 칼리시바이러스, 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 풍진 바이러스, 아데노바이러스, 광견병 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 우역 바이러스, 코로나바이러스, 파르보바이러스, 전염성 비기관염 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 전염성 복막염 바이러스, 조류 전염성 점액낭병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 마레크병 바이러스, 돼지 호흡기 및 생식기병 바이러스, 말 동맥염 바이러스 및 다양한 뇌염 바이러스(이에 한정되지 않음)에 의해 야기되는 질환의 예방 및/또는 치료를 목적으로 하는 것들을 포함한다.
본 발명의 보조제 배합물을 함유하는 목적하는 박테리아 백신은 헤모필루스 인플루엔자균(형 분류가능형 및 형 분류불가능형 모두), 헤모필루스 솜누스균, 모락셀라 카타르할리스균, 폐렴연쇄구균, 화농성 연쇄구균, 스트렙토코쿠스 아갈락티에균, 대변 연쇄구균, 나선형 유문세균, 수막염균, 임균, 클라미디아 트라코마티스 균, 클라미디아 폐렴균, 클라미디아 사이태시균, 보르데텔라 백일해균, 티푸스균, 쥐티푸스균, 돈콜레라균, 대장균, 이질균속, 콜레라균, 디프테리아균, 결핵균, 계형결핵균-미코박테리윰 세포내 복합체, 기괴변형균, 심상변형균, 황색포도상구균, 파상풍균, 렙토스피라 인테로간스균, 보렐리아 부르그도르페리균, 용혈성 폐렴균, 파스퇴렐라 멀토시다균, 악티노바실루스 늑막폐렴균 및 미코플라즈마 칼리셉티큠균(이에 한정되지 않음)에 의해 야기되는 질환의 예방 및/또는 치료를 목적으로 하는 것들을 포함한다.
본 발명의 보조제 배합물을 함유하는 진균류 병원체에 대한 목적하는 백신은 아스페르길리스속, 분아균속, 칸디다속, 쿠시디오데스속, 크립토코쿠스속 및 히스토플라즈마속(이에 한정되지 않음)에 의해 야기되는 질환의 예방 및/또는 치료를 목적으로 하는 것들을 포함한다.
본 발명의 보조제 배합물을 함유하는 기생충에 대한 목적하는 백신은 레이슈마니아 메이져, 회충속, 편충속, 기아르디아속, 주혈흡충속, 크립토스포리듐속, 트리코모나스속, 톡소플라즈마 곤디속 및 주폐포자층속(이에 한정되지 않음)에 의해 야기되는 질환의 예방 및/또는 치료를 목적으로 하는 것들을 포함한다.
본 발명의 보조제 배합물을 함유하는, 척추동물 숙주에서 치료 또는 예방 항암 효과를 도출하기 위한 목적하는 백신은 전립선 특이적 항원, 암배아성 항원, MUC-1, Her2, CA-125 및 MAGE-3을 포함하는(이에 한정되지 않음), 암 항원 또는 종양-관련 항원을 이용하는 것들을 포함한다.
본 발명의 보조제 배합물을 함유하는, 척추동물 숙주에서 알레르겐에 대한 반응을 완화하기 위한 목적하는 백신은 알레르겐 또는 이의 단편을 함유하는 것들을 포함한다. 이러한 알레르겐의 예는 본원에 참조로 인용되는, 미국 특허 제5,830,877호(45) 및 공개 국제 특허 출원 제WO 99/51259호(46)에 설명되어 있고, 화분, 곤충 독액, 동물 비듬, 진균류 포자 및 약제(예, 페니실린)를 포함한다. 백신은 알레르기 반응의 원인으로 알려진, IgE 항체의 생성을 방해한다.
본 발명의 보조제 배합물을 함유하는, 척추동물 숙주에서 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료를 위한 목적하는 백신은 Aβ 단백질 또는 그것의 펩타이드의 일부를 함유하는 것들을 포함한다. 이 질환은 알츠하이머병, 아밀로이드증 또는 아밀로이도겐병이라는 이름으로 다양하게 불린다. β-아밀로이드 펩타이드(Aβ펩타이드로도 불림)는 β및 γ세크레타제 효소에 의한 Aβ 단백질 또는 그것의 펩타이드의 프로세싱에 의해 생성된, Aβ 단백질 또는 그것의 펩타이드의 42개 아미노산의 단편이고, 하기 서열을 가진다:
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His
Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys
Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(서열번호 10).
일부 환자에서, 아밀로이드 침착은 응집 Aβ펩타이드 형태를 취한다. 놀랍게도, 분리된 Aβ펩타이드의 투여가 척추동물 숙주에서 아밀로이드 침착물의 Aβ펩타이드 성분에 대한 면역반응을 유도함이 본 발명에 이르러 발견되었다(47). 따라서, 본 발명의 백신은 본 발명의 보조제 배합물과, Aβ펩타이드와, Aβ펩타이드의 단편 및 Aβ펩타이드에 대한 항체 또는 이의 단편을 포함한다. Aβ펩타이드의 이러한 단편은 하기 서열을 가지는 28개 아미노산의 펩타이드이다(48):
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His
Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(서열번호 11).
HIV 및 SIV의 경우에, 항원 조성물은 적어도 하나의 단백질, 단백질로부터 유도된 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편을 포함한다. 일부 예에서, 복합 HIV 또는 SIV 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및/또는 단편이 항원 조성물에 포함된다.
본 발명의 보조제 배합 제형물은 또한 폴리뉴클레오타이드 백신(또한 DNA 백신으로 알려짐)에서 보조제로서 포함되기에 적당하다. 이러한 백신은 부피비카인(참조: 본원에 참조로 인용되는 U.S. 특허 제5,593,972호(49))과 같은 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명이 더욱 잘 이해될 수 있도록, 하기의 실시예가 상술되었다. 실시예는 설명만을 목적으로 하고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실험 1
HIV 펩타이드 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
실시예 1
재료 및 방법
동물
생후 7-9주가 된, 암컷 Balb/c 마우스를 Taconic Farms, Inc.(Germantown, NY)로부터 구입한다. 모든 마우스를 American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care로부터 공인받은 시설에 둔다. 마우스를 연구 개시하기에 앞서 1주간 수용 시설에 순응시킨다.
펩타이드
멀티에피토프 HIV-1-MN 펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys)의 서열은 하기와 같다:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met
Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His
Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(서열번호 2).
이 펩타이드는 이미 설명되었고(28, 29), 마우스와 인간 모두에서 CD4+ Th 세포 반응을 유발하는 HIV-1 gp120MN으로부터의 서열, 주요 중화 결정기 및 Balb/c 마우스에서 CD8+ CTL에 의해 인식되는 부위를 포함한다. 펩타이드는 Dr. R. Scearce(Duke University, Durham, NC)에 의해 제공된다. CTL 분석을 위해, HIV-1-IIIB(Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile(서열번호 12), H-2Dd 제한) 또는 HIV-1-MN(Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr(서열번호 13), H-2Dd 제한)의 V3 루프 내의 CTL 에피토프에 상응하는 펩타이드는 Genosys Biotechnologies Inc.(The Woodlands, TX)로부터 구입한다. 펩타이드는 멸균수에 용해되고, 적당한 완충액 또는 세포 배양 배지로 사용하기 전에 희석된다.
보조제
모든 MPLTM-함유 보조 제제는 Ribi ImmunoChem Research, Inc.(Hamilton, MT)로부터 입수가능하다. MPLTM은 트리에탄올아민(Sigma, St. Louis, MO)을 사용하여 수성 제형물로 제조된다. 용해 후에, MPLTM을 제조업자의 지시에 따라 초음파처리하여 멸균 여과된 유백광/투명 용액을 생성한다. MPLTM SE는 0-2500 ㎍/㎖ 범위의 MPLTM 농도를 가지는, 예비제형된 스쿠알렌을 기본으로 하는 수중유(1-2% 오일) 에멀션으로 제공된다. 알루미늄 포스페이트는 인-하우스 제조된다. 완전한 프로인트 보조제(CFA) 및 불완전한 보조제(IFA)는 Difco Laboratories, Detroit, MI로부터 구입한다. T1SP10MN(A) 펩타이드 및 프로인트 보조제는 연결된 두 시린지를 사용하여 1:1의 비로 유화된다. 재조합으로 발현된 쥐 IL-12는 Genetics Institute(Cambridge, MA)로부터 제공된다. 재조합 쥐 GM-CSF는 R&D Systems(Minneapolis, MN)에 의해 제공된, Immunex(Seattle, WA)에 의해 공급되거나, 담체-부재 동결건조된 분말로서 Biosource International(Camarillo, CA)로부터 구입한다.
면역화
마우스를 미부의 각 측면에 동등하게 나눈 전체 용적 0.2 ㎖로 둔부에서 피하 면역화한다. 면역화는 하기에 명시된 것처럼, 다양한 시간 간격으로 도입된다. 항원 및 시토킨은 포스페이트 완충된 식염수로 적당한 농도까지 희석되고 면역화 전 16시간 내에 멸균 조건하에서 보조제와 제형된다. 백신은 부드러운 교반으로 혼합되고 4℃에서 저장된다. 제형물은 면역화 직전에 와동으로 혼합된다.
샘플 수집
동물을 초기 면역화 전과 명시된 시점에서 출혈시킨다. 각 마우스로부터의 혈청 또는 그룹의 마우스로부터의 풀로서 분석한다. 질 세척은 안락사한 마우스로 수행되어 항체 수준이 평가된다. 이는 200:1 피펫을 사용하여 암컷 마우스의 질구개로 75:1 RPMI-10을 점적함으로써 달성된다. 구개는 유체의 반복 전달 및 제거에 의해 세척된 다음 FBS의 10:1까지 첨가된다. 질 세척은 풀로서 분석된다.
세포 제제
증식 분석 및 시험관내 시토킨 분석을 위해, 비장 세포를 명시된 시점에서 마우스로부터 수득한다. 단일 세포 현탁액을 결과에 명시된 것처럼 3-5마리 마우스의 풀로부터 제조한다. 증식 및 시토킨 분석을 위해, 세포를 HIV 펩타이드 항원, 대조 단백질 또는 RPMI-10만으로 밤새 예비코팅한 둥근바닥의 96 웰 배양 플레이트에 현탁한다. 비장 세포를 2배 보충물을 가지는 배양 배지를 사용하여 5 ×105 세포/웰로 첨가한다. 세포 배양 상등액을 배양 개시 3일 또는 6일 후에 시토킨 분석을 위해 삼중 웰로부터 수확한다. 상등액 수확 직후에, 배양액을 18-24시간 동안 3H-티미딘으로 펄싱하고, 수확하여 세포 증식을 정량한다.
효소면역 흡착 분석
HIV 펩타이드-특이적 항체 및 서브클래스 분포의 분석을 위해, 펩타이드를 카보네이트 완충액(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6) 또는 PBS에 1 ㎍/㎖의 농도로 현탁하고, 100:1의 용적으로 96 웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc)에 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 배양한 후에, 플레이트를 세척하고, 실온에서 2-4시간 동안 블로킹한다(0.1% 젤라틴/PBS). ELISA 플레이트를 연속 희석된 혈청(PBS, 0.1% 젤라틴, 0.05% 트윈TM 20, 0.02% 나트륨 아지드)의 첨가 전에 세척 완충액(PBS, 0.1% 트윈TM 20)으로 세척한다. 4시간 배양한 후에, 웰을 세척하고 비오틴 첨가된 항-동종형/서브클래스 항체의 적당한 희석액을 4℃에서 밤새 배양하는 동안 첨가한다. 웰을 세척하고 스트렙파비딘-접합 호스래디쉬 퍼옥시다제와 함께 배양한다. 배양 후에, 웰을 세척하고 ABTS로 전개시킨다. 웰은 405 nm에서 판독된다. 역가는 대조 혈청을 사용하여 표준화된다.
시토킨 분석을 위해, 세포 배양 상등액을 BVD6-11B11(항-IL4의 경우) 또는 R4-6A2(인터페론-감마의 경우)로 코팅된 웰에 첨가한다. 배양하고 세척한 후에, 웰을 비오틴-표지 BVD6-24G2(IL4 경우) 또는 XMG 1.2(인터페론-감마 경우)를 사용하여 전개시킨다. 시토킨의 농도는 재조합 쥐 인터페론-감마 또는 인터류킨-4로부터 얻어진 표준 곡선을 사용하여 결정된다. 모든 시토킨 반응물은 Pharmingen(San Diego, CA)로부터 구입한다.
HIV-1 MN 중화 분석
중화 분석은 Duke University의 Dr. Thomas Matthews의 실험실에서 수행된 다. 간략하게 설명하면, 암호화 혈청이 실험실 바이러스 분리물 HIV-1MN(NIH)의 중화를 위해 제공된다. 분석은 본질적으로 이미 설명된 것처럼(25) 수행된다. 간략하게 설명하면, 시험 혈청의 희석액을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 분획화한다(25:1/웰). 동일한 용적의 연속 희석된 바이러스 스톡을 각 웰에 첨가한다. 배양 후에, 바이러스/항체 혼합물을 AA5 표적 세포에 첨가한다. 세포를 격일로 신선한 배지를 첨가함으로써 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 배양한다. 감염 7일 후에, 상등액을 바이러스 복제 및 성공적인 감염 또는 억제의 측정으로서 바이러스 역전사효소의 존재에 대해 평가한다.
실시예 2
상호적인 항-T1SP10MN(A) IgG 종점 역가
상호적인 항-HIV 펩타이드-특이적 IgG 종점 역가는 초기 면역화 후 명시된 시점에서 풀링 혈청(n = 5 Balb/c)으로 측정된다. 마우스를 달리 언급하지 않는 한, 0일 및 27일 째에 T1SP10MN(A)(-Cys) 25 ㎍으로 둔부에서 피하 면역화한다. 프로인트 보조제의 수용자 경우, 마우스를 CFA로 유화된 펩타이드로 프라이밍하고 IFA로 부스팅한다. MPLTM SE는 투여량마다 2% 스쿠알렌 오일 및 MPLTM 50 ㎍을 함유하는 에멀션으로서 제공된다. SE는 스쿠알렌, 글리세롤 및 유화제로 이루어진 수중유 에멀션 비히클이다. 재조합 쥐 IL-12는 50 ng/마우스로 전달된다. 재조합 쥐 GM-CSF는 10 ㎍/마우스로 전달된다. 결과는 표 1에 나타나 있다.
표 1
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 역가
Figure 112001029140742-pct00001

