JP3108095B2 - Ｈｒｓｖワクチン - Google Patents

Ｈｒｓｖワクチン

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JP3108095B2 JP03513097A JP51309791A JP3108095B2 JP 3108095 B2 JP3108095 B2 JP 3108095B2 JP 03513097 A JP03513097 A JP 03513097A JP 51309791 A JP51309791 A JP 51309791A JP 3108095 B2 JP3108095 B2 JP 3108095B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はヒト呼吸器合胞体ウイルス（Human Respirat
ory Syncytial Virus）（HRSV）からヒトを保護するワ
クチンにおいて有用な免疫原性ペプチドおよびHRSVから
ヒトを保護する方法に関する。
発明の背景 HRSVは1956年に発見され、世界中で見つかっている。
HRSVは、特に乳幼児にて上および下気道疾患を引き起こ
す。急性呼吸器疾患で入院している乳児の約30％はHRSV
感染症を有している。小児および大人の場合、該疾患は
より緩和である。
HRSVでの感染症は気道のあらゆる区分に属しており、
通常、発熱、咳、鼻かぜおよび疲労に伴い、臨床的には
気管支炎、毛細気管支炎、肺炎、クループまたはウイル
ス感染症と診断される。小児および大人の場合、該ウイ
ルスは、一般に、上気道における複製に制限される。該
ウイルスが肺にまで広がると、乳児はより激しく影響を
受けうる。肺障害は永久不変的であるとすることができ
る。
HRSVでの主要感染は、初期に、通常、２才までに生じ
る。子供の間で、このウイルスにより引き起こされる病
気は、数カ月の持続期間、かなりはっきりと定められる
急激な発生にて、毎年、少なくとも１回起こる傾向にあ
る。流行病は、一般に３ないし５カ月間と明確に制限さ
れる。家族研究において、低学年の子供がそのウイルス
を頻繁に家庭内に導入し、他の家族よりもより年下の家
族がより重度に感染する。感染症の臨床結果は、最初ま
たは２回目の体験者で最も重度であり、免疫学的に経験
した個人ではより緩和されるようになる。
HRSVの従属的効果は、不明瞭な感染から重度の肺炎お
よび死まで変化しうる。気道炎症が大部分の徴候に関係
している。たいていの場合、完全な回復が、一生を通じ
て存続すると思われる抗体の生成と共に１〜３週間で生
じる。アメリカ合衆国においては、１才の乳児の約30
％、５才の子供の95％が循環HRSV抗体を有する。抗体を
有する年長の乳児、子供および大人の場合、再感染は風
邪の形態であって、ほとんど緩和な上部呼吸器疾患であ
る。
細胞培養中におけるウイルスの収率の低さがHRSVの研
究を妨げているが、該ウイルスはすでに十分に研究され
ている。HRSVは、10モノシストロン性メッセンジャーに
転写される１本負鎖RNAを含有するパラミクソウイルス
である。該メッセンジャーはイン・ビトロにて単離さ
れ、翻訳されている。その生成物は、ゲル電気泳動法、
ペプチド地図作製および免疫沈降法により、ビリオンか
ら単離された構造蛋白質と同様であると特徴付けられ
た。その構造蛋白質は、主要ヌクレオカプシド蛋白質
（N;MW約42,000）；ヌクレオカプシドリン蛋白質（P;MW
約34,000）；大型ヌクレオカプシド蛋白質（L;MW約200,
000）；エンベロープマトリックス蛋白質（M;MW約26,00
0）；第２のマトリックス蛋白質（MW約22,000）；およ
び２つのエンベロープ糖蛋白質、融合糖蛋白質（F;MW約
68,000〜70,000）および第２のメチオニン欠乏糖蛋白質
（G;MW約84,000〜90,000）を包含する。加えて、1A蛋白
質と称される別の蛋白質は約9,500ダルトンの蛋白質で
あり、精製されたHRSVの膜フラクションおよびウイルス
感染細胞の膜において見つかっている。加えて、他の小
型蛋白質が感染細胞中に存在することが知られている，
コリンス・ピー・エル（Collins,P.L.）らのジャーナル
・オブ・バイロロジー（J.Virol.）49:572−578（198
4）およびその中に挙げる引例参照。モーガン・エル・
エイ（Morgan,L.A.）らは、ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・バイオロロジー（J.gen.Virol.）68:2781〜2788
（1987）において株変異およびHRSVに言及している。
HRSVを攻撃するのに、目下のところ入手可能な効果的
なワクチンは存在しない。HRSVに対する効果的なワクチ
