KR100550132B1 - 호흡 신시티아 바이러스의 부착 (지) 단백질에서 유도된펩티드 - Google Patents
호흡 신시티아 바이러스의 부착 (지) 단백질에서 유도된펩티드 Download PDFInfo
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Abstract
면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우, 차후 RSV를 척추동물에 감염시 높은 질환(예, 폐 호산구증다증과 같은 비전형적인 폐 염증)을 유도하지 않는 변형 RSV G 단백질 또는 이 부위에 관해 기재되고 있다. 특정 양태에서, 변형 G 단백질은 아미노산 184에서 아미노산 198 영역의 변형을 포함한다. 변형 RSV G 단백질을 포함하고, 임의로는 RSV F 단백질을 포함하는 면역원성 조성물 및 백신에 관해서도 기재되어있다.
변형 RSV G 단백질
Description
관련 출원
본 출원은 1997년 9월 19일자에 출원된 미국 가출원 60/059,684 및 1998년 5월 8일자에 출원된 미국 가출원 60/084,863의 이점을 청구하고 있으며, 이 둘 모두 본원에서 참조문헌으로 인용된다.
호흡 신시티아 바이러스(RSV), 파라믹소비리데 과의 (-) 가닥 바이러스는 특히 어린 아이 및 유아에게서, 하부 폐질환의 주된 원인이다. 백신으로서 포르말린-비활성 RSV(FI-RSV)의 비경구 투여는 차후 야생성 RSV에 감염되는 RSV-미경험 수용체(혈청 반응 음성)에서의 높은 질환과 연관된다. 높은 질환은 병에 걸린 환자의 말초 혈액과 폐 모두에서 호산구 비율의 증가가 특징적이다(Kim et al., Am. J. Epidemiol. 89:422-434 (1969); Kim et al., Pediatric Res. 10:75-78 (1976)). 설치류에서의 최근 연구는 FI-RSV가 T-헬퍼 2 (TH2) 면역 반응을 유도하지만, 약독화 바이러스 생백신이 T-헬퍼 1 (TH1) 반응과 우선적으로 연관이 있음을 지적하고 있다.
RSV는 두개의 두드러진 외피 글리코프로테인, 융합 (F) 단백질 및 부착 (G) 단백질을 함유하는데, 이들은 바이러스 감염도에 중요하며 RSV에 대한 서브유닛 백신의 디자인을 위한 적절한 표적으로 작용한다. F-단백질에 기초한 백신에 의해 RSV에 대한 중화 항체의 생성은 G 단백질을 포함시켜 굉장한 정도로 증가될 수 있음이 이미 알려져 있다(Hancock et al., J. Virol. 70:7783-7791 (1996)). 그러나, FI-RSV-유도된 높은 질환의 경우 분자 기초를 이해하는 시도에서, RSV의 네이티브 부착 (G) 글리코프로테인이 높은 생산 수준의 인터루킨-5-(IL-5), TH2 사이토킨과 연관된 폐 호산구증다증이 특징인 비전형적인 폐 염증을 프라이밍하기에 충분한 것으로 나타났다(Hancock et al., J. Virol. 70:7783-7791 (1996)). 실제로, IL-5의 생체내 제거는 RSV가 투여된 G 단백질-면역된 마우스의 기관지폐포 세척 세포에서 호산구성 반응을 상당한 정도로 감소시킨다. G 단백질에 대한 반응은 미경험된 수용체 마우스로 G 단백질-특이성 CD4+ T 세포주의 전달에 의해 매개된 T 세포가 차후 공격시 비전형적인 폐 염증 반응을 일으키는 것으로 나타났다(Alwan et al., J. Exp. Med. 179:81-89 (1994)).
발명의 요약
본원에 기재되듯이 네이티브 G 단백질 및, G 단백질의 아미노산 48에서 294에 이르는 일련의 중복 펩티드 (도 2에 도시)에 의해 일어난 면역 반응이 특징적이다. G 단백질-백신접종된 마우스의 비장세포 자극 분석에서, 일 펩티드(19, 스패닝 아미노산 184-198)는 비장 세포 증식을 자극하는 능력이 우세하다(도 3). 기타 G 단백질-유도된 펩티드에서 유사한 효과없이, 항원으로서 펩티드 19의 사용은 기존 수준의 15배 이상으로 비장 세포 증식을 자극한다. 펩티드 19는 사이토킨 방출을 수반하는 G 단백질의 주요 영역인 것으로 밝혀졌다. IFN-γ 및 IL-5 모두 G 단백질-백신접종된 BALB/c 마우스에서 유도된 비장세포의 배양물중에서 상등액을 유도시켜 검출된다 (도 4a 및 4b). 펩티드 19(RSV G 단백질의 아미노산 184-198)는 BALB/c 마우스에서 폐 호산구증다증을 특이적으로 유도한다. 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 접합된 펩티드 19로 백신접종된 마우스는 차후 살아있는 RSV 공격시 상당한 폐 호산구증다증(총 기관지폐포 세척 세포의 39.5%)을 보인다(도 5). 반면, KLH에 접합된 아미노산 208-222(펩티드 22)를 함유한 펩티드로 면역된 마우스는 최소한의 폐 호산구증다증(3.3%)을 나타낸다. 펩티드 19의 아미노산 서열에서 돌연변이는 마우스가 폐 호산구증다증에 걸리도록 하는 성향을 없애준다(도 6).
CD4+ 세포의 생체내 결핍은 펩티드 19 접합체로 백신접종된 마우스에서 폐 호산구증다증을 없애주지만, CD8+ 세포의 결핍은 무시할 정도의 효과를 가진다(도 8). 이들 데이터는 살아있는 RSV 공격에 대한 반응에서 RSV G 단백질의 펩티드 19와 폐 호산구증다증의 CD4+ T 세포-매개된 유도 사이의 연관성을 나타내는데, 이는 펩티드 19-특이성 CD4+ T 세포가 폐 호산구증다증의 원인제임을 나타낸다. 43 공여체로부터 인간 말초 혈액 세포를 분석함에 있어, 6는 RSV G 단백질에 대한 반응성을 나타내고, 3은 펩티드 19에 반응한다 (도 7). 이 데이터는 펩티드 19가 종종 관찰되는 기관지초염, 아토피성 체질 또는 천식에 이어 혈청 반응 음성 유아의 RSV 감염을 수반할 수 있음을 나타낸다(Welliver and Welliver, Pediatrics in Review 14:134-139 (1993)).
따라서, 본 발명은 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여될 경우, 차후 척추동물에 RSV의 감염시 높은 질환을 유도함이 없이 보호를 제공하는 RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정 양태에서, 높은 질환은 비전형적인 폐 염증, 특히 폐 호산구증다증이다. 일 양태에서, 변형은 RSV G 단백질의 아미노산 184에서 아미노산 198 사이의 영역에 존재한다. 대체 양태에서, 변형은 야생형 G 단백질에 비해 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드에 의해 IL-5 분비를 위한 프라이밍을 저해시킨다.
본 발명은 또한 RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것으로, 변형 단백질 또는 폴리펩티드는 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우, 차후 척추동물에 RSV의 감염시 높은 질환을 유도하지 않는다. 일 양태에서, 변형은 RSV G 단백질의 아미노산 184에서 아미노산 198 사이의 영역에 존재한다.
본 발명은 또한 조절 서열에 작동적으로 연결된 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 DNA 작제물을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명은 (a) 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우, 차후 척추동물에 RSV 투여시 높은 질환을 유도하지 않는 RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자; (b) RSV의 F 단백질 전부 또는 면역성 부위를 암호화하는 핵산 분자; 및 (c) F 및 변형 G 단백질 모두에 작동적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 키메라 DNA 작제물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 DNA 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포, 및 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투 여되는 경우, 차후 척추동물에 RSV 감염시 높은 질환을 유도하지 않는 RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 생성하고, 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드의 발현에 적당한 조건하에 본 발명의 재조합 숙주 세포를 유지하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입하고 척추동물에 투여하는 경우, 차후 척추동물로 RSV 감염시 높은 질환을 유도하지 않는 RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드, 및 RSV의 F 단백질 전부 또는 면역원성 부위를 포함하는 키메라 폴리펩티드의 생성방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 백신과 같은 약제 제조의 경우, 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이를 발현시키는 재조합 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 생리학적으로 허용가능한 매질 및, 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우, 차후 척추동물로 RSV 감염시 높은 질환을 유도하지 않는 RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특정 양태에서, 면역원성 조성물은 야생형 G 단백질을 포함하는 면역원성 조성물에 비해 IL-5 분비를 위한 프라이밍을 저해한다. 일 양태에서, 변형은 RSV G 단백질의 아미노산 184에서 아미노산 198 영역에 존재한다. 면역원성 조성물은 RSV F 단백질 전부 또는 일부를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 면역원성을 보유하고 있어, 백신에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우에, 차후 척추동물로 RSV 감염시 높은 질환을 유도함이 없이 보호를 제공하는 면역학적으로 효과적인 양의 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하 는 백신 조성물에 관한 것이다. 일 양태에서, 변형은 아미노산 184에서 아미노산 198 영역에 존재한다. 백신 조성물은 RSV F 단백질 전부 또는 일부의 면역학적으로 효과적인 양을 포함할 수도 있다. 특정 양태에서, 백신 조성물은 추가로 보조제를 포함한다.
본 발명은 추가로 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드가 면역원성을 보유하고 있어, 백신에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우, 차후 척추동물로의 RSV 감염시 높은 질환을 유도함이 없이 보호를 제공하는 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, RSV를 이용한 척추동물의 백신접종 및 차후 감염 후에 높은 질환의 유도를 저해하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 생리학적으로 허용가능한 비히클 및, RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유효량의 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것으로, 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 면역원성을 보유하고 있어, 백신으로 주입되고 척추동물로 투여되는 경우, 차후 척추동물로 RSV 감염시 높은 질환을 유도함이 없이 보호를 제공한다. 일 양태에서, 백신은 추가로 형질감염-촉진제를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로 형질감염-촉진제를 이용하여, 면역 반응을 유도하는데 효과적인 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 척추동물에 투여하는 단계를 포함하는 척추동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 여기서 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 면역원성을 보유하고 있어, 백신에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우에, 차후 척추동물로 RSV 감염시 높은 질환을 유도함이 없이 보호를 제공한다.
