CN114096675A - 冠状病毒免疫原性组合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了免疫原性化合物、其药物制剂，和其用于诱导针对哺乳动物的2019新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染和变体的保护性免疫应答的用途。

Description

冠状病毒免疫原性组合物和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求以下临时申请的优先权：提交于2020年2月14日的美国系列No.62/977,078；提交于2020年3月20日的美国系列No.62/992,553；提交于2020年4月6日的美国系列No.63/005,923；提交于2020年4月28日的美国系列No.63/016,902；提交于2020年7月12日的美国系列No.63/050,844；提交于2020年8月5日的美国系列No.63/069,792；提交于2020年10月7日的美国系列No.63/088,736；提交于2021年1月21日的美国系列No.63/140,128；提交于2021年1月27日的美国系列No.63/142,077；提交于2021年2月11日的美国系列No.63/148,374，这些临时申请均全文并入本申请中。
序列表
本申请包含序列表，该序列表经由EFS-Web已以ASCII格式电子地提交，并据此全文以引用方式并入。创建于2021年2月11日的所述ASCII副本名称为ALT2029PCT_ST25.TXT并且大小为471,040字节。
技术领域
本申请整体涉及一种腺病毒载体冠状病毒抗原药物制剂以用于施用至哺乳动物受试者，该制剂诱导了受试者的免疫应答并且选择性地提供针对新型2019冠状病毒(SARS-CoV-2)的保护。
背景技术
冠状病毒为大型包膜、正链RNA(ss RNA)病毒的多样化组，其引起人和其它动物的呼吸道和肠道疾病。例如，人冠状病毒229E(HCoV-229E)、OC43(HCoV-OC43)、NL63和HKU1在人群中流行，并且引起高达30％的普通感冒。动物的冠状病毒(如猪类传播性胃肠炎病毒(TGEV)、鼠科肝炎病毒(MHV)和禽类感染性支气管炎病毒(IBV))引起其各自宿主中的呼吸道、胃肠道、神经系统或肝脏疾病。
冠状病毒具有正义、非分段、单链RNA基因组，其编码至少18种病毒蛋白(诸如非结构蛋白(NSP)1-13、结构蛋白E、M、N、S，以及RNA依赖性RNA聚合酶)。冠状病毒具有三种主要表面糖蛋白(命名为S、E和M)，并且一些冠状病毒具有另一种表面糖蛋白，称为血凝素酯酶(HE)；此外，N(核衣壳)蛋白为碱性磷蛋白，其一般与基因组相关联并且已记录为抗原性的(Holmes和Lai，《菲尔德病毒学(Fields Virology)》，第34章，1996年)。S(刺突)蛋白(冠状病毒的主要抗原)具有两个域：Sl，其据信涉及受体结合；和S2，其据信介导病毒和靶细胞之间的膜融合(Holmes和Lai，1996年，同上)。
S(刺突)蛋白可形成非共价连接同源三聚体(寡聚体)，其可介导受体结合和病毒感染。S蛋白的同源三聚体对呈现受体结合域的正确天然构象并且诱发中和抗体应答的应用可能为必需的。此外，S蛋白的胞内加工与显著的翻译后寡糖修饰相关联。通过N-聚糖基序分析所预期的翻译后寡糖修饰(糖基化)表明，S蛋白具有用于此类修饰的多达23个位点。此外，C-端半胱氨酸残基也可参与蛋白折叠和保存天然(功能性)S蛋白构象。通过高尔基体中的胰蛋白酶样蛋白酶或通过胞外定位酶，一些冠状病毒的S蛋白可在S蛋白的中心附近酶解地加工成连接多肽，该连接多肽包N-端Sl和C-端S2多肽。目前，冠状病毒细分成α-属、β-属(例如，MERS、SARS、SARS-CoV-2)和γ-属。参见图14。
冠状病毒感染通过病毒包膜的脂质双层与宿主细胞膜的融合来实现。膜融合通过病毒包膜上的病毒刺突(S)糖蛋白来介导。S-糖蛋白合成为约180kDa的前体，该前体在内质网中寡聚化；并且在前高尔基体区室并入芽殖型病毒粒子中。S1包含受体结合位点，并且因此有助于限定病毒的宿主范围。S2为跨膜子单元，其有助于介导病毒和细胞膜之间的融合。S2包含两个4,3-疏水性重复域(HR)，其预计形成盘绕结构。这些区域标注为HR-1和HR-2，并且通过氨基酸残基的居间片段(称为螺旋间域)来分开。这些盘绕区域可能在决定刺突蛋白的天然状态寡聚结构和其融合能力方面发挥重要作用。
新型冠状病毒SARS-CoV-2，最初记录为2019-nCoV，由冠状病毒研究组(国际病毒分类委员会的工作组)基于系统发育学、分类学和既定实践(BioRxiv；doi.org/10.1101/2020.02.07.937862)而官方命名为SARS-CoV-2，其导致了如今的全球卫生紧急情况。基因组测序已示出，其为一种正义单链RNA冠状病毒(GenBank登录号MN908947.3；RefSeq NC_045512)。冠状病毒主要通过密切接触进行传播，特别地在大约6英尺(1.8米)范围内通过咳嗽和打喷嚏的呼吸道飞沫进行传播。感染的常见征象包括呼吸道症状、发烧、咳嗽、呼吸短促和呼吸困难。在更严重的情况下，感染可引起肺炎、严重急性呼吸道综合征、肾衰竭和甚至死亡。迫切需求可用于诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的载体和包括其的免疫原性组合物。本发明解决了这些问题。
发明内容
在一些实施例中，本发明提供了用于诱导和/或改善(例如，增强)针对冠状病毒，特别新型2019年冠状病毒SARS-CoV-2的免疫应答的试剂、组合物和方法。例如，在一些实施例中，本发明提供了复制缺陷腺病毒载体，其编码至少一种SARS-CoV-2抗原(例如，E1A/E3缺失的人腺病毒5型(hAd5)(hAd5-SARS-CoV-2))，和/或不同类型的感染病原体(例如，不同类型的病毒，诸如流感(例如，Ad-HA))或缺乏转基因("hAdE"；例如，未编码外源性感染病原体的至少一种抗原或免疫原，“空”)的其它一种或多种外源性抗原,该复制缺陷腺病毒载体在本文可统称为“SARS-CoV-2免疫载体”。如本文所讨论，此类载体(和/或包括其的免疫原性组合物)可用于诱导针对SARS-CoV-2(例如，针对保护性SARS-CoV-2表位，诸如刺突(S)蛋白受体结合域(RBD))的粘膜、细胞介导和/或体液免疫应答。在一些实施例中，本发明描述了将此类载体(例如，hAd5-SARS-CoV-2和/或hAd5)施用至动物和/或人类以诱导和/或增强对于SARS-CoV-2T表位(例如，显性表位)具有特异性的免疫应答(例如，产生抗体和/或CD8+T细胞(和/或其它T细胞))。在一些实施例中，由鼻内施用的载体所诱导的免疫应答诱导和/或增强了呼吸道中具有常驻记忆表型的T细胞应答。在一些实施例中，此类免疫应答针对SARS-CoV-2为保护性的，和/或对于缓解SARS-CoV-2的症状和/或感染为有效的，并且在一些实施例中，针对SARS-CoV-2攻击可为保护性的。因此，在一些实施例中，本发明描述了包括hAd5-SARS-CoV-2的免疫原性组合物的用途，关于SARS-CoV-2传播和感染的本领域公认问题提供解决方案。
在某些实施例中，本文提供了用于治疗和/或预防由SARS-CoV-2病毒感染所引起的COVID-19相关疾病的免疫原性组合物、其制剂和使用方法，其中该免疫原性组合物包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体，该rdAd载体包括编码SEQ ID NO:446或包含与SEQ ID NO:446至少90％或至少95％同一性的变体的核酸序列。在实施例中，免疫原性组合物包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体，该rdAd载体包括编码SEQ ID NO:15或包括与SEQ ID NO:15至少90％或至少95％的同一性的变体的核酸序列。SEQ ID NO:15包括RBD序列(SEQ ID NO:446)，该RBD序列具有刺突蛋白(SEQ ID NO:3)的S1域的长侧翼序列和前导序列。在某些实施例中，核酸序列编码SEQ ID NO:13(S1域)。在实施例中，核酸序列编码包括SEQ ID NO:3的一个或多个点突变的序列。
如本文所用，“变体”指代RBD序列中的一个或多个突变。在某些实施例中，核酸序列编码以下项的一个或多个：SEQ ID NO:412-417、SEQ ID NO:438-445、SEQ ID NO:475-476和SEQ ID NO:460(相比于以下项的RBD序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:446、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15，其RBD序列包括一个或多个突变)。在实施例中，核酸序列编码包括在位置333-388、390-395、397-399、401-411、413-415、417-419、424、426-435、437、439-442、444-446、449、450、452、453、455-463、465、467-473、475-479、481-486、490、491、493-495、499-510或513-526处的一个或多个突变的序列，其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:411或SEQ ID NO:3(全长刺突蛋白)。在实施例中，核酸序列编码包括在氨基酸位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504和/或505处一个或多个突变的序列，其中氨基酸的编号对应于SEQ ID NO:411或SEQ ID NO:3(全长刺突蛋白)。
在实施例中，一个或多个突变选自以下项：由N取代的氨基酸417(K)、由V、S或A取代的氨基酸446(G)、由N取代的氨基酸449(Y)、由F取代的氨基酸453(Y)、由F取代的氨基酸455(L)、由L取代的氨基酸456(F)、由V取代的氨基酸473(Y)、由V取代的氨基酸475(A)、由S或A取代的氨基酸476(G)、由N、R、T、G、A或I取代的氨基酸477(S)、由Q、K、D、A或R取代的氨基酸484(E)、由L或S取代的氨基酸486(F)、由F取代的氨基酸453(Y)、由L或R取代的氨基酸493(Q)、由N或F取代的氨基酸495(Y)、由I取代的氨基酸500(T)、由Y、T或S取代的氨基酸501(N)、由R、D或C取代的氨基酸502(G)、由L、I或F取代的氨基酸503(V)，或由H、E、W或C取代的氨基酸505(Y)，其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:411。在实施例中，核酸序列编码包括选自K417T、K417N、E484K、L452R和/或N501Y一个或多个突变的序列，其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:411或SEQ ID NO:3(全长刺突蛋白)。在实施例中，编码SEQ ID NO:446的核酸序列还包括由编码选自SEQ ID NO:418至437的序列的核酸序列所编码的前导序列。
在实施例中，本文提供了一种免疫原性组合物，其中转基因的编码序列对于哺乳动物受试者进行密码子优化。在实施例中，复制缺陷腺病毒载体为牛腺病毒、犬腺病毒、非人灵长类腺病毒、鸡腺病毒、猪或猪型腺病毒，或人腺病毒。在实施例中，非人灵长类腺病毒为黑猩猩或大猩猩腺病毒。在实施例中，复制缺陷腺病毒载体为人腺病毒。在实施例中，人腺病毒为Ad5或Ad26。
在实施例中，本文提供了一种药物制剂，该药物制剂包括有效量的免疫原性组合物(例如，包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体，该rdAd载体包括编码SEQ ID NO:446或包括与SEQ ID NO:446至少90％或至少95％的同一性的变体的核酸序列)，该组合物包括至少一种药学上可接受稀释剂或载体，任选地其中该稀释剂为磷酸盐缓冲盐水。在实施例中，该制剂配置用于非侵入性或鼻内施用，任选地其中药学上可接受载体为喷雾或气溶胶形式。
在实施例中，本文提供了一种用于诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的方法，该方法包括将有效量的本发明免疫原性组合物(例如，包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体，该rdAd载体包括编码SEQ ID NO:446的或包括与SEQ ID NO:446至少90％或至少95％的同一性的变体的核酸序列)施用至人类。在实施例中，所述有效量为至少108个病毒颗粒(vp)，至少109个病毒颗粒(vp)，或至少1010个病毒颗粒(vp)。在实施例中，免疫原性组合物鼻内地施用。
在实施例中，本发明的组合物可用于SARS-CoV-2的治疗或预防，并且本发明的组合物可用于制备用于SARS-CoV-2的治疗或预防的药物。因此，尽管本发明包括治疗和预防SARS-CoV-2的方法，但是本发明还包括本发明的组合物的用途，并且此类用途可并行于本发明方法的任一者并且涉及本发明组合物的任一者或全部。
附图说明
并入本说明书并构成本说明书的一部分的附图示出了本发明的一个或多个实施例，并且连同具体实施方式和实例章节一起用于解释本发明的原理和实施方式。
图1A至图1J.示例性SARS-CoV-2完整基因组(基因库：MN908947.3；SEQ ID NO:1)。
图2A至图2E.SARS-CoV-2ORF1ab多聚蛋白(基因库：QHD43415.1；SEQ ID NO:2)。
图3A.SARS-CoV-2表面糖蛋白(例如，刺突蛋白)，包括天然前导序列(基因库：QHD43416.1；SEQ ID NO:3)。
图3B.SARS-CoV-2表面糖蛋白刺突蛋白的RBD区域(SEQ ID NO:446)。
图4.SARS-CoV-2ORF3A蛋白(基因库：QHD43417.1；SEQ ID NO:4)。
图5.SARS-CoV-2包膜蛋白(基因库：QHD43418.1；SEQ ID NO:5)。
图6.SARS-CoV-2膜糖蛋白(基因库：QHD43419.1；SEQ ID NO:6)。
图7.SARS-CoV-2ORF6蛋白(基因库：QHD43420.1；SEQ ID NO:7)。
图8.SARS-CoV-2ORF7a蛋白(基因库：QHD43421.1；SEQ ID NO:8)。
图9.SARS-CoV-2ORF8蛋白(基因库：QHD43422.1；SEQ ID NO:9)。
图10.SARS-CoV-2核衣壳磷蛋白(基因库：QHD43423.2；SEQ ID NO:10)。
图11.SARS-CoV-2ORF10蛋白(基因库：QHI42199.1；SEQ ID NO:11)。
图12示出了SARS-CoV-2完整基因组的示意图(基因库：MN908497；NCBI参考序列：NC_045512.2；SEQ ID NO:1)。
图13示出了刺突蛋白多肽和其结构域的示意图(例如，SEQ ID NO:3)。
图14示出了冠状病毒经由冠状病毒刺突蛋白的S1和S2域的分类。
图15示出了保守氨基酸取代的列表，这些保守氨基酸取代位于刺突蛋白的S1部分的受体结合域(RBD)中的位置455、493、494和501。
图16.SARS-CoV-2表面糖蛋白(例如，刺突蛋白)(基因库：QHD43416.1)，下划线为pTA信号序列(SEQ ID NO:12)。
图17A.SARS-CoV-2刺突蛋白S1域，下划线为pTA信号序列(SEQ ID NO:13)。当SEQID NO:13插入腺病毒载体中时，该腺病毒载体在此称为“S1载体”。
图17B.S1域中的SARS-CoV-2变体突变(“序列”为SEQ ID NO:411)。
图18.S1域的SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域(RBD)，下划线为pTA信号序列和短侧翼序列(SEQ ID NO:14)。
图19.S1域的SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域(RBD)，下划线为pTA信号序列和长侧翼序列(SEQ ID NO:15)。当SEQ ID NO:15插入腺病毒载体中时，该腺病毒载体在此称为“RBD载体”。
图20.S1域的SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域(RBD)，其中保守取代处于位置455、486、493和501(SEQ ID NO:16)。
图21.SARS-CoV-2刺突蛋白，S1域的受体结合域(RBD)的一部分，其中保守取代处于位置455、486、493和501(SEQ ID NO:17)。
图22.SARS-CoV-2表面糖蛋白(例如，刺突蛋白)，下划线为pTA信号序列并且取代处于S1/S2、S2'和HR1位点(SEQ ID NO:18)。
图23.SARS-CoV-2表面糖蛋白(例如，刺突蛋白)，下划线为pTA信号序列并且取代处于S1/S2、S2'和HR1位点(SEQ ID NO:19)。
图24.SARS-CoV-2表面糖蛋白(例如，刺突蛋白)，下划线为pTA信号序列并且取代处于S1/S2、S2'、HR1、融合肽和ER保留基序位点(SEQ ID NO:20)。
图25示出了在施用(本发明单价流感疫苗组合物(例如，NasoVAX))后2周不存在的剂量依赖性载体脱落，未发现可复制性病毒(如经由聚合酶链式反应("PCR")测定所确定)，并且抗载体抗体相对于基线在第29天呈现为GMR，其中仅证实了最高剂量下1个月之后的2.3倍诱导。本发明单价流感疫苗组合物证实了具有有限抗载体(Ad载体)免疫应答的短暂脱落(Ad载体)。
图26示出了预先存在(基线Ad5血清状态)抗载体(Ad5)免疫的NasoVAX施用(高剂量；11×1011vp)的效果，如对于体液(第29天的"HAI"或微中和"MN")、粘膜(第29天"IgA")和细胞(第8天的"ELISpot")所测量，其中未观察到Ad5血清阴性或Ad5血清阳性受试者之间的免疫应答差异。Ad5+受试者的中值滴度高于定量下限(LLOQ)22倍。
图27.横穿整个SARS-CoV-2蛋白质组的高度亲和力HLA I类和HLA II类结合基序的表达谱。
图28.横穿整个SARS-CoV-2蛋白质组的高度和中度亲和力HLA I类和HLA II类结合基序的表达谱。
图29.用于SEQ ID NO:328的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图30.用于SEQ ID NO:329的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图31.用于SEQ ID NO:330的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图32.用于SEQ ID NO:331的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图33.用于SEQ ID NO:332的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图34.用于SEQ ID NO:333的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图35.用于SEQ ID NO:334的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图36.用于SEQ ID NO:335的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图37.用于SEQ ID NO:336的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图38.用于SEQ ID NO:337的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图39.用于SEQ ID NO:338的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图40.用于SEQ ID NO:339的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图41.用于SEQ ID NO:340的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图42.用于SEQ ID NO:341的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图43.用于SEQ ID NO:342的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图44.用于SEQ ID NO:343的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图45.用于SEQ ID NO:344的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图46.用于SEQ ID NO:345的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图47.用于SEQ ID NO:346的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图48.用于SEQ ID NO:347的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图49.用于SEQ ID NO:348的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图50.用于SEQ ID NO:349的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图51.用于SEQ ID NO:350的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图52.用于SEQ ID NO:351的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图53.用于SEQ ID NO:352的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图54.用于SEQ ID NO:353的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图55.用于SEQ ID NO:354的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图56.用于SEQ ID NO:355的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图57.用于SEQ ID NO:356的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图58.用于SEQ ID NO:357的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图59.用于SEQ ID NO:358的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图60.用于SEQ ID NO:359的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图61.用于SEQ ID NO:360的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图62.用于SEQ ID NO:361的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图63.用于SEQ ID NO:362的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图64.用于SEQ ID NO:363的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图65.用于SEQ ID NO:364的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图66.用于SEQ ID NO:365的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图67.用于SEQ ID NO:366的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图68.用于SEQ ID NO:367的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图69.用于SEQ ID NO:368的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图70.用于SEQ ID NO:369的HLA I类和HLA II类结合基序的图谱。
图71.血清中抗SAR-CoV-2IgG(μg/ml)(A)、支气管肺泡灌洗液BAL抗SAR-CoV-2IgG(ng/ml)(B)和BAL抗SAR-CoV-2IgA(ng/ml)(C)的测量值，这些测量值在不同时间点获得自独立C57BL/6小鼠，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内剂量的复制缺陷Ad5载体，复制缺陷Ad5载体表达RBD域(如SEQ ID NO:15所示)。结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。第0天记录了所有组的对照组数值。接受2次鼻内剂量的组的第7天和第14天记录了接受相同剂量的单次施用的组的数值。
图72.通过病灶减少中和检验(PRNT)所测得的十只C57BL/6小鼠针对SARS-CoV-2的血清中和抗体，这些小鼠已接受单次鼻内高剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID N0:15)。每个图表(图72A至图72J)对应于从一只免疫小鼠所获得的结果。黑色线对应于阴性对照血清，并且红色线对应于所检验血清样本。
图73.通过病灶减少中和检验(PRNT)所测得的五只C57BL/6小鼠针对SARS-CoV-2的血清中和抗体，这些小鼠已接受单次鼻内中度剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID N0:15)。每个图表(图73A至图73E)对应于从一只免疫小鼠所获得的结果。黑色线对应于阴性对照血清，并且红色线对应于所检验血清样本。
图74A至图74L.独立C57BL/6小鼠的肺部的免疫细胞的流式细胞仪分析，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内高剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID N0:15)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。
图75A至图75E.独立C57BL/6小鼠的支气管肺泡灌洗液的免疫细胞的流式细胞仪分析，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内中度剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID N0:15)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。
图76A至图76J.独立C57BL/6小鼠的纵膈淋巴结的免疫细胞的流式细胞仪分析，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内高剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID N0:15)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。
图77A至图77L.独立C57BL/6小鼠的脾脏的免疫细胞的流式细胞仪分析，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内高剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID N0:15)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。
图78.血清中抗SAR-CoV-2IgG(μg/ml)(A)、支气管肺泡灌洗液(BAL)的BAL抗SARS2S IgG(ng/ml)(B)和BAL抗SARS-2S IgA(ng/ml)(C)的测量值，这些测量值在不同时间点获得自独立C57BL/6小鼠，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内剂量的复制缺陷Ad5载体，复制缺陷Ad5载体表达S1域(如SEQ ID NO:13)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。第0天记录了所有组的对照组数值。接受2次鼻内剂量的组的第7天和第14天记录了接受相同剂量的单次施用的组的数值。
图79.通过病灶减少中和检验(PRNT)所测得的五只C57BL/6小鼠针对SARS-CoV-2的血清中和抗体，这些小鼠已接受单次鼻内高剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达S1域(SEQ ID N0:13)。每个图表对应于从一个免疫小鼠所获得的结果(图79A至图79E)。黑色线对应于阴性对照血清，蓝色线对应于阳性对照，并且红色线对应于所检验血清样本。
图80.通过病灶减少中和检验(PRNT)所测得的五只C57BL/6小鼠针对SARS-CoV-2的血清中和抗体，这些小鼠已接受单次鼻内中度剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达S1域(SEQ ID NO:13)。每个图表对应于从一个免疫小鼠所获得的结果(图80A至图80E)。黑色线对应于阴性对照血清，蓝色线对应于阳性对照，并且红色线对应于所检验血清样本。
图81A至图81L.独立C57BL/6小鼠的肺部的免疫细胞的流式细胞仪分析，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内高剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达S1域(SEQ ID N0:13)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。
图82A至图82E.独立C57BL/6小鼠的支气管肺泡灌洗液的免疫细胞的流式细胞仪分析，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内中度剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达S1域(SEQ ID N0:13)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。
图83A至图83J.独立C57BL/6小鼠的纵膈淋巴结的免疫细胞的流式细胞仪分析，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内高剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达S1域(SEQ ID N0:13)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。
图84A至图84L.独立C57BL/6小鼠的脾脏的免疫细胞的流式细胞仪分析，该独立C57BL/6小鼠已接受单次鼻内高剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达S1域(SEQ ID N0:13)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。
图85.血清中抗SAR-CoV-2IgG(μg/ml)(A)、支气管肺泡灌洗液(BAL)的BAL抗SARS-CoV-2IgG(ng/ml)(B)和BAL抗SARS-COV-2IgA(ng/ml)(C)的测量值，这些测量值在不同时间点获得自独立CD-1小鼠，该独立CD-1小鼠已接受一次或两次鼻内剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID NO:15)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。第0天记录了所有组的对照组数值。接受2次鼻内剂量的组的第7天和第14天记录了接受相同剂量的单次施用的组的数值。
图86.血清中抗SAR-CoV-2IgG(μg/ml)(A)、支气管肺泡灌洗液的BAL抗SARS-CoV-2IgG(ng/ml)(B)和BAL抗SARS-CoV-2IgA(ng/ml)(C)的测量值，这些测量值在不同时间点获得自独立CD-1小鼠，该独立CD-1小鼠已接受单次鼻内剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达S1域(SEQ ID NO:13)。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。第0天记录了所有组的对照组数值。
图87A至图87E.SARS-CoV-2串联多聚蛋白；来源于SEQ ID NO:1(基因库：MN908947.3)。
图88.独立CD-1小鼠或对照组的肺部T细胞在第10天(A)和第14天(B)以及脾脏T细胞在第10天(C)和第14天(D)的测量值；该独立CD-1小鼠接受单次鼻内剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID NO:15)(“RBD载体”)，该对照组仅接受A195缓冲液。这些组的结果表示为+/-95％置信区间的几何平均应答。
图89.独立CD-1小鼠在第14天的肺部CD4+IFN-g+CD11a+T细胞(A)、肺部CD4+TNF-a+CD11a+T细胞(B)、肺部CD4+IFN-g+CD11a+T细胞(C)和肺部CD4+TNF-a+CD11a+T细胞(D)的测量值；该独立CD-1小鼠接受单次鼻内剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID NO:15)(“RBD载体”)，或仅接受对照A195缓冲液。在流式细胞仪分析之前，细胞以2mcg/肽/mL的RBD肽池进行重新刺激。结果对应于+/-95％置信区间的几何平均应答。
图90.独立CD-1小鼠在第14天的脾脏CD4+IFN-g+CD11a+T细胞(A)、脾脏CD4+TNF-a+CD11a+T细胞(B)、脾脏CD4+IFN-g+CD11a+T细胞(C)和脾脏CD4+TNF-a+CD11a+T细胞(D)的测量值；该独立CD-1小鼠接受单次鼻内剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID NO:15)(“RBD载体”)，或仅接受对照A195缓冲液。结果对应于+/-95％置信区间的几何平均应答。
图91.独立CD-1小鼠在第14天的肺部常驻记忆CD4+(A)和CD8+(B)T细胞(表达组织常驻记忆T细胞(TRM)标记CD103和CD69)的测量值；该独立CD-1小鼠已接受单次鼻内剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID NO:15)(“RBD载体”)，或仅接受对照A195缓冲液。结果对应于+/-95％置信区间的几何平均应答。
图92.通过病灶减少中和检验(FRNT)所测得的十只CD-1小鼠针对SARS-CoV-2的血清中和抗体，这些小鼠已接受单次鼻内高剂量的复制缺陷Ad5载体，该复制缺陷Ad5载体表达RBD域(SEQ ID N0:15)。每个图表对应于从一个免疫小鼠所获得的结果(图92A至图92J)。黑色线对应于阴性对照血清，并且红色线对应于所检验血清样本。
图93.S1或RBD载体感染细胞中刺突转基因的表达和检测。Per.C6细胞以MOI:5分别感染了S1(SEQ ID N0:13)或RBD(SEQ ID N0:15)载体(“S1载体”或“RBD载体”)。感染后24小时，采集细胞，固定并透化，并且然后以小鼠中和刺突特异性单克隆抗体MM-43(上图)或MM-57(下图)填充直方图进行染色。未感染细胞用作阴性对照(空心直方图)。
图94.在单次鼻内施用S1载体和RBD载体之后，血清中的SARS-CoV-2中和抗体应答。A:28天前以中度剂量或高剂量的S1或RBD载体所接种的C57BL/6或CD-1小鼠的中和抗体应答，如所示。结果表示为血清样本的稀释度倒数，该稀释度倒数需达到容许性Vero E6细胞的野生型SARS-CoV-2感染的50％中和率(FRNT50)。线代表组中值。B:接种动物血清中的中和抗体应答和刺突特异性IgG应答之间的关联性。关联性分析以用双尾Spearman检验来执行。在10/10只C57BL/6和8/10只CD-1小鼠中，以RBD载体的高剂量鼻内接种诱导了高于背景的中和抗体应答。
图95.单次鼻内施用RBD载体之后第14天的肺部常驻记忆T细胞的胞内细胞因子产率。如实例17所描述，向CD-1小鼠单次鼻内施用媒介物(Ctrl)或高剂量RBD载体。肺部细胞(n＝10只小鼠/疫苗，3只小鼠/对照)在第14天进行分离，以RBD肽池重新刺激5小时，并且通过流式细胞仪进行分析以确定CD69+CD103+常驻记忆T细胞(Trm)。结果表示为独立小鼠的CD4+或CD8+T细胞的百分比。行表示为多组的平均应答+/-SD。统计分析以Mann-Whitney检验来执行。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。
图96.单次鼻内施用RBD载体之后第10天的脾脏T细胞的所分泌细胞因子产率。如实例18所描述，向CD-1小鼠单次鼻内施用媒介物(Ctrl)或高剂量RBD载体。脾脏细胞(n＝10只小鼠/疫苗，3只小鼠/对照)在第10天进行分离，并且以RBD肽池重新刺激48小时。利用细胞因子多重测定，所分泌细胞因子在上清液中进行检测。结果以单位pg/ml来表示。线表示+/-SD的平均应答。统计分析以Mann-Whitney检验来执行：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。
图97.单次鼻内施用RBD载体之后的纵向刺突特异性血清IgG应答。C57BL/6J小鼠(n＝20)接受单次鼻内施用的RBD载体。血清在接种前第0天和接种后第15、30、63和120天进行收集，并单独地分析以用于刺突特异性IgG的量化。结果以单位μg/ml来表示。参见实例18。
图98.单次鼻内施用RBD载体之后，在骨髓和肺部中产生IgG和IgA抗体的RBD特异性抗体分泌细胞("ASC")的量化。CD-1小鼠(n＝5)接受单次鼻内施用的RBD载体。肺部细胞(LG)和骨髓细胞(BM)在免疫后第69天("69dpi")进行收集，并且单独地分析以用于ASC通过ELISpot的量化。(A)示出了B细胞ELIspot板孔的实例。(B)示出了产生IgG和IgA的RBD特异性ASC的测量值，示为骨髓中每106个总细胞的频率或数量。(C)示出了产生IgG和IgA的RBD特异性ASC的测量值，示为肺部中每106个总细胞的频率或数量。参见实例19。
图99.单次鼻内施用RBD载体之后第168天的长寿命RBD特异性B细胞的量化。C57BL/6J小鼠(n＝4)接受单次鼻内施用的RBD载体。纵膈淋巴结在免疫后第168天(24周)进行收集，并且单独地分析以用于RBD特异性记忆B细胞通过流式细胞仪的量化。幼稚C57BL/6J(n＝5)用作阴性对照。(A)示出了流式细胞仪分析的门控策略。(B)示出了与幼稚动物相比，接种动物所测量的RBD特异性记忆B细胞的绝对数。参见实例20。
图100.单次鼻内施用RBD载体之后，在骨髓中产生IgG和IgA抗体的长寿命RBD特异性ASC的量化。C57BL/6J小鼠(n＝4)接受单次鼻内施用的RBD载体。骨髓细胞(BM)在免疫后第168天(24周)进行收集，并且单独地分析以用于ASC通过ELISpot的量化。幼稚C57BL/6J(n＝5)用作阴性对照。(A)示出了B细胞ELIspot板孔的实例。(B)示出了产生IgG和IgA的RBD特异性ASC的测量值，示为骨髓中每106个总细胞的数量。参见实例20。
具体实施方式
本发明涉及一种免疫原性组合物(例如，疫苗)，其包括编码至少一种2019年新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原(“SARS-CoV-2转基因”)的腺病毒载体；包含该免疫原性组合物的组合物；以及其用途，以用于诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答。腺病毒是一种天然存在的呼吸道病毒，通常已用作载体以将遗传物质引入细胞中，其中腺病毒载体可将SARS-CoV-2抗原基因转入鼻粘膜细胞中(经由鼻内施用)，从而导致所编码SARS-CoV-2抗原蛋白或其肽在此类细胞中的瞬时表达。随后SARS-CoV-2抗原在正常人上皮细胞中产生，可以对SARS-CoV-2抗原产生免疫应答，因为它发生在自然循环的冠状病毒(如SARS-CoV-2)中。SARS-CoV-2(初始地记录为2019-nCoV)为一种新的高病原性病毒，在2019年12月才出现。在人体中，SARS-CoV-2与世界卫生组织(WHO)官方定义的称为2019冠状病毒疾病(COVID-19)的病症有关。本文所公开组合物是靶向SARS-CoV-2并且提供针对COVID-19和相关疾病的保护的首批组合物之一。因此，本文所公开的免疫原性组合物提供用于预防和治疗这种新型的和病原性的SARS-CoV-2病毒，不存在针对该SARS-CoV-2病毒的现有治疗并且有可能保持大流行。在一些实施例中，免疫原性组合物预防和/或减小COVID-19的严重度，其通过2020年6月的FDA行业指南“预防COVID-19的疫苗的开发和许可(Development and Licensureof Vaccines to Prevent COVID-19)”和2020年10月的FDA行业指南“预防COVID-19的疫苗的紧急使用授权(Emergency Use Authorization for Vaccines to Prevent COVID-19)”所定义，每一项均以引用方式并入本文。在一些优选实施例中，免疫原性组合物减少了COVID-19的感染或病毒学确认无症状或有症状病例的发生率。在一些优选实施例中，免疫原性组合物减少了严重和/或非严重(轻度或中度)COVID-19的发病率或COVID-19相关入院的发生率。在一些优选实施例中，免疫原性组合物减少了轻度或中度COVID-19的发病率。在一些优选实施例中，免疫原性组合物减少了严重COVID-19的发病率。在一些优选实施例中，免疫原性组合物减少了COVID-19相关急诊室就诊、COVID-19住院和/或COVID-19相关死亡的发生率。在一些优选实施例中，免疫原性组合物减少了COVID-19相关疾病的严重度。在一些优选实施例中，免疫原性组合物减少了SARS-CoV-2的传播。在一些优选实施例中，免疫原性组合物减少了SARS-CoV-2的传播。
在实施例中，本发明提供了复制缺陷腺病毒载体，该复制缺陷腺病毒载体编码至少一种SARS-CoV-2抗原(例如，E1A/E3缺失的人腺病毒5型(hAd5)(hAd5-SARS-CoV-2))，和/或不同类型的感染病原体(例如，不同类型的病毒，诸如流感(例如，Ad-HA))的其它一种或多种外源性抗原，或缺乏转基因("hAdE"；例如，不编码外源性感染病原体的至少一种抗原或免疫原“空”)，以及表达盒，例如以用于包含编码序列和/或将编码序列插入载体中，该表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原(和/或不同类型的感染病原体的另一种或一种或多种外源性抗原)的SARS-CoV-2抗原编码序列。此类载体在本文统称为“SARS-CoV-2免疫载体”。如本文所讨论，此类SARS-CoV-2免疫载体(和/或包括其的免疫原性组合物)优选地用于诱导针对SARS-CoV-2(例如，针对保护性SARS-CoV-2表位，诸如刺突(S)蛋白受体结合域(RBD))的粘膜、细胞介导和/或体液免疫应答。在一些实施例中，此类SARS-CoV-2免疫载体(和/或包括其的免疫原性组合物)刺激了先天免疫应答；从而在预防性地使用的情况下，支持载体的适应性免疫，如果在暴露前时段(感染之前数天)期间或在暴露后时段期间施用的情况下，将直接地干预SARS-CoV-2感染。在一些实施例中，本发明描述了将此类载体(例如，hAd5-SARS-CoV-2和/或hAd5)施用至动物和/或人类以诱导和/或增强对于SARS-CoV-2T细胞表位(例如，显性表位)具有特异性的免疫应答(例如，产生抗体和/或CD8+T细胞(和/或其它T细胞))。在一些实施例中，此类免疫应答对SARS-CoV-2具有保护性和/或对于缓解SARS-CoV-2的症状和/或感染和/或减少SARS-CoV-2的传播为有效的，并且在一些实施例中，针对SARS-CoV-2攻击可为保护性的。因此，在一些实施例中，本发明描述了包括hAd5-SARS-CoV-2的免疫原性组合物的用途，从而针对本领域公认的SARS-CoV-2传播和感染的问题提供解决方案。