ンを得るのに多くの試みがなされてきた。フリードワル
ド（Friedewald）らは、ジェイ・アム・メド・アッソ
（J.Am.Med.Asso.）,204:690〜694（1968年５月20日）
において、ウシ胎児腎組織培養中におけるHRSVの増殖を
記載している。34℃または28℃で増殖させたウイルスは
感染力または菌力が減少しなかった。26℃で増殖させた
HRSVは感染力が制限されており、免疫原性が乏しいた
め、大人の場合の感染力の減少に伴い、該ウイルスを大
人の感染の予防に用いると考えることはできなかった。
キム（Kim）らは、ペディアトリックス（Pediatrics）,
48:745〜755（1971年11月）において、26℃で増殖させ
たウイルスから製造した不活性HRSVワクチンが、６カ月
から13才の年令の乳児および子供において高レベルの血
清抗体の発展を刺激するが、感染を予防しなかったと開
示している。マックイントッシュ（McIntosh）らは、ペ
ディアトリック・リサーチ（Pediatr.Res.）,8:689〜69
6（1974）において、２種類の実験用生HRSVワクチン、2
6℃で増殖させたウイルスから製造したワクチンと、32
℃でよく増殖し、37℃またはそれ以上では全く増殖しな
い温度感受性変異体から製造したワクチンを論じてい
る。第１のワクチンは、ワクチン処置と攻撃の間隔が４
カ月以上であると、該ワクチンは感染に対する保護を示
さないために不十分なものであった。さらに第２のワク
チンもまた数人のワクチン接種を受けた人でその温度感
受性を明らかに喪失している点で不十分であった。クラ
イヘッド（Craighead）は、ジャーナル・オブ・インフ
ェクシャス・ディシーズ（J.Infect.Dis.）,131:749〜7
53（1975年６月）において、1966年に行われた試験を論
じており、その試験では数群の研究者が乳児および幼児
において組織培養中にて増殖させたホルムアルデヒド処
理のミョウバン−沈降ウイルスを試験している。その
後、野生ウイルスに暴露させると、該ワクチン受容者は
悪化した気道疾患様式を示した。クライヘッド（Craigh
ead）は、ホルムアルデヒドで処理したウイルスによる
免疫処置が該疾患の激しさを増大させたと結論してい
る。ライト（Wright）らは、ジャーナル・オブ・ペディ
アトリックス（j.Pediatr.）,88:931〜936（1976年６
月）において、乳児における温度感受性弱毒化生HRSVワ
クチンの評価を記載している。すべての血清陰性の乳児
を感染させるに十分に高い投与量レベルで投与した場
合、このワクチンは温和な上部呼吸器疾病を引き起こし
たが、その用量を低くすると許容しうるレベルの感染力
が得られなかった。また、該ウイルスは、あるワクチン
接種を受けた人で温度感受性を喪失した証拠があるよう
に、遺伝学的に不安定であった。このワクチンによる天
然疾病の強化およびワクチン接種を受けた人の間で生じ
る再感染を明らかにするものは何もない。
米国特許第4,517,304号は、培養中、増殖させた感受
性細胞の細胞膜上で免疫学的に活性なHRSV蛋白質を産生
する方法を開示している。これらの細胞は、ついで宿主
に注射されて免疫応答を顕在化させる。
HRSV蛋白質を含むサブユニットワクチンが提案されて
いる。このようなHRSV蛋白質からなるワクチンを患者に
投与し、抗体標的として有用な抗原を得ることができ
る。また、ワクシニアウイルス発現系を用いてHRSV蛋白
質を得、保護免疫応答用の抗原標的として供することが
できる。該ワクシニアウイルス発現系は、HRSVのＧおよ
びＦ糖蛋白質を包含する数種のHRSV蛋白質を別々に発現
することが知られている。ボール（Ball）ら、ピー・エ
ヌ・エイ・エス・ユー・エス・エイ（P.N.A.S.USA）83:
246〜250（1986）およびオルムステッド（Olmsted）、
ピー・エヌ・エイ・エス・ユー・エス・エイ83:7462〜7
466（1986）。これらの２種の糖蛋白質が生HRSVウイル
ス攻撃に対して哺乳動物における免疫保護を誘発するこ
とが証明された：ストット（Stott）ら、ジャーナル・
オブ・バイロロジー（Journal of Virology）67:607〜6
13（1986）；ワルシュ（Walsh）ら、ジャーナル・オブ
・インフェクシャス・ディシーズ（Journal of Inefcti
ous Diseases）,1198〜1204（1987）；ウエルツ（Wert
z）ら、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Journal of
Virology）,293〜301（1987）；エランゴ（Elango）
ら；およびオルムステッド・アール・エイ（Olmsted,R.