본 발명은 또한 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우, 차후 척추동물로 RSV 감염시 높은 질환을 유도하지 않는 면역학적으로 효과적인 양의 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, RSV로부터 척추동물을 면역화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 면역학적으로 효과적인 양의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 척추동물에 투여하는 단계를 포함하는 RSV에 대한 척추동물의 면역화 방법에 관한 것으로, 여기서 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우, 차후 척추동물로 RSV 감염시 높은 질환을 유도하지 않는다.
일 양태에서, 조성물은 추가로 면역학적으로 효과적인 양의 RSV F 단백질 전부 또는 일부, 또는 면역학적으로 효과적인 양의 RSV F 단백질 전부 또는 일부 각각을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 또다른 양태에서, 척추동물은 RSV 혈청 반응 음성 인간이다.
도 1a와 1b는 BAL에서 백혈구 자극의 동역학을 설명하는 그래프이다. BALB/c 마우스에 StimulonTM QS-21이 보충된 1 ㎍의 G 단백질 (20㎍/마우스), 네이티브 RSV A2(1 - 2 x 16 PFU), 또는 모의 HEp-2 세포 용해물로 백신접종한다. 2차 백신접종 2주 후에, 마우스에 RSV를 투여하고 이후 각 백신접종 그룹 중에서 대표적인 5을 3, 5, 7 및 10일째에 죽이고, BAL 세포를 분리한다. 도 1a는 트리판 블루 배제에 의해 수행된 총 백혈구 수를 나타낸다. 도 1b는 세포 염색 Diff-Quik를 이용하여 측정된 BAL에서 호산구%를 도시한다. 데이터는 표준 편차를 나타내는 오차 막대를 이용하여 5 마우스의 평균 수로 나타낸다.
도 2는 RSV의 G 단백질의 중복 영역에 대응되는 합성 펩티드 (서열 번호: 1-31) 표이다. 일련의 중복 펩티드는 Genosys Biotechnologies, Inc.(미국 텍사스 우드랜드)에서 합성되었다. 펩티드는 RSV A2 G 단백질의 아미노산 48(G 단백질의 두번째 해독 출발 코돈에 대응됨)에서 아미노산 294 영역에 이른다. 펩티드의 순도는 질량 분광법으로 측정된다. 동결건조된 펩티드는 멸균수에 2 mg/㎖의 농도로 용해되고 -20℃에 보관된다.
도 3은 G 단백질-유도된 펩티드를 지닌 BALB/c 마우스로부터 G 단백질-프라임된 비장세포의 자극을 설명하는 막대 그래프이다. 0 및 4 주째에 BALB/c 마우스에 StimulonTM QS-21이 보충된 1 ㎍ G 단백질을 백신 접종한다. 2차 백신 접종 후 2주째, 5 마우스로부터 비장세포를 분리하고, 풀링한 다음 4일간 항원의 존재하에 배양한다. 각 합성 펩티드는 50 ㎍/㎖의 농도로 공급된다. 네이티브 G 단백질을 0.5 및 2.5 ㎍/㎖의 농도로 첨가한다. 비장세포의 Concavalin A(ConA) 자극은 평균 94,746±8005 cpm이다. 대조구로서, 배양물은 배지 단독 (Med) 또는 CRM197 (CRM)로 자극된다. 데이터는 3가지 웰의 평균 (±SD)으로 표시된다. 이 실험은 5 가지의 독립 실험의 대표격이며, 각각은 정성적으로 유사한 결과를 보여준다.
도 4a 및 4b는 배양물 상등액에서 펩티드-유도된 사이토킨(IFN-γ 및 IL-5)의 분석을 보여주는 막대 그래프이다. 네이티브 G 단백질 및 StimulonTM QS-21로 백신 접종된 BALB/c 마우스의 비장세포는 도 3에서 설명했듯이 펩티드 항원과 함께 배양된다. 4일간 배양 후, 상등액 100 ㎕를 3가지 웰에서 풀링하고 차후 항원 포착 ELISA에 의해 IFN-γ(도 4a) 및 IL-5(도 4b)를 분석한다. 데이터는 2가지 사이토킨 분석의 평균 OD490으로 표시된다.
도 5는 BALB/c 마우스에서 펩티드 19에 의한 폐 호산구증다증의 특이한 유도를 도시한 막대 그래프이다. PBS 또는 KLH를 받아들인 대조 마우스와 비교된 G 단백질 또는 19-KLH 백신접종된 마우스의 경우 중요한 차이점(*)이 나타나 있다. 데이터는 유사한 결과가 얻어진 3가지 실험을 나타낸다.
도 6은 호산구 반응을 촉진하는 펩티드 19에서 T 세포 에피토프의 확인을 도시한 막대 그래프이다. BALB/c 마우스(5/그룹)에 0 및 4주째에 근육내로 20 ㎍ StimulonTM QS-21중의 네이티브 정제된 RSV G 단백질 1㎍; 250 ㎍ 펩티드 19-KLH; 250 ㎍ 펩티드 22-KLH; 250 ㎍ 변이체 펩티드 19-1-KLH 또는 250 ㎍ 변이체 펩티드 19-2-KLH를 백신접종하거나, 비내로 106 pfu를 함유한 살아있는 RSV 50 ㎕ 용적을 백신접종한다. 2차 백신 접종 후 2주째에, 마우스에 살아있는 RSV를 투여하고 7일 후에 BAL 분석에 의해 폐 호산구증다증을 정량한다. 데이터는 BAL에서 호산구의 평균% (±표준 편차)로 표시된다.
도 7은 G 단백질-유도된 펩티드에 대한 인간 PBMC의 증식 반응을 도시한 막대 그래프이다. RSV G 단백질에 대해 반응성을 보이는 43 공여체 중 6의 PBMC은 합성 펩티드 19 및 22의 존재하에 배양에 의한 증식을 위해 평가된다. 각 펩티드는 50 ㎍/㎖의 농도로 제공된다. 정제된 G 단백질은 3 ㎍/㎖의 농도로 첨가된다. 모든 공여체의 PBMC의 PHA 자극은 22,945에서 55,619 cpm 범위이다. PBMC를 배지 단독으로 배양하고 자극 지수를 계산한다. 데이터는 삼중 배양물에서 얻어진 평균 자극 지수로 표시된다.
도 8은 CD4 T 세포가 RSV G 단백질과 펩티드 19-KLH에 의해 유도된 호산구 반응을 매개함을 도시한 표이다. BALB/c 마우스(5/그룹)에 0 및 4주째에 근육내로 20 ㎍ StimulonTM QS-21중의 네이티브 정제된 RSV G 단백질 1㎍; StimulonTM QS-21이 보충된 18 ㎍ 펩티드 19를 함유한 250 ㎍ KLH를 백신접종하거나, 비내로 106 pfu를 함유한 살아있는 RSV 50 ㎕를 백신접종한다. T 세포 서브셋을 결핍시키기 위해, 최종 면역화 이후 14 및 20일째에 지시된 모노클로날 항체(또는 대조구로서 래트 Ig)를 각각 750 ㎍ 및 250 ㎍/마우스의 양으로 복막내 투여한다. 최종 백신접종 후 21일 째, 마우스에 살아있는 RSV를 투여하고 7일 후 BAL 분석에 의해 폐 호산구증다증을 정량한다. FACS 분석은 항-CD4 및 항-CD8 형광 항체를 이용하여 수행된다. 데이터는 BAL에서 호산구의 평균%(±표준 편차) 및 총 비장 림프구의 함수에 따른 CD4+에서 CD8+ 세포의 %로 표시된다. 주요 차이점(**)은 래트 Ig를 받아들여 유사하게 백신접종된 대조구와 비교되어 나타나 있다.
RSV G 단백질은 실질적으로 공격으로부터 BALB/c 마우스를 보호하기 위한 F 단백질의 능력을 증가시킨다(표). 이는 RSV에 대한 서브유닛 백신에 G 단백질이 포함됨을 암시한다. 그러나, G 단백질에 의한 폐 호산구증다증을 위한 프라이밍은 지속적이고도 광범위하여, 일반적으로 백신용으로는 부적절하다. 공격 후 백신접종된 마우스의 BAL중으로 백혈구 세포의 유입 동역학을 정량함에 있어, G 단백질이 백신접종된 마우스에서 7일째에 최대 세포 침투물(1.42 x 106 세포)이 일어남을 알 수 있다(도 1a). 호산구는 10일간에 걸쳐 G 단백질을 이용한 백신접종에 대한 반응으로 나타나며, 7일째에는 총 백혈구 세포의 최대 65%에 이른다(도 1b).
본 발명은 차후 RSV 감염시 폐 호산구증다증을 자극하지 않는 RSV G 단백질-유도된 단백질 및/또는 폴리펩티드의 합성에 관한 것이다. 상세히 말하면, 본원에 기재된 작업은 활성 면역화에 이용될 수 있는 다가 백신을 포함한 백신 제형에서 면역원으로 이용될 수 있는 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 및/또는 폴리펩티드 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 방법은 G 단백질 서열의 특정 영역에서 1 이상의 아미노산을 변형시켜, 비전형적인 폐 염증(예, 폐 호산구증다증) 또는 높은 RSV 질환 형태를 프라이밍함이 없이 면역원성인 RSV G 단백질에서 유도된 단백질 또는 폴리펩티드를 생성하는 것을 수반한다.
RSV G 단백질의 야생형 (네이티브) 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 당해 분야에 공지되어있다(Wertz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4075- 4079(1985); Satake et al., Nucl. Acids Res. 13(21): 7795-7810(1985)). 본원에서 사용된 "변형" 및 이의 유도체는 야생형 서열과는 다른 아미노산 서열, 및 야생형 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열을 암호화하는 뉴크레오티드 서열을 의미하는 것으로 한다. 변형은 1 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다.