在实施例中，SARS-CoV-2抗原可为如本文所公开的刺突(S)抗原或其它SARS-CoV-2抗原，或本领域的技术人员可以以其他方式获得的抗原。在某些实施例中，SARS-CoV-2抗原可为全长刺突(S)蛋白、其免疫原性片段，或共识刺突(S)抗原，该共识刺突抗原来源于SARS-CoV-2(或密切相关SARS分离物)的多个菌株的刺突抗原的序列，该SARS-CoV-2在2019/2020年爆发期间确认并且初始地测序并提供于基因库MN908497中；NCBI参考序列：NC_045512.2(以引用方式并入本文)；还参见Tegally等人的“南非SARS-CoV-2的十六种新型品系(Sixteen novel lineages of SARS-CoV-2in South Africa)”，《自然医学(NatMed)》(2021年)，经由互联网在doi.org/10.1038/s41591-021-01255-3可获得(以引用方式并入本文，并且Tegally所引用的所有数据和代码(包括扩展数据)和Tegally等人所引用的所有参考文献据此也以引用方式并入本文)；Conti等人的“新冠状病毒-19(Sars-Cov-2)的英国变体不应产生疫苗问题(The British variant of the new coronavirus-19(Sars-Cov-2)should not create a vaccine problem)”，《生物调节剂和稳态剂杂志(J BiolRegul Homeost Agents)》，12月30日；35(1)(2020年)，经由互联网在doi:10.23812/21-3-E可获得(以引用方式并入本文)；Fiorentini等人的“2020年8月意大利的SARS-Cov-2刺突蛋白N501突变的首次检测(First detection of SARS-Cov-2spike protien N501 mutationin Italy in August,2020)”，《柳叶刀感染性疾病(Lancet Infect Dis)》(2021年)，经由互联网在doi.org/10.1016/S1473-3099(21)00007-4可获得(以引用方式并入本文，并且Fiorentini所引用的参考文献据此也以引用方式并入本文)。在一些实施例中，包括编码至少一种冠状病毒抗原的编码序列的表达盒至少包括刺突蛋白的S1和/或S2域，或其免疫原性片段(例如，刺突蛋白的S1域的RBD序列)。参见图13、图14和图15。在一些实施例中，可使用融合前稳定的刺突蛋白(例如，通过将脯氨酸残基引入S2(HR1域)中)，示为在MERS和SARS中的改善表达(参见美国专利公布No.2020/0061185A1(Graham等人；参见例如其图4))，在S1/S2裂解位点(QQAQ突变)处用NSPQQAQSVAS(SEQ ID NO:451)取代野生型氨基酸序列NSPRRARSVAS(SEQ ID NO:450)，在S2'裂解位点(融合肽截断，819-828缺失)处用KRSFIADA(SEQ ID NO:453)取代KRSFIEDLLFNKVTLADA(SEQ ID NO:452)，和/或以SRLDPPEAEV(SEQ IDNO:455)(2P突变，K986P/V987P)取代SRLDKVEAEV(SEQ ID NO:454)。本文还考虑使用其它类型的S蛋白/抗原，如本领域的技术人员所理解。参见下文的稳定的刺突蛋白抗原的设计部分。
在一些实施例中，包括编码至少一种冠状病毒抗原的编码序列的表达盒包括S1的受体结合域(RBD)和/或N-端域(NTD)。参见例如图13、图16至图21。在某些实施例中，表达盒包括编码SEQ ID NO:3(图3A)的编码序列，或编码SEQ ID NO:3的至少一个域序列(例如，B细胞表位或T细胞表位)的编码序列，或至少编码SEQ ID NO:446(图3B)的RBD域的编码序列。在实施例中，编码SARS-CoV-2抗原的腺病毒载体可为单价的或多价的(即，一种或一种以上的抗原表位)。在实施例中，表达盒包括用于更好表达和分泌编码序列的前导序列(例如，tPA)，其中编码序列任选地对于哺乳动物受试者(例如，人)进行密码子优化。在实施例中，表达盒包括RBD序列(例如，SEQ ID NO:446)，该RBD序列任选地还包括SARS-CoV-2病毒(例如，SEQ ID NO:14和15)的天然长或短侧翼序列，该侧翼序列可增强RBD的天然球状构象的表达。在实施例中，免疫原性组合物包括一种或多种重组腺病毒，其各自编码一种或多种SARS-CoV-2抗原。
在一些实施例中，本发明提供了用于诱导针对哺乳动物受试者(包括人受试者)的冠状病毒的免疫应答的组合物和方法。在某些实施例中，本文提供了包括复制缺陷腺病毒载体的免疫原性组合物，该载体包括表达盒，该表达盒包括编码序列，该编码序列编码至少一种冠状病毒抗原或其至少一个免疫原性片段。如本文所用，免疫原性组合物指代任一种或多种Ad-载体化合物或药剂或所表达的免疫原和/或抗原，其能够引发、增效、激活、诱发、刺激、加强、提升、扩增或增强适应性(特异性)免疫应答，该免疫应答可为细胞(T细胞)、体液(B细胞)和/或粘膜，或其组合。细胞应答可为鼻粘膜或呼吸道的外周T细胞应答或常驻T细胞应答。另外，细胞应答可优选地通过具有抗病毒表型的CD8+T细胞和/或CD4+T细胞来驱动(例如产生干扰素-γ)。优选地，适应性免疫应答为保护性的，该保护可包括病毒的中和(减少或消除病毒感染性)和/或症状或病毒脱落(即，传播)的减少。
在一些实施例中，本发明提供了免疫组合物，该免疫组合物包括空(即，不具有Ad5基因组中所编码的外源性非Ad病原体抗原)腺病毒载体(AdE)，其作为针对冠状病毒的治疗剂，可激发先天免疫应答(包括粘膜先天免疫应答)。参见实例2。在一些实施例中，当在暴露于SARS-CoV-2之前约两天至约20天施用AdE时，单次鼻内施用可提供保护。在一些实施例中，施用免疫原性组合物可在接种后和攻击后诱导MCP-1和IFN-γ的水平增加，从而导致单核细胞、中性粒细胞和/或淋巴细胞的募集，其随后可刺激IFN-γ的产生。在一些实施例中，施用此类免疫原性组合物可诱导IL-1α、IL-6和/或IL-12p70的显著下降(例如，与安慰剂对照相比)，这些细胞因子被证实用以介导COVID-19的肺部间质炎症。参见实例7。
在一些实施例中，本发明提供了用于鼻内(i.n.)施用AdE载体(即，复制缺陷ΔE1E3腺病毒5型(Ad5))病毒颗粒(不具有Ad5基因组中所编码的外源性非Ad病原体抗原)的试剂(例如，免疫原性组合物)和方法以赋予哺乳动物(优选地，人类)针对SARS-CoV-2的预防疗法。在优选实施例中，此类AdE免疫原性组合物可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，其为免疫原性组合物)，并且证实了可接受的安全特性。在优选实施例中，所得免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性的(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，此类AdE免疫原性组合物可用于治疗感染SARS-CoV-2的人类(例如，住院患者)。参见实例3。
在一些实施例中，本发明提供了包括表达盒的E1/E3缺失的复制缺陷hAd5，该表达盒包括前导序列(例如，组织纤溶酶原激活剂(tPA))和密码子优化核苷酸序列(编码至少一种SARS-CoV-2蛋白(例如，SEQ ID NO：2-11的任一者或多者，和/或其一个或多个片段和/或衍生物)，该SARS-CoV-2操作地连接至，启动子(例如，巨细胞病毒(CMV)))；免疫原性组合物；和利用其来诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的方法。参见实施例4。在一些实施例中，SARS-CoV-2编码序列插入hAd5的E1区域中(“hAd5-SARS-CoV-2”)。在一些实施例中，hAd5-SARS-CoV-2可基于E1和E3缺失的复制缺陷腺病毒5型载体平台(Tang等人，2009年)以表达SARS-CoV-2刺突蛋白的S1域(残基16至685(参见例如，实例14、实例16))或RBD域(S1域的残基331-527(参见例如，实例15、实例17))的人密码子优化基因(登录号QHD43416.1(SEQ IDNO:3))。在优选实施例中，此类Ad5-载体的S1和RBD转基因包括人组织纤溶酶原激活剂前导序列，并且可在巨细胞病毒即时早期启动子/增强子的控制条件下进行表达(分别参见例如，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的优选实施例)。在一些实施例中，可以采用足够数量的hAd5-SARS-CoV-2病毒颗粒(vp)或感染单位(ifu)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)经鼻内(i.n)免疫人类，从而诱导中和抗体。在一些实施例中，hAd5-SARS-CoV-2疫苗可诱导保护性应答，从而降低疾病严重度。在一些实施例中，hAd5-SARS-CoV-2组合物可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(即，其为免疫原性组合物)，并且表现出可接受的安全特性。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在一些实施例中，此类免疫原性组合物可改善感染SARS-CoV-2的患者(例如，住院患者)的临床改善和/或恢复时间。参见实例5。在一些实施例中，单次(或作为初级-加强计划的一部分，相同或不同免疫原性组合物)鼻内施用的复制缺陷Ad5载体(表达刺突蛋白的RBD域)(参见例如，优选实施例SEQ IDNO:15)刺激了血清中IgG抗体的产生，从而表明哺乳动物(优选地，人类)中系统性应答的诱导以及IgG和IgA抗体的产生。在优选实施例中，接受单次施用的高剂量疫苗的动物示出了存在针对SARS-CoV-2的中和抗体(优选地，持久的(参见例如，实例18))，如通过病灶减少中和检验(FRNT)所测量；和/或诱导了不同免疫区间的先天性和适应性免疫细胞的募集和/或增殖(参见实例13B)。在优选实施例中，施用此类免疫原性组合物可诱导哺乳动物(优选地，人类)的针对SARS-CoV-2的系统性和粘膜T细胞免疫(例如，在优选实施例中，Th-1偏向应答)，如利用流式细胞仪可确定(参见例如，实例17)。在优选实施例中，当作为单次鼻内剂量施用至哺乳动物时，包括hAd5-SARS-CoV-2的免疫原性组合物可诱导针对刺突蛋白的抗体应答，该抗体应答持久至少4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月，或至少约12个月(一年)。参见实例18。在一些实施例中，施用免疫原性组合物(例如，hAd5-SARS-CoV-2，诸如RBD载体)可诱导哺乳动物(优选地，人类)的骨髓和肺部常驻记忆抗体分泌细胞(例如，在优选实施例中，分泌抗刺突IgG和IgA两者的骨髓和肺部常驻记忆抗体分泌细胞)。参见实例19。在优选实施例中，表达SARS-CoV-2刺突RBD序列的鼻内施用的复制抑制型Ad5载体(参见例如，优选实施例SEQ IDNO:15)可在系统性和粘膜位点两者生成体液和细胞免疫应答，特别是在肺部内，其代表感染和临床疾病的主要部位(参见例如，实例20)。
在一些实施例中，本发明提供了用于鼻内(i.n.)施用rdAd抗SARS-CoV-2载体的组合(例如，“组合SARS-CoV-2组合物”)的方法，以赋予针对SARS-CoV-2的预防性疗法。参见实例10。组合SARS-CoV-2组合物的组分(例如，AdE、AdD和/或hAd5-SARS-CoV-2；“AdD”指代用于治疗和/或预防冠状病毒感染的复制缺陷腺病毒载体，可以是不表达一种或多种冠状病毒抗原但表达不同类型感染性病原体(例如，流感病毒)的一种或多种抗原的载体；“AdE”指代用于预防和/或治疗冠状病毒感染的rdAd载体，可以是不表达外源性抗原(对于来自腺病毒载体的腺病毒而言是外源的)的载体；并且“rdAD”或“rdAd”指代复制缺陷腺病毒)可包含于单一组合物中，或可包含于不同组合物中，这些不同组合物可同时或在不同时间(例如，作为初级-加强方案的一部分)和在受试者(例如，哺乳动物，优选地人类)的相同或不同位点进行施用。优选初级-加强方案包括将第一组合物施用至哺乳动物(优选地，人类)，然后在适当时间之后(在一些优选实施例中，7至21天后，优选地7天后)施用第二组合物(即，单独施用第一和第二组合物)，其中该第一和第二组合物包括相同或不同的rdAd抗SARS-CoV-2载体。在优选实施例中，组合SARS-CoV-2组合物配置成在施用所述免疫原性组合物的哺乳动物(优选地，人类)中诱导针对SARS-CoV-2的本文所公开的中和抗体、IgA和/或细胞免疫应答和/或其它应答(例如，避免或缩短Covid-19患者的住院时间)。在优选实施例中，组合SARS-CoV-2组合物可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，其为免疫原性组合物)，并且具有可接受的安全特性。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，数据示出，组合SARS-CoV-2组合物可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。
在一些实施例中，组合SARS-CoV-2组合物可包括：a)缺乏编码外源性非腺病毒抗原的编码序列的rdAd载体；b)包括表达盒的rdAd载体，该表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原(即，hAd5-SARS-CoV-2)的SARS-CoV-2抗原编码序列，任选地其中所述抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)；c)包括表达盒的rdAd载体，该表达盒包括编码序列，该编码序列编码SARS-CoV-2以外的感染性病原体的至少一种外源性抗原；d)a)和b)的载体的组合；e)b)和c)的载体的组合；f)a)、b)和c)任一者的rdAd载体的任一者的组合；和/或g)b)的两种不同类型的rdAd载体的组合(即，hAd5-SARS-CoV-2)；其中每种类型包括表达盒，该表达盒编码不同于由该组合中的至少一种其它类型的hAd5-SARS-CoV-2载体所编码的抗原的至少一种SARS-CoV-2抗原(“多价COVID-19疫苗”)。在一些实施例中，组合SARS-CoV-2组合物的组分可包括AdE和/或AdD的一者或两者和/或一种或多种类型的hAd5-SARS-CoV-2。在一些实施例中，组合SARS-CoV-2组合物可包括包含AdE和/或AdD的第一组合物，该第一组合物施用至人类，然后施用包含至少一种类型的hAd5-SARS-CoV-2的第二组合物。在一些实施例中，组合SARS-CoV-2组合物可包括至少两种类型的hAd5-SARS-CoV-2，其中每种类型的hAd5-SARS-CoV-2包括编码不同于该组合中由其它类型的hAd5-SARS-CoV-2载体所编码的抗原的至少一种SARS-CoV-2抗原的表达盒。因此，在一些实施例中，组合SARS-CoV-2组合物可包括表达第一种SARS-CoV-2抗原的第一类hAd5-SARS-CoV-2和编码第二种SARS-CoV-2抗原的第二类hAd5-SARS-CoV-2，该第二种SARS-CoV-2抗原不同于第一种SARS-CoV-2抗原。在一些实施例中，组合SARS-CoV-2组合物可包括包含AdE、AdD和/或第一类型的hAd5-SARS-CoV-2的第一组合物，该第一组合物施用至人类，然后在适当时间之后(在一些优选实施例中，7至21天后，优选地7天后)施用第二组合物(即，单独施用第一和第二组合物)，该第二组合物包括至少一种不同于第一类型hAd5-SARS-CoV-2(或第一种,其中第一组合物为AdE或AdD)的第二类型的hAd5-SARS-CoV-2。
在一些实施例中，本发明提供了包含AdD载体(即，复制缺陷ΔE1E3腺病毒5型(Ad5)病毒颗粒，其编码来源于SARS-CoV-2之外的感染性病原体的病原体抗原，例如流感，诸如NasoVAX；该NasoVAX为表达流感血凝素(HA)抗原的Ad载体(Ad5)，该Ad载体(Ad5)描述于例如提交于2020年4月6日的美国申请系列No.16/840,723中，美国申请系列No.16/840,723要求享有提交于2019年4月6日的美国申请系列No.62/830,444的优先权并公布为US2020/0316188，这两个申请的每一者以及其所引用的所有参考文献以引用方式并入本文并且公开了NasoVAX的制备；还参见美国专利No.6,706,693、No.6,716,823、No.6,348,450和美国专利出版物No.2003/0045492、No.2004/0009936、No.2005/0271689、No.2007/0178115和No.2012/0276138，这些文献可涉及制备用于施用至哺乳动物的腺病毒载体，该腺病毒载体可包括并表达流感抗原，这些专利的每一者以及其所引用的所有参考文献据此以引用方式并入)的免疫原性组合物和鼻内(i.n.)施用AdD载体的方法，以赋予针对SARS-CoV-2的预防疗法(其中提到，虽然NasoVAX为一种特定产品，但在其中术语“NasoVAX”用于本发明的情况下，技术人员既可理解该特定产品，也可以广义地理解表达流感血凝素(HA)抗原的Ad载体(Ad5)，有利地为E1和/或E3 Ad5载体)。在此类实施例中，AdD载体可诱导针对SARS-CoV-2和与AdD载体的表达外源性抗原相关联的病原体两者的先天性免疫应答，优选地保护性免疫应答。例如，NasoVAX(或更广义地，包括表达流感抗原的AdD载体的免疫原性组合物)可用于诱导针对流感和包括SARS-CoV-2的冠状病毒两者的免疫应答。这样，AdD为一种双重疫苗，诱导了针对两种呼吸道感染性病原体的先天免疫应答，和针对所表达抗原的保护性适应性免疫应答。在一些实施例中，此类免疫原性组合物可施用至已感染有SARS-CoV-2的患者，并且可改善临床改善和/或恢复的时间。在一些实施例中，然后，AdD组合物可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，其为免疫原性组合物)，并具有可接受的安全特性。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，数据示出，AdD组合物可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。在一些实施例中，NasoVAX可用作感染早期阶段的治疗；或用作COVID-19的伴随治疗，在一些实施例中，与直接抗病毒药剂(例如，氯喹、阿奇霉素)联合使用。参见实例7。在一些时刻，原料药可转变成产品，其中载体单独施用(例如，如同AdE，不含转基因)。在一些实施例中，NasoVAX可有效地减少COVID-19早期发病患者的ICU入住和机械通气的比率，和/或减少需要住院治疗的COVID-19早期发病患者的COVID-19严重度。在一些实施例中，在将NasoVAX施用至受试者之后，会导致炎症细胞因子(诸如IL-1α、IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或RANTES(CCL5))的表达减少(参见例如，实例2)；并且在一些实施例中可用于诊断COVID-19，和/或预测其恢复，并且用于相应地调整治疗方案(例如，非NasoVAX治疗)。在一些实施例中，MCP1和/或RANTES在施用NasoVAX后短期内的增加可用于预测(例如，作为标记物)COVID-19的恢复和症状的改善。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，数据示出，NasoVAX组合物可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。在优选实施例中，此类免疫原性组合物可重复地施用(例如，作为季节性疫苗，约每11至14个月施用一次)，而不诱导针对腺病毒载体自身的显著免疫应答。参见实例9。
在一些实施例中，本发明提供了在环境温度下，诸如室温下(例如，15至30℃，优选地20至25℃)稳定约3个月的腺病毒载体疫苗组合物(例如，AdD、NasoVAX)。在一些实施例中，此类腺病毒载体疫苗组合物可储存或运输，无需冷藏或特定储存条件。在某些实施例中，此类腺病毒载体疫苗组合物可配置成诱导针对SARS-CoV-2病毒(大流行冠状病菌株)感染的免疫应答和/或改善COVID-19疾病症状，并且可直接地运输至用户以用于施用至患者(有效地，鼻内施用)。参见实例8。
在一些实施例中，如本文实例2所示，将AdE施用至小鼠减少了参与由病毒(诸如流感)所引起的感染性疾病的进展和症状的某些已知的细胞因子的表达。例如，据示出，未感染小鼠(用流感)在施用AdE后第25天表现出单核细胞趋化蛋白(MCP-1(CCL2))、干扰素γ(IFN-γ)和RANTES(CCL5)的表达增加。在施用AdE后28天，此类未感染小鼠表现出MCP-1和IFN-γ的表达增加，但还表现出IL-12的表达减少。被流感激活的小鼠在施用AdE后，发现小鼠表现出IL-1α、IL-6、IL-12、MCP-1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和RANTES的表达减少。在施用AdE后第六(6)天，感染小鼠表现出IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1和GM-CSF的表达减少，和巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α(CCL3))和RANTES(CCL5)的表达增加。这些结果与SARS-CoV-2感染期间的“细胞因子风暴”的发展一致。在一些实施例中，然后，为预防和/或治疗SARS-CoV-2感染(通过，例如，禁止细胞因子风暴的发展或抑制细胞因子风暴)，SARS-CoV-2免疫原性组合物与一种或多种抗细胞因子试剂(例如，一种或多种抗IL-1α试剂、一种或多种抗IL-5试剂、一种或多种抗IL-6试剂、一种或多种抗IL-12试剂、一种或多种抗IL-17试剂、一种或多种抗MCP-1试剂、一种或多种抗TNF-α试剂、一种或多种抗GM-CSF试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂)一起施用至人类。参见实例11。在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂将不包括一种或多种抗MIPα试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。如本文所描述可使用的示例性抗细胞因子试剂可包括例如本文表1所示那些的任一者。在一些实施例中，通过适用于每种试剂的合适途径(例如，SARS-CoV-2免疫原性组合物的鼻内施用，和抗细胞因子试剂的皮下注射)，此类抗细胞因子试剂可以有效量与SARS-CoV-2免疫原性组合物一起在相同时间(即，同时)或基本上相同时间进行施用。在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂可与SARS-CoV-2组合物共同施用，并且在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂随后作为唯一活性剂进行施用。在优选实施例中，SARS-CoV-2组合物和一种或多种抗细胞因子试剂的组合可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，其为免疫原性组合物)，具有可接受的安全特性，并缓解与一些患者所经历的细胞因子的有害影响(例如，前述细胞因子风暴)有关的症状。在优选实施例中，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地，为保护性和/或治愈性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，SARS-CoV-2组合物和一种或多种抗细胞因子试剂的组合可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。
如本文所描述，本文所描述的S蛋白(刺突蛋白)免疫原、片段及其变体包含一个或多个表位，该表位引发或诱导免疫应答(优选地，保护性免疫应答)，该免疫应答可为体液应答、粘膜IgA应答和/或细胞介导免疫应答。保护性免疫应答可表现为以下至少一项：预防宿主感染有冠状病毒；调节或限制感染；协助、改善、增强或刺激宿主从感染重恢复；和产生免疫记忆，该免疫记忆将预防或限制冠状病毒的后续感染。体液应答可包括抗体的产生；该抗体中和了感染性，使病毒和/或感染细胞裂解，促进宿主细胞的病毒清除(例如，促进吞噬作用)，和/或结合至病毒抗原物质并促进病毒抗原物质的清除。抗体应答还可包括粘膜应答，该粘膜应答包括引起或诱导特异性粘膜IgA应答。在某些实施例中，提供了一种用于诱导人受试者针对SARS-CoV-2感染的粘膜、体液和/或细胞介导的组合的保护性免疫应答的方法。
本文提供了适用于和/或配置用于鼻内施用至哺乳动物受试者的药学上可接受组合物(其还可称为制剂)，该药学上可接受组合物配置成诱导针对抗原(例如，免疫原)的免疫应答并且任选地诱导保护性免疫应答(即，作为疫苗)。在一些实施例中，药物制剂为免疫原性组合物，该免疫原性组合物在施用后诱导哺乳动物受试者的针对抗原的免疫应答。在一些实施例中，药物制剂为疫苗或治疗组合物，该疫苗或治疗组合物配置成诱导哺乳动物受试者的保护性免疫应答(针对外来感染性病原体为保护性的)，并且在优选实施例中，诱导或刺激针对SARS-CoV-2感染的保护性应答。
定义
如本文所用，术语“一个”或“一种”在专利文件中通常用于包括一者或一者以上，无关于任何其它情况或“至少一者”或“一者或多者”的用法。
如本文所用，术语“或”用于指代非排他性或，使得“A或B”包括“A但非B”、“B但非A”和“A和B”，除非另行指明。
如本文所用，术语“约”用于指代大约、接近、几乎，或近似等于或等于规定量的数量，例如规定量加/减约5％、约4％、约3％、约2％或约1％。
本发明的组合物、制剂和方法可包括、基本上由以下项组成，或由以下项组成：本发明的组分和成分以及本文所描述的其它成分。如本文所用，“基本由......组成(consisting essentially of)”和“基本由......组成(consists essentially of)”意指，组合物、制剂和方法可包括额外步骤、组分或成分，但前提是这些额外步骤、组分或成分未实质性地更改所要求保护组合物、制剂和方法的基本和新颖特性。术语诸如“包括(comprises)”、“包括(comprised)”、“包括(comprising)”等与术语诸如“包括(including)”、“包含(containing)”或“特征在于(characterized by)”为同义的，并且为包容性或开放式术语(未排除额外未述及元素、组分或成分或步骤)。在这方面，本发明的目的是在本发明范围内未涵盖任何先前已知产品、制备该产品的过程或利用该产品的方法，使得申请人保留权利并且据此公开了任何先前已知产品、过程或方法的免责声明。还需指出的是，本发明不期望在本发明的范围内涵盖任何产品、过程、该产品的制备或利用该产品的方法(其不符合美国法律/USPTO(例如，35USC§112(a),(b))的书面描述、授权和/或清晰性或明确性要求或不符合EPC/EPO的充分性要求(例如，EPC第83条))，使得申请人保留权利并且据此公开了针对不符合书面描述、授权和/或清晰性/明确性和/或充分性要求和/或先前所描述或已知的产品、制备该产品的过程或利用该产品的方法的任何主题的免责声明。可能有利的是，本发明的实践符合EPC第53(c)条款和EPC第28(b)和(c)条例。明确保留在本申请谱系或任何其它谱系或任何第三方的任何先前提交申请中的申请人的任何授权专利的主题中明确地否认的任何实施例的所有权利。明确保留用以明确地否认属于任何先前提交但未先前公布的专利申请或专利的内容的所有权利(其中“先前提交但未先前公布”对应于赋予本发明的提交日期)。本文的任何内容不应理解为承诺。本申请中对任何文件的引用或识别并非承认此类文件可作为现有技术。还应指出的是，如在本说明书和所附权利要求书中所用，术语“配置”描述被构造或配置成执行特定任务或采用特定配置系统、设备或其它结构。术语“配置”可与其它类似短语互换地使用，诸如布置和配置、构造和布置、适配和配置、适配、构造、制造和布置，等等。
如本文所用，“佐剂”指代增强身体对于抗原免疫应答的物质。在实施例中，本发明单价流感药物制剂为无佐剂疫苗组合物。
所谓“施用”意指将本发明的免疫原性或疫苗组合物引入至受试者；其还可指代向受试者提供本发明的组合物的行为(例如，通过开处方或施用)。
如本文所用，术语“环境温度”为用于储存本发明单价流感药物制剂的空气温度。在实施例中，环境温度为室温，该室温诸如选自约15至30℃(优选地，约20至25℃)范围内的任何温度。
如本文所用，术语“治疗有效量”指代所施用的将诱导组合的、粘膜、体液和细胞介导的免疫应答的化合物的量。术语“治疗有效量”还指代将在一定程度上缓解或预防待治疗病症的一个或多个症状的本发明组合物的量。关于可以使用本发明的组合物来直接地治疗的病症/疾病，治疗有效量指代具有以下效果的量：预防病症/疾病发生于哺乳动物(可易患该疾病，但尚未患有或表现该病症/疾病的症状)中(预防性治疗)；缓解该病症/疾病的症状；减轻该病症/疾病的程度；稳定(例如，不恶化)该病症/疾病；预防该病症/疾病的扩散；延迟或减缓该病症/疾病进展；改善或减轻该病症/疾病状态，和其组合。术语“有效量”指代所施用化合物的量，该量将产生反应(例如，保护性免疫应答和/或疫苗所提供的反应)，该反应不同于在不存在该化合物的情况下将发生的反应。
如本文所用，术语“同源性百分比(％)”或“同一性百分比(％)”和其在两个序列(例如，蛋白序列)的语境下语法变型，指代两个或多个序列或子序列(即，其片段)具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和/或100％的核苷酸或氨基酸残基同一性(同源性)，当利用周知序列比较算法的任一者或通过视觉检查所测量时，进行比较和校准以获得最大的一致性。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例为Karlin&Altschul的算法(《美国国家科学研究院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，1990年；87:2264-2268，在Karlin&Altschul的(《美国国家科学研究院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，1993年；90:5873-5877进行修改)。用于比较两个序列的数学算法的另一非限制性实例为Myers&Miller的算法(《生物科学中的计算机应用(CABIOS)》，1988年；4：11-17)。此类算法并入ALIGN程序(2.0版)，其为GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可利用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。用于识别局部序列相似性和对比性的区域的又一可用算法为FASTA算法，如Pearson&Lipman所描述(《美国国家科学研究院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，1988年；85:2444-2448)。有利的是利用WU-BLAST(华盛顿大学BLAST)2.0版软件。用于数种UNIX平台的WU-BLAST2.0版可执行程序可从ftp://blast.wustl.edu/blast/executables进行下载。本程序基于WU-BLAST 1.4版，该WU-BLAST 1.4版继而基于公共领域NCBI-BLAST 1.4版(Altschul&Gish，1996年，“局部比对统计(Local alignment statistics)”，Doolittle编辑，《酶学方法(Methods in Enzymology)》，266:460-480；Altschul等人，《分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)》，1990年，215:403-410；Gish&States，1993年，《自然遗传学(Nature Genetics)》，3:266-272；Karlin&Altschul，1993年，《美国国家科学研究院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，90：5873-5877；所有这些期刊以引用方式并入本文)。此外，根据本定义，当本发明谈及同源性百分比(％)时，读者也可理解为同一性百分比(％)。此外，应当理解，本发明中的蛋白可不同于本发明所示出和所描述的精确序列。因此，本发明设想了所示序列的缺失、添加和取代，只要这些序列根据本发明的方法而起作用。在这方面，特别优选的取代将通常为保守性质的，即，在氨基酸家族中出现的那些取代。例如，氨基酸通常分成四个家族。(1)酸性--天门冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时归类为芳香族氨基酸。可合理预测的是，以异亮氨酸或缬氨酸独立代替亮氨酸，或反之亦然；以谷氨酸独立替换天门冬氨酸，或反之亦然；以丝氨酸替换苏氨酸，或反之亦然；或结构上相关的氨基酸的类似保守替换，对于生物活性将不具有重大影响。因此，具有与所示出和所描述的序列大体上相同但具有较少氨基酸取代(未显著地影响蛋白的免疫原性)的氨基酸序列的蛋白属于本发明的范围。关于此类蛋白，本发明范围内的核酸序列将从本文所明确公开的核酸序列类似地改变。因此，本发明涵盖了核苷酸序列，该核苷酸序列编码本文所公开抗原或蛋白的功能上和/或抗原性等同变体或衍生物，和其功能上等同片段。这些功能上等同变体、衍生物和片段显示出保留抗原活性的能力。例如，不改变所编码的氨基酸序列的DNA序列的变化，以及导致氨基酸残基的保守取代，一个或数个氨基酸缺失或增加，以及氨基酸残基被氨基酸类似物取代的那些变化是不会显著地影响所编码多肽的性质的那些变化。保守氨基酸取代为甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/蛋氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。
如本文所用，术语“人腺病毒”旨在涵盖腺病毒科的所有人腺病毒，该腺病毒科包括哺乳动物腺病毒属的成员。迄今为止，已确认了腺病毒的五十一种以上人血清型(参见例如，Fields等人，《病毒学2(Virology 2)》，第67章(第三版，Lippincott-Raven出版社))。腺病毒可为血清组A、B、C、D、E或F。人腺病毒可为血清型1(Ad1)、血清型2(Ad2)、血清型3(Ad3)、血清型4(Ad4)、血清型5(Ad5)、血清型6(Ad6)、血清型7(Ad7)、血清型8(Ad8)、血清型9(Ad9)、血清型10(Ad10)、血清型11(Ad11)、血清型12(Ad12)、血清型13(Ad13)、血清型14(Ad14)、血清型15(Ad15)、血清型16(Ad16)、血清型17(Ad17)、血清型18(Ad18)、血清型19(Ad19)、血清型19a(Ad19a)、血清型19p(Ad19p)、血清型20(Ad20)、血清型21(Ad21)、血清型22(Ad22)、血清型23(Ad23)、血清型24(Ad24)、血清型25(Ad25)、血清型26(Ad26)、血清型27(Ad27)、血清型28(Ad28)、血清型29(Ad29)、血清型30(Ad30)、血清型31(Ad31)、血清型32(Ad32)、血清型33(Ad33)、血清型34(Ad34)、血清型35(Ad35)、血清型36(Ad36)、血清型37(Ad37)、血清型38(Ad38)、血清型39(Ad39)、血清型40(Ad40)、血清型41(Ad41)、血清型42(Ad42)、血清型43(Ad43)、血清型44(Ad44)、血清型45(Ad45)、血清型46(Ad46)、血清型47(Ad47)、血清型48(Ad48)、血清型49(Ad49)、血清型50(Ad50)、血清型51(Ad51)，或其组合，但不限于这些实例。在某些实施例中，腺病毒为血清型5(Ad5)。
如本文所用，“免疫原性组合物”指代通常包括至少一种类型的如本文所公开的复制缺陷腺病毒载体和至少一种药学上可接受载体的组合物；所述组合物在施用至宿主时诱导和/或增强了针对抗原和/或感染性病原体的免疫应答，此类免疫应答指向该感染性病原体(例如，由复制缺陷腺病毒载体所编码的抗原，和/或如可由“空”hAd5载体进行诱导/增强)。“疫苗”指代这样一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物在施用时诱导了针对感染性病原体的免疫应答(例如，保护宿主免受感染性病原体的攻击)。在某些实施例中，免疫原性组合物(例如，疫苗)可包括含有和/或表达抗原的一种或多种病毒载体，以及适用于施用至哺乳动物宿主的免疫原性组合物(例如，疫苗)的其它组分；该其它组分包括例如一种或多种佐剂、缓释化合物、溶剂、缓冲剂等。在某些实施例中，免疫原性组合物和/或疫苗可包括蛋白和/或碳水化合物和/或脂质和/或其它抗原，包括但不限于一种或多种被杀死抗原(例如，杀死或完全无活性的病毒)或减毒活体抗原(例如，减毒病毒)。在一些实施例中，无论抗原来源或其功能，免疫原性组合物和/或疫苗改善了对于任何抗原的免疫应答。
如本文所用，“药学上可接受载体”指代载体或稀释剂，该载体或稀释剂不会引起对于人受试者的显著刺激并且不削弱所施用免疫原性或疫苗组合物的生物活性和性质。
如本文所用，术语“血清转换”定义为在接种疫苗(例如，施用本发明免疫原性或疫苗组合物)之后的血清中和抗体滴度(例如，抗S1/S2抗体或S1抗体的抗RBD)的4倍或更多增加。
如本文所用，术语“血清阳性”意指在接种疫苗(例如，施用本发明免疫原性组合物)之后的血清中和抗体的可测量性(例如，在体外测定中的可检测性)。
如本文所用，术语“保护”指示，保护性免疫应答已诱发，并且保护性免疫应答可表现为以下项的至少一者：预防宿主感染有冠状病毒；修饰或限制感染；协助、改善、增强或刺激感染宿主的恢复；和产生将预防或限制冠状病毒的后续感染的免疫记忆。体液应答可包括抗体的产生；该抗体中和了感染性，使病毒和/或感染细胞裂解，促进宿主细胞的病毒清除(例如，促进吞噬作用)，和/或结合至病毒抗原物质并促进病毒抗原物质的清除。抗体应答还可包括粘膜应答，该粘膜应答包括引起或诱导特异性粘膜IgA应答。如本文所用，术语“血清保护”意指受试者接种疫苗后产生血清中和抗体而受保护从而免于感染。在群体中，这称为血清保护个体的百分比(％)(例如，50％)。在实施例中，本发明免疫原性组合物和使用方法向哺乳动物受试者(诸如人受试者)提供针对SARS-CoV-2感染的血清保护。保护期可为至少约一个月到至少约14个月。血清保护可持续至少约1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月或至少约13个月。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”为用于获得有益或期望的临床结果的方式。具体地，有益或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减弱、疾病的稳定(例如，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、大体上防止疾病的扩散、疾病状态的改善或减轻，和可检测到或不可检测到的缓解(部分或全部)。此外，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还可意指相比于在未接受治疗情况下的预期生存期的延长生存期，和/或在对于疾病和/或归因于该疾病的负面影响的部分或完全治愈的方面可为治疗性的。如本文所用，术语“预防性治疗(prophylactically treat)”或“预防性治疗(prophylactically treating)”指代完全地、大体上或部分地预防宿主的疾病/病症或其一个或多个症状。类似地，“延迟病症的发病”也可包括于“预防性治疗”中，并且指代增加易患有病症患者的病症的实际发病之前时间的行为。
在本发明中，“疫苗”有利地指代包括复制缺陷腺病毒载体的组合物；该复制缺陷腺病毒载体含有并表达冠状病毒抗原或其它感染性病原体，和/或缺乏外源性抗原的编码序列(例如，空Ad载体)，以及用于诱导保护性免疫应答的疫苗制剂的其它组分，包括例如佐剂、缓释化合物、溶剂等。本发明的此类组合物(该组合物包括复制缺陷腺病毒载体，该复制缺陷腺病毒载体含有并表达冠状病毒抗原或其它感染性病原体，和/或缺乏外源性抗原的编码序列(例如，空Ad载体)，以及用于诱导保护性免疫应答疫苗制剂的其它组分，包括例如佐剂、缓释化合物、溶剂等)还可用于诱导免疫应答，并且属于本文所讨论的“免疫原性组合物”。在本发明的实施例中，疫苗或免疫原性组合物可改善对于任何抗原的免疫应答，而与抗原来源或其功能无关。
如本文所述，“载体”携带抗原的遗传密码或其一部分，然而其不是抗原自身。在一个示例性方面，载体可包括病毒载体，诸如腺病毒载体。如本文所述，“抗原”意指物质，该物质诱导和/或增强了受试者(包括人和/或动物)的针对抗原和/或表达此类抗原的感染性病原体的特异性免疫应答。抗原可包括完整生物体(灭活的、减毒的或活体的)；生物体的亚单元或部分；含有具有免疫原性性质的插入物的重组载体；在呈现至宿主动物时能够诱导免疫应答的DNA的碎片或片段；多肽、表位、半抗原；或其任何组合。在各种方面，抗原为病毒、细菌、生物体的亚单元、自身抗原或癌症抗原。
范围在此可表达为从大约一个特定值，和/或至大约另一个特定值。当表达此类范围时，另一方面包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当数值表达为近似值时，通过利用先行词约或大约，应当理解，该特定值形成另一个方面。还应当理解，范围的每一个端点相对于其它端点是重要的，并且独立于其它端点。范围(例如，90％-100％)旨在包括范围本身以及该范围内的每个独立值，如同每个数值单独地列出。
免疫原性组合物和疫苗
本文提供了复制缺陷腺病毒(“rdAd”)载体和包括其的免疫原性组合物(在一些实施例中，疫苗制剂)，适用于和/或配置用于施用至哺乳动物受试者以预防和/或治疗冠状病毒感染(“冠状病毒药物制剂”)，优选地其中冠状病毒为SARS-CoV-2。在一些实施例中，本领域技术人员已知并且制备用于施用至哺乳动物的任何腺病毒载体(Ad载体)，其可包括并表达冠状病毒抗原(优选地，SARS-CoV-2抗原)，而且不可表达外源性(即，非Ad)抗原，或可为空Ad载体(例如，无外源性抗原转基因))，可用于本申请的组合物和方法中。此类Ad-载体包括本领域技术人员已知的任一者，包括但不限于以下所描述的那些：美国专利No.6,706,693、No.6,716,823、No.6,348,450和/或美国专利公布No.2003/0045492、No.2004/0009936、No.2005/0271689、No.2007/0178115和/或No.2012/0276138；所有文献全文以引用方式并入本文。在某些实施例中，非复制腺病毒病毒载体(rdAd)为人腺病毒。在另选实施例中，腺病毒为牛腺病毒、犬腺病毒、非人灵长类腺病毒(例如，黑猩猩)、鸡腺病毒，或猪或猪型腺病毒。在示例性实施例中，非复制病毒载体为人腺病毒。在一些实施例中，非复制腺病毒载体特别适用于基因转移到真核细胞，和适用于免疫原性组合物(例如，疫苗)开发，以及适用于动物模型。
