ES2257744T3 - Interleuquina-12 como adyuvante para vacunas contra paramyxoviridae. - Google Patents
Interleuquina-12 como adyuvante para vacunas contra paramyxoviridae.Info
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Abstract
SE MUESTRA UN METODO PARA REDUCIR LA REPLICACION VIRAL DE UN VIRUS DE LA FAMILIA PARAMIXOVIRIDAE EN UN PACIENTE, QUE SUPONE LA ADMINISTRACION A ESTE DE UN ANTIGENO DEL VIRUS EN COMBINACION CON UNA CANTIDAD ADYUVANTE EFECTIVA DE INTERLEUQUINA-12 (IL-12). LOS VIRUS HUMANOS DE LA FAMILIA PARAMIXOVIRIDAE INCLUYEN PARAMIXOVIRUS (P.E. VIRUS PARAINFLUENZA 1, VIRUS PARAINFLUENZA 2, VIRUS PARAINFLUENZA 3 Y VIRUS PARAINFLUENZA 4), MORBILIVURS (P.E. VIRUS DEL SARAMPION) Y NEUMOVIRUS I (P.E. VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO; OTROS VIRUS NO HUMANOS DE LA FAMILIA PARAMIXOVIRIDAE INCLUYEN EL VIRUS DEL MOQUILLO CANINO, VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO BOVINO, VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE Y VIRUS DE LA PESTE ANIMAL. TAMBIEN SE MUESTRA UNA COMPOSICION QUE INCLUYE UNA MEZCLA DE UN ANTIGENO DE UN VIRUS DE LA FAMILIA PARAMIXOVIRADAE Y UNA CANTIDAD ADYUVANTE EFECTIVA DE INTERLEUQUINA-12 (IL-12).
Description
Interleuquina-12 como adyuvante
para vacunas contra Paramyxoviridae.
El virus sincitial respiratorio (RSV), un
miembro del género Pneumovirus de la familia
Paramyxoviridae, es una causa importante de enfermedades
respiratorias en infantes y niños (Connors, M., et al., J.
of Virol., 66:7444-7451 (1992)). La base
inmunológica de las distintas susceptibilidades entre individuos, y
del limitado intervalo de edad en el que sucede la enfermedad
grave, sigue sin estar clara.
El mayor impedimento para avanzar nuevas vacunas
candidatas del RSV a ensayos clínicos es un conocimiento incompleto
de la enfermedad complicada por la vacuna causada por la vacunas del
RSV inactivadas con formol en los años 1960. Los ensayos clínicos
de una vacuna de RSV inactivada con formol precipitada con alum en
los años 1960 mostraron que la vacuna producía anticuerpos que se
unían al complemento pero que fallaban en proteger a los niños de
la infección. Además, la enfermedad después de la infección
subsiguiente fue inusualmente grave con algunas muertes, y una
estancia de hospitalización mayor (Kapikian, A.Z., et al. Amer.
J. Epidem., 89:405 (1969); Fulginti, V.A., et al, Amer. J.
Epidem., 89:435 (1969); Kim, W.H., Amer. J. Epidemol.,
89:422 (1969); Chin, J.R., et al. Amer. J. Epidem.,
89:449 (1969)). Una enfermedad similar complicada puede
inducirse en ratones con infección de RSV que han sido
anteriormente inmunizados con la vacuna inactivada con formol, pero
no en ratones inmunizados con RSV vivo (Conners, M., et al., J.
Virol. 66:7441 (1992); Gram., B.S., et al., Immunol.
151:2032 (1993); Alwan, W.H., et al., J. Exp. Med. 179:81
(1994)). Los ensayos clínicos de productos de vacuna de RSV vivo
atenuado no han estado asociados con la enfermedad complicada.
Aunque las vacunas de RSV vivo no ocasionaron una enfermedad
pulmonar complicada con la infección natural, las vacunas fueron, a
todos los efectos, igualmente no exitosas como las vacunas de RSV
inactivadas con formol precipitadas con alum (Kim, W.H., et al.,
Pediatrics, 48:745 (1971); Kim, W.H., et al., Pediatrics,
52:56 (1973); Belshe, R.B., et al., J. Infec. Dis.,
145:311 (1982); Wright, R.B., et al., Infect. Immun.,
37:397 (1982). Mutantes de RSV sensibles a la temperatura, RSV
adaptado al frío o RSV vivo administrados parenteralmente han sido
considerados sin éxito como vacunas debido a altas proporciones de
reversión al tipo silvestre, virulencia inaceptable o falta de
inmunogenicidad en el grupo de edad apropiado (Graham., B.S., et
al., J. of Immun., 151:2032-2040 (1993).
De manera que hay necesidad de desarrollar
métodos eficaces de vacunación contra el RSV y de formulaciones de
vacuna.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que la IL-12 tiene un efecto
adyuvante potente en la inmunización contra la infección de los
virus Paramyxoviridae. En una realización, la invención
comprende un método para reducir la replicación viral de un virus
de la familia paramyxoviridae en un hospedante (por ejemplo,
mamíferos, incluyendo seres humanos, y aves) que comprende
administrar al hospedante un antígeno del virus en combinación con
una cantidad adyuvante eficaz de interleuquina-12
(IL-12). Los virus humanos de la familia
paramyxoviridae incluyen los paramixovirus (por
ejemplo el virus de la parainfluenza 1, el virus de la
parainfluenza 2, el virus de la parainfluenza 3, el virus de la
parainfluenza 4 y los virus de la parotiditis), los
morbillivirus (por ejemplo, los virus del sarampión) y
pneumovirus (por ejemplo, el virus sincitial
respiratorio); otros virus no humanos de la familia
paramyxoviridae incluyen los virus del moquillo canino, el
RSV bovino, el virus de la enfermedad de Newcastle y el virus de
rhinderpest. En una realización, la invención se refiere a
un método de reducir la replicación del virus sincitial respiratorio
(RSV), en un hospedante que comprende administrar al hospedante un
antígeno de RSV en combinación con una cantidad adyuvante eficaz de
IL-12. Así la presente invención se refiere también
a un método para provocar una respuesta inmune contra el virus de
la familia paramyxoviridae en un hospedante, que comprende
administrar al hospedante un antígeno de un virus de la familia
paramyxoviridae en combinación con una cantidad adyuvante
eficaz de IL-12. La presente invención también se
refiere a un método para inmunizar a un hospedante contra el RSV que
comprende administrar al hospedante una mezcla que comprende un
antígeno del virus sincitial respiratorio en combinación con
una cantidad adyuvante eficaz de inter-
leuquina-12.
leuquina-12.
