DE69534922T2

DE69534922T2 - Interleukin-12 als adjuvans für paramyoxviridae impfstoffe

Info

Publication number: DE69534922T2
Application number: DE69534922T
Authority: DE
Inventors: S. Barney Nashville GRAHAM; Yi-Wei Nashville TANG
Original assignee: Vanderbilt University
Current assignee: Vanderbilt University
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1995-10-02
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2015-10-03
Also published as: AU3887695A; PT784486E; MX9702396A; ATE322289T1; US6071893A; ES2257744T3; JP3939752B2; EP0784486A1; EP0784486B1; US20070087016A1; DK0784486T3; DE69534922D1; AU701753B2; JPH10507175A; WO1996011019A1

Description

HINTERGRUND
Das Respiratory Syncytial Virus (RSV), ein Mitglied der Gattung Pneumovirus der Paramyxoviridae Familie, ist ein wichtiger Auslöser von Atemwegserkrankungen bei Säuglingen und Kindern (Connors, M., et al., J. of Virol., 66:7444-7451 (1992). Die immunologische Grundlage der unterschiedlichen Anfälligkeit der Individuen sowie die begrenzte Altersspanne, wo eine ernste Erkrankung erfolgt, bleibt unklar.
Das Haupthindernis bei der Weiterentwicklung neuer Kandidatenimpfstoffe, die gegen RSV gerichtet sind, für klinische Versuche ist, dass die von Formalin-inaktivierten RSV-Impfstoffen in den 1960er Jahren verursachte Impfstoff-verstärkte Krankheit nicht vollständig verstanden ist. Klinische Versuche mit einem Formalin-inaktivierten Alaunpräzipitierten RSV-Impfstoff in den 1960ern zeigten, dass der Impfstoff die Produktion Komplement-bindender Antikörper hervorrief, aber bei dem Schutz gegen eine Infektion bei Kindern versagte. Zusätzlich verlief die Krankheit nach einer anschließenden Infektion mit einigen Todesfällen und vermehrten Krankenhauseinweisungen ungewöhnlich schwer (Kapikian, A.Z., et al., Amer. J. Epidem., 89:405 (1969); Fulginti, V.A., et al., Amer. J. Epidem., 89:435 (1969); Kim, W.H., Amer. J. Epidemol., 89:422 (1969); Chin, J.R., et al., Amer. J. Epidem., 89:449 (1969)). Eine ähnlich verstärkte Krankheit kann in Mäusen, die zuvor mit dem Formalin-inaktivierten Impfstoff immunisiert worden sind, nach einer RSV-Infektion ausgelöst werden, aber nicht in Mäusen, die mit lebenden RSV immunisiert worden sind (Connors, M., et al., J. Virol. 66:7441 (1992); Graham, B.S., et al., Immunol. 151:2032 (1993); Alwan, W.H., et al., J. Exp. Med. 179:81 (1994)). Klinische Versuche mit lebenden attenuierten RSV-Impstoffprodukten sind nicht mit einer verstärkten Krankheit in Verbindung gebracht worden. Obwohl die RSV-Lebendimpfstoffe zu keiner verstärkten Lungenerkrankung nach einer natürlichen Infektion führten, waren die Impfstoffe in anderer Hinsicht ebenso wenig erfolgreich wie Formalin-inaktivierte Alaunpräzipitierte RSV-Impfstoffe (Kim, W.H., et al., Pediatrics, 48:745 (1971); Kim, W.H., et al., Pediatrics, 52:56 (1973); Belshe, R.B., et al., J. Infect. Dis., 145:311 (1982); Wright, R.B., et al., Infect. Immun., 37:397 (1982)). Temperatursensitive Mutanten von RSV, an Kälte angepasste RSV oder lebende RSV, parenteral verabreicht, sind als Impfstoffe aufgrund der hohen Reversionsraten zu Wildtypformen, nicht akzeptierbarer Virulenz oder fehlender Immunogenität in der geeigneten Altersgruppe als aussichtslos betrachtet worden (Graham, B.S., et al., J. of Immun., 151:2032-2040 (1993).
Folglich besteht ein Bedarf an einer Entwicklung wirksamer Impfmethoden gegen RSV und an Impfstoffzusammensetzungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass IL-12 eine potente Adjuvans-Wirkung für eine Immunisierung gegen eine Paramyxoviridae Virusinfektion besitzt. In einer Anwendungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Verminderung der viralen Replikation eines Virus der Paramyxoviridae Familie in einem Wirt (z.B. Säuger, einschließlich Mensch, und Vogel), umfassend Verabreichen eines Antigens des Virus zusammen mit einer wirksamen Adjuvans-Menge an Interleukin-12 (IL-12) an den Wirt. Humane Viren der Paramyxoviridae Familie umfassen Paramyxoviren (z.B. Parainfluenza-Virus 1, Parainfluenza-Virus 2, Parainfluenza-Virus 3, Parainfluenza-Virus 4 und Mumpsvirus), Morbilliviren (z.B. Masernvirus) und Pneumoviren (z.B. Respiratory Syncytial Virus); andere nicht-humane Viren der Paramyxoviridae Familie einschließlich Hundestaupevirus, bovines RSV, Newcastle Disease Virus und Rinderpest-Virus. In einer Anwendungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verminderung der Replikation des Respiratory Syncytial Virus (RSV) in einem Wirt, umfassend Verabreichen eines RSV-Antigens zusammen mit einer wirksamen Adjuvans-Menge an IL-12 an den Wirt. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen Viren der Paramyxoviridae Familie in einem Wirt, umfassend Verabreichen eines Antigens eines Virus der Paramyxoviridae Familie zusammen mit einer wirksamen Adjuvans-Menge an IL-12 an den Wirt. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Immunisieren eines Wirts gegen RSV, umfassend Verabreichen eines Gemisches an den Wirt, umfassend ein Antigen von Respiratory Syncytial Virus zusammen mit einer wirksamen Adjuvans-Menge an IL-12.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch eines Antigens eines Virus der Paramyxoviridae Familie und einer wirksamen Adjuvans-Menge an Interleukin-12 (IL-12). In einer Anwendungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend ein Antigen des Respiratory Syncytial Virus und IL-12.
