JPH10507175A

JPH10507175A - パラミクソウイルスワクチン用アジュバントとしてのインターロイキン−１２

Info

Publication number: JPH10507175A
Application number: JP8512635A
Authority: JP
Inventors: エス．グラハム，バーニー; タング，イー−ウェイ
Original assignee: バンダービルトユニバーシティー
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1995-10-02
Publication date: 1998-07-14
Anticipated expiration: 2015-10-02
Also published as: AU3887695A; DE69534922T2; PT784486E; MX9702396A; ATE322289T1; US6071893A; ES2257744T3; JP3939752B2; EP0784486A1; EP0784486B1; US20070087016A1; DK0784486T3; DE69534922D1; AU701753B2; WO1996011019A1

Abstract

(57)【要約】ウイルス抗原をアジュバント有効量のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）とともに宿主に併用投与することからなる、該宿主におけるパラミクソウイルス科のウイルスのウイルス複製を低下させる方法が開示される。パラミクソウイルス科のヒトウイルスとしては、パラミクソウイルス類（たとえばパラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３およびパラインフルエンザウイルス４）、モルビリウイルス類（たとえば麻疹ウイルス）、およびニューモウイルス類（たとえばＲＳウイルス）などが挙げられ、パラミクソウイルス科の前記以外の非ヒトウイルスとしては、イヌジステンパーウイルス、ウシＲＳウイルス、ニューカッスル病ウイルス、および牛疫ウイルスなどが挙げられる。パラミクソウイルス科のウイルス抗原とアジュバント有効量のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の混合物からなる組成物も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】パラミクソウイルスワクチン用アジュバントとしてのインターロイキン−１２発明の背景パラミクソウイルス科のニューモウイルス属に属するＲＳウイルス（respirat ory syncytial virus）（ＲＳＶ）は乳幼児および小児の呼吸器疾患の重要な原因である［コンノースら（Connors，M.，et al．）、J．of Virol．66:7444-745 1(1992)］。感受性が個体間で異なること、および重度障害が起きる年齢範囲が限られていることの免疫学的根拠は不明である。１９６０年代にホルマリン不活化ＲＳＶワクチンによって引き起こされたワクチン性障害悪化についての理解が不十分であることが、新規対ＲＳＶワクチン候補物質の臨床治験開始を妨げている大きな原因となっている。１９６０年代に行なわれたホルマリン活性化ミョウバン沈降ＲＳＶワクチンの臨床治験で、該ワクチンは補体結合抗体を惹起するが、小児における感染を防御できないことが示された。また、後の感染の後で見られた障害は通常見られないほど重度で、時には死に至り、入院率も上昇した［カピキアンら（Kapikian，A.Z.，et al.）、Amer ．J．Epidem．89:405(1969)；フルギンティら（Fulginti，V.A．et al．）、Ame r．J．Epidem．89:435(1969)；キム（Kim，W.H．）、Amer．J．Epidem．89:422( 1969)；チンら（Chin，J.R.，et al.）、Amer．J．Epidem．89:449(1969)］。同様の障害悪化は、あらかじめホルマリン不活化ワクチンで免疫化しておいたマウスにおいてＲＳＶ感染により誘導されうるが、生のＲＳＶで免疫化したマウスでは誘導されない［コナースら（Conners，M.，et al．）、J．Virol．66:7441(19 92)；グラハムら（Graham，B.S.，et al.）、Immunol．151:2032(1993)；アルワンら（Alwan，W.H.，et al．）、J．Exp．Med．179:81(1994)］。減弱ＲＳＶ生ワクチン製剤の臨床治験では、障害悪化との関連は見られていない。ＲＳＶ生ワクチンは、自然感染時には肺疾患を悪化させなかったが、他の点では、ホルマリン不活化ミョウバン沈降ＲＳＶワクチンと同様に不成功に終わった［キムら（Ki m，W.H.，et al．）、Pediatrics 48:745(1971)；キムら（Kim，W.H.，e t al．）、Pediatrics 52:56（1973）；ベルシェら（Belshe，R.B.，et al.）、 J．Infect．Dis．145:311(1982)；ライトら（Wright，R.B.，et al.）、Infect ．Immun．37:397(1982)］。温度感受性のＲＳＶ変異体、低温適応ＲＳＶ、または生のＲＳＶの非経口的投与は、野生型復帰率が高いこと、許容できないビルレンスがあること、または対応する年齢群において免疫原性がないことゆえに、不成功であると考えられれている［グラハムら（Graham，B.S.，et al.）、J．of Immun．151:2032-2040（1993）］。したがって、効果的な対ＲＳＶワクチン接種方法の開発とワクチン組成物が求められている。発明の概要本発明は、ＩＬ−１２がパラミクソウイルス感染に対する免疫化において強力なアジュバント作用を示すという知見に基づくものである。