A.）、ピー・エヌ・エイ・エス・ユー・エス・エイ83:2
46〜250（1986）。
各ケースにおいて、感染に拮抗する保護を付与する能
力を有するワクチンを得ようとする試みは、患者が暴露
され、結果的にその後の感染に対する免疫応答に基づく
抗体を開発する抗原性標的を提供することを包含する。
その免疫系は、HRSVのような細菌またはウイルス感染に
伴うウイルス等を包含する「外来性侵入物」を認識し、
排除するように機能する。リンパ球が該免疫系の構成要
因である。これらの細胞はＢ−リンパ球（Ｂ−細胞）ま
たはＴ−リンパ球（Ｔ−細胞）に分類することができ
る。Ｂ−細胞およびある種のＴ−細胞は、抗体、すなわ
ち、侵入感染物質により提示される特異的パターンを認
識し、それに結合する分子の生成に関与している。抗体
によって認識される特異的パターンは、エピトープ、抗
原決定基または抗原部位と称される。エピトープを示す
分子を抗原と称する。エピトープは、典型的には、蛋白
質分子の表面に見られる折りたたみ鎖の部分である。Ｂ
−細胞およびその後代細胞が抗体を分泌しうる。Ｔ−細
胞は抗体を分泌しないが、それにもかかわらずエピトー
プを認識する。
抗原が誘発しうる１つの活性はＴ−細胞の増殖であ
る。個別のエピトープに暴露されると、そのエピトープ
に対して特異的なＴ−細胞は、刺激されていないＴ−細
胞よりも高速で複製するであろう。増殖Ｔ−細胞はその
エピトープに対して特異的であり、該エピトープに対す
る免疫応答において機能する。すなわち、個々のＴ−細
胞がエピトープに対する免疫原性応答にていかなる役割
を果たしている場合であっても、このような応答は、増
殖、すなわち、そのＴ−細胞の複製を引き起こす抗原に
暴露されることにより強化される。
Ｔ−細胞にはいくつかの異なった種類がある。あるＴ
−細胞はＢ−細胞活性を抑制する。他のＴ−細胞、ヘル
パーＴ−細胞は、Ｂ−細胞が刺激されるようになること
を補助する。増殖応答を示すヘルパーＴ−細胞は、ヘル
パーＴ−細胞を刺激するのと同一または類似のエピトー
プに対する抗体を産生するようにＢ−細胞を刺激するで
あろう。キラーまたは細胞毒性Ｔ−細胞（CTL）は、感
染に対する防御に基づく抗体に関与しない。それよりも
むしろ、CTLは癌細胞、移植組織またはウイルスに感染
した細胞のような他の細胞を認識し、攻撃して殺すもの
である。免疫応答を制御する分子機構は十分には理解さ
れておらず、ペプチドエピトープが免疫応答を誘導する
過程について解明すべきことが多くある。
ある種の蛋白質がヘルパーＴ−細胞活性を刺激するこ
とを証明するいくつかの研究が報告されている。オペン
ショウ・ピー・ジェイ（Openshaw,P.J.）らは、ジャー
ナル・オブ・ジェネラル・バイオロロジー（J.Gen.Viro
l.）69:305〜312（1988）において、ヘルパーＴ−細胞
のHRSVに対する蛋白質特異性を開示している。HRSVの融
合蛋白質がHRSVのＧ糖蛋白質よりも強いヘルパーＴ−細
胞応答を誘発することが判明した。
本発明はペプチド断片に関するものであり、それがHR
SV感染からヒトを保護するための改良手段を提供する。
本発明のペプチド断片に暴露されたヒトは、Ｔ−細胞活
性を刺激することによりHRSV感染から保護される。ウイ
ルス攻撃が生じた場合、刺激されたＴ−細胞活性によっ
て与えられる保護は体液性保護よりも早く活性化され
る。加えて、刺激されたCTL活性由来の保護は体液性保
護よりも長く続く。
本発明はHRSV感染に対する保護を付与しうるワクチン
において有用なペプチドを提供するものである。本発明
のペプチドは、HRSVからのＦ糖蛋白質のアミノ酸残基32
8〜355とその断片から誘導される。本発明に係るペプチ
ドからなるワクチンは、HRSV感染に対する免疫学的応答
にて活性なＴ−細胞の増殖を刺激する。
情報開示 PCT特許出願PCT/US86/02756は、Ｆ糖蛋白質を含む天
然構造ウイルス蛋白質からなる、HRSV感染に対する耐性
を付与するワクチンを開示している。さらに、ウイルス
蛋白質をコードするDNAの組換え発現によるその産生が
開示されている。その蛋白質を精製してワクチンに処方
する。
PCT特許出願PCT/US88/03784は、HRSVに対するウイル
ス特異的免疫応答を生成するのに有用である、新規なキ
メラ糖蛋白質をコードするDNA組成物を開示している。
その記載されているキメラ糖蛋白質は、HRSVのＦおよび
Ｇ糖蛋白質の両方の部分の組み合わせである。その産生
されたキメラ糖蛋白質はHRSV感染に対する耐性を付与す
るワクチンを製造するのに有用である。
PCT特許出願PCT/US88/03623は、HRSVの1A蛋白質の残
基45〜64由来のペプチドを開示している。該ペプチドは
ヒトおよびウシHRSV感染に対するワクチンとして有用で
ある。該ペプチドはヘルパーＴ−細胞機能を刺激し、そ
れにより抗体応答が強化される。その開示されているペ