Wie es hier gezeigt ist, verringert eine Behandlung mit exogenenem IL-12, das zum Zeitpunkt der Immunisierung mit RSV-Antigen verabreicht ist, die RSV-Replikation und erhöht die endogene IL-12 mRNA-Expression zum Zeitpunkt einer nachfolgenden RSV-Challenge. Dies führt zu einer Verschiebung von einem Th2 zu einem Th1-ähnlichen Cytokin-Expressionsmuster und einer folgenden Verschiebung in einer Antikörperisotyp-Verwendung. Diese Ergebnisse zeigen, dass IL-12 ein potentes Adjuvans für Paramyxoviridae-Impfstoffe ist.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Säulendiagramm einer IL-12-Behandlung versus log 10 der Plaquebildenden Einheiten (pfu)/g Lunge aus dem Plaque-Assay, das veranschaulicht, dass zum Zeitpunkt der Immunisierung verabreichtes IL-12 eine ausgeprägte Wirkung auf die Verminderung der viralen Replikation besitzt.
2 ist ein Säulendiagramm einer IL-12-Behandlung versus gemittelte α-Tubulinnormalisierte Dichte von den mRNA-Northern-Blots, das veranschaulicht, dass IL-12 die Th1-Zelldifferenzierung verstärkt und eine Verschiebung von einer Th2 zu einer Th1-ähnlichen Antwort in Mäusen hervorrief, die mit inaktiviertem RSV-Immunogen immunisiert worden waren.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verminderung der viralen Replikation eines Virus der Paramyxoviridae Familie in einem Wirt (z.B. Säuger, einschließlich Mensch, und Vogel), umfassend Verabreichen eines Gemisches aus einem Antigen des Virus und einer wirksamen Adjuvans-Menge an Interleukin-12 (IL-12) an den Wirt. Obwohl das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von RSV beispielhaft dargestellt ist, kann das Verfahren zur Verminderung der viralen Replikation von einer Reihe an Viren der Paramyxoviridae Familie verwendet sein, das humane Paramyxoviridae-Viren umfasst, wie Paramyxoviren (z.B. Parainfluenza-Virus 1, Parainfluenza-Virus 2, Parainfluenza-Virus 3, Parainfluenza-Virus 4 und Mumpsvirus), Morbilliviren (z.B. Masernvirus) und Pneumoviren (z.B. Respiratory Syncytial Virus). Andere nicht-humane Viren der Paramyxoviridae Familie umfassen Hundestaupevirus, bovines RSV, Newcastle Disease Virus und Rinderpest-Virus. In einer Anwendungsform ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verminderung der viralen Replikation des Respiratory Syncytial Virus (RSV) in einem Wirt angewandt und umfasst Verabreichen eines RSV-Antigens und einer wirksamen Adjuvans-Menge an IL-12 an den Wirt.
In einer anderen Anwendungsform ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein Virus der Paramyxoviridae Familie in einem Wirt angewandt, umfassend Verabreichen eines Antigens des Virus und einer wirksamen Adjuvans-Menge an IL-12 an den Wirt. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Immunisieren eines Wirts gegen RSV, umfassend Verabreichen eines Gemisches, umfassend ein RSV-Antigen und einer wirksamen Adjuvans-Menge an IL-12.
Ein Antigen eines Virus der Paramyxoviridae Familie umfasst die Verwendung des ganzen Virus (z.B. inaktiviertes oder lebendes, attenuiertes ganzes Virus), eines antigenen Teils des Virus und rekombinant produzierten Virus oder Teile davon oder Fusionsproteine. Zusätzlich umfassen Antigene der vorliegenden Erfindung Nucleinsäure-Sequenzen, die ein Antigen eines Virus der Paramyxoviridae Familie codieren. Antigene Teile der Viren der Paramyxoviridae Familie umfassen das Fusionsglycoprotein (F-Protein) und die Hämagglutinin-Neuraminidase der Parainfluenza-Viren 1, 2, 3, 4; das F-Protein und die Hämagglutinin-Neuraminidase des Mumpsvirus; das F-Protein und die Hämagglutinin-Neuraminidase des Masernvirus; und das F-Protein und das G-Glycoprotein des RSV. Weitere antigene Teile der Viren der Paramyxoviridae Familie, die in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet sein können, können vom Fachmann ermittelt werden.
Das IL-12 der vorliegenden Erfindung kann aus einer geeigneten Quelle für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung erhalten sein. Zum Beispiel kann IL-12 aus natürlichen Quellen (z.B. menschlichen, tierischen) gereinigt, mit Hilfe einer chemischen Synthese oder mit rekombinanten DNA-Techniken hergestellt sein, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Zusätzlich umfasst das IL-12 der vorliegenden Erfindung IL-12 codierende Nucleinsäure-Sequenzen wie auch von derartigen Nucleinsäure-Sequenzen codierte RNAs. Wie hier verwendet, bezeichnet „Interleukin-12" und „IL-12" Interleukin 12, seine einzelnen Untereinheiten, Fragmente davon, die IL-12-Adjuvans-Aktivität zeigen, und funktionelle Äquivalente von „Interleukin-12" und „IL-12". Funktionelle Äquivalente von „Interleukin-12" und „IL-12" umfassen modifiziertes IL-12-Protein, so dass das resultierende IL-12-Produkt dieselbe Adjuvans-Aktivität besitzt wie das hier beschriebene IL-12, und Nucleinsäure-Sequenzen, die durch die Degeneration des genetischen Codes das gleiche Peptid-Genprodukt wie IL-12 codieren und die hier beschriebene IL-12 Adjuvans-Aktivität besitzen. Zum Beispiel kann ein funktionelles Äquivalent von „Interleukin-12" oder „IL-12" ein „stilles" Codon oder eine Aminosäure-Substitution (z.B. Substitution einer sauren Aminosäure durch eine andere saure Aminosäure; oder Substitution eines Codons, das eine hydrophobe Aminosäure codiert, durch ein anderes Codon, das eine hydrophobe Aminosäure codiert) enthalten.