１つの態様においては、本発明は、パラミクソウイルス科のウイルスの抗原をアジュバント有効量のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）とともに宿主（たとえばヒトを含む哺乳類および鳥類）に併用投与することを特徴とする、該宿主における該ウイルスのウイルス複製を低下させる方法からなる。パラミクソウイルス科のヒトウイルスとしては、パラミクソウイルス類（たとえばパラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４およびムンプスウイルス）、モルビリウイルス類（たとえば麻疹ウイルス）、およびニューモウイルス類（たとえばＲＳウイルス）などが挙げられ、パラミクソウイルス科の前記以外の非ヒトウイルスとしては、イヌジステンパーウイルス、ウシＲＳＶ、ニューカッスル病ウイルス、および牛疫ウイルスなどが挙げられる。１つの態様においては、本発明は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）の抗原をアジュバント有効量のＩＬ−１２とともに宿主に併用投与することを特徴とする、該宿主におけるＲＳＶの複製を低下させる方法に関する。したがって、本発明はまた、パラミクソウイルス科のウイルスの抗原をアジュバント有効量のＩＬ−１２とともに宿主に併用投与することを特徴とする、該宿主におけるパラミクソウイルス科のウイルス類に対する免疫応答を惹起する方法に関する。本発明はまた、ＲＳウイルスの抗原を含む混合物をアジュバント有効量のインターロイキン−１２とともに宿主に併用投与することを特徴とする、該宿主の対ＲＳＶ免疫化方法に関する。また、本発明は、パラミクソウイルス科のウイルスの抗原とアジュバント有効量のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の混合物からなる組成物に関する。１つの態様においては、本発明は、ＲＳウイルスの抗原とＩＬ−１２からなる組成物に関する。本明細書で示すとおり、ＲＳＶ抗原による免疫化の際に外因性ＩＬ−１２の投与処理を行なうと、ＲＳＶ複製が低下し、その後のＲＳＶチャレンジの際に内因性ＩＬ−１２ｍＲＮＡの発現が増大する。その結果、サイトカイン発現のパターンがＴｈ２からＴｈ１様パターンへと変化し、それに伴い抗体アイソタイプ利用も変化する。これらの結果から、ＩＬ−１２はパラミクソウイルスワクチン用アジュバントとして強力であることがわかる。図面の説明図１は、プラークアッセイで得られた、ＩＬ−１２処理と肺組織１グラムあたりプラーク形成単位（ｐｆｕ）のｌｏｇ１０対数の関係を示す棒グラフであり、免疫化の際に投与したＩＬ−１２がウイルス複製に対して顕著な抑制作用を示すことを示している。図２は、ｍＲＮＡノーザンブロットで得られた、ＩＬ−１２処理と平均化α− チュブリン標準化密度の関係を示す棒グラフであり、ＩＬ−１２が不活化ＲＳＶ免疫原で免疫化しておいたマウスにおけるＴｈ１細胞分化を強化するとともに、Ｔｈ２からＴｈ１様応答への変化を引き起こしたことを示している。発明の詳細な説明本発明は、パラミクソウイルス科のウイルスの抗原とアジュバント有効量のインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の混合物を宿主（たとえばヒトを含む哺乳類および鳥類）に投与することを特徴とする、該宿主における該ウイルスのウイルス複製を低下させる方法に関する。本発明の方法はＲＳＶを使用するもので例示されるが、パラミクソウイルス類（たとえばパラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、ムンプスウイルス）、モルビリウイルス類（たとえば麻疹ウイルス）、およびニューモウイルス類（たとえばＲＳウイルス）などのヒトパラミクソウイルスをはじめとするパラミクソウイルス科の様々なウイルスのウイルス複製を低下させる目的に使用することができる。前記以外のパラミクソウイルス科の非ヒトウイルスとしては、イヌジステンパーウイルス、ウシＲＳＶ、ニューカッスル病ウイルス、および牛疫ウイルスなどが挙げられる。１つの態様においては、本発明の方法は、宿主におけるＲＳウイルス（ＲＳＶ）のウイルス複製を低下させる目的に使用され、ＲＳＶ抗原およびアジュバント有効量のＩＬ−１２を該宿主に併用投与することを特徴とする。別の態様においては、本発明の方法は、宿主におけるパラミクソウイルス科のウイルスに対する免疫応答を惹起する目的に使用され、該ウイルスの抗原およびアジュバント有効量のＩＬ−１２を該宿主に投与することを特徴とする。また、本発明は、ＲＳＶ抗原とアジュバント有効量のＩＬ−１２からなる混合物を宿主に投与することを特徴とする、該宿主の対ＲＳＶ免疫化方法に関する。パラミクソウイルス科のウイルスの抗原に関しては、ウイルス全体（たとえば不活化または生の減弱ウイルス全体）、該ウイルスの抗原部分、および組み換え技術により製造されたウイルスまたはその一部または融合タンパク質などが使用される。また、本発明の抗原としては、パラミクソウイルス科のウイルスの抗原をコードする核酸配列を含む。パラミクソウイルス科のウイルスの抗原部分としては、パラインフルエンザウイルス１、２、３、４の融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）およびヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ；ムンプスウイルスのＦタンパク質およびヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ；麻疹ウイルスのＦタンパク質およびヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ；およびＲＳＶのＦタンパク質およびＧ糖タンパク質などが挙げられる。本発明の方法および組成物において使用することができるパラミクソウイルス科のウイルスの前記以外の抗原部分は、当該分野に熟練せる者であればこれを決定することができる。本発明のＩＬ−１２は、本発明の方法における使用に適したソースから得ることができる。たとえば、ＩＬ−１２は天然ソース（たとえばヒト、動物）から精製することができ、化学合成によって、または実施例１で説明するようにして組み換えＤＮＡ技術によって製造することもできる。