예를 들어, 변형은 프레임 이동 돌연변이를 야기하는 단일 뉴클레오티드, 또는 1 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실; 1 이상의 암호화된 아미노산이 바뀌는 최소 하나의 뉴클레오티드 변화; 미성숙 종결 코돈을 생성시키는 최소 하나의 뉴클레오티드 변화; 뉴클레오티드에 의해 암호화된 1 이상의 아미노산이 결실되는 다수의 뉴클레오티드의 결실; 유전자의 암호 서열이 방해를 받는 1 또는 다수의 뉴클레오티드의 삽입; 유전자 전부 또는 일부 중복; 유전자 전부 또는 일부 전위; 또는 유전자 전부 또는 일부의 재배열일 수 있다. 한가지 이상의 이러한 돌연변이가 단일 유전자에 존재할 수 있다. 이러한 서열 변화는 유전자에 의해 암호화된 G 단백질에서 변형을 야기한다. 예를 들어, 변형이 프레임 이동 돌연변이인 경우, 프레임 이동은 암호화된 아미노산을 변형시키고/변형시키거나 미성숙 종결 코돈을 만들어, 끝잘린 단백질을 생성시킬 수 있다.
예를 들어, 변형(들)은 바람직하게는 네이티브 G 단백질의 삼차원 구조를 보존할 수 있다. 또한, G 단백질의 기능, 특히 면역원성에 필수적인 아미노산은 당해 분야에 알려진 방법으로 동정될 수 있다. 특히 유용한 방법은 보존된 아미노산의 동정, 자리-직접 돌연변이 및 알라닌-스캐닝 돌연변이(예를 들면, Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085(1989)), 결정화 및 핵 자기 공명을 포함한다. 이들 방법에 의해 생성된 변형 폴리펩티드는 면역원성, 폐 호산구증다증 감소 및 항원성을 포함한 특정 생물 활성을 위해 시험될 수 있다.
상세히 말하면, 적절한 아미노산 변형은 소수성, 염기성 또는 산성, 전하, 극성, 크기, 작용 그룹(예, -SH 또는 글리코실화 부위)의 존재 또는 부재, 및 방향성을 포함한 다수의 기준을 기초로 이루어질 수 있다. 상기 성질에 기초한 유사 그룹으로 각종 아미노산의 할당은 숙련인이 쉽게 알 수 있을 것이고; 추가로 적절한 아미노산 변화도 Bowie et al(Science 247:1306-1310(1990))에서 발견될 수 있다.
예를 들어, 아미노산 184-198 영역의 경우, 변형은 보호 면역 반응과 연관된 G 단백질 영역의 속성을 보유하고 있지만 폐 호산구증다증(즉, 생물학적 등가물)의 자극과 연관된 에피토프를 삭제하거나 개질하는 영역 184-198(아미노산 서열 AICKRIPNKKPGKKT; 서열번호:19)의 보존(예, 글라이신 → 알라닌; 발린 → 이소루신; 아스파라진 → 글루타민) 자리-직접 돌연변이 형태를 취할 수 있다. 변형은 또한 호산구증다증의 유해한 자극을 줄이거나 없애는 비-보존성 돌연변이(예, 라이신 → 트레오닌; 알라닌 → 프롤린) 형태를 취할 수도 있다. 변형은 또한 남은 RSV G 단백질 유도 부위를 연속 사용하여, 영역 184-198 의 완전한 결실 또는 이의 부분 결실 형태를 취할 수도 있다. 결실은 최적 해독 및/또는 면역원성을 위해 남은 G 단백질 또는 폴리펩티드의 공간성을 보유하는 링커 영역에 의해 대체될 수 있다. 변형은 파아지(예, M13)를 수반한 자리-직접 돌연변이 또는 합성 올리고뉴클 레오티드와 연관된 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술의 사용과 같은 표준 돌연변이 또는 돌연변이 공정을 이용하여 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명은 RSV의 변형 G 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것으로, RSV의 변형 G 단백질, 또는 이의 일부는 면역원성을 보유한다. 본원에서 사용된 용어 "변형 G 단백질"은 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신중에 주입되고 척추동물에 투여될 경우, 차후 RSV 감염시 높은 질환(예, 폐 호산구증다증과 같은 비전형적인 폐 염증)을 유도하지 않는 RSV G 단백질(또는 이의 일부)을 의미한다. 특정 양태에서, 변형 G 단백질은 아미노산 184에서 아미노산 198 영역의 변형을 포함한다.
본 발명이 아미노산 184-198을 포함한 RSV G 단백질 영역과 관련지어 상세히 설명되고 있지만, 184-198 영역을 동정하기 위해 사용된 본원에 기재된 방법은 변형된 추가 영역을 동정하기 위해 야생형 G 단백질의 추가 영역에 적용될 수 있는 것으로 해석한다. 예를 들어, 연구된 아미노산 영역(48-294)의 상류(아미노-말단쪽) 및 하류(카복시-말단쪽) 영역은 변형이 유리한 효과를 생성하는 추가 도메인을 위해 분석될 수 있다. 달리, 48-294의 아미노산 영역은 변형이 유리한 기타 도메인을 동정하기 위해 상이한 중복을 지닌 펩티드가 재분석될 수 있다.
적절한 본 발명의 핵산 분자는 RNA, 예를 들면 mRNA, 또는 DNA, 예를 들면 cDNA 및 게놈 DNA일 수 있다. DNA 분자는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있고; 일본쇄 RNA 또는 DNA는 암호화, 또는 센스 가닥 또는 비-암호화, 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 적어도 약 14개 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게 는 최소 약 50개 뉴클레오티드, 더욱더 바람직하게는 최소 약 200개 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 단지 최소한의 변형 G 단백질의 아미노산 서열단편을 암호화하는 것일 수 있고; 달리, 뉴클레오티드 서열은 인트론과 비-암호 3' 및 5' 서열(예를 들어 조절 서열 포함)과 같은 추가 비-암호 서열과 함께 변형 G 단백질 아미노산 암호 서열의 최소한의 단편을 포함할 수 있다. 추가로, 뉴클레오티드 서열은 마커 서열, 예를 들면, 폴리펩티드의 분리 또는 정제를 돕는 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 융합될 수 있다. 이러한 서열은 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질을 암호화 하는 서열, 및 인플루엔자로부터 헤마글루티닌 A (HA) 펩티드 마커를 암호화하는 서열을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "뉴클레오티드 서열"은 화학적 또는 재조합 수단에 의해 합성된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 벡터에 함유된 재조합 DNA는 본 발명에 포함된다. 또한, 뉴클레오티드 서열은 이종 숙주 세포에서 재조합 DNA 분자, 및 용액에서 부분 또는 상당한 정도로 정제된 DNA를 포함한다. 본 발명의 DNA 분자의 생체내 및 시험관내 RNA 전사체도 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 포함된다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 예를 들면, 암호화된 변형 G 단백질의 제조에 유용하다.
본 발명은 또한 변형 G 단백질의 일부, 유사체 또는 유도체(단, 일부, 유사체 또는 유도체는 변형 G 단백질을 포함해야 함)를 암호화하는 것과 같은, 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 변이를 포함한다. 이러한 변이는 대립 유전자 변형의 경우와 같이 뉴클레오티드 서열의 비변형 부위에서 자연스레-발생된 변이, 또는 각종 돌연변이체 및 돌연변이 공정에 의해 유도된 것과 같은 인위-발생된 변이일 수 있 다. 의도된 변이는 첨가 및 결실을 포함하는 보존 또는 비보존 아미노산 변화를 야기할 수 있는 1 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실 및 치환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 기재된 본 발명은 앞서 기재된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 용어 "단편"은 길이가 최소 약 14 인접 뉴클레오티드에서 최소 약 50 인접 뉴클레오티드인 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 것으로 하며, 단 이러한 단편은 변형 G 폴리펩티드를 암호화하고; 이러한 단편은 프라이머로 유용해야 한다. 특히 바람직한 프라이머 및 탐침은 본원에 기재된 변형 G 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 선택적으로 하이브리드화된다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형 G 단백질의 항원성 부위를 암호화하는 단편이 유용하다.
본 발명은 배지, 좀더 바람직하게는 고 수렴성 하이브리드화 조건(예, 선택성 하이브리드화의 경우)하에 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 적절한 수렴성 조건이 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있거나 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]과 같은 표준서에서 발견될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에 기재된 변형 뉴클레오티드 서열의 실체를 지닌 뉴클레오티드 서열에 관한 것으로; 특히 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열의 최소 약 90% 실체, 좀더 바람직하게는 최소 약 95% 실체를 지닌 뉴클레오티드 서열이 바람직하다. 특히 이 경우 본원에 기재된 변형 G 단백질과 실질적으로 유사한 면역 활성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 바람직하다.
본 발명은 또한 RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여될 경우, 차후 RSV 감염시 높은 질환(예, 폐 호산구증다증과 같은 비전형적인 폐 염증)을 유도하지 않는 RSV G 단백질 (또는 이의 일부)이다. 특정 양태에서, 변형 G 단백질은 아미노산 184에서 아미노산 198 영역에 최소 하나의 변형을 포함한다. 본 발명의 변형 G 단백질은 부분 또는 상당한 정도의 정제(예, 상동성으로 정제)되고/정제되거나 실질적으로 기타 단백질이 존재하지 않는다.
변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 추가 성분에 융합된 변형 G 단백질 아미노산 서열 전부 또는 일부를 포함하는 융합 단백질일 수도 있다. 방사성동위원소 및 항원성 태그와 같은 추가 성분은 폴리펩티드의 분리 또는 정제를 돕거나 폴리펩티드의 반감기를 연장하도록 선택될 수 있는데; 예를 들어, 헥사히스티딘 태그는 니켈 크로마토그래피에 의한 손쉬운 정제를 가능케한다. 달리, 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 RSV F 단백질 아미노산 서열 전부 또는 일부에 융합된 변형 G 단백질 아미노산 서열 전부 또는 일부를 포함한 융합 단백질일 수 있다(Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci(USA) 81:7683-7687(1984); U.S. Patent No. 5,639,853; U.S. Patent No. 5,723,130).
본 발명은 또한 변형 단백질 또는 폴리펩티드가 투여된 척추동물에서 높은 질환을 막는데 필요한 변형이외의 추가 아미노산 변형을 포함한 변형 G 단백질 및 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 변형, 예를 들어, 변형 단백질의 투 여로 인해 질환 특성에 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 변화가 본 발명에 포함된다. 또한 본원에 기재된 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드와 최소 약 40% 정도 일치하는 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다. 그러나, 보다 낮은 수준의 상동성을 나타내는 폴리펩티드도 특히 이들이 단백질의 1 이상의 특정 도메인보다 높은, 예를 들어 최소 약 40%의 상동성을 나타낸다면 유용하다. 예를 들어, 면역원성 기능 및 수용체 결합 활성을 포함한 특정 활성에 필요한 도메인보다 높은 정도의 상동성을 지닌 변형 폴리펩티드도 본원에 포함된다. 본원에 기재된 폴리펩티드는 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생성될 수 있다.