Es ist berichtet worden, dass IL-12, ein überwiegend von Makrophagen sezerniertes heterodimeres Cytokin, die NK-Zellaktivität und CTL-Aktivität verstärkt, die Differenzierung von Th1-Zellen stimuliert und die Produktion von Cytokinen, wie IFN-γ induziert (Gately, M.K., et al, Cell. Immunol. 143:127 (1992); Naume, B., et al, J. Immunol. 148:2429 (1992); Hsieh, C.S., et al, Science 260:547 (1993); Manetti, R., et al, J. Exp. Med. 177:1199 (1993); Chan, S.H., et al, J. Exp. Med. 173:869 (1991); D'Andrea, A., et al; J. Exp. Med. 176:1387 (1992); Macatonia, S.E., et al, Int. Immunol. 5:1119 (1993); Tripp, C.S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3725 (1993)). IL-12, das früher als natürlicher Killerzellen-stimulierender Faktor oder cytotoxischer Lymphocyten-Reifungsfaktor bezeichnet worden ist, dient der Aktivierung und der Verknüpfung angeborener und erworbener Immunantworten (Kobayashi, M., et al., J. Exp. Med., 170:827 (1989); Stern, A.S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6808 (1990); Locksley, R.M., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5879 (1993)). IL-12 fördert die Differenzierung nicht geprägter T-Helferzellen in Richtung Typ 1 (Th1) Phänotyp (Hsieh; C.S., et al., Science 260:547 (1993); Manetti, R., et al, J. Exp. Med. 177:1199 (1993)). Dies führt zu einer charakteristischen Cytokin-Konstellation, wie IFN-γ und fördert im Allgemeinen die zellvermittelte Immunität (Chan, S.H., et al., J. Exp. Med. 173:869 (1991); D'Andrea, A., et al, J. Exp. Med. 176:1387 (1992); Macatonia, S.E., et al, Int. Immunol. 5:1119 (1993); Gately, M.K., et al, Cell. Immunol. 143:127 (1992); Naume, B., et al, J. Immunol. 148:2429 (1992)). Von IL-12 ist gezeigt worden, dass es die Immunantwort verstärkt und die schützende Immunität in mehreren Infektionskrankheitsmodellen, einschließlich Listeriose, Leishmaniase, Toxoplasmose und lymphocytäre Choriomeningitis-Virusinfektion verbessert (Tripp, C.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3725 (1993); Heinzel, F.P., et al, J. Exp. Med. 177:1505 (1993); Sypek, J.P., et al. J. Exp. Med. 177:1797 (1993); Afonso, L.C., et al, Science 263:235 (1994); Gazzinelli, R.T., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6115 (1993); Khan, I.A., et al, Infect. Immun. 62:1639 (1994); Orange, J.S., et al, J. Immunol. 152:1253 (1994)). Die Reinigung und Klonierung von IL-12 sind in der PCT-Veröffentlichung, Nr. WO 92/05256 und WO 90/05147, und in der europäischen Patentpublikation Nr. 322.827 (als „CLMP" bezeichnet) offen gelegt.
Wir haben Kenntnis von der europäischen Patentanmeldung EP 0 609 739 (American Cyanimid Company), die ein Verfahren zur Reversion der Immunsuppression in Impfstoffen beschreibt. Cytokine oder Cytokinhemmer sind zusammen mit dem Kombinationsimpfstoff verabreicht. Das Cytokin oder der Cytokinhemmer können gleichzeitig mit oder nach dem Impfstoff verabreicht sein, und können rekombinant produziert oder von einer Zellkultur isoliert sein.
Interleukin-12 oder IL-12 ist ein Säuger-Cytokin, das zahlreiche immunologische Wirkungen zeigt, einschließlich Modulation der T-Zellantwort auf Antigene (siehe zum Beispiel PCT-Veröffentlichungen, Nr. WO 92/05256 und WO 90/05147, worin IL-12 als ein „NKSF" bezeichnet ist). Es ist ebenfalls allgemein vermutet worden, dass IL-12 als ein Impfstoff-Adjuvans eine Verwendung finden könnte (Scott, P., Science, 260:496-497 (1993)); Trichieri, G., Immunology Today, 14:335-338 (1993)).
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist eine wirksame Adjuvans-Menge an IL-12 in zusammen mit einem Antigen eines Virus der Paramyxoviridae Familie verabreicht. Das heißt, das IL-12 ist zu einem sehr nahen Zeitpunkt bezogen auf die Immunisierung des Wirts mit dem viralen Antigen verabreicht, so dass eine verstärkte Immunantwort in dem Wirt verglichen mit der Immunisierung in einem Wirt hervorgerufen wird, dem IL-12 nicht verabreicht ist. Folglich kann das IL-12 vor, vorzugsweise genau vor, einer Immunisierung, zum Zeitpunkt einer Immunisierung (d.h. gleichzeitig) oder nach einer Immunisierung (d.h nachfolgend) verabreicht sein. Zusätzlich kann das IL-12 vor Immunisierung mit dem viralen Antigen der Paramyxoviridae Familie, im Anschluss an nachfolgende Injektionen von IL-12 nach Immunisierung mit dem Antigen verabreicht sein.
Das IL-12 und das Antigen können an einen Wirt auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Die Verabreichungswege umfassen intrademale, transdermale (z.B. Depotpolymere), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale, epidurale und intranasale Wege. Jeder andere geeignete Verabreichungsweg kann genommen sein, zum Beispiel Infusion oder Bolusinjektion oder Absorption durch Epithel- oder Mukokutanschichten. Zusätzlich können das IL-12 und das Antigen des Paramyxoviridae-Virus zusammen mit weiteren Komponenten oder biologisch aktiven Agenzien, wie andere bekannte Adjuvanzien (z.B. Alaun, MPL, QS21), pharmazeutisch verträgliche Detergenzien (z.B. Glyceride), Arzneimittelhilfsstoffe (z.B. Lactose), Träger, Verdünnungsmittel und Vehikel, verabreicht sein. Falls erwünscht, können bestimmte Süßstoffe, Geschmackstoffe und/oder Farbstoffe ebenfalls zugegeben sein.
Das IL-12 und das Antigen können als ein prophylaktischer Impfstoff an Wirte verabreicht werden, die mit dem Virus entweder infiziert oder nicht infiziert sind. Das IL-12 und das Antigen können ebenfalls als ein therapeutischer Impfstoff an infizierte Wirte verabreicht werden und kann zu einer Besserung oder Beseitigung des durch den infizierenden Virus verursachten Krankheitszustandes führen.