また、本発明のＩＬ−１２としては、ＩＬ−１２をコードする核酸配列、ならびにそのような核酸配列によってコードされるＲＮＡなども挙げられる。本明細書で使用する場合、「インターロイキン−１２」および「ＩＬ−１２」という用語は、インターロイキン−１２、そのそれぞれのサブユニット、ＩＬ−１２アジュバント活性を示すそれらの断片、および「インターロイキン−１２」および「ＩＬ−１２」の機能的同等物をいう。「インターロイキン−１２」および「ＩＬ−１２」の機能的同等物としては、生じるＩＬ−１２産物が本明細書で説明するＩＬ−１２と同じアジュバント活性を有するような修飾ＩＬ−１２タンパク質、および遺伝子コードの縮重によってＩＬ−１２と同じペプチド遺伝子産物をコードするとともに、本明細書で説明するＩＬ−１２アジュバント活性を有する核酸配列などが挙げられる。たとえば、「インターロイキン−１２」および「ＩＬ−１２」の機能的同等物は、「サイレント」のコドンまたはアミノ酸置換（たとえば１つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸に置換したもの、または疎水性アミノ酸をコードする１つのコドンが疎水性アミノ酸をコードする別のコドンに置換したもの）を含むことができる。主にマクロファージ細胞から分泌されるヘテロダイマーサイトカインであるＩＬ−１２は、ＮＫ細胞およびＣＴＬ活性を強化すること、Ｔｈ１細胞の分化を刺激すること、およびＩＦＮ−γなどのサイトカインの産生を誘導することが報告されている［ガテリーら（Gately，M.K.，et al.）、Cell．Immunol．143:127（ 1992）；ナウメら（Naume，B.，et al．）、J．Immunol．148:2429（1992）；フシエら（Hsieh，C.S.，et al．）、Science 260:547(1993)；マネッティら（Man etti，R.，et al．）、J．Exp．Med．177:1199(1993)；チャンら（Chan，S.H.， et al.）、J．Exp．Med．173:869（1991）；ダンドレアら（D'Andrea，A.，et a l.）、J．Exp．Med．176:1387(1992)；マカトニアら（Macatonia，S.E.，et al ．）、Int．Immunol．5:1119（1993）；トリップら（Tripp，C.S.，et al．）、 Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:3725（1993）］。以前はナチュラルキラー細胞刺激因子または細胞傷害性リンパ球成熟因子と呼ばれていたＩＬ−１２は、先天性および後天性免疫応答を活性化させ、リンクさせる機能を示す［コバヤシら（ Kobayashi，M．et al.）、J．Exp．Med．170:827（1989）；ステルンら（Stern ，A.S.，et al．）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6808（1990）；ロックスレーら（Locksley，R.M.，et al.）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:5879（19 93）］。ＩＬ−１２は非免疫委任Ｔヘルパー細胞のタイプ１（Ｔｈ１）表現型分化を促進する［フシエら（Hsieh，C.S.，et al．）、Science 260:547(1993)；マネッティら（Manetti，R.，et al．）、J．Exp．Med．177:1199(1993)］。その結果、ＩＦＮ−γなどのサイトカインの特徴的な布置要因を招き、細胞性免疫を促進するのが普通である［チャンら（Chan，S.H.，et al.）、J．Exp．Med.， 173:869(1991)；ダンドレアら（D'Andrea，A.，et al.）、J．Exp．Med．176:13 87(1992)；マカトニアら（Macatonia，S.E.，et al．）、Int．Immunol．5:1119 （1993）；ガテリーら（Gately，M.K.，et al.）、Cell．Immunol.，143:127(19 92)；ナウメら（Naume，B.，et al．）、J．Immunol．148:2429（1992）］。ＩＬ−１２は免疫応答を強化し、リステリア症、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、およびリンパ球性脈絡膜炎ウイルス感染などの数種類の感染症モデルにおいて防御免疫を向上させることが明らかにされている［トリップら（Tripp，C .S.，et al．）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:3725（1993）；ヘインゼルら（Heinzel，F.P.，et al．）、J．Exp.Med．177:1505(1993)；シペックら（Sype k，J.P.，et al．）、J．Exp．Med．177:1797(1993)；アフォンソら（Afonso，L .C.，et al.）、Science 263:235(1994)；ガジネリら（Gazzinelli，R.T.，et a l.）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:6115（1993）；カーンら（Khan，I.A.， et al.）、Infect．Immun．62:1639（1994）；オランゲら（Orange，J.S.，et a l.）、J．Immunol．152:1253（1994）］。ＩＬ−１２の精製およびクローニングについては、ＰＣＴ国際公開第９２／０５２５６号パンフレットおよび国際公開第９０／０５１４７号パンフレット、ならびに欧州特許出願公開第３２２，８２７号明細書（「ＣＬＭＦ」として同定されている）に開示されている。