Además, la presente invención se refiere a una
composición que comprende una mezcla de un antígeno de un virus de
la familia paramyxoviridae y una cantidad adyuvante eficaz de
interleuquina-12 (IL-12). En una
realización, la invención se refiere a una composición que
comprende un antígeno del virus sincitial respiratorio y
IL-12.
Como se muestra aquí, el tratamiento exógeno con
IL-12 administrado durante la inmunización con el
antígeno de RSV, disminuye la replicación de RSV y aumenta la
expresión del ARNm de la IL-12 endógena en el
siguiente enfrentamiento con RSV. Esto origina un desplazamiento de
un patrón de expresión de citoquina tipo Th2 a un patrón tipo Th1 y
un desplazamiento subsiguiente en la utilización de isotipo de
anticuerpo. Estos resultados demuestran que la
IL-12 es un adyuvante potente para vacunas de
paramyxoviridae.
\newpage
La Figura 1 es un gráfico de barras de
tratamiento con IL-12 frente al logaritmo en base 10
de las unidades formadoras de placa (pfu)/gramo pulmón del ensayo
de placa ilustrando que la IL-12 administrada
durante la inmunización tiene un marcado efecto en la reducción de
la replicación viral.
La Figura 2 es un gráfico de barras de
tratamiento con IL-12 frente a la media de la
densidad de los Northern blots de ARNm normalizada con la
\alpha-tubulina que ilustran que la
IL-12 aumentó la diferenciación de las células Th1
y produjo un desplazamiento de la respuesta tipo Th2 a Th1 en
ratones inmunizados con inmunógeno de RSV inactivado.
La presente invención se refiere a un método para
reducir la replicación viral de un virus de la familia
Paramyxoviridae en un hospedante (por ejemplo, mamíferos,
incluyendo seres humanos, aves) que comprende administrar al
hospedante una mezcla de un antígeno del virus y una cantidad
adyuvante eficaz de interleuquina-12
(IL-12). Aunque el método de la presente invención
se ejemplariza usando el RSV, el método puede usarse para reducir la
replicación viral de una variedad de virus de la familia
paramyxoviridae que incluye los virus humanos de la familia
paramyxoviridae tales como los paramixovirus (por
ejemplo el virus de la parainfluenza 1, el virus de la parainfluenza
2, el virus de la parainfluenza 3, el virus de la parainfluenza 4 y
los virus de la parotiditis), los morbillivirus (por
ejemplo, los virus del sarampión) y pneumovirus (por ejemplo,
el virus sincitial respiratorio); otros virus no humanos de
la familia paramyxoviridae incluyen los virus del moquillo
canino, el RSV bovino, el virus de la enfermedad de Newcastle y el
virus de rhinderpest. En una realización, el método de la presente
invención se usa para reducir la replicación viral del virus
sincitial respiratorio (RSV) en un hospedante, y comprende
administrar al hospedante un antígeno de RSV y una cantidad
adyuvante eficaz de IL-12.
En otra realización, el método de la presente
invención se usa para provocar una respuesta inmune contra un virus
de la familia paramyxoviridae en un hospedante, que comprende
administrar al hospedante un antígeno del virus y una cantidad
adyuvante eficaz de IL-12. Además, la presente
invención se refiere a un método para inmunizar a un hospedante
contra el RSV que comprende administrar al hospedante una mezcla que
comprende un antígeno de RSV y una cantidad adyuvante eficaz de
IL-12.
Un antígeno del virus de la familia
Paramyxoviridae incluye el uso del virus completo (por
ejemplo, inactivado o vivo, virus completo atenuado), una porción
antigénica del virus, y virus o porciones del mismo producidos por
técnicas recombinantes o proteínas de fusión. Además, los antígenos
de la presente invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos
que codifican un antígeno de un virus de la familia
Paramyxoviridae. La porciones antigénicas de los virus de la
familia Paramyxoviridae incluyen la glicoproteína de fusión
(proteína F) y la hemaglutinina neuraminidasa de los virus de la
parainfluenza 1, 2, 3, 4; la proteína F y la hemaglutinina
neuraminidasa de los virus de la parotiditis; la proteína F y la
hemaglutinina neuraminidasa de los virus del sarampión; y la
proteína F y la glicoproteína G del RSV. Otras porciones antigénicas
de los virus de la familia Paramyxoviridae que pueden usarse
en los métodos y composiciones de la presente invención, pueden
determinarse por aquellos con habilidad ordinaria en la técnica.
La IL-12 de la presente invención
puede obtenerse de una fuente adecuada para uso en el presente
método. Por ejemplo, la IL-12 puede purificarse de
fuentes naturales (por ejemplo, seres humanos, animales), producirse
por síntesis química o producirse por técnicas recombinantes de ADN
como se describe en el ejemplo 1. Además, la IL-12
de la presente invención incluye las secuencias de ácido nucleico
que codifican la IL-12, así como los ARN
codificados por dichas secuencias de ácidos nucleicos. Como se usan
aquí, los términos "interleuquina-12" y
"IL-12" se refieren a la interleuquina 12, sus
subunidades individuales, los fragmentos de las mismas que muestran
actividad adyuvante de IL-12 y los equivalentes
funcionales de la "interleuquina-12" y
"IL-12". Los equivalentes funcionales de la
"interleuquina-12" y
"IL-12" incluyen proteína IL-12
modificada de manera que el producto de IL-12
resultante tiene la misma actividad adyuvante de
IL-12 aquí descrita, y las secuencias de ácido
nucleico que a través de la degeneración del código genético
codifican el mismo producto péptido genético como
IL-12 y que tienen la actividad adyuvante de
IL-12 aquí descrita. Por ejemplo, un equivalente
funcional de la "interleuquina-12" y
"IL-12" puede contener un codon
"silencioso" o una sustitución de aminoácido (por ejemplo,
sustitución de un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido; o
sustitución de un codon que codifica un aminoácido hidrófobo con
otro codon que codifica un aminoácido hidrófobo).