2가지 폴리펩티드 서열의 상동성%를 측정하기 위해, 서열을 비교에 최적이도록 배열한다(예를 들면, 첫번째 아미노산 서열에 갭이 도입될 수 있음). 대응되는 아미노산 위치에서 아미노산 잔기를 비교한다. 첫번째 서열상의 위치가 두번째 서열의 대응되는 위치와 동일한 아미노산 잔기에 의해 채워진다면, 분자는 이 위치에서 일치한다. 두 서열간의 상동성%는 서열에 의해 차지된 동일한 위치 수의 함수이다(즉, 상동성% = 일치되는 위치 수/위치의 총 수 x 100).
두 서열간의 상동성%의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하면 가능하다. 두 서열의 비교를 위해 사용된 바람직하면서, 비제한적인 수학적 알고리즘의 예는 문헌[참조: Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)]의 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘을 NBLAST 및 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, wordlength =3에 도입하여, 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질 분자와 원하는 상동성을 지닌 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교의 목적으로 갭이 생긴 배열을 만 들기 위해서는, 문헌[참조: Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1997)]에 기재된 갭형성 BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 갭형성 BLAST 프로그램을 이용하면, 개개 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 결석 파라미터가 이용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조. 서열 비교에 이용된 또다른 바람직한, 비제한적인 수학적 알고리즘의 예는 Myers et al., CABIOS (1989)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘을 GCG 서열 배열 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 도입한다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하면, PAM120 중량 잔사 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 두 서열간의 상동성%는 갭의 존재 또는 부재하에, 앞서 기재된 것과 유사한 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 상동성%를 계산함에 있어, 단지 정확한 매치만을 셈에 넣는다.
본 발명은 또한 최소한 하나의 조절 서열과 작동적으로 연결된 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하고 있는 발현 벡터, 예를 들면, 핵산 작제물을 제공한다. 다수의 이러한 벡터가 시판중에 있고, 기타 적당한 벡터는 숙련인에 의해 쉽게 제조될 수 있다. "작동적으로 연결된"은 뉴클레오티드 서열이 핵산 서열을 발현시키는 방법으로 조절 서열에 연결됨을 의미하고; 이 용어는 직접 물리적 링키지 및 링커 또는 개입 서열에 의한 링키지 모두를 포함하는 것으로 한다. 조절 서열은 당해 분야에 공지되어있고 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드인 폴리펩티드를 생성하도록 선택된다. 따라서, 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서, 및 문헌[참조: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 기재된 기타 발현 조절 요소를 포함한다. 예를 들어, 네이티브 조절 서열 또는 형질전환된 숙주 세포에 대한 네이티브 조절 서열이 이용될 수 있다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현되길 원하는 단백질 타입과 같은 인자에 의존할 수 있음을 이해해야 한다.
예를 들어, 본 발명의 변형 G 단백질 및 폴리펩티드는 핵산 분자, 또는 이의 일부를 원핵 세포, 진핵 세포 또는 이 둘 모두에서 발현에 적합한 벡터로 연결시켜 생성될 수 있다(예를 들어, Broach, et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye (Academic Press, 1983) p. 83; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 and 17참조). 전형적으로, 발현 작제물은 디하이드로폴레이트 리덕타제를 암호화하는 유전자 및 네오마이신, 테트라사이클린, 앰피실린, 클로람페니콜, 카나마이신 및 스트렙토마이신 내성을 제공하는 유전자(이에 한정되지 않음)를 포함한 1 이상의 선택성 마커를 함유할 것이다.
발현 작제물은 임의로는 직접 또는 폴리뉴클레오티드 링커에 의해, RSV F 단백질 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 분자에 연결된 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 작동적으로 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 작제물의 발현은 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드 및 F 단백질 또는 폴리펩티드 전부 또는 일부를 포함하는 키메라를 야기할 것이고; 폴리펩티드 링커가 작제물에 사용되면, F 및 변형 G 폴리펩티드는 1 이상의 아미노산에 의해 연결될 것이다. F/G 키메라의 제조 및 발현 방법은 일반적으로 예를 들면, 미국 특허 5,194,595(Wathen)에 교시되어있고, 이는 본원에서 참조문헌으로 인용된다.
기재된 벡터에 의해 형질감염된 원핵 및 진핵 숙주 세포도 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들면, 본 발명의 벡터로 형질감염될 수 있는 세포는 이. 콜리(E. coli)(예, 이. 콜리 K12 균주), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)과 같은 박테리아 세포, 초파리를 포함한 곤충 세포(baculovirus), 효모 세포와 같은 진균 세포, 식물 세포 및 흉선세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), HEp-2 세포, Vero 세포 및 COS 세포와 같은 포유류 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본원에 기재된 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 이용하여 미생물 또는 진핵생물 세포 공정에 의해 단백질의 재조합 형태를 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터와 같은 유전자 작제물에 연결하고, 진핵생물(효모, 닭, 곤충, 식물 또는 포유류) 또는 원핵생물(박테리아 세포) 숙주로 형질전환 또는 형질감염은 기타 익히 알려진 단백질을 생성하는데 이용된 표준 과정이다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 및 베네수엘라 말 엔세팔리티스 벡터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 백시니아 바이러스(VV)는 포유동물 세포주에서 발현하거나, 동물 모델, RSV의 각종 단백질에 전달하는데 사용된다(Olmstead et al., PNAS 83:7462-7466 (1986); Wertz et al., J. Virol 63:4767-4776 (1989)). 또한, VV의 티미딘 키나제 유전자에 삽입된 RSV G 단백질에 대한 변형 cDNA를 지닌 유사 작제물을 이용하여 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 합성할 수 있다. 예를 들어, Ball 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:246-250(1986)) 또는 Olmstead 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7462-7466(1986))이 기술한 방법을 이용하여 백시니아 바이러스 벡터로부터 변형 G 단백질 또는 F 단백질/변형 G 단백질 키메라를 발현시킬 수 있다. 유사 과정 또는 이의 변형법을 이용하여 미생물 수단 또는 조직-배양 기술에 의해 본 발명에 따른 재조합 단백질을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 재조합 기술에 의한 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드의 생성에 관한 것이다.
본 발명의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드가 시험관내에서 생성되는 상기 숙주 세포 시스템 이외에, 각종 시스템이 생체내 변형 G 단백질 및 폴리펩티드의 발현 및 전달에 적절하다. 이들 시스템은 전달제로서 박테리아 또는 바이러스와 같은 독성이 약화된 병원체를 이용한다. 이들 살아있는 약독화 병원체는 본 발명의 원하는 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 이종 핵산 단편으로서 이들내에 삽입된다. 이들 시스템을 이용하여, 원하는 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 척추동물 체내에 살아있는 약독화 박테리아 또는 바이러스에 의해 발현된다.
이러한 살아있는 약독화 병원체의 예로는 미국 특허 4, 837,151에 기재되어있고, 특히 경구 전달에 적당한 살모넬라와 같은 살아있는 약독화 박테리아, 및 미국 특허 5,643,576에 기재되고, 비내 또는 흡입 전달에 특히 적당한 살아있는 약독화 베네수엘라 말 엔세팔리티스 바이러스가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단백질 및 폴리펩티드는 각종 공정에 의해 재조합 세포 배양으로부터 분리 또는 정제(예, 상동성으로)될 수 있다. 이들은 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 에탄올 침전, 친화성 크로마토그래피 및 고 해상 액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 사용된 특정 방법은 폴리펩티드의 성질 및 숙주 세포의 선택에 좌우되며; 당해 분야의 숙련인은 적절한 방법을 쉽게 찾을 수 있다.
본 발명은 또한 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드에 결합하는 항체에 관한 것이다. 예를 들면, 기재된 변형 G 단백질에 결합하는 비인간 및 인간 항체를 포함한 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 인간 항체, 키메라 항체 및 이의 항원-결합 단편(Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y. (1994); EP Application 173,494 (Morrison); International Patent Application WO 86/01533(Neuberger) and U.S. Patent No. 5,225,539(Winters))이 본 발명의 범위내이다. 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유류는 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드의 면역원성 형태로 면역화될 수 있다. 단백질 또는 펩티드상에 면역원성을 부여하는 기술은 캐리어와의 접합 또는 당해 분야에 익히 공지된 기타 기술을 포함한다. 단백질 또는 폴리펩티드는 보조제의 존재하에 투여될 수 있다. 면역화 공정은 혈장 또는 혈청에서 항체 역가의 검출에 의해 모니터링될 수 있다. 표준 ELISA 또는 기타 면역분석은 항원으로 면역원을 이용하여 항체 수준을 분석할 수 있다.
면역화에 이어, 항-펩티드 항혈청이 얻어질 수 있고, 원한다면, 폴리클로날 항체가 혈청으로부터 분리될 수 있다. 모노클로날 항체도 당해 분야에 익히 공지된 표준 기술에 의해 생성될 수 있다(Kohler and Milstein, Nature 256:495-497(1975);Kozbar et al., Immunology Today 4:72(1983); and Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inn., pp. 77-96 (1985)). 본원에서 사용된 용어 "항체"는 Fab 및 F(ab)2와 같은 이의 단편을 포함하는 것으로 한다. 본원에 기재된 항체는 특히 시험관내 및 세포 추출물에서, 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여, 본원에 기재된 변형 G 단백질의 활성을 저해하는데 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 "저해"는 완전한 부재를 포함한 양적 또는 질적 감소를 의미한다. 부가적으로, 방사성 표시와 같은 라벨을 지닌 항체는 예를 들어, 조직 샘플 또는 세포 배양물에서 나온 세포에서 발현 단백질의 존재를 분석하는데 사용될 수 있고, 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 분리하기 위해 ELISA와 같은 면역흡착 공정에 이용될 수 있다. 분석될 수 있는 조직 샘플은 인간 조직, 예를 들면, 분화 및 비분화 세포를 포함한다. 예로는 폐, 척수, 흉선, 신장, 간, 뇌, 췌장, 섬유아세포 및 내피세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 변형 G 단백질 및 폴리펩티드를 포함한 약학 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명의 변형 G 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 이의 프로드러그는 약학 조성물(예, 면역원성 조성물)을 제조하기 위해 생리학적으로 허용가능한 매질에서 제형될 수 있다. 특정 생리학적 매질은 물, 완충 식염, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 선택된 매질에서 활성 성 분(들)의 최적 농도는 익히 공지된 과정에 의해 경험적으로 알 수 있으며, 원하는 최상의 약학 제형에 좌우될 것이다. 치료 부위에 외생 펩티드의 도입 방법은 피부내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 경구 및 비내를 포함하며, 이에 한정되지는 않는다. 기타 적당한 도입 방법은 유전자 요법, 재충진성 또는 생분해성 장치, 에어로졸 및 느린 방출 중합 장치를 포함할 수도 있다. 변형 G 단백질은 RSV F 단백질 전부 또는 일부를 포함한 추가 면역원과 함께 투여될 수 있고; 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 추가 면역원과 별도로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 예를 들어, 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 RSV F 단백질 전부 또는 일부의 혼합물 형태로 제공될 수 있다.