インターロイキン−１２すなわちＩＬ−１２は、抗原に対するＴ細胞応答の調節など数多くの免疫作用を示す哺乳類サイトカインである（たとえばＰＣＴ国際公開第９２／０５２５６号パンフレットおよび国際公開９０／０５１４７号パンフレット参照；これらの公報でＩＬ−１２は「ＮＫＳＦ」として同定されている）。また、ＩＬ−１２は、一般にワクチンアジュバントとしての用途も可能であることが示唆されている［スコット（Scott，P．）、Science 260:496-497(1993 )；トリチェリ（Trichieri，G．）、Immunology Today 14:335-338(1993)］。本発明の方法においては、アジュバント有効量のＩＬ−１２をパラミクソウイルス科のウイルスの抗原と併用投与する。すなわち、ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２を投与しない宿主の免疫化と比べて強化された免疫応答を宿主においてもたらすように、ウイルス抗原による宿主の免疫化の時点と近い時点で投与される。したがって、ＩＬ−１２は免疫化の前、好ましくは免疫化の直前、免疫化の時点で（すなわち同時に）、または免疫化後に（すなわち引き続いて）、投与することができる。また、ＩＬ−１２はパラミクソウイルス科のウイルス抗原による免疫化の前に投与した後、抗原による免疫化の後に引き続いてＩＬ−１２の注射を行なうことができる。ＩＬ−１２および抗原は様々な方法で宿主に投与することができる。投与ルートとしては、皮内、経皮（たとえば徐放性ポリマー）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、および鼻腔内ルートなどが挙げられる。たとえば輸液またはボーラス注射、または上皮細胞または粘膜皮膚細胞内層など、前記以外の便利な投与ルートを用いることができる。また、ＩＬ−１２およびパラミクソウイルス科ウイルスの抗原は、前記以外の公知のアジュバント（たとえばミョウバン、ＭＰＬ、ＱＳ２１）、薬学的に許容できる界面活性剤（たとえばグリセリド）、賦形剤（たとえばラクトース）、担体、希釈剤、およびビヒクルなどその他の成分または生理活性物質と併用投与することができる。所望により、ある種の甘味料、着香料、および／または着色料も添加することができる。ＩＬ−１２および抗原は、宿主がウイルスに感染しているかいないかにかかわらず、宿主に対して予防ワクチンとして投与することができる。ＩＬ−１２および抗原はまた、感染宿主に対して治療ワクチンとして投与することができ、その感染原ウイルスによって引き起こされた疾患状態を軽減または除去することができる。さらに、抗原および／またはＩＬ−１２は、それをコードするポリヌクレオチドを哺乳類対象内でイン・ビボ発現させることによって投与することができる。たとえば、ＩＬ−１２またはパラミクソウイルス抗原は、生きたベクターを用いて宿主に投与することができ、ＩＬ−１２および／または抗原核酸配列を含有する該生きたベクターは、該抗原および／またはＩＬ−１２がイン・ビボで発現されるような条件下で投与される。たとえば、宿主は、イン・ビボでパラミクソウイルス科のウイルスの抗原をコードし発現するベクターとＩＬ−１２タンパク質またはペプチドを併用するか、イン・ビボでＩＬ−１２タンパク質をコードし発現するベクターを併用したものの注射を受けることができる。あるいは、宿主は、イン・ビボでＩＬ−１２をコードし発現するベクターとペプチドまたはタンパク質の形のパラミクソウイルス抗原を併用するか、イン・ビボでパラミクソウイルス抗原をコードし発現するベクターを併用したものの注射を受けることができる。パラミクソウイルス抗原をコードする配列を含有する単一のベクターおよびＩＬ−１２タンパク質も、本発明の方法および組成物において有用である。数種類の発現ベクター系が市販されており、組み換えＤＮＡ技術および細胞培養技術により増殖させることもできる。たとえば、酵母またはワクシニアウイルス発現系などのベクター系、またはウイルスベクターを本発明の方法および組成物に使用することができる［カウフマン（Kaufman，R.J．）、A J．of Meth．in Cell and Molec．Biol．2:221-236（1990）］。裸のプラスミドまたはＤＮＡおよびクローン化遺伝子をターゲット化リポソーム中または赤血球ゴースト中にカプシド化したものを用いる前記以外の技術を用いて、ＩＬ−１２および／またはパラミクソウイルス抗原ポリヌクレオチドを宿主に導入することができる［フレイドマン（Freidman，T.）、Science 244:1275-1281(199)；ラビノビッチら（Ra binovich，N.R.，et al.）、Science 265:1401-1404（1994）］。発現ベクターの構築および様々な宿主細胞へのベクターならびに核酸の組み込みは、Molecula r CloningおよびCurrent Protocols in Molecular Biologyなどの手引書に記載の遺伝子工学技術を用いるか、市販のキットを用いることによって、これを行なうことができる［サムブルークら（Sambrook，J.，et al.）、Molecular Clonin g，Cold Spring Harbor Press，1989；アウスベルら（Ausubel，F.M.，et al．）、Current Protocols in Moleuclar Biology，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，1989］。本発明の方法および組成物において使用される抗原の量は、宿主において効果的な免疫刺激応答を引き起こす量である。ＩＬ−１２のアジュバント有効量とは、ＩＬ−１２のアジュバント有効量を投与しない場合の免疫応答と比べて強化された免疫応答を投与時に引き起こす量である。また、宿主の免疫化に使用されるパラミクソウイルス科のウイルスの抗原およびＩＬ−１２の量は、使用する抗原、宿主のサイズ、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、および投与時間と期間、またはワクチン接種の対象となっているパラミクソウイルス科のウイルスの特定の性質など様々な因子によって決まる。