Se ha publicado que la IL-12, una
citoquina heterodimérica secretada predominantemente por las células
macrófagas, aumenta la actividad celular NK y la actividad CTL,
para estimular la diferenciación de las células Th1 e inducir la
producción de citoquinas, tales como IFN-\gamma
(Gately, M.K., et al, Cell. Immunol. 143:127 (1992); Naume,
B., et al, J. Immunol. 148:2429 (1992); Hsieh, C.S., et
al, Science 260:547 (1993); Manetti, R., et al, J. Exp. Med.
177:119 (1993); Chan, S.H., et al, J. Exp. Med, 173:869
(1991); D'Andrea, A., et al, J. Exp. Med. 176:1387 (1992);
Macatonia, S.E., et al, Int. Immunol. 5:1119 (1993); Tripa,
C.S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3725 (1993)). La
IL-12 antiguamente denominada factor estimulante de
las células asesinas naturales o factor de maduración citotóxico de
los linfocitos funciona como activador y para unir las respuestas
inmunes innatas y adquiridas (Kobayashi, M., et al, J. Exp. Med.
170:827 (1989); Stern, A.S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87:6808 (1990); Locksley, R.M., et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:5879 (1993)). La IL-12 promueve la
diferenciación de células T ayudantes no comprometidas al fenotipo
de Tipo 1 (Th1) (Hsieh, C.S., et al, Science 260:547 (1993);
Manetti, R., et al, J. Exp. Med. 177:1199 (1993)). Esto
ocasiona una constelación característica de citoquinas, tales como
la IFN-\gamma, y en general promueve la inmunidad
mediada por las células (Chan, S.H., et al, J. Exp. Med.
173:869 (1991); D'Andrea, A., et al, J. Exp. Med.
176:1387 (1992); Macatonia, S.E., et al, Int. Immunol.
5:1119 (1993); Gately, M.K. et al, Cell. Immunol. 143:127
(1992); Naume, B., et al, J. Immunol. 148:2429 (1992)). Se
ha demostrado que la IL-12 aumenta la respuesta
inmune y mejora la inmunidad protectora en varios modelos de
enfermedades infecciosas, incluyendo la listeriosis, la
leismaniasis, la toxoplasmosis y la infección del virus de la
coriomeningitis linfocitaria (Trip, C.S., et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:3725 (1993);.Heinzel, F.P., et al, J. Exp.
Med. 177:1505 (1993); Sypek, J.P. et al, J. Exp. Med.
177:1797 (1993); Alfonso, L.C., et al, Science 263:235
(1994); Gazzinelli, R.T. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6115 (1993); Khan, I.A., et al, Infect. Immun. 62:1639
(1994); Orange, J.S. et al, J. Immunol. 152:1253 (1994)). La
purificación y clonación de la IL-12 se describe en
los documentos de patente internacional WO 92/05256 y WO 90/05147,
y en el documento de patente europea número 322.827 (identificado
como "CLMF").
Conocemos el documento de solicitud de patente
europea EP 0 609 739 (American Cyanamid Company) que describe un
método de invertir la inmunosupresión con las vacunas. Se
administran citoquinas, o inhibidores de las citoquinas junto con
la vacuna de combinación. La citoquina o inhibidor de citoquina
puede administrarse junto con o después de la vacuna, y puede ser
producida con técnicas recombinantes o aislada de cultivos
celulares.
La interleuquina-12 o
IL-12 es una citoquina de los mamíferos que muestra
muchos efectos inmunológicos, incluyendo la modulación de la
respuesta de las células T a los antígenos (véase, por ejemplo, los
documentos de patente internacional WO 92/05256 y WO 90/05147, en
donde la IL-12 se identifica como "NKSF").
Generalmente se ha sugerido también que la IL-12
podría tener alguna aplicación como adyuvante en las vacunas (Scott,
P., Science, 260:496-497(1993);
Trichieri, G., Immunology Today,
14:335-338 (1993)).
En el método de la presente invención, una
cantidad adyuvante eficaz de IL-12 se administra en
combinación con un antígeno de un virus de la familia
Paramyxoviridae. Esto es, la IL-12 se
administra en un tiempo que es muy dependiente de la inmunización
del hospedante con el antígeno viral, de manera que se produce una
respuesta inmune aumentada en el hospedante en relación con la
inmunización de un hospedante al que no se le administra
IL-12. Así, el IL-12 puede
administrarse antes de, preferiblemente justo antes de, la
inmunización, durante la inmunización (o sea simultáneamente) o
después de la inmunización (o sea posteriormente). Además. La
IL-12 puede administrarse antes de la inmunización
con el antígeno viral de la familia Paramyxoviridae, seguido
de la inyección posterior de IL-12 después de la
inmunización con el antígeno.
La IL-12 y el antígeno pueden
administrarse a un hospedante en una variedad de formas. Las rutas
de administración incluyen intradérmica, transdérmica (por ejemplo
con polímeros de liberación retardada), intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural e
intranasal. Puede usarse cualquier otra ruta de administración
conveniente, por ejemplo, inyección por infusión o bolo, o
absorción a través de capas epiteliales o mucocutáneas. Además, la
IL-12 y el antígeno del virus Paramyxoviridae
pueden administrarse junto a otros componentes o agentes
biológicamente activos, tales como otros adyuvantes conocidos (por
ejemplo, alum, MPL, QS21), tensioactivos farmacéuticamente
aceptables (por ejemplo, glicéridos), excipientes (por ejemplo,
lactosa), transportadores, diluyentes y vehículos. Si se desea,
pueden también añadirse ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes
y/o colorantes.