실시예 3
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 서브클래스 역가
상호적인 종점 IgG 서브클래스 역가는 초기 면역화 6주 후에, 2차 면역화 2주 후에 풀링 혈청(n = 5 Balb/c)으로 측정된다. 마우스는 달리 언급하지 않는 한, 펩타이드 25 ㎍으로 둔부에서 피하 면역화된다. 프로인트 보조제의 수용자 경우, 마우스를 완전한 프로인트 보조제로 유화된 펩타이드로 프라이밍하고, 불완전한 프로인트 보조제로 4주 및 6주 째에 부스팅한다. MPLTM SE는 투여량마다 2% 스쿠알렌 오일 및 MPLTM 50 ㎍을 함유하는 에멀션으로서 제공된다. SE는 스쿠알렌, 글리세롤 및 유화제로 이루어진 수중유 에멀션 비히클이다. 재조합 쥐 IL-12는 50 ng/마우스로 전달된다. 재조합 쥐 GM-CSF는 10 ㎍/마우스로 전달된다. 결과는 표 2에 나타나 있다.
표 2
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 서브클래스 역가
Figure 112001029140742-pct00002
실시예 4
질 세척 IgG 및 IgA 항-T1SP10MN(A)(-Cys) 항체 역가
질 IgG 및 IgA 항-펩타이드 항체 역가는 최종 면역화 2주 후에 수득된 세척액으로 측정된다. 5 마리의 Balb/c 암컷 마우스 그룹이 T1SP10MN(A)(-Cys) 25 ㎍ 및 명시된 보조제 제형물로 0, 28 및 42일 째에 면역화된다. 질 항체 역가는 풀링 세척액으로 측정된다. 결과는 표 3에 나타나 있다.