確立された用量範囲の調整および操作は、当該分野に熟練せる者の能力の範囲内で容易に可能である。ワクチン製剤の処方および送達ルートは、Ｔヘルパーリンパ球サブセットの誘導に影響を及ぼしうるため、ウイルスチャレンジ後の疾患発現に影響を及ぼすことがある［グラハムら（Graham，B.S.，et al.）、Immunol．151:2032(1993)］。免疫化の際に中和モノクローナル抗体によってＩＬ−４を剥奪すると、Ｔｈ２からＴｈ１様免疫応答への変化が誘導され、臨床転帰が向上し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性が増大する［タングら（Tang，Y.-W.，et al．）、J．Clin．Invest．（1994）］。これは、抗ＩＬ−４処理マウスにおけるチャレンジの際の内因性ＩＬ−１２メッセージの発現増大と関連していた。これらの知見から、Ｔｈ２様細胞サブセットの選択的活性化が、ＲＳＶワクチンによって誘導される疾患の免疫賦活化の原因であること、およびＩＬ−１２はＴｈ２からＴｈ１様応答側への応答変化と関連している可能性が示唆される。ＩＬ−１２投与マウスにおける生のＲＳＶによるチャレンジの後では、ＲＳＶの複製が顕著に低下する。ＲＳＶ由来抗原とＩＬ−１２からなる組成物中のアジュバントとしてＩＬ−１２を使用した場合も、ＲＳＶチャレンジ後のマウスにおいてＴｈ２からＴｈ１様免疫応答への変化が誘導された。ＩＬ−１２アジュバント作用はＲＳＶ複製の低下に対して強く見られたが、ＲＳＶによるチャレンジ後の障害を抑制する目的でワクチンアジュバントを使用することの方が重要である。アジュバントとしてサイトカインを使用すると、免疫化によって誘導される免疫パラメーターをコントロールして防御作用を向上させるとともに、ＲＳＶワクチンの悪影響を抑制させることができる。ＲＳＶワクチン接種に対する免疫応答に及ぼすＩＬ−１２の影響を、ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおける生のウイルスによるチャレンジ後に測定した結果を実施例で説明する。その結果、ＩＬ−１２は強力なアジュバントとして作用し、ＲＳＶワクチンに含まれるべき有用な産物であることが判明した。実施例１で説明するように、ＢＡＬＢ／ｃマウスを不活化ウイルス全体で筋肉内免疫化処理し、ネズミ組み換え体ＩＬ−１２を、免疫化またはチャレンジの１日前から５日間連続で腹腔内投与した。４週後にマウスを生のウイルスでチャレンジ処理した。チャレンジ後４日目の肺におけるウイルス複製を評価した。免疫化の際に投与したＩＬ−１２はウイルス複製に対して顕著な抑制作用を示した。肺組織あたりのｌｏｇ１０ｐｆｕは、ＩＬ−１２投与を行なわなかったＲＳＶ免疫化対照マウスにおける６．９から、ＩＬ−１２投与を行なった免疫化マウスにおける３．８へと低下した（図１）。一方、チャレンジの際のＩＬ−１２投与はウイルス複製に有意な影響を及ぼさなかった（図１）。様々なＩＬ−１２送達ルートの影響について、実施例２で説明する。ＩＬ−１２は、実施例１と同様にして腹腔内投与するか、ＲＳＶ免疫原と混合して筋肉内投与した。表１に、ウイルス複製の低下に及ぼすＩＬ−１２の腹腔内送達または筋肉内送達の影響を示す。免疫原と同時に単回投与したＩＬ−１２は、５回腹腔内投与方式の場合と同じウイルス複製低下効果を示した。特異的免疫調節物質としてのＩＬ−１２は、ＲＳＶ免疫化マウスにおいてのみ機能し、抗原刺激を受けていない（unprimed）マウスにおいては作用を示さなかった（図１、表１）。これらのデータから、ＩＬ−１２は不活化ＲＳＶ免疫原に対して強力なアジュバント作用を示すことが明らかである。免疫化に応答して産生される免疫グロブリンアイソタイプのパターンは、イン・ビボで産生されるサイトカインのタイプの間接的指標となる。ＩｇＧ２ａはＴｈ１細胞活性化の結果としてマウスにおいて産生されるのに対し、ＩＬ−４はＩｇＧ１の産生を促進する［ブルステインら（Burstein，H.J.，et al.）、J．Imm unol．147:2950（1991）；フィンケルマンら（Finkelman，F.D.，et al．）、An nu.Rev．Immunol．8:303（1990）；モリスら（Morris，S.C.，et al.）、J．Imm unol．152:1047（1994）］。実施例３で説明するように、ＩＬ−１２投与を受けたＲＳＶ免疫化マウスにおける血清ＲＳＶ特異的免疫グロブリンアイソタイプ価の盲験アッセイで、ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２投与を受けていない免疫化マウスと比べて、有意に多いＲＳＶ特異的ＩｇＧ２ａ抗体および有意に少ないＩｇＧ１抗体を誘導することが示された。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１のＲＳＶ特異的抗体応答のパターンは、ＩＬ−１２を筋肉内投与するか腹腔内投与するかにかかわらず同様であった（表２）。ＩＬ−１２によって誘導された抗体アイソタイプ利用のパターンから、ＩＬ− １２をイン・ビボ投与すると、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞の分化を促進し、不活化ＲＳＶの筋肉内免疫化に応答するＴｈ２細胞の出現を阻害することができることが示唆される。肺におけるサイトカインｍＲＮＡ発現のパターンを、実施例４で説明するようにして直接調べた。ＩＬ−１２処理の有無にかかわらず、免疫化マウスの肺組織を生のウイルスによるチャレンジ後４日目に採取した。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１２のサイトカインｍＲＮＡをノーザンブロット分析で測定した。異なる処理を行なったマウス間でＩＬ−６およびＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルには明確な差はなかったが、免疫化またはチャレンジのいずれかの時点でＩＬ−１２で処理したマウスの肺は、ＩＬ− １２投与を受けなかった対照マウスと比べて多量のＩＦＮ−γを含んでいた（図２）。