La IL-12 y el antígeno pueden
administrarse como una vacuna profiláctica a hospedantes que estén
infectados o no infectados con el virus. La IL-12 y
el antígeno pueden también administrarse como una vacuna terapéutica
a hospedantes infectados y puede producir una mejora o eliminación
de la enfermedad causada por el virus in-
feccioso.
feccioso.
Además, el antígeno y/o la IL-12
pueden administrarse por la expresión in vivo de
polinucleótidos que los codifican en un mamífero. Por ejemplo, la
IL-12 o el antígeno Paramyxoviridae pueden
administrarse a un hospedante usando vectores vivos, en donde los
vectores vivos que contienen IL-12 y/o las
secuencias del ácido nucleico del antígeno se administran en
condiciones en las cuales el antígeno y/o la IL-12
se expresan in vivo. Por ejemplo, un hospedante puede ser
inyectado con un vector que codifica y expresa un antígeno de un
virus de la familia Paramyxoviridae in vivo en combinación
con una proteína o péptido de IL-12, o en
combinación con un vector que codifica y expresa la proteína de
IL-12 in vivo. Alternativamente, un
hospedante puede ser inyectado con un vector que codifica y expresa
la IL-12 in vivo en combinación con un
antígeno de Paramyxoviridae en forma de péptido o proteína o
en combinación con un vector que codifica y expresa un antígeno de
Paramyxoviridae in vivo. Un único vector que contiene
las secuencias que codifican un antígeno de Paramyxoviridae y
la proteína de IL-12 es también útil en el método y
composiciones de la presente invención.
Varios sistemas de expresión de vectores son
obtenibles comercialmente o pueden reproducirse según técnicas de
ADN recombinante y cultivos celulares. Por ejemplo, sistemas de
vectores tales como los sistemas de expresión de los virus de
levaduras o vacunas, o vectores de virus pueden usarse en los
métodos y composiciones de la presente invención (Kaufman, R.J.,
A J. of Meth. In Cell and Molec. Biol.,
2:221-236 (1990)). Otras técnicas que usan
plásmidos desnudos o ADN, y genes clonados encapsulados en liposomas
diana o en eritrocitos fantasmas, pueden usarse para introducir la
IL-12 y/o los polinucleótidos del antígeno de
Paramyxoviridae en el hospedante (Freidman, T., Science,
244:1275-1281 (199); Rabinovich, N.R., et
al., Science, 265:1401-1404 (1994)). La
construcción de vectores de expresión y la transferencia de vectores
y ácidos nucleicos dentro de varias células hospedantes pueden
conseguirse usando técnicas de ingeniería genética, como se describe
en manuales como Molecular Cloning y Current Protocols in
Molecular Biology o usando kits obtenibles comercialmente
(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Press, 1989; Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in
Molecular Biology, Greene Publishing Associates y
Wiley-Interscience, 1989).
La cantidad de antígeno usada en los métodos y
composiciones de la presente invención es una cantidad que produce
una respuesta inmunoestimulante eficaz en el hospedante. Una
cantidad adyuvante eficaz de IL-12 es una cantidad
tal que cuando se administra, ocasiona una respuesta inmune mayor
que cuando una cantidad adyuvante eficaz de IL-12
no se administra. Además, la cantidad de antígeno de un virus de la
familia Paramyxoviridae e IL-12 usadas para
inmunizar el hospedante variarán dependiendo de una variedad de
factores, incluyendo el antígeno empleado, el tamaño, edad, peso
corporal, estado general de salud, sexo y dieta del hospedante, y
el tiempo de administración, duración o cualidades particulares del
virus Paramyxoviridae contra el que se está vacunando. El
ajuste y manipulación de intervalos de dosificación establecidos
está bien al alcance de la habilidad de aquellos versados en la
técnica.
La formulación y ruta de administración de las
formulaciones de vacuna puede influir la inducción de subgrupos de
linfocitos ayudantes T y puede por lo tanto afectar la expresión de
la enfermedad después del enfrentamiento viral (Gram., B.S., et
al, Immunol. 151:2032 (1993)). La falta de
IL-4 en el momento de la inmunización debido a
anticuerpos monoclonales neutralizantes induce un desplazamiento de
la respuesta inmune de tipo Th2 a tipo Th1, acompañado de un
resultado clínico mejor y un aumento de la actividad de los
linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ (Tang, Y.-W., et al, J.
Clin. Invest. (1994)). Esto estuvo asociado con un aumento en la
expresión del mensaje de IL-12 endógena en el
momento del enfrentamiento en los ratones tratados con
anti-IL-4. Estos resultados
sugieren que la activación selectiva del subgrupo de células tipo
Th-2 puede ser responsable de la inmunopotenciación
de la enfermedad inducida por la vacuna de RSV y de que la
IL-12 puede estar asociada con el desplazamiento de
la respuesta de tipo Th2 a una respuesta más tipo Th1.
La replicación de RSV después de un
enfrentamiento con RSV vivo en ratones a los que se les ha
administrado IL-12 está muy reducida. El uso de
IL-12 como adyuvante en una composición que
comprende un antígeno de RSV y IL-12 indujo también
un desplazamiento de la respuesta inmune del tipo Th2 al tipo Th1 en
ratones después del enfrentamiento con RSV. Mientras que el efecto
adyuvante de IL-12 fue potente en la reducción de la
replicación de RSV, es más importante para uso como adyuvante de
vacuna el que aminore la enfermedad después del enfrentamiento con
RSV. El uso de las citoquinas como adyuvantes puede permitir
controlar los parámetros inmunológicos inducidos por la
inmunización para mejorar los efectos protectores y disminuir los
efectos negativos de una vacuna de RSV. Los efectos de
IL-12 en las respuestas inmunes a la vacunación de
RSV como se miden después del enfrentamiento con virus vivos en el
modelo de ratones BALB/c se describen en los ejemplos. Los
resultados indican que la IL-12 actúa como un
potente adyuvante y es un producto útil para incluir en las vacunas
de RSV.