プチドはワクチンとして送達される。
オペンショウ・ピー・ジェイ（Openshoaw,P.J.）ら
は、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）64
（４）:1683〜1689,1990年４月において、ポリクローナ
ルCTLを培養するに、標的細胞を感染させるのに用いたH
RSV22−Ｋ（Vac22K）蛋白質含有の組換えワクシニアウ
イルスを開示している。そのデータは、HRSV感染によっ
て初回抗原刺激を受けたＨ−2dマウスのHRSV特異的CTL
による主要標的抗原として22−Ｋ蛋白質を示唆してい
る。Vac22Kを用いてマウスを接種すると、HRSVに対する
最小限のCTL活性が誘発された。
ニコラス・ジェイ（Nicholas,J.）らは、ジャーナル
・オブ・バイロロジー（J.Virol.）64（９）:4232〜424
1,1990年９月において、マウスHRSV特異的CTLが主要CTL
抗原としてのHRSV22K蛋白質を認識することを開示して
いる。
オルムステッド・アール・エイ（Olmsted,R.A.）ら
は、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ス
テート・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）8
3:7462〜7466,1986において、ワクシニアウイルスプロ
モーターの制御下、構築され、ワクシニアウイルスのチ
ミジン・キナーゼ遺伝子に挿入される融合糖蛋白質
（Ｆ）ウイルスの配列をコードするmRNAを表すcDNAクロ
ーンを開示している。得られた組換えワクシニアウイル
ス、ワクシニアＦは、細胞培養中、Ｆ糖蛋白質のF1およ
びF2分裂産生物を発現した。F1およびF2はその真正なHR
SV対照物と区別できなかった。ワクシニアＦに皮内感染
したコトンラットはHRSVの感染力を中和する血清Ｆ−特
異的抗体を高力価で発達させた。
ワルシュ（Walsh）らは、ジャーナル・オブ・インフ
ェクシャス・ディーシーズ（J.Infect.Dis.）,155:1198
〜1204,1987において、HRSVの精製された吸着蛋白質
（Ｇ）または融合蛋白質（Ｆ）で免疫処置した動物が、
HRSVによる攻撃に対して、鼻耐性は部分的にすぎない
が、完全な肺耐性を発達させたことを開示している。該
ウイルス糖蛋白質を精製し、動物に腹腔内的に導入し
た。
ウェルツ（Wertz）らは、ジャーナル・オブ・バイロ
ロジー（J.Viirol.）61:293−301,1987において、HRSV
の融合（Ｆ）蛋白質遺伝子の全長cDNAコピーを含有す
る、構築されたワクシニアウイルス組換え体を開示して
いる。ウサギをＦ発現の組換えベクターで接種し、HRSV
F蛋白質に特異的な抗血清の産生を得た。この抗血清は
ウイルス感染力を中和し、HRSV感染細胞における融合を
予防する能力を有した。
バンガム，シー・アール・エムおよびアスコナス，ビ
ー・エイ（Bangham,C.R.M.およびAskonas,B.A.）は、ジ
ャーナル・オブ・ジェネラル・バイオロロジー（J.gen.
Virol）67:623−629,1986で、マウス中のHRSVに対して
産生されたCTLが他の免疫化ウイルス菌株に対して特異
的であるかまたはウイルス菌株の間で交差反応性である
と開示している。
ペンベルトン，アール・エム（pemberton,R.M.）ら
は、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイオロロジー
（J.gen.Virol）68:2177−2182,1987において、HRSV蛋
白質に対するCTL特異性の点でＦ蛋白質が重要なＴ抗原
であると開示している。
発明の要約 本発明は、HRSVによる感染からの保護を提供するの
に、HRSV F糖蛋白質の断片を使用することに関する。加
えて、本発明は、免疫学的に活性なＦ糖蛋白質の断片の
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供する
ものである。本発明は、Ｆ糖蛋白質の免疫原性断片を用
いてHRSV感染に対する保護を付与する方法に関する。
発明の詳細な記載 本発明は、HRSVのＦ糖蛋白質のアミノ酸残基328〜355
およびその断片に由来するアミノ酸配列を有するペプチ
ドを提供する。本明細書中で用いる場合、「Ffrag」
は、（328−355）のGlu−Gly−Ser−Asn−Ile−Cys−Le
u−Thr−Arg−Thr−Asp−Arg−Gly−Trp−Tyr−Cys−As
p−Asn−Ala−Gly−Ser−Val−Ser−Phe−Phe−Pro−Gl
n−Ala;のアミノ酸配列を有するペプチドおよびその断
片をいう。Ffragはペプチド合成法または組換えDNA法を
用いて製造することができる。HRSV感染に対する保護を