免疫化の際にＩＬ−１２処理をしたマウスではＩＬ−１２ｍＲＮＡ発現が増大したのに対し、チャレンジ時のＩＬ−１２投与ではＩＬ−１２ｍＲＮＡ発現は増大しなかった（図２）。これらのデータから、ＩＬ−１２は、不活化ＲＳＶ免疫原で免疫化したマウスにおいてＴｈ１細胞分化を強化するとともに、Ｔｈ２からＴｈ１様応答への変化を引き起こしたことが示唆される。免疫化マウスの肺におけるＲＳＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を評価して、ＩＬ−１２投与が正の調節エフェクターとして細胞性免疫を強化したかどうかを判定した。実施例５で説明するように、イン・ビトロ刺激を含まない、肺リンパ球を用いた直接ＣＴＬアッセイを利用した［タングら（Tang，Y.-W .，et al．）、J．Clin．Invest.（1994）］。免疫化の際にＩＬ−１２処理を受けた群と受けなかった群の間にＣＴＬ活性の差はなかった。２回連続の実験でこれと同じ結果が得られたことから、Ｔｈ１様サイトカインパターンはＣＤ４＋Ｔ細胞の産物であったことがさらに示唆される。ＩＬ−１２の用量を変更すると、障害パターンを変化させるようなより大きなＣＤ８＋応答が誘導されるものと期待してもよい。実施例５で説明するように、ＩＬ−１２が肺において劇的なＲＳＶ複製低下効果を示すとしても、群間には体重減少および障害スコアなどの臨床転帰に有意差はなかった。したがって、単なるサイトカイン発現パターン変化は障害変化の予測因子ではなかった。このことは、障害のカギとなる決定因子はサイトカイン産生の役目を担う細胞集団であって、サイトカイン自体ではないことを示唆している。たとえば、免疫化の際に抗ＩＬ−４で処理したマウスも、チャレンジ時に肺におけるＩＦＮ−γ発現が増大したが、この抗ＩＬ−４処理は、ＣＤ８＋ＣＴＬ活性の増大と関連する障害抑制をもたらした［タングら（Tang，Y.-W.，et al．）、J．Clin．Invest.（1994）］。抗ＩＬ−４処理マウスの場合、ＩＦＮ−γがＣＤ８＋Ｔ細胞の産物であって、ＩＬ−１２処理マウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞がソースである可能性が高い。ＩＬ−１２の用量を調整すると、その性質を変えることができる。リンパ球性脈絡膜炎（ＬＣＭＶ）に対する免疫応答に及ぼすＩＬ−１２の影響について調べた最近の研究で、脾臓ＣＤ８＋細胞数増加およびＬＣＭＶ複製低下から明らかになったように、低用量のＩＬ−１２はＬＣＭＶ感染に対する免疫性を強化することが示されたが、実施例で用いたものと同等の高用量のＩＬ−１２は、ウイルス特異的ＣＴＬ活性の低下およびウイルス複製の増大から明らかになったように、ＬＣＭＶ感染に対する抵抗性を弱めた［オランゲら（Orange，J.S.，et al.）、 J．Immunol．152:1253（1994）］。したがって、ＩＬ−１２の用量またはその送達方法を調整して、ウイルス阻害に対する影響を維持しつつ、障害に対しても影響を及ぼすことが可能となる。以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。実施例実施例１ＲＳＶおよびＩＬ−１２によるマウスの免疫マウス：病原体を持たない雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、８〜１０ヶ月齢、をチャールスリバーラボラトリーズ社(Raleigh，North Carolina)より購入し、公知の文献「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」に従って、取り扱った[グラハムら(Graham，B.S.，et al)，J．Med．Virol．26:153(1988)]。ＲＳＶ免疫原およびウイルス：ホルマリン不活化ミョウバン沈降ＲＳＶの調製およびＲＳＶのＡ２株のストックの調製は、公知である[グラハムら（Graham，B .S.，et al.）、Immunol．151:2032(1993)]。ワクチンの調製およびチャレンジのストックの両方とも、ＲＳＶのＡ２株由来であった。ネズミサイトカインＩＬ−１２：ネズミ組み換えＩＬ−１２を、クローン化ｃＤＮＡより発現させた[シェーンハウトら（Schoenhaut，D.S.，et al.）、J．Im munol．148:3433(1992)]。本明細書で使用したロットは、ＰＨＡブラストアッセイにより決定した５．６×１０⁶ユニット／ｍｇの比活性を有するＭＲＢ０２１６９３−１．２（ジェネティックスインスティテュート社、Cambridge，Massa chusetts）であった[ウオルフら(Wolf，S．F.，et al.)、J．Exp．Med．146:307 4(1991)]。濃縮ＩＬ−１２の一部を−７０℃で保存し、１％の正常マウス血清を含むリン酸緩衝生理食塩水（１％ＰＢＳ）で希釈した。免疫：既報[グラハムら（Graham，B.S.，et al.）、Immunol．151:2032（1993 ）;タングら（Tang，Y.-W.，et al．）、J．Clin．Invest．(1994)]に従って、２．２×１０⁶ｐｆｕのウイルス抗原と同等物を含むホルマリン不活化ミョウバン沈降ＲＳＶを用いて、マウスを筋肉内免疫し、４週間後、１０⁷ｐｆｕの生のＲＳＶを用いて、鼻腔内チャレンジした。ＩＬ−１２を、１μｇ／マウスの用量で、免疫の１日前から始めて５日間連続腹腔内投与した。同じスケジュールで１％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、対照マウスに投与した。チャレンジ後４日目の肺におけるウイルスの複製を、プラークアッセイにより評価した。生のＲＳＶチャレンジ当日および２週間後に、マウス血清試料を集めた。プラークアッセイおよび中和試験：Ｃｏｓｔａｒの１２ウエルのプレート中、８０％コンフルエントの２日目のＨＥｐ−２単層をプラークアッセイおよび中和試験に用いた。既報に従って、アッセイを行なった[グラハムら（Graham，B.S. ，et al.）