Como se describe en el Ejemplo 1, los ratones
BALB/c se inmunizaron intramuscularmente con virus completo
inactivado, y se administró IL-12 murina
recombinante por vía intraperitoneal durante 5 días sucesivos
empezando un día antes de la inmunización o enfrentamiento. Se
enfrentó a los ratones con virus vivos 4 semanas más tarde. Se
evaluó la replicación viral en los pulmones 4 días después del
enfrentamiento. La administración de IL-12 durante
la inmunización tuvo un marcado efecto en la reducción de la
replicación viral. El logaritmo en base 10 de pfu por pulmón se
redujo desde 6,9 en los ratones de control inmunizados de RSV sin
administración de IL-12 a 3,8 en ratones
inmunizados de RSV con administración de IL-12
(Figura 1). Por el contrario, la administración de
IL-12 durante el enfrentamiento no tuvo ningún
efecto significativo en la replicación viral (Figura 1).
Los efectos de las distintas rutas de
administración de IL-12 se describen en el Ejemplo
2. Se administró IL-12 o por vía intraperitoneal
como se describe en el Ejemplo 1, o por vía intramuscular mezclada
con el inmunógeno de RSV. La Tabla 1 muestra el efecto de la
administración intraperitoneal o intramuscular de
IL-12 en la reducción de la replicación viral. Una
dosis única de IL-12 administrada simultáneamente
con el inmunógeno tuvo el mismo efecto en la reducción de la
replicación viral que el régimen de 5 dosis por vía intraperitoneal.
La IL-12 sólo funcionó como un inmunomodulador
específico en ratones inmunizados con RSV, y no tuvo ningún efecto
en ratones no tratados (Figura 1, Tabla 1). Estos datos demuestran
que la IL-12 ejerce un efecto adyuvante potente en
el inmunógeno inactivado de RSV.
Los patrones de isotipos de inmunoglobulinas
producidos en respuesta a la inmunización son indicadores indirectos
de los tipos de citoquinas producidas in vivo. La IgG2a se
produce en los ratones como consecuencia de la activación de
células Th1, mientras que la IL-4 promueve la
producción de IgG1 (Burstein, H:J: et al, J. Immunol.
147:2950 (1991); Finkelman, F.D., et al, Annu Rev. Immunol.
8:303 (1990); Morris , S.C., et al, J. Immunol. 152:1047
(1994)). Como se describe en el Ejemplo 3, ensayos ciegos de títulos
de isotipos de inmunoglobulinas del suero específicas de RSV en
ratones inmunizados con RSV que recibieron IL-12
mostraron que la IL-12 indujo significativamente
más anticuerpos IgG2a específicos de RSV y significativamente menos
anticuerpos IgG1 comparado con los ratones inmunizados a los que no
se les administró IL-12. El patrón de respuesta de
anticuerpos IgG2a y IgG1 específicos de RSV fue similar si se
administró la IL-12 por vía intramuscular o
intraperitoneal (Tabla 2).
El patrón de uso de isotipos de anticuerpos
inducido por la IL-12 sugiere que la administración
de la IL-12 in vivo puede promover la
diferenciación de células Th1 CD4+ específicas para el antígeno e
inhibir el desarrollo de las células Th2 en la respuesta a la
inmunización intramuscular de RSV inactivado. El patrón de expresión
de citoquina de ARNm en los pulmones se examinó directamente como
se describe en el Ejemplo 4. Tejidos pulmonares de ratones
inmunizados, con o sin tratamiento con IL-12, se
recogieron 4 días después del enfrentamiento con virus vivos. Se
midieron los ARNm de las citoquinas IFN-\gamma,
IL-4, IL-6, IL-10, e
IL-12, por análisis de Northern blot. No hubo
diferencias obvias en concentraciones de ARNm de
IL-6 e IL-12 entre los ratones con
distintos tratamientos. Sin embargo, los pulmones de ratones
tratados con IL-12 durante la inmunización o
enfrentamiento contenían más IFN-\gamma en
relación a IL-4 comparados con los ratones de
control que no recibieron IL-12 (Figura 2). Hubo un
aumento en la expresión de ARNm de IL-12 en los
ratones tratados con IL-12 durante la inmunización,
mientras que la administración de IL-12 en el
enfrentamiento no aumentó la expresión de ARNm de
IL-12 (Figura 2). Estos datos sugieren que la
IL-12 aumentó la diferenciación de las células Th1
y produjo un desplazamiento de la respuesta tipo Th2 a Th1 en
ratones inmunizados con el inmunógeno inactivado de RSV.
La actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL)
específicos del RSV en pulmones de ratones inmunizados se investigó
para evaluar si la administración de IL-12 aumentó
la inmunidad mediada celularmente como un efector modulador
positivo. Como se describe en el Ejemplo 5, se utilizó un ensayo
directo de CTL usando linfocitos pulmonares que no incluye la
estimulación in vitro (Tang, Y.-W., et al, J. Clin.
Invest. (1994). No hubo diferencia en la actividad de CTL entre
los grupos que recibieron o no recibieron tratamiento con
IL-12 durante la inmunización. Este resultado, que
fue repetido en dos experimentos consecutivos, adicionalmente
sugiere que el patrón de citoquina tipo Th-1 fue un
producto de células T CD4+. Es razonable esperar que alterar la
dosis de IL-12 induciría una mayor respuesta CD8+
que alteraría el patrón de la enfermedad.
Como se describe en el Ejemplo 5, incluso aunque
la IL-12 tiene efectos dramáticos en la reducción de
la replicación de RSV en los pulmones, no hubo diferencias
significativas en el resultado clínico, incluyendo pérdida de peso
y valoración de la enfermedad entre los grupos. El desplazamiento
sencillo en el patrón de expresión de las citoquinas no fue por lo
tanto predictivo de un cambio en la enfermedad. Esto sugiere que las
poblaciones celulares responsables de la producción de citoquinas
pueden ser determinantes claves de la enfermedad y no las
citoquinas mismas. Por ejemplo, los ratones tratados con
anti-IL-4 durante la inmunización
tuvieron también expresión aumentada de
IFN-\gamma en los pulmones durante el
enfrentamiento. Sin embargo, el tratamiento
anti-IL-4 produjo una disminución en
la enfermedad asociado con un aumento de actividad de CTL CD8+
(Tang, Y.-W., et al, J. Clin. Invest. (1994)). En el caso de
ratones tratados con anti-IL-4, pude
ser que el IFN-\gamma fuera un producto de las
células T CD8+, mientras que en los ratones tratados con
IL-12, las células T CD4+ son una fuente más
probable.