付与するにおいて効果的なワクチンは、当該分野におけ
る当業者であれば、Ffragを用いて製造することができ
る。
Ffragが保護を付与する機構は、Ｔ−細胞の増殖応答
の刺激を介している。したがって、Ffragと接触したＴ
−細胞は刺激されて複製する。かくして、その後代は、
より多数を利用してFfragエピトープを認識してそれに
応答できる。FfragエピトープはHRSVのＦ糖蛋白質に見
られる。したがって、Ffragによって刺激されたＴ−細
胞活性はHRSV攻撃に応答するのに有用であり、それによ
りHRSV感染に対する保護が得られる。
FfragによるＴ−細胞活性の刺激は、HRSVやFfragを含
めたＦ糖蛋白質の断片への暴露に対するＴ−細胞応答を
研究することにより証明される。HRSVで再刺激すること
で、８人の正常な成人ドナー由来のヒトＴ−細胞の応答
を評価した。応答性レベルはドナー間で変化したが、８
個人のうち７人はHRSVでの再刺激に対して有意なＴ−細
胞増殖応答を示した。
HRSVのＦ糖蛋白質の細胞外および細胞質ドメインにわ
たる一連の重複切形ペプチドの使用を介して、残基328
−355の範囲内に見られる、１の免疫優性形質のＴ−細
胞刺激エピトープを同定した。モノクローナル抗体（MA
b）遮断実験は、DR2が３個人にて免疫優性形質のFfrag
エピトープを提示するMHCクラスII制限因子であること
を明らかにした。本発明は、ヒトにおける天然HRSV感染
後のMHCクラスII DR2決定基によって示されるＦ糖蛋白
質上に位置する免疫優性形質のＴ−細胞エピトープに合
わせて設計されたペプチドに関する。
一連の第１の実験は、HRSVでの再刺激後の、ヒト細胞
のＴ−細胞増殖応答を評価した。このデータを用い、高
度レスポンダー（high responder）および中程度レスポ
ンダー（intermediate responder）のドナーを同定し
た。一連の第２の実験においては、その同定したレスポ
ンダーの一連のペプチドによる再刺激を用い、Ｆ糖蛋白
質の免疫優性形質のエピトープを同定した。
末梢血液単核細胞（PBMC）を、ロイカフェレーシス
（leukapheresis）を介し、１年を通じて８人の正常な
成人ドナーから得て、フィコール（ficoll）（ニュージ
ャージー州、ピスカタウェイ、ファーマシア（Pharmaci
a））上で精製し、採取し、使用まで10％DMSO/液体窒素
中にて凍結貯蔵した。パネル実験のすべてのドナーは、
その生涯の間にHRSVで数回天然感染した経験があると仮
定した。最近のHRSV感染が１個人にて確認され、その個
人からPBMCドネーションの２、３カ月前の入院の間にHR
SVを単離した。各ドナーからのPBMCをイン・ビトロにて
HRSVで再刺激し、得られた増殖応答を、培養を培地単独
で再刺激した場合に得られる応答と比較した。HRSV（A2
菌株）を、４％胎児ウシ血清（FBS、ニューヨーク州、
グランド・アイランド、ギブコ（Gibco））含有のイー
グルMEM（Eagle's MEM）（メリーランド州、ウォーカー
ズビル、ホワイタッカー・バイオプロダクツ（Whittake
r Bioproducts）中のHEp2細胞にて増殖させ、３％FBS含
有の５％アガロース下のプラーク検定により力価測定し
た。イン・ビトロにおける再刺激の場合、PBMCを最終濃
度10％のヒトAB血清（ペンシルベニア州（PA）、デンバ
ー（Denver）、ハズレトン（hazleton））含有のMLR培
地中、マイクロタイターにて１ウェルに付き４×105細
胞で培養した。各ウェルにHRSウイルス希釈物含有の等
容量の培地を加えた。0.1〜1.0ウイルス粒子／細胞の感
染多重度でウイルスを加えた。培養を５日間インキュベ
ートし、ついで細胞を１μg/ウェルの3H−チミジン（カ
リフォルニア州、アーヴィン、ICNファーマシューティ
カルズ（ICN Pharmaceuticals））で６時間パルス標識
化した。ついで、細胞を収集し、Ｔ−細胞応答をCPM3H
−チミジン取り込みとして表すか、または刺激指数（S
I）＋／−標準偏差として算定した；ここでSIは抗原の
存在下における平均cpm/培地単独の存在下における平均
cpmを意味する。チミジン取り込みの測定は、細胞複製
の標準的測定法であるDNA産生の相対的定量を可能とす
る。
HRSVでの再刺激に対するPBMC応答はドナー間で変化
し、３つのカテゴリー：高度レスポンダー（３）、中程
度レスポンダー（５）および１の低度レスポンダー（lo
w responder）に分けられる。HRSVの特異的増殖応答は
Ｔ−細胞の刺激と一致する。かくして、抗原またはその
個々のエピトープのいずれかでの再刺激に対して応答す
る細胞の母集団を、以下、Ｔ−細胞という。本明細書に
示すデータは、HRSVが健康な成人ドナーから得られる一
団のヒト末梢血液Ｔリンパ球の増殖を刺激したことを示
す。