、J．Med．Virol．26:153(1988)]。免疫の際に投与したＩＬ−１２は、ウイルス複製低下に対して、顕著な効果を示す。肺当たりＬｏｇ１０ｐｆｕは、ＩＬ−１２投与なしのＲＳＶ免疫対照マウスの６．９からＩＬ−１２投与の免疫マウスの３．８まで低下した。これとは対照的に、チャレンジの際のＩＬ−１２投与は、ウイルスの複製に対して、有効な作用を示さなかった。図１を参照（Ｌｏｇ１０ｐｆｕ／グラム肺を、算術平均± Ｓ．Ｄ．として示す；ＫＶは、死ウイルスを示す）。実施例２アジュバント能としてのＩＬ−１２の送達ルートの効果アジュバントＩＬ−１２の種々の送達ルートの効果を調べた。実施例１に記載のように、ＩＬ−１２をマウスの１群に腹腔内投与した。別の群のマウスには、ＩＬ−１２をＲＳＶ抗原と混合して筋肉内投与した。対照マウスは、ｍｏｃｋ免疫または抗原なしのＩＬ−１２単独で処理のいずれかを行った。表１に、免疫原と同時のＩＬ−１２単回投与は、５回の用量の腹腔内養生と比べて、ウイルスの複製の低下において同様の効果を有するという実験結果をまとめている。特異的免疫調節剤としてのＩＬ−１２は、ＲＳＶ免疫マウスでしか作用せず、プライミングしないマウスには何の作用も有しなかった。図１と表１を参照。これらのデータにより、ＩＬ−１２は、不活化ＲＳＶ免疫原に強力なアジュバント効果を及ぼすことが示される。実施例３ＩＬ−１２を投与されたＲＳＶ免疫マウスにおける免疫グロブリンアイソタイプの力価の測定ＩＬ−１２を投与されたＲＳＶ免疫マウスで産生された免疫グロブリンアイソタイプの型を調べた。生のＲＳＶのチャレンジの日およびその２週間後、マウスの血清試料を集めた。ＲＳＶ特異的免疫グロブリンアイソタイプのＥＬＩＳＡ：すべての血清学的試験は、実験群に対して知らない者により行った。ＢＣＨ４細胞およびＢＣ細胞を、Ｉｍｍｕｌｏｎ II ９６ウエルプレート(ＮＵＮＣ社、Denmark)上の固相に結合させた。各ウエルに、連続希釈のマウス血清試料を添加した。プレートをインキュベートし、洗浄して、１：１０００希釈のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ネズミＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ(サザンバイオテクノロジー社、Birmingham ，Alabama)をそれぞれ添加した。もう１回インキュベートした後、プレートを洗浄して、基質を添加して室温で３０分間置き、ＯＤ₄₀₅を測定した[グラハムら（ Graham，B.S.，et al.）、Immunol．151:2032（1993）;タングら（Tang，Y.-W. ，et al．）、J．Clin．Invest．(1994)]。ＢＣＨ４細胞の２個のウエルの光学密度の平均がＢＣ被覆ウエルのそれより２倍大きく、かつ、０．１より大きい場合、血清希釈が陽性であるとみなした。これらの結果により、ＩＬ−１２を投与されない免疫マウスと比較して、ＩＬ −１２は、ＲＳＶ特異的ＩｇＧ２ａ抗体を有意に誘導し、ＩｇＧ１抗体を有意に誘導しないことがわかる。ＩＬ−１２が筋肉内投与であるか腹腔内投与であるかに関わらず、ＲＳＶ特異的抗体応答ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の型は、類似していた。表２を参照。実施例４ＩＬ−１２免疫および非免疫マウス由来の肺におけるサイトカインｍＲＮＡ発現のパターンＩＬ−１２処理および非処理免疫マウス由来の肺組織を、生のウイルスのチャレンジ後、４日目に採取した。ノーザンブロット分析により、ＩＦＮ−γ、ＩＬ −４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のサイトカインｍＲＮＡを調べた。ｍＲＮＡ抽出、ノーザンブロッティングおよびサイトカインの検出：既報に従って、肺全体由来の全ＲＮＡを抽出し、ポリＡＲＮＡを単離し、電気泳動により分離してメンブレンに転写した[グラハムら（Graham，B.S.，et al.）、Immun ol．151:2032（1993）;タングら（Tang，Y.-W.，et al．）、J．Clin．Invest.( 1994)]。既報に従って、³²Ｐオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを行った[グラハムら（Graham，B.S.，et al.）、Immunol.，151:2032(19 93)]。洗浄後、メンブレンを−７０℃でＫｏｄａｋＸ−ｏｍａｔフィルムに感光させた。ＧｅｌＳｃａｎＸＬソフトウエアを用いるＬＫＢＵｌｔｒｏＳｃａｎＸＬ（ファルマシアファインケミカルズ社、Piscataway，New Jers ey）により、レーザーデンシトメトリーを行った。ネズミＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６オリゴヌクレオチドプローブを、Ｒ＆Ｄシステムズ（Mi nneapolis，Minnesota）またはクローンテックラボラトリー社(Palo Alto，Cali fornia)より購入した。ＩＬ−１２の検出のためにデザインしたオリゴヌクレオチドのカクテルは、ヒトＩＬ−１２配列での同定に基づく予想スプライス部位にわたるネズミＩＬ−１２配列に基づいたものであった[シェーンハウトら（Schoe nhaut，D.S.，et al.）、J．Immunol.，148:3433(1992)]。５’から３’へ：ｐ−４０：ｐ−３５： α−チュブリン標準化密度で平均化したサイトカインｍＲＮＡノーザンブロット（群当り２個の試料）を、図２に示す。種々の処理を行ったマウス間で、ＩＬ −６およびＩＬ−１０ｍＲＮＡレベルの違いは見られなかった。しかし、免疫の際またはチャレンジの際のいずれかでＩＬ−１２処理を行ったマウス由来の肺は、ＩＬ−１２を投与されなかった対照マウスと比較して、ＩＬ−４よりＩＦＮ− γを多く含んでいた（図２）。免疫の際にＩＬ−１２処理を行ったマウスでは、ＩＬ−１２ｍＲＮＡの発現が増加していたが、チャレンジの際のＩＬ−１２投与は、ＩＬ−１２ｍＲＮＡの発現を増加させなかった（図２）。