변형 G 단백질 또는 폴리펩티드(또는 혼합물, 융합 단백질 또는 키메라)는 포유동물 숙주와 같은 척추동물에서 항원에 대한 면역 반응을 유발하기 위한 항원으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 항원은 변형 G 단백질 전부 또는 면역원성 부위 또는 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드의 키메라 및 RSV F 단백질 전부 또는 면역원성 부위일 수 있다. 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 관련된 상세한 설명은 RSV F 단백질 전부 또는 일부와 함께 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한 조성물을 포함하는 것으로 한다.
본 발명의 방법은 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드의 혼합물을 포함한 백신 조성물과 적당한 보조제를 면역학적으로 효과적인 양을 척추동물에 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 "보조제"는 백신 항원에 대한 면역 반응을 증진시키거나 개질시키기에 충분한 제제를 의미하는 것으로 한다. 본원에서 사용된 백 신 조성물의 "면역학적으로 효과적인" 양은 면역 반응을 유발시키기에 적당한 양이다. 특정 투여량은 치료받을 척추동물의 나이, 체중 및 신체 조건, 및 투여방법에 좌우된다. 적당한 투여량은 숙련인이 쉽게 결정할 수 있다. 백신 조성물은 생리 식염 또는 글리세롤 또는 프로필렌 글리콜과 같은 에탄올 폴리올과 같은 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 비히클에 임의 투여될 수 있다.
적당한 보조제는 식물성 오일 또는 이의 에멀션, 표면 활성 물질, 예, 헥사데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 옥타데실아민, 리솔레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-딕옥타데실-N'-N'비스(2-하이드록시에틸-프로판 디아민), 메톡시헥사데실글리세롤, 및 플루론산 폴리올; 폴리아민, 예, 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC, 카보폴; 펩티드, 예, 뮤라밀 디펩티드, 디메틸글리신, 튜프신; 면역 자극 복합체; 오일 에멀션; 미네랄 겔; 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트와 같은 알루미늄 화합물; MPLTM (3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A, RIBI ImmunoChem Research, Inc., 미국 몬태나 해밀턴); 콜레라 톡신 및 이.콜리 열 불안정 톡신의 탈독성화 변이체; 네이키드 DNA CpG 모티브; 및 StimulonTM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals, 미국 매사추세츠 프래밍햄)를 포함한다. 본 발명의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 리포솜 또는 ISCOMS(면역자극 복합체)에도 삽입될 수 있고, 상보성 활성 성분들도 이용될 수 있다. 본 발명의 항원은 IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, IFN-γ 및 GM-CSF(이에 한정되지 않음)를 포함한 림포카인과 함께 투여될 수도 있다.
본 발명의 조성물 및 백신은 비경구, 동맥내, 피부내, 경피(예, 느린 방출 중합체의 사용에 의해), 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 경구 및 비내 투여 경로를 포함한 각종 경로에 의해 인간 또는 동물에 투여될 수 있다. 이러한 백신에 이용된 변형 G 단백질의 양은 투여 경로 및 척추동물의 물리적 특성에 따라 달라질 것이다. 당해 분야의 숙련인은 본 백신에 적합한 전통적인 캐리어 항원의 경우에 사용된 정해진 투여량 범위를 쉽게 조절 및 조정할 수 있다. 본 발명의 백신은 미성숙 및 성숙 척추동물 모두, 특히 인간을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 면역 반응을 조절 또는 증진시키기 위해 캐리어 분자와 커플링될 수 있다. 적당한 캐리어 단백질은 척추동물의 투여에 안전하고 캐리어로서 면역학적으로 효과적인 박테리아 톡신을 포함한다. 예로는 백일해, 디프테리아 및 파상풍 톡소이드 및 비독성 변이체 단백질 (크로스-반응 물질 (CRM)), 예를 들면 디프테리아 톡소이드의 비독성 변이체, CRM197을 포함한다. 최소 하나의 T-세포 에피토프를 함유한 네이티브 톡신 또는 톡소이드의 단편도 항원에 대한 캐리어로 유용하다. 항원 및 캐리어 분자의 접합체 제조방법은 당해 분야에 익히 공지되어있고 예를 들면, 문헌[참조: Wong, Chemistry of Protein Conjugation (CRC Press Inc., 미국 미시간 앤 아버 (1991)); Bernatowicz and Matsueda, Analytical Biochemistry 155:95-102(1986);Frisch et al., Bioconjugate Chem. 7:180-186(1996); and Boeckler et al., J. Immunological Methods 191:1-10 (1996)]에서 발견할 수 있다.
또한, 전체 펩티드 19 영역(아미노산 184-198)이 결실되면, 파라인플루엔자 바이러스 타입 3(이에 한정되지 않음)를 포함한 또다른 유기체의 항원의 1 이상의 에피토프는 결실된 영역에 삽입되어, 2가 백신을 생성할 수 있다.
본 발명은 또한 RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및 생리학적으로 허용가능한 비히클을 포함한 벡터에 관한 것으로, 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여되는 경우, 차후 척추동물에 RSV 감염시 높은 질환을 유도함이없이 보호를 제공한다. 이러한 백신은 본원에서 핵산 백신 또는 DNA 백신으로 불리고 척추동물의 유전 면역화에 유용하다.
본원에서 사용된 용어 "유전 면역화"는 병원성 제제, 특히 RSV에 대한 핵산 백신을 척추동물, 특히 포유동물에 접종시켜, RSV에 대해 척추동물을 보호함을 말한다. 본원에서 사용된 "핵산 백신" 또는 "DNA 백신"은 폴리펩티드 항원, 특히 본원에 기재된 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한 핵산 작제물이다. 핵산 작제물은 전사 프로모터 요소, 인핸서 요소, 스플라이싱 요소, 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 및 기타 핵산 서열을 포함할 수도 있다.
본원에서 사용된 "RSV에 대한 보호"는 척추동물에서 RSV에 의해 야기된 질환의 발현으로부터 (부분 또는 전체) 보호하는 면역 반응 유발을 말한다. RSV 바이러스에 의해 야기된 질환으로부터 보호된 척추동물은 면역화없이 일어나는 것보다 훨씬더 적은 정도로 RSV에 감염될 수 있고; RSV에 감염되더라도 질환 증상을 나타내지 않거나; RSV에 감염되어도 면역화없이 일어나는 것보다 질환 증상을 적게 나타낸다. 달리, RSV에 의해 야기된 질환으로부터 보호된 척추동물은 바이러스로 노 출되더라도, RSV 바이러스에 전혀 감염되지 않을 수 있다. 그러나, 모든 경우에, 핵산 백신은 차후 척추동물에 RSV 감염시 높은 질환을 유도하지 않는다.
핵산 백신은 표준 방법으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 공지된 방법을 사용하여, RSV의 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(예, DNA)은 발현 벡터로 삽입되어 핵산 백신을 작제할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)참조).
개개 척추동물에는 표준 방법을 이용하여, 핵산 백신이 접종된다(즉, 핵산 백신이 투여됨). 척추동물은 피하, 정맥내, 복막내, 피부내, 근육내, 국부, 경구, 직장, 코, 구강, 질, 흡입 분무, 또는 기존 비독성, 생리학적으로 허용가능한 캐리어 또는 비히클을 함유한 투여량의 제형이 이식된 저장기에 의해 접종될 수 있다. 달리, 척추동물에는 입자 가속기("유전자 건")를 이용하여 핵산 백신이 접종된다. 투여되는 형태(예, 캡슐, 정제, 용액, 에멀션)는 부분적으로는 투여 경로에 좌우된다. 예를 들어, 점막 투여의 경우, 점비약, 흡입제 또는 좌약이 이용될 수 있다.
핵산 백신은 적당한 보조제와 함께 투여될 수 있다. 보조제는 충분한 양, 즉, 핵산 백신에 대해 높은 면역 반응을 유발하기에 충분한 양이 투여된다. 보조제는 핵산 백신의 접종 이전(예, 1 일 전 이상); 핵산 백신의 접종과 동시(예, 24시간 이내); 핵산 백신과 동시(동시에)(예, 보조제가 핵산 백신과 혼합되어, 이 혼합물이 척추동물에 투여됨); 또는 핵산 백신의 접종 후(예, 1 일 후 이상)에 투여될 수 있다. 보조제는 또한 1회 이상 투여될 수 있다(예, 핵산 백신의 접종 이전 및 핵산 백신의 접종 후). 본원에서 사용된 용어 "함께"는 본원에서 구체적으로 기재된 기간, 및 본원에서 구체적으로 기재된 기간과 조합된 기간이 포함되는데, 이 기간 동안 보조제는 핵산 백신에 대한 높은 면역 반응을 유도하기 위해 투여될 수 있다(예, 핵산 백신에 의해 암호화된 항원에 대해 증가된 항체 역가, 또는 RSV에 대한 증가된 항체 역가). 보조제 및 핵산 백신은 척추동물에 대략적으로 동일한 위치에 투여될 수 있고; 예를 들어, 보조제 및 핵산 백신 모두 척추동물의 손발의 표시된 부위에 투여된다.