Des weiteren kann das Antigen und/oder das IL-12 durch eine in vivo Expression von diese codierenden Polynucleotiden in einen Säuger verabreicht sein. Zum Beispiel kann das IL-12 oder das Paramyxoviridae-Antigen an einen Wirt unter Verwendung lebender Vektoren verabreicht sein, wobei die lebenden Vektoren, die IL-12-Nucleinsequenzen und/oder Antigen-Nucleinsequenzen enthalten, unter Bedingungen verabreicht sind, unter denen das Antigen und/oder IL-12 in vivo exprimiert wird. Zum Beispiel kann einem Wirt ein Vektor, der ein Antigen eines Virus der Paramyxoviridae Familie codiert und in vivo exprimiert zusammen mit IL-12-Protein oder Peptid, oder zusammen mit einem Vektor, der das IL-12-Protein codiert und in vivo exprimiert, injiziert werden. Alternativ kann einem Wirt ein Vektor, der IL-12 codiert und in vivo exprimiert zusammen mit einem Paramyxoviridae-Antigen in Protein- oder Peptidform, oder zusammen mit einem Vektor, der ein Paramyxoviridae-Antigen codiert und in vivo exprimiert, injiziert werden. Ein einziger Vektor, der die Sequenzen enthält, die ein Paramyxoviridae-Antigen und das IL- 12-Protein codieren, ist ebenfalls in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zweckdienlich.
Mehrere Expressionsvektorsysteme sind im Handel erhältlich oder können gemäß rekombinanten DNA- und Zellkulturtechniken vervielfältigt werden. Zum Beispiel können Vektorsysteme, wie die Hefe- oder Vacciniavirus-Expressionssysteme, oder virale Vektoren in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet sein (Kaufman, R.J., A. J. of Meth. in Cell and Molec. Biol., 2:221-236 (1990)). Weitere Techniken unter Verwendung nackter Plasmide oder DNA und klonierter Gene, die in zielgerichteten Liposomen oder in Erythrocyten-Ghosts verpackt sind, können zur Einführung der Polynucleotide von IL-12 und/oder Polynucleotide von Paramyxoviridae-Antigenen in den Wirt verwendet sein (Freidman, T., Science, 244:1275-1281 (1999); Rabinovich, N.R., et al., Science, 265:1401-1404 (1994)). Die Konstruktion von Expressionsvektoren und die Übertragung von Vektoren und Nucleinsäuren in verschiedene Wirtszellen können unter Verwendung gentechnischer Verfahren, wie sie in Handbüchern wie Molecular Cloning und Current Protocols in Molecular Biology beschrieben sind, oder unter Verwendung im Handel erhältlicher Kits durchgeführt sein (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 1989; Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1989).
Die in den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Antigen-Menge ist eine Menge, die eine wirksame immunstimulierende Antwort in dem Wirt hervorruft. Eine wirksame Adjuvans-Menge an IL-12 ist eine derartige Menge, die, wenn sie verabreicht ist, zu einer verstärkten Immunantwort im Vergleich mit einer Immunantwort führt, wenn eine wirksame Adjuvans-Menge an IL-12 nicht verabreicht ist. Zusätzlich hängt die Antigen-Menge von einem Virus der Paramyxoviridae Familie und IL-12, die zur Immunisierung des Wirts eingesetzt ist, von einer Reihe an Faktoren ab, einschließlich des eingesetzten Antigens, der Größe, des Alters, Körpergewichtes, allgemeinen Gesundheitszustandes, Geschlechts und der Ernährung des Wirts und des Zeitpunktes der Verabreichung, der Dauer oder der besonderen Eigenschaften des Paramyxoviridae-Virus, gegen den geimpft werden soll. Einstellung und Handhabung etablierter Dosierungsbereiche sind völlig dem Können des Fachmanns überlassen.
Die Formulierung und der Überbringungsweg von Impfstoffprodukten können die Induktion von Untermengen der T-Helfer-Lymphocyten beeinflussen und dadurch auf die Krankheitsausprägung nach einer viralen Challenge einwirken (Graham, B.S., et al., Immunol. 151:2032 (1993)). Eine Depletion an IL-4 zum Zeitpunkt der Immunisierung durch einen neutralisierenden monoklonalen Antikörper induziert eine Verschiebung von einer Th2 zu einer Th1-ähnlichen Immunantwort, die von einem verbesserten klinischen Ergebnis und einer erhöhten CD8+ cytotoxischen T-Lymphocyten-(CTL)-Aktivität begleitet ist (Tang, Y.-W., et al., J. Clin. Invest. (1994)). Dies war mit einer verstärkten Expression einer endogenen IL-12-Message zum Zeitpunkt der Challenge bei den anti-IL-4-behandelten Mäusen verbunden. Diese Feststellungen lassen vermuten, dass eine selektive Aktivierung der Th2-ähnlichen Zelluntermenge für die RSV-Impfstoff-induzierte Immunverstärkung der Krankheit verantwortlich sein kann und dass IL-12 mit einer Verschiebung der Antwort weg von Th2 zu einer eher Th1-ähnlichen Antwort verbunden sein kann.
Die Replikation von RSV ist nach einer Challenge mit lebenden RSV in Mäusen, die IL-12 erhalten haben, deutlich verringert. Die Verwendung von IL-12 als ein Adjuvans in einer Zusammensetzung, die aus einem RSV-Antigen und IL-12 besteht, induzierte ebenfalls eine Verschiebung von einer Th2 zu einer Th1-ähnlichen Immunantwort in Mäusen nach einer RSV-Challenge. Während die Wirkung des IL-12-Adjuvans für die Verminderung der RSV-Replikation wirksam war, ist es für die Verwendung als ein Impfstoff-Adjuvans wichtiger, die Krankheit nach einer RSV-Challenge abzuschwächen. Die Verwendung von Cytokinen als Adjuvanzien kann erlauben, die von einer Immunisierung induzierten Immunparameter zu steuern, um Schutzwirkungen zu verbessern und die negativen Wirkungen eines RSV-Impfstoffes verringern. Die Wirkungen von IL-12 auf die Immunantworten auf eine RSV-Impfung, wie es nach einer Challenge mit lebenden Viren in dem BALB/c-Mausmodell gemessen wurde, sind in den Beispielen beschrieben. Die Resultate zeigen, dass IL-12 als ein potentes Adjuvans wirkt und ein zweckdienliches Inhaltsprodukt in RSV-Impfstoffen ist.
Wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden die BALB/c-Mäuse mit inaktiviertem ganzen Virus intramuskulär immunisiert und murines rekombinantes IL-12 wurde an fünf aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend einen Tag vor der Immunisierung oder Challenge, intraperitoneal verabreicht. Die Mäuse wurden einer Challenge mit lebendem Virus 4 Wochen später unterzogen. Die virale Replikation in den Lungen wurde 4 Tage nach der Challenge bewertet. Zum Zeitpunkt der Immunisierung verabreichtes IL-12 zeigte eine deutliche Wirkung auf die Verringerung der viralen Replikation. Der log 10 pfu pro Lunge verringerte sich von 6,9 in RSV-immunisierten Kontrollmäusen ohne IL-12-Verabreichung auf 3,8 in immunisierten Mäusen mit IL-12-Verabreichung (1). Im Gegensatz dazu besaß eine IL-12-Verabreichung zum Zeitpunkt der Challenge keine signifikante Wirkung auf die virale Replikation (1).
Die Wirkungen unterschiedlicher Überbringungswege für IL-12 sind in Beispiel 2 beschrieben. IL-12 wurde entweder intraperitoneal, wie in Beispiel 1 beschrieben, oder vermischt mit dem RSV-Immunogen intramuskulär verabreicht. Tabelle 1 zeigt die Wirkung entweder der intraperitonealen oder der intramuskulären Überbringung von IL-12 auf die Verringerung der viralen Replikation. Eine einzige, gleichzeitig mit dem Immunogen gegebene IL-12-Dosis, besaß dieselbe Wirkung auf die Verringerung der viralen Replikation verglichen mit den 5 Dosen des intraperitonealen Dosierungsschemas. Als ein spezifischer Immunmodulator wirkte IL-12 nur in RSV-immunisierten Mäusen und zeigte keine Wirkungen in nicht immunstimulierten Mäusen (1, Tabelle 1). Diese Daten zeigen, dass IL-12 eine potente Adjuvans-Wirkung auf das inaktivierte RSV-Immunogen ausübt.
Die Muster der als Antwort auf die Immunisierung gebildeten Immunoglobulinisotypen sind indirekte Indikatoren der in vivo gebildeten Cytokintypen. IgG2a wird in Mäusen als eine Folge der Th1-Zellaktivierung gebildet, wohingegen IL-4 die Produktion von IgGI fördert (Burstein, H.J., et al., J. Immunol. 147:2950 (1991); Finkelman, F.D., et al., Annu. Rev. Immunol. 8:303 (1990); Morris; S.C., et al., J. Immunol. 152:1047 (1994)). Wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, zeigten Blindassays von Serum RSV-spezifischer Immunoglobulinisotyp-Titer in RSV-immunisierten Mäusen, die IL-12 erhalten hatten, dass IL-12 signifikant mehr RSV-spezifische IgG2a-Antikörper und signifikant weniger IgG1-Antikörper induzierte verglichen mit immunisierten Mäusen, die kein IL-12 erhalten hatten. Das Muster der IgG2a und IgG1 RSV-spezifischen Antikörper-Antwort war ähnlich, gleich ob IL-12 intramuskulär oder intraperitoneal gegeben war (Tabelle 2).
Das Muster der von IL-12 induzierten Antikörperisotyp-Verwendung lässt vermuten, dass eine in vivo IL-12-Verabreichung die Differenzierung Antigen-spezifischer CD4+ Th1-Zellen fördert und die Entwicklung von Th2-Zellen hemmt als Reaktion auf die intramuskuläre Immunisierung mit inaktiviertem RSV. Das Muster der Cytokin mRNA-Expression in der Lunge wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, direkt untersucht. Lungengewebe von immunisierten Mäusen, mit oder ohne IL-12-Behandlung, wurden 4 Tage nach der Challenge mit lebendem Virus geerntet. Die Cytokin mRNAs für IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-10 und IL-12 wurden mit Northern-Blot-Analysen bestimmt. Es bestanden keine erkennbaren Unterschiede zwischen IL-6 und IL-10-mRNA-Levels bei Mäusen mit unterschiedlichen Behandlungen. Allerdings enthielten die Lungen von Mäusen, die entweder zum Zeitpunkt der Immunisierung oder der Challenge mit IL-12 behandelt wurden, mehr IFN-γ bezogen auf IL-4 im Vergleich mit Kontrollmäusen, die kein IL-12 erhielten (2). Eine erhöhte mRNA-Expression erfolgte in den Mäusen, die mit IL-12 zum Zeitpunkt der Immunisierung behandelt wurden, während eine Verabreichung bei der Challenge zu keiner Erhöhung der IL-12 mRNA-Expression führte (2). Diese Daten lassen vermuten, dass IL-12 die Th1-Zelldifferenzierung verstärkte und eine Verschiebung von einer Th2 zu einer Th1-ähnlichen Antwort in Mäusen hervorrief, die mit dem inaktivierten RSV-Immunogen immunisiert waren.
Die RSV-spezifische cytotoxische T-Lymphocyten-(CTL)-Aktivität in der Lunge immunisierter Mäuse wurde bewertet, um zu untersuchen, ob eine IL-12-Verabreichung eine zellvermittelte Immunität wie ein positiver Modulationseffektor verstärkte. Wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, wurde ein direkter CTL-Assay unter Verwendung von Lungen-Lymphocyten durchgeführt, der keine in vitro Stimulierung umfasst (Tang, Y.-W., et al., J. Clin. Invest. (1994)). Es bestand kein Unterschied bei der CTL-Aktivität zwischen Gruppen, die eine IL-12-Behandlung zum Zeitpunkt der Immunisierung erhielten oder nicht erhielten. Dieses Ergebnis, das in zwei aufeinanderfolgenden Versuchen wiederholt wurde, lässt des weiteren vermuten, dass das Th1-ähnliche Cytokin-Muster ein Produkt von CD4+ T-Zellen war. Es wird selbstverständlich erwartet, dass eine Änderung der IL-12-Dosis eine größere CD8+ Antwort induzieren würde, die das Krankheitsmuster verändern würde.
Wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, bestand kein signifikanter Unterschied im klinischen Ergebnis, einschließlich Gewichtsverlust und Krankheitsbewertung zwischen den Gruppen, selbst wenn IL-12 eine drastische Wirkung auf die Verringerung der RSV-Replikation in der Lunge hat. Die einfache Verschiebung im Cytokin-Expressionsmuster war deshalb keine Vorhersage einer Veränderung bei der Krankheit. Dies lässt vermuten, dass die für die Cytokinproduktion verantwortlichen Zellpopulationen Schlüsseldeterminanten der Krankheit sein können und nicht die Cytokine selbst. Zum Beispiel zeigten Mäuse, die mit anti-IL-4 zum Zeitpunkt der Immunisierung behandelt wurden, ebenfalls eine erhöhte IFN-γ-Expression in den Lungen zum Zeitpunkt der Challenge. Allerdings führte die Behandlung mit anti-IL-4 zu einer schwächeren Krankheit, die mit einer erhöhten CD8+ CTL-Zellaktivität verbunden war (Tang, Y.-W., et al., J. Clin. Invest. (1994)). Im Falle der mit anti-IL-4 behandelten Mäuse, kann es sein, dass das IFN-γ ein Produkt der CD8+ T-Zellen war, wohingegen in IL-12-behandelten Mäusen die CD4+ T-Zellen eine wahrscheinlichere Quelle sind.
Eine Anpassung der IL-12-Dosis kann seine Eigenschaften verändern. Eine kürzlich durchgeführte Untersuchung von IL-12 über Immunantworten bei der lymphocytären Choriomeningitis-(LCMV)-Infektion zeigte, dass geringe IL-12-Dosen die Immunität gegen eine LCMV-Infektion verstärkten, wie es durch erhöhte CD8+ T-Zellzahlen der Milz und eine verringerte LCMV-Replikation gezeigt wurde. Allerdings beeinträchtigten hohe IL-12-Dosen, die den in den Beispielen eingesetzten Dosen entsprechen, die Resistenz gegen eine (LCMV-Infektion, wie es durch eine verminderte Virus-spezifische CTL-Aktivität und eine erhöhte virale Replikation gezeigt wurde (Orange, J.S., et al., J. Immunol. 152:1253 (1994)). Es kann deshalb möglich sein, die IL-12-Dosis oder ihr Überbringungsverfahren anzupassen, um die Wirkung auf die virale Replikation aufrecht zu halten, aber auch um die Krankheit stark zu beeinflussen.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert.
BEISPIELE
Beispiel 1 Immunisierung von Mäusen mit RSV und IL-12
Mäuse: 8 bis 10 Monate alte, pathogenfreie weibliche Balb/c-Mäuse wurden von den Charles River Laboratories (Raleigh, North Carolina) bezogen und gemäß dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", wie zuvor beschrieben, (Graham, B.S., et al, J. Med. Virol. 26:153 (1988)) gehalten.
RSV-Immunogen und Virus: Herstellung des Formalin-inaktivierten Alaunpräzipitierten RSV und Herstellung einer Stammkultur des RSV A2-Stammes ist zuvor beschrieben worden (Graham, B.S., et al, Immunol. 151:2032 (1993)).
Sowohl das Impfstoff-Präparat als auch der Challenge-Stamm stammten von dem RSV A2-Stamm ab.
Murines Cytokin IL-12: Murines rekombinantes IL-12 wurde von klonierten cDNAs exprimiert (Schoenhaut, D.S., et al, J. Immunol. 148:3433 (1992)). Die in dieser Veröffentlichung verwendete (Charge war MRB021693-1.2 (Genetics Institute, Cambridge, Massachusetts) mit einer spezifischen Aktivität von 5,6 × 10⁶ Einheiten/mg, wie es mit einem PHA-Blast-Assay bestimmt wurde (Wolf, S.F., et al, J. Exp. Med. 146:3074 (1991)). Konzentrierte IL-12-Aliquote wurden bei –70°C aufbewahrt und mit Phosphatgepufferter Saline mit 1 % normalem Mausserum (1% PBS) verdünnt.
Immunisierung: Die Mäuse wurden mit Formalin-inaktiviertem Alaun-präzipitierten RSV, das 2,2 × 10⁴ pfu Äquivalente des Virus-Antigens enthielt, intramuskulär immunisiert und einer Challenge mit 10⁷ pfu oder lebendem RSV intranasal 4 Wochen später unterzogen, wie bereits beschrieben (Graham, B.S., et al, Immunol. 151:2032 (1993)); Tang, Y.-W., et al, J. Clin. Invest. (1994)). An 5 aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend einen Tag vor der Immunisierung, wurde IL-12 mit einer Dosis von 1 μg/Maus intraperitoneal verabreicht. Die Kontrollmäuse erhielten nach dem gleichen Zeitschema 1% Phosphat-gepufferte Saline (PBS).
4 Tage nach der Challenge wurde die virale Replikation in den Lungen mittels Plaque-Assay untersucht. Maus-Serumproben wurden am Tag der Challenge mit lebenden RSV und zwei Wochen später gesammelt.
Plaque-Assays und Neutralisierungstests: Zwei Tage alte HEp-2 Monolayer, zu 80% konfluent, in Costar-Platten mit 12 Vertiefungen wurden für die Plaque-Assays und die Neutralisierungstests verwendet. Die Assays wurden, wie zuvor beschrieben, durchgeführt (Graham, B.S., et al, J. Med. Virol. 26:153 (1988)).