これらのデータにより、ＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞の分化を亢進させ、不活化ＲＳＶ免疫原で免疫したマウスにおいて、Ｔｈ２からＴｈ１様応答の変化を起こすことが示された。実施例５免疫マウスの肺におけるＲＳＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性免疫マウスの肺におけるＲＳＶ特異的ＣＴＬ活性を調べて、ＩＬ−１２投与が、正の調節エフェクターとして細胞性免疫を亢進させるかどうかを評価した。インビトロ刺激を含まない肺のリンパ球を用いる直接ＣＴＬアッセイを行った[タングら（Tang，Y.-W.，et al．）、J．Clin．Invest．(1994)]。細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（比重１．０９）クッション遠心分離により、肺の全リンパ球を単離した。⁵¹Ｃｒ（デュポン−ニューイングランドニュークレア社、Boston,Massachusetts）で標識したＢＣＨ４およびＢＣ標的細胞を、既報に従って、９６ウエルマイクロタイタープレート中、３７℃で４時間エフェクター細胞とインキュベートした[タングら（Tang，Y.- W.，et al．）、J．Clin．Invest．(1994)]。自発放出および全放出は、それぞれ、１０％ＲＰＭＩおよび５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００界面活性剤で処理することにより得られた。各点は、３連のウエルからの平均であった。標的細胞からの⁵¹Ｃｒの特異的放出を、１００×（試料ｃｐｍ−バックグランドｃｐｍ）／（全ｃｐｍ−バックグランドｃｐｍ）と定義した。免疫の際にＩＬ−１２処理を受けた群または受けなかった群間で、ＣＴＬ活性に差異はなかった。この結果は、２つの連続実験で再現され、さらに、Ｔｈ１様サイトカインパターンは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の産物であったことが示唆される。肺において、ＩＬ−１２はＲＳＶ複製の低下に劇的な効果を有するけれども、群間の体重減少および障害スコアを含む臨床転帰の有意な差はなかった。体重減少および臨床スコアを含む障害評価は、既報に従って行った[タングら（Tang，Y.-W. ，et al．）、J．Clin．Invest．(1994)]。従って、サイトカインの発現パターンの単なる変化は、障害の変化の前兆ではなかった。このことにより、サイトカイン産生に応答できる細胞集団は、障害のカギとなる決定因子であってもよく、サイトカインそれ自体ではないことが示唆される。例えば、免疫の際に抗ＩＬ− ４で処理したマウスも、チャレンジの際に肺においてＩＦＮ−γの発現を増加させた。しかし、抗ＩＬ−４処理は、ＣＤ８＋ＣＴＬ活性の上昇を伴う障害の減少という結果となった[タングら（Tang，Y.-W.，et al．）、J．Clin．Invest．(1 994)]。抗ＩＬ−４処理マウスの場合、ＩＦＮ−γがＣＤ８＋Ｔ細胞産物であるかもしれないが、ＩＬ−１２処理マウスの場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞がよりソースらしいかもしれない。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。このような均等物は、下記クレームの範疇に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/39 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】１．パラミクソウイルス科のウイルス抗原およびアジュバント有効量のインターロイキン−１２の混合物からなる組成物。２．パラミクソウイルス科のウイルスが、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳ（respiratory syncytia l）ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ウシＲＳウイルスＲＳＶ、ニューカッスル病ウイルスおよび牛疫ウイルスからなる群より選ばれる請求項１９記載の組成物。３．抗原が、融合糖タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼおよびＧ糖タンパク質からなる群より選ばれる請求項１９記載の組成物。４．宿主におけるパラミクソウイルス科のウイルスのウイルス複製を低下させる使用のための、パラミクソウイルス科のウイルス抗原およびアジュバント量のインターロイキン−１２の混合物からなる組成物。５．宿主におけるパラミクソウイルス科のウイルスに対する免疫応答を惹起させる使用のための、パラミクソウイルス科のウイルス抗原およびアジュバント量のインターロイキン−１２の混合物からなる組成物。６．パラミクソウイルス科のウイルスが、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、イヌジステンパーウイルス、ウシＲＳウイルス、ニューカッスル病ウイルスおよび牛疫ウイルスからなる群より選ばれる請求項４または５記載の組成物。７．抗原が、融合糖タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼおよびＧ糖タンパク質からなる群より選ばれる請求項６記載の組成物。８．抗原および／またはインターロイキン−１２が、宿主で発現されるポリヌクレオチドである請求項４または５記載の組成物。９．ウイルス抗原をアジュバント有効量のインターロイキン−１２とともに宿主に併用投与することからなる、該宿主におけるパラミクソウイルス科のウイルス複製を低下させる方法。１０．ウイルス抗原をアジュバント有効量のＩＬ−１２とともに宿主に併用投与することからなる、該宿主におけるパラミクソウイルス科のウイルスに対する免疫応答を惹起する方法。