El ajustar la dosis de IL-12
puede cambiar sus propiedades. Un estudio reciente sobre
IL-12 en las respuestas inmunes a la infección de
la coriomeningitis linfocítica (LCMV) mostró que dosis bajas de
IL-12 aumentaron la inmunidad a la infección de
LCMV como se demuestra por el aumento del número de células T CD8+
esplénicas y la disminución de la replicación de LCMV. Sin embargo,
dosis altas de IL-12, equivalentes a las usadas en
los ejemplos, disminuyeron la resistencia contra la infección de
LCMV como se demuestra por la reducción en la actividad de CTL
específicos al virus y el aumento de la replicación viral (Orange,
J.S. et al, J. Immunol. 152:1253 (1994)). Puede ser posible
por lo tanto ajustar la dosis de IL-12 o su método
de dosificación para mantener el efecto de inhibición viral, pero
también para impactar en la enfermedad.
La invención se ilustra además en los ejemplos
siguientes.
Ratones: Ratones hembra libres de
patógenos BALB/c, de 8 a 10 meses de edad, fueron adquiridos de los
laboratorios Charles River (Raleigh, Carolina del Norte) y cuidados
según la "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"
como se describió previamente (Graham, B. S., et al, J. Med.
Virol. 26:153 (1988))
Inmunógeno de RSV y virus: La preparación
del RSV inactivado con formol y precipitado con alum y la
preparación del stock de la cepa A2 de RSV ha sido previamente
descrito (Graham, B. S., et al, Immunol. 151:2032 (1993)).
Ambos, la preparación de la vacuna y el stock de enfrentamiento
fueron derivados de la cepa A2 de RSV.
Citoquina IL-12 murina:
IL-12 murina recombinante fue expresada de ADNc
clonados (Schoenhaut, D. S., et al, J.Immunol.
148:3433 (1992)). El lote usado en esta referencia fue
MRB021693-1.2 (Genetics Institute, Cambridge,
Massachussets) con una actividad específica de 5,6x10^{6}
unidades/mg como se determina por el ensayo de análisis de la
ráfaga (blast assay) de PHA (Wolf, S. F., et al J. Exp. Med.
146:3074 (1991)), Alícuotas concentradas de
IL-12 se guardaron a -70ºC y diluyeron con solución
salina tamponada de fosfatos con suero de ratón normal al 1% (1%
PBS).
Inmunización: Los ratones fueron
inmunizados con RSV inactivado con formol y precipitado con alum
conteniendo 2,2 X 10^{6} pfu equivalentes del antígeno del virus
por vía intramuscular, y enfrentados con 10^{7} pfu de RSV vivo
intranasal 4 semanas más tarde como se describió previamente
(Graham, B. S., et al, Immunol. 151:2032 (1993)); Tang, Y.
-W., et al, J. Clin. Invest. (1994)). IL-12
se administró por vía intraperitoneal durante 5 días sucesivos,
comenzando un día antes de la inmunización a una dosis de 1
\mug/ratón. Los ratones de control recibieron solución salina
tamponada de fosfatos al 1% (PBS) según el mismo régimen.
La replicación viral en los pulmones 4 días
después del enfrentamiento fue valorada por el ensayo de placa. Las
muestras del suero de ratón se recogieron en el mismo día y dos
semanas después del enfrentamiento con RSV vivo.
Ensayos de placa y pruebas de
neutralización: Monocapas de HEp-2 de dos días,
80% confluentes en placas Costar de 12 pocillos, se usaron para el
ensayo de placa y las pruebas de neutralización. Los ensayos se
llevaron a cabo como se describió previamente (Graham, B. S., et
al, J. Med. Virol. 26:153 (1988)).
La administración de IL-12
durante la inmunización tiene un marcado efecto en la reducción de
la replicación viral. Log 10 pfu por pulmón se redujo desde 6,9 en
los ratones de control inmunizados de RSV sin administración de
IL-12 a 3,8 en ratones inmunizados con
administración de IL-12. Por el contrario, la
administración de IL-12 durante el enfrentamiento
no tuvo efecto significativo sobre la replicación viral. Véase la
figura 1. (Log 10 pfu/gramo pulmón se muestra como medias
aritméticas \pm D.E. (desviación estándar); KV denota virus
muertos).
Se valoró el efecto de una ruta de administración
diferente del adyuvante IL-12. IL-12
se administró por vía intraperitoneal como se describió en el
ejemplo 1 a un grupo de ratones. A otro grupo de ratones, se
administró IL-12 por vía intramuscular mezclado con
el antígeno RSV. Los ratones de control fueron o inmunizados con
placebo o tratados con IL-12 solo sin antígeno. La
Tabla 1 resume los resultados del experimento que muestra que una
única dosis de IL-12 administrada simultáneamente
con el inmunógeno tuvo el mismo efecto sobre la reducción de la
replicación viral comparado con el régimen de 5 dosis por vía
intraperitoneal. La IL-12 como inmunomodulador
específico solo fue eficaz en los ratones inmunizados con RSV, no
teniendo ningún efecto sobre los ratones no tratados. Véase la
Figura 1 y la Tabla 1. Estos datos demuestran que la
IL-12 ejerció un efecto potente adyuvante sobre el
inmunógeno de RSV inactivado.
Se examinaron los patrones de isotipos de
inmunoglobulina producidos en ratones inmunizados de RSV que
recibieron IL-12. Las muestras de suero de ratón se
recogieron en el día del enfrentamiento con RSV vivo y dos semanas
más tarde.