표 3
질 세척 IgG 및 IgA 항-T1SP10MN(A)(-Cys) 항체 역가
Figure 112001029140742-pct00003
실시예 5
비장 세포 증식
T1SP10MN(A)(-Cys) 및 다양한 보조제 제형물로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포의 증식이 측정된다. 5 마리의 Balb/c 암컷 마우스 그룹이 0일 및 28일 째에 T1SP10MN(A)(-Cys) 25 ㎍ 및 명시된 보조제로 면역화된다. 비장 세포는 56일 째에 배양액에 정착되고, 96시간 후에 3H-티미딘 도입의 측정을 위해 수확된다. 마우스는 수성 제형물로 또는 2% SE와 함께 안정한 에멀션으로 IL-12 50 ng, GM-CSF 10 ㎍, MPLTM 50 ㎍으로 면역화된다. 데이타는 자극 없이 배양액에서 성장한 세포로 측정된 증식 값과 비교한 델타 cpm 값으로 표시된다. 백그라운드 자극 카운트는 <800 cpm이다. 결과는 표 4에 나타나 있다.
표 4
비장 세포 증식
Figure 112001029140742-pct00004
실시예 6
비장 세포에 의한 IL-4의 분비
T1SP10MN(A)(-Cys) 25 ㎍으로 자극된 비장 세포에 의해 배양액으로 분비된 인터류킨-4가 측정된다. 비장 세포는 5 마리의 Balb/c 암컷 마우스의 풀로부터 수확되고 명시된 항원 자극원(명시된 바와 같이 IL-12 50 ng, GM-CSF 10 ㎍, MPLTM 50 ㎍)과 함께 3일 또는 6일간 배양된다. 인터류킨-4 수준은 ELISA에 의해 측정되고, 알고 있는 농도를 가지는 표준과 비교된다. 블랭크 웰은 분석이 이러한 배양 조건으로 인터류킨-4를 검출할 수 없음을 나타낸다. 검출 감도의 더 낮은 한계는 22 유니트/㎖이다. 결과는 표 5에 나타나 있다.

표 5a
비장 세포에 의한 IL-4의 분비
3일 배양:
Figure 112001029140742-pct00005
표 5b
비장 세포에 의한 IL-4의 분비
6일 배양:
Figure 112001029140742-pct00006


실시예 7
비장 세포에 의한 인터페론-감마의 분비
인터페론-감마가 T1SP10MN(A)(-Cys) 25 ㎍으로 자극된 비장 세포에 의해 배양액으로 분비된다. 비장 세포는 5 마리의 Balb/c 암컷 마우스의 풀로부터 수확되고 명시된 항원 자극원(실시예 6과 동일)과 함께 3일 또는 6일간 배양된다. 인터페론-감마 수준은 ELISA에 의해 측정되고, 알고 있는 농도를 가지는 표준과 비교된다. 블랭크 웰은 분석이 이러한 배양 조건으로 인터페론-감마를 검출할 수 없음을 나타낸다. 검출 감도의 더 낮은 한계는 4 피코그램/㎖이다. 결과는 표 6에 나타나 있다.
표 6a
비장 세포에 의한 인터페론-감마의 분비
3일 배양:
Figure 112001029140742-pct00007


표 6b
비장 세포에 의한 인터페론-감마의 분비
6일 배양:
Figure 112001029140742-pct00008
실험 2
HIV 펩타이드 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
실시예 8
재료 및 방법
동물
생후 7-9주가 된, 암컷 Balb/c 마우스가 상기 실시예 1에 따라 사용된다.
펩타이드
실시예 1에 설명된 HIV-1-MN 펩타이드 T1SP10MN(A)가 사용된다. 펩타이드는 식염수로 1 mg/㎖의 농도로 재수화된다.
보조제
사용되는 보조제는 일부 예에서, MPLTM이 안정한 에멀션 형태를 사용하는 대 신 수성 제형물로 보유됨을 제외하고는, 실시예 1에서 설명된 바와 같다.
면역화
마우스를 미부의 각 측면에 동등하게 나눈 0.2 ㎖의 전체 용적으로 둔부에서 피하 면역화한다. 면역화는 보조제(들)의 명시된 양과 함께, HIV 펩타이드 25 ㎍으로 0일 및 21일 째에 도입된다. CFA/IFA를 투여받은 마우스에 0일에 CFA를 21일 째에 IFA를 투여한다. 희석 및 혼합은 실시예 1에 설명된 바와 같다.
샘플 수집
동물로부터의 샘플 수집은 각 면역화 하루 전 및 2차 면역화 14일 후에 실시예 1의 프로토콜에 따라 수행된다.
세포 제제
세포 제제는 실시예 1의 프로토콜에 따라 생성되고 취급된다.
효소면역 흡착 분석
ELISA가 실시예 1의 프로토콜에 따라 수행된다.
HIV-1 MN 중화 분석
중화 분석은 반복하여 실시예 1의 프로토콜에 따라 Duke University에서 수행된다.
실시예 9
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 역가
상호적인 항-펩타이드 IgG 종점 역가가 2차 면역화 14일 후에 수득된, 각 마 우스(GMT) 또는 풀링 혈청(n = 5 Balb/c)으로부터의 기하 평균으로 측정된다. IgG1 및 IgG2a 서브클래스 종점 역가 또한 풀링 혈청으로부터 측정된다. 프로인트 보조제의 수용자 경우, 마우스를 CFA로 유화된 펩타이드 25 ㎍으로 프라이밍하고, IFA로 부스팅한다. MPLTM SE는 투여량마다 1% 스쿠알렌 오일 및 MPLTM 50 ㎍을 함유하는 에멀션으로 제공된다. 수성 MPLTM은 투여량마다 50 ㎍으로 전달된다. 재조합 쥐 IL-12는 40 ng/마우스로 전달된다. 재조합 쥐 GM-CSF는 10 ㎍/마우스로 전달된다. 결과는 표 7에 나타나 있다.
표 7
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 역가
Figure 112001029140742-pct00009