在某些实施例中，重组腺病毒载体可为非复制的或复制缺陷的(RD)，从而要求补充E1活性以用于复制。在实施例中，重组腺病毒载体可包括E1缺陷、E3缺陷和/或E4缺陷腺病毒载体，或病毒基因被缺失的“无肠”腺病毒载体。E1突变提高了载体的安全系数，因为E1缺陷腺病毒突变体在非允许性细胞中无法复制。E3突变通过破坏腺病毒下调MHC I类分子的机制从而增强了抗原的免疫原性。E4突变通过抑制后期基因表达从而降低了腺病毒载体的免疫原性，因此可允许利用相同载体的重复接种。在示例性实施例中，重组腺病毒载体为E1和E3缺陷载体。“无肠”腺病毒载体复制要求辅助病毒，表达E1a和Cre两者的特殊人293细胞系，这是自然环境中不存在的条件；该载体被剥夺了病毒基因，因此作为免疫原性组合物(例如，疫苗)载体的载体为非免疫原性的，并且可进行多次接种以用于重复接种。“无肠”腺病毒载体还包括36kb空间以用于容纳转基因，从而允许将大量的抗原基因共同递送至细胞中。特定序列基序(诸如，RGD基序)可插入至腺病毒载体的H-I环中以增强其感染性。腺病毒重组体可通过将特定转基因或转基因片段克隆到腺病毒载体(诸如下文所描述的那些)的任一者中来构建。腺病毒重组载体用于以非侵入性方式转导脊椎动物的表皮细胞，以用作免疫剂。腺病毒载体也可用于侵入式施用方法，诸如静脉注射、肌肉注射或皮下注射。
在一些实施例中，用于预防和/或治疗冠状病毒感染的此类rdAd载体可为不表达外源性抗原的载体(对于来源于腺病毒载体的腺病毒而言是外源的)，此类载体在本文称为“AdE”载体。在一些实施例中，用于治疗和/或预防冠状病毒感染的复制缺陷腺病毒载体可为不表达一种或多种冠状病毒抗原但表达不同类型感染性病原体(例如，流感病毒)的一种或多种抗原的载体(在本文称为“AdD”)。在某些实施例中，提供了包括rdAd载体的免疫原性组合物，该rdAd载体包括表达盒(该表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原的编码序列)，在本文称为hAd5-SARS-CoV-2载体。在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物可包括不同类型的此类载体(例如，AdE或AdD)，独立或与hAd5-SARS-CoV-2载体组合。在一些实施例中，这些类型的载体可共同地(或至少两个此类载体的子组)称为“rdAd抗SARS-CoV-2载体”。SARS-CoV-2免疫原性组合物(例如，疫苗)为包括一种或多种此类rdAd抗SARS-CoV-2载体的药物制剂。
AdE载体为不编码外源性抗原的rdAd载体(即，腺病毒的外源性抗原来源于腺病毒载体，例如，不同类型感染性病原体(诸如流感)的抗原)。此类hAd5载体还可称为“空的”，缺乏外源性转基因，和/或为“不含转基因的”。在一些实施例中，AdE载体可为ΔE1E3 Ad5载体(例如，缺乏病毒基因组的E1区域(核苷酸343至3511)和E3区域中的核苷酸28132至30813)。本发明提供了一些实施例，包括包含AdE载体(包括AdE病毒颗粒)的免疫原性组合物和使用此类免疫原性组合物以预防和/或治疗冠状病毒感染，优选地其中冠状病毒为SARS-CoV-2，以及其制备方法。在一些实施例中，此类AdE载体可与一种或多种其它rdAd抗SARS-CoV-2载体一起共同施用。在一些实施例中，此类共同施用可指代施用包括AdE载体和一种或多种rdAd抗SARS-CoV-2载体的单一免疫原性组合物，和/或基本上同时和/或顺序施用多种免疫原性组合物(包括AdE载体)和另一种免疫原性组合物(包括一种或多种其它rdAd抗SARS-CoV-2载体)。此类AdE载体还可作为初级-加强方案的一部分来施用，其中包括AdE的免疫原性组合物在施用包括一种或多种其它类型的rdAd抗SARS-CoV-2载体的免疫原性组合物之前或之后(例如，之前和/或之后7至28天)进行施用。在一些实施例中，本发明提供了方法，以用于通过施用(例如，鼻内地)有效量的此类组合物(例如，至少约107个感染单位(ifu)或病毒颗粒(vp)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)的AdE，和如果存在的话，至少一种其它rdAd抗SARS-CoV-2载体)而诱导(和/或增强)有需要哺乳动物受试者的针对SARS-CoV-2的免疫应答。在一些实施例中，通过施用此类免疫原性组合物而诱导或增强的针对SARS-CoV-2的免疫应答优选地在施用后约二十四小时内开始，并且优选地持续至少约21天。在优选实施例中，此类方法包括以有效量(例如，至少约107个ifu的AdE，和如果存在的话，至少一种其它rdAd抗SARS-CoV-2载体)鼻内施用此类免疫原性组合物。在优选实施例中，第二种rdAd抗SARS-CoV-2载体编码SARS-CoV-2的至少一种异源抗原和/或至少一种其它感染性病原体(例如，AdD)，从而提供药物-疫苗二合一方案。在一些实施例中，施用多次剂量的AdE载体(和/或其它rdAd抗SARS-CoV-2载体)可约间隔7、10、14、21、28、35、42、49或56天的任一者。优选地，此类免疫原性组合物可鼻内地施用。在一些实施例中，宿主为动物，诸如成人或儿童人类，任选地其中宿主为免疫功能不完全的。在优选实施例中，针对冠状病毒的免疫应答持续至少约40至50天，并且可通过重新施用具有或不具有一种或多种SARS-CoV-2载体的AdE而重新引发。本文还设想出此类AdE载体、免疫原性组合物和/或方法的其它实施例，如本领域的技术人员所理解。
AdD载体为编码冠状病毒和/或SARS-CoV-2之外的感染性病原体的外源性抗原(例如，不同类型感染性病原体的抗原，诸如流感(例如，猪型流感、季节性流感、禽流感、H1N1流感或H5N1流感))的rdAd载体。在一些实施例中，AdD载体可为编码至少一种异源(例如，非Ad)抗原的ΔE1E3 Ad5载体，优选地对于宿主(例如，哺乳动物)中的表达进行优化。可用于利用本文所述方法而产生针对SARS-CoV-2的免疫应答的抗原的代表性实例可包括流感血凝素、流感核蛋白、流感M2、破伤风毒素C片段、炭疽保护性抗原、炭疽致死因子、狂犬病糖蛋白、HBV表面抗原、HIV gp 120、HIV gp 160、人癌胚抗原、疟疾CSP、疟疾SSP、疟疾MSP、疟疾pfg和结核分枝杆菌HSP等。在一个实施例中，AdD载体可为编码A/新喀里多尼亚/20/99H1N1IFV(NC20)HA1域的AdNC.H1.1载体(参见例如，Tang等人，《疫苗专家评论(Expert RevVaccines)》，第8卷，469-481(2009年))。在一个实施例中，AdD载体可包含基因插入物；该基因插入物编码A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)类流感菌株的血凝素(HA)表面蛋白抗原(AdcoCA09.HA"NasoVAX")，优选地通过复制容许PER.C6细胞中的繁殖来制备，然后纯化感染细胞采集的病毒，并且制备为包括以下辅料的最终产品：Tris HCl(pH7.4)、组氨酸、蔗糖、氯化钠、氯化镁、聚山梨酯80、乙二胺四乙酸和乙醇。本发明提供了一些实施例，包括包含AdD载体(包括AdD病毒颗粒)的免疫原性组合物和使用此类免疫原性组合物以预防和/或治疗冠状病毒感染，优选地其中冠状病毒为SARS-CoV-2，以及其制备方法。在一些实施例中，此类AdD载体可与一种或多种其它rdAd抗SARS-CoV-2载体一起共同施用。在一些实施例中，此类共同施用可指代施用包括AdD载体和一种或多种rdAd抗SARS-CoV-2载体的单一免疫原性组合物，和/或基本上同时和/或顺序施用多种免疫原性组合物(包括AdD载体)和另一种免疫原性组合物(包括一种或多种其它rdAd抗SARS-CoV-2载体)。此类AdD载体还可作为初级-加强方案的一部分来施用，其中包括AdD载体(例如，作为病毒颗粒)的免疫原性组合物在施用包括一种或多种其它类型的rdAd抗SARS-CoV-2载体的免疫原性组合物之前或之后(例如，之前和/或之后7至21天)进行施用。在一些实施例中，本发明提供了方法，以用于通过施用(例如，鼻内地)有效量的此类组合物(例如，至少约107个病毒颗粒(vp)或感染单位(ifu)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)的AdD载体的每一者，和如果存在的话，至少一种其它rdAd抗SARS-CoV-2载体)而诱导(和/或增强)有需要哺乳动物受试者的针对SARS-CoV-2的免疫应答。在一些实施例中，通过施用此类免疫原性组合物而诱导或增强的针对SARS-CoV-2的免疫应答优选地在施用后约二十四小时内开始，并且优选地持续至少约21天。在优选实施例中，此类方法包括以有效量(例如，至少约107个vp或ifu(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)的AdD载体的每一者，和如果存在的话，至少一种其它rdAd抗SARS-CoV-2载体)鼻内施用此类免疫原性组合物。在优选实施例中，第二种rdAd抗SARS-CoV-2载体为AdE和/或编码SARS-CoV-2的至少一种异源抗原和/或至少一种其它感染性病原体，从而提供药物-疫苗二合一方案。在一些实施例中，施用多次剂量的AdD载体(和/或其它rdAd抗SARS-CoV-2载体)可约间隔7、10、14、21、28、35、42、49或56天的任一者。优选地，此类免疫原性组合物可鼻内地施用。在一些实施例中，宿主为动物，诸如成人或儿童人类，任选地其中宿主为免疫功能不完全的。在优选实施例中，针对冠状病毒的免疫应答持续至少约40至50天，并且可通过重新施用具有或不具有一种或多种SARS-CoV-2载体的AdD而重新引发。本文还设想出此类AdD载体、免疫原性组合物(包括AdD载体)和/或利用其的方法的其它实施例，如本领域的技术人员所理解。
在一些实施例中，本发明提供了免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括一种或多种SARS-CoV-2载体，该载体包括rdAd载体，该rdAd载体包括表达盒，该表达盒包括编码至少一个SARS-CoV-刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)或其至少一个免疫原性片段的编码序列，其中该组合物配置成诱导哺乳动物受试者的针对刺突蛋白RBD的中和抗体。推测研究表明，刺突蛋白经由其S1受体结合域结合至血管紧张素转换酶2(ACE2)受体。生成至少针对刺突蛋白的RBD的免疫应答为用于诱导中和抗体的有吸引力靶点，其中刺突蛋白通过首先结合至宿主受体(例如，ACE2)和然后融合病毒和宿主膜而介导冠状病毒进入宿主细胞中。SARS-CoV-2的刺突蛋白在本文提供为SEQ ID NO:3(基因库：QHD43416.1)。参见图3。
在某些实施例中，免疫原性组合物(例如，疫苗)包括一种或多种冠状病毒抗原。在某些实施例中，冠状病毒为SARS-CoV-2，其中SARS-CoV-2的编码序列在本文提供为SEQ IDNO:1。在实施例中，复制缺陷腺病毒载体包括SEQ ID NO:1的一个或多个编码序列。这些序列包括一个或多个免疫原性域，诸如B细胞和/或T细胞表位。在某些实施例中，复制缺陷腺病毒载体包括和/或表达(例如，包括表达盒编码)以所编码SEQ ID NO:2至20的任一者所提供的一个或多个免疫原性域。在优选实施例中，复制缺陷腺病毒载体包括和/或表达(例如，包括表达盒编码)SEQ ID NO:15，或其变体(即，在RBD序列中(SEQ ID NO:15的氨基酸57-253(包括SEQ ID NO:446))，和/或信号和/或前导和/或侧翼序列)。在实施例中，复制缺陷腺病毒载体的编码序列至少编码一个或多个B细胞表位、一个或多个CD8+T细胞表位，和/或一个或多个CD4+T细胞表位。利用生物信息学方法诸如在免疫表位数据库(IEDB)可获得的公众可用工具，基于感染阳性受试者的PBMC与扫描抗原序列的短线性肽相组合的体外测定，或利用扫描抗原序列的短线性或构象肽的基于血清的体外测定，本领域的技术人员理解如何确认较大序列内的那些表位。
在实施例中，复制缺陷腺病毒载体表达盒，该表达盒包括编码序列，该编码序列编码以下项的抗原：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、RBD氨基酸序列(SEQ ID NO:15的氨基酸57-253(SEQ ID NO:446))，或其免疫原性片段。在实施例中，复制缺陷腺病毒载体包括表达盒，该表达盒包括编码序列，该编码序列编码SARS-CoV-2刺突蛋白、S1域、S2域，或其免疫原性片段。在实施例中，免疫原性组合物的表达盒包括用于以下项的编码序列：刺突(S)蛋白(例如，在优选实施例中，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:12)、刺突蛋白的S1域(例如，在优选实施例中，SEQ ID NO:13)，或其免疫原性片段(例如，在优选实施例中，SEQ ID NO:14-17(图17B至图21))。在优选实施例中，编码序列编码包括SEQ ID NO:15的氨基酸57-253的RBD序列(SEQ ID NO:446)。在某些实施例中，这些编码序列包括前导信号序列，包括pTA信号序列的天然的或重组序列(例如，优选实施例，MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGS(SEQ IDNO:427))。
在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为SEQ ID NO:3中所呈现的序列，或其免疫原性片段，或与SEQ ID NO:3具有至少80％同源性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:3具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为SEQ ID NO:12中所呈现的序列，或其免疫原性片段，或与SEQ ID NO:12具有至少80％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:12具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列。在某些优选实施例中，免疫原性组合物的编码序列为SEQ ID NO:13中所呈现的序列，或其免疫原性片段，或与SEQ ID NO:13具有至少80％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:13具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为SEQ ID NO:14中所呈现的序列，或其免疫原性片段，或与SEQ ID NO:14具有至少80％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:14具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列。在某些优选实施例中，免疫原性组合物的编码序列为SEQ ID NO:15中所呈现的序列，或其免疫原性片段，或与SEQ ID NO:15具有至少80％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:15具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列。某些优选实施例中，免疫原性组合物的编码序列为SEQ ID NO:16中所呈现的序列，或其免疫原性片段，或与SEQ ID NO:16具有至少80％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:16具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列。某些优选实施例中，免疫原性组合物的编码序列为SEQ ID NO:17中所呈现的序列，或其免疫原性片段，或与SEQID NO:17具有至少80％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:17具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列。在某些优选实施例中，免疫原性组合物的编码序列为SEQ ID NO:446中所呈现的序列，或其免疫原性片段，或与SEQ ID NO:446具有至少80％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:446具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列。某些优选实施例中，免疫原性组合物的编码序列为以下项的任一者中：412-417、SEQ ID NO:438-445、SEQ ID NO:460和SEQ ID NO:475-476所呈现的序列，或其免疫原性片段，或与SEQ ID NO:412-417、SEQ ID NO:438-445、SEQ IDNO:460和SEQ ID NO:475-476具有至少80％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:412-420的任一项具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列。
在某些其它实施例中，免疫原性组合物的表达盒包括用于以下项的编码序列：刺突蛋白的S1域(例如，SEQ ID NO:13)，或其免疫原性片段。在某些实施例中，所述编码序列至少编码SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸残基331-527，其中氨基酸位置编号基于全长刺突蛋白序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与以下项具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列：SEQ ID NO:3的氨基酸残基331-527；SEQ ID NO:12；或SEQ ID NO:13；其中氨基酸位置编号基于全长刺突蛋白序列(图3)。
在某些实施例中，免疫原性组合物的表达盒包括用于以下项的编码序列：刺突蛋白的S1域(例如，SEQ ID NO:13；图17A)，或其片段(优选地，免疫原性片段)(例如，SEQ IDNO:14或15)；其中该序列包括下述残基的一者或多者：L455、F486、Q493、S494和/或N501(氨基酸位置编号基于全长刺突蛋白)。参见例如图3、图15和图17B至图21。在实施例中，编码序列包括Q493和N501。在实施例中，编码序列包括Q493。SARS-CoV-2位置455、486、493、494和/或501处的这些特定氨基酸残基据信与其受体直接地交互。基于刺突蛋白的位置455、486、493、494和/或501处的SARS-CoV-2的氨基酸的物理化学性质，这些氨基酸残基可独立地经由保守取代进行修饰。这样，可生成将潜在地捕获逃逸者(例如，病毒突变，该病毒突变逃避所获得中和抗体但仍结合至宿主受体)的替换序列，其中免疫原性组合物将基于这些替换序列而诱导中和抗体。在某些实施例中，免疫原性组合物的表达盒包括用于以下项的编码序列：刺突蛋白的S1域，S1域的RBD，或其免疫片段，其中该序列包括SEQ ID NO:16，其中455(L)选自Y、F、L或S；486(F)选自L、F、S或P；493(Q)选自L、N、Q、R或K；494(S)选自D、G、P、L或S；并且501(N)选自T、S、N或Y。在实施例中，免疫原性组合物的表达盒包括用于以下项的编码序列：刺突蛋白的S1域，S1的RBD，或其免疫原性片段，其中该序列包括SEQ ID NO:17，其中455(L)选自Y、F、L或S；486(F)选自L、F、S或P；493(Q)选自L、N、Q、R或K；494(S)选自D、G、P、L或S；并且，501(N)选自T、S、N、或Y。
在一些实施例中，免疫原性组合物的表达盒包括编码序列，以用于SEQ ID NO:13的刺突蛋白序列的分段的修饰，该分段的氨基酸序列示出于图17B(“序列”)和下文：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNF(SEQ ID NO:411)。
在一些实施例中，编码序列可编码SEQ ID NO:411的氨基酸任一者的至少一个取代。在一些实施例中，编码序列可编码SEQ ID NO:411的至少一个取代(“突变”)。优选地，SEQ ID NO:411的一个或多个取代为图17所示那些的一者。在一些实施例中，一个或多个取代可为氨基酸333-388、390-395、397-399、401-411、413-415、417-419、424、426-435、437、439-442、444-446、449、450、452、453、455-463、465、467-473、475-479、481-486、490、491、493-495、499-510或513-526的任一者或多者，其中编号对应于图17B所示。在优选实施例中，取代可为氨基酸的一者或多者，该氨基酸用作与人ACE2受体的主要接触残基，优选为氨基酸417、446、447、449、453、455、456、473、475-477、484、486、487、493、495-498、500-503和/或505(编号对应于图17B所示)。在一些实施例中，SEQ ID NO:411的取代为以下项的至少一者：氨基酸417(K)被N取代、氨基酸446(G)被V、S或A取代、氨基酸449(Y)被N取代、氨基酸453(Y)被F取代、氨基酸455(L)被F取代、氨基酸456(F)被L取代氨基酸473(Y)被V取代、氨基酸475(A)被V取代、氨基酸476(G)被S或A取代、氨基酸477(S)被N、R、T、G、A或I取代、氨基酸484(E)被Q、K、D、A或R取代、氨基酸486(F)被L或S取代、氨基酸453(Y)被F取代、氨基酸493(Q)被L或R取代、氨基酸495(Y)被N或F取代、氨基酸500(T)被I取代、氨基酸501(N)被Y、T或S取代、氨基酸502(G)被R、D或C取代、氨基酸503(V)被L、I或F取代，和/或氨基酸505(Y)被H、E、W或C取代；与之对应的编号示出于图17B中。
在实施例中，编码刺突蛋白RBD序列包括选自Y455、F455或S455的残基。在其它实施例中，编码刺突蛋白RBD序列包括选自L486或P486的残基。在某些实施例中，编码刺突蛋白RBD序列包括选自N493、R493或K493的残基。在实施例中，编码刺突蛋白RBD序列包括选自D494或G494的残基。在实施例中，编码刺突蛋白RBD序列包括选自T501或S501的残基。
稳定刺突蛋白抗原设计
针对Covid-19(例如，SARS-CoV-2)的病毒载体免疫原性组合物或疫苗的开发面临涉及以下方面的一些关键挑战：(1)病毒载体表达具有四级结构的蛋白的能力，该四级结构的蛋白代表了由冠状病毒所表达的天然预融合蛋白，并且与针对SARS-CoV-2的中和抗体的诱导是兼容的；和(2)病毒载体在其制备期间在细胞基表达系统中传播的能力，干扰是有限的，这可能与转基因刺突蛋白的伴随表达相关。
在实施例中，设计在感染细胞的表面上所表达的融合前三聚体构象中表达稳定刺突抗原的病毒载体，对于开发Covid-19免疫原性组合物或疫苗是期望的，以解决疫苗的抗原性和制备。在其它实施例中，其免疫原性片段(刺突蛋白)(诸如S1或受体结合域(RBD))对于开发Covid-19免疫原性组合物或疫苗是期望的，这也解决了免疫原性组合物或疫苗的抗原性和制备。这些激活部分是由于SARS-Cov-2刺突蛋白的“融合”性质；如本文所用，融合性质指代刺突蛋白进入宿主细胞中(例如，作为病毒颗粒的表面上的外壳蛋白)的融合性质：利用ACE2作为进入受体或当在宿主细胞上表达时，与相邻细胞融合来形成较大合胞体或合体细胞(多核宿主细胞)，以此利用独立于进入受体的这种细胞-细胞融合而极其快递地传播。通过宿主细胞蛋白酶对冠状病毒S蛋白的激发是病毒进入表达ACE2的细胞是至关重要的，并且涵盖了S1/S2和S2′位点的S蛋白裂解。SARS-CoV-2S的S1/S2裂解位点包含了数个精氨酸残基(多基的)，这指示高裂解性(Hoffmann等人，“SARS-CoV-2细胞进入取决于ACE2和TMPRSS2，并由临床证实蛋白酶抑制剂阻断(SARS-CoV-2Cell Entry Depends on ACE2 andTMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor)”；《细胞(Cell)》；2020年4月16日；181(2):271–280.e8)。S蛋白的成功构象变化(导致膜融合)不仅需要受体结合，而且需要适当蛋白酶激活。在SARS-CoV-2S蛋白的S1和S2(氨基酸682-685，RRAR)亚单元之间存在有弗林位点，类似于高致病性流感病毒中所发现的那些。该弗林位点(RRAR)不存在于其它冠状病毒S蛋白中(例如，参见Walls等人的图1C，“SARS-CoV-2刺突糖蛋白的结构、功能和抗原性(Structure,Function,and Antigenicity of the SARS-CoV-2Spike Glycoprotein)”；《细胞(Cell)》；2020年3月9日，以引用方式并入本文)，并且可导致不稳定性，从而可能混淆病毒载体疫苗开发。因此，在某些实施例中，可清除和/或修饰SARS-CoV-2刺突蛋白中的那些氨基酸残基以改善或清除SARS-CoV-2刺突蛋白所存在的S1和S2域之间的弗林酶裂解位点。
因此，用以稳定刺突蛋白的一种方式是(1)在细胞基制备中(诸如在(腺病毒)病毒载体的生产期间、并在E1互补细胞系中)的蛋白的表达期间，和/或(2)在施用病毒载体后的哺乳动物的蛋白的表达期间，使蛋白对蛋白质水解降解更耐受。蛋白质裂解位点可通过氨基酸取代、插入或缺失进行修饰，以防止或减少酶降解。这类方式所关注的蛋白质裂解位点优选地见于蛋白的溶剂可及区域，这些溶剂可及区域形成了蛋白三聚体复合物的三维结构的溶剂面向表面。这些溶剂可及位点包括S1/S2结点QTQTNSPRRARSVASQ(SEQ ID NO:25)和S2’结点PDPSKPSKRSF(SEQ ID NO:26)。其它溶剂可及区域可通过计算相对溶剂可及分数区域(SASA)的已知方法来确认。参与刺突蛋白的蛋白质裂解的潜在酶包括弗林蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶，纤溶酶、TMPRSS2、糜蛋白酶、组织蛋白酶-L、组织蛋白酶-B、TMPRSS11D、二肽基肽酶IV、MMP-13、MMP-12、MMP-2、MMP-9、MMP-3、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9。蛋白酶裂解位点可利用已知算法进行预测，诸如Proper、Properous、PeptideCutter、Pripper、CasCleave、CasCleave 2.0、CASVM和iProt-Sub。
S1/S2结点QTQTNSPRRARSVASQ(SEQ ID NO:25)从SARS-CoV-2和/或其它冠状病毒的对应序列中裂解，已证实主要依赖于精氨酸残基，诸如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:12的位置685、682和/或683的精氨酸。为干预蛋白质裂解，亲水性、非带正电的氨基酸或小氨基酸(诸如N、Q、D、E、T、S、G或A)可考虑用于精氨酸残基的取代。此外，S1/S2结点通过氨基酸的缺失或插入可保持耐受蛋白质裂解，前提是这些序列修饰不会更改刺突蛋白的三维构象以保留其抗原性和刺激中和抗体的产生的能力。对于序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:12中的位置814的赖氨酸残基和位置815的精氨酸残基，类似方法也可应用于S2'结点PDPSKPSKRSF(SEQ ID NO:26)。在实施例中，免疫原性组合物的表达盒包括SEQ ID NO:18(优选实施例)；SEQ ID NO:19(优选实施例)或SEQ ID NO:20的编码序列。参见图22至图24。因此，在某些优选实施例中，免疫原性组合物的编码序列为SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19中所呈现序列，或其免疫原性片段，或与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19具有至少80％同源性和/或同一性的序列。在某些实施例中，免疫原性组合物的编码序列为与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性和/或同一性的序列
在其它实施例中，用于稳定刺突蛋白的另一种方式包括将亚稳态刺突蛋白维持于其预融合构象中。用以将冠状病毒刺突蛋白稳定于预融合构象中的序列修饰已先前公开于Pallesen等人2017年(“合理设计预融合MERS-CoV刺突抗原的免疫原性和结构(Immunogenicity and structures of a rationally designed prefusion MERS-CoVspike antigen)”，《美国国家科学研究院学报(Proc Natl Acad Sci U S A.)》，2017年8月29日；114(35):E7348-E7357)和Wrapp等人2020年(“预融合构象中的2019-nCoV刺突的Cryo-EM结构(Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusionconformation)”，《科学(Science)》，2020年3月13日；367(6483):1260-1263)，从而示出，第一七肽重复区(HR1)和中心螺旋区(CH)之间的环路中的脯氨酸取代限制了融合蛋白的过早触发，并且通常增加了预融合胞外域的表达量。参见图22至图24和SEQ ID NO:18、19和20。
在实施例中，其它方式包括促进蛋白在感染细胞表面处的表达。刺突蛋白可保持于内质网和/或前高尔基体/高尔基体中，这一现象与跨膜和/或胞内域的性质相关联。通过取代富含半胱氨酸域中的半胱氨酸而修饰胞内域(IC)，或通过修饰C端内质网滞留基序(VKLHYT(SEQ ID NO:409))，防止胞内滞留。参见图24和SEQ ID NO:20。
在某些实施例中，在制造病毒载体期间限制转基因刺突蛋白的毒性可通过修饰刺突抗原序列内所包含的融合肽来实现。可在刺突序列中通过缺失、插入氨基酸和/或通过取代氨基酸的修饰，从而破坏融合肽的α螺旋构象。融合肽的α螺旋构象的破坏可通过用脯氨酸残基取代特定氨基酸来实现。
因此，在实施例中，针对Covid-19(表达稳定全长三聚体刺突抗原)的病毒载体免疫原性组合物或疫苗的设计可包括上文所描述的一种或多种修饰。表1(S1/S2、S2'和融合域)和表2(HR1/CH和IC域)呈现了这些修饰的实例(图22-24，SEQ ID NO:18-20)。
表1
用于增加全长刺突的稳定性或表面表达的示例性修饰
Figure GDA0003417796820000411
“.”＝保守氨基酸；X＝N、Q、D、E、T、S、G或A；和"-"＝缺失。
表2
用于增加全长刺突蛋白的稳定性或表面表达的示例性修饰
Figure GDA0003417796820000412
Figure GDA0003417796820000421
“.”＝保守氨基酸；Z＝N、Q、D、E、T、S、G或A；和"-"＝缺失。
在实施例中，本发明免疫原性组合物为多价组合物。在某些实施例中，复制缺陷腺病毒载体的表达盒还包括编码序列，该编码序列编码SARS-CoV-2结构蛋白包膜(E)、膜(M)或核衣壳(N)的一者或多者。这些结构蛋白的每一者在本文分别呈现为SEQ ID NO:5、SEQID NO:6和SEQ ID NO:10。还参见图5、6和10。在另选实施例中，这些结构蛋白可从单独复制缺陷腺病毒载体进行编码；并且提供为具有复制缺陷腺病毒载体的多价制剂，该复制缺陷腺病毒载体包括表达盒，该表达盒包括编码序列，该编码序列编码至少一种SARS-CoV-2(2019年新型冠状病毒；2019-nCoV)刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)，或其至少一个免疫原性片段。
融合后刺突抗原的中和
如上文所讨论，不同于子群B的其它β-冠状病毒，SARS-CoV-2的S蛋白包含独特的S1/S2弗林可识别位点，从而指示其S蛋白可具有独特感染性质。事实上，在活动性SARS-CoV-2感染中，合胞体细胞现象示为由感染细胞自然地形成，这在SARS-CoV-2感染中很少报道，从而证实介导膜融合的高能力(Xu Z.等人，“与急性呼吸窘迫综合征相关联的COVID-19的病理学发现(Pathological findings of COVID-19 associated with acuterespiratory distress syndrome)”，《柳叶刀呼吸道医学(Lancet Respir Med.)》2020年4月；8(4):420-422)。这些细胞病变合胞体可能是，至少部分地是COVID-19患者身上所观察的病理学的原因。另外，合胞体的形成有助于病毒通过利用独立于受体的这种细胞-细胞融合机制而极其快速地传播(受体独立传播)。因此，诱导针对S抗原(其融合后形式)的中和抗体表示用于限制合胞体的形成和/或用于防止病毒以进入受体独立方式的快速传播的手段。融合后刺突抗原在刺突蛋白通过蛋白酶的裂解之后获得的。裂解诱导了S2域的三维重排，如在Wall等人2017年(Walls等人，“冠状病毒刺突糖蛋白的构造构象变化促进了膜融合(Tectonic conformational changes of a coronavirus spike glycoprotein promotemembrane fusion)”，《美国国家科学研究院学报(Proc Natl Acad Sci US A.)》，2017年；114(42):11157–11162.)中所呈现。
在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫载体可另外或可替代地包括多核苷酸，该多核苷酸引起在不具有S1域的刺突抗原的细胞中的表达，诸如刺突的S2域(大约从SEQ ID NO:3的氨基酸残基686)，或刺突的S2'域(大约从SEQ ID NO:3的氨基酸残基816)，或从SEQ IDNO:3的残基816之外开始并且至少包括HR1、HR2和跨膜域的序列。在一些优选实施例中，这些SARS-CoV-2免疫载体诱导了免疫应答，该免疫应答中和了融合后刺突蛋白(例如，针对S2域的抗体)；并且通过防止合胞体的形成和/或通过防止病毒以独立于进入受体的方式的增殖而提供保护。在一些实施例中，免疫原性组合物的表达盒包括刺突(S)蛋白的S2部分(例如，SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23)的编码序列。在一些实施例中，免疫原性组合物的表达盒包括刺突(S)蛋白的S2部分的编码序列，该编码序列包含额外跨膜域以替换融合肽(例如，SEQ ID NO:24)。SEQ ID NO:21、22、23和24的多肽示出如下：
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGSSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:21；SARS-CoV-2刺突蛋白-S2域；具有pTA信号)；
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGSSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:22；SARS-CoV-2刺突蛋白-S2'域；具有pTA信号)；
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGSGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:23；SARS-CoV-2刺突蛋白-HR1+HR2域；具有pTA信号)；和
GPPLSSSLGLALLLLLLALLFWLYIVMGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQID NO:24；SARS-CoV-2刺突蛋白-S2'域+额外跨膜域)。
T细胞表位肽
在实施例中，SARS-CoV-2免疫载体包括长度为8个至60个氨基酸的一个或多个肽编码序列(并且如果多于一个则串联)，其中每个肽包括至少一个CD8+T细胞表位和/或至少一个CD4+T细胞表位。在这种情况下，所串联肽编码多核苷酸表达了多肽，其中T细胞表位或含有T细胞表位的序列由包含氨基酸(诸如甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸残基)的间隔序列来分开。多核苷酸还可包括编码泛素或信号肽的多核苷酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫载体包括编码一种或多种S蛋白抗原的一种或多种多核苷酸(Ahmed等人，“基于SARS-CoV免疫学研究的COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)的潜在疫苗靶点初步识别(PreliminaryIdentification of Potential Vaccine Targets for the COVID-19Coronavirus(SARS-CoV-2)Based on SARS-CoV Immunological Studies)”，《病毒学(Virology)》，254(2020年))。一种或多种S蛋白肽抗原可包括任何T细胞表位，例如表3A中所示肽的任一者：
表3A
Figure GDA0003417796820000451
Figure GDA0003417796820000461
Figure GDA0003417796820000471
Figure GDA0003417796820000481
Figure GDA0003417796820000491
Figure GDA0003417796820000501
Figure GDA0003417796820000511
在一些优选实施例中，载体可编码多个表位，单独地或作为单个多肽(例如，串联的，任选地由两个至十个氨基酸的连接子氨基酸序列所分开的)的一部分。在一些实施例中，载体可编码多个表位，如在表3B所示的示例性组中：
表3B
Figure GDA0003417796820000512
Figure GDA0003417796820000521
Figure GDA0003417796820000531
本文还设想出表位的其它组合，如本领域的技术人员所理解的。
在一些实施例中，载体可编码可为B细胞表位的下述表位的一者或多者：DVVNQNAQALNTLVKQL(SEQ ID NO:283),FFGMSRIGMEVTPSGTW(SEQ ID NO:284),EAEVQIDRLITGRLQSL(SEQ ID NO:285),GLPNNTASWFTALTQHGK(SEQ ID NO:286),EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY(SEQ ID NO:287),GTTLPK(SEQ ID NO:288),EVAKNLNESLIDLQELG(SEQ ID NO:289),IRQGTDYKHWPQIAQFA(SEQ ID NO:290),GAALQIPFAMQMAYRFN(SEQ ID NO:291),KHIDAYKTFPPTEPKKDKKK(SEQ ID NO:292),GAGICASY(SEQ ID NO:293),KHWPQIAQFAPSASAFF(SEQ ID NO:294),AISSVLNDILSRLDKVE(SEQ ID NO:295),YNVTQAFGRRGPEQTQGNF(SEQ ID NO:296),GSFCTQLN(SEQ ID NO:297),KTFPPTEPKKDKKKK(SEQ ID NO:298),ILSRLDKVEAEVQIDRL(SEQ ID NO:299),LLPAAD(SEQ IDNO:300),KGIYQTSN(SEQ ID NO:301),LNKHIDAYKTFPPTEPK(SEQ ID NO:302),AMQMAYRF(SEQID NO:303),LPQGTTLPKG(SEQ ID NO:304),KNHTSPDVDLGDISGIN(SEQ ID NO:305),LPQRQKKQ(SEQ ID NO:306),MAYRFNGIGVTQNVLYE(SEQ ID NO:307),PKGFYAEGSRGGSQASSR(SEQ ID NO:308),AATKMSECVLGQSKRVD(SEQ ID NO:309),QFAPSASAFFGMSRIGM(SEQ ID NO:310),PFAMQMAYRFNGIGVTQ(SEQ ID NO:311),QGTDYKHW(SEQ ID NO:312),QALNTLVKQLSSNFGAI(SEQ ID NO:313,50),QLPQGTTLPKGFYAE(SEQ ID NO:314),QLIRAAEIRASANLAAT(SEQ ID NO:315),QLPQGTTLPKGFYAEGSR(SEQ ID NO:316),QQFGRD(SEQID NO:317),QLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQ(SEQ ID NO:318),RASANLAATKMSECVLG(SEQ ID NO:319),TFPPTEPK(SEQ ID NO:320),RLITGRLQSLQTYVTQQ(SEQ ID NO:321),RRPQGLPNNTASWFT(SEQ ID NO:322),EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY(SEQ ID NO:323),SQASSRSS(SEQ IDNO:324),SLQTYVTQQLIRAAEIR(SEQ ID NO:325),SRGGSQASSRSSSRSR(SEQ ID NO:326)和DLGDISGINASVVNIQK(SEQ ID NO:327)；和/或其组合。在一些优选实施例中，载体可编码多个此类表位，单独地或作为单个多肽(例如，在一些实施例中，串联的，任选地由两个至十个氨基酸的连接子氨基酸序列所分开的)的一部分。
在一些实施例中，由SARS-CoV-2免疫载体所编码的SARS-CoV-2肽序列可基于刺激CD4+和CD8+T细胞应答的能力而选择，并且在一些实施例中，可基于蛋白质组区域的预测而选择，该蛋白质组区域包含一系列所选HLA等位基因中的最高数量的HLA I类和HLA II类结合基序。在一些实施例中，SARS-CoV-2序列中的HLA II类结合基序的分析可利用NetMHCpanEL 4.0来执行，该NetMHCpan EL 4.0在IEDB(http://tools.iedb.org/mhci/；Jurtz等人，“NetMHCpan-4.0：整合洗脱配体和肽结合亲和力数据的改善肽-MHC I类关联预测(NetMHCpan-4.0:Improved Peptide-MHC Class IInteraction PredictionsIntegrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data)”，《免疫学杂志(JImmunol)》，2017年；199(9):3360-3368)处可获得。在一些实施例中，NetMHCpan EL 4.0可用于确认结合基序，该结合基序至HLA I类分子具有从9至11个氨基酸的长度变化并且分配了等级百分比(等级％)。在一些实施例中，高亲和力结合肽可确认为表现出等级％≤0.1的肽，而中度亲和力结合肽可视为具有包括于>0.1和≤0.5之间的等级％的肽。在优选实施例中，NetMHCpan EL 4.0预测可以采用本文所示的18个HLA-A等位基因、32个HLA-B等位基因和20个HLA-C等位基因的集合来执行：HLA-A*01:01,HLA-A*02:01,HLA-A*02:06,HLA-A*03:01,HLA-A*11:01,HLA-A*23:0,HLA-A*24:02,HLA-A*25:01,HLA-A*26:01,HLA-A*29:02,HLA-A*30:01,HLA-A*30:02,HLA-A*31:01,HLA-A*32:01,HLA-A*33:03,HLA-A*68:01,HLA-A*68:02,HLA-A*74:01,HLA-B*07:02,HLA-B*08:01,HLA-B*13:01,HLA-B*13:02,HLA-B*14:02,HLA-B*15:01,HLA-B*15:02,HLA-B*15:25,HLA-B*18:01,HLA-B*27:02,HLA-B*27:05,HLA-B*35:01,HLA-B*35:03,HLA-B*37:01,HLA-B*38:01,HLA-B*39:01,HLA-B*40:01,HLA-B*40:02,HLA-B*44:02,HLA-B*44:03,HLA-B*46:01,HLA-B*48:01,HLA-B*49:01,HLA-B*50:01,HLA-B*51:01,HLA-B*52:01,HLA-B*53:01,HLA-B*55:01,HLA-B*56:01,HLA-B*57:01,HLA-B*58:01,HLA-B*58:02,HLA-C*01:02,HLA-C*02:02,HLA-C*02:09,HLA-C*03:02,HLA-C*03:03,HLA-C*03:04,HLA-C*04:01,HLA-C*05:01,HLA-C*06:02,HLA-C*07:01,HLA-C*07:02,HLA-C*07:04,HLA-C*08:01,HLA-C*08:02,HLA-C*12:02,HLA-C*12:03,HLA-C*14:02,HLA-C*15:02,HLA-C*16:01和HLA-C*17:01。其它HLA I类等位基因也可为合适的，如本领域的技术人员所理解的。