Das zum Zeitpunkt der Immunisierung verabreichte IL-12 hat eine deutliche Wirkung auf die Verminderung der viralen Replikation. Der log 10 pfu pro Lunge wurde von 6,9 in RSV-immunisierten Kontrollmäusen ohne IL-12-Verabreichung auf 3,8 in immunisierten Mäusen mit IL-12 Verabreichung vermindert. Im Gegensatz dazu hatte eine IL-12 Verabreichung zum Zeitpunkt der Challenge keine signifikante Wirkung auf die virale Replikation. Siehe 1. (log 10 pfu/gram Lunge ist als arithmetrisches Mittel ± Standardabweichung dargestellt; KV bezeichnet abgetötetes Virus)
Beispiel 2 Wirkung der Verabreichungswege von IL-12 auf seine Fähigeit als Adjuvans
Die Wirkung eines anderen Verabreichungsweges des IL-12-Adjuvans wurde untersucht. IL-12 wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, einer Mäusegruppe intraperitoneal verabreicht. Einer anderen Mäusegruppe wurde IL-12 gemischt mit dem RVS-Antigen intramuskulär verabreicht. Die Kontrollmäuse wurden entweder scheinimmunisiert oder nur mit IL-12 ohne Antigen behandelt. Tabelle 1 fasst die Ergebnisse des Experiments zusammen, die zeigen, dass eine einzige IL-12 Dosis, die mit Immunogen gleichzeitig verabreicht wurde, die gleiche Wirkung auf die Verminderung der viralen Replikation besitzt verglichen mit 5 Dosen im intraperitonealen Dosierungsschema. IL-12 als ein spezifischer Immunmodulator wirkte nur in RSV-immunisierten Mäusen und besaß keine Wirkung auf nicht immunstimulierte Mäuse. Siehe 1 und Tabelle 1. Diese Daten zeigen, dass IL-12 eine potente Adjuvans-Wirkung auf das inaktivierte RSV-Immunogen ausübt.
Beispiel 3 Bestimmung der Immunoglobinisotyp-Titer in RSV-immunisierten Mäusen die IL-12 erhielten
Die Muster der Immunoglobulinisotypen, die in Mäusen gebildet werden, wurden untersucht. Maus-Serumproben wurden am Tag der Challenge mit lebenden RSV und zwei Wochen danach gesammelt.
ELISA mit RSV-spezifischem Immunoglobulinisotyp: Alle serologischen Untersuchungen wurden von einer Person durchgeführt, der die experimentellen Gruppen verborgen blieb. BCH4- und BC-Zellen wurden an die feste Phase in Immulon II-Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc^®, Dänemark) gebunden. Verdünnungsreihen von Maus-Serumproben wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden inkubiert, gewaschen und 1:1000 verdünntes Ziege-anti-Maus-IgG1 oder IgG2a, konjungiert mit alkalischer Phosphatase (Southern Biotechnology, Birmingham, Alabama), wurde jeweils zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation wurden die Platten gewaschen und Substrat wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben und die OD₄₀₅ wurde bestimmt (Graham, B.S., et al, Immunol. 151:2032 (1993); Tang, Y.-W., et al, J. Clin. Invest. (1994)). Eine Serumverdünnung wurde als positiv betrachtet, wenn die mittlere optische Dichte von zwei Vertiefungen der BCH4-Zellen höher als zweimal diejenige der BC-beschichteten Vertiefungen und größer als 0,1 war.
Die Ergebnisse zeigen, dass IL-12 signifikant mehr RSV-spezifischen IgG2a-Antikörper und signifikant weniger IgG1-Antikörper im Vergleich zu immunisierten Mäusen ohne IL-12 Verabreichung induziert. Die Muster der IgG2a und IgGI RSV-spezifischen Antikörperantwort war ähnlich, egal ob Il-12 intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht wurde. Siehe Tabelle 2.
Beispiel 4 Cytokin mRNA-Expressionsmuster in Lungen von immunisierten Mäusen mit und ohne IL-12
Lungengewebe von immunisierten Mäusen, mit und ohne IL-12 Behandlung, wurden 4 Tage nach einer Challenge mit Lebendvirus geerntet. Die Cytokin mRNAs für IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-10 und IL-12 wurden mittels Northern-Blot-Analyse bestimmt.
mRNA-Extraktion, Northern-Blotting und Cytokin-Detektion: Die Gesamt-RNA aus ganzen Lungen wurde extrahiert und polyA-RNA isoliert, elektrophoretisch aufgetrennt und, wie bereits beschrieben, auf eine Membran transferiert (Graham, B.S., et al, Immunol. 151:2032 (1993); Tang, Y.-W., et al, J. Clin. Invest. (1994)). Eine Hybridisierung mit ³²P-Oligonucleotidsonden wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Graham, B.S., et al, Immunol. 151:2032 (1993). Nach dem Waschen wurden die Membranen einem Kodak^® Xomat^® Film bei –70°C exponiert. Eine Laserdensitometrie wurde mit einem LKB U1troScan XL mit Hilfe der GelScan XL Software (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey) durchgeführt. Die Oligonucleotidsonden für murines IL-4, IL-10, IFN-γ, IL-6 wurden von R & D Systems (Minneapolis, Minnesota) oder Clontech Laboratory Inc. (Palo Alto, California) bezogen. Ein zur Detektion von IL-12 entwickelter Cocktail aus Oligonucleotiden beruhte auf der murinen IL-12-Sequenz, die sich über die vorhergesagten Spleißstellen erstreckt, die auf denen in der humanen IL-12 Sequenz identifizierten beruhen (Schoenhaut, D.S., et al, J. Immunol. 148:3433 (1992)).
Von 5' nach 3':
p-40:
TGAGGACACATCTTGCTTTGCTGCGAGCTG (SEQ. ID. NR :1),
TCCCGCCTTTGCATTGGACTTCGGTGATG (SEQ. ID. NR :2) und
CAACGTTGCATCCTAGGATCGGACCCTGCA (SEQ. ID. NR :3);
p-35:
GCCAGGCAACTCTCGTTCTTGTGTAGTTCC (SEQ. ID. NR :4) und
GCGTTGATGGCCTGGAACTCTGTCTGGTAC (SEQ. ID. NR :5).
Cytokin mRNA Northern-Blots (2 Proben pro Gruppe) mit gemittelten α-Tubulinnormalisierten Dichten sind in 2 gezeigt. Es gab keine offensichtlichen Unterschiede bei den IL-6 und IL-10 mRNA-Levels bei Mäusen mit unterschiedlichen Behandlungen. Jedoch enthielten die Lungen aus entweder zum Zeitpunkt der Immunisierung oder Challenge mit IL-12 behandelten Mäuse relativ zu IL-4 mehr IFN-γ im Vergleich zu Kontrollmäusen, die kein IL-12 erhielten (2). Eine erhöhte IL-12 mRNA-Expression kam in den zum Zeitpunkt der Immunisierung mit IL-12 behandelten Mäusen vor, während eine IL-12-Verabreichung bei der Challenge die IL-12 mRNA-Expression nicht erhöhte (2). Diese Daten lassen vermuten, dass IL-12 die Th1-Zelldifferenzierung verstärkte und eine Verschiebung von einer Th2 zu einer Th1-ähnlichen Antwort in Mäusen hervorrief, die mit dem inaktivierten RSV-Immunogen immunisiert worden waren.