실시예 10
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 서브클래스 역가
상호적인 HIV 펩타이드-특이적 질 세척 종점 IgG 및 IgA 항체 역가가 2차 면역화 15일 후에 풀링 혈청(n = 5 Balb/c)으로 측정된다. 마우스는 실시예 9에서처럼 면역화된다. MPLTM SE는 투여량마다 1% 스쿠알렌 오일 및 MPLTM 50 ㎍을 함유하는 에멀션으로 제공된다. 수성 MPLTM은 투여량마다 50 ㎍으로 전달된다. 재조합 쥐 IL-12는 40 ng/마우스로 전달된다. 재조합 쥐 GM-CSF는 10 ㎍/마우스로 전달된다. 결과는 표 8에 나타나 있다.
표 8
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 및 IgA 종점 역가
Figure 112001029140742-pct00010

실시예 11
비장 세포 증식
T1SP10MN(A)(-Cys) 및 다양한 보조제 제형물(실시예 10과 동일)로의 시험관내 자극에 반응하는 비장 세포 증식이 측정된다. 세포는 총 96시간 동안 배양된다. 3H-티미딘은 마지막 18시간 동안 배양액에 첨가된다. 데이타는 배양액에서 ConA로 자극된 세포로 표준화된 증식 지수로 표시된다: ([평균 cpm 항원/평균 cpm ConA]-[평균 cpm 배지/평균 cpm ConA]) ×100. 그 결과, 배지에서 배양된 세포는 0의 백그라운드 증식을 가진다. 결과는 표 9에 나타나 있다. 비자극 배양액에서 성장한 세포보다 낮은 증식 값은 괄호 안에 있다.
표 9
비장 세포 증식
Figure 112001029140742-pct00011
실시예 12
비장 세포에 의한 IL-4의 분비
T1SP10MN(A)(-Cys)로 자극된 비장 세포에 의해 배양액에 분비된 인터류킨-4가 측정된다. 세포는 총 96시간 동안 배양된다. 세포 배양 상등액은 ELISA에 의해 IL-4에 대해 분석된다. 모든 값은 무관한 단백질(라이소자임) 10 ㎍으로 자극된 세포의 상등액으로 측정된 값에서 감한 후의 값이다. 결과는 표 10에 pg/㎖로 나타나 있다. 라이소자임으로 유도된 자극에서 감한 후에, 검출 한계 이하의 결과는 "bd"로 표시된다. 보조제는 IL-12 40 ng, GM-CSF 10 ㎍ 및 MPLTM 50 ㎍이다.
표 10
비장 세포에 의한 IL-4의 분비
Figure 112001029140742-pct00012

실시예 13
비장 세포에 의한 인터페론-감마의 분비
T1SP10MN(A)(-Cys)로 자극된 비장 세포에 의해 배양액에 분비된 인터페론-감마가 측정된다. 세포는 총 96시간 동안 배양된다. 세포 배양 상등액은 ELISA로 인터페론-감마에 대해 분석된다. 모든 값은 라이소자임 10 ㎍으로 자극된 세포의 상등액으로 측정된 값에서 감한 후의 값이다. 결과는 유니트/㎖로 표 11에 나타나 있다. 라이소자임으로 유도된 자극에서 감한 후에, 검출 한계 이하의 결과는 "bd"로 표시된다. 보조제는 실시예 12와 동일하다.
표 11
비장 세포에 의한 인터페론-감마의 분비
Figure 112001029140742-pct00013


실험 3
HIV 펩타이드 및 다양한 보조제로의 Swiss-Webster 마우스의 면역화
Balb/c 마우스 대신 Swiss-Webster 마우스를 사용하여, 실험 2의 프로토콜을 수행한다. 상호적인 항-펩타이드 IgG 종점 역가와 상호적인 질 세척 종점 IgG 및 IgA 항체 역가만이 이 실험에서 측정된다.
실시예 14
상호적인 항-HIV 펩타이드 IgG 종점 역가
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 역가가 2차 면역화 14일 후에 수득된, 각 Swiss-Webster 마우스(GMT)로부터의 기하 평균으로 측정된다. IgG1 및 IgG2a 서브클래스 종점 역가 또한 풀링 혈청으로 측정된다. 프로인트 보조제의 수용자 경우, 마우스를 CFA로 유화된 펩타이드로 프라이밍하고, IFA로 부스팅한다. MPLTM SE는 투여량마다 1% 스쿠알렌 오일 및 MPLTM 50 ㎍을 함유하는 에멀션으로 제공된다. 수성 MPLTM은 투여량마다 50 ㎍으로 전달된다. 재조합 쥐 IL-12는 40 ng/마우스로 전달된다. 재조합 쥐 GM-CSF는 10 ㎍/마우스로 전달된다. 결과는 표 12에 나타나 있다.



표 12
상호적인 항-HIV 펩타이드 IgG 종점 역가
Figure 112001029140742-pct00014
실시예 15
상호적인 항-HIV 펩타이드 IgG 종점 서브클래스 역가
상호적인 HIV 펩타이드-특이적 질 세척 종점 IgG 및 IgA 항체 역가가 2차 면역화 15일 후에 풀링 혈청(n = 5 Swiss-Webster)으로 측정된다. 마우스는 실시예 14처럼 면역화된다. MPLTM SE는 투여량마다 1% 스쿠알렌 오일 및 MPLTM 50 ㎍을 함유하는 에멀션으로 제공된다. 수성 MPLTM은 투여량마다 50 ㎍으로 전달된다. 재조합 쥐 IL-12는 40 ng/마우스로 전달된다. 재조합 쥐 GM-CSF는 10 ㎍/마우스로 전달된다. 결과는 표 13에 나타나 있다.
표 13
상호적인 항-HIV 펩타이드 IgG 및 IgA 종점 역가
Figure 112001029140742-pct00015
실험 4
HIV 펩타이드 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
마우스가 0 및 28일 째에 면역화되고, 0, 27 및 41일 째에 혈청학 평가를 위해 출혈시킴을 제외하고는, 실험 2의 프로토콜을 수행한다. CFA/IFA는 0일에 CFA와, 28일 째에 IFA와 함께 제형된다. MPLTM SE는 MPLTM 50 ㎍ 및 2% SE와 함께 제형되고, 반면 IL-12 50 ng 및 GM-CSF 10 ㎍이 사용된다.
실시예 16
상호적인 항-HIV 펩타이드 IgG 종점 역가
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 역가가 초기 면역화 41일 후에, 2차 면역화 13일 후에 각 마우스 및 이의 기하 평균(n = 5 Balb/c)으로 측정된다. 결과는 표 14에 나타나 있다. 0일의 각 역가는 모두 50 이하이다. "[데이타 없음]"이라는 표시는 프로토콜의 완료 전에 사망한 동물을 의미한다. "SD"는 표준편차를 의미한다.
표 14
T1SP10MN(A)(-Cys)에 대해 특이적인 각 마우스 및 기하 평균 IgG 혈청 역가
Figure 112001029140742-pct00016
실시예 17
상호적인 항-HIV 펩타이드 IgG 종점 서브클래스 역가
상호적인 종점 항-펩타이드 IgG 서브클래스 역가가 초기 면역화 41일 후에, 2차 면역화 13일 후에 풀링 혈청(n = 5 Balb/c)으로부터 측정된다. 결과는 표 15에 나타나 있다.