次に示す一連の実験は、Ｆ糖蛋白質上のいずれのエピ
トープが応答するＴ−細胞により認識され、Ｔ−細胞の
細胞増殖を刺激するのかを測定するように設計した。Ｆ
糖蛋白質の一連の52個の重複ペプチドを合成して精製し
た。切形ペプチドの各々は、Ffrag（xxx−yyy）と称さ
れるFfragの断片であり、ここで（xxx−yyy）はそのペ
プチドの最初と最後の残基をいう。ペプチドは、0.1ミ
リモルのスケールで、ABI（アプライド・バイオシステ
ムズ・インコーポレイティッド）（Applied Biosystems
Inc.）のSmall Scale Rapid cycles（SSRC）を用いるA
BI430Aペプチド・シンセサイザー上での固相法により合
成した。SSRCは、標準的Boc化学での省略された単一の
カップリングサイクルを用いる。用いるｔ−Boc−Ｌ−
アミノ酸（１ミリモル）は標準的側鎖保護基を有してお
り、ABIより入手した。完成したペプチドを、側鎖保護
基と同時に、ペプチドのアミノ酸配列に依存する適当な
カチオン性スカベンジャー（10％v/vアニソール、ｐ−
クレゾール＋ｐ−チオクレゾール、1,4−ブタンジチオ
ール＋アニソールまたはDMS＋アニソール）を用いる標
準HF操作により、支持PAM（フェニルアセトアミドメチ
ル）樹脂より取り外した。
HF切断後、粗ペプチドを、各相が0.1％TFA含有の水−
アセトニトリル勾配を用いるフェノメネックス（Phenom
enex）製Ｃ−18カラム（250×22.5mm）上の分取用逆相
クロマトグラフィーにより精製した。精製フラクション
（分析HPLCにより測定）をプールし、アセトニトリルを
蒸発させ、水溶液を凍結乾燥させた。すべての化合物を
高速原子衝撃マススペクトル法により分析し、予想され
る（Ｍ＋Ｈ）＋を得た。
最初の一連の実験におけるように、PBMCをロイカフェ
レーシス（leukapheresis）を介して正常な成人ドナー
から得て、フィコール（ficoll）（ニュージャージー
州、ピスカタウェイ、ファーマシア（Pharmacia））上
で精製し、採取し、使用まで10％DMSO/液体窒素中にて
凍結貯蔵した。これらの研究では、２つの代表的なドナ
ーである、中程度レスポンダーおよび高度レスポンダー
を選択した。イン・ビトロにおけるペプチドでの再刺激
では、PBMCを、最終濃度10％のヒトAB血清（ペンシルベ
ニア州、デンバー、ハズレトン（Hazleton））含有のML
R培地中、マイクロタイターにて４×105細胞／ウェルで
培養した。各ウェルに等容量の適当な合成ペプチドまた
はHRSV希釈物含有の培地を加えた。HRSVを0.1〜10ウイ
ルス粒子／細胞の感染多重度で加えた。ペプチドを0.01
〜100μg/mlの濃度で培地に加えた。各ウェルにこの培
地0.2mlを加えた。培養を５日間インキュベートし、つ
いで細胞を１μg/ウェルの3H−チミジン（カリフォルニ
ア州、アーヴィン、ICNファーマシューティカルズ（ICN
Pharmaceuticals））で６時間パルス標識化した。つい
で、細胞を収集し、Ｔ−細胞応答をCPM3H−チミジン取
り込みとして表すか、または刺激指数（SI）＋／−標準
偏差として算定した；ここで、SIは抗原の存在下におけ
る平均cpm/培地単独の存在下における平均cpmを意味す
る。
中程度レスポンスドナー（intermediate response do
nor）からのＴ−細胞を、完全な一連の切形Ｆペプチド
で再刺激した。１のペプチドのFfrag(338-355)だけが、
有意で再現可能なこのドナーＴ−細胞の再刺激を誘発し
た。高度レスポンスドナーからのＴ−細胞は、一貫し
て、Ffrag(328-342)またはFfrag(338-355)での再刺激に
対して応答した。最も驚くべきことに、両ドナーからの
Ｔ−細胞は、Ffrag(338-355)での再刺激に対して強く応
答した。そこで、この応答をさらに特徴付けるために、
以下のMAb遮断研究を行った。
単一形のヒトクラスII組織適合決定基、ヒトCD4およ
び胸腺細胞CD1抗原の各々に対して特異性を有する精製
されたMAbs抗−HLA−DR、Leu3aおよびLeu6を、カリフォ
ルニア州、マウンテン・ビュー、ベクトン・ディッキン
ソン（Becton Dickinson）から購入した。すべての抗体
を1000倍容量のPBSに対して透析し、ナトリウムアジド
を除去した。遮断研究では、最終濃度0.51g/mlの精製さ
れたMAbが、ペプチド再刺激の初期での増殖検定中に含
まれる。結果を以下のようにペプチド誘発増殖の％抑制
として表す： ２つのドナーのHLA特性の比較は、両者が共にDR2およ
びDQw1 MHCクラスII決定基を有することを明らかにし
た。両ドナーからのＴ−細胞を、DRMHCクラスII決定
基、CD4または胸腺細胞CD1抗原に対して指向された精製
MAbの存在下でFfrag(338-355)で再刺激し、Ffrag