특정 양태에서, 핵산 작제물은 형질감염-촉진제와 함께 투여될 수 있다. 바람직한 양태에서, 형질감염-촉진제는 디옥틸글리실스퍼민(DOGS)(공개된 PCT 출원 공개 번호 WO 96/21356)이다. 또다른 양태에서, 형질감염-촉진제는 부피비카인(미국 특허 5,593,972)이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 면역원성 조성물, 백신 또는 핵산 백신을 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 척추동물에 투여하는 단계를 포함하는, 척추동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 척추동물은 혈청 반응 음성 척추동물, 예를 들면, 혈청 반응 음성 인간이다. 본 발명은 또한 면역원성을 보유하고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여될 경우, 차후 RSV를 이용한 척추동물 감염시 높은 질환을 유도하지 않는 면역학적으로 효과적인 양의 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한 조성물을 척추동물에 투여하는 단계를 포함하는, RSV에 대한 척추동물, 예를 들어, RSV 혈청 반응 음성 인간을 면역화하는 방법을 제공한다. 달리, 조성물은 면역원성을 보유하 고 있어, 면역원성 조성물 또는 백신에 주입되고 척추동물에 투여될 경우, 차후 RSV를 이용한 척추동물 감염시 높은 질환을 유도하지 않는 면역학적으로 효과적인 양의 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 백신 또는 핵산 백신을 척추동물에 투여하는 단계를 포함한, 척추동물의 백신접종 방법에 관한 것이다.
종합적으로 말하면, 본원에 기재된 데이터는 펩티드 19(AICKRIPNKKPGKKT)(서열 번호:19)가 IL-5, 재작극시 호산구 유도 및 재발과 관련된 사이토킨을 분비하도록 정해진 CD4+ T 세포의 팽창을 자극함으로써 폐 호산구증다증을 프라이밍함을 보여준다(Coffman et al., Science 245:308-310(1989)).
이론에 구에됨이 없이, 면역 프라이밍 모델은 펩티드 19내의 1 이상의 Th 세포 에피토프가 차후 면역 반응의 성질을 조절하여, Th2 표현형으로 심하게 치우치는 것으로 제시된다. T 세포 수용체 (TCR)-MHC 상호작용의 펩티드 성분이 Th1과 Th2 표현형간의 면역 반응의 질을 조절할 수 있음은 앞서 펩티드 서열을 변화시킴으로써 알 수 있었다(Pfieffer et al., J. Exp. Med. 181:1569-1574(1995); Murray et al., Eur. J. Immunol. 24:1337-1344(1994)). 그러나, 펩티드 19를 포함하는 15 아미노산은 1 이상의 T 세포 에피토프를 함유하고, 각각은 Th1 대 Th2 반응을 자극하는 별개의 능력을 가지는 것이 가능하다. 이 이론을 뒷받침하는 것으로, 펩티드 19 서열의 분석은 이것이 결정적인 1, 4, 6 및 9 앵커 잔기(각각 I, K 또는 R, I, 및 K)(펩티드 19의 아미노산 187, 189 및 192)(Rammensee et al., Immunogenetics 41:178-228(1995))에 조밀하게 배열된 MHC 부류 II I-Ed에 한정된 3 개의 포텐셜 T 세포 에피토프를 함유함을 나타낸다. 이들 추정 서열 각각은 MHC-결합된 펩티드의 생화학적 분리 또는 펩티드 결합 분석에 의해 생성된 공지된 리간드의 공개를 기초로 부류 II 결합과 일치한다(Rammensee et al., Immunogenetics 41:178-228(1995)). 펩티드 19(AICKRIPNKKPGKKT)(서열번호.19)를 포텐셜 T 세포 에피토프(AICGRGPNGKPGKKT (변이체 1; 서열 번호. 32)) 또는 (AGCGRGPGGKPGKGT (변이체 2; 서열 번호:33))의 중요한 MHC-결합 앵커 영역을 파괴하는 서열로 돌연변이시키면 마우스가 폐 호산구증다증에 걸리기 쉽도록하는 이 펩티드의 성향을 완전히 없애준다(도 6).
본원에 기재된 데이터는 G 단백질의 아미노산 184-198을 포함하는 펩티드와 폐 호산구증다증에 걸리기 쉬운 경향성 간의 양의 상관관계를 제공한다. 따라서, 혈청 반응 음성 집단의 경우, 결과는 G 단백질의 아미노산 184-198 영역이 유전적으로 개질된 RSV에 대한 백신의 작제에 대한 증거가 된다. 이 백신은 비전형적인 폐 질환에 대해 수용체를 바이어스하는 것이 아니라, 차후 RSV 공격으로부터 보호하는 능력을 보유한다. 펩티드 19에 대한 반응성을 지닌 HLA형 배열은 혈청 반응 음성 유아의 RSV 감염에 이어 종종 관찰되는 기관지초염, 아토피성 체질 또는 천식의 징후시 이 아미노산 서열의 역할을 좀더 깊게 이해하도록 해준다(Welliver and Welliver, Pediatrics in Review 14:134-139(1993)). 따라서, 혈청 반응 음성 집단에 대한 가장 선호적인 RSV 백신 기술은 면역생리학적 후유증을 프라이밍하지 않으면서, 보호 CD4+ 및 CD8+ 세포 타입을 자극하는 균형있는 면역 반응을 달성하는 성분들로 구성된다. 도 4a 및 4b에 제시된 데이터는 IFN-γ 분비를 자극하고 이러 한 역할이 가능한 다수의 펩티드를 확인시켜 준다(즉: 펩티드 10, 14, 16 및 18). 마찬가지로, 이 데이터는 펩티드 19를 차지하는 서열의 부재하에 PBMC의 증식을 자극할 수 있고 RSV 공격에 대한 보호가 충분할 수 있는 다수의 펩티드(예, 공여체 100의 경우; 펩티드 2, 4, 9, 15, 및 29)를 제시한다.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예를 들어 설명하고 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다. 본원에서 인용된 모든 참고문헌의 교시는 본원에서 참조문헌으로 인용된다.
재료 및 방법
마우스
7-9주간 자란 암컷 BALB/c (H-2d) 마우스를 Taconic Farms, Inc.(미국 뉴욕 게르만타운)에서 구입한다. 모든 마우스는 American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care로 불리는 시설에 수용되어 있다.
백신 항원의 제조 및 용도:
HEp-2 세포(ATCC CCL 23)를 감염시키고 차후 세포 파편을 제거하기 위해 배양물 상등액을 원심분리시켜 바이러스를 정제함으로써 균주 RSV A2의 바이러스 입자를 생성한다. RSV F 및 G 단백질을 Vero 세포에서 자란 RSV A2 균주에서 정제한다(ATCC CCL 81). 앞서 기재된(Hancock et al., J. Virol. 70:7783-7791(1996)) G 단백질-특이성 모노클로날 항체 L7(ATCC HB10233으로 기탁된 하이브리도마)을 이용하는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 G 단백질을 분리한다. ELISA 및 SDS-PAGE 에 의해, 생성물 G 단백질은 >95% 순도로 측정된다. 면역화를 위해, 달리 언급이 없으면, 0 및 4주째에 1 ㎍ 정제된 G 단백질 및 20 ㎍ StimulonTM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc., 미국 매사추세츠 프래밍햄)을 보조제로 함유하는 PBS 0.1 ㎖를 각 마우스에 근육내로 백신접종한다. F 단백질을 이온-교환 크로마토그래피로 정제하고 3 ㎍을 100 ㎍ 알루미늄 하이드록사이드(AlOH)가 보충된 백신접종에 이용한다. RSV 백신접종 및 투여의 경우, 감염성 RSV A2의 1-2 x 106 플라크 형성 단위(pfu)를 50 ㎕ 용적으로 비내 투여한다. 동일 용적의 HEp-2 세포 용해물을 모의 백신접종으로 이용한다.
펩티드 항원의 제조 및 용도
Genosys Biotechnologies, Inc(미국 텍사스 우들랜드)에서 RSV의 G 단백질의 중복 영역에 대응되는 일련의 합성 펩티드가 합성되었다(도 2). 생성물은 RSV A2 G 단백질의 아미노산 48-294를 포함한다(Wertz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4075-4079 (1985)). 질량 분광계로 측정된 펩티드의 순도는 90% 이상이다. 동결건조된 펩티드를 멸균수에 2 mg/㎖로 용해시켜 -20℃에서 보관한다. 5 ㎍/㎖ 농도의 펩티드를 사용하여 시험관내에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 G 단백질-프라임된 쥐 비장 세포를 자극한다.
선별된 펩티드를 Imject
활성된 접합 키트(Pierce Chemical, 미국 일리노이 록포드)를 사용하여 말레이미드-활성화된 (Partis et al., J. Prot. Chem. 2:263-277 (1983)) 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 접합시킨다. 접합 메카니즘은 KLH의 말레이미드 그룹과 펩티드의 SH 그룹간의 화학 반응에 좌우되기 때문에, 펩티드 22의 카복시-말단에 시스테인을 첨가한다. 각종 펩티드가 접합되는 정도를 Ellman 시제(Pierce Chemical)를 사용하여, 펩티드에서 티올 그룹의 손실을 측정함으로써 정량한다. 이들 반응에서 보여진 접합 정도(전형적으로 50-80 ㎍ 펩티드/KLH mg)를 이 기술(Tsao et al., Anal. Biochemistry 197:137-142(1991))에 의해 펩티드를 KLH에 부착하기 위해 앞서 보여진 것과 선호적으로 비교한다. 각종 펩티드에 의한 호산구증다증의 유도를 연구하기 위해, 각각의 펩티드에 접합된 KLH 250 ㎍을 PBS 0.1 ㎖중의 20 ㎍ StimulonTM QS-21로 보충하고 0 및 4주째에, 각 마우스를 근육내로 면역화시키는데 사용한다. 2차 백신접종 후 2주째에, 비내로 50 ㎕용적이 투여된 감염성 RSV A2 1-2 x 106 PFU를 마우스에 투여한다(Hancock et al., J. Virol 70:7783-7791(1996)). 7일 후, 경부 탈구에 의해 마우스를 죽이고 기관지폐포 세척 (BAL)을 수행한다.