표 15
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 서브클래스 역가
Figure 112001029140742-pct00017
실시예 18
질 세척 IgG 및 IgA 항-HIV 펩타이드 항체 역가
질 IgG 및 IgA 항-펩타이드 항체 역가는 초기 면역화 41일 후에, 2차 면역화 13일 후에 세척액으로 측정된다. 결과는 표 16에 나타나 있다.






표 16
질 세척 IgG 및 IgA 항-T1SP10MN(A)(-Cys) 항체 역가
Figure 112001029140742-pct00018
실시예 19
비장 세포 증식
T1SP10MN(A)(-Cys) 및 다양한 보조제 제형물로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포의 증식이 측정된다. 비장 세포는 T1SP10MN(A)(-Cys) 3.3 ㎍/㎖로 4일간 시험관내 자극된다. 결과는 자극의 부재시 도입에 대한 T1SP10MN(A)(-Cys) 3.3 ㎍/㎖로 시험관내 자극 결과로서 표지된 티미딘 도입의 변화(델타 cpm)로 도 4에 나타나 있다.
실험 5
HIV 펩타이드 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
마우스가 0일 및 22일 째에 피하 면역화되고 42일 째에 혈청학 평가를 위해 출혈시킴을 제외하고는, 실험 2의 프로토콜을 수행한다. MPLTM SE는 MPLTM 50 ㎍ 및 1% SE와 함께 제형되고, 반면 GM-CSF 10 ㎍이 사용된다.
실시예 20
상호적인 항-HIV 펩타이드 IgG 종점 역가
상호적인 항-펩타이드 종점 IgG 서브클래스 역가가 초기 면역화 42일 후에, 2차 면역화 13일 후에 풀링 혈청(n = 5 Balb/c)으로 측정된다. IgG에 대한 표준편차와 함께 기하 평균 또한 측정된다. 결과는 표 17에 나타나 있다.
표 17
상호적인 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 종점 역가
Figure 112001029140742-pct00019
실험 6
HIV 펩타이드 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
HIV 펩타이드가 아미노산 17 위치에 시스테인을 포함하고, 마우스(n = 3 Balb/c)가 0일 및 21일 째에 피하 면역화되며, -1(1차 면역화 하루 전), 13, 20 및 28일 째에 혈청학 평가를 위해 출혈시킴을 제외하고는, 실험 2의 프로토콜을 수행 한다. MPLTM SE는 MPLTM 50 ㎍ 및 1% SE와 함께 제형되고, 반면 GM-CSF 10 ㎍이 사용된다. HIV 펩타이드 T1SP10MN(A)(+Cys)(26)는 아미노산 17 위치에 시스테인을 포함하고 40개 잔기의 길이이다. T1SP10MN(A)(+Cys)는 Genosys Biotechnologies(The Woodlands, TX)로부터 구입한다.
실시예 21
상호적인 항-T1SP10MN(A) IgG 종점 역가
상호적인 항-T1SP10MN(A) IgG 종점 역가가 각 마우스 및 기하 평균(n = 3 Balb/c)으로 초기 면역화 28일 후에 측정된다. 결과는 표 18에 나타나 있다.
표 18
MPLTM SE + GM-CSF가 HIV 펩타이드(+Cys)에 대한 IgG 반응에 끼치는 영향
Figure 112001029140742-pct00020
실험 7
HIV 펩타이드 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
마우스(n = 3 Balb/c)가 0일 및 32일 째에 피하 면역화되고, 38일 째에 혈청 학 평가를 위해 출혈시킴을 제외하고는, 실험 6의 프로토콜을 수행한다. MPLTM SE는 MPLTM 50 ㎍ 및 1% SE와 함께 제형되고, 반면 GM-CSF 10 ㎍이 사용된다.
실시예 22
상호적인 항-HIV 펩타이드 IgG 종점 역가
상호적인 항-T1SP10MN(A)(+Cys) IgG 종점 역가가 각 마우스 및 기하 평균(n = 3 Balb/c)으로 초기 면역화 38일 후에 측정된다. 결과는 표 19에 나타나 있다.
표 19
MPLTM SE + GM-CSF가 HIV 펩타이드(+Cys)에 대한 IgG 반응에 끼치는 영향
Figure 112001029140742-pct00021