Beispiel 5 RSV-spezifische cytotoxische T-Lymphocyten-(CTL)-Aktivität in Lungen immunisierter Mäuse
Die RSV-spezifische CTL-Aktivität in Lungen immunisierter Mäuse wurde bestimmt, um zu untersuchen, ob eine IL-12-Verabreichung eine zellvermittelte Immunität als ein positiver Modulationseffektor verstärkte. Ein direkter CTL-Assay wurde unter Verwendung von Lungenlymphocyten angewandt, der aber keine in vitro Stimulation umfasste (Tang, Y.-W., et al. J. Clin. Invest. (1994)).
T-Zell Cytotoxizitätsassays: Lymphocyten der Gesamtlunge wurden mittels Ficoll^®-Hypaque (spezifisches Gewicht 1,09) Cushion-Zentrifugation isoliert. Mit ⁵¹Cr markierte BCH4- und BC-Zielzellen (Dupont-New England Nuclear, Boston, Massachusetts) wurden mit Effektorzellen 4 Stunden bei 37°C in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen inkubiert, wie beschrieben (Tang, Y.-W., et al. J. Clin. Invest. (1994). Die spontane und vollständige Freisetzung wurde mittels Behandlung der Zielzellen mit jeweils 10% RPMI und 5% Triton^®-X-100 Detergens erreicht. Jeder Punkt stellt den Mittelwert dreier Vertiefungen dar. Die spezifische Freisetzung von ⁵¹Cr aus Zielzellen wurde als 100 X (cpm Probe – Hintergrund cpm)/(Gesamt cpm – Hintergrund cpm) definiert.
Es gab keinen Unterschied in der CTL-Aktivität zwischen den Gruppen, die eine IL-12 Behandlung zum Zeitpunkt der Immunisierung erhielten oder nicht erhielten. Dieses Ergebnis wurde in zwei aufeinanderfolgenden Experimenten wiederholt und lässt ferner vermuten, dass das Th1-ähnliche Cytokinmuster ein Produkt der CD4+ T-Zellen war. Selbst wenn IL-12 eine drastische Wirkung auf die Verminderung der RSV-Replikation in Lungen besitzt, gab es zwischen den Gruppen keinen signifikanten Unterschied in dem klinischen Ergebnis, einschließlich Gewichtsverlust und Krankheitsbewertung. Krankheitseinschätzung, einschließlich Gewichtsverlust und klinischer Bewertung, wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben, (Tang, Y.-W., et al. J. Clin. Invest. (1994). Die einfache Verschiebung in dem Cytokin-Expressionsmuster war deshalb keine Voraussage einer Änderung der Krankheit. Dies lässt vermuten, dass die für die Cytokin-Produktion verantwortliche Zellpopulation eine Schlüsseldeterminante der Erkrankung sein kann und nicht die Cytokine selbst. Zum Beispiel besaßen mit anti-IL-4 zum Zeitpunkt der Immunisierung behandelte Mäuse zum Zeitpunkt der Challenge ebenfalls eine erhöhte IFN-γ Expression in den Lungen. Allerdings führte eine anti-IL-4-Behandlung zu einer abgeschwächten Erkrankung, die mit einer erhöhten CD8+ CTL-Aktivität verbunden war (Tang, Y.-W., et al. J. Clin. Invest. (1994). Im Falle der anti-IL-4 behandelten Mäuse kann es sein, dass das IFN-γ ein Produkt der CD8+ T-Zellen war, während in IL-12 behandelten Mäusen die CD4+ T-Zellen die wahrscheinlichere Quelle sind. Tabelle 1 Entweder intraperitoneal oder intramuskulär verabreichtes IL-12 vermindert die Virus-Replikation in Lungen und Nasen

* Mittelwert ± Standardabweichung
p < 0,001 im Vergleich zu log 10 pfu/g Lunge in Gruppe 1
p < 0,001 im Vergleich zu log 10 pfu/Nase in Gruppe 1
KV abgetötetes Virus
IP intraperitoneal
IM intramuskulär

SEQUENZLISTE

Claims

Eine Zusammensetzung umfassend ein Gemisch eines Antigens eines Virus der Paramyxoviridae Familie und einer wirksamen Adjuvans-Menge an Interleukin-12.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 für eine therapeutische Verwendung.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, worin die Verwendung zur Verminderung der viralen Replikation des Virus in einem Wirt dient.
Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, worin die Verwendung zum Auslösen einer Immunantwort gegen das Virus in einem Wirt dient.
Eine Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Verminderung der viralen Replikation oder der Immunantwort auf die virale Replikation oder Imunantwort in Abwesenheit der Zusammensetzung bezogen ist.
Eine Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Virus der Paramyxoviridae Familie ausgewählt ist aus: Parainfluenza-Virus 1, Parainfluenza-Virus 2, Parainfluenza-Virus 3, Parainfluenza-Virus 4, Mumpsvirus, Masernvirus, Respiratory Syncytial Virus, Canines Distemper-Virus, Bovines Respiratory Syncytial Virus, Newcastle Disease Virus und Rinderpest-Virus.
Eine Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Antigen ausgewählt ist aus: dem Fusionsglycoprotein, der Hämagglutinin-Neuraminidase und dem G-Glycoprotein.
Eine kombinierte Zubereitung für die gleichzeitige oder sequentielle therapeutische Verwendung, wobei die kombinierte Zubereitung ein Antigen eines Virus der Paramyxoviridae Familie und eine wirksame Adjuvans-Menge an Interleukin-12 umfasst.
Verwendung eines Antigens eines Virus der Paramyxoviridae Familie und einer wirksamen Adjuvans-Menge an Interleukin-12 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung zur Verminderung der viralen Replikation des Virus in einem Wirt.
Verwendung eines Antigens eines Virus der Paramyxoviridae Familie und einer wirksamen Adjuvans-Menge an Interleukin-12 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung zur Auslösung einer Immunantwort gegen das Virus in einem Wirt.
Die Verwendung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin die Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder die kombinierte Zusammensetzung nach Anspruch 8 ist.