감염성 RSV의 적정:
RSV-감염된 마우스의 분쇄된 폐에서 나온 상등액을 연속 희석하고 HEp-2 세포의 단층을 감염시킨다. 2 시간 배양 후, 접종물을 흡기로 빨아내고 각 웰에 배지중의 1% Sephadex G-75를 둔다. 추가 3일간 배양 후, 겔 오버레이를 제거하고 웰을 80% 메탄올에 고정시킨다. RSV G 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 홀스래디시 퍼록시다제에 접합된 염소 항-마우스의 2차 mAb를 이용하여 RSV 플라크를 동정한다. 포스페이트 완충된 식염 (PBS)에 기질, 0.05% 4-클로로나프톨/0.09% 수소 퍼록사이드를 첨가하여 색을 전개한다. RSV 플라크 형성 단위(pfu)를 셈하고 역가를 pfu/폐 조직 g으로 표현한다.
BALB/c 마우스에 RSV의 A2 균주로부터 정제된 네이티브 융합 (F) 및/또는 부착 (G) 단백질로 구성된 다수의 백신 중 하나를 근육내로 프라이밍한다. 마우스의 3 그룹을 3,000, 300, 또는 30 ng F 단백질/투여량으로 프라이밍한다. 마우스의 3개의 개개 그룹을 1,000, 100 또는 10 ng G 단백질/투여량으로 프라이밍한다. 또한 마우스의 3 그룹을 각각 3,000 + 1,000; 300 + 100: 또는 30 + 10 ng F 및 G 단백질을 함유한 조합 백신으로 프라이밍한다. 모든 백신을 알루미늄 하이드록사이드(AlOH, 100 ㎍/투여량)로 제형한다. 대조 마우스는 RSV A2 균주로 감염되거나 PBS/AlOH의 근육내 주사 받는다. 1차 면역화 후 4주째에 모든 마우스에 RSV A2 균주를 투여한다. 4일 후 마우스를 죽이고 폐 조직의 감염성 바이러스를 정량한다 (표).
표: 마우스 폐에서 RSV 역가 측정
항원 (ng)
GMT RSV
a
F(3000)+G(1000) <1.6±0.2
F(300)+G(100) <2.1±0.7
F(30)+G(10) <2.8±0.9b
F(3000) <2.1±0.5
F(300) <2.5±1.0
F(30) 4.1±0.8
G(1000) 3.5±0.5
G(100) 4.7±0.2
G(10) 4.7±0.2
PBS 5.1±0.2
RSV <1.6±0.1
a GMT는 기하학적 평균 역가 (log10) ± 1 RSV의 표준 편차/폐 조직 g임. GMT RSV는 비내 투여 후 4일째 측정됨.
b P<0.05 대 F(30) 단독, G (10) 단독, 또는 PBS로 백신접종된 그룹.
기관지폐포 세척:
기관지폐포 세척(BAL)은 기관속으로 주입하고, RPMI에서 아이스-콜드 12 mM Lidocaine HCl 1 ㎖를 함유한 용액을 최소 5회 회수하여 수행된다(Hancock et al., Vaccine 13:391-400(1995)). BAL 현탁물을 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. PBS에서 0.2% 트리판 블루를 이용하여 세포 분취물을 염색시켜 백혈구를 정량한다. 차후, 세포를 유리 슬라이드상으로 사이토스피닝하고, 고정한 다음 Diff-Quik로 염색한다(Dade International Inc., 미국 플로리다 마이애미). 슬라이드당 최소 400 세포를 분석하여 개개 백혈구 집단을 셈한다. 결과는 그룹당 5 마우스의 평균% (+SD)로 표현된다.
T 세포 서브셋의 생체내 결실
재조합 단백질 G 컬럼(Pharmacia, 미국 뉴저지 피스카타웨이) 위의 하이브리 도마 배양 상등액에서 쥐 CD4, GK1.5(ATCC TIB 207) 및 쥐 CD8, 53-6.72(ATCC TIB 105)에 대한 모노클로날 항체 (mAb)를 정제한다. 대조구로서, 정제된 래트 IgG를 Calbiochem(미국 캘리포니아 샌디에고)에서 구입한다. MAb에 최종 면역화 후 14 및 20일째에 마우스당 각각 750 ㎍ 및 250㎍의 양을 투여한다. 마우스에 차후 살아있는 RSV를 투여하고 이후 7일 후에 BAL-유도 세포의 분석으로 폐 호산구증다증을 정량한다. 유동 사이토메트리를 FACScan (Becton Dickinson, 미국 캘리포니아 마운틴 뷰)에서 수행하여 결실 부위의 기능을 평가한다. Pharmingen(미국 캘리포니아 샌디에고)에서 구입된 PE 항-마우스 CD4(L3T4) 및 FITC 항-마우스 CD8(Ly-8)을 이용한 표준 유동 사이토메트리 기술이 이용된다.
비장 면역세포의 시험관내 팽창
네이티브 G 단백질 및 StimulonTM QS-21가 2차 백신 접종된지 2주 후에 5마리의 마우스 그룹에서 비장을 분리하고 앞서 기재한 바와같이 이를 단일 세포 현탁물로 전환시킨다(Hancock et al., J. Virol. 70:7783-7791(1996)). 암모늄 클로라이드 용해를 이용하여 적혈구를 제거하고 생성된 비장 세포를 트리판 블루 배제에 의해 정량한다. 2 mM 글루타민; 100 U 페니실린 및 50 ㎍ 스트렙토마이신/㎖; 5 x 10-4 M β-머캅토에탄올; 10 mM HEPES; 1% 노르말 마우스 혈청(Biocell Labs, Inc., 미국 캘리포니아 랜코 도밍구즈)가 보충된 RPMI 1640을 함유한 배지에서 2.5 x 105 세포/웰의 농도로 96-웰 평면 바닥 플레이트에서 삼중 배양하다. 펩티드 항원을 50 ㎍/㎖의 농도로 배양 배지에 첨가한다. 대조구로, 정제된 G 단백질, 디프테리 아 톡소이드 크로스-반응성 단백질(CRM197) 및 Concanavalin A(ConA)를 각각 0.5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가한다. 37℃ 및 5% CO2에서 4일간 배양 후, 추가 18시간 동안 세포를 3H-티미딘 1 μCi로 펄싱한다. 차후 세포를 수거하고 DNA에 주입된 3H-티미딘을 액체 신틸렌이션 카운팅으로 측정한다.
헤파린화된 인간 혈액을 일반 성인 공여자로부터 모아 Ficoll-Hypaque(Pharmacia, 미국 뉴저지 피스카타웨이) 원심분리를 이용하여 분리한다. 세포를 10% AB- 혈청(Biocell)을 함유한 RPMI 1640 배지에서 상술된 바와같이 펩티드를 이용하여 배양한다. 대조구로서, 세포를 CRM197 (30 ㎍/㎖), PHA(5 ㎍/㎖), 또는 배지 단독으로 배양한다.
사이토킨 분석:
삼중 웰에서 풀링된 상등액을 항원-포착 ELISA에 의해 IFN-γ 및 IL-5를 분석한다. 간단히 말하면, 맥시소브(maxisorb) 플레이트(Nunc)를 각각 IFN-γ 및 IL-5 포착을 위한 R406A2 (3㎍/㎖) 또는 TRFK.5(2.5 ㎍/㎖) 모노클로날 항체를 함유한 카보네이트-비카보네이트 완충액 50 ㎕(pH 9.6)로 코팅한다. 5% FBS 및 10% 밀크 파우더 (중량/용적)를 함유한 Tris-완충된 식염을 이용하여 비-특이성 결합 부위를 블로킹한다. 배양 현탁물을 웰에 이중 첨가하고 2시간 동안 실온에서 배양한다. 결합된 사이토킨을 검출하기 위해, 바이오티닐화된 항체 XMG1.2(IFN-γ) 및 TRFK.4(IL-5)를 각각 1 ㎍/㎖ 및 2 ㎍/㎖의 농도로 사용한다. 사이토킨 분석에 사 용된 모든 4가지 모노클로날 항체를 Pharmingen(미국 캘리포니아 샌디에고)에서 구입한다. NADP, 디아포라제, 알콜 디하이드로게나제 및 INT 바이올렛으로 구성된 기질 시스템을 지닌 스트렙타비딘-알칼라인 포스파타제를 이용하여 사이토킨을 정량한다. 0.3 M 황산을 첨가하여 기질의 색을 전개시키고 Dynatech(미국 버지니아 챈틸리) ELISA 리더상의 490 nm(OD490)에서 광학 밀도를 측정한다. 직선을 위해 재조합 IFN-γ(Genzyme, 미국 매사추세츠 캠브리지) 및 IL-5(Pharmingen, 미국 캘리포니아 샌디에고)를 이용하여 각 사이토킨에 해당되는 표준 곡선을 만든다. 데이터는 각 항원에 대한 평균 OD490으로 표시된다.
폐 호산구증다증의 유도:
7 내지 9주간 자란 암컷 BALB/c(H-2d) 마우스에 20 ㎍ StimulonTM QS-21이 보충되고 정제된 G 단백질 1 ㎍을 함유한 PBS 0.1 ㎖; 250 ㎍ KLH; 펩티드 19 또는 22에 접합된 250 ㎍ KLH 또는 250 ㎍ 유리 펩티드 19 또는 22를 0 및 4주째에 근육내로 백신접종한다. 미국 일리노이 록포드에 소재하는 Pierce Chemical에서 구입된 Imject
활성된 접합 키트 (제품 번호 77111)를 이용하여 펩티드를 말레이미드-활성된 KLH에 접합시킨다. 전형적으로, 각 접합 반응의 경우, 80-100 ㎍의 펩티드를 1 mg의 KLH에 결합시킨다. 따라서, 각 마우스에 백신접종시마다 20-25 ㎍이 제공되기 때문에, 이는 관련 펩티드의 20-25 ㎍에 상당한다. 2차 백신 접종 후 2주째, 마우스에 감염성 RSV A2 1-2 x 106 PFU를 50 ㎕용적으로 비내 주입시켜 투여한다. 7일 후 마우스를 경부 탈구에 의해 죽이고 기관지 폐포 세척을 수 행한다. 세포를 유리 슬라이드상으로 사이토스피닝하고, 고정한 다음 Diff-Quik (Dade Diagnostics)으로 염색한다. 총 백혈구 세포의 함수로서, 관련 호산구 비율을 슬라이드당 최소 400 세포를 분석하여 계산한다. 결과(도 5)는 그룹당 5 마우스의 평균 % (+SD)로 표현된다.