실험 8
Balb/c 마우스의 CTL 분석
마우스의 면역화를 고려하여 실험 6의 프로토콜을 수행한다. 2차 면역화 7일 후에 마우스로부터 분리된 비장 세포의 CTL 활성이 평가된다. MPLTM SE는 1% SE 중의 MPLTM 50 ㎍(GM-CSF 10 ㎍과 함께 또는 GM-CSF 없이) 및 T1SP10MN(A)(+Cys) 50 ㎍과 함께 제형된다.
실시예 23
Balb/c 마우스의 CTL 분석
CTL 분석을 위해, 비장 세포가 1차 면역화 14일 후 및 2차 면역화 7일 후에 면역화된 마우스로부터 제거된다. 본질적으로 이미 설명된 프로토콜(34)에 따라 수행된다. 간략하게 설명하면, 그룹마다 3 마리 마우스로부터의 적혈구-고갈 비장 세포가 풀링된다. 비장 작동 세포(4 ×106/㎖)가 "MN", 또는 "IIIB" 10mer CTL 에피토프 펩타이드 1 ㎍/㎖로 7일간 1.5-2 ㎖의 용적으로 24 웰 배양 플레이트에서 재자극된다. CTL 에피토프는 모두 H-2Dd에 제한된다. 배양액에 배양하는 마지막 5일간 재조합 쥐 IL-2(Biosource) 10 U/㎖를 보충한다. 세포독성 활성의 분석을 위해, P815 세포를 Cr51로 표지하고 4시간 동안 펩타이드(IIIB 또는 MN) 5 ㎍/㎖로 펄싱한 다음, 배양된 비장 작동 세포에 첨가한다. 작동 세포 대 표적 세포 비의 3배 희석인, 100:1 내지 3.7:1이 사용된다. CTL 활성%는 ((특이적 크롬 방출 - 자연 크롬 방출)/(최고 크롬 방출 - 자연 크롬 방출)) ×100을 사용하여 크롬 방출의 %로 계산된다. 크롬 방출은 배양 6시간 후에 평가된다. 크롬의 평균 자연 방출은 항상 최고 방출의 15%이하이다. 28일 째의 결과의 데이타는 도 5에 나타나 있다.
실험 9
다양한 SIV 펩타이드 및 보조제로의 리서스 짧은 꼬리 원숭이의 면역화
MPLTM SE 및 GM-CSF 보조제 제형물이 항원-특이적 CTL을 유도하는 능력에 대해 리서스 짧은 꼬리 원숭이(Macaca Mulatta)를 시험한다. 이 실험에서, 보조제 제형물은 3 개의 개별 Mamu A*01 제한된 CTL 에피토프(각각 gag, pol 및 env로부터의 에피토프)로 이루어진 3가 펩타이드 면역원과 함께 시험되는데, 이들은 각각 Dr. Barton Haynes, Duke University의 실험실에서 SIV env로부터의 무차별 T-헬퍼 에피토프와 함께 또는 없이 화학적으로 합성된다.
Mamu A*01 제한된 CTL 에피토프를 함유하는 펩타이드는 하기와 같다:
Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met(서열번호 3)(gag)
Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val(서열번호 4)(pol)
Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile(서열번호 5)(env)
이러한 CTL-함유 에피토프는 각각 또한 하기 서열을 가지는 T-헬퍼 에피토프에 결합된다:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly
Val Ala Pro Thr Lys Ala(서열번호 6)
따라서, 3 멀티에피토프 펩타이드는 하기 서열을 가진다:
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly
Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln
Met(서열번호 7)
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly
Val Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu
Val(서열번호 8)
Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly
Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln
Ile(서열번호 9)
CTL 분석은 Dr. Norman Letvin, Harvard Medical School의 실험실에서 Mamu A*01 제한된 테트라머 염색 분석으로 수행된다.
동물, 투여량 및 면역원:
HLA-A 상동 분자 Mamu A*01 및 서브타입 DRβ0201을 발현하는 리서스 짧은 꼬리 원숭이를 PCR로 동정하고 New Iberia, LA에 콜로니로 둔다.
연구는 각각 표 20에 설명된 2 마리의 어린 리서스 짧은 꼬리 원숭이(Macaca Mulatta) 3 그룹을 포함한다. 그룹 1은 2 마리의 Mamu A*01 양성, DRβ0201 음성 동물 Rh 73 및 Rh 80으로 구성된다. 이러한 동물에 MPLTM SE 및 GM-CSF와 함께, 3가 Mamu A*01 제한된 SIV gag, env 및 pol CTL 에피토프 펩타이드(짧은 펩타이드 칵테일)를 투여한다. 그룹 2는 MPLTM SE 및 GM-CSF와 함께, Th/SIVCTL gag, pol 및 env 에피토프 펩타이드(긴 펩타이드 칵테일)를 투여하는, 2 마리의 Mamu A*10 양성, DRβ0201 양성 짧은 꼬리 원숭이로 구성된다. 그룹 3은 Th/SIVCTL gag, pol 및 env 펩타이드(긴 펩타이드 칵테일)가 접종된 2 마리의 Mamu A*01 음성, DRβ0201 양성 동물로 구성된다. 표 20은 사용된 HLA형 및 펩타이드 면역원으로 그룹을 상술한다.
표 20
동물, 투여량 및 면역원
Figure 112001029140742-pct00022
모든 그룹은 0, 4 및 8주 째에 1% 오일 중의 MPLTM SE 50 ㎍ 및 인간 GM-CSF
250 ㎍으로 제형된 각 펩타이드 칵테일 1 ㎖로 피하 면역화된다. MPLTM SE의 투여량은 18주의 면역화 동안 1% 오일 중의 125 ㎍까지 증가한다. 모든 그룹에 대해, 긴 펩타이드 각각 2.4 mg 및 짧은 펩타이드 각각 0.75 mg이 증류된 탈이온수 900 ㎕에 용해된다. 펩타이드 용액은 이어서 인간 GM-CSF의 재구성을 위해 사용되고, MPLTM SE 제형물 100 ㎕가 첨가된다.
실시예 24
리서스 짧은 꼬리 원숭이의 CTL 분석
동물을 2주마다 출혈시키고 헤파린 첨가 혈액을 신선하고 배양된 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 테트라머 염색함으로써 Mamu A*01 제한된 CTL에 대해 분석한다(50). PBMC는 0일에 p11c, p68A, p41A 또는 p46으로 자극된 다음 IL-2의 존재하에 배양되어 11일 째에 분석된다. 표준 51Cr 방출 분석 또한 배양된 PBMC로 수행된다(50).
테트라머 분석은 하기와 같이 수행된다:
gag로부터의 에피토프 펩타이드 p11c, pol로부터의 에피토프 펩타이드 p68A 또는 env로부터의 에피토프 펩타이드 p41A가 β2 마이크로글로불린의 존재하에 정제된 비오틴 첨가된 Mamu A*01과 함께 배양된 다음, 아비딘에 부착되고 PE(피코에리트)에 접합된다. 이어서 이 테트라머는 p11c, p68A 또는 p41A 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체로 짧은 꼬리 원숭이 CD8+ 세포를 염색하는 데 사용된다. 상이한 DR β0201 테트라머는 p46 Th 에피토프를 특이적으로 인식하는 CD4+ 세포의 염색을 허용하는 지배적인 env p46 에피토프 주위에서 폴딩된다. 결과는 표 21-24에 나타나 있다.
표 21
% P11c/SIVgag 테트라머 양성 CD8+ 세포
Figure 112001029140742-pct00023

표 22
% p68A/SIV CTL pol 테트라머 양성 CD8+ 세포
Figure 112001029140742-pct00024

표 23
% p41A/SIV env 테트라머 양성 CD8+ 세포
Figure 112001029140742-pct00025
표 24
% p46/SIV T 헬퍼 DRβ0201 테트라머 양성 CD4+ 세포
Figure 112001029140742-pct00026
실험 10
임균 포린 B 단백질 및 다양한 보조제로의 Swiss-Webster 마우스의 면역화
무작위교배 Swiss-Webster 마우스를 각각 10 마리의 5 그룹으로 나눈다. 각 그룹에 재조합 포린 B 단백질(아미노-말단에 파지로부터의 16개 아미노산을 가지는 계통 FA1090으로부터의 단백질, 이어서 포린 B 단백질의 성숙한 형태) 1 ㎍을 투여 한다. 제 1 그룹에는 보조제를 투여하지 않는다; 제 2 그룹에는 MPLTM 50 ㎍을 투여한다; 제 3 그룹에는 MPLTM과 GM-CSF 5 ㎍을 투여한다; 제 4 그룹에는 MPLTM SE 25 ㎍을 투여한다; 제 5 그룹에는 MPLTM SE와 GM-CSF 5 ㎍을 투여한다. 마우스를 미부/둔부 근저의 각각 두 부위에 동등하게 나눈, 전체 용적 0.2 ㎖로 둔부에서 피하 면역화한다. 면역화는 0주 및 4주 째에 도입된다.
실시예 25
상호적인 항-포린 B 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가
마우스를 각 면역화 하루 전 및 최종 면역화 13일 후에 출혈시킨다. 그룹의 마우스의 풀로부터의 혈청을 분석한다. 상호적인 종점 항-포린 B 단백질 IgG 서브클래스 역가가 3주 및 6주 째에 질 세척에 의해 풀링 혈청(n = 10 Swiss-Webster)으로 측정된다. 결과는 표 25에 나타나 있다. 0일의 예비-면역화 역가는 모두 50이하이다.
표 25
상호적인 항-포린 B 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가
Figure 112001029140742-pct00027
6주 째에 재조합 포린 B 단백질에 대한 각 IgG 역가 기하 평균 또한 측정된다. 결과는 표 26에 나타나 있다.
표 26
각 IgG 역가
Figure 112001029140742-pct00028
실험 11
임균 포린 B 단백질 및 다양한 보조제로의 Swiss-Webster 마우스의 면역화
무작위교배 Swiss-Wester 마우스를 각각 5 마리의 6 그룹으로 나눈다. 각 그룹에 재조합 포린 B 단백질(아미노-말단에 파지로부터의 16개 아미노산을 가지는 계통 FA1090으로부터의 단백질, 이어서 포린 B 단백질의 성숙한 형태) 1 ㎍을 투여한다. 제 1 그룹에는 보조제를 투여하지 않는다(단백질은 PBS에서 제형된다); 제 2 그룹에는 IL-12 40 ng을 투여한다; 제 3 그룹에는 MPLTM 50 ㎍을 투여한다; 제 4 그룹에는 MPLTM과 IL-12 40 ng을 투여한다; 제 5 그룹에는 MPLTM SE 25 ㎍을 투여한다; 제 6 그룹에는 MPLTM SE와 IL-12 40 ng을 투여한다. 마우스를 전체 용적 0.2 ㎖로 둔부에서 피하로 면역화한다. 면역화는 0주 및 4주 째에 도입된다.
실시예 26
상호적인 항-포린 B 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가 및 질 세척 IgG 및 IgA 역가
마우스를 각 면역화 하루 전 및 최종 면역화 13일 후에 출혈시킨다. 혈청을 그룹의 마우스로부터의 풀로 분석한다. 상호적인 종점 항-포린 B 단백질 IgG 서브클래스 역가가 질 세척에 의해 풀링 혈청(n = 5 Swiss-Webster)으로 측정되고, IgG 및 IgA 질 세척 역가가 각각 3주 및 6주 째에 측정된다. 결과는 표 27에 나타나 있다. 0일의 예비-면역화 역가는 모두 50 이하이다. 질 세척 분석을 위한 출발 희석은 1/5이다.
표 27
상호적인 항-포린 B 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가 및 질 세척 IgG 및 IgA 역가
Figure 112001029140742-pct00029