在一些实施例中，SARS-CoV-2多肽序列内的HLA II类结合基序可利用NetMHCII2.3来执行(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/；Jensen等人，“预测多肽与MHC II类分子结合亲和力的改善方法(Improved methods for predicting peptidebinding affinity to MHC class II molecules)”，《免疫学(Immunology)》，2018年7月；154(3):394-406)，该NetMHCII 2.3基于人工神经网络的集合，该人工神经网络关于免疫表位数据库(IEDB)的定量肽结合亲和力数据上进行培训。在一些实施例中，NetMHCII 2.3可用于确认由HLA II类分子呈递的肽，通过确定例如等级百分比(等级％)(与HLA分子的肽亲和力相关)和核心九个氨基酸结合基序。在一些实施例中，高亲和力HLA II类结合肽可确认为表现出等级％≤2的肽，而中度亲和力结合肽可视为具有>2和10的等级％。在优选实施例中，NetMHCII 2.3系统可基于本文所示的20个HLA-DR等位基因、20个HLA-DQ等位基因和9个HLA-DP等位基因的集合：DRα1*0101-DRβ1*0101,DRα1*0101-DRβ1*0301,DRα1*0101-DRβ1*0401,DRα1*0101-DRβ1*0701,DRα1*0101-DRβ1*0801,DRα1*0101-DRβ1*0802,DRα1*0101-DRβ1*0901,DRα1*0101-DRβ1*1001,DRα1*0101-DRβ1*1101,DRα1*0101-DRβ1*1201,DRα1*0101-DRβ1*1301,DRα1*0101-DRβ1*1302,DRα1*0101-DRβ1*150,DRα1*0101-DRβ1*1602,DRα1*0101-DRβ3*0101,DRα1*0101-DRβ3*0202,DRα1*0101-DRβ3*0301,DRα1*0101-DRβ4*0101,DRα1*0101-DRβ4*0103,DRα1*0101-DRβ5*0101,DPα1*0103-DPβ1*0301,DPα1*0103-DPβ1*0401,DPα1*0103-DPβ1*0402,DPα1*0103-DPβ1*0601,DPα1*0201-DPβ1*0101,DPα1*0201-DPβ1*0501,DPα1*0201-DPβ1*1401,DPα1*0301-DPβ1*0402,DPα1*0103-DPβ1*0201,DQα1*0101-DQβ1*0501,DQα1*0102-DQβ1*0501,DQα1*0102-DQβ1*0502,DQα1*0102-DQβ1*0602,DQα1*0103-DQβ1*0603,DQα1*0104-DQβ1*0503,DQα1*0201-DQβ1*0202,DQα1*0201-DQβ1*0301,DQα1*0201-DQβ1*0303,DQα1*0201-DQβ1*0402,DQα1*0301-DQβ1*0301,DQα1*0301-DQβ1*0302,DQα1*0303-DQβ1*0402,DQα1*0401-DQβ1*0402,DQα1*0501-DQβ1*0201,DQα1*0501-DQβ1*0301,DQα1*0501-DQβ1*0302,DQα1*0501-DQβ1*0303,DQα1*0501-DQβ1*0402和DQα1*0601-DQβ1*0402。其它HLAII类等位基因也可为合适的，如本领域的技术人员所理解的。
对于各自41个氨基酸长的窗口扫描SARS-CoV-2序列，分别计算了所选70个HLAI类等位基因的HLA I类结合基序的数量和所选49个HLA II类等位基因(具有高或高加(+)中度亲和力)的HLA II类结合基序的数量，并呈现于图27-70中。关于本分析，预测的跨膜域由于其高疏水性而被取消选择。基于本分析，如表4所呈现的具有34至124个氨基酸的长度变化的四十二(42)个长肽序列基于SRAS-CoV-2蛋白质组(SEQ ID NO:410)的HLA I类和/或HLAII类基序的最高含量而被选择。
表4
包含高密度HLA I类和/或HLA II类结合基序的所选SARS-CoV-2长肽序列(SEQIDNO:328至369)
Figure GDA0003417796820000571
Figure GDA0003417796820000581
Figure GDA0003417796820000591
Figure GDA0003417796820000601
Figure GDA0003417796820000611
对于每个所选长序列SEQ ID NO:328至SEQ ID NO:369，HLA I类和HLA II类等位基因(预测其高或中度结合)的数量呈现于表5中。
表5
HLA I类和HLA II类等位基因的数量，在包含高密度HLA I类和/或HLA II类结合基序的所选SARS-CoV-2长肽序列内(SEQ ID NO:328-369)预测高或中度结合
Figure GDA0003417796820000621
Figure GDA0003417796820000631
除了长肽序列SEQ ID NO:328至SEQ ID NO:369，还确认了三十九(39)个长度为31至47个氨基酸残基的较短序列。三十九个较短序列对应于SEQ ID NO:328至SEQ ID NO:369序列内的具有最高数量的HLA I类和II类结合基序的部分，示出于表6中(SEQ ID NO:370-408)。在实施例中，这些较短肽可串联以用于从腺病毒载体的插入和表达。
表6
包含高密度HLA I类和/或HLA II类结合基序的所选SARS-CoV-2较短序列(SEQ IDNO:370至408)
Figure GDA0003417796820000641
Figure GDA0003417796820000651
Figure GDA0003417796820000661
对于SEQ ID NO:370-408(表3)的每一者，HLA I类和HLA II类等位基因(预测其高或中度结合)的数量呈现于表7中。
表7
HLA I类和HLA II类等位基因的数量，在包含高密度HLA I类和/或HLA II类结合基序的所选SARS-CoV-2较短肽序列(SEQ ID NO:370-408)内进行预测其高或中度结合
Figure GDA0003417796820000662
Figure GDA0003417796820000671
Figure GDA0003417796820000681
对于SEQ ID NO:328至SEQ ID NO:369的每个所选序列，HLA I类和HLA II类结合基序的图谱呈现于图29-70中。在图29-70中，每个HLA I类和II类基序中的N-端氨基酸(即，氨基酸#1)由X或O来标识，其中X还指示HLA结合基序的高亲和力并且O指示HLA结合基序的中度亲和力。参考每个图所示的SEQ ID编号，示例性HLA结合基序可通过以下方式从图29-70进行推导：包括基序中X或O氨基酸残基，和随后的包括八个至十个氨基酸，使得每个基序包括九个至十一个氨基酸残基(即，每个基序为9至11个氨基酸的肽)。任何此类结合基序可单独和/或组合地用作本文所公开载体中的免疫原。SEQ ID NO:328-369的任一者的其它结合基序也可适用于包括于本文的SARS-CoV-2免疫载体中，如本领域技术人员所理解的。
匹配循环性SARS-CoV-2变体的RBD序列
如上文所描述，rdAd载体可设计成编码与以下项同源性的序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15，或包括具有或不具有额外侧翼残基并且并入单个或多个RBD突变(如图17B所描述的那些)的SEQ ID NO:446的任何序列。优选地，RBD变体序列可包括单个或组合突变，该单个或组合突变处于氨基酸位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504和/或505，其中氨基酸位置编号对应于SEQ ID NO:3(全长刺突蛋白)(图17B)。更优选地，RBD序列包括位置K417T、K417N、E484K、L452R和/或N501Y处的单个或组合突变(图17B)。在优选实施例中，RBD变体蛋白序列可选自SEQ ID NO:412-417，其中RBD序列加下划线：
SARS-CoV加利福尼亚CAL.20C B.1.429品系的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKCVFNFN(SEQ ID NO:412)
SARS-CoV巴西P.2品系B.1.1.28.2品系的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKCVFNFN(SEQ ID NO:413)
SARS-CoV英国VOC 202012/01；B.1.1.7品系(又名20I/501Y.V1)的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKCVFNFN(SEQ ID NO:414)
SARS-CoV英国B.1.1.7品系(E484K)的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKCVFNFN(SEQ ID NO:415)
SARS-CoV巴西P.1品系B.1.1.28.1品系(又名20J/501Y.V3)的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKCVFNFN(SEQ ID NO:416)
南非501Y.V2 B.1.351品系(又名20H/501Y.V2)：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKCVFNFN(SEQ ID NO:417)
在优选实施例中，将由rdAd(单价RBD载体)表达的RBD序列将前接有前导/信号肽序列，以解决多肽以细胞分泌途径的表达。表9描述了有效靶向哺乳动物细胞中所表达的重组蛋白的常用前导肽序列。
表9
Figure GDA0003417796820000701
Figure GDA0003417796820000711
变体RBD序列和多价疫苗组合物
还可有利的是开发多价免疫原性组合物或疫苗，其提供针对共同循环性SARS-CoV-2变体和未来变体的免疫力。在一些实施例中，多价遗传免疫原性组合物或疫苗组合物可通过组合数几种单价遗传免疫原性组合物或疫苗组合物(在同一制剂中各自表达抗原序列变体)来实现。在一些实施例中，单一遗传构建体也可构建成共同表达多个抗原序列变体，以提供多价RBD SARS-CoV-2免疫原性组合物或疫苗组合物。在一些实施例中，例如，本发明的rdAd载体可包括一个或多个表达盒，该表达盒包括SARS-CoV-2抗原编码序列，该编码序列在刺突蛋白RBD区并入了一个或多个突变并且将能够针对流行性SARS-CoV-2变体和潜在未来变体进行保护。在一些实施例中，单一遗传构建体可包括在单个表达盒中所共线排列的多个RBD变体单元。RBD变体单元可选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15，或包括具有或不具有额外侧翼残基并且并入单个或多个RBD突变(如图17B所描述的那些)的SEQ ID NO:446的任何序列。每个RBD变体单元可通过包括例如甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基的柔性间隔序列与共线排列中的其它RBD变体隔开。在优选实施例中，间隔肽可包括氨基酸序列(GGGGS)n、(GGGGA)n、(GGGGQ)n、(GGGPS)n、(GPGPG)n和其组合，其中n处于1和10之间。其它间隔物(优选地，亲水性性质并且包括极性氨基酸)也可为合适的，如本领域的技术人员所理解的。在一些实施例中，间隔物可包括前蛋白转化酶(PC)的一个或多个蛋白质裂解基序；该前蛋白转化酶还称为真核枯草杆菌酶，由一组丝氨酸蛋白酶表示，该丝氨酸蛋白酶包括弗林酶(PACE)、PC1(PC3)、PC2、PC4、PACE4、PC5(PC6)和PC7(LPC、PC8)，它们通过在多基本基序处裂解前体蛋白而生成生物活性蛋白和肽，诸如激素、受体和生长因子。在优选实施例中，此类多基本基序包括下表所描述的一者：
表8
Figure GDA0003417796820000721
X＝任何天然氨基酸；↓＝裂解位置
间隔序列优选地进行优化，以避免在伪蛋白序列内引入新表位。此外，不同间隔物可在相同序列中进行组合。在一些实施例中，间隔物可包括柔性部分和可裂解部分。在一些实施例中，不同间隔序列可用于相同多价构建体内的RBD变体单元之间。在优选多价RBD载体中，相同遗传序列中所共线排列的RBD变体单元的数量可为2至10个单元，优选地2至6个单元。RBD变体序列的相应次序也可改变；引入了间隔物的用途使得每个RBD变体单元在免疫原上为独立的。每个RBD变体单元可包括任何单一突变或突变组合，如图17B所描述的那些。
优选地，RBD变体序列可包括位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504和/或505处的单一或组合突变(图17B)。更优选地，RBD序列包括位于K417T、K417N、E484K、L452R和/或N501Y处的单一或组合突变，其中氨基酸位置编号对应于SEQ ID NO:3(全长刺突蛋白)(图17B)。SEQ ID NO:438至443和460提供为RBD变体序列的优选实施例，其可用于设计多价RBD载体。包括多个RBD变体单元的多价RBD序列的优选实例呈现为SEQ IDNO:444、SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:475和SEQ ID NO:476。在优选实施例中，将由rdAd(“多价RBD载体”，一种类型的多价hAd5-SARS-CoV-2)表达的多价RBD序列将前接有前导/信号肽序列，以解决多肽以细胞分泌途径的表达。表9描述了有效靶向哺乳动物细胞中所表达的重组蛋白的常用前导肽序列。
在优选实施例中，RBD变体蛋白序列可选自SEQ ID NO:438-443和460，并且示例性多价RBD构建体示出于下文SEQ ID NO:444、445、475和476，其中RBD序列加下划线：
SARS-CoV的刺突RBD(基因库：MN908947.3)：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKSVNFTF(SEQ ID NO:438)(CVFNFN被SVNFT取代)
SARS-CoV加利福尼亚CAL.20C B.1.429品系的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKSVNFTF(SEQ ID NO:439)(CVFNFN被SVNFT取代)
SARS-CoV巴西P.2品系B.1.1.28.2品系的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKSVNFTF(SEQ ID NO:440)(CVFNFN被SVNFT取代)
SARS-CoV英国VOC 202012/01；B.1.1.7品系(又名20I/501Y.V1)的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKSVNFTF(SEQ ID NO:460)(CVFNFN被SVNFT取代)
SARS-CoV英国B.1.1.7品系(E484K)的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKSVNFTF(SEQ ID NO:441)(CVFNFN被SVNFT取代)
SARS-CoV巴西P.1品系B.1.1.28.1品系(又名20J/501Y.V3)的刺突RBD：
TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLY NSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKV GGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAP ATVCGPKKSTNLVKNKSVNFTF(SEQ ID NO:442)(CVFNFN被SVNFT取代)
南非501Y.V2 B.1.351品系(又名20H/501Y.V2)：
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包括SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:443和SEQ ID NO:441的多价RBD构建体组合：
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包括SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:443和SEQ ID NO:441的多价RBD构建体组合：
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包括SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:440、SEQ ID NO:441、SEQ IDNO:442和SEQ ID NO:443的多价RBD构建体组合：
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包括SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:440、SEQ ID NO:441、SEQ IDNO:442和SEQ ID NO:443的多价RBD构建体组合：
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本文还设想出其它肽、多肽、构建体和其组合，如本领域的技术人员所理解的。
受体结合拮抗剂
在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫载体(即，表达一种或多种外源性抗原的那些)可包括编码一种或SARS-CoV-2阻断蛋白(例如，受体结合拮抗剂)的多核苷酸。例如，已知冠状病毒(诸如SARS-CoV-2)将刺突(S)蛋白的同源三聚体用于宿主细胞附接、融合和进入该宿主细胞中，并且可涉及唾液酸和/或ACE2(细胞膜C-端锚定蛋白，其促进血管紧张素I裂解为血管紧张素1-9，以及血管紧张素II裂解为血管扩张剂血管紧张素1-7，从而在系统性血压调节中发挥重要作用(Alifano等人，“肾素-血管紧张素系统为COVID-19大流行的核心(Renin-angiotensin system at the heart of COVID-19 pandemic)”，《生物化学(Biochimie)》,174:30-33(2020年))。已知宿主细胞蛋白酶处理冠状病毒S蛋白以生成两个亚单元(S1和S2)，这两个亚单元保持非共价结合于病毒的融合前构象中(参见例如，Tortorici等人，“附接至唾液酸受体的人冠状病毒的结构基础(Structural basis forhuman coronavirus attachment to sialic acid receptors)”，《自然结构与分子生物学(Nat.Struc.Mol.Biol.)》,26:481-489(2019年))。S1亚单元包括四个域NTD、RBD、SD1和带有NTD和RBD且由如图13所呈现的连接子序列分开的SD1。在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫载体可另外或可替换地包括多核苷酸，该多核苷酸引起S1域的至少一者或两者(NTD和/或RBD)或作为全长S蛋白(具有或不具有跨膜域)的一部分，和/或其免疫原性片段在细胞中的表达；在一些优选实施例中，诱导了干预S蛋白(例如，针对S1 RBD和/或NTD域的抗体)结合至上文所述及唾液酸和/或ACE2的免疫应答，从而干预SARS-CoV-2进入宿主细胞和/或影响ACE2。在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫载体可另外或可替换地包括多核苷酸，该多核苷酸引起可结合至S蛋白(例如，S1 RBD和/或其NTD域，和/或S2)的蛋白(例如，抗体或其片段，或肽(例如，ACE2模拟物、RBD结合肽))在细胞中的表达，从而干预SARS-CoV-2进入宿主细胞(例如，阻断S蛋白至其宿主细胞受体(诸如ACE2)的结合)和/或其对ACE2(统称为“RBD结合剂”)的影响。在一些实施例中，RBD结合剂可为具有对应于ACE2的病毒结合域的至少一个阈的肽，例如构象上匹配RBD的肽。在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫载体可另外或可替换地包括多核苷酸，该多核苷酸引起可结合至ACE的蛋白(例如，ACE2结合剂)在细胞中的表达；和/或可以其它方式防止S蛋白(例如，其S1 RBD和/或NTD域，和/或S2，可表达为自由蛋白)附接至其上，从而干预SARS-CoV-2进入宿主细胞和/或其对ACE2的影响，优选地不会干预ACE2的正常生理功能(即，其用作SARS-CoV-2的受体的能力之外)。在一些实施例中，此类ACE2结合剂可为肽，诸如干预SARS-CoV-2结合至ACE2的肽。在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫载体可包括编码RBD结合剂和ACE2结合剂两者的一种或多种，和/或双重RBD结合剂和ACE2结合剂的多核苷酸。在优选实施例中，RBD结合剂和/或ACE2结合剂干预在ACE2的15个残基的一者或多者(24(Q)、27(T)、30(D)、31(K)、34(H)、35(E)、37(E)、38(D)、41(Y)和42(Q)位于α1，一个残基(残基82M)得自α2，残基353(K)、354(G)、355(D)和357(R)得自β3和β4之间的连接子)处ACE2和RBD的相互作用，这些残基当前理解为与RBD相互作用(Han等人，“SARS-CoV-2的ACE2基肽抑制剂的计算设计(Computational Design of ACE2-Based PeptideInhibitors of SARS-CoV-2)”，《ACS纳米(ACS Nano)》,2020年，公布日期：2020年4月14日，(https://doi.org/10.1021/acsnano.0c02857)；Yan等人，“通过全长人ACE2识别SARS-CoV-2的结构基础(Structural Basis for the Recognition of the SARS-CoV-2byFull-Length Human ACE2)”，《科学(Science)》，367:1444-1448(2020年))；优选地，不影响ACE2蛋白的正常生理功能(即，其用作SARS-CoV-2的受体的能力之外)。因此，在一些实施例中，本发明的SARS-CoV-2免疫载体可包括一种或多种多核苷酸，该多核苷酸编码可结合以及阻断ACE2受体(增加免疫之外的额外活性)的分泌抗原(例如，S1、NTD、RBD、ACE2结合剂)。
病毒载体佐剂
在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫载体可另外或可替换地包括至少一种多核苷酸，该多核苷酸编码多肽和/或肽，该多肽和/或肽改善或增强了载体(例如，作为佐剂(例如，分子佐剂))的免疫原性；该载体由宿主细胞表达并且协助诱导抗SARS-CoV-2免疫应答，和/或增强了持续存在的抗SARS-CoV-2免疫应答，该抗SARS-CoV-2免疫应答源于将载体施用至宿主(例如，在优选实施例中，不会诱导系统性炎症应答，该系统性炎症应答可干预SARS-CoV-2感染的患者的恢复)。例如，在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫载体可编码一者或多者：1)多肽或肽，该多肽或肽用作“共刺激”组分，诸如，例如结合以下项：CD28家族成员(即，CD28，ICOS；Hutloff等人，《自然(Nature)》，1999年，397:263–265；Peach等人，《实验医学杂志(J Exp Med)》，1994年，180:2049–2058)，诸如CD28结合多肽B7.1(CD80；Schwartz，1992年；Chen等人，1992年；Ellis等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，156(8):2700-9)和B7.2(CD86；Ellis等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，156(8):2700-9)；整联蛋白家族的成员(即，LFA-1(CD11a/CD18)；Sedwick等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，1999年，162:1367–1375；Wülfing等人，《科学(Science)》，1998年，282:2266–2269；Lub等人，《当代免疫学(Immunol Today)》，1995年，16:479–483)，包括ICAM家族的成员(即，ICAM-1,-2或-3)；CD2家族成员(即，CD2，信号淋巴细胞激活分子(CDw150或“SLAM”；Aversa等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，1997年，158:4036–4044)，诸如CD58(LFA-3；CD2配体；Davis等人，《当代免疫学(Immunol Today)》，1996年，17:177–187)或SLAM配体(Sayos等人，《自然(Nature)》，1998年，395:462–469)；热稳定抗原(HSA或CD24；Zhou等人，《欧洲免疫学杂志(Eur JImmunol)》，1997年，27:2524–2528)；TNF受体(TNFR)家族的成员(即，4-1BB(CD137；Vinay等人，《免疫学研讨文辑(Semin Immunol)》，1998年，10:481–489))，OX40(CD134；Weinberg等人，《免疫学研讨文辑(Semin Immunol)》，1998年，10:471–480；Higgins等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，1999年，162:486–493)，和CD27(Lens等人，《免疫学研讨文辑(SeminImmunol)》，1998年，10:491-499))，诸如4-1BBL(4-1BB配体；Vinay等人，《免疫学研讨文辑(Semin Immunol)》，1998年，10:481-48；DeBenedette等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，1997年，158:551–559)，TNFR关联因子-1(TRAF-1；4-1BB配体；Saoulli等人，《实验医学杂志(J Exp Med)》，1998年，187:1849-1862；Arch等人，《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》，1998年，18:558–565)，TRAF-2(4-1BB和OX40配体；Saoulli等人，《实验医学杂志(J ExpMed)》，1998年，187:1849-1862；Oshima等人，《国际免疫学(Int Immunol)》，1998年，10:517-526；Kawamata等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》，1998年，273:5808–5814)；TRAF-3(4-1BB和OX40配体；Arch等人，《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》，1998年，18:558–565；Jang等人，《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)》，1998年，242:613-620；Kawamata S等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》，1998年，273:5808–5814)；OX40L(OX40配体；Gramaglia等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，1998年，161:6510–6517)；TRAF-5(OX40配体；Arch等人，《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》，1998年，18:558-565；Kawamata等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》，1998年，273:5808–5814)；和CD70(CD27配体；Couderc等人，《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)》，5(3):163-75)；CD154(CD40配体或“CD40L”；Gurunathan等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，1998年，161:4563-4571；Sine等人，《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》，2001年，12:1091-1102)；2)一种或多种细胞因子(例如，如对于逆转录病毒所描述，Ohs等人，“用作针对逆转录病毒感染的接种的遗传佐剂的白细胞介素编码腺病毒载体(Interleukin-Encoding Adenoviral Vectors as GeneticAdjuvant for Vaccination against Retroviral Infection.)”，《公共科学图书馆期刊(PLos One)》，8(12):e82528(2013年12月))，诸如白细胞介素-2(IL-2)(Rosenberg等人，《自然医学(Nature Med.)》，4:321-327(1998年))、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(Pardoll所审查，1992年；Harries等人，《基因医学杂志(J.Gene Med.)》，2000年7月-8月；2(4):243-9；Rao等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，156:3357-3365(1996年))、IL-15(Xin等人，《疫苗(Vaccine)》，17:858-866，1999年)、IL-16(Cruikshank等人，《白细胞生物学杂志(J.LeukBiol.)》，67(6):757-66，2000年)，IL-18(《癌症研究与临床肿瘤学杂志(J.CancerRes.Clin.Oncol.)》，2001年，127(12):718-726)，GM-CSF(CSF(Disis等人，《血液(Blood)》，88:202-210(1996年))、IL-23、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或干扰素(例如，干扰素-γ(INF-γ))；3)趋化因子，诸如包括CXCL10(IP-10)和CCL7(MCP-3)的融合蛋白，该融合蛋白融合至肿瘤自身抗原，该肿瘤自身抗原已示出诱导抗肿瘤免疫性(Biragyn等人，《自然生物(Nature Biotech.)》,1999年，17:253-258)、CCL3(MIP-1α)，和/或CCL5(RANTES)(Boyer等人，《疫苗(Vaccine)》，1999年，17(补编2):S53-S64)；4)免疫抑制蛋白和/或肽，诸如抗CTLA-4剂(Shrikant等人，《免疫(Immunity)》，1996年，14:145-155；Sutmuller等人，《实验医学杂志(J Exp Med)》，2001年，194:823-832)、抗CD25剂(Sutmuller，同上)、抗CD4剂(Matsui等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，1999年，163:184-193)、融合蛋白IL13Rα2-Fc(Terabe等人，《自然免疫学(Nature Immunology)》，2000年，1:515-520)、抗细胞因子剂(例如，抗体或其片段，诸如抗IL6、抗IL6受体、抗IL17(例如，BMS-945429(ALD518)、克拉扎珠单抗、达必妥单抗、伊斯利莫单抗、奥洛珠单抗(CDP6038)、司妥昔单抗(Sylvant)、西卢卡单抗(CNTO 136)、托珠单抗(Actemra)；还参见本文表4所列出的药剂)；5)一种或多种TLR激动剂(LPS模拟7-mer肽(TLR4激动剂；例如，Gln Glu Ile Asn Ser Ser Tyr(SEQ ID NO:463)(RS01)；Ser His Pro Arg Leu Ser Ala(SEQ ID NO:464)(RS02)；Ser Met Pro Asn ProMet Val(SEQ ID NO:465)(RS03)；Gly Leu Gln Gln Val Leu Leu(SEQ ID NO:466)(RS04)；His Glu Leu Ser Val Leu Leu(SEQ ID NO:467)(RS05)；Tyr Ala Pro Gln ArgLeu Pro(SEQ ID NO:468)(RS06)；Thr Pro Arg Thr Leu Pro Thr(SEQ ID NO:469)(RS07)；Ala Pro Val His Ser Ser Ile(SEQ ID NO:470)(RS08)；Ala Pro Pro His AlaLeu Ser(SEQ ID NO:471)(RS09)；Thr Phe Ser Asn Arg Phe Ile(SEQ ID NO:472)(RS10)；Val Val Pro Thr Pro Pro Tyr(SEQ ID NO:473)(RS11)；和Glu Leu Ala Pro AspSer Pro(SEQ ID NO:474)(RS12))；或鞭毛蛋白(TLR5激动剂(例如，FliC；Skountzou等人，“沙门氏菌鞭毛蛋白为鼻内施用全灭活流感疫苗的强效佐剂(Salmonella flagellins arepotent adjuvants for intranasally administered whole inactivated influenzavaccine)”，《疫苗(Vaccine)》，5月28日；28(24):4103-4112(2010年))；例如，整合有TLR激动剂序列的S1亚单元(Kim等人，“微针阵列递送重组冠状病毒疫苗：免疫原性和快速转化发展(Microneedle array delivered recombinant coronavirus vaccines:Immunogenicity and rapid translational development)”，《电子生物医学(EBioMedicine)》，(2020年))；以及它们的组合。本文还设想出其它类型的分子佐剂的用途，如本领域的技术人员所理解。
制剂
在一些实施例中，包含并表达SARS-CoV-2刺突(S)抗原或其免疫原性片段(其可对于人受试者进行密码子优化)的复制缺陷腺病毒载体可与其它冠状病毒抗原(例如，病毒载体表达抗原)进行组合以形成多价冠状病毒药物制剂。其它组分可包括在内，以诱导针对不同于即时腺病毒载体(包含刺突蛋白抗原)中所呈现的表位的体液抗体应答。在其它实施例中，其它组分可包括在内，以诱导针对冠状病毒抗原的免疫系统的不同方式，诸如细胞介导的或粘膜免疫应答。
在某些实施例中，本文提供了适用于鼻内施用至人受试者的单价或多价冠状病毒药物制剂，该药物制剂包括：有效量的至少107个病毒颗粒(vp)或感染单位(ifu)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)的rdAd载体(例如，一种或多种SARS-CoV-2载体)；和药学上可接受赋形剂、稀释剂和/或载体。在一些实施例中，rdAd载体包含并表达对于人受试者进行密码子优化的SARS-CoV-2刺突抗原或其免疫原性片段；和药学上可接受赋形剂、稀释剂和/或载体。在某些实施例中，有效量诱导了保护性免疫应答，该保护性免疫应答被配置成向人受试者提供针对SARS-CoV-2感染的血清保护、粘膜保护或细胞保护(例如，基于细胞免疫应答，诸如T细胞)至少1个月(例如，28天或4周)、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月、至少12个月、至少13个月或至少14个月。至少1个月到至少14个月的时段可视为保护的持续时间。在某些实施例中，保护性免疫应答包括粘膜、体液和/或T细胞应答的组合。在实施例中，保护性免疫应答经由单次鼻内剂量来诱导。在可替换实施例中，保护性免疫应答经由两次或更多次鼻内剂量来诱导，例如初次剂量，然后2至3周后的加强剂量。
在示例性实施例中，本文提供了适用于鼻内施用至人受试者的SARS-CoV-2免疫原性组合物(例如，疫苗)，该免疫原性组合物包括：有效量的至少107个病毒颗粒(vp)或感染单位(ifu)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)的复制缺陷腺病毒载体，该复制缺陷腺病毒载体包括表达盒，该表达盒包括编码序列，该编码序列至少编码对于人受试者进行密码子优化的SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)或其至少一个免疫原性片段，其中该组合物配置成诱导人受试者的针对刺突蛋白RBD的中和抗体；和药学上可接受赋形剂、稀释剂和/或载体。
关于重组病毒及其表达产品的剂量、施用途径、制剂、佐剂和用途，本发明的组合物可用于肠外、局部或粘膜施用，优选地通过皮内、皮下、鼻内或肌肉内途径。当利用粘膜施用时，可能的是利用口腔、眼部或鼻腔途径。在示例性实施例中，本发明免疫原性组合物(例如疫苗)鼻内地施用。在示例性实施例中，本发明免疫原性组合物(例如，疫苗)鼻内地施用至哺乳动物受试者。在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫原性组合物可利用诸如微针的装置来施用(例如，Kim等人，《电子生物医学(EBioMedicine)》，00(2020年))。
包括感兴趣的腺病毒载体的免疫原性组合物(例如，制剂)可根据制药或兽医领域的技术人员所周知的标准来制备。参见实例1和实例2。考虑到年龄、性别、体重和施用途径等因素，此类制剂可以临床领域的熟练人员所周知的剂量和技术来施用。制剂可单独地施用(即，作为唯一活性剂)，或可与组合物，例如与“其它”免疫原性组合物或减毒、灭活、重组免疫原性组合物(例如，疫苗)或治疗性组合物一起共同施用或依序施用，从而提供本发明的多价或“鸡尾酒式”或组合组合物以及其使用方法。在一些实施例中，制剂可包括作为防冻剂的蔗糖和作为非离子表面活性剂的聚山梨酸酯-80。在某些实施例中，制剂还包括自由基氧化抑制剂乙醇和组氨酸、金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)，或具有类似活性的其它药剂(例如，阻断或防止金属离子催化的自由基氧化)。
组合物(例如，制剂)可存在于用于粘膜(例如，口腔、鼻腔、眼部等)施用的液体剂型(诸如悬浮液)中，和用于肠外、皮下、皮内、肌肉内、静脉(例如，可注射施用)的制剂(诸如，无菌悬浮液或乳剂)中。在此类制剂中，腺病毒载体可与合适载体、稀释剂或赋形剂混合，诸如无菌水、生理盐水、增粘赋形剂等。可使用用于粘膜施用的某些专门制剂，包括粘膜粘合剂、粘膜渗透剂和粘膜破坏剂。制剂还可为冻干或冷冻的。制剂可包含辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲液、佐剂、防腐剂等，取决于施用途径和所需剂型。制剂可包含至少一种佐剂化合物。在示例性实施例中，本发明免疫原性组合物(例如，疫苗)为无佐剂的。可查询标准文本(诸如，《雷明顿医药科学(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE)》，第17版，1985年，以引用方式并入本文)，以制备合适剂型而无需过度实验。
在一些实施例中，有效量(例如，诱导保护性免疫应答的量)的腺病毒载体为至少107个病毒粒子(vp)或感染性单位(ifu)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)的复制缺陷腺病毒载体，该复制缺陷腺病毒载体包含并表达冠状病毒刺突蛋白抗原，或其片段(对于人受试者进行密码子优化)。如本领域技术人员所理解，密码子优化提高宿主生物体中异源基因的表达。
在优选实施例中，“有效量”的腺病毒载体和/或免疫原性组合物为以足以诱导抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，体液、粘膜和/或细胞介导免疫应答)的形式、剂量和/或施用方案施用至宿主的量；在一些实施例中，抗SARS-CoV-2免疫应答对于SARS-CoV-2感染(和/或CoV疾病进展)可为保护性的。在一些实施例中，诸如本文实例所描述，施用了有效量的宿主可表现出能够产生抗SARS-CoV-2抗体的细胞(例如，B细胞、浆细胞)的诱导(例如，出现)和/或数量和/或功能的增加；抗SARS-CoV-2抗体产生细胞产生了结合至CoV和/或其抗原(或免疫原)的抗体，诸如SARS-CoV-2特异性免疫球蛋白G(IgG)应答。在一些实施例中，诸如本文实例所描述，施用了有效量的宿主可表现出能够形成抗SARS-CoV-2细胞介导应答的细胞(例如，T细胞、粒细胞、自然杀伤(NK)细胞等)的诱导(例如，出现)和/或数量和/或功能的增加。在一些实施例中，施用了有效量的宿主可表现出能够产生抗SARS-CoV-2抗体的细胞和能够形成抗SARS-CoV-2细胞介导应答的细胞的诱导(例如，出现)和/或数量和/或功能的增加。
为确定施用了有效量的宿主是否表现出抗SARS-CoV-2抗体产生细胞(能够产生抗SARS-CoV-2抗体的细胞)的诱导(例如，出现)和/或数量和/或功能的增加，在一些实施例中，可利用SARS-CoV-2-特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)。如在利用鼠科动物模型的实例中所示，在施用免疫原性组合物之后(例如，施用后21天)，小鼠可放血以提供样本以用于利用SARS-CoV-2-特异性ELISA来确定系统性抗体应答的存在(例如，来确定已发生的SARS-CoV-2特异性IgG应答)。简而言之，ELISA可通过以1μg/ml在碳酸钠缓冲液(pH9.3)中的SARS-CoV-2S蛋白涂布聚苯乙烯96孔板在4℃下过夜来执行。板可清洗(例如，在含有0.02％Tween 20的PBS中清洗三次)，并在适当时间和温度下封闭(例如，以脱脂奶粉)(例如，在37℃下以PBS、2％BSA和0.02％Tween20阻断一小时)。hAd5-SARS-CoV-2接种小鼠的血清可连续地稀释(例如，在PBS中)，在适当温度和时间(例如，37℃)下温育，清洗(例如，以含有0.02％Tween 20的PBS清洗四次)，并且然后与标记二级抗体(例如，生物素标记的山羊抗小鼠二级抗体)一起温育适当时间量(例如，一小时)。样本然后可清洗并以适当试剂(例如，HRP偶联链霉亲和素)温育，然后利用适当药剂(例如，四甲基联苯胺底物)来显影；该反应通过添加适当药剂(例如，2N H2SO4)来停止，并且利用微板读取器来发射(450nm)读取。在一些实施例中，向宿主施用有效量的包括编码一种或多种CoV抗原(例如刺突蛋白)的腺病毒载体的免疫原性组合物可导致特定类型(例如，IgA、IgM、IgG)和/或量(例如，指示应答的特定倒数平均值端点(例如，相比于幼稚宿主))的SARS-CoV-2特异性(例如，CoV S蛋白特异性)抗体的表达。其它测定系统也可用于确定是否已施用有效量，诸如，例如但不限于中和抗体测定。