통계적 분석
JMP
통계적 전개 소프트웨어 (SAS Institute Inc., 미국 노스캐롤라이나 캐리)를 이용하여 Tukey-Kramer HSD 다중 비교 시험에 의해 그룹간의 주요 차이점을 측정한다.
결과
본원에 기재된 작업으로 인해 네이티브 G 단백질 및, G 단백질의 아미노산 48에서 294에 이르는 일련의 중복 펩티드(도 2에 도시됨)에 의해 유도된 면역 반응이 특징화되고 있다. 아미노산 48은 RSV G 단백질의 두번째 해독 개시 코돈에 대응된다. 0 및 4주째에 네이티브 G 단백질의 근육내 (IM) 백신접종을 받은 BALB/c 마우스는 살아있는 RSV를 비내 (IN) 투여 후 7일째에 최대 기관지폐포 세척(BAL) 호산구증다증(총 백혈구 세포의 65%)을 나타내었다. 대조적으로, 실험상 감염 또는 경험중인 1차 감염에 의해 백신접종된 마우스의 BAL 유체는 2% 이하의 호산구를 함유한다(도 1b).
G 단백질-백신접종된 BALB/c 마우스에서 비장 세포의 시험관내 자극 분석은 G 단백질의 아미노산 184-198을 포함하는 펩티드에 대해 우세한 증식 반응을 나타낸다(도 3). 증식은 백그라운드 수준의 16배를 넘고 기타 G 단백질-유도된 펩티드 에 의해 얻어진 것을 훨씬 초과한다. 또한, 펩티드 19에 대한 반응 크기는 정제된 네이티브 G 단백질의 경우에 얻어진 것에 필적할 만하다. 따라서 데이터는 BALB/c마우스로부터 프라임된 비장세포의 증식을 자극하는 RSV G 단백질의 능력이 아미노산 184-198을 차지하는 단백질 구획내에 완전히 함유됨을 보여준다.
헬퍼 T 세포 서브셋과 결합된 사이토킨에 대한 배양 상등액의 분석은 펩티드 19를 이용한 자극 후 최고 수준의 IFN-γ 및 IL-5가 관찰됨을 보여준다. 또한, 이 수준은 네이티브 G 단백질을 이용한 재자극 후에 얻어진 것과 일치하거나, 이보다 크다(도 4a 및 4b). 이 데이터는 아미노산 184-198에 걸친 영역이 BALB/c 마우스에서 T 세포에 의해 인식된 RSV G 단백질에 우세한 에피토프(들)를 함유함을 보여준다.
예비 연구는 G 단백질이 백신접종된 BALB/c 마우스의 BAL에서 폐 호산구증다증이 투여 7일째에 65±5.4%에서 피크를 보임을 입증한다. 마우스에서 폐 호산구증다증을 프라이밍함에 있어 펩티드 19의 직접적인 역할을 알아보기 위해, 펩티드 19를 펩티드 22와 비교한다. 후자 펩티드는 IL-5의 자극 없이, IFN-γ 생성을 자극하는 것으로 나타났다(도 4a 및 4b).
충분한 면역원성을 보장하기 위해, 펩티드를 말레이미드-활성된 KLH에 접합시킨다. 보조제(2.5±2.0%)만이 백신접종된 마우스와 비교해서 펩티드 19 KLH(39.5±8.0%) 또는 G 단백질 (63±1.9%)로 프라이밍된 마우스에서 통계적으로 중요한 폐 호산구증다증이 관찰되었다(도 5). 대조적으로, 펩티드 22가 면역원성임을 보이는 데이터에도 불구하고, 펩티드 22-KLH(4.9±3.3%)와 관련된 호산구증다 증의 수준은 백그라운드 수준이다. 최종 백신접종 2주 후, 펩티드 19-KLH 또는 펩티드 22-KLH로 백신접종된 마우스의 기하학적 평균 항-RSV G 단백질 IgG 역가는 각각 1517 및 5611이다. 따라서, 인간 면역 반응이 각각의 펩티드-접합체에 대해 생성되지만, 이상 호산구증다증의 유도는 펩티드 19를 제공받은 마우스에 한정된다. 비접합된 펩티드 19 또는 22를 이용한 면역화는 검출가능한 인간 면역 반응을 유발하지 않고 PBS/StimulonTM QS-21 대조구와는 별 차이가 없는 호산구증다증의 비교%(각각 6.5±5.2% 및 2.5±2.5)를 생성한다.
폐 호산구증다증의 원인제로서 펩티드 19를 평가하기 위해, MHC 부류 II 결합 부위의 중요한 1, 4, 6 및 9 앵커 영역에서 아미노산 치환을 지닌 펩티드 19의 변이체를 평가한다. 이들 돌연변이는 마우스가 폐 호산구증에 걸리기 쉬운 성향을 없애준다(도 6). 도 5와 함께, 이 데이터는 펩티드 19의 아미노산 서열과 차후 투여시 마우스에서 폐 호산구증다증의 유도간의 직접적인 상관관계를 보여준다.
펩티드 19-KLH 관련 호산구증다증이 CD4+ 세포에 의해 매개되는지 여부를 측정하기 위해, CD4 또는 CD8 표면 분자에 대한 mAb를 이용하여 일련의 결실 실험을 수행한다. 투여 후 7일째에 백신접종된 비장에서 나온 림프구의 게이팅 집단에서 FACS 분석을 수행한다(도 8).
CD4+ 세포의 결실은 G/StimulonTM QS-21 또는 펩티드 19-KLH/StimulonTM QS-21이 백신접종된 마우스에서 BAL 호산구증다증의 상당한 감소를 야기한다(도 8). 구체적으로 말하면, 항-CD4 mAb를 이용한 치료는 폐 호산구증다증을 각각 67.2±8.5% 및 29.6 ± 13.3% 에서 8.1±4.7% 및 0.75±0.6%로 상당히 감소시킨다. 항-CD8 mAb 처리의 대응되는 효과는 호산구증다증 유도에 최소한 영향을 미치는데, 이는 수준이 G 및 펩티드 19-KLH가 백신접종된 마우스 각각의 경우에 63.8±6.4% 및 32.8±10.3%로 유지된다. 도 8에서 알 수 있듯이, 실험적으로 RSV가 감염된 마우스의 BAL에서는 단지 0.7%의 호산구증다증만이 관찰된다. 따라서, 데이터는 CD4+ 세포가 투여시 G 단백질 또는 펩티드 19 면역화된 BALB/c 마우스에서 보인 폐 호산구성 반응의 경우에 필요함을 입증한다.
최근 감염을 받은 개체를 동정하기 위해 정제된 G 단백질에 대한 반응성을 공여자의 패널의 말초 혈액 단핵 세포에서 시험한다. 차후, G 단백질에 대해 증식 반응을 보인 6 공여자의 세포를 도 2에 기재된 합성 펩티드의 존재하에 배양한다(도 7). 공여자 100의 경우 펩티드 19에 대해 강한 증식 반응이 관찰된다(평균 자극 지수, 8.5). 또한, 펩티드 19에 대한 증식 반응은 각각의 경우에 3배의 평균 자극 지수를 지닌 공여자 9 및 20의 경우에 분명하다.
등가물
본 발명이 바람직한 양태에 의해 구체적으로 도시 및 기재되고 있지만, 당해 분야의 숙련인은 첨부된 청구항에서 규정된 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어남이 없이 각종 변형을 행할 수 있다.
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- 서열 번호:19으로 표현되는 아미노산 184 내지 아미노산 198 영역내에 변형을 갖는 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드로서,상기 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드는 면역원성을 보유하고,면역원성 조성물 또는 백신으로 주입되고 척추동물에 투여될 경우 차후 척추동물이 RSV로 감염시 높은 질환을 유도하지 않는 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드.
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- 제 55 항에 있어서, 변형은 야생형 G 단백질에 비해 분리된 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드에 의해서 IL-5 분비를 위한 프라이밍(priming)을 저해하는 것인 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드.
- 제 55 항 또는 제 58 항에 있어서, 단백질 또는 폴리펩티드가 서열 번호:32 및 서열 번호:33으로 구성된 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 지닌 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드.
- 제 55 항 또는 제 58 항에 따른 변형 G 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
- 조절 서열에 작동적으로 연결된 제 60 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 작제물.
- (1) 제 60 항에 따른 핵산 분자,(2) RSV의 F 단백질 전부 또는 면역원성 부위를 암호화하는 핵산 분자; 및(3) (1)과 (2) 모두에 작동적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 키메라 핵산 작제물.
- 제 61 항 또는 제 62 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포.
- 삭제
- 제 55 항 또는 제 58 항에 따른 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 제 63 항에 따른 재조합 숙주 세포를 유지하는 단계를 포함하는, 제 55 항 또는 제 58 항에 따른 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드의 생성방법.
- 삭제
- 생리학적으로 허용가능한 매질, 및 제 55 항 또는 제 58 항에 따른 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제 67 항에 있어서, RSV F 단백질을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
- 면역학적으로 유효량의 제 55 항 또는 제 58 항에 따른 변형 RSV G 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물.
- 제 69 항에 있어서, 면역학적으로 유효량의 RSV F 단백질 전부 또는 일부를 추가로 포함하는 백신 조성물.
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- 생리학적으로 허용가능한 캐리어, 및 제 60 항에 따른 핵산 분자 유효량을 포함하는 백신 조성물.
- 제 60 항에 따른 핵산 서열이 이종 핵산 단편으로서 삽입되어 있는 살아있는 약독화 병원체(a live attenuated pathogen)를 면역학적으로 유효량으로 포함하는 백신 조성물.
- 제 73 항에 있어서, 살아있는 약독화 병원체가 살모넬라인 백신 조성물.
- 제 73 항에 있어서, 살아있는 약독화 병원체가 약독화 바이러스인 백신 조성물.
- 제 75 항에 있어서, 살아있는 약독화 바이러스가 약독화 베네수엘라 말 엔세팔리티스 바이러스(Venezuelan Equine Encephalitis virus)인 백신 조성물.
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