실험 12
호흡기 합포체 바이러스 F 단백질 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
Balb/c 마우스를 각각 5 마리의 7 그룹으로 나눈다. 각 그룹에 정제된 네이티브 인간 호흡기 합포체 바이러스(RSV) F 단백질(이량체 형태) 3 ㎍을 투여한다. 제 1 그룹에는 보조제를 투여하지 않는다(단백질은 PBS에서 제형된다); 제 2 그룹에는 알루미늄 포스페이트(알룸) 100 ㎍을 투여한다; 제 3 그룹에는 StimulonTM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA) 20 ㎍을 투여한다; 제 4 그룹에는 MPLTM 50 ㎍을 투여한다; 제 5 그룹에는 MPLTM과 GM-CSF 5 ㎍을 투여한다; 제 6 그룹에는 MPLTM SE 25 ㎍을 투여한다; 제 7 그룹에는 MPLTM SE와 GM-CSF 5 ㎍을 투여한다. 마우스를 대퇴 상부에 전체 용적 0.2 ㎖로 근육내 면역화한다. 면역화는 0주 및 4주 째에 도입된다.
실시예 27
상호적인 항-RSV F 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가
마우스를 각 면역화 하루 전 및 최종 면역화 13일 후에 출혈시킨다. 그룹의 마우스의 풀로부터의 혈청이 분석된다. 상호적인 종점 항-RSV F 단백질 IgG 서브클래스 역가가 풀링 혈청(n = 5 Balb/c)으로 측정된다. 결과는 표 28에 나타나 있다. 0일의 예비면역화 역가는 모두 50 이하이다.
표 28
상호적인 항-RSV F 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가
Figure 112001029140742-pct00030
실시예 28
비장 세포 증식
RSV F 단백질 2.5 ㎍/㎖ 및 다양한 보조제 제형물(실시예 27과 동일)로의 시험관내 자극에 반응하는 비장 세포 증식이 측정된다. 비장 세포는 2차 면역화 14일 후에 수확되고 5 ×105 세포의 밀도로 배양액에 정착된다. 세포는 총 96시간 동안 배양된다. 3H-티미딘이 마지막 18시간 동안 배양액에 첨가된다. 데이타는 ConA로 배양액에서 자극받은 세포로 표준화된 증식 지수로 제시된다 ([평균 cpm 항원/평균 cpm ConA] - [평균 cpm 배지/평균 cpm ConA]) ×100. 그 결과, 배지에서 배양된 세포는 0의 백그라운드 증식을 가진다. 결과는 표 29에 나타나 있다.


표 29
비장 세포 증식
Figure 112001029140742-pct00031
실험 13
호흡기 합포체 바이러스 F 단백질 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
실험 12의 프로토콜을 반복한다(다양한 보조제와 함께 또는 보조제 없이 RSV F 단백질로 0주 및 4주 째에 면역화).
실시예 29
상호적인 항-RSV F 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가
마우스를 각 면역화 하루 전 및 최종 면역화 13일 후에 출혈시킨다. 그룹의 마우스의 풀로부터의 혈청이 분석된다. 상호적인 종점 항-RSV F 단백질 IgG 서브클래스 역가가 풀링 혈청(n = 5 Balb/c)으로 측정된다. 결과는 표 30에 나타나 있다. 0일의 예비-면역화 역가는 모두 50 이하이다.