为确定施用了有效量的宿主是否表现出形成抗SARS-CoV-2细胞介导应答的细胞(能够形成抗SARS-CoV-2细胞介导应答的细胞)的诱导(例如，出现)和/或数量和/或功能的增加，可利用细胞类型和/或数量和/或细胞因子表达和/或功能测定。例如，在一些实施例中，施用了免疫原性组合物的宿主(或该宿主)的T细胞可分离并研究(例如，与其它细胞物理分离和/或存在于生物样本内，诸如血液)。在一些实施例中，胞内细胞因子染色测定可执行以确定表达特定细胞因子的细胞的类型和/或数量，和/或在其内表达的此类细胞因子的水平。简而言之，已施用了免疫原性组合物的宿主的生物样本(例如，血液、脾脏)可在施用之后的特定点(例如，施用后的8至21天)进行分离。然后，与所述生物样本分离的细胞(例如，细胞培养基(含有10％FBS和HEPES的RPMI)中的大约106个细胞)可接种于培养板中(例如，圆底96孔板)；在存在刺激物(例如，10μg/ml的布雷菲德菌素A和α-CD3(2C11克隆)或10μg的CoV肽(例如，90％DMSO中的刺突抗原SARS-CoV-2肽(SEQ ID NO:3)))的情况下，在适当的温度等条件(例如，37℃、5％的CO2下6小时)下刺激适当时间量。在CoV肽刺激之后，细胞可清洗(例如，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗一次)，并且对于下述细胞表面标记物进行染色，该细胞表面标记物指示细胞类型(例如，α-CD8-PerCP-Cy 5.5(克隆53-6.7)、α-CD3-AF700(克隆500A2)和α-CD19-BV605(克隆1D3))。然后，细胞可固定(例如，利用福尔马林)、透化，对胞内细胞因子标记物(例如，α-IFN-γ-APC(克隆B27))进行染色，并通过流式细胞仪(例如，利用Attune-NXT)进行分析。在一些实施例中，有效量可为提高了表达细胞因子(例如，IFN-γ)的细胞数量和/或此类细胞所表达的量的免疫原性组合物的量。
在一些实施例中，抗SARS-CoV-2免疫应答为保护性的，意味着其可保护宿主免于患有SARS-CoV-2感染的一种或多种症状。在一些实施例中，保护性免疫应答预防了SARS-CoV-2感染，这可通过对施用了有效量的宿主(或该宿主)进行攻毒来证实。在一些实施例中，保护性的免疫原性组合物和/或其有效量为疫苗。为确定免疫原性组合物是否为保护性的，可利用临床前动物模型。例如，在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫原性组合物可施用至对感染和疾病易感的小鼠，并且该小鼠在后续时间(例如，施用后7至21天)用活体SARS-CoV-2进行攻击并且监测相比于对照组的存活期和/或症状。SARS-CoV-2感染的症状也可进行监测，包括疾病的临床征象(例如，上呼吸道和下呼吸道症状)。因此，在一些实施例中，为确定hAd5-SARS-CoV-2免疫原性组合物是否为保护性的(即，是否为疫苗)，本领域的技术人员可进行动物攻毒试验。
在一些实施例中，在动物模型的接种疫苗之后，执行用以确定中和抗体的滴度的测定，诸如斑块减少中和检验(PRNT)或病灶减少中和检验(FRNT)，该测定将证实保护性免疫应答的诱导。在这种情况下，从接种后动物(例如，用hAd5-SARS-CoV-2)进行收集血清或其它生物流体，并且与SARS-CoV-2悬浮液混合，并且温育一段时间以允许血清抗体与SARS-CoV-2反应。将血清抗体/SARS-CoV-2混合物倾注于宿主细胞的融合性(即，SARS-CoV-2容许性)单层上。细胞层的表面覆盖着琼脂或羧甲基纤维素层，以防止SARS-CoV-2病毒肆意地扩散。斑块形成单位(pfu)的浓度可通过数天后所形成的斑块(感染细胞的区域)的数量来估计。斑块形成单位可通过显微镜观察、荧光抗体或与感染细胞反应的特定染料进行测量。相比于无血清病毒，使斑块数量减少50％的血清浓度给出了中和抗体存在的量多少或其效果如何(即，保护性)的量度。这个测量值表示为PRNT50值。此外，在FRNT测定中，病毒可利用抗体标记进行可视化，以类似地计算FRNT50。利用伪病毒中和测定或ACE-2结合抑制测定的其它方法，从而对针对SARS-CoV-2而存在的中和抗体进行定量测定。
在某些实施例中，本发明免疫原性组合物(例如，疫苗)包括有效量的约107个病毒颗粒(vp)或感染性单位(ifu)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)的复制缺陷腺病毒载体。在示例性实施例中，本发明免疫原性组合物(例如，疫苗)包括有效量的约108个病毒颗粒(vp)的复制缺陷腺病毒载体。在某些其它示例性实施例中，本发明免疫原性组合物(例如，疫苗)包括有效量的约109个病毒颗粒(vp)的复制缺陷腺病毒载体。在某些其它示例性实施例中，本发明免疫原性组合物(例如，疫苗)包括有效量的约1010个或更多个病毒颗粒(vp)的复制缺陷腺病毒载体。在某些其它示例性实施例中，本发明免疫原性组合物(例如，疫苗)包括有效量的约1011个或更多个病毒颗粒(vp)的复制缺陷腺病毒载体。在一些实施例中，哺乳动物为伴侣型或驯养型或生产食物型或生产饲料型或牲畜型或游戏型或比赛型或运动型动物，诸如牛、狗、猫、山羊、绵羊、兔或猪或马，或甚至禽类，诸如火鸡、鸭或鸡。在示例性实施例中，哺乳动物受试者为人。
使用方法
本文提供了用于诱导针对冠状病毒的免疫应答的方法，该方法包括将有效量的SARS-CoV-2免疫原性组合物施用至哺乳动物受试者。在某些实施例中，提供了用于经粘膜施用本发明治疗/免疫原性组合物(例如，疫苗)的药物剂量的方法，该治疗/免疫原性组合物配置成经由鼻内施用而诱导免疫应答(例如，作为疫苗的保护性免疫应答)。在某些实施例中，本发明免疫原性组合物包括复制缺陷腺病毒载体，该复制缺陷腺病毒载体包括表达盒，该表达盒包括编码至少一种冠状病毒抗原或其至少一个免疫原性片段的编码序列，其中该编码序列编码至少一个或多个B细胞表位、一个或多个CD8+T细胞表位和/或一个或多个CD4+T细胞表位。在示例性实施例中，哺乳动物受试者为人类，并且冠状病毒抗原得自SARS-CoV-2。在一些实施例中，哺乳动物受试者为感染SARS-CoV-2的人类(例如，住院人类)。在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫原性组合物可用于治疗SARS-CoV-2感染(即，此类感染和/或住院人类)。
在一些实施例中，本发明的方法可包括在哺乳动物(优选地，人类)施用本发明的一种或多种免疫原性组合物以：诱导抗SARS-CoV-2免疫应答，优选统计学显著的抗SARS-CoV-2免疫应答；诱导保护性和/或治愈性抗SARS-CoV-2免疫应答；诱导具有可接受安全特性的抗SARS-CoV-2免疫应答；赋予针对SARS-CoV-2的预防性治疗；减少早期发病COVID-19患者的重症监护室(ICU)入住和机械通气的比率；减少需要住院的早期发病COVID-19患者的COVID-19的严重度；阻止、抑制和/或防止SARS-CoV-2感染期间的“细胞因子风暴”的发展(在优选实施例中，将一种或多种免疫原性组合物与一种或多种抗细胞因子试剂一起共同施用)；诱导患有COVID-19的患者(即，感染SARS-CoV-2的患者)的IL-1α、IL-6和/或IL-12p70和/或肺部间质炎症的显著减少(例如，相比于安慰剂对照)；加速感染SARS-CoV-2的患者(例如，住院患者)的临床改善和/或恢复的时间；诱导抗SARS-CoV-2中和抗体(在优选实施例中，IgG和/或IgA)；诱导抗SARS-CoV-2T细胞免疫(例如，系统性和/或粘膜)；诱导骨髓和肺部常驻记忆抗体分泌细胞；诱导免疫应答(例如，中和抗体和/或T细胞免疫)，该免疫应答在至少4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约12个月内为有效的和/或可检测；和/或提供重复施用(例如，作为季节性疫苗约每11至14个月施用一次)而不诱导针对腺病毒载体自身的显著免疫应答。
当与或未与佐剂一起使用时，免疫原性组合物(例如，Ad-载体SARS-CoV-2疫苗)的剂量可在约107至约1012个感染性单位或斑块形成单位(ifu或pfu)之间，或剂量单位可为病毒颗粒(vp)，其中1个vp等于约1至100个ifu或pfu。在一个实施例中，施用至哺乳动物受试者的Ad-载体SARS-CoV-2免疫原性组合物或疫苗的剂量为约或至少约107个vp或感染性单位(ifu)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)。在另一方面，施用至哺乳动物受试者的Ad-载体SARS-CoV-2免疫原性组合物或疫苗的剂量为约或至少约108个vp。在又一方面，施用至哺乳动物受试者的Ad-载体SARS-CoV-2免疫原性组合物或疫苗的剂量为约或至少约109个vp。在另一方面，施用至哺乳动物受试者的Ad-载体SARS-CoV-2免疫原性组合物或疫苗的剂量为约或至少约1010个vp。在另一方面，施用至哺乳动物受试者的Ad-载体SARS-CoV-2免疫原性组合物或疫苗的剂量为约或至少约1011个vp。在另一方面，施用至哺乳动物受试者的Ad-载体SARS-CoV-2免疫原性组合物或疫苗的剂量为约或至少约1012个vp。
本领域的技术人员理解，小鼠的有效剂量可对于较大动物进行缩放，诸如人、狗、猪、非人灵长类动物、水貂、雪貂、猫、马/马驹等；并且，这些较大动物为根据本发明内容所施用的受试者。这样，通过异速生长缩放(也称为生物缩放)，较大动物的剂量可从小鼠的剂量进行推算，以基于该动物的体重或体表面积而获得等同剂量。
在某些实施例中，Ad载体SARS-CoV-2免疫原性组合物或疫苗的非侵入性施用包括但不限于对皮肤的局部应用，和/或鼻内和/或粘膜和/或舌下和/或颊部和/或口部和/或口腔施用。应用Ad载体SARS-CoV-2免疫原性组合物或疫苗的剂型可包括液体、膏剂、粉末和喷剂。根据需要，活性组分可在无菌条件下与生理学上可接受载体和任何防腐剂、缓冲液、推进剂或吸收增强剂剂进行混合。
在某些实施例中，本文提供了将治疗剂量的非复制病毒载体免疫原性组合物(例如，疫苗)经粘膜施用至人受试者的方法，其中该方法包括将免疫原性组合物(例如，疫苗)鼻内地使用至人受试者，该免疫原性组合物包括有效量的至少107个病毒颗粒(vp)或感染性单位(ifu)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)的复制缺陷腺病毒载体，该复制缺陷腺病毒载体包含并表达对于哺乳动物受试者进行密码子优化的异源SARS-CoV-2抗原；由此，经粘膜施用的治疗剂量诱导了保护性免疫应答。
在实施例中，(经)粘膜施用组合物可为通过挤压式喷雾器、泵式分配器、多剂量分配器、滴管式分配器或气溶胶分配器的剂型并分配。此类分配器还可用于将组合物递送至口部或口腔(例如，颊部或舌下)粘膜)。气溶胶通常处于碳氢化合物的压力下。泵分配器可优选地分配计量剂量，或具有特定颗粒尺寸的剂量。气溶胶颗粒/液滴尺寸的分布可用以下方式来表示：质量中值空气动力学直径(MMAD)--气溶胶质量的一半包含于较小液滴并且一半包含于较大的液滴中的液滴尺寸；体积平均直径(VMD)；质量中值直径(MMD)；或者细小颗粒分数(FPF)--直径小于5um的颗粒的百分比。这些测量可通过冲击法(MMD和MMAD)或激光法(VMD)来进行。对于液体颗粒，在维持环境条件(例如，标准湿度)的情况下，VMD、MMD和MMAD可为相同的。然而，在未维持湿度的情况下，由于在冲击器测量期间的脱水，MMD和MMAD测定值将小于VMD。出于本描述的目的，VMD、MMD和MMAD的测量视为在标准条件下，使得VMD、MMD和MMAD的描述将为可比较的。质量中值空气动力学直径(MMAD)大于约5微米的颗粒通常不会到达肺部；相反，在口服施用的情况下，它们往往冲击咽喉的后部，并且吞咽并可能口服吸收；并且鼻腔施用的这种尺寸的颗粒将滞留于鼻粘膜中。这种尺寸的颗粒在鼻腔给药时，会滞留在鼻粘膜中。直径为约1至5微米的颗粒足够小以到达中上部肺部区域(传导气道)，但太大而无法到达肺泡。较小颗粒(即，约0.5至约2微米)能够到达肺泡区域。直径小于约0.5微米的颗粒还可通过沉淀作用而沉积于肺泡区域中，但极小颗粒可呼出。根据是否期望以粘膜方式施用至鼻粘膜或中上部肺部区域或肺泡，技术人员可根据本发明和本领域的知识而实现这些目标的任一者或全部。此外，对于鼻内施用，可有利地采用雾化器装置，诸如泰利福有限公司(Teleflex LLC公司)的LMA MAD300(鼻腔粘膜雾化装置LMATM#MAD300鼻腔装置，无注射器，长1.65英寸，尖端直径0.17英寸)。在本发明的实践中，可有利地采用气溶胶装置或分配器，诸如雾化器，其向嗅觉粘膜或鼻粘膜递送具有约30至约100微米的典型颗粒尺寸的雾气；用于实践本发明的本发明的制剂液滴的有利颗粒尺寸可为约30至约100微米，例如，约30或约40或约50至约60或约70或约80或约90或约100微米，以用于鼻内施用。
在实施例中，本发明SARS-CoV-2药物制剂用于提供针对季节性冠状病毒的保护。在某些其它实施例中，本发明CoV药物制剂用于提供针对大流行SARS-CoV-2的保护。在某些其它实施例中，本发明SARS-CoV-2药物制剂用于提供针对SARS-CoV-2的保护。在实施例中，血清保护持续至少约1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月或至少约13个月。
在一些实施例，提供了用于诱导针对冠状病毒的免疫应答的方法，该方法包括将单次剂量的本发明免疫原性组合物/制剂/剂量施用至哺乳动物受试者(例如，人)。在某些实施例中，所述方法包括将有效量的免疫应答组合物鼻内施用至哺乳动物受试者，其中免疫应答提供针对SARS-CoV-2攻击的保护。在某些实施例中，提供了诱导人受试者中针对冠状病毒的粘膜、体液和/或T细胞保护性免疫应答的组合的方法，该方法包括向人受试者鼻内地施用单次剂量的SARS-CoV-2药物制剂(免疫原性组合物)或其药物剂量，其中该施用诱导了针对冠状病毒的血清抗体、粘膜抗体和T细胞。在实施例中，人受试者受血清保护至少约1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月或至少约13个月。在某些实施例中，人受试者进行血清保护至少约9个月。
在可替换的实施例中，通过了用于诱导针对冠状病毒的免疫应答的方法，其中该方法包括至少使用初次剂量和加强剂量的本发明免疫原性组合物/制剂/剂量。在某些实施例中，在使用初次剂量之后约2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周、41周、42周、43周、44周、45周、46周、47周、48周、49周、50周、51周或52周施用加强剂量。
在实施例中，初次剂量和加强剂量为同源性的，意味着它们为相同制剂。在某些实施例中，所提供方法和组合物包括施用异源性免疫原性组合物或疫苗的初次剂量和加强剂量，从而导致免疫应答(例如，T细胞、体液和/或粘膜)的诱导，其中“异源性”意指不同于加强剂量的初次剂量，前提是两者均包括至少一个或多个SARS-Cov-2抗原表位。在某些实施例中，“异源性”意指初次剂量和加强剂量，其中抗原/免疫原/肽经由不同递送载体和/或媒介呈现至免疫系统。如本文所用，“异源性给药方案”意指初次剂量和加强剂量，其中抗原/免疫原/肽经由不同递送载体和/或媒介呈现至免疫系统。例如，在本发明中，第一组合物(作为初次剂量或加强剂量)包括病毒载体抗原或免疫原，并且第二组合物(作为初次剂量或加强剂量)包括氟碳化合物链接肽，其中该肽包括与病毒载体抗原或免疫原共用的一个或多个T细胞表位。换句话说，在某些实施例中，本发明免疫原性组合物或疫苗组合为两种不同T细胞诱导免疫原性组合物或疫苗组合物，其中每种组合物诱导了针对相同抗原的抗原特异性CD8+T细胞。在可替换的实施例中，第一组合物(作为初次剂量或加强剂量)包括病毒载体抗原或免疫原，并且第二组合物(作为初次剂量或加强剂量)包括RNA免疫原性组合物或疫苗组合物，诸如包括修饰mRNA、未修饰mRNA或自扩增mRNA的以脂质体或脂质纳米颗粒所配制的组合物，通过电穿孔或利用脂质基制剂所施用的DNA组合物，减毒活体免疫原性组合物或疫苗组合物，配制具有或不具有佐剂或递送系统的蛋白基组合物，灭活免疫原性组合物或疫苗组合物，不同腺病毒载体免疫原性组合物或疫苗组合物(诸如，HAdV-1至57、猿猴腺病毒或非腺病毒载体，诸如但不限于腺相关病毒(AAV)、慢病毒或痘病毒)。第一组合物可首先施用以局部地或系统性地激发免疫应答，第二免疫原性组合物或疫苗(诸如腺病毒)可作为加强剂以粘膜方式施用以局部地“拉动”所激发免疫细胞并以抗原特异性方式重新刺激它们。
在实施例中，初次剂量和加强剂量相隔至少7天，相隔至少14天或更长时间施用。在实施例中，初次剂量和加强剂量相隔约7天、相隔约14天、相隔约20天、相隔约25天、相隔约30天、相隔约35天、相隔约40天、相隔约45天、相隔约50天、相隔约55天、相隔约60天或相隔约65天来施用。有利地，剂量相隔约40天、相隔约41天、相隔约42天、相隔约43天、相隔约44天、相隔约45天、相隔约46天、相隔约47天、相隔约48天、相隔约49天或相隔约50天来施用。在某些实施例中，初次剂量和加强剂量相隔约1周、相隔约2周、相隔约3周、相隔约4周、相隔约5周、相隔约6周、相隔约7周、相隔约8周、相隔约9周、相隔约10周、相隔约11周或相隔约12周来施用。在某些其它实施例中，初次剂量和加强剂量相隔约1个月、相隔约2个月、相隔约3个月、相隔约4个月、相隔约5个月、相隔约6个月、相隔约7个月、相隔约8个月、相隔约9个月、相隔约10个月、相隔约11个月或相隔约12个月来施用。
在实施例中，第一或第二免疫原性组合物或疫苗组合物作为初次剂量和加强剂量相隔至少7天，相隔至少14天或更长时间施用。在实施例中，初次剂量和加强剂量相隔约7天、相隔约14天、相隔约20天、相隔约25天、相隔约30天、相隔约35天、相隔约40天、相隔约45天、相隔约50天、相隔约55天、相隔约60天或相隔约65天来施用。有利地，剂量相隔约40天、相隔约41天、相隔约42天、相隔约43天、相隔约44天、相隔约45天、相隔约46天、相隔约47天、相隔约48天、相隔约49天或相隔约50天来施用。在某些实施例中，初次剂量和加强剂量相隔约1周、相隔约2周、相隔约3周、相隔约4周、相隔约5周、相隔约6周、相隔约7周、相隔约8周、相隔约9周、相隔约10周、相隔约11周或相隔约12周来施用。在某些其它实施例中，初次剂量和加强剂量相隔约1个月、相隔约2个月、相隔约3个月、相隔约4个月、相隔约5个月、相隔约6个月、相隔约7个月、相隔约8个月、相隔约9个月、相隔约10个月、相隔约11个月或相隔约12个月来施用。
在一些实施例中，rdAd抗SARS-CoV-2载体(例如，SARS-CoV-2免疫原性组合物(其可包括一种以上类型的rdAd抗SARS-CoV-2载体))可与一种或多种抗细胞因子试剂一起施用。如实例2所示，将AdE施用至小鼠，显示出减少了已知的参与由病毒(诸如流感)所引起的感染性疾病的进展和症状的细胞因子的表达。例如，在施用至非感染哺乳动物时，AdE可引起单核细胞趋化蛋白(MCP-1(CCL2))、干扰素γ(IFN-γ)和RANTES(CCL5)的表达增加，这可伴随IL-12的表达减少。暴露于流感后三天，据发现，施用了AdE的动物表现出IL-1α、IL-6、IL-12、MCP-1的表达减少，其中IL-1α和IL-12明显减少。在暴露于流感六(6)天之后，动物表现出IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1和GM-CSF的表达减少，和巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α(CCL3))和RANTES(CCL5)的表达增加。这些结果与SARS-CoV-2感染期间的“细胞因子风暴”的发展一致。在一些实施例中，为预防和/或治疗SARS-CoV-2感染，SARS-CoV-2免疫原性组合物可与一种或多种抗细胞因子试剂一起施用(即，共同施用)至哺乳动物(诸如人类)。此类共同施用可作为单一混合物(例如，一种或多种抗细胞因子试剂可包括于SARS-CoV-2免疫原性组合物中)来进行，或可作为单独组合物来进行；该单独组合物通过适当途径(例如，SARS-CoV-2免疫原性组合物的鼻内施用和一种或多种抗细胞因子试剂的皮内或静脉施用)和以有效量(该有效量对于每种类型的抗细胞因子试剂(如本领域已知)可改变)基本上同时和/或在相同解剖部位或其附近，或在不同解剖部位进行施用。在一些实施例中，SARS-CoV-2免疫原性组合物可作为单次剂量来施用，一种或多种抗细胞因子试剂也是如此。在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂可在施用SARS-CoV-2组合物(在一些实施例中，包括SARS-CoV-2组合物的初始施用)之后多次施用(例如，约7天、14天、21天的任一者，或约一个月、两个月或三个月的任一者)。因此，用于施用至哺乳动物以预防和/或治疗SARS-CoV-2的示例性抗细胞因子试剂可包括但不限于一种或多种抗IL-1α试剂、一种或多种抗IL-5试剂、一种或多种抗IL-6试剂、一种或多种抗IL-12试剂、一种或多种抗IL-17试剂、一种或多种抗MCP-1试剂、一种或多种抗TNF-α试剂、一种或多种抗GM-CSF试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂将不包括一种或多种抗MIPα试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。如本文所描述可使用的示例性抗细胞因子试剂可包括例如表10所示那些的任一者。
表10
Figure GDA0003417796820000921
Figure GDA0003417796820000931
在一些实施例中，在施用SARS-CoV-2免疫原性组合物之前、基本同时或之后，一种或多种额外抗SARS-CoV-2药剂也可施用至受试者，(诸如，例如氯喹(例如，其药物盐和/或衍生物；例如，羟氯喹每天400毫克，连续5天，或200毫克，每天3次，连续10天)，和/或阿奇霉素(例如，第一天500毫克，然后每天4次250毫克的剂量)，和/或瑞德西韦(例如，初始200毫克，然后每天100毫克的剂量)，和/或一种或多种抗炎药(例如，泼尼松、地塞米松)，和/或任何其它合适试剂)。如本领域技术人员可获得，其它施用/给药方案、抗细胞因子试剂、其组合，以及与其它抗SARS-CoV-2药剂的组合可适用于如本文所公开的用途，如本领域技术人员所理解。
在一些实施例中，通过合适技术(例如，用以检测病毒颗粒的聚合酶链式反应(PCR)、鼻拭子)，受试者(例如，人类)可对于冠状病毒进行检验。然后，包括一种或多种rdAd抗SARS-CoV-2载体(例如，作为病毒颗粒；SARS-CoV-2免疫原性组合物)的免疫原性组合物可施用至对于冠状病毒感染检测为阳性的个体。优选地，此类施用可在初始暴露于冠状病毒之后的七天至十天内完成。在一些实施例中，包括一种或多种rdAd抗SARS-CoV-2载体(例如，作为病毒颗粒)的SARS-CoV-2免疫原性组合物可施用至处于感染和/或症状(例如，呼吸道症状，死亡)高风险的个体(诸如免疫力低下的个体和/或患有其它疾病病症(例如，肾衰竭)的个体)，和/或处于高风险情况下的人员(例如，前往大流行地区、封闭空间(诸如游轮)的旅行者)，无论此类个体是否对于冠状病毒感染已检测为阳性。
在一些实施例中，本文所公开的组合物可施用至包括鼻孔的宿主，其中此类鼻孔向上倾斜(即，鼻背位置)以经由鼻内施用而生成强免疫原性应答。本文还设想出其它施用和给药策略，如本领域的技术人员所理解。
在一些实施例中，本发明提供了包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体的免疫原性组合物，该rdAd载体：a)缺乏编码外源性非腺病毒抗原(例如，AdE)的编码序列；b)包括表达盒，该表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原的编码序列，任选地其中所述抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)；c)包括表达盒，该表达盒包括编码序列，该编码序列编码SARS-CoV-2(例如，AdD)以外的感染性病原体的至少一种抗原；d)a)和b)的载体的组合，其中载体一起或单独地施用；e)b)和c)的rdAd载体的组合，其中载体一起或单独地施用；f)a)、b)或c)任一者的rdAd载体的任一者的组合，其中rdAd载体一起或单独地施用；和/或g)b)的两种不同类型的rdAd载体的组合，其中每种类型的rdAd载体包括表达盒，该表达盒编码不同于由该组合中的其它类型的rdAd载体所编码的抗原的至少一种SARS-CoV-2抗原，其中rdAd载体一起或单独地施用；其中所述免疫原性组合物被配置成诱导哺乳动物受试者的针对SARS-CoV-2的中和抗体和/或细胞免疫应答，所述免疫原性组合物施用至该哺乳动物受试者。在一些实施例中，免疫原性组合物可包括a)-c)的rdAd载体的任何两者的组合，诸如两部分组合物，该两部分组合物含有包括a)-c)的rdAd载体的至少一种组合物和包括a)-c)的不同rdAd载体的至少第二组合物。在一些实施例中，表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原的编码序列，该编码序列选自：刺突(S)蛋白的编码序列或刺突蛋白的S1域；SEQ ID NO:3所呈现的序列，或与SEQ ID NO:3具有至少80％同源性的序列；至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸331至527的序列；编码刺突蛋白RBD序列，该刺突蛋白RBD序列包括下述氨基酸的一者或多者(编号对应于SEQ ID NO:3)：L455、F486、Q493、S494和/或N501，在一些实施例中优选地为Q493和N501，在一些实施例中优选地为选自Y455、F455或S455的残基，在一些实施例中优选地为选自L486或P486的残基，在一些实施例中优选地为选自N493、R493或K493的残基，在一些实施例中优选地为选自D494或G494的残基，在一些实施例中优选地为选自T501或S501的残基；包括以下项的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14，优选地SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:446，SEQID NO:412-417和SEQ ID NO:438-445以及SEQ ID NO:475-476或460的任一者，或其免疫原性片段；包括以下项的氨基酸序列：SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17，其中氨基酸455选自Y、F、L或S，氨基酸486选自L、F或P，氨基酸493选自N、Q、R或K，氨基酸494选自D、G或S，并且氨基酸501选自T、S或N；编码SARS-CoV-2结构蛋白包膜(E)、膜(M)或核衣壳(N)的一者或多者的编码序列。在一些实施例中，表达盒包括修饰型式的SEQ ID NO:411的编码序列，SEQ IDNO:411包括：氨基酸333-388、390-395、397-399、401-411、413-415、417-419、424、426-435、437、439-442、444-446、449、450、452、453、455-463、465、467-473、475-479、481-486、490、491、493-495、499-510和/或513-526中的任何一者或多者的一个或多个取代；和/或氨基酸367、403、417、439、446、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、490、493、494、495、496、499、500、501、502、503、504和/或505中的任何一者或多者的一个或多个取代；选自由以下项组成的组的一个或多个取代：氨基酸367(V)被F、I、L S或A取代、氨基酸403(R)被K或S取代、417(K)被N或T取代、氨基酸439(N)被K取代、氨基酸446(G)被V、S或A取代、氨基酸449(Y)被N取代、氨基酸452(L)被L、M或Q取代、氨基酸453(Y)被F取代、氨基酸455(L)被F取代、氨基酸456(F)被L取代、氨基酸470(T)被I、A或N取代、氨基酸473(Y)被V取代、氨基酸475(A)被V取代、氨基酸476(G)被S或A取代、氨基酸477(S)被N、R、T、G、A或I取代、氨基酸476(G)被S或A取代、氨基酸477(S)被N、R、T、G、A或I取代、氨基酸478(T)被I、K、R或A取代、氨基酸484(E)被Q、K、D、A或R取代、氨基酸486(F)被L或S取代、氨基酸490(F)被L或S取代、氨基酸493(Q)被L或R取代、氨基酸494(S)被P或L取代、氨基酸495(Y)被N或F取代、氨基酸496(G)被V或S取代、氨基酸499(P)被H，S或R取代、氨基酸500(T)被I取代、氨基酸501(N)被Y、T或S取代、氨基酸502(G)被R、D或C取代、氨基酸503(V)被L、I或F取代、氨基酸504(G)被V、D或S取代和氨基酸505(Y)被H、E、W或C取代。在一些实施例中，SARS-CoV-2之外的感染性病原体的至少一种抗体来源于流感病毒。在一些实施例中，免疫原性组合物还配置成诱导针对SARS-CoV-2粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合。在一些实施例中，编码序列至少编码一个或多个B细胞表位、一个或多个CD8+T细胞表位，和/或一个或多个CD4+T细胞表位。在一些实施例中，编码序列对于哺乳动物受试者进行密码子优化。在一些实施例中，免疫原性组合物诱导了中和抗体的产生，该中和抗体针对哺乳动物受试者的SARS-CoV-2感染为血清保护的，任选地其中该哺乳动物受试者为人类。在一些实施例中，复制缺陷腺病毒载体(rdAd)为人腺病毒，任选地Ad5或Ad26。在一些实施例中，rdAd为灵长类腺病毒、鸡腺病毒，或猪或猪型腺病毒。在一些实施例中，rdAd为E1、E3和/或E4缺失或破坏腺病毒。
在一些实施例中，本发明提供了药物制剂，该药物制剂包括有效量的此类免疫原性组合物(即，包括一种或多种rdAd抗SARS-CoV-2载体的组合物)和药学上可接受稀释剂或载体，任选地其中该稀释剂为磷酸盐缓冲盐水。在一些实施例中，药物制剂配置用于非侵入性施用和/或鼻内施用至哺乳动物受试者。在一些实施例中，药物制剂至哺乳动物受试者的施用诱导了哺乳动物受试者的保护性免疫应答，任选地诱导了粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合。在一些实施例中，药学上可接受载体为喷雾或气溶胶形式。在一些实施例中，有效量为至少107个病毒颗粒(vp)，至少108个病毒颗粒(vp)，或至少109个病毒颗粒(vp)(rdAd抗SARS-CoV-2载体的病毒颗粒)。在一些实施例中，药物制剂配置为单次鼻内剂量。在一些实施例中，药物制剂配置为两次或更多次鼻内剂量。在一些实施例中，本发明提供了适用于单次剂量鼻内施用至人受试者的药物制剂，该药物制剂包括：有效量的至少107个病毒颗粒(vp)或感染单位(ifu)(例如，至少1x107，或至少1×108，或至少1×109，或至少1×1010，或至少1×1011个vp或ifu)的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括至少一种复制缺陷腺病毒载体，该复制缺陷腺病毒载体包括表达盒，该表达盒包括编码序列，该编码序列至少编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)或其至少一个免疫原性片段，其中该有效量诱导了粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合；和药学上可接受稀释剂和/或载体。在一些实施例中，制剂配置成向人受试者提供针对SARS-CoV-2的血清保护至少6个月或优选9个月。在一些实施例中，本发明提供了用于鼻内施用的药物剂量，该药物剂量包括喷雾或气溶胶形式的药学可接受载体，该药学可接受载体与本文所公开的免疫原性组合物进行掺和，其中该剂量配置用于鼻内施用以非侵入性地诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答。在一些实施例中，免疫原性组合物包括有效量的至少107个病毒颗粒(vp)，至少108个病毒颗粒(vp)，或至少109个病毒颗粒(vp)的rdAd抗SARS-CoV-2载体。在一些实施例中，有效量诱导了针对冠状病毒(优选地，SARS-CoV-2)粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合。在一些实施例中，药物剂量制剂配置为两次或更多次剂量以诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答。
在一些实施例中，本发明提供了用于诱导针对冠状病毒(优选地，SARS-CoV-2)的免疫应答的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用有效量的本文所公开的免疫原性组合物(或制剂或剂型)，优选地其中该免疫应答针对SARS-CoV-2为保护性的。在一些实施例中，所述方法包括将有效量的本文所公开的免疫应答组合物鼻内施用至哺乳动物受试者，其中免疫应答提供针对SARS-CoV-2攻击的保护。在一些实施例中，本发明提供了用于诱导人受试者的针对冠状病毒粘膜、体液和/或T细胞保护性免疫应答的组合的方法，该方法包括：向人受试者鼻内地施用单次剂量的冠状病毒，优选地SARS-CoV-2、本文所公开的药物制剂或剂量；其中该施用诱导了针对SARS-CoV-2的血清抗体、粘膜抗体和T细胞，任选地由此人受试者受血清保护至少约6个月或优选至少约9个月。优选地，血清保护持续至少12个月、至少13个月或至少14个月。
在优选实施例中，rdAd抗SARS-CoV-2载体包括SEQ ID NO:15(或包括编码SEQ IDNO:15的核酸序列)，优选地包括于表达盒内。在优选实施例中，rdAd抗SARS-CoV-2载体包括表达盒，该表达盒包括S1域的SARS-CoV-2载体刺突蛋白受体结合域(RBD)、pTA信号序列(斜体)和长侧翼序列(加下划线)，如图19所示。还设想出SEQ ID NO:15的变体。例如，图19所示的前导序列和侧翼序列的任一者可缺失(例如，不包括)或可由其它前导序列和/或侧翼序列来取代。在优选实施例中，rdAd抗SARS-CoV-2载体(包括SEQ ID NO:15(或包括编码SEQID NO:15的核酸序列))，或其变体，可作为药物组合物来施用，该药物组合物包括有效量的至少107个病毒颗粒(vp)，或至少108个病毒颗粒(vp)，或至少109个病毒颗粒(vp)，或至少1010个病毒颗粒(vp)，或至少1011个病毒颗粒(vp)；优选地鼻内施用(优选地其中哺乳动物(优选地，人类)在施用期间处于仰卧位置)；和优选地作为单次施用(剂量)，但在一些实施例中，包括彼此分开一定时间(例如，7天至21天)的至少两次施用(剂量)。在优选实施例中，施用诱导了抗SARS-CoV-2中和抗体的产生和/或抗SARS-CoV-2细胞应答(例如，T细胞)；该细胞应答提供至少约6个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月的保护(例如，在一些优选实施例中，血清保护)。在优选实施例中，施用rdAd抗SARS-CoV-2载体(包括SEQ ID NO:15(或包括编码SEQ ID NO:15的核酸序列)导致了针对SARS-CoV-2感染的保护，加速了SARS-CoV-2感染的恢复，减缓和/或逆转了SARS-CoV-2感染患者的临床恶化，和/或减少或消除了对于SARS-CoV-2感染患者的住院和/或ICU病房护理的需求。
在一些实施例中，本发明提供了诸如上文那些的方法，该方法还包括向人类施用一种或多种抗细胞因子试剂(参见例如，表4)以预防和/或治疗SARS-CoV-2，任选地其中一种或多种抗细胞因子试剂包括一种或多种抗IL-1α试剂、一种或多种抗IL-5试剂、一种或多种抗IL-6试剂、一种或多种抗IL-12试剂、一种或多种抗IL-17试剂、一种或多种抗MCP-1试剂、一种或多种抗TNF-α试剂、一种或多种抗GM-CSF试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂不包括一种或多种抗MIPα试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂与有效量的免疫原性组合物基本上共同施用。在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂基本上不与有效量的免疫原性组合物一起施用。在一些实施例中，免疫原性组合物一次施用至哺乳动物并且一种或多种抗细胞因子试剂多次施用。在一些实施例中，免疫原性组合物与一种或多种抗细胞因子试剂一起共同施用至哺乳动物，并且一种或多种抗细胞因子试剂随后施用至该哺乳动物。在一些实施例中，本发明提供了用于治疗和/或抑制(例如，改善)哺乳动物的呼吸道病毒感染症状的方法，所述呼吸道病毒感染引起白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1-α(IL-1α)和/或白细胞介素-12(IL-12)在所述哺乳动物的肺部的升高表达从而可引起宿主的有害影响。在一些实施例中，此类方法包括向受试者鼻内施用有效量的E1和E3缺失的腺病毒载体，由此IL-6、IL-1a和/或IL-12在肺部的表达得以减少，从而在施用该载体后至多约28天缓解所述症状。在一些实施例中，此类方法引起，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、RANTES和/或IL-17的表达在施用该载体后在肺部减少。在一些实施例中，在载体的施用之后，巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)和/或RANTES的表达未减少。在一些实施例中，本发明提供了用于诱导有需要哺乳动物受试者的抗病毒免疫应答的方法，该哺乳动物受试者患有或面临呼吸道病毒感染，该方法包括：向受试者鼻内施用有效量的E1和E3缺失的腺病毒载体，其中抗病毒免疫应答在施用步骤后，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和/或干扰素α(IFN-γ)的表达增加。在此类方法的一些实施例中，哺乳动物受试者(例如，人类)在向其施用药物制剂之前感染了SARS-CoV-2(例如，在医院进行SARS-CoV-2感染治疗)。在一些实施例中，在施用SARS-CoV-2免疫原性组合物之前、基本同时或之后，一种或多种额外抗SARS-CoV-2药剂可施用至受试者(诸如，例如氯喹(例如，其药物盐和/或衍生物；例如，羟氯喹每天400毫克，连续5天，或200毫克，每天3次，连续10天)，和/或阿奇霉素(例如，第一天500毫克，然后每天4次250毫克的剂量)，和/或瑞德西韦(例如，初始200毫克，然后每天100毫克的剂量)，和/或任何其它合适试剂)。
在一些实施例中，本发明提供了SARS-CoV-2免疫原性组合物，该SARS-CoV-2免疫原性组合物包括一种或多种rdAd抗SARS-CoV-2载体，该rdAd抗SARS-CoV-2载体包括一个或多个SARS-CoV-2抗原编码序列，该编码序列编码一个或多个肽，该肽包括表3A的一个或多个T细胞表位、表3B的一组或多组T细胞表位，或SEQ ID NO:27-282；和/或SEQ ID NO:283-327的一个或多个B细胞表位；和/或SEQ ID NO:328-408的一者或多者；任选地其中该肽进行串联，并且任选地通过两个至十个氨基酸的连接子氨基酸序列来分开。
在一些实施例中，本发明提供了SARS-CoV-2免疫原性组合物，该SARS-CoV-2免疫原性组合物包括一种或多种rdAd抗SARS-CoV-2载体，该rdAd抗SARS-CoV-2载体包括至少一个多核苷酸，该多核苷酸编码至少一种分子佐剂，该分子佐剂选自由以下项组成的组：一种或多种多肽或肽，该多肽或肽作用为共刺激组分；一种或多种细胞因子；一种或多种趋化因子；一种或多种免疫抑制蛋白；一种或多种TLR激动剂，任选地其中一种或多种TLR激动剂选自由SEQ ID NO:463-474；和其组合组成的组。
在一些实施例中，本发明提供了SARS-CoV-2免疫原性组合物，该SARS-CoV-2免疫原性组合物包括一种或多种rdAd抗SARS-CoV-2载体，该rdAd抗SARS-CoV-2载体包括至少一个多核苷酸，该多核苷酸编码至少一种SARS-CoV-2阻断蛋白；其中至少一个多核苷酸序列编码至少一种肽或多肽：该肽或多肽诱导免疫应答，该免疫应答干扰SARS-CoV-2S蛋白与其细胞受体的结合；直接地干扰SARS-CoV-2S蛋白与其细胞受体的结合；为RBD结合剂；为ACE2结合剂；和/或为RBD结合剂和ACE2结合剂两者。
在一些实施例中，本发明提供了编码本文所公开的rdAd抗SARS-CoV-2载体的一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，本发明提供了在宿主细胞中表达此类多核苷酸时所产生的一种或多种rdAd抗SARS-CoV-2载体。在一些实施例中，本发明提供了一种或多种组合物，该组合物包括在一些实施例中作为药物组合物或药物剂型的此类多核苷酸和/或rdAd抗SARS-CoV-2载体。
本发明的优选方面
本发明的优选方面包括：
一种包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体的免疫原性组合物，其中所述rdAd载体选自：
a)缺乏编码外源性非腺病毒抗原的编码序列的rdAd载体；
b)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原的SARS-CoV-2抗原编码序列，任选地其中所述抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)；
c)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2以外的感染性病原体的至少一种外源性抗原；
d)a)和b)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
e)b)和c)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
f)a)、b)和c)任一者的所述载体的任一者的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
g)b)中两种不同类型的rdAd载体的组合，其中每种类型的rdAd载体包括表达盒，所述表达盒编码不同于由所述组合中的其它类型的rdAd载体所编码的抗原的至少一种SARS-CoV-2抗原，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
所述免疫原性组合物配置成施用至哺乳动物受试者时诱导针对SARS-CoV-2的中和抗体和/或细胞免疫应答。