ELISA del isotipo de inmunoglobulina
específica de RSV: Todos los ensayos séricos se llevaron a cabo
por una persona ciega en cuanto a los grupos experimentales.
Células BCH_{4} y BC se unieron a una fase sólida sobre placas de
96 pocillos de Immulon II (NUNC®, Dinamarca). Muestras de suero de
ratón diluidas seriadas se añadieron a cada pocillo. Las placas se
incubaron, lavaron, y se añadieron IgG1 o IgG2a anti murina de
carnero conjugado a fosfatasa alcalina (Southern Biotechnology,
Birmingham, Alabama) diluida 1:1000, respectivamente. Después de
otra incubación, las placas se lavaron y el sustrato se añadió
durante 30 minutos a temperatura ambiente y se determinó la
DO_{405} ((Graham, B. S., et al, Immunol. 151:2032 (1993);
Tang, Y. -W., et al. J. Clin. Invest. (1994)). Una dilución
de suero se consideró positiva si la media de la densidad óptica de
dos pocillos de células BCH_{4} era mayor que dos veces la de los
pocillos recubiertos de BC y mayor que 0,1.
Los resultados demostraron que
IL-12 indujo significativamente más anticuerpos
IgG2a específicos de RSV y significativamente menos anticuerpos
IgG1 comparado con los ratones inmunizados no administrados
IL-12. El modelo de la respuesta al anticuerpo
específico de RSV de IgG2a y IgG1 fue similar tanto si
IL-12 fue administrada por vía intramuscular como
si fue por vía intraperitoneal. Véase la Tabla 2.
Tejidos pulmonares de ratones inmunizados, con y
sin tratamiento de IL-12, se recogieron 4 días
después del enfrentamiento con virus vivos. Los ARNm de citoquina
para IFN-\gamma, IL-4,
IL-6, IL-10 y IL-12
se midieron mediante análisis de Northern blot.
Extracción de ARNm, análisis de Northern Blot,
y detección de citoquina: El ARN total de los pulmones completos
se extrajo y se aisló poliA ARN, se separó por electroforesis y se
transfirió a una membrana como se describió previamente (Graham, B.
S., et al, Immunol. 151:2032 (1993); Tang, Y. -W., et al
J. Clin. Invest. (1994)). La hibridación con sondas de
oligonucleótido de ^{32}P se llevó a cabo como se describió
previamente (Graham, B. S., et al, Immunol. 151:2032
(1993)). Después de lavarlas, las membranas se expusieron a película
Kodak® X-omat® a -70ºC. La densitometría de láser
se llevo a cabo con un LKB UltroScan XL usando el programa de
GelScan XL (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, Nueva Jersey). Las
sondas de oligonucleótido para IL-4,
IL-10, IFN-\gamma,
IL-6 murinas se compraron de R & D Systems
(Mineápolis, Minesota) o Clontech Laboratory Inc. (Palo Alto,
California). Un cocktail de oligonucleótidos diseñados para detectar
IL-12 estaba basado en la secuencia de
IL-2 murina produciendo lugares de división
predecibles basada en aquellos identificados en la secuencia de
IL-12 humana. (Schoenhaut, D. S., et al, J.
Inmunol. 148:3433 (1992)).
\newpage
De 5'a
3':
p-40:
- TGAGGACACATCTTGCTTTGCTGCGAGCTG
- (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA 1),
- TCCCGCCTTTGCATTGGACTTCGGTGATG
- (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA 2), y
- CAACGTTGCATCCTAGGATCGGACCCTGCA
- (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA 3),
p-35:
- GCCAGGCAACTCTCGTTCTTGTGTAGTTCC
- (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA 4), y
- GCGTTGATGGCCTGGAACTCTGTCTGGTAC
- (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Northern blots de ARNm de citoquina (2 muestras
por grupo) con densidades medias normalizadas con
\alpha-tubulina se muestran en la Figura 2. No
hubo diferencias obvias en niveles de ARNm de IL-6 y
IL-10 entre los ratones con tratamientos
diferentes. Sin embargo, los pulmones de ratones tratados con
IL-12 durante la inmunización o enfrentamiento
contenían más IFN-\gamma en relación a
IL-4 comparado con los ratones control que no
recibieron IL-12 (Figura 2). Un aumento en la
expresión del ARNm de IL-12 ocurrió en los ratones
tratados con IL-12 durante la inmunización,
mientras que la administración de IL-12 en el
enfrentamiento no aumentó la expresión de ARNm de
IL-12 (Figura 2). Estos datos sugieren que
IL-12 aumentó la diferenciación de células Th1 y
produjo un desplazamiento de la respuesta tipo Th2 a un tipo Th1 en
ratones inmunizados con el inmunógeno de RSV inactivado.
La actividad de CTL específicos de RSV en
pulmones de ratones inmunizados se valoró para evaluar si la
administración de IL-12 aumentaba la inmunidad
mediada por las células como un efector modulador positivo. Se
empleó un ensayo de CTL directo usando linfocitos de pulmón que no
incluye la estimulación in vitro (Tang, Y. -W., et al, J.
Clin. Invest. (1994)).
Ensayos de citotoxicidad de células T: Se
aislaron linfocitos de pulmón completo por centrifugación Ficoll® -
Hypaque (gravedad específica 1,09). Las células diana BCH4 y BC
marcadas con ^{51}Cr (Dupont-New England Nuclear,
Boston, Massachusetts) se incubaron con células efectoras durante 4
horas a 37ºC en placas de microtitulación de 96 pocillos como está
previamente descrito (Tang, Y. -W., et al, J. Clin, Invest.
(1994)). La liberación espontánea y total se obtuvo tratando las
células diana con RPMI al 10% y detergente Triton
X-100 al 5%, respectivamente. Cada punto fue la
media de tres pocillos replicados. La liberación específica de
^{51}Cr de las células diana se definió como 100 x (cpm de la
muestra - cpm base)/(cpm total -cpm base).