표 30
상호적인 항-RSV F 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가
Figure 112001029140742-pct00032
실시예 30
비장 세포 CTL 활성
RSV F 단백질 및 명시된 보조제로의 면역화 결과로 비장 세포 CTL(세포독성 T-림프구) 활성이 최종 면역화 2주 후에 평가된다. 데이타는 작동 세포 대 표적 세포의 비 33:1로 RSV-감염된 표적 세포와 함께 배양된 비장 세포의 특이적 CTL 활성%을 나타낸다. 특이적 CTL 활성%는 실시예 24에서처럼, RSV-감염된 표적 세포에 대해 특이적인 활성에서 비-감염 표적에 대한 CTL 활성을 감함으로써, 측정된다. 나이브 비장 세포는 2시간 동안 1.5의 MOI(감염 다중도)로 시험관내 자극 세포의 공급원으로서 RSV로 감염된다. 면역화된 마우스의 비장으로부터의 반응 세포가 5:1의 비로 자극 세포에 첨가되어, 6일간 배양된다. 5일 째에, 표적 세포(Balb/C MHC-H-2d 세포주)가 2시간 동안 10의 MOI로 RSV로 감염되고 밤새 배양된다. 6일 째에, 감염 및 비-감염 표적 세포가 수확되고 51Cr로 펄싱된다. 이어서 시험관내 작동 세포가 100:1 내지 3:1 범위의 E:T의 비로 표적 세포에 첨가된다. 크롬 방출이 배양 4시간 후에 측정된다. 결과는 표 31에 나타나 있다.
표 31
비장 세포 CTL 활성
Figure 112001029140742-pct00033
실험 14
호흡기 합포체 바이러스 F 단백질 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
Balb/c 마우스를 각각 5 마리의 6 그룹으로 나눈다. 각 그룹에 정제된 네이티브 RSV F 단백질(이량체 형태) 3 ㎍을 투여한다. 제 1 그룹에는 보조제를 투여하지 않는다(단백질은 PBS에서 제형된다); 제 2 그룹에는 IL-12 40 ng을 투여한다; 제 3 그룹에는 MPLTM 50 ㎍을 투여한다; 제 4 그룹에는 MPLTM과 IL-12 40 ng을 투여한다; 제 5 그룹에는 MPLTM SE 25 ㎍을 투여한다; 제 6 그룹에는 MPLTM SE와 IL-12 40 ng을 투여한다. 마우스는 미부의 각 측면에 주어지는 두 투여량 사이에 동등하게 나눈, 0.2 ㎖의 전체 용적으로 둔부에서 피하 면역화된다. 면역화는 0주 및 4주 째에 도입된다.
실시예 31
상호적인 항-RSV F 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가
마우스를 각 면역화 하루 전 및 최종 면역화 13일 후에 출혈시킨다. 그룹의 마우스의 풀로부터의 혈청을 분석한다. 상호적인 종점 항-RSV F 단백질 IgG 서브클래스 역가를 풀링 혈청(n = 5 Balb/c)으로 측정한다. 결과는 표 32에 나타나 있다. 0일의 예비-면역화 역가는 모두 50 이하이다.
표 32
상호적인 항-RSV F 단백질 IgG 종점 서브클래스 역가
실시예 32
비장 세포 CTL 활성
RSV F 단백질 및 명시된 보조제로의 면역화 결과로서 비장 세포 CTL 활성이 최종 면역화 2주 후에 평가된다. 데이타는 33:1의 작동 세포 대 표적 세포의 비로 RSV-감염된 표적 세포와 함께 배양된 비장 세포의 특이적 CTL 활성%를 나타낸다. 특이적 CTL 활성%는 실시예 24에서처럼, RSV-감염된 표적 세포에 대해 특이적인 활성에서 비-감염된 표적에 대한 CTL 활성을 감함으로써 측정된다. 나이브 비장 세포 는 2시간 동안 1.5의 MOI로 시험관내 자극 세포의 공급원으로서 RSV로 감염된다. 면역화된 마우스의 비장으로부터의 반응 세포가 5:1의 비로 자극 세포에 첨가되고, 6일간 배양된다. 5일 째에, 표적 세포(Balb/C MHC-H-2d 세포주)는 2시간 동안 10의 MOI로 RSV로 감염되고 밤새 배양된다. 6일 째에, 감염 및 비-감염 표적 세포가 수확되고 51Cr로 펄싱된다. 이어서 시험관내 작동 세포가 100:1 내지 3:1 범위의 E:T의 범위로 표적 세포에 첨가된다. 크롬 방출은 배양 4시간 후에 측정된다. 결과는 표 33에 나타나 있다.
표 33
비장 세포 CTL 활성
Figure 112001029140742-pct00035
실험 15
인플루엔자 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 및 다양한 보조제로의 Balb/c 마우스의 면역화
Balb/c 마우스를 각각 5 마리의 6 그룹으로 나눈다. 각 그룹에 A/dorn/307/72 계통으로부터의 인플루엔자 바이러스 NP(뉴클레오캡시드) 단백질 1 ㎍을 투여한다. [그룹 체크] 제 1 그룹에는 보조제를 투여하지 않는다(펩타이드는 PBS에서 제형된다); 제 2 그룹에는 알루미늄 포스페이트(알룸) 100 ㎍을 투여한다; 제 3 그룹에는 MPLTM 50 ㎍을 투여한다; 제 4 그룹에는 MPLTM과 GM-CSF 5 ㎍을 투여한다; 제 5 그룹에는 MPLTM SE 25 ㎍을 투여한다; 제 6 그룹에는 MPLTM SE와 GM-CSF 5 ㎍을 투여한다. 마우스를 전체 용적 0.2 ㎖로 둔부에서 피하 면역화한다. 면역화는 0주 및 4주 째에 도입된다.
실시예 33
비장 세포 CTL 활성
인플루엔자 NP 펩타이드 및 명시된 보조제로의 면역화의 결과로서 비장 세포 CTL 활성이 최종 면역화 2주 후에 평가된다. 평가는 펩타이드-펄싱 표적 p815 세포(NP의 147-155 아미노산에 상응하는 펩타이드이고 Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val(서열번호 14)의 서열을 가짐)를 사용하여 실시예 32의 과정에 따라 수행된다. MPLTM 또는 MPLTM SE를 함유하는 제형물에 GM-CSF의 포함은 CTL 활성의 현저한 감소를 초래한다(데이타 비도시).
Figure 112001029140742-pct00036
Figure 112001029140742-pct00037
Figure 112001029140742-pct00038
<110> American Cyanamid Company <120> Adjuvant Combination Formulations <130> 33482-00/PCT <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 1 Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15 Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro 20 25 30 Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys 35 40 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 2 Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15 Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly 20 25 30 Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys 35 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 3 Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 4 Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 5 Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile 1 5 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 6 Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala 1 5 10 15 Pro Thr Lys Ala 20 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 7 Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala 1 5 10 15 Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met 20 25 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 8 Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala 1 5 10 15 Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val 20 25 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <400> 9 Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala 1 5 10 15 Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile 20 25 <210> 10 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: Human amyloid peptide protein <400> 10 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 11 <211> 28 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown Organism: Human amyloid peptide protein <400> 11 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 12 Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 13 Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 14 Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val 1 5

Claims (90)

  1. 병원성 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충, 또는 암 세포 또는 종양 세포, 또는 알레르겐, 또는 아밀로이드 베타 단백질(Aβ 단백질) 중에서 선택된 항원 ; 및
    (1) 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 지질 A, 및 (2) 과립구 대식세포 콜로니 자극인자로 구성되는 유효량의 보조제 배합물
    을 포함하는, 척추 동물 숙주에서 항원에 대한 면역반응 도출능 증대용 항원 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
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  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 1 항에 있어서, 선택된 항원이 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터의 항원인 항원 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 제 1 항에 있어서, 선택된 항원이 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)로부터의 항원인 항원 조성물.
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 제 1 항에 있어서, 선택된 항원이 임균으로부터의 항원인 항원 조성물.
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 제 1 항에 있어서, 선택된 항원이 인간 호흡기 합포체 바이러스(RSV)로부터의 항원인 항원 조성물.
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 제 1 항, 제 18 항, 제 29 항, 제 40 항 및 제 51 항 중어느 한 항에 있어서, 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 항원 조성물.
  61. 삭제
  62. 병원성 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충 중에서 선택된 항원; 및
    (1) 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 지질 A, 및 (2) 과립구 대식세포 콜로니 자극인자로 구성되는 유효량의 보조제 배합물
    을 포함하는, 척추 동물 숙주에서의 면역반응 도출능 증대용 항원 조성물.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 면역반응이 세포독성 T 림프구를 도출하는 항원 조성물.
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 제 62 항 또는 제 63 항에 있어서, 상기 항원이 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터의 항원인 항원 조성물.
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 제 62 항 또는 제 63 항에 있어서, 상기 항원이 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)로부터의 항원인 항원 조성물.
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 제 62 항 또는 제 63 항에 있어서, 상기 항원이 임균으로부터의 항원인 항원 조성물.
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 제 62 항 또는 제 63 항에 있어서, 상기 항원이 인간 호흡기 합포체 바이러스(RSV)로부터의 항원인 항원 조성물.
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 암세포 또는 종양세포로부터 선택된 암 항원 또는 종양관련 항원; 및
    (1) 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 지질 A, 및 (2) 과립구 대식세포 콜로니 자극인자로 구성되는 유효량의 보조제 배합물
    을 포함하는, 척추동물 숙주의 암 치료 또는 예방용 항원 조성물.
  89. 알레르기 항원; 및
    (1) 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 지질 A, 및 (2) 과립구 대식세포 콜로니 자극인자로 구성되는 유효량의 보조제 배합물
    을 포함하는, 알레르기 항원에 의한 척추동물 숙주에서의 알레르기 반응 완화용 항원 조성물.
  90. Aβ 단백질 또는 이의 펩타이드; 및
    (1) 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 지질 A, 및 (2) 과립구 대식세포 콜로니 자극인자로 구성되는 유효량의 보조제 배합물
    을 포함하는, 척추동물 숙주의 알츠하이머병 또는 아밀로이드증의 치료 또는 예방용 항원 조성물.
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