根据先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述表达盒包括用于刺突(S)蛋白或所述刺突蛋白的S1域的SARS-CoV-2抗原编码序列。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述表达盒包括选自由以下项组成的组的SARS-CoV-2抗原编码序列：SEQ ID NO:3；与SEQ ID NO:3具有至少80％(例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同源性和/或同一性的序列；SEQ ID NO:12所示序列；与SEQ ID NO:12具有至少80％(例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同源性和/或同一性的序列；SEQ ID NO:15；与SEQ ID NO:15具有至少80％(例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同源性和/或同一性的序列；SEQ ID NO:446；与SEQ ID NO:446具有至少80％(例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同源性和/或同一性的序列；SEQ ID NO:412-417的任一者；SEQ ID NO:438-445和SEQ ID NO:475-476和460的任一者；与SEQ ID NO:412-417和SEQ ID NO:438-445以及和SEQ ID NO:475-476和460的任一者具有至少80％(例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同源性和/或同一性的序列。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列编码刺突蛋白序列，所述刺突蛋白序列包括以下项：其中S1/S2可裂解位点和/或S2'对蛋白质组降解耐受的序列，和/或其中融合肽已缺失或修饰以防止其融合活性的序列，和/或其中胞内域已修饰或部分地修饰以更改内质网保留基序的序列。根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述表达盒包括选自由以下项组成的组和/或包括以下项至少一者的SARS-CoV-2抗原编码序列：所述S1/S2裂解位点处的NSPQQAQSVAS(SEQ ID NO:451)、NSPSGAGSVAS(SEQ ID NO:456)或NSP-----VAS(SEQ ID NO:461)；所述S2'裂解位点处的KRSFIADA(SEQ ID NO:453)、PSKPSKQSF(SEQ ID NO:457)、PSKPSKNSF(SEQ ID NO:458)、PSKPSNASF(SEQ ID NO:459)；或SRLDPPEAEV(SEQ ID NO:455)；和/或表1和/或表2中所呈现的任何序列修饰。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列为以SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所表示序列或其免疫原性片段。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列至少编码SEQ ID NO:3的氨基酸331至527。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列编码刺突蛋白受体结合域(RBD)序列，所述刺突蛋白受体结合域(RBD)序列包括下述取代的一者或多者：K417N、K417T、R403K、N439K、G446V、G446S、L452R、G476A、S477N、T478K、E484D、T478I、E484K、F490S、Q493R、S494P、P499H和/或N501Y。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列编码刺突蛋白受体结合域(RBD)序列，或其免疫原性片段；和/或包括以下项的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:412-417、SEQ ID NO:438-445、SEQ ID NO:446、SEQ IDNO:460、SEQ ID NO:475和SEQ ID NO:476，或其免疫原性片段。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体的所述表达盒还包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2结构蛋白包膜(E)、膜(M)或核衣壳(N)的一者或多者。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，包括额外复制缺陷腺病毒载体，所述额外复制缺陷腺病毒载体包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2结构蛋白包膜(E)、膜(M)或核衣壳(N)的一者或多者。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体的所述表达盒包括用于SEQ ID NO:411的修饰形式的编码序列；其包括：
氨基酸333-388、390-395、397-399、401-411、413-415、417-419、424、426-435、437、439-442、444-446、449、450、452、453、455-463、465、467-473、475-479、481-486、490、491、493-495、499-510和/或513-526中的任何一者或多者的一个或多个取代；氨基酸367、403、417、439、446、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、490、493、494、495、496、499、500、501、502、503、504和/或505中的任何一者或多者的一个或多个取代；选自由以下项组成的组的一个或多个取代：氨基酸367(V)被F、I、L S或A取代、氨基酸403(R)被K或S取代、417(K)被N或T取代、氨基酸439(N)被K取代、氨基酸446(G)被V、S或A取代、氨基酸449(Y)被N取代、氨基酸452(L)被L、M或Q取代、氨基酸453(Y)被F取代、氨基酸455(L)被F取代、氨基酸456(F)被L取代、氨基酸470(T)被I、A或N取代、氨基酸473(Y)被V取代、氨基酸475(A)被V取代、氨基酸476(G)被S或A取代、氨基酸477(S)被N、R、T、G、A或I取代、氨基酸476(G)被S或A取代、氨基酸477(S)被N、R、T、G、A或I取代、氨基酸478(T)被I、K、R或A取代、氨基酸484(E)Q、K、D、A或R取代被、氨基酸486(F)被L或S取代、氨基酸490(F)被L或S取代、氨基酸493(Q)被L或R取代、氨基酸494(S)被P或L取代、氨基酸495(Y)被N或F取代、氨基酸496(G)被V或S取代、氨基酸499(P)被H，S或R取代、氨基酸500(T)被I取代、氨基酸501(N)被Y、T或S取代、氨基酸502(G)被R、D或C取代、氨基酸503(V)被L、I或F取代、氨基酸504(G)被V、D或S取代和氨基酸505(Y)被H、E、W或C取代。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中SARS-CoV-2之外的感染性病原体的至少一种抗原来源于流感病毒。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，包括a)-c)的所述rdAd载体的任何两者的组合。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物为两部分组合物，所述两部分组合物含有包括a)-c)的rdAd载体的至少一种组合物和包括a)-c)的不同rdAd载体的至少第二组合物。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，还配置成诱导针对SARS-CoV-2粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述编码序列至少编码一个或多个B细胞表位、一个或多个CD8+T细胞表位，和/或一个或多个CD4+T细胞表位。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述编码序列对于所述哺乳动物受试者进行密码子优化。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述中和抗体针对哺乳动物受试者的SARS-CoV-2感染为血清保护的，任选地其中所述哺乳动物受试者为人类。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为人腺病毒，任选地Ad5或Ad26。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为牛腺病毒、犬腺病毒、非人灵长类腺病毒、鸡腺病毒、猪或猪型腺病毒。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为E1、E3和/或E4缺失或破坏的腺病毒。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列编码一个或多个肽，所述一个或多个肽包括表3A的一个或多个T细胞表位，表3B的一组或多组T细胞表位，或SEQ ID NO:27-282；和/或SEQ ID NO:25-68的一个或多个B细胞表位；和/或SEQ ID NO:328-369的一者或多者；任选地其中所述肽进行串联，并且通过两个至十个氨基酸的连接子氨基酸序列来分开。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述rdAd载体还包括至少一种分子佐剂，所述分子佐剂选自由以下项组成的组：一种或多种多肽或肽，所述多肽或肽作用为共刺激组分；一种或多种细胞因子；一种或多种趋化因子；一种或多种免疫抑制蛋白；一种或多种TLR激动剂，任选地其中所述一种或多种TLR激动剂选自由SEQ ID NO:463-474组成的组；和其组合。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述rdAd载体包括至少一个多核苷酸序列，所述至少一个多核苷酸序列编码至少一种SARS-CoV-2阻断蛋白；其中所述至少一个多核苷酸序列编码至少一种肽或多肽：所述肽或多肽诱导免疫应答，所述免疫应答干扰所述SARS-CoV-2S蛋白与其细胞受体的结合；直接地干扰所述SARS-CoV-2S蛋白与其细胞受体的结合；为RBD结合剂；为ACE2结合剂；和/或既为RBD结合剂又为ACE2结合剂。
一种编码根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物的rdAd载体的多核苷酸，一种在宿主细胞中表达所述多核苷酸时所产生的rdAd载体，和一种包括所述rdAd载体的组合物。
一种药物制剂，所述药物制剂包括有效量的根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，和药学上可接受的稀释剂或载体，任选地其中所述稀释剂为磷酸盐缓冲盐水。
根据任一项先前方面所述的药物制剂，所述药物制剂配置用于非侵入性施用。
根据任一项先前方面所述的药物制剂，所述药物制剂配置用于鼻内施用至所述哺乳动物受试者。
根据任一项先前方面所述的药物制剂，其中所述药物制剂至所述哺乳动物受试者的施用诱导了所述哺乳动物受试者的保护性免疫应答，任选地诱导了粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合。
根据任一项先前方面所述的药物制剂，其中所述药学上可接受载体为喷雾或气溶胶形式。
根据任一项先前方面所述的药物制剂，其中所述有效量为至少107个病毒颗粒(vp)，至少108个病毒颗粒(vp)，或至少109个病毒颗粒(vp)。
根据任一项先前方面所述的药物制剂，所述药物制剂配置为单次鼻内剂量。
根据任一项先前方面所述的药物制剂，所述药物制剂配置为两次或更多次鼻内剂量。
一种适用于单次剂量鼻内施用至人受试者的药物制剂，所述药物制剂包括：
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物的有效量的至少107个病毒颗粒(vp)，所述免疫原性组合物包括至少一个复制缺陷腺病毒载体，所述复制缺陷腺病毒载体包括表达盒，所述表达盒包括至少编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)或其至少一个免疫原性片段的编码序列，其中所述有效量诱导了粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合；和
药学上可接受稀释剂或载体。
根据任一项先前方面所述的药物制剂，其中所述制剂配置成向所述人受试者提供针对SARS-CoV-2的血清保护至少6个月。
根据任一项先前方面所述的药物制剂，其中所述编码序列对于所述人受试者进行密码子优化。
一种用于鼻内施用的药物剂量，所述药物剂量包括：
喷雾或气溶胶形式的药学可接受载体，所述药学可接受载体与根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物进行混合，其中所述剂量配置用于鼻内施用以非侵入性地诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答。
根据任一项先前方面所述的药物剂量，其中所述免疫原性组合物包括至少107个病毒颗粒(vp)，至少108个病毒颗粒(vp)，或至少109个病毒颗粒(vp)的有效量。
根据任一项先前方面所述的药物剂量，其中所述有效量诱导了粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合。
根据任一项先前方面的任一项所述的药物剂量，所述药物剂量配置为单次剂量以诱导针对冠状病毒的保护性免疫应答。
根据任一项先前方面的任一项所述的药物剂量，所述药物剂量配置为两次或更多次剂量以诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答。
一种用于诱导针对冠状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物施用至哺乳动物受试者。
根据任一项先前方面所述的方法，其中所述免疫应答针对SARS-CoV-2为保护性的。
一种用于诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的方法，所述方法包括将根据任一项先前方面所述的药物制剂或根据任一项先前方面所述的药物剂量施用至哺乳动物受试者。
根据任一项先前方面所述的方法，其中所述免疫应答针对SARS-CoV-2为保护性的。
根据任一项先前方面所述的方法，所述方法包括将有效量的所述免疫应答组合物鼻内施用至所述哺乳动物受试者，其中所述免疫应答提供针对SARS-CoV-2攻击的保护。
一种诱导针对冠状病毒的人受试者的粘膜、体液和/或T细胞保护性免疫应答组合的方法，所述方法包括：
向人受试者鼻内施用单次剂量的根据任一项先前方面所述的冠状病毒(SARS-CoV-2)药物制剂或根据任一项先前方面所述的药物剂型，其中所述施用诱导了针对SARS-CoV-2的血清抗体、粘膜抗体和T细胞，任选地由此所述人受试者受血清保护至少约6个月或更优选地约9个月。
根据任一项先前方面所述的方法，其中所述血清保护持续至少12个月、至少13个月或至少14个月。
根据任一项先前方面所述的方法，还包括向所述人类施用一种或多种抗细胞因子试剂以预防和/或治疗SARS-CoV-2，任选地其中所述一种或多种抗细胞因子试剂包括一种或多种抗IL-1α试剂、一种或多种抗IL-5试剂、一种或多种抗IL-6试剂、一种或多种抗IL-12试剂、一种或多种抗IL-17试剂、一种或多种抗MCP-1试剂、一种或多种抗TNF-α试剂、一种或多种抗GM-CSF试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。
根据任一项先前方面所述的方法，其中所述一种或多种抗细胞因子试剂不包括一种或多种抗MIPa试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。
根据任一项先前方面所述的方法，其中：
所述一种或多种抗细胞因子试剂与所述有效量的所述免疫原性组合物基本上共同施用；
所述一种或多种抗细胞因子试剂基本上未与所述有效量的所述免疫原性组合物一起施用；
所述免疫原性组合物一次施用至所述哺乳动物并且所述一种或多种抗细胞因子试剂多次施用；或
所述免疫原性组合物与所述一种或多种抗细胞因子试剂一起共同施用至所述哺乳动物，并且所述一种或多种抗细胞因子试剂随后施用至所述哺乳动物。
一种治疗或抑制哺乳动物的呼吸道病毒感染症状的方法，所述呼吸道病毒感染引起白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1-α(IL-1α)和/或白细胞介素-12(IL-12)在所述哺乳动物的肺部中的升高表达，所述方法包括：向所述受试者鼻内施用根据任一项先前方面所述的有效量的E1和E3缺失的腺病毒载体或包含其的制剂或组合物，由此在所述载体的施用之后，IL-6、IL-1α和/或IL-12在所述肺部的表达得以减少，从而缓解所述症状至多约28天。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在所述载体的施用之后，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IFN-γ和/或RANTES的表达在所述肺部中增加。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在所述载体的施用之后，巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)和/或RANTES的表达未减少。
一种在患有或可能患有呼吸道病毒感染的有需要哺乳动物受试者中诱导抗病毒免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者鼻内施用根据任一项先前方面所述的有效量的E1和E3缺失的腺病毒载体或包含其的制剂或组合物，其中在所述施用步骤之后，所述抗病毒免疫应答增加了单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和/或干扰素α(IFN-γ)的表达。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在施用E1和E3缺失腺病毒载体之前、基本同时或之后，向受试者施用一种或多种额外抗SARS-CoV-2药剂，任选地其中所述一种或多种额外药剂选自由氯喹、阿奇霉素、瑞德西韦、抗炎药和其组合组成的组。
根据任一项先前方面所述的方法，其中所述哺乳动物受试者在向其施用所述药物制剂之前感染了SARS-CoV-2。
根据任一项先前方面所述的方法，其中所述哺乳动物受试者为人类。
一种包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体的免疫原性组合物，其中所述rdAd载体选自：
a)缺乏编码外源性非腺病毒抗原的编码序列的rdAd载体；
b)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原的SARS-CoV-2抗原编码序列，任选地其中所述抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)；
c)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2以外的感染性病原体的至少一种外源性抗原；
d)a)和b)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
e)b)和c)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
f)a)、b)和c)任一者的所述载体的任一者的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
g)b)的两种不同类型的rdAd载体的组合，其中每种类型的rdAd载体包括表达盒，所述表达盒编码不同于由所述组合中的其它类型的rdAd载体所编码的抗原的至少一种SARS-CoV-2抗原，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
所述免疫原性组合物配置成诱导针对哺乳动物受试者中SARS-CoV-2的中和抗体和/或细胞免疫应答，所述免疫原性组合物施用至所述哺乳动物受试者，以用于SARS-CoV-2的治疗或预防。
包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体的免疫原性组合物的用途，其中所述rdAd载体选自：
a)缺乏编码外源性非腺病毒抗原的编码序列的rdAd载体；
b)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原的SARS-CoV-2抗原编码序列，任选地其中所述抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)；
c)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2以外的感染性病原体的至少一种外源性抗原；
d)a)和b)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
e)b)和c)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
f)a)、b)和c)任一者的所述载体的任一者的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
g)b)的两种不同类型的rdAd载体的组合，其中每种类型的rdAd载体包括表达盒，所述表达盒编码不同于由所述组合中的其它类型的rdAd载体所编码的抗原的至少一种SARS-CoV-2抗原，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
所述免疫原性组合物配置成诱导针对哺乳动物受试者中SARS-CoV-2的中和抗体和/或细胞免疫应答，所述免疫原性组合物施用至所述哺乳动物受试者；
所述用途特征在于制备用于治疗或预防SARS-CoV-2的药物。
一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体，所述rdAd载体包括编码SEQ ID NO:446或变体的核酸序列，所述变体包括与SEQ ID NO:446至少90％或至少95％的同一性。
根据先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO:15。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO:13。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码以下项的一者或多者：SEQ ID NO:412-417、SEQ ID NO:438-445、SEQ ID NO:475-476和SEQ ID NO:460。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码包括SEQ IDNO:3的一个或多个点突变的序列。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码包括一个或多个突变的序列，所述一个或多个突变处于位置333-388、390-395、397-399、401-411、413-415、417-419、424、426-435、437、439-442、444-446、449、450、452、453、455-463、465、467-473、475-479、481-486、490、491、493-495、499-510或513-526，其中氨基酸编号对应于SEQID NO:411。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码包括一个或多个突变的序列，所述一个或多个突变处于氨基酸位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504和/或505，其中氨基酸的编号对应于SEQ ID NO:411。
根据先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述一个或多个突变选自以下项：由N取代的氨基酸417(K)、由V、S或A取代的氨基酸446(G)、由N取代的氨基酸449(Y)、由F取代的氨基酸453(Y)、由F取代的氨基酸455(L)、由L取代的氨基酸456(F)、由V取代的氨基酸473(Y)、由V取代的氨基酸475(A)、由S或A取代的氨基酸476(G)、由N、R、T、G、A或I取代的氨基酸477(S)、由Q、K、D、A或R取代的氨基酸484(E)、由L或S取代的氨基酸486(F)、由F取代的氨基酸453(Y)、由L或R取代的氨基酸493(Q)、由N或F取代的氨基酸495(Y)、由I取代的氨基酸500(T)、由Y、T或S取代的氨基酸501(N)、由R、D或C取代的氨基酸502(G)、由L、I或F取代的氨基酸503(V)，或由H、E、W或C取代的氨基酸505(Y)，其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:411。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码包括一个或多个突变的序列，所述一个或多个突变选自K417T、K417N、E484K、L452R和/或N501Y，其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:411。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码以下项的一者或多者：SEQ ID NO:412-417。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码以下项的一者或多者：SEQ ID NO:438-443或460。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中编码SEQ ID NO:446的所述核酸序列还包括由核酸序列所编码的前导序列，编码前导序列的所述核酸序列编码选自SEQID NO:418至437的序列。
根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述编码序列对于哺乳动物受试者进行密码子优化。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为牛腺病毒、犬腺病毒、非人灵长类腺病毒、鸡腺病毒、猪或猪型腺病毒，或人腺病毒。
根据先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述非人灵长类腺病毒为黑猩猩或大猩猩腺病毒。
根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为人腺病毒。
根据先前方面所述的免疫原性组合物，其中所述人腺病毒为Ad5或Ad26。
一种药物制剂，所述药物制剂包括有效量的根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物，所述组合物包括至少一种药学上可接受稀释剂或载体，任选地其中所述稀释剂为磷酸盐缓冲盐水。
根据先前方面所述的药物制剂，所述药物制剂配置用于非侵入性或鼻内施用，任选地其中所述药学上可接受载体为喷雾或气溶胶形式。
一种用于诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的根据任一项先前方面所述的免疫原性组合物施用至人类。
根据先前方面所述的方法，其中所述有效量为至少108个病毒颗粒(vp)，至少109个病毒颗粒(vp)，或至少1010个病毒颗粒(vp)。
根据任一项先前方面所述的方法，其中所述免疫原性组合物鼻内地施用。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在施用至人受试者之后，针对SARS-CoV-2的所述免疫应答持续至少6个月、至少9个月或至少12个月。
根据任一项先前方面所述的方法，其中针对SARS-CoV-2的所述免疫应答包括在施用所述免疫原性组合物之后所诱导的针对SARS-CoV-2的粘膜IgA和/或T细胞应答。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了轻度或中度COVID-19相关疾病的发病率。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了重度COVID-19相关疾病的发病率。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了COVID-19相关疾病的严重度。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了SARS-CoV-2感染的发病率。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了无症状COVID-19的发病率。
根据任一项先前方面所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了SARS-CoV-2的传播。
本文还设想出其它实施例，如本领域的技术人员所理解。
实例
下述实例提出用以向本领域的技术人员提供关于如何利用本文所提供实施例的完整公开内容和描述，并且非旨在限制本发明的范围，也非旨在表示下述实例为所有的实验或仅为所执行的实验。已努力确保所用数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另行指示，部分为体积部分，温度为摄氏度。应当理解，所描述的方法变型可在未改变实例旨在说明的基本方面的情况下来做出。
实例1：材料和方法
重组复制缺陷腺病毒5型。复制缺陷人腺病毒5(hAd5)利用先前所描述方法来生成(Miravet等人《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》，2014年，1089,159-173)。简而言之，缺陷hAd5缺乏E1和E3基因，来允许转基因插入物的基因组空间。在一些实施例中，hAd5缺乏任何外源性抗原的编码序列(即，如AdE载体中的非腺病毒抗原)。在一些实施例中，hAd5编码一个或多个SARS-CoV-2抗原(本文称为“hAd5-SARS-CoV-2”)。在一些实施例中，hAd5编码一个或多个流感抗原(如AdD载体中)。hAd5-SARS-CoV-2载体和AdD载体可分别编码任何SARS-CoV-2或流感抗原，对于人类或非人动物(例如，哺乳动物)中的此类抗原为免疫原性的。例如，SARS-CoV-2抗原插入物可编码由SEQ ID NO:1(图1A-J)(诸如SEQ ID NO:2-11、13或15的任一者或多者和/或其任何一个或多个片段和/或衍生物(例如，其至少3、6、9或11个连续氨基酸的肽))所编码的任何蛋白(和/或其任何一个或多个片段和/或衍生物)。表达盒为巨细胞病毒(CMV)即时早期驱动转基因(该转基因任选地编码组织纤溶酶原激活剂信号序列(tPA))，随后为密码子优化的SARS-CoV-2刺突(S)盒，插入到腺病毒载体的E1区域。本发明免疫原性组合物通过RD-Ad5载体在复制容许性CAP细胞中的增殖来制造(
Figure GDA0003417796820001121
等人，《生物医学中心会议记录(BMC Proceedings)》，2011年，5(补编8):P133；Cevec)，随后纯化感染细胞采集的病毒，并且最终产品可包括下述赋形剂(Tris HCl(pH 7.4)、组氨酸、蔗糖、氯化钠、氯化镁、聚山梨酯80、乙二胺四乙酸和乙醇)，最终产品在-80℃下储存。
对于动物和/或临床研究，本发明药物制剂以单次使用玻璃小瓶来供应，每个小瓶包括0.7mL标称体积的免疫原性组合物(例如，疫苗)的无菌冷冻悬浮液，该免疫原性组合物配制成递送1×107、1×108、1×109、1×1010或1×1011个病毒颗粒(vp)的标称剂量。另选地，本发明药物制剂以单次使用(预填充)注射器(任选地具有雾化器(例如，BD Accuspray))来供应，每个注射器包括0.5mL标称体积的免疫原性组合物(例如，疫苗)的无菌冷冻悬浮液，该免疫原性组合物配制成递送1×107、1×108、1×109、1×1010或1×1011个病毒颗粒(vp)的标称剂量。
病灶形成测定。hAd5载体(例如，AdE、hAd5-SARS-CoV-2、AdD)滴定度通过病灶形成测定(FFA)或其它合适测定来执行。简而言之，关于FFA，表达病毒受体(例如，ACE2受体(血管紧张素转换酶2))的细胞在测定的前一天接种于96孔板中，然后病毒原液连续地稀释，让其感染细胞，然后，任选地以甲基纤维素覆盖。细胞在37℃下温育48小时，然后以多聚甲醛固定。利用冠状病毒单克隆抗体和二级抗体的免疫染色用于使hAd5-SARS-CoV-2原液个体感染细胞的病灶形成可视化。
免疫印迹。为确认hAd5(例如，重组hAd5-SARS-CoV-2病毒)的蛋白表达，293细胞(例如，293、CALU-3、Caco-2或Vero)用hAd5-SARS-CoV-2来感染。在37℃、5％CO2二氧化碳条件下经过一个潜伏期(例如，48小时)后，细胞以PBS冲洗一次，并利用2xNuPage缓冲液来采集。样品在95℃下加热10分钟，冷却，并加载至NuPage4-12％凝胶上。将蛋白转移至硝酸纤维素膜，以脱脂牛奶封闭，以TBST中的一种或多种类型的一级抗体进行检测，每种抗体对于一种或多种SARS-CoV-2抗原具有特异性。在过夜温育之后，膜用TBST清洗3次，并且用荧光偶联的二级抗体(分子探针)进行印迹。在二级抗体中一小时之后，膜在TBST清洗3次，并且在PBS清洗一次，然后荧光信号以成像仪来捕获。
胞内细胞因子染色。从接种疫苗后8天的接种小鼠来采集脾脏。将脾脏在100μm的细胞滤网上研磨，并在含有10％FBS和HEPES的RPMI中培养。将约106个细胞接种于圆底96孔板的每个孔中，并且在存在10μg/ml布雷菲德菌素A和α-CD3(2C11克隆)或10μg肽的90％DMSO中，在37℃、5％CO2条件下刺激6小时。肽刺激后，细胞以PBS清洗一次，并对表面标记物进行染色。然后，细胞固定并透化，并且对胞内标记物(例如，IFN-γ)进行染色。细胞通过流式细胞仪进行分析。
ELISA。在4℃下，聚苯乙烯96孔板在碳酸钠缓冲液(pH9.3)中以1μg/ml的SARS-CoV-2抗原包被过夜。板在含有0.02％Tween 20的PBS中清洗三次，并以含有PBS、2％BSA和0.02％Tween 20的脱脂奶粉在37℃下封闭一小时。hAd5(例如，hAd5-SARS-CoV-2)接种小鼠的血清在PBS中连续地稀释，然后在37℃下温育。板以含有0.02％Tween 20的PBS清洗四次，并且以标记的二级抗体温育一小时。在根据需要的清洗和温育之后，板以微板读数器来读取。
以重组复制缺陷腺病毒5型的接种。小鼠利用氯胺酮/赛拉嗪(90mg/kg：10mg/kg)进行麻醉，并且然后以适当体积的1×107个颗粒的PBS中所稀释的hAd5-SARS-CoV-2来鼻内地接种。
动物攻击。SARS-CoV-2在无菌PBS pH7.4中稀释，以获得每只小鼠(例如，表达病毒受体的那些)的SARS-CoV-2的合适最终浓度，最终体积为10至50μL。在hAd5-SARS-CoV-2接种疫苗后的第21天，通过鼻内施用来执行病毒攻击。小鼠在该过程期间利用氯胺酮/赛拉嗪(90mg/kg：10mg/kg)进行麻醉。在攻毒之后，检查每只小鼠的明显创伤，并且放回笼子进行恢复。
临床监测。在SARS-CoV-2攻击之后，每天观察动物的临床结果。每天记录每只动物的体重变化、SARS-CoV-2病毒感染的症状，和死亡率。
实例2：用于针对呼吸道感染的免疫的AdE组合物
本实例所描述的研究评估了在施用用于预防和/或治疗呼吸道感染(例如，可由流感引起)的AdE之后的免疫应答，包括血凝抑制法测定的血清抗体水平和肺部灌洗液的分泌性IgA水平。细胞免疫性通过ELISpot定量测定肺部灌洗液中细胞释放的IFN-γ和IL-4进行评估。此外，腺病毒特异性免疫性利用接种小鼠的血清通过腺病毒中和进行评估。本研究确定了空腺病毒载体(AdE)在小鼠中提供的针对流感甲型H1N1、H3N2、H5N1和乙型流感病毒攻击感染的保护的能力。此外，肺部灌洗液中的细胞因子水平在接种和攻击之后进行评估，以试图确定AdE载体所提供的保护机制。
材料和方法
本实例中所用的缩写包括：IL-白细胞介素；MCP-单核细胞趋化蛋白；IFN-干扰素；TNF-肿瘤坏死因子；MIP-巨噬细胞炎症蛋白；GM-CSF-粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子；以及RANTES-激活后调节的，正常T细胞表达和分泌的。
动物：六周大的雌性BALB/c小鼠获得查尔斯河实验室。小鼠在使用前隔离72小时，并且在犹他州立大学的实验动物研究中心以Teklad啮齿动物饲料(Harlan Teklad)和自来水维持。
病毒：甲型流感/加州/04/2009(大流行H1N1)(菌株编号175190)来自于田纳西州孟菲斯市的圣裘德儿童研究医院感染性疾病部的Elena Govorkova博士。通过小鼠肺部的9次连续传代，病毒适应于在BALB/c小鼠的肺部中复制。病毒在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国菌种收集所(American Type Culture Collection,Manassas,VA))中进行斑块纯化；并且病毒原液通过在胚化鸡卵中生长，然后在MDCK细胞中生长来制备。甲型流感/维多利亚/3/75(H3N2)流感病毒得自于美国菌种收集所(弗吉尼亚州马纳萨斯)。在感染动物肺部的七次连续传代之后，该病毒对于小鼠为致命的。在小鼠适应之后，病毒原液通过在MDCK细胞中的生长来制备。甲型流感/越南/1203/2004(H5N1)得自于疾病控制中心(乔治亚州亚特兰大)。病毒增殖和测定在MDCK细胞中进行。母体病毒传代一次以制备攻击池。乙型流感/四川/379/99病毒得自于疾病控制中心(乔治亚州亚特兰大)。该病毒在MDCK细胞中增殖两次，然后在小鼠中连续传代10次。在小鼠适应之后，病毒原液通过在MDCK细胞中的生长来制备。
AdE组合物：AdE的病毒滴度为6.4×109个感染形成单位(ifu)/ml(3.2×108个ifu/0.05ml)。疫苗通过鼻内途径来施用，单次50μl体积(参见实验设计)。
实验设计：动物数量和研究组描述于表1至表3中。各组小鼠在研究第0天或第20天通过鼻内途径进行接种。安慰剂组通过相同途径接受50μl生理无菌盐水(PSS)。对于流感病毒攻击，在以90μl的甲型流感/CA/04/2009(H1N1p)、甲型流感/维多利亚/3/1975(H3N2)、乙型流感/四川/379/1999或75μl的甲型流感/越南/1203/2004(H5N1)的鼻内攻击之前，小鼠通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪(50mg/kg//5mg/kg)进行麻醉。攻击剂量约为每只小鼠的3倍LD50 CCID50(细胞培养感染剂量)的病毒。所有小鼠在研究第22天接受病毒攻击。攻击后，观察所有小鼠在攻击后第21天的体重下降和死亡率。
表11
观察研究组的死亡率和体重
Figure GDA0003417796820001151
Figure GDA0003417796820001161
表12
用于细胞因子分析的研究组
Figure GDA0003417796820001162
Figure GDA0003417796820001171
表13
细胞分析的阴性对照
Figure GDA0003417796820001172
各组小鼠在研究第0天或第20天通过鼻内途径进行接种。安慰剂组通过相同途径接受50μl生理无菌盐水(PSS)。对于流感病毒攻击，在以90μl的甲型流感/CA/04/2009(H1N1p)、甲型流感/维多利亚/3/1975(H3N2)、乙型流感/四川/379/1999或75μl的甲型流感/越南/1203/2004(H5N1)的鼻内测试之前，小鼠通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪(50mg/kg//5mg/kg)进行麻醉。攻击剂量约为每只小鼠的3倍LD50 CCID50(细胞培养感染剂量)的病毒。所有小鼠在研究第22天接受病毒攻击。攻击后，观察所有小鼠在攻击后第21天的体重下降和死亡率。
统计分析：生成Kaplan-Meier存活曲线，并通过对数秩(Mantel-Cox)检验进行比较，然后利用Prism 5.0f(加利福尼亚州拉霍亚的GraphPad软件公司(GraphPad SoftwareInc.,La Jolla,CA))中的Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行配对比较。平均体重通过方差分析(ANOVA)进行分析，然后利用Prism 5.0f进行Tukey多重比较检验。
支气管肺泡灌洗(BAL)：灌洗过程在采血后立即开始，并在每只动物死亡后5至10分钟内完成。0.75ml体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)通过气管导管缓慢地递送至肺部中。紧随递送后，通过轻柔吸力缓慢地抽出流体，并且样本储存于-80℃下。该过程共重复三次，并且聚集每只小鼠的灌洗液。
肺部病毒滴度确定：BAL样品在2000倍重力下离心5分钟。对MDCK细胞中感染性病毒的不同10倍稀释的BAL上清液一式三份进行测定，其中病毒滴度如先前所描述进行计算(1,2)。假设等同方差和正常分布，病毒滴度差值通过ANOVA针对对数转换数值进行评估。ANOVA之后，利用Prism 5.0f，独立治疗数值通过Tukey配对比较检验与安慰剂对照进行比较。
肺部细胞因子/趋化因子的测定：根据制造商的说明(Quansys Biosciences Q-PlexTMArray公司，犹他州洛根(Logan,UT))，利用基于化学发光ELISA的分析法测定来自每次肺部灌洗的样本(200μl)的细胞因子和趋化因子。Quansys复式ELISA为一种定量检验，其中16种不同捕获抗体已以限定阵列应用至96孔板的每个孔。每个样品上清液以2个稀释度对于以下项进行检验：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、MCP-1、IFN-g、TNF-a、MIP-1a、GM-CSF和RANTES。
细胞因子和趋化因子的滴度以肺部灌洗液的pg/ml为单位进行记录。假设等同方差和正常分布，通过ANOVA针对数值对滴度差值进行评估。此外，使用Prism 5.0f，基于感染后不同天数的效果，通过双向ANOVA评估治疗组平均值。
结果和讨论：
本研究确定了空腺病毒载体(AdE)在小鼠中提供的针对甲型流感H1N1、H3N2、H5N1和乙型流感病毒攻击感染的保护的能力。此外，肺部灌洗液中的细胞因子水平在以甲型流感/CA/04/2009(大流行H1N1)病毒的接种和攻击之后进行评估，以试图确定AdE载体所提供的保护机制。小鼠通过鼻内途径以3.2×108个ifu/50μl的AdE进行接种。单次接种在攻击感染之前三周进行。此外，本研究评估了在攻击感染之前两天施用AdE载体的抗病毒效应。感染后，观察所有小鼠在攻击后第21天的体重下降和死亡率。
据发现，当在攻击之前20天施用时，AdE载体针对以甲型流感/CA/04/2009(大流行H1N1)病毒的攻击提供了100％保护；并且当在攻击之前两(2)天施用时，提供了80％保护。当在攻击之前20天施用时，AdE载体提供了针对甲型流感/维多利亚/3/75(H3N2)病毒的90％保护。然而，由攻击之前两(2)天所施用的AdE载体所提供的保护为非显著的。在甲型流感/越南/1203/2004(H5N1)病毒攻击之前20天所施用的AdE载体未提供针对死亡率的保护，但显著地增加了平均死亡天数。然而，当在攻击之前两(2)天施用AdE载体时，未提供针对甲型流感/越南/1203/2004(H5N1)的保护。当在攻击之前20天施用时，AdE载体还提供了针对乙型流感/四川/379/9病毒的100％保护。此外，当在以乙型流感/四川/379/9病毒的攻击之前两(2)天施用时，AdE载体提供了90％保护。在乙型流感/四川/379/9病毒攻击之后，AdE载体仅提供了针对体重下降的显著保护。AdE的两个施用时间(第0天和第20天)提供了针对攻击之后的体重下降的保护。相比于两个日期的安慰剂对照，在测试之前20天接受AdE的小鼠组示出了甲型流感/CA/04/2009(大流行H1N1)病毒滴度降低1-2个对数。
为确认通过以AdE载体的免疫所提供的保护的免疫机制，确定了甲型流感/CA/04/2009(大流行H1N1)病毒感染之后的肺部灌洗液中细胞因子和趋化因子的表达。在接种后第3天和第6天、接种后第25天和第28天以及攻击后第3天和第6天(与接种后第25天和第28天相同)测量IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、MCP-1、IFN-γ、TNFα、MIP-1α、GM-CSF和RANTES的表达。观察到IL-1α、IL-6、IL-12p70、MCP-1、IFN-γ和RANTES的细胞因子和趋化因子水平的显著变化。相比于安慰剂对照，在攻击感染之后观察到IL-1α、IL-6和IL-12p70的显著下降。未观察到IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17、TNF-α、MIP-1α和GM-CSF的显著变化。当在攻击之前20天施用AdE时，在攻击后第3天观察到IL-1α表达的显著下降(P<0.01)。在攻击和以AdE的接种之后(例如，当在攻击之前20天施用AdE时，攻击后第6天)，观察到肺部灌洗液中IL-6表达的显著下降(P<0.01)。在攻击和以AdE的接种之后，当在攻击之前20天施用AdE时，在攻击后第3天观察到肺部灌洗中IL-12p70表达的显著下降(P<0.01)。在接种之后和在攻击感染之后，观察到肺部灌洗液中MCP-1和IFN-γ表达的显著变化(P<0.01)。所有AdE治疗组的MCP-1水平在接种后第3、6、25和28天增加。然而，当在攻击之前20天施用AdE时，MCP-1水平在攻击后第6天下降。当在攻击之前两(2)天施用AdE时，IFN-γ水平在接种后第6天增加；并且当在攻击之前20天施用AdE时，保持升高，直至接种后第25天和第28天(P<0.001)。此外，当在攻击之前两(2)天施用AdE时，IFNγ水平在攻击后第6天增加约10倍。在接种后第3天(p<0.0001)、第6天(p<0.001)和第25天(p<0.01)观察到RANTES水平的显著变化。本数据汇总于表14中。
表14
Figure GDA0003417796820001191
Figure GDA0003417796820001201
结论
本实例描述了空腺病毒载体(AdE)作为疫苗针对小鼠的甲型流感H1N1、H3N2、H5N1和乙型流感病毒攻击感染的用途。在攻击感染之前三(3)周或攻击感染之前两(2)天，进行单次接种。明显地，当在攻击前20天施用AdE时，提供了针对所有攻击菌株的保护。所观察的针对H5N1病毒的存活效应实际上不是针对死亡率，而是平均死亡天数的增加。此外，当在攻击之前两(2)天施用时，AdE载体提供了针对H1N1和乙型流感病毒攻击的保护。接种后两(2)天所观察的保护表明了先天免疫机制。然而，先天免疫性预计不会在感染后持续四(4)天以上。因此，据观察，除了接种之后三(3)周，在仅两(2)天后也可针对病毒攻击保护小鼠，从而表明一种以上的作用机制。通过接种后和攻击后的MCP-1和IFN-γ的增加水平所表明的一种可能机制为，以AdE的接种导致MCP-1的增加，该MCP-1募集单核细胞、中性粒细胞和/或淋巴细胞，然后刺激IFN-γ的产生。
实例3：SARS-CoV-2疫苗接种的AdE人临床实验
在本实例中，描述了鼻内(i.n.)施用AdE载体(即，复制缺陷ΔE1E3腺病毒5型(Ad5))病毒颗粒(不具有Ad5基因组中所编码的外源性非Ad病原体抗原))以赋予针对SARS-CoV-2的预防疗法的用途。为建立包括AdE载体的免疫原性组合物针对SARS-CoV-2的免疫原性和/或保护性能力，将包括AdE病毒颗粒(vp)的AdE免疫原性组合物施用至人类受试者并且检验其针对SARS-CoV-2的免疫应答的效应。这样，可执行随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增的临床试验，以评估AdE免疫原性组合物在18岁至49岁健康成年人中的安全性和免疫原性。通常随机在28天内(第1天)进行受试者筛查。
例如，研究可包括两个部分：评估AdE免疫原性组合物的安全性的A部分和评估免疫原性的B部分。在A部分中，符合所有纳入标准和无排斥标准并提供书面知情同意书的大约120名受试者纳入四个连续队列，每个队列30名受试者，各自由AdE剂量限定(1×108、1×109、1×1010和1×1011个vp)。在每个队列中(和第一剂量队列中的前哨组)，受试者以4:1:1的比例随机接受一次鼻内剂量的AdE免疫原性组合物(第1天)或一次鼻内剂量的安慰剂(生理盐水)(第1天)。AdE免疫原性组合物和安慰剂以双盲方式来施用。反应原性可通过确定受试者在接种后14天出现局部反应(包括但不限于鼻腔刺激、打喷嚏、鼻塞、咳嗽、喉咙痛、嗅觉改变、味觉改变、视觉改变、眼痛、疼痛、触痛、压痛、红斑、局部淋巴结病)和系统性反应(头痛、疲劳、肌痛、恶心、呕吐、腹泻、咳嗽、寒颤、发热)的数量和百分比来断定。不良反应(AE)确定为从第1天至第57天出现AE的受试者的数量和百分比；确定为在施用AdE免疫原性组合物之后的第1天至第181天的医疗护理AE(MAAE)、严重AE(SAE)和新发慢性疾病(NCI)。例如，可在第4、8、15、22、29和57天执行针对性和症状导向的身体检查，包括生命征象；可在第57天执行心电图；可在第8和57天执行安全实验室检验；并且可在第8、15、22、29、57、91、181和361天执行血清样本抽取以用于免疫原性检验。用于评估A部分的安全特性的主要终点为出现接种后所记录的主动和非主动AE的受试者的数量和百分比(95％置信区间(CI))。安全性分析利用安全群体来执行。出现局部反应和系统性反应的受试者的数量(百分比，95％CI)以组别进行汇总，反应原性也是如此。从第1天至第57天出现AE(包括MAAE、NCI、SAE)的受试者的数量(百分比，95％CI)以优选术语(PT)和组别对于每个《药事管理的标准医学术语集(Medical Dictionary for Regulatory Activities)》的系统器官类别(SOC)进行汇总。从第1天至第181天出现MAAE、NCI和SAE的受试者的数量(百分比)以类似方式进行汇总。出现AE的受试者的数量(百分比，95％CI)以严重度和与研究性产品(IP)的关系也进行汇总。提供了AE、MAAE、NCI和SAE的列表。
在B部分中，确定AdE免疫原性组合物的免疫原性。在通过鼻内喷雾将AdE免疫原性组合物作为1×108、1×109、1×1010和1×1011个vp的单次剂量和作为这些剂量中耐受性最高的两次剂量(相隔3周)施用至受试者之后，免疫应答可通过血清的ELISA进行测量以测量抗SARS-CoV-2抗原抗体，并且确定GMT、几何平均比率(GMR)(相同剂量组内接种后和接种前GMT的比率)和应答率(给药后IgG上升≥4倍)。例如，符合所有纳入标准和无排除标准并且提供书面知情同意书的大约25名受试者以4:1的比例随机接受A部分中最高耐受剂量的AdE免疫原性组合物或安慰剂的两次鼻内剂量，相隔21天(第1天和第22天)。AdE免疫原性组合物和安慰剂以双盲方式来施用。鼻内剂量的AdE免疫原性组合物和安慰剂施用至坐姿或躺姿的受试者。在B部分中，可在第8、15、22、29、36、43、50和57天执行针对性和症状导向的身体检查，包括生命征象；可在第57天执行心电图；可在第8、29和57天执行安全实验室检验；可在第8、15、22、29、57、91、181和361天执行血清样本抽取以用于免疫原性检验；并且可在第8、15、29、36、43、50、57和91天执行鼻咽拭子收集。在筛选时和在第29天和第57天所收集的鼻咽样本也可随后进行检验以用于评估粘膜免疫应答。
在一些实施例中，临床试验可利用已感染SARS-CoV-2感染的患者来执行，并且确定临床改善和/或恢复的时间(或在一些实施例中，所检验患者的队列)。主要结果量度为临床改善时间(TTCI)和/或临床恢复时间(TTCR)，该临床改善时间(TTCI)和/或临床恢复时间(TTCR)在施用如上文所描述的AdE组合物之后的28天内确定。TTCI定义为从研究治疗(活性药物或安慰剂)的开始至临床状态的六种类别顺序标度中的两种类别随机状态的下降的时间(以天为单位)，该临床状态在1(出院)至6(死亡)的范围内。六种类别的顺序标度如下：6.死亡；5.ICU，需要体外膜氧合作用(ECMO)和/或有创机械通气(IMV)；4.重症监护室(ICU)/住院，需要无创机械通气(NIV)/高流量鼻插管(HFNC)治疗；3.住院，需要补充氧气(但不需要NIV/HFNC)；2.住院，不需要补充氧气；和1.出院或符合出院标准(出院标准定义为临床恢复，即发热、呼吸频率、氧饱和度恢复正常，以及咳嗽缓解)。次要结果TTCI量度包括所有原因死亡率(筛查期间的基线SpO2，PaO2/FiO2＜300mmHg或呼吸频率≥24次/分钟，无需补充氧气)；呼吸进展的频率(室内空气中SPO2≤94％或PaO2/FiO2＜300mmHg，并且需要补充氧气或更高级的呼吸机支持)；退热时间(入院时发烧的人)；记录为轻度或无咳嗽的时间(入院时咳嗽评为重度或中度的人)；记录为轻度或无呼吸困难的时间(以重度、中度、轻度、无呼吸困难为标准，入院时呼吸困难评为重度或中度的人)；需要补充氧气或无创通气的频率；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中SARS-CoV-2RT-PCR阴性的时间；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中SARS-CoV-2病毒负荷的变化(减少)，如以病毒负荷曲线下的面积所评估(例如，如利用聚合酶链式反应(PCR)所确定)；需要机械通气的频率；和严重不良事件的频率。TTCI定义为从研究治疗(活性药物或安慰剂)的开始至发烧、呼吸频率和氧饱和度的正常化以及咳嗽缓解的时间(单位为小时)，持续时间至少72小时。主要的TTCR结果量度包括正常化和缓解标准；发热--≤36.9℃腋下或≤37.2℃口腔；呼吸频率--室内空气中≤24次/分钟；氧饱和度--室内空气中>94％；以及，咳嗽--在严重、中度、轻度、不存在的标度上患者记录为轻度或不存在。次要TTCR结果量度与上文所列出TTCI次要结果相同。
标准临床试验设计和统计方法用于其分析中。例如，本研究的样本量选择为足够和合理的，以用于初步审查AdE免疫原性组合物在良好耐受剂量下的安全性和免疫原性特性，而非初步审查统计功效(例如，如上文所描述的120名受试者)。样本量允许反应原性的初始评估。例如，假设共计100名受试者接受AdE免疫原性组合物，该研究设计成具有80％的概率检测到至少一种AE，其发生率为1.6％。如果在接受AdE免疫原性组合物的100名受试者中未观察到SAE，那么SAE发生率的95％置信区间(CI)的单边上限将约为3％。免疫学分析利用可评估和按方案(PP)群体来执行，主要结论来自PP群体。基于“可评估群体”的分析仅在任一组的多于1人的受试者排除在“PP群体”之外的情况下来进行并呈现。利用如下文所描述的异常应答者分析，缺失数据的归纳未执行。数据在分析前进行适当转换。基线定义为在AdE免疫原性组合物施用之前、在第1天所收集的样本。确定用于评估针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫应答(例如，细胞介导应答)的所关注主要变量。在一些实施例中，每个AdE免疫原性组合物剂量组的应答者针对安慰剂组的比较还可利用Fisher精确检验来执行。为确定给药前Ad5血清抗体水平对于第29天(A部分)或第50天(B部分)的AdE免疫原性组合物的免疫原性的影响，以基线Ad5滴度作为协变量采用ANCOVA来进行分析。粘膜免疫原性分析利用可评估和PP群体来执行。缺失数据的归纳未执行。通过ELISA所测量的IgA抗体水平的GMT和GMR作为分析终点。连续参数(安全实验室检验和生命征象)的汇总统计以组别呈现如下：接种前、接种后，以及从接种前到接种后评估的变化。将接种后安全实验室数值或生命征象值记录为新异常(即，毒性级别相对于基线数值增加的情况，和中度或更高的严重度级别的情况)的受试者的数量和百分比制成表格。编制移位表，该移位表以严重度级别对每个受试者的接种前和接种后安全实验室数值进行交叉制表。汇总受试者的数量和百分比，该受试者具有正常、非临床显著异常和临床显著异常的ECG解释。对于Ad5载体的脱落，数据通过以时间点的计数和阳性百分比，以及中值拷贝数进行汇总。对于每个AdE免疫原性组合物组和所有组合免疫原性组合物剂量组，呈现了Ad5脱落的中值持续时间、四分位数范围、Ad5脱落的最小和最大持续时间。还列出了用于评估腺病毒感染的病毒培养结果。
这些研究将示出，AdE组合物可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，其为免疫原性组合物)，并且表现出可接受安全特性。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，数据示出，AdE组合物可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。
实例4
A.重组人腺病毒5型SARS-CoV-2(hAd5-SARS-CoV-2)的生成
E1/E3缺失的复制缺陷hAd5任选地利用组织纤溶酶原激活剂(tPA)前导序列，该前导序列之后为密码子优化核苷酸序列，该核苷酸序列编码至少一种SARS-CoV-2蛋白(例如，SEQ ID NO：2-11的任一者或多者，和/或其一个或多个片段和/或衍生物)。包含巨细胞病毒(CMV)启动子和SARS-CoV-2编码序列的表达盒插入hAd5的E1区域中。该载体在本文称为“hAd5-SARS-CoV-2”。
为研究hAd5-SARS-CoV-2疫苗中SARS-CoV-2蛋白的表达水平，将被SARS-CoV-2感染的Vero细胞的SARS-CoV-2蛋白的表达通过免疫印迹与S特异性的抗SARS-CoV-2兔多克隆相比较。免疫印迹示出，hAd5-SARS-CoV-2疫苗表达了感染细胞中的S。所表达的S抗原也进行测序以验证天然序列。
B.hAd5-SARS-CoV-2疫苗的免疫原性
为了解hAd5-SARS-CoV-2疫苗的免疫原性，八周大小鼠(例如，野生型或转基因型，前提是它们表达了SARS-CoV-2的受体)用足够数量的(例如，1×107)hAd5-SARS-CoV-2病毒颗粒进行鼻内(i.n)免疫。在第八天，在T细胞适应性免疫应答的高峰期，对一部分的接种小鼠实施安乐死，并且SARS-CoV-2抗原特异性CD8+T细胞应答通过胞内细胞因子染色和/或IFN-γELISpot进行评估。脾脏或PBMC T细胞以覆盖抗原的肽池和/或免疫优势SARS-CoV-2肽进行刺激，并且确定IFN-γ产生T细胞的频率。在接种后二十一天，将小鼠放血以评估血清抗体应答。SARS-CoV-2特异性ELISA用于确定SARS-CoV-2S特异性免疫球蛋白(IgG)应答。单次hAd5-SARS-CoV-2接种可生成SARS-CoV-2S特异性IgG应答，例如相对于具有检测限值之下的倒数平均端点滴度的幼稚动物，具有较高倒数平均端点。为确定中和抗体的数量，完成了病灶减少中和检验。
C.SARS-CoV-2的中和
疫苗的病毒中和能力将利用如本实例的章节B所描述的免疫小鼠的血清，利用斑块减少或感染病灶减少方法进行确定。野生型、减毒型或VSV-伪型的SARS-CoV-2S将与各种稀释度的接种小鼠血清混合，并且在室温下温育30分钟，然后感染Vero或其它适当细胞系。然后，病毒中和量化为能够将斑块或感染病灶的数量减少预定值(例如，50％)的最高抗体稀释度。
D.hAd5-SARS-CoV-2免疫原性组合物的保护能力
为建立SARS-CoV-2免疫原性组合物的保护能力，将足够数量的hAd5-SARS-CoV-2病毒颗粒(例如，1×107)鼻内施用至小鼠或其它适当啮齿动物(例如，表达病毒受体的转基因啮齿动物)。二十一天后，该动物以及接种磷酸盐缓冲盐水(PBS)的对照组用SARS-CoV-2进行攻击，并且监测存活期。在严格攻击后，据发现，所有PBS接种对照小鼠表现出关于SARS-CoV-2感染的症状和/或死亡，同时大多数hAd5-SARS-CoV-2接种小鼠存活。对疾病的临床征象进行12天评分，并且发现相比于未接种对照，hAd5-SARS-CoV-2接种小鼠有所改善。此类结果将证实，hAd5-SARS-CoV-2疫苗能够诱导保护性应答，从而导致该动物模型的疾病严重度减小。
E.其它
通过以另一种此类载体(例如，AdE、AdD)取代hAd5-SARS-CoV-2，上文所描述检验还可利用一种或多种其它rdAd抗SARS-CoV-2载体(例如，AdE、AdD)来执行，如本领域技术人员所理解。结果的生成和解释将根据所测试的特定rdAd抗SARS-CoV-2载体进行调整，如本领域技术人员所理解。
实例5：SARS-CoV-2疫苗接种的hAd5-SARS-CoV-2人临床试验
为建立hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物(包括hAd5-SARS-CoV-2病毒颗粒(vp)和至少一种药学上可接受赋形剂)的免疫原性和/或保护能力，将其施用至人受试者并且检验其对于此类受试者的SARS-CoV-2的免疫应答的影响，以及其对于感染SARS-CoV-2的患者(例如，住院患者)的临床改善和/或恢复时间的影响。这样，执行随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增的临床试验，以评估hAdv5-SARS-CoV-2组合物在18岁至49岁健康成年人中的安全性和免疫原性。受试者通常随机在28天内(第1天)进行筛查。
例如，研究可包括两个部分：评估hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物的安全性的A部分和评估免疫原性的B部分。在A部分中，符合所有纳入标准和无排斥标准并提供书面知情同意书的大约120名受试者纳入四个连续队列，每个队列30名受试者，各自由hAdv5-SARS-CoV-2剂量限定(1×108、1×109、1×1010和1×1011个vp)。在每个队列中(和第一剂量队列中的前哨组)，受试者以4:1:1的比例随机接受一次鼻内剂量的hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物(第1天)或一次鼻内剂量的安慰剂(生理盐水)(第1天)。hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物和安慰剂以双盲方式来施用。反应原性通过确定受试者在接种后14天出现局部反应(包括但不限于鼻腔刺激、打喷嚏、鼻塞、咳嗽、喉咙痛、嗅觉改变、味觉改变、视觉改变、眼痛、疼痛、触痛、压痛、红斑、局部淋巴结病)和系统性反应(头痛、疲劳、肌痛、恶心、呕吐、腹泻、咳嗽、寒颤、发热)的数量和百分比可断定。不良反应(AE)确定为从第1天至第57天出现AE的受试者的数量和百分比；确定为在施用hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物之后的第1天至第181天的医疗护理AE(MAAE)、严重AE(SAE)和新发慢性疾病(NCI)。例如，可在第4、8、15、22、29和57天执行针对性、症状导向的身体检查，包括生命征象；可在第57天执行心电图；可在第8和57天执行安全实验室检验；并且可在第8、15、22、29、57、91、181和361天执行血清样本抽取以用于免疫原性检验(例如，血清的酶联免疫吸附测定(ELISA)测量抗SARS-CoV-2抗原抗体，相比于第0天(基线)的几何平均滴度(GMT))。应答率还如下文所描述进行确定(例如，给药后IgG中上升≥四倍)。用于评估A部分的安全特性的主要终点为出现接种后所记录的主动和非主动AE的受试者的数量和百分比(95％置信区间(CI))。安全性分析利用安全群体来执行。出现局部事件和系统性事件的受试者的数量(百分比，95％CI)以组别进行汇总，反应原性也是如此。从第1天至第57天出现AE(包括MAAE、NCI、SAE)的受试者的数量(百分比，95％CI)以优选术语(PT)和组别对于每个《药事管理的标准医学术语集(Medical Dictionary for Regulatory Activities)》的系统器官类别(SOC)进行汇总。从第1天至第181天出现MAAE、NCI和SAE的受试者的数量(百分比)以类似方式进行汇总。出现AE的受试者的数量(百分比，95％CI)以严重度和与研究性产品(IP)的关系也进行汇总。提供了AE、MAAE、NCI和SAE的列表。
在B部分中，确定hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物的免疫原性。在通过鼻内喷雾将hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物作为1×108、1×109、1×1010和1×1011个vp的单次剂量和作为这些剂量中耐受性最高的两次剂量(相隔3周)施用至受试者之后，免疫应答可通过血清的ELISA进行测量以测量抗SARS-CoV-2抗原抗体，并且确定GMT、几何平均比率(GMR)(相同剂量组内接种后和接种前GMT的比率)和应答率(给药后IgG中上升≥4倍)。例如，符合所有纳入标准和无排除标准并且提供书面知情同意书的大约25名受试者以4:1的比例随机接受A部分中最高耐受剂量的hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物或安慰剂的两次鼻内剂量，相隔21天(第1天和第22天)。hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物和安慰剂以双盲方式来施用。鼻内剂量的hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性组合物和安慰剂施用至坐姿的受试者。在B部分中，可在第8、15、22、29、36、43、50和57天执行针对性和症状导向的身体检查，包括生命征象；可在第57天执行心电图；可在第8、29和57天执行安全实验室检验；可在第8、15、22、29、57、91、181和361天执行血清样本抽取以用于免疫原性检验；并且可在第8、15、29、36、43、50、57和91天执行鼻咽拭子收集。在筛选时和在第29天和第57天所收集的鼻咽样本也可随后进行检验以用于评估粘膜免疫应答。
临床试验可在已感染SARS-CoV-2感染的患者中执行，并且确定临床改善和/或恢复的时间(或在一些实施例中，所检验患者的队列)。主要结果量度为临床改善时间(TTCI)和/或临床恢复时间(TTCR)，该临床改善时间(TTCI)和/或临床恢复时间(TTCR)在施用如上文所描述的hAdv5-SARS-CoV-2组合物之后的28天内确定。TTCI定义为从研究治疗(活性药物或安慰剂)的开始至临床状态的六种类别顺序标度中的两种类别随机状态的下降的时间(以天为单位)，该临床状态在1(出院)至6(死亡)的范围内。六种类别的顺序标度如下：6.死亡；5.ICU，需要体外膜氧合作用(ECMO)和/或有创机械通气(IMV)；4.重症监护室(ICU)/住院，需要无创机械通气(NIV)/高流量鼻插管(HFNC)治疗；3.住院，需要补充氧气(但不需要NIV/HFNC)；2.住院，不需要补充氧气；和1.出院或符合出院标准(出院标准定义为临床恢复，即发热、呼吸频率、氧饱和度恢复正常，以及咳嗽缓解)。次要结果TTCI量度包括所有原因死亡率(筛查期间的基线SpO2，PaO2/FiO2＜300mmHg或呼吸频率≥24次/分钟，无需补充氧气)；呼吸进展的频率(室内空气中SPO2≤94％或PaO2/FiO2＜300mmHg，并且需要补充氧气或更高级的呼吸机支持)；退热时间(入院时发烧的人)；记录为轻度或无咳嗽的时间(入院时咳嗽评为重度或中度的人)；记录为轻度或无呼吸困难的时间(以重度、中度、轻度、无呼吸困难为标准，入院时呼吸困难评为重度或中度的人)；需要补充氧气或无创通气的频率；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中2019-nCoV-2RT-PCR阴性的时间；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中SARS-CoV-2病毒负荷的变化(减少)；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中2019-nCoV-2病毒负荷的变化(减少)；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中SARS-CoV-2病毒负荷的变化(减少)，如以病毒负荷曲线下的面积所评估(例如，如利用聚合酶链式反应(PCR)所确定)；需要机械通风的频率；和严重不良事件的频率。TTCI定义为从研究治疗(活性药物或安慰剂)的开始至发烧、呼吸频率和氧饱和度的正常化以及咳嗽缓解的时间(单位为小时)，持续时间至少72小时。主要的TTCR结果量度包括正常化和缓解标准；发热--≤36.9℃腋下或≤37.2℃口腔；呼吸频率--室内空气中≤24次/分钟；氧饱和度--室内空气中>94％；以及，咳嗽--在严重、中度、轻度、不存在的标度上患者记录为轻度或不存在。次要TTCR结果量度与上文所列出TTCI次要结果相同。
标准临床试验设计和统计方法用于分析从试验所获得的数据。例如，本研究的样本量选择为足够和合理的，以用于初步审查hAdv5-SARS-CoV-2组合物在良好耐受剂量下的安全性和免疫原性特性，而非初步审查统计功效(例如，如上文所描述的120名受试者)。样本量允许反应原性的初始评估。例如，假设共计100名受试者接受hAdv5-SARS-CoV-2组合物，该研究设计成具有80％的概率检测到至少一种AE，其发生率为1.6％。如果在接受hAdv5-SARS-CoV-2免疫组合物的100名受试者中未观察到SAE，那么SAE发生率的95％置信区间(CI)的单边上限将约为3％。免疫学分析利用可评估和按方案(PP)群体来执行，主要结论来自PP群体。基于“可评估群体”的分析仅在任一组的多于1人的受试者排除在“PP群体”之外的情况下来进行并呈现。利用如下文所描述的异常应答者分析，缺失数据的归纳未执行。数据在分析前进行适当转换。基线定义为在hAdv5-SARS-CoV-2组合物施用之前、在第1天所收集的样本。用于评估针对SARS-CoV-2的体液免疫应答的所关注主要变量为抗SARS-CoV-2抗原IgG滴度。GMT在基线处和接种后第8、15、22、29、57、91和181天(A部分)和第8、15、22、29、36、43、50、91和181天(B部分)进行确定，并以剂量组进行汇总。hAdv5-SARS-CoV-2组合物剂量和安慰剂之间的比较结果通过协方差分析(ANCOVA)进行评估，其中治疗为固定效应，基线对数转换水平为协变量，并且抗SARS-CoV-2IgG的基线后对数转换水平为因变量。根据这些分析，获得了最小平方(LS)平均值、LS治疗差异，和对数标度上的治疗差异的95％CI。结果通过指数化转换回原始标度，以提供每个研究日的治疗几何LS平均值、几何LS平均值比率的点估计值和这些比率的95％CI。“响应者”定义为抗SARS-CoV-2抗原滴度在第8、15、22、29、57、91和181天(A部分)和第8、15、22、29、36、43、50、91和181天(B部分)比基线上升4倍的受试者。用于确定应答者状态的倍数变化利用无+1转换的后归纳值进行计算，即倍数变化＝当前归纳值/基线归纳值。应答率通过每个剂量组的百分比和该百分比的95％Clopper-Pearson确切CI进行制表。95％CI的差异用于将每个hAdv5-SARS-CoV-2组合物剂量组的应答率与安慰剂组的应答率相比较。在一些实施例中，每个hAdv5-SARS-CoV-2组合物剂量组的应答者针对安慰剂组的比较还可利用Fisher精确检验来执行。为确定给药前Ad5血清抗体水平对于第29天(A部分)或第50天(B部分)的hAdv5-SARS-CoV-2组合物的免疫原性的影响，以基线Ad5滴度作为协变量，使用ANCOVA来进行分析。粘膜免疫原性分析利用可评估和PP群体来执行。缺失数据的归纳未执行。通过ELISA所测量的IgA抗体水平的GMT和GMR作为分析终点。所用方法与体液免疫原性分析相同。连续参数(安全实验室检验和生命征象)的汇总统计以组别呈现如下：接种前、接种后，以及从接种前到接种后评估的变化。将疫苗接种后安全实验室数值或生命征象记录为新异常(即，毒性级别相对于基线数值增加的情况，和中度或更高的严重度级别的情况)的受试者的数量和百分比制成表格。编制移位表，该移位表以严重度级别对每个受试者的接种前和接种后安全实验室数值进行交叉制表。汇总受试者的数量和百分比，该受试者具有正常、非临床显著异常和临床显著异常的ECG解释。对于RD-Ad5载体的脱落，数据通过以时间点的计数和阳性百分比，以及中值拷贝数进行汇总。对于每个hAdv5-SARS-CoV-2组合物组和所有组合hAdv5-SARS-CoV-2组合物剂量组，呈现了Ad5脱落的中值持续时间、四分位数范围、Ad5脱落的最小和最大持续时间。还列出了用于评估腺病毒感染的病毒培养结果。
这些研究将示出，hAdv5-SARS-CoV-2组合物可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(即，其为免疫原性组合物)，并且表现出可接受安全特性。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，数据示出，hAdv5-SARS-CoV-2疫苗组合物可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。
实例6：SARS-CoV-2疫苗的AdD载体人临床试验
在本实例中，描述了AdD载体(即，复制缺陷ΔE1E3腺病毒5型(Ad5)病毒颗粒，其编码来源于SARS-CoV-2之外的感染性病原体的病原体抗原，例如流感，诸如NasoVAX；该NasoVAX为表达流感血凝素(HA)抗原的Ad载体(Ad5)，该Ad载体(Ad5)描述于例如提交于2019年4月6日的系列申请No.62/830,444，该文件以引用方式并入本文并且公开了NasoVAX的制备)的鼻内(i.n.)施用的用途，以赋予针对SARS-CoV-2的预防性治疗。在实施例中，AdD载体诱导针对SARS-CoV-2和与AdD载体表达的外源性抗原相关联的病原体两者的免疫应答，优选地保护性免疫应答。例如，NasoVAX将诱导针对流感和冠状病毒(包括SARS-CoV-2)两者的免疫应答。这样，AdD为双重疫苗，其诱导了针对两种呼吸道感染性病原体的免疫应答。
为建立包括AdD载体的组合物针对SARS-CoV-2的免疫原性和/或保护性能力，包括AdD病毒颗粒(vp)的AdD组合物施用至人类受试者并且检验其针对SARS-CoV-2的免疫应答的效应。这样，可执行随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增的临床试验，以评估AdD免疫组合物在18岁至49岁健康成年人中的安全性和免疫原性。受试者通常随机在28天内(第1天)进行筛查。
例如，研究可包括两个部分：评估AdD组合物(例如，NasoVax)的安全性的A部分和评估免疫原性的B部分。在A部分中，符合所有纳入标准和无排斥标准并提供书面知情同意书的约120名受试者纳入四个连续队列，每个队列30名受试者，各自由AdD剂量限定(1×108、1×109、1×1010和1×1011个vp)，每名受试者在鼻孔之间平均地施用作为鼻腔喷雾的总体积为0.5ml的单次鼻内剂量(“安慰剂”受试者接受0.5ml的不包括AdD的生理盐水，该剂量也作为鼻腔喷雾平均地分布在两个鼻孔之间)。在每个队列中(和第一剂量队列中的前哨组)，受试者以4:1:1的比例随机接受一次鼻内剂量的AdD组合物(第1天)或一次鼻内剂量的安慰剂(生理盐水)(第1天)。AdD组合物和安慰剂以双盲方式来施用。反应原性通过确定受试者在接种后14天出现局部反应(包括但不限于鼻腔刺激、打喷嚏、鼻塞、咳嗽、喉咙痛、嗅觉改变、味觉改变、视觉改变、眼痛、疼痛、触痛、压痛、红斑、区域淋巴结病)和系统性反应(头痛、疲劳、肌痛、恶心、呕吐、腹泻、咳嗽、寒颤、发热)的数量和百分比来确定。不良反应(AE)确定为从第1天至第57天出现AE的受试者的数量和百分比；确定为在施用AdD组合物之后的第1天至第181天的医疗护理AE(MAAE)、严重AE(SAE)和新发慢性疾病(NCI)。例如，可在第4、8、15、22、29和57天执行针对性、症状导向的身体检查，包括生命征象；可在第57天执行心电图；可在第8和57天执行安全实验室检验；并且可在第8、15、22、29、57、91、181和361天执行血清样本抽取以用于免疫原性检验(例如，血清的酶联免疫吸附测定(ELISA)以测量抗SARS-CoV-2抗原抗体和/或抗D抗原抗体，相比于第0天(基线)的几何平均滴度(GMT)，和/或抗SARS-CoV-2和/或抗AdD免疫细胞应答(例如，T细胞应答))。应答率还如下文所描述进行确定(例如，给药后IgG中上升>四倍)。用于评估部分A的安全特性的主要终点为接种后所记录的主动和非主动AE的受试者的数量和百分比(95％置信区间(CI))。安全性分析利用安全群体来执行。出现局部反应和系统性反应的受试者的数量(百分比，95％CI)以组别进行汇总，反应原性也是如此。从第1天至第57天出现AE(包括MAAE、NCI、SAE)的受试者的数量(百分比，95％CI)以优选术语(PT)和组别对于每个《药事管理的标准医学术语集(MedicalDictionary for Regulatory Activities)》的系统器官类别(SOC)进行汇总。从第1天至第181天出现MAAE、NCI和SAE的受试者的数量(百分比)以类似方式进行汇总。出现AE的受试者的数量(百分比，95％CI)以严重度和与研究性产品(IP)的关系也进行汇总。提供了AE、MAAE、NCI和SAE的列表。
在B部分中，确定AdD组合物的免疫原性。在通过鼻内喷雾将AdD组合物以0.5ml的体积(作为鼻腔喷雾平均地分布于鼻孔之间)作为1×108、1×109、1×1010和1×1011个vp的单次剂量(和在一些实施例中，作为这些剂量中耐受性最高的两次剂量(相隔3周))施用至受试者之后，免疫应答可通过血清的ELISA进行测量以测量抗SARS-CoV-2抗原抗体和/或抗AdD抗体，并且确定GMT、几何平均比率(GMR)(相同剂量组内接种后和接种前GMT的比率)和应答率(给药后IgG中上升≥4倍)以及免疫细胞应答(例如，T细胞应答)。例如，符合所有纳入标准和无排除标准并且提供书面知情同意书的大约25名受试者以4:1的比例随机接受A部分中最高耐受剂量的AdD组合物或安慰剂的两次鼻内剂量，相隔21天(第1天和第22天)。AdD组合物和安慰剂以双盲方式来施用。鼻内剂量的AdD组合物和安慰剂施用至坐姿或躺姿的受试者。在B部分中，可在第8、15、22、29、36、43、50和57天执行针对性和症状导向的身体检查，包括生命征象；可在第57天执行心电图；可在第8、29和57天执行安全实验室检验；可在第8、15、22、29、57、91、181和361天执行血清样本抽取以用于免疫原性检验；并且可在第8、15、29、36、43、50、57和91天执行鼻咽拭子收集。在筛选时和在第29天和第57天所收集的鼻咽样本也可随后进行检验以用于评估粘膜免疫应答。
在一些实施例中，临床试验可利用已感染SARS-CoV-2感染的患者来执行，并且确定临床改善和/或恢复的时间(或在一些实施例中，所检验患者的队列)。主要结果量度为临床改善时间(TTCI)和/或临床恢复时间(TTCR)，该临床改善时间(TTCI)和/或临床恢复时间(TTCR)在施用如上文所描述的AdD组合物之后的28天内确定。TTCI定义为从研究治疗(活性药物或安慰剂)的开始至临床状态的六种类别顺序标度中的两种类别随机状态的下降的时间(以天为单位)，该临床状态在1(出院)至6(死亡)的范围内。六种类别的顺序标度如下：6.死亡；5.ICU，需要体外膜氧合作用(ECMO)和/或有创机械通气(IMV)；4.重症监护室(ICU)/住院，需要无创机械通气(NIV)/高流量鼻插管(HFNC)治疗；3.住院，需要补充氧气(但不需要NIV/HFNC)；2.住院，不需要补充氧气；和1.出院或符合出院标准(出院标准定义为临床恢复，即发热、呼吸频率、氧饱和度恢复正常，以及咳嗽缓解)。次要结果TTCI量度包括所有原因死亡率(筛查期间的基线SpO2，PaO2/FiO2＜300mmHg或呼吸频率≥24次/分钟，无需补充氧气)；呼吸进展的频率(室内空气中SPO2≤94％或PaO2/FiO2＜300mmHg，并且需要补充氧气或更高级的呼吸机支持)；退热时间(入院时发烧的人)；记录为轻度或无咳嗽的时间(入院时咳嗽评为重度或中度的人)；记录为轻度或无呼吸困难的时间(以重度、中度、轻度、无呼吸困难为标准，入院时呼吸困难评为重度或中度的人)；需要补充氧气或无创通气的频率；上呼吸道标本中SARS-CoV-2RT-PCR阴性的时间；上呼吸道标本中SARS-CoV-2病毒负荷的变化(减少)，如以病毒负荷曲线下的面积所评估(例如，如利用聚合酶链式反应(PCR)所确定)；需要机械通气的频率；和严重不良事件的频率。TTCI定义为从研究治疗(活性药物或安慰剂)的开始至发烧、呼吸频率和氧饱和度的正常化以及咳嗽缓解的时间(单位为小时)，持续时间至少72小时。主要的TTCR结果量度包括正常化和缓解标准；发热--≤36.9℃腋下或≤37.2℃口腔；呼吸频率--室内空气中≤24次/分钟；氧饱和度--室内空气中>94％；以及，咳嗽--在严重、中度、轻度、不存在的标度上患者记录为轻度或不存在。次要TTCR结果量度与上文所列出TTCI次要结果相同。
在一些实施例中，临床试验可对约120名50岁以上的SARS-CoV-2检测阳性的受试者来执行，这些受试者随机分成安慰剂组和治疗组。安慰剂组接受不包括任何AdD载体的0.5ml的生理盐水，该生理盐水作为鼻腔剂量以鼻孔之间平均分配的单次鼻内剂量来施用。治疗组施用包括任何AdD载体(即，NasoVax)的0.5ml的生理盐水，该生理盐水作为鼻腔剂量以鼻孔之间平均分配的单次鼻内剂量来施用。主要疗效终点为出现急性呼吸窘迫症状(ARDS)和COVID-19(即，SARS-CoV-2感染的症状)的最大严重程度(通过强制呼气量(FEV-1)和放射学标准)的受试者的比例。次要终点包括病毒脱落、机械通气天数和住院时长。
标准临床试验设计和统计方法用于其分析中。例如，本研究的样本量选择为足够和合理的，以用于初步审查AdD组合物在良好耐受剂量下的安全性和免疫原性特性，而非初步审查统计功效(例如，如上文所描述的120名受试者)。样本量允许反应原性的初始评估。例如，假设共计100名受试者接受AdD组合物，该研究设计成具有80％的概率检测到至少一种AE，其发生率为1.6％。如果在接受hAdv5-D(AdD)组合物的100名受试者中未观察到SAE，那么SAE发生率的95％置信区间(CI)的单边上限将约为3％。免疫学分析利用可评估和按方案(PP)群体来执行，主要结论来自PP群体。基于“可评估群体”的分析仅在任一组的多于1人的受试者排除在“PP群体”之外的情况下来进行并呈现。利用如下文所描述的异常应答者分析，缺失数据的归纳未执行。数据在分析前进行适当转换。基线定义为在AdD组合物施用之前、在第1天所收集的样本。确定测定了评估针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫应答的主要变量(例如，抗SARS-CoV-2和/或抗AdD抗原IgG滴度、T细胞应答)。GMT在基线处和接种后第8、15、22、29、57、91和181天(A部分)和第8、15、22、29、36、43、50、91和181天(B部分)进行确定，并以剂量组进行汇总。AdD组合物剂量和安慰剂之间的比较结果通过协方差分析(ANCOVA)进行评估，其中治疗为固定效应，基线对数转换水平为协变量，并且抗SARS-CoV-2IgG的基线后对数转换水平为因变量。根据这些分析，获得了最小平方(LS)平均值、LS治疗差异，和对数标度上的治疗差异的95％CI。结果通过指数化转换回原始标度，以提供每个研究日的治疗几何LS平均值、几何LS平均值比率的点估计值和这些比率的95％CI。“响应者”定义为抗SARS-CoV-2抗原和/或抗D滴度在第8、15、22、29、57、91和181天(A部分)和第8、15、22、29、36、43、50、91和181天(B部分)比基线上升4倍的受试者。用于确定应答者状态的倍数变化利用无+1转换的后归纳值进行计算，即倍数变化＝当前归纳值/基线归纳值。应答率通过每个剂量组的百分比和该百分比的95％Clopper-Pearson确切CI进行制表。95％CI的差异用于将每个AdD组合物剂量组的应答率与安慰剂组的应答率相比较。在一些实施例中，每个AdD组合物剂量组的应答者针对安慰剂组的比较还可利用Fisher精确检验来执行。为确定给药前Ad5血清抗体水平对于第29天(A部分)或第50天(B部分)的AdD组合物的免疫原性的影响，以基线Ad5滴度作为协变量并采用ANCOVA来进行分析。粘膜免疫原性分析利用可评估和PP群体来执行。缺失数据的归纳未执行。通过ELISA所测量的IgA抗体水平的GMT和GMR作为分析终点。所用方法与体液免疫原性分析相同。连续参数(安全实验室检验和生命征象)的汇总统计以组别呈现如下：接种前、接种后，以及从接种前到接种后评估的变化。将接种后安全实验室数值或生命征象记录为新异常(即，毒性级别相对于基线数值增加的情况，和中度或更高的严重度级别的情况)的受试者的数量和百分比制成表格。编制移位表，该移位表以严重度级别对每个受试者的接种前和接种后安全实验室数值进行交叉制表。汇总受试者的数量和百分比，该受试者具有正常、非临床显著异常和临床显著异常的ECG解释。对于Ad5载体的脱落，数据通过以时间点的计数和阳性百分比，以及中值拷贝数进行汇总。对于每个AdD组合物组和所有组合免疫组合物剂量组，呈现了Ad5脱落的中值持续时间、四分位数范围、Ad5脱落的最小和最大持续时间。还列出了用于评估腺病毒感染的病毒培养结果。
这些研究将示出，AdD组合物可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，其为免疫原性组合物)，并且表现出可接受的安全特性。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，数据示出，AdD组合物可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。
实例7：用于预防早期发病COVID-19患者的临床恶化的NasoVAX的双盲、随机、安慰剂对照研究
在本实例中，NasoVAX用作感染早期阶段的治疗，或用作直接抗病毒药剂的伴随治疗。关于COVID-19的治疗，NasoVAX(和AdE)被证实，在临床前小鼠模型中提供针对呼吸道病毒的致命攻击的保护，这种效果在短短2天内出现并持续3周或更长。参见美国专利No.9,175,310。在上述实例2中，AdE(无转基因表达)的用途与IL-6、IL-1和IL-12的下调相关联。这些为已证实用于介导COVID-19的肺间质炎症的细胞因子。NasoVAX和AdE在临床前小鼠模型中所提供的保护可归因于腺病毒载体，因为在存在或不存在表达流感血凝素(HA)抗原的转基因的情况下，该载体具有相应效果。NasoVAX的保护效果可视为调节先天免疫的生物应答，该生物应答抑制了对于呼吸道病原体的过度和致病性免疫应答。这将类似于IL-6抑制剂Kevzara(沙利叶酸)和Actemra(托西珠单抗)的用途，以调节与COVID-19有关的肺部炎症。在实施例中，当鼻内施用时，腺病毒载体(表达或未表达呼吸道病原体的转基因)改善了COVID-19疾病症状。
该载体方法的优势在于，不同于可用于调节与COVID-19相关的肺部炎症的其它药剂(例如，Kevzara(沙利叶酸)和Actemra(托西珠单抗))，NasoVAX鼻内地施用，从而为其它药物留出静脉通道；不限于单一细胞因子；不具有血液学副作用(例如，中性粒细胞减少症)；并且表现出延长作用时间，该延长作用时间将在疾病过程的极早阶段用于调节后续细胞因子损伤。此外，如下文实例9所示，当腺病毒载体免疫原性组合物鼻内施用时，避开了受试者(例如，对于病毒载体(即，Ad5)为血清阳性的受试者)的腺病毒免疫，从而允许重复给药和/或对腺病毒血清阳性受试者重复给药。
因此，在一些实施例中，NasoVAX可用作感染早期的疗法；或用作COVID-19的伴随疗法，在一些实施例中，与直接抗病毒药剂(例如，氯喹、阿奇霉素)联合使用。在一些时刻，原料药可转变成产品，其中载体单独施用(例如，不含转基因的AdE)。
NasoVAX通过分离细菌菌落来制备，该细胞菌落包含大重组腺病毒质粒，所述质粒携带来自甲型流感/加利福尼亚/04/2009(pAdcoCA09.HA)的密码子优化人血凝素cDNA。在利用流式细胞电穿孔技术(型号STX-100，马里兰州盖瑟斯堡Maxcyte公司(MaxcyteInc.Gaithersburg,MD))将pAdcoCA09.HA质粒以单次操作大规模转染至约4×109个细胞中之后，AdcoCA09.HA重组载体从PER.C6细胞的悬浮液回收。在采集时，感染细胞和含有任何释放载体的生长培养基要经受三个周期的冷冻-解冻，然后通过CsCl等密度离心和针对最终产品形成缓冲液的渗析来分离和纯化载体。纯化载体在PER.C6细胞中扩增，通过三个周期的冷冻-解冻从感染细胞沉淀物释放以形成感染细胞裂解液，该感染细胞裂解液通过离心进行澄清并且作为前主代病毒种子进行无菌过滤。NasoVAX前MVS在检验之后释放。AdcoCA09.HA的制备包括载体扩增步骤，由此载体前MVS在cGMP条件下扩增以增加用于生产运行感染的可用种子原液。本中间扩展步骤的产品为AdcoCA09.HA MVS。AdcoCA09.HA MVS的生产始于前MVS的cGMP载体扩增，然后是MVS的衍生、生产和表征。原料药的制备包括悬浮液中PER.C6细胞的AdcoCA09.HA感染，然后聚集细胞沉淀物的载体，从细胞沉淀物释放载体，使裂解液澄清，并且利用两种连续阴离子交换层析树脂来使载体纯化。产品洗脱液针对制剂缓冲液进行渗漏，必要时进行浓缩，并且进行无菌过滤以形成原料药物质(BDS)。在以制剂缓冲液稀释至适当强度之后，从BDS获得了最终药物产品(FDP)，并且在填充至最终容器中之前进行无菌过滤。本实例中将使用的检验产品为以单次使用玻璃注射器所提供(例如，1×109、1010和/或1011个vp)的NasoVAX，该注射器包含500μL的LA195缓冲液(10mM Tris、10mM组氨酸、5％(w/v)蔗糖、75mM NaCl、1mM MgCl2、0.02％(w/v)聚山梨酯80、0.1mM EDTA、0.5％(v/v)乙醇，pH 7.4)中的无菌冷冻悬浮液。注射器(BD，AccusprayTM)设计成将250μL的鼻内喷雾递送至每个鼻孔。另选地，NasoVAX以2mL玻璃小瓶来提供，其中剂量移动至结核菌素注射器并且在鼻内施用之前附连至LMA MAD300雾化器装置(泰利福公司，以色列)。稳定性样本作为检验产品以相同剂型和容器(BD AccusprayTM)来封装，并且利用稳定性指示测定进行检验，包括病毒颗粒的物理稳定性(病毒颗粒检验，HPLC)、病毒的感染性(感染性滴度，腺病毒荧光病灶单位(FFU)测定)、腺病毒载体的功能性(转基因表达)(效力)、制剂的物理稳定性(外观和pH值)和无菌性。
在本实例中，描述了包括早期发病COVID-19的约120名患者的临床试验，这些患者以1:1随机分成NasoVAX(1×1011个vp剂量)或安慰剂并且以年龄进行分层。每位患者将参与至多约6周的研究(2周的治疗期和1个月的电话随访)。纳入本研究的患者利用下述非限制性标准来选择：能够并愿意提供知情同意书；35岁及以上的男性和女性；早期发病COVID-19，定义为口腔温度≥38.0℃，在48小时内症状发作，和在随机化24小时内通过基于PCR的诊断确认COVID-19；饱和O2(SaO2)≥96.0％，连续两次测量休息5分钟；有生育能力的女性(非永久不育[有记录的子宫切除术、双侧输卵管结扎术、输卵管切除术或卵巢切除术]或绝经后[12个月无月经且无其它医疗原因]的女性)，该女性在筛查时表现出尿妊娠试验阴性并愿意采取高效避孕方法，该避孕方法包括但不限于禁欲、仅与同性的性关系、与绝经后伴侣的一夫一妻关系、与已结扎伴侣的一夫一妻关系、输精管切除术、许可的荷尔蒙方法、宫内避孕器，或具有杀精剂的屏障避孕法(例如，避孕套、避孕膜)在最后剂量的研究药物后28天内的持续使用；具有生育能力的性伴侣的男性，该男性愿意在最后剂量的研究药物后45天内采用如上文所描述的高效避孕方法；能够并愿意在整个研究周期内遵守本研究的所有方面。排除标准包括：孕妇或哺乳期女性；休息时中度或重度气短；体检结果表明快速疾病进展，需立即住院，阻塞性气道疾病，包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘，或其它可独立于COVID-19所引起那些加剧的呼吸道疾病；可影响鼻内用药适宜性的鼻部病症，诸如慢性鼻炎、鼻中隔缺损、腭裂、鼻息肉或美容隆鼻以外的鼻部手术的病史；过去30天内使用氯喹和羟氯喹以及其它COVID-19的研究性药剂；筛选后30天内与免疫功能低下有关的病史，或已知影响免疫系统的治疗，包括但不限于口服或静脉注射皮质类固醇、烷基化药物、抗代谢药、细胞毒性药物、辐射、免疫调节生物制剂；以及根据调查员的判断，将干扰遵守方案、安全性评估(包括反应原性)或患者给予知情同意的能力或成为其禁忌的任何医疗、精神病或社会状况或职业或其它责任。
患者在COVID-19诊断的24小时内，以1:1随机分成NasoVAX或安慰剂，该NasoVAX或安慰剂作为0.5mL(每个鼻孔0.25mL)的单次鼻内剂量来施用。首批20名研究参与者(大约10名以NasoVAX治疗，并且10名以安慰剂治疗)由35至49岁患者的前哨队列组成。患者提供有一次性指尖血氧仪和数字温度计，并在试验期间返回家中。使用移动/智能电话脉搏血氧仪和网络日志，SaO2、口腔温度和脉搏呼吸率在休息时进行远程监测(每天两次，每次2分钟，持续14天)，以记录口腔温度、症状和伴随药物并且每天打电话以记录临床状态和不良反应(AE)。在远程监测的最后日期之后，大约每7±2天给患者打电话以记录最终结果和不良反应。SAE、医院和ICU入住时长，以及住院患者的死亡率将进行记录。在研究期间，预计无亲身访问。
关于疗效，本研究的主要目标是评估NasoVAX对于预防出现早期发作COVID-19的患者的临床恶化的有效性；并且次要目标是评估NasoVAX对于减少出现早期发作COVID-19的患者的ICU入院和机械通气的比率以及减少出现早期发作COVID-19的患者(需要住院)的COVID-19严重度的有效性。主要终点为临床恶化的患者比例，定义为在家庭随访或住院期间通过移动脉搏血氧仪的任何测量中，平均SaO2至94％或更低水平的4％下降。在门诊患者中，次要疗效终点包括COVID-19的严重度(通过在家庭随访期间由门诊脉搏血氧仪所测量的SaO2和自发通气率的最大下降来评估)，和需要机械通气的患者比例。在住院患者中，次要疗效终点包括无呼吸机天数，定义为第1天和第30天的研究药物给药之间的每一天的一个时间点(天)，患者在该时间点活着并且无需机械通气；和动脉血氧分压与吸入氧分数的比率(P/F比率)。
关于安全性，主要目标是评估NasoVAX对于预防早期发作COVID-19患者的临床恶化的安全性和耐受性。这些包括不良反应(AE)的发生率和严重度、死亡率、住院时长和ICU入住时长。安全性终点是在家中记录的AE与在医疗护理的住院期间所记录的AE之间单独地分类。
统计方法包括功效和样本量假设：接受NasoVAX的10％患者出现临床恶化，而接受安慰剂的患者为29％(每种治疗方式60名)，在单侧0.05提供77％的功效以实现主要疗效变量的统计意义。群体定义包括：“安全性分析设定”：接受任何研究药物的所有患者；“意向性治疗”(ITT)：接受任何数量的研究药物的所有随机患者，具有基线和至少一个基线后SaO2测量值，受试者根据他们接受的治疗进行分析；和，“按方案”(PP)：根据正确治疗分配而接受任何量的研究药物和在第14天或住院期间具有每天两次的SaO2测量值的所有随机患者。基线定义为，在任何研究药物给药之前所收集的最接近随机化的数据。所有分析和汇总统计以治疗组(NasoVAX，安慰剂)来呈现。描述性统计(包括分类变量的数字和百分比，以及连续变量的数字、平均值、标准偏差、中值、最小值和最大值)通过治疗来提供。患者以1:1随机分成NasoVAX组或安慰剂组，并且以年龄组进行分层(35至49岁与50岁及以上)。为确保前哨队列中NasoVax和安慰剂的1:1分配(20名患者中各10名)，该组的随机分配未进行分层。关于疗效分析，描述性统计用于评估人口统计和基线特征的差异。关于初步分析，使用Cochrane Mantel Haenszel检验，表现临床恶化(定义为在家庭随访或住院期间通过移动脉搏血氧仪的任何测量中，平均SaO2至94％或更低水平的4％下降)的患者比例以0.05％单侧显著性水平在NasoVAX组和安慰剂组之间进行比较。相同方式适用于次要或探索性终点，这些终点本质上是分类的。过早停药或数据缺失的受试者视为该终点的非应答者。执行敏感性分析从而评估部位对于研究药物应答的影响。线性和逻辑回归用于检查基线因素(诸如年龄、性别、药物和医疗并存症)对于应答的影响。定量安全数据利用描述性统计和频率分布进行汇总。所有汇总以治疗方式来呈现。AE利用《药事管理的标准医学术语集(MedicalDictionary for Regulatory Activities)》
Figure GDA0003417796820001381
进行编码，伴随药物利用世界卫生组织(WHO)药物词典进行编码。COVID-19严重度(通过在家庭随访期间由门诊脉搏血氧仪所测量的SaO2和自发通气率的最大下降来评估)的基线变化利用重复测量混合模型(MMRM)进行分析。模型将包括固定治疗效果、分层因素、周数，和治疗-就诊相互作用，以及基线水平的连续协变量。模型将采用非结构化患者内部协方差矩阵和限制最大似然(ReML)估计方法。无呼吸机天数利用t检验或Mann-Whitney对于连续数据进行分析。建立Kaplan-Meier模型以比较治疗组之间的SaO2随时间的变化。对于次要或探索性终点未进行多重调整。
这些研究将示出，NasoVAX可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，其为免疫原性组合物)，并且表现出可接受的安全特性。数据还将示出，NasoVAX有效地减少COVID-19早期发病患者的ICU入住和机械通气的比率，和需要住院的COVID-19早期发病患者的COVID-19严重度。在一些实施例中，在将NasoVAX施用至受试者之后，炎症细胞因子(诸如IL-1α、IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或RANTES(CCL5))的表达减少(参见例如，实例2)可出现；并且在一些实施例中可用于诊断COVID-19，和/或预测其恢复，并且用于相应地调整治疗方案(例如，非NasoVAX治疗)。在一些实施例中，MCP1和/或RANTES在施用NasoVAX后短期内的增加可用于预测(例如，作为标记)COVID-19的恢复和症状的改善。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，数据示出，NasoVAX组合物可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。
实例8.室温下的NasoVAX稳定性
本实例描述了NasoVAX液体制剂在室温下的长期稳定性。室温下的长期稳定性为疫苗的期望特征，该疫苗可在其中冷藏或用于稳定制剂的手段不可用的情况下使用。这在流行病或大流行情况(在这种情况下，疫苗需运输至远程区域(该区域可缺少设备来将制剂维持于较冷温度下)，或直接地运输至终端用户，诸如在家或隔离区自行隔离的个人)下将为重要的。如下表9和表10所示，低剂量(2×109vp/mL剂量)和高剂量(2×1011vp/mL剂量)的制剂分别制备并且在玻璃小瓶中在室温下维持一个月、三个月和六个月。NasoVAX载体的活力利用腺病毒荧光病灶单元(FFU)进行确定。简而言之，FFU测定通过以适当的NasoVAX稀释液感染细胞单层并且温育24-48小时来执行。然后，清洗细胞、检查、固定(例如，冰冷90％甲醇中4分钟)，并再次清洗。然后，以各种稀释度添加抗Ad5抗体(对照样本中省略了抗体)，然后在适当条件下(例如，室温下摇晃十分钟)添加检测剂(例如，NCL腺病毒(Novocastra，英国纽斯卡尔))。然后，清洗细胞，并且确定感染性颗粒的总数(例如，通过数字光散射(DLS))。如表15和表16所示，低剂量和高剂量的NasoVAX制剂在室温下至少三个月为稳定的。
本研究示出，腺病毒载体疫苗组合物(例如，AdD、NasoVAX)在环境温度下，诸如室温下(例如，15至30℃，优选地20至25℃)，约3个月为稳定的。在实施例中，腺病毒载体疫苗组合物可储存或运输，无需冷藏或特定储存条件。在某些实施例中，本发明鼻内腺病毒载体疫苗配置成诱导针对SARS-CoV-2病毒(大流行冠状病菌株)感染的免疫应答和/或改善COVID-19疾病症状，并且可直接地运输至用户以用于鼻内施用。
表15
NasoVAX的稳定性数据(2x109vp/mL剂量)
Figure GDA0003417796820001391
Figure GDA0003417796820001401
表16
NasoVAX的稳定性数据(2x1011vp/mL剂量)
Figure GDA0003417796820001402
Figure GDA0003417796820001411
实例9：NasoVAX脱落和抗NasoVAX载体抗体
NasoVAX事先在2a期、随机、双盲、安慰剂对照试验进行评估，以评估NasoVAX(单价Adco.CA.HA)在18至49岁健康成人中的安全性和免疫原性。受试者随机分配并赋予单次剂量的1×109、1×1010和1×1011个病毒颗粒(vp)或盐水安慰剂，均作为0.5mL剂量来赋予，每个鼻孔大约0.25mL鼻腔喷雾。该方案描述于提交于2019年4月6日的美国系列No.62/830,442中。
该研究的次要目标是评估受试者的针对腺病毒载体(Ad5)的免疫应答，该受试者在施用NasoVAX时对于Ad5为血清阳性的(相比于血清阴性的受试者)。在给药后4天、8天和15天，从每个受试者收集鼻咽拭子样本，并且每个受试者所脱离的Ad5载体的浓度通过聚合酶链式反应(PCR)测定进行量化。如图25所示，NasoVAX载体的剂量依赖性脱落直至给药后第8天检测到，并且在第15天未检测到。未检测到具有复制能力的病毒。
图25还示出了在施用单次鼻内剂量的109个vp、1010个vp或1011个vp的NasoVAX后，针对NasoVAX的Ad5载体组分的抗体GMR。如其中所示，相比于对照，最高剂量(1011个vp)的施用令人惊讶地仅导致受试者的抗Ad5载体抗体的约2.3倍诱导。这是一项重要发现，因为其指示，鼻内施用途径可用于NasoVAX或潜在其它腺病毒载体免疫原性组合物(包括Ad5基载体)的重复给药。
图26示出了在将单次鼻内剂量(1011个vp)的NasoVAX施用至受试者之后，预存在抗Ad5免疫对于Ad5血清状态的影响。如其中所示，在施用鼻内剂量的NasoVAX之后，预存在抗Ad5免疫(“Ad5血清阳性”(中值滴度高于定量下限值(“LLOQ”)22倍)对于体液(HAI)、微中和(MN)、粘膜(IgA)或细胞(ELISpot)抗Ad5免疫具有小影响。这是另一项重要发现，因为其指示，NasoVAX甚至可以鼻内地施用至对于Ad5具有预存在免疫的受试者。在实施例中，本发明鼻内腺病毒载体疫苗可重复地施用(例如，作为季节性疫苗，约每11至14个月施用一次)，而不诱导针对病毒载体的显著免疫应答。
实例10：作为SARS-CoV-2疫苗的组合rdAd抗SARS-CoV-2载体的人临床试验
在本实例中，描述了rdAd抗SARS-CoV-2载体的组合物(例如，“组合SARS-CoV-2组合物”)的鼻内(i.n.)施用，以赋予针对SARS-CoV-2的预防性疗法。为建立此类免疫原性组合物的免疫原性和/或保护能力，包括AdE的组合物施用至人类，然后七天后施用包括hAd5-SARS-CoV-2的组合物，然后检验这种组合对于人类的针对SARS-CoV-2的免疫应答的影响。依次施用的组合物AdE和包括hAd5-SARS-CoV-2的组合物在本文称为“组合SARS-CoV-2组合物”。这样，可执行随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增的临床试验，以评估组合SARS-CoV-2组合物在18岁至49岁健康成年人中的安全性和免疫原性。受试者通常随机在28天内(第1天)进行筛查。
例如，研究可包括两个部分：评估组合SARS-CoV-2组合物的安全性的A部分和评估免疫原性的B部分。在A部分中，符合所有纳入标准和无排斥标准并提供书面知情同意书的大约120名受试者纳入四个连续队列，每个队列30名受试者，各自由组合SARS-CoV-2组合物剂量限定(每次剂量1×108、1×109、1×1010和1×1011个vp)。在每个队列中(和第一剂量队列中的前哨组)，受试者以4:1:1的比例随机接受一次鼻内剂量的组合SARS-CoV-2组合物(第1天接受AdE组合物，然后在第7天接受hAd5-SARS-CoV-2组合物)或多次鼻内剂量的安慰剂(生理盐水)(第1天和第7天)。组合SARS-CoV-2组合物和安慰剂以双盲方式来施用。反应原性通过确定受试者在接种后14天出现局部反应(包括但不限于鼻腔刺激、打喷嚏、鼻塞、咳嗽、喉咙痛、嗅觉改变、味觉改变、视觉改变、眼痛、疼痛、触痛、压痛、红斑、区域淋巴结病)和系统性反应(头痛、疲劳、肌痛、恶心、呕吐、腹泻、咳嗽、寒颤、发热)的数量和百分比得以确定。不良反应(AE)确定为从第1天至第57天出现AE的受试者的数量和百分比；确定为在施用组合SARS-CoV-2组合物或安慰剂之后的第1天至第181天的医疗护理AE(MAAE)、严重AE(SAE)和新发慢性疾病(NCI)。例如，可在第4、8、15、22、29和57天执行针对性、症状导向的身体检查，包括生命征象；可在第57天执行心电图；可在第8和57天执行安全实验室检验；并且可在第8、15、22、29、57、91、181和361天执行血清样本抽取以用于免疫原性检验(例如，血清的酶联免疫吸附测定(ELISA)以测量抗SARS-CoV-2抗原抗体，相比于第0天(基线)的几何平均滴度(GMT)，和/或抗SARS-CoV-2免疫细胞应答(例如，T细胞应答))。应答率还如下文所描述进行确定(例如，给药后IgG中上升>四倍)。用于评估A部分的安全特性的主要终点为出现接种后所记录的主动和非主动AE的受试者的数量和百分比(95％置信区间(CI))。安全性分析利用安全群体来执行。出现局部反应和系统性反应的受试者的数量(百分比，95％CI)以组别进行汇总，反应原性也是如此。从第1天至第57天出现AE(包括MAAE、NCI、SAE)的受试者的数量(百分比，95％CI)以优选术语(PT)和组别对于每个《药事管理的标准医学术语集(Medical Dictionary for Regulatory Activities)》的系统器官类别(SOC)进行汇总。从第1天至第181天出现MAAE、NCI和SAE的受试者的数量(百分比)以类似方式进行汇总。出现AE的受试者的数量(百分比，95％CI)以严重度和与研究性产品(IP)的关系也进行汇总。提供了AE、MAAE、NCI和SAE的列表。
在B部分中，确定组合SARS-CoV-2组合物的免疫原性。在通过鼻内喷雾将组合SARS-CoV-2组合物作为1×108、1×109、1×1010和1×1011个vp的单次剂量(即，这些剂量中耐受性最高的组合SARS-CoV-2组合物(在第1天施用AdE组合物，然后在第7天施用hAd5-SARS-CoV-2组合物))施用至受试者之后，免疫应答可通过血清的ELISA进行测量以测量抗SARS-CoV-2抗原抗体、GMT、几何平均比率(GMR)(相同剂量组内接种后和接种前GMT的比率)和应答率(给药后IgG中上升>4倍)以及免疫细胞应答(例如，T细胞应答)。例如，符合所有纳入标准和无排除标准并且提供书面知情同意书的大约25名受试者以4:1的比例随机接受A部分中最高耐受剂量的组合SARS-CoV-2组合物或安慰剂的两次鼻内剂量，相隔21天(第1天和第22天)。组合SARS-CoV-2组合物和安慰剂以双盲方式来施用。鼻内剂量的组合SARS-CoV-2免疫原性组合物和安慰剂施用至坐姿或躺姿的受试者。在B部分中，可在第8、15、22、29、36、43、50和57天执行针对性和症状导向的身体检查，包括生命征象；可在第57天执行心电图；可在第8、29和57天执行安全实验室检验；可在第8、15、22、29、57、91、181和361天执行血清样本抽取以用于免疫原性检验；并且可在第8、15、29、36、43、50、57和91天执行鼻咽拭子收集。在筛选时和在第29天和第57天所收集的鼻咽样本也可随后进行检验以用于评估粘膜免疫应答。
在一些实施例中，临床试验可利用已感染SARS-CoV-2感染的患者来执行，并且确定临床改善和/或恢复的时间(或在一些实施例中，所检验患者的队列)。主要结果量度为临床改善时间(TTCI)和/或临床恢复时间(TTCR)，该临床改善时间(TTCI)和/或临床恢复时间(TTCR)在施用如上文所描述的组合SARS-CoV-2组合物之后的28天内确定。TTCI定义为从研究治疗(活性药物或安慰剂)的开始至临床状态的六种类别顺序标度中的两种类别随机状态的下降的时间(以天为单位)，该临床状态在1(出院)至6(死亡)的范围内。六种类别的顺序标度如下：6.死亡；5.ICU，需要体外膜氧合作用(ECMO)和/或有创机械通气(IMV)；4.重症监护室(ICU)/住院，需要无创机械通气(NIV)/高流量鼻插管(HFNC)治疗；3.住院，需要补充氧气(但不需要NIV/HFNC)；2.住院，不需要补充氧气；和1.出院或符合出院标准(出院标准定义为临床恢复，即发热、呼吸频率、氧饱和度恢复正常，以及咳嗽缓解)。次要结果TTCI量度包括所有原因死亡率(筛查期间的基线SpO2，PaO2/FiO2＜300mmHg或呼吸频率≥24次/分钟，无需补充氧气)；呼吸进展的频率(室内空气中SPO2≤94％或PaO2/FiO2＜300mmHg，并且需要补充氧气或更高级的呼吸机支持)；退热时间(入院时发烧的人)；记录为轻度或无咳嗽的时间(入院时咳嗽评为重度或中度的人)；记录为轻度或无呼吸困难的时间(以重度、中度、轻度、无呼吸困难为标准，入院时呼吸困难评为重度或中度的人)；需要补充氧气或无创通气的频率；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中2019-nCoV RT-PCR阴性的时间；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中SARS-CoV-2病毒负荷的变化(减少)；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中2019-nCoV病毒负荷的变化(减少)；咽拭子、痰液、下呼吸道标本和/或上呼吸道标本中SARS-CoV-2病毒负荷的变化(减少)，如以病毒负荷曲线下的面积所评估(例如，如利用聚合酶链式反应(PCR)所确定)；需要机械通气的频率；和严重不良事件的频率。TTCI定义为从研究治疗(活性药物或安慰剂)的开始至发烧、呼吸频率和氧饱和度的正常化以及咳嗽缓解的时间(单位为小时)，持续时间至少72小时。主要的TTCR结果量度包括正常化和缓解标准；发热--≤36.9℃腋下或≤37.2℃口腔；呼吸频率--室内空气中≤24次/分钟；氧饱和度--室内空气中>94％；以及，咳嗽--在严重、中度、轻度、不存在的标度上患者记录为轻度或不存在。次要TTCR结果量度与上文所列出TTCI次要结果相同。
标准临床试验设计和统计方法用于其分析中。例如，本研究的样本量选择为足够和合理的，以用于初步审查组合SARS-CoV-2组合物在良好耐受剂量下的安全性和免疫原性特性，而非初步审查统计功效(例如，如上文所描述的120名受试者)。样本量允许反应原性的初始评估。例如，假设共计100名受试者接受组合SARS-CoV-2组合物，该研究设计成具有80％的概率检测到至少一种AE，其发生率为1.6％。如果在接受hAdv5-SARS-CoV-2组合物的100名受试者中未观察到SAE，那么SAE发生率的95％置信区间(CI)的单边上限将约为3％。免疫学分析利用可评估和按方案(PP)群体来执行，主要结论来自PP群体。基于“可评估群体”的分析仅在任一组的多于1人的受试者排除在“PP群体”之外的情况下来进行并呈现。利用如下文所描述的异常应答者分析，缺失数据的归纳未执行。数据在分析前进行适当转换。基线定义为在第1天(对于AdE组合物)和第7天(对于hAdv5-SARS-CoV-2组合物)的组合SARS-CoV-2组合物施用之前所收集的样本。确定用于评估针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫应答(例如，抗SARS-CoV-2抗原IgG滴度、T细胞应答)的所关注主要变量。GMT在基线处和接种后第8、15、22、29、57、91和181天(A部分)和第8、15、22、29、36、43、50、91和181天(B部分)进行确定，并以剂量组进行汇总。组合SARS-CoV-2组合物剂量和安慰剂之间的比较结果通过协方差分析(ANCOVA)进行评估，其中治疗为固定效应，基线对数转换水平为协变量，例如，抗SARS-CoV-2IgG的基线后对数转换水平为因变量。根据这些分析，获得了最小平方(LS)平均值、LS治疗差异，和对数标度上的治疗差异的95％CI。结果通过指数化转换回原始标度，以提供每个研究日的治疗几何LS平均值、几何LS平均值比率的点估计值和这些比率的95％CI。“响应者”定义为抗SARS-CoV-2抗原滴度在第8、15、22、29、57、91和181天(A部分)和第8、15、22、29、36、43、50、91和181天(B部分)比基线上升4倍的受试者。用于确定应答者状态的倍数变化利用无+1转换的后归纳值进行计算，即倍数变化＝当前归纳值/基线归纳值。应答率通过每个剂量组的百分比和该百分比的95％Clopper-Pearson确切CI进行制表。95％CI的差异用于将每个组合SARS-CoV-2组合物剂量组的应答率与安慰剂组的应答率相比较。在一些实施例中，每个组合SARS-CoV-2组合物剂量组的应答者针对安慰剂组的比较还可利用Fisher精确检验来执行。为确定给药前Ad5血清抗体水平对于第29天(A部分)或第50天(B部分)的组合SARS-CoV-2组合物的免疫原性的影响，以基线Ad5滴度作为协变量，采用ANCOVA来进行分析。粘膜免疫原性分析利用可评估和PP群体来执行。缺失数据的归纳未执行。所分析的终点为通过ELISA所测量的IgA抗体水平的GMT和GMR。所用方法与体液免疫原性分析相同。连续参数(安全实验室检验和生命征象)的汇总统计以组别呈现如下：接种前、接种后，以及从接种前到接种后评估的变化。将接种后安全实验室数值或生命征象记录为新异常(即，毒性级别相对于基线数值增加的情况，和中度或更高的严重度级别的情况)的受试者的数量和百分比制成表格。编制移位表，该移位表以严重度级别对每个受试者的接种前和接种后安全实验室数值进行交叉制表。汇总受试者的数量和百分比，该受试者具有正常、非临床显著异常和临床显著异常的ECG解释。对于Ad5载体的脱落，数据通过以时间点的计数和阳性百分比，以及中值拷贝数进行汇总。对于每个组合SARS-CoV-2组合物组和所有组合免疫原性组合物剂量组，呈现了Ad5脱落的中值持续时间、四分位数范围、Ad5脱落的最小和最大持续时间。还列出了用于评估腺病毒感染的病毒培养结果。
这些研究将示出，组合SARS-CoV-2组合物可用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，其为免疫原性组合物)，并且具有可接受安全特性。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地为保护性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，数据示出，组合SARS-CoV-2组合物可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。
实例11：利用细胞因子抑制的抗SARS-CoV-2人临床实验
如实例2所示，向小鼠施用AdE显示其降低了某些细胞因子的表达，所述细胞因子涉及由病毒(诸如流感)所引起的感染性疾病的进展和症状。例如，据示出，非感染小鼠(流感)在施用AdE后第25天表现出单核细胞趋化蛋白(MCP-1(CCL2))、干扰素γ(IFN-γ)和RANTES(CCL5)的表达增加。在施用AdE后第28天，此类非感染小鼠表现出MCP-1和IFN-γ的表达增加，但还表现出IL-12的表达减少。在施用AdE后第3天以流感攻击小鼠；据发现，小鼠表现出IL-1α、IL-6、IL-12、MCP-1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和RANTES的表达减少。在施用AdE后第六(6)天，感染小鼠表现出IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1和GM-CSF的表达减少，和巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α(CCL3))和RANTES(CCL5)的表达增加。这些结果与SARS-CoV-2感染期间的“细胞因子风暴”的发展一致。在一些实施例中，然后，为通过例如抑制细胞因子风暴的发展或抑制细胞因子风暴而预防和/或治疗SARS-CoV-2感染，SARS-CoV-2免疫原性组合物与一种或多种抗细胞因子试剂(例如，一种或多种抗IL-1α试剂、一种或多种抗IL-5试剂、一种或多种抗IL-6试剂、一种或多种抗IL-12试剂、一种或多种抗IL-17试剂、一种或多种抗MCP-1试剂、一种或多种抗TNF-α试剂、一种或多种抗GM-CSF试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂)一起施用至人类。在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂将不包括一种或多种抗MIPα试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。如本文所描述可使用的示例性抗细胞因子试剂可包括例如表10所示那些的任一者。
通过适用于每种试剂的合适途径(例如，SARS-CoV-2免疫原性组合物的鼻内施用和抗细胞因子试剂的皮下注射)，此类抗细胞因子试剂以有效量与SARS-CoV-2免疫原性组合物一起在相同时间(即，同时)或基本上相同时间进行施用。在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂与SARS-CoV-2组合物共同施用，并且在一些实施例中，一种或多种抗细胞因子试剂随后作为唯一活性剂进行施用。这些研究将示出，SARS-CoV-2组合物和一种或多种抗细胞因子试剂的组合用于诱导人类的抗SARS-CoV-2免疫应答(例如，其为免疫原性组合物)，具有可接受安全特性，并缓解与一些患者所经历的细胞因子的有害影响(例如，前述细胞因子风暴)有关的症状。优选的是，免疫应答为统计学显著的，并且甚至更优选地，为保护性和/或治愈性免疫应答(即，其为SARS-CoV-2疫苗)。在优选实施例中，数据示出，SARS-CoV-2组合物和一种或多种抗细胞因子试剂的组合可用于治疗感染有SARS-CoV-2的受试者(例如，住院患者)。
实例12.动物研究给药策略
在一些实施例中，一种或多种抗SARS-CoV-2载体和/或抗SARS-CoV-2载体的组合(即“SARS-CoV-2疫苗”)以各种剂量施用至动物，以评估其临床前验证。在一些实施例中，确定了动物中的疫苗诱导的保护机制。在一些实施例中，确定了在对更常见的循环冠状病毒具有预存在免疫性的动物中疫苗诱导的保护机制(对于大多数人而言亦是如此)。这些研究提供：(i)对SARS-CoV-2疫苗诱导的肺部炎症的评估；(ii)SARS-CoV-2疫苗抗体滴度与同种型和到28天的反应性广度；(iii)至施用后第28天抗SARS-CoV-2抗体(Ab)的中和滴度；以及(iv)确认最佳SARS-CoV-2疫苗剂量/施用时间表。
在一些实施例中，动物的免疫性可利用Yu等人所描述的流式细胞检测技术进行研究(PLOS ONE|DOI：10.1371/journal.pone.0150606 2016年3月3日)，该技术已示出可用于准确量化十一种不同的免疫细胞类型，包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、中性白血球、嗜酸性粒细胞、炎性单核细胞、常驻单核细胞、巨噬细胞(例如组织特异性巨噬细胞、常驻/间质巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、小胶质细胞)、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和/或浆细胞样DC，和/或对特定细胞类型执行详细表型分析。在一些实施例中，例如，SSC与MHC II类表达的比较可用于从成熟髓样细胞中分离出NK细胞和单核细胞；和/或CD64与CD24表达的比较可用于区分巨噬细胞与树突状细胞，如同CD11c与MHC II类表达的比较(然而前者可为更准确的)。还可以研究如本领域中已知的其它标记物(例如，CD11b、CD14、CD24、CD68、CD103、CD169、CD206、CX3CR1、CCR2、F4/80、IA-IE、Ly6C、和/或MerTK中的任一者或多者)。在一些实施例中，确定了肺气道和血清中的抗SARS-2-CoV-2特异性抗体滴度(例如，使用微珠阵列)；测量了进入肺部的炎性细胞浸润(例如，使用流式细胞术)；确定了抗SARS-CoV-2中和滴度(例如，利用SARS-2微中和测定)；评估了局部和系统性细胞因子水平；确定了从早期(7-14天)起，到幼稚小鼠和对相关地方性冠状病毒具有预存在免疫性的小鼠接种疫苗后的记忆时间点(1-4个月)，抗SARS-2特异性B细胞(例如，及其亚群)、T细胞(例如，使用ICCS或细胞因子ELISPOT))和浆细胞(例如，利用抗体ELISPOT)的数量和功能属性。还可使用如本领域中已知的其它类型的分析，或本领域技术人员将理解的其它类型的分析也为适用的。
在一些实施例中，确定了动物中疫苗诱导的保护机制，从而研究了按照表17所示的给药方案施用SARS-CoV-2疫苗的动物。
表17
Figure GDA0003417796820001481
Figure GDA0003417796820001491
*候选疫苗#1：S1载体(SEQ ID NO：13)；候选疫苗#2：RBD载体(SEQ ID NO：15)
admin”表示“施用(administration)
a微珠阵列法测定BAL中的Abs
bBAL、肺组织、medLN、脾脏、血液T细胞、B细胞NK和骨髓谱系亚群(T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、炎性单核细胞、常驻单核细胞、肺泡巨噬细胞、常驻/间质巨噬细胞、CD11b-DC和CD11b+DC)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4777539/pdf/pone.0150606.pdf
c通过微珠阵列法测定血清Ab COVID特异性、域特异性和与地方性冠状病毒的交叉反应性(包括同种型和亚同种型)
d血清中和或病毒减少测定(基于所收集的血清样品的结合测定选择最相关的时间点和候选疫苗)
在一些实施例中，例如为了评估对候选疫苗的B细胞和T细胞应答以确定最佳给药和施用时间表，使用表17中所示的给药方案。在一些实施例中，利用通过表18中所示方案确定的最佳给药和施用时间表，动物接受SARS-CoV-2疫苗(或两种不同的SARS-CoV-2疫苗，如表17所示)。在四个时间点(例如，n＝7/组/时间点/功能测定，0-120天之间的时间点)采集数据。至第28天测量SARS-CoV-2疫苗诱导的肺部炎症和Ab应答，至第120天测定抗SARS-CoV-2Ab滴度的同种型和反应性广度，至第120天测定抗SARS-CoV-2Ab中和滴度，至第28天测定SARS-CoV-2疫苗诱导的T细胞应答，并且至第120天测定SARS-CoV-2疫苗诱导的ASC和记忆B细胞应答。
表18
Figure GDA0003417796820001492
Figure GDA0003417796820001501
fBAL上清液中的细胞因子/Ab(例如，该列表中的5种细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α、IL-5、IFN-α、IFN-β,IFN-γ、MIP-1a和MIP-2)
gBAL细胞-ELISPOT(SARS2特异性IgA、M和G)。
hBAL细胞T细胞调用IFNg ICCS(表达SARS2 S蛋白的CD4和CD8 restim抗CD3和/或EL4细胞)
i肺组织、medLN、脾脏、BM ELISPOT(SARS2特异性IgA、M和G)
j肺组织、medLN、脾脏抗原特异性T细胞调用IFNγICCS(表达SARS2 S蛋白的CD4和CD8 restim抗CD3和/或EL4细胞)
kBAL、肺部、medLN、脾脏SARS2特异性B细胞应答流式细胞术
l血清Ab根据需要重复
m根据需要的血清中和或病毒减少测定
在一些实施例中，使用下述方案，无论对地方性β-冠状病毒的预存在免疫是否影响对于SARS2的疫苗应答。在该实验中(表3)，评估预存在抗冠状病毒刺突蛋白记忆B细胞对地方性β-冠状病毒的影响。使用两种不同的佐剂(CFA或明矾)，近交小鼠(BALB/c或B6)接种了重组OC43或HKU1刺突蛋白，以建立对于地方性冠状病毒刺突蛋白的记忆B细胞应答(即“记忆小鼠”)。然后，免疫小鼠和对照幼稚小鼠接受最佳SARS-CoV-2疫苗。评估记忆小鼠的肺部炎症、抗SARS-CoV-2Ab和B细胞应答、抗SARS-CoV-2Ab质量。表19提供了关于施用方案的额外详情。
表19
Figure GDA0003417796820001511
nLuminex法测定BAL中的细胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α、IL-5、IFN-α、IFN-β和IFN-γ)
o微珠阵列法测定BAL中的Ab
pBAL、肺组织、medLN、脾脏、血液T细胞、B细胞NK和骨髓品系亚群(T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、炎性单核细胞、常驻单核细胞、肺泡巨噬细胞、常驻/间质巨噬细胞、CD11b-DC和CD11b+DC)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4777539/pdf/pone.0150606.pdf
qBAL、肺部、medLN、脾脏SARS2特异性B细胞应答流式细胞术
r克隆SARS2特异的B细胞受体并观察反应性(以及亲和力/活动性)的广度和深度
s通过微珠阵列法测定血清Ab COVID特异性、域特异性和与地方性冠状病毒的交叉反应性(包括同种型和亚同种型)
t血清中和或病毒减少测定(首先为伪型病毒，其次为初级SARS2)
实例13A.用于临床前测试的腺病毒载体(S1和RBD)的制备
使用复制缺陷型、E1和E3缺失的腺病毒5型载体平台(Tang等人，2009)，用于表达S1域(残基16至685)或SARS-CoV-2刺突蛋白(保存编号QHD43416.1)的RBD域(残基302至543)的人密码子优化的基因、从而制备用于实施例13A至18的候选疫苗。Ad5载体S1和RBD转基因包括人组织纤溶酶原激活剂前导序列，并在巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO:15)的控制下表达。使用可扩展的转染系统(Maxcyte STX-100)，将重组载体质粒大规模转染到E1互补的PER.C6细胞中，获得初始原种。使用CL1.1处理组合程序(Li LH、Shivakumar R、Feller S、Allen C、Weiss JM、Dzekunov S、Singh V、Holaday J、Fratantoni J、Liu LN，“高效大流量电穿孔(Highly efficient,large volumeflow electroporation)”，《癌症研究和治疗技术(Technol Cancer Res Treat)》,2002年10月；1(5):341-50.)，细胞转染通过静态电穿孔来执行。进一步扩增后，在感染后70小时收集感染细胞，并通过冻融循环从成团细胞中释放出病毒。所得细胞裂解液通过离心进行澄清，然后使用0.22μm截止点进行过滤。以CsCl梯度纯化RBD和S1 Ad5载体，在含有pH 7.4的10mM Tris、75mM NaCl、1mM MgCl2、10mM组氨酸、5％(wt/vol)蔗糖、0.02％聚山梨酯-80(wt/vol)、0.1mM EDTA和0.5％(vol/vol)乙醇的配方缓冲液(A195)中对上述载体进行透析，然后冷冻并在-65℃保存。为确认S1和RBD转基因是否已表达且具有完整抗原性，用S1载体或RBD载体感染PerC6细胞，然后用两种不同的抗SARS-CoV-2S1(SinoBiologics分类号：40591-MM43)和SARS-CoV-2RBD(SinoBiologicals，分类号：40592-MM57)的中和单克隆抗体进行细胞内染色，并通过流式细胞术进行分析(图93)。
实例13B.在C57BL/6小鼠中鼻内施用表达RBD域的Ad5载体
将表达SARS-CoV-2(SEQ ID NO：15)的刺突抗原的RBD域的复制缺陷Ad5载体鼻内施用至C57BL/6小鼠以评估针对SARS-CoV-2的系统性和粘膜免疫的诱导。如表18所示，C57BL/6小鼠以50μl的量以三种不同的剂量接受一次或两次鼻内施用的Ad5载体。在A195缓冲液中，高剂量为6.7E+09ifu/ml(50μL中为3.35E+08ifu)，中剂量为1.2E+09ifu/ml(50μL中为6E+07ifu)并且低剂量为1.2E+08ifu/ml(50μL中为6E+06ifu)。对照组仅接受鼻内施用的50μl的A195缓冲液。疫苗施用后第7天、第14天、第21天或第28天，根据下表从每组10只动物中采集血清、支气管肺泡灌洗液(BAL)，以及包括肺部、纵膈淋巴结和脾脏的组织。免疫学读数包括以下测量值：血清和BAL中的SARS-CoV-2刺突抗原特异性IgG、BAL中的SARS-CoV-2刺突抗原特异性IgA、血清中的针对SARS-CoV-2的中和抗体应答，以及肺部、淋巴结、BAL和脾脏在不同时间点的免疫细胞的数量。这些参数汇总于表20中。
表20
Figure GDA0003417796820001531
利用偶联重组SARS-CoV-2胞外域刺突蛋白的细胞计数微珠阵列，检测免疫动物血清或BAL样本中SARS-CoV-2刺突IgG和IgA的含量。为产生重组SARS-CoV-2S胞外域蛋白，两种密码子优化构建体以线性序列来生成，该线性序列依次编码：人IgG前导序列、SARS-CoV-2S胞外域(氨基酸14-1211)、GGSG连接子、T4纤维蛋白折叠子序列、GS连接子，和最后Avi标签(构建体1)或6X-His标签(构建体2)。每个构建体设计有两组突变以稳定蛋白的融合前构象。这些突变包括S1/S2裂解位点处RRAR>SGAG(残基682至685，如Walls等人2020年)的取代和两个脯氨酸残基的引入；K983P、V984P，如Walls等人2020年和Wrapp等人2020年所述。通过将质粒构建体1和2(1:2比率)共同转染到FreeStyle 293-F细胞中，产生了Avi/His标记三聚体。细胞生长3天，并且上清液(培养基)通过离心法来回收。重组S三聚体利用HisTrapHP柱(GE)通过FPLC从培养基进行纯化，并且以250mM的咪唑洗脱。在交换至10mM Tris-HCl(pH 8.0)或50mM N-二(羟乙基)甘氨酸(pH 8.3)中之后，纯化刺突胞外域三聚体通过添加生物素-蛋白连接酶(科罗拉多州奥罗拉的Avidity公司(Avidity,Aurora,CO))进行生物素化。将生物素化的刺突胞外域三聚体以缓冲液交换至PBS中，无菌过滤、分装，然后在使用之前储存于-80℃下。在his标记蛋白的亲和力纯化和酶促生物素化之后，所得重组SARS-CoV-2三聚体被动地吸附至链霉亲和素功能化的荧光微粒上(Spherotech 3.6um分类号：CPAK-3567-4K，峰值4)。500μg的生物素化SARS2-CoV-2与2x1e7个链霉亲和素功能化荧光微粒一起在400ul的1％BSA PBS中温育。偶联后，SARS-CoV-2刺突偶联微珠在1ml的1％BSA、PBS、0.05％NaN3中清洗两次，最后再悬浮至1x108微珠/毫升的浓度。SARS-CoV-2偶联微珠储存于4℃下。重组SARS2-CoV-2刺突至微珠上的加载通过以稀释剂(在1ug/ml至2ng/ml的重组抗SARS刺突抗体CR3022的范围内)染色1x105个微珠进行评估，并且以抗人IgG二代来可视化。IgG和IgA标准通过同种型特异性多克隆抗体与荧光颗粒的共价偶联来获得。简而言之，PBS中的0.2mg的山羊多克隆抗小鼠IgG(南方生物技术公司(southern Biotech)分类号1013-01)、抗IgM(分类号1022-01)和抗IgA(分类号1040-01)抗体与5x1e7个荧光微粒混合，在远红通道具有独特荧光强度的每个荧光微粒(Spherotech 3.6um分类号CPAK-3567-4K，峰值1-3)重悬于0.1M MES缓冲液(pH 5.0)中。等体积的EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺)(10mg/mL)在0.1M MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲液中(pH5.0)，并且混合物在室温下温育过夜。微珠通过离心造粒和重悬于PBS来清洗两次。清洗后，微珠重悬于含有0.005％NaN3(作为防腐剂)的1％BSA，PBS中。稀释1/4-8的BAL样品或血清样本在50μl的PBS中稀释至1/1000-5000，与50ul的标准液一起排列于96孔U底聚苯乙烯板中，该标准液包括小鼠IgG、IgM或IgA，范围从1μg/ml至2ng/ml，稀释度为0.75倍(南方生物技术公司IgM：分类号0106-01；IgG：分类号0107-01；IgA：分类号0106-01)。将含有5x1e5的每种SARS-CoV-2刺突、抗IgM、抗IgA和抗IgG微珠的5μl悬浮液添加至稀释样本。悬浮液通过吸移管进行混合并且在室温下温育15分钟。通过添加200μl的PBS并在室温下以3000g离心5分钟，清洗微珠。CBA颗粒重悬浮于二次染色溶液中，该二次染色溶液包括偶联至PE的多克隆抗IgG 488(南方生物科技公司分类号1010-30)和山羊多克隆抗IgM(南方生物科技公司分类号1020-09)或抗IgA(南方生物科技公司分类号1040-09)，该PE在PBS中以1％BSA中稀释至1/400。悬浮液在室温下黑暗中温育15分钟。微珠通过添加200μl的PBS进行清洗，并在室温下以3000g离心5分钟进行造粒。颗粒重悬于75μl的PBS中，并且在板形式的BD Cytoflex流式细胞仪上以每分钟100ul的采样率直接分析。样本收集在采集75μL后停止。采集后，所得FCS文件以flowJo(treestar)进行分析。简而言之，微珠通过在前向散射和侧向散射参数的对数标度上对单体3.6um颗粒进行选通来识别。APC-Cy7通道荧光闸门用于通过微珠识别来隔离颗粒。几何平均荧光强度在PE和488个通道中进行计算。利用基于逐个板的已知标准协调性，最佳拟合功效曲线从Ig捕获微珠来生成。本公式适用于对应测定(其将MFI转换为ng/ml或μg/ml)的所有样本的SARS-COV-2刺突颗粒的MFI。这些计算值关于稀释因子进行校正。
病灶减少中和检验(FNRT)用于量化针对SARS-CoV-2分离株USA-WA1/2020的中和抗体的滴度。Vero E6细胞在96孔板上生长至汇合。在测定的感染阶段当天，制备抗血清的系