(338-355)がDR2またはDQw1と組み合わせて提示されてい
るかどうかを測定した。後者のCD1に対するMAbを非特異
的遮断対照として供した。中程度レスポンスドナーから
のＴ−細胞におけるFfrag(338-355)誘発の増殖を抑制す
るこれらMAbの能力が明らかにされた。抗−DR抗体がFfr
ag(338-355)誘発増殖を有意に遮断し、抗−CD4抗体もま
たFfrag(338-355)誘発増殖を適度に遮断するという結果
が示された。抗−CD1では、わずかな遮断効果が高ペプ
チド濃度で認められたが、低ペプチド濃度では遮断は全
く観察されなかった。同様に、高度レスポンスドナーか
らのＴ−細胞をFfrag−(338-355)で再刺激すると、ペプ
チド特異的増殖は抗−DRまたは抗−CD4抗体のいずれに
よっても効果的に遮断された。これらのデータはFfrag
(338-355)がこれらの２個人にてDR2決定基と一緒に提示
されることを示唆しており、応答細胞集団がCD4+T−細
胞からなることを確認した。さらなる研究にて、Ffrag
(328-342)による高度レスポンスドナーＴ−細胞のペプ
チド誘発増殖がまた抗−DRまたは抗−CD4抗体によって
効果的に遮断されることが証明された。第３のドナー由
来のPBMCを用いる実験は、高度レスポンスドナーで行わ
れた実験の結果を確認した。第３のドナーはFfrag
(328-342)およびFfrag(338-355)に暴露されると刺激さ
れたＴ−細胞増殖活性を示した。
かくして、Ｆ糖蛋白質の細胞外および細胞質ドメイン
にわたる一連の重複ペプチドを用い、HRSVに対する高度
レスポンダーおよび中程度レスポンダーにおけるＴ−細
胞刺激エピトープをマップした。両ドナーからのＴ−細
胞は、残基338〜355にわたるペプチドの存在下、強く刺
激されて増殖した。加えて、残基328〜342にわたるペプ
チドは高度レスポンスドナーからのＴ−細胞を刺激し
た。これら２人のドナー由来のEBV形質転換Ｂリンパ芽
球の組織分類は、それらがクラスII MHC遺伝子複合体の
２つの対立遺伝子、DR2およびDQw1を共に有しており、
そのいずれも338〜355のペプチドの提示に関与しうるこ
とを明らかにした。非−多形性DR決定基に対して指向さ
れたモノクローナル抗体は両ドナーにおけるこのペプチ
ドに対する増殖応答を遮断し、これはDR2が抗原提示因
子であると示唆している。これらのデータは、残基328
〜355にわたるペプチドが、DR2を発現するヒトではＦ糖
蛋白質の主要な免疫優性形質のＴ−細胞エピトープの全
部または一部を含むことを示している。
本発明は、HRSV F糖蛋白質の328〜355残基に従って設
計されたアミノ酸配列またはそのサブユニットを有する
ペプチドおよびそのようなペプチドからなるワクチンを
提供するものである。本発明に係るペプチドは、以下
の： さらには、本発明は前記のペプチドからなるワクチンを
包含する。加えて、本発明は前記のペプチドからなるワ
クチンを投与することを特徴とするHRSVに対してヒトを
免疫処置する方法を包含する。本発明に係る方法におい
ては、該ワクチンを鼻腔内、筋肉内、皮下内または舌下
的に、患者の体重1kgに付き0.015μｇ〜0.15mgの範囲に
及ぶ用量にて投与することができる。
意図する均等物はこのようなアミノ酸配列からなり、
前記のペプチドにより付与されるようなＴ−細胞増殖応
答を提供する機能を有する、より大型のペプチド、ポリ
ペプチドおよび蛋白質を包含する。さらには、意図する
均等物は、同様のＴ−細胞増殖応答を提供する機能を有
し、Ffragペプチドに従って設計され、アミノ酸挿入お
よび／または欠失および／または保存的置換を有するア
ミノ酸ペプチドからなる同様の大きさのペプチド、より
大型のペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質を包含す
る。
実施例１ Ffrag(328-355)の生成 Ffrag(328-355)ペプチドは、Glu−Gly−Ser−Asn−Il
e−Cys−Leu−Thr−Arg−Thr−Asp−Arg−Gly−Trp−Ty
r−Cys−Asp−Asn−Ala−Gly−Ser−Val−Ser−Phe−Ph
e−Pro−Gln−Alaのアミノ酸配列からなる。ワクチン使
用のペプチドを製造するのに、該ペプチドを0.1ミリモ
ルの規模にて、ABI（アプライド・バイオシステムズ・
インコーポレイティッド（Applied Biosystems Inc.）
のSmall Scale Rapid Cycles（SSRC）を用いるABI430A
ペプチドシンセサイザー上での固相法により合成した。
SSRCは標準的Boc化学での省略された単一カップリング
サイクルを用いる。用いるｔ−Boc−Ｌ−アミノ酸（１
ミリモル）は、標準的な側鎖保護基を有しておりABIよ
り入手した。完成したペプチドを、側鎖保護基と同時