No hubo diferencias en la actividad de CTL entre
grupos que recibieron o no recibieron tratamiento con
IL-12 durante la inmunización. Este resultado se
repitió en dos experimentos consecutivos y sugiere además que el
patrón de la citoquina tipo Th1 fue un producto de células T CD4+.
Incluso aunque IL-12 tiene un efecto dramático en
la reducción de la replicación de RSV en los pulmones, no hubo
diferencias significativas en el resultado clínico, incluyendo
pérdida de peso y evaluación de la enfermedad entre los grupos. La
valoración de la enfermedad, incluyendo la pérdida de peso y las
evaluaciones clínicas se llevó a cabo como está descrito
anteriormente (Tang, Y. -W., et al, J. Clin, Invest.
(1994)). El desplazamiento simple en el patrón de expresión de
citoquina no fue por tanto indicativo de un cambio en la
enfermedad. Esto sugiere que la población celular responsable de la
producción de citoquina puede ser un determinante clave de la
enfermedad y no las citoquinas mismas. Por ejemplo, los ratones
tratados con anti-IL-4 durante la
inmunización también tuvieron aumentada la expresión de
IFN-\gamma en los pulmones al tiempo del
enfrentamiento. Sin embargo, el tratamiento
anti-IL-4 condujo a mejoría de la
enfermedad que fue asociada con el aumento de la actividad CTL CD8+
(Tang, Y. -W., et al, J. Clin, Invest. (1994)). En el caso
de ratones tratados con anti-IL-4,
puede ser que la IFN-\gamma sea un producto de
las células T CD8+, mientras que en los ratones tratados con
IL-12, células T CD4+ fueron un origen más
probable.
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | N | Immunógeno | Vía | Log 10 pfu/gramo | Log 10 pfu/ |
| IL-12 | pulmón* | nariz* | |||
| 1 | 5 | KV | - - | 6,56 \pm 0,44 | 3,73 \pm 0,15 |
| 2 | 5 | KV | IP | 4,75 \pm 0,25 \dagger | 2,61 \pm 0,23\ddagger |
| 3 | 5 | KV | IM | 4,44 \pm 0,55 \dagger | 2,80 \pm 0,34\ddagger |
| 4 | 5 | placebo | - - | 6,55 \pm 0,32 | 3,73 \pm 0,29 |
| 5 | 5 | placebo | IP | 6,51 \pm 0,34 | 3,21 \pm 0,27 |
| * | Media \pm Desviación Estádar. | ||||
| \dagger | p < 0,001 comparado con Log 10 pfu/gramo pulmón en el grupo 1 | ||||
| \dagger | p < 0,001 comparado con log 10 pfu/nariz en el grupo 1 | ||||
| KV | virus muerto | ||||
| IP | vía intraperitoneal | ||||
| MI | vía intramuscular |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Universidad de Vanderbilt
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 405 Kirkland Hall
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nashville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO/PROVINCIA TN
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- DISTRITO POSTAL/NÚMERO: 37240
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (615) 322-8333
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FACSIMIL: (615) 343-3930
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INTERLEUQUINA-12 COMO ADYUVANTE PARA VACUNAS CONTRA PARAMYXOVIRIDAE
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P. C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Two Militia Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lexington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- DISTRITO POSTAL: 02173
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DEL MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Salida de PatentIn # 1.0, Versión # 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: 08/318.480
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE LA SOLICITUD: 5 de Octubre 1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Brook Esq., David E.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 22.592
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE ENTRADA: VDB94-01 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 861-6240
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FACSIMIL: (617) 861-9540
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE
IDENTIFICACIÓN 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGGACACA TCTTGCTTTG CTGCGAGCTG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE
IDENTIFICACIÓN 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCCGCCTTT GCATTGGACT TCGGTGATG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE
IDENTIFICACIÓN 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACGTTGCA TCCTAGGATC GGACCCTGCA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE
IDENTIFICACIÓN :4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCAGGCAAC TCTCGTTCTT GTGTAGTTCC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA. Nº DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGTTGATGG CCTGGAACTC TGTCTGGTAC
\hfill30
Claims (11)
1. Una composición que comprende una mezcla de un
antígeno de un virus de la familia Paramyxoviridae y una
cantidad adyuvante eficaz de interleuquina-12.
2. Una composición según la reivindicación 1,
para uso en terapia.
3. La composición según la reivindicación 2, en
donde el uso es reducir la replicación viral del virus en un
hospedante.
4. La composición según la reivindicación 2, en
donde el uso es originar una respuesta inmune contra el virus en un
hospedante.
5. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la reducción de la replicación
viral o la respuesta inmune está en relación a la replicación viral
o la respuesta inmune en ausencia de la composición.
6. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el virus de la familia
Paramyxoviridae se selecciona de: el virus de la
parainfluenza 1, el virus de la parainfluenza 2, el virus de la
parainfluenza 3, el virus de la parainfluenza 4, los virus de la
parotiditis, los virus del sarampión, el virus sincitial
respiratorio, los virus del moquillo canino, el virus
sincitial respiratorio bovino, el virus de la enfermedad de
Newcastle y el virus de Rhinderpest.
7. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el antígeno se selecciona de:
la glicoproteína de fusión, la hemaglutinina neuraminidasa y la
glicoproteína G.
8. Una preparación combinada para uso simultáneo
o secuencial en terapia, la preparación combinada comprende un
antígeno de un virus de la familia Paramyxoviridae y una
cantidad adyuvante eficaz de la
interleuquina-12.
9. El uso de un antígeno de un virus de la
familia Paramyxoviridae y una cantidad adyuvante eficaz de la
interleuquina-12 para la fabricación de una
composición para el uso de reducir la replicación viral del virus en
un hospedante.
10. El uso de un antígeno de un virus de la
familia Paramyxoviridae y una cantidad adyuvante eficaz de la
interleuquina-12 para la fabricación de una
composición para el uso de originar una respuesta inmune contra el
virus en un hospedante.
11. El uso de la reivindicación 9 ó 10, en donde
la composición es según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
7 o la preparación combinada de la reivindicación 8.
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