に、該ペプチドのアミノ酸配列に依存する適当なカチオ
ン性スカベンジャー（10％v/vアニソール、ｐ−クレゾ
ール＋ｐ−チオクレゾール、1,4−ブタンジチオール＋
アニソールまたはDMS＋アニソール）を用いる標準的HF
操作により、支持PAM（フェニルアセトアミドメチル）
樹脂から取り外した。
HF切断後、粗ペプチドを、各相が0.1％TFAを含有する
水−アセトニトリル勾配を用いるフェノメネックス（Ph
enomenex）製Ｃ−18カラム（250×22.5mm）上の分取用
逆相クロマトグラフィーにより精製した。純粋なフラク
ション（分析HPLCにより測定）をプールし、アセトニト
リルを蒸発させ、水溶液を凍結乾燥させた。そのペプチ
ドを高速原子衝撃質量分光学法により分析し、得られた
（Ｍ＋Ｈ）＋を予想した（Ｍ＋Ｈ）＋と比較した。
実施例２ 他のFfragペプチドの生成 本明細書の発明の詳細な記載部に列挙した他のFfrag
ペプチドはいずれも、当業者であれば実施例１の開示に
従って生成して精製することができる。
実施例３ Ffrag（328−355）からなるワクチン Ffrag(328-355)ペプチドは周知操作によりワクチン投
与形にて製造することができる。該ワクチンは舌下的、
筋肉内、皮下内または鼻腔内に投与することかできる。
筋肉内注射のような非経口投与の場合、その免疫原は適
当な担体と組み合わされていてもよく、例えば、該免疫
原は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸
アルミニウムカリウムミョウバン、硫酸ベリリウム、シ
リカ、カオリン、炭素、油中水型エマルジョン、ムラミ
ルジペプチド、細菌性内毒素、リピドＸ、コリネバクテ
リウム・パルバム（Corynebacterium parvum）（プロピ
オノバクテリウム・アクネス（Propionobacterium acne
s））、ボルデテラ・ペルタスシス（Bordetella pertus
sis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウ
ム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、
リポソーム、レバミソール、DEAE−デキストラン、遮断
コポリマーまたは他の合成アジュバントのような種々の
アジュバントまたは免疫調節剤と共にまたはそれなし
で、水、生理食塩水または緩衝ビヒクル中にて投与する
ことができる。このようなアジュバントは種々の供給源
から商業上入手可能である；例えば、メルク・アジュバ
ント65（Merck Adjuvant65）（メルク・アンド・カンパ
ニー，インコーポレイテッド（Merck and company,In
c.），ラーウエイ（Rahway）、ニュージャージー州）。
免疫原とアジュバントの比率は、両者が有効量にて存
在する限り、広範にわたって変化させることができる。
例えば、水酸化アルミニウムは、ワクチン混合物（Al2O
3主成分）の約0.5％の量にて存在しうる。１用量当た
り、免疫原濃度を約0.015μｇ〜約1.5mg/kg/患者の体重
の範囲とすることができる。好ましい用量範囲は患者の
体重1kgに付き約1.5μｇ〜約0.15mgである。ヒトにおけ
る適当な用量サイズは約0.1〜1ml、好ましくは約0.1ml
である。従って、例えば、筋肉内注射用の１回用量は、
0.5％水酸化アルミニウムを含む混合物中に免疫原を含
有する0.1mlからなる。
ワクチンはまた、他の疾患用の他のワクチンと組み合
わされ、多価ワクチンを製造してもよい。さらに、それ
を抗生物質のような他の医薬と組み合わせてもよい。
実施例４ Ffragペプチドからなるワクチン 本明細書の発明の詳細な記載部に列挙した他のFfrag
ペプチドはいずれも、当業者であれば実施例３の開示に
従ってワクチンを製造するのに用いることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/135 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： ［式中、R1は、 からなる群より選択され；および R2は、 からなる群より選択される］ で示されるペプチド。
  2. 【請求項２】R1がGlu−Gly−Ser−Asn−Ile−Cys−Leu
    −Thr−Arg−Thr−Aspである請求項１記載のペプチド。
  3. 【請求項３】式： で示される請求項２記載のペプチド。
  4. 【請求項４】式： で示される請求項２記載のペプチド。
  5. 【請求項５】式： で示される請求項１記載のペプチド。
  6. 【請求項６】請求項１ないし５いずれか１項記載のペプ
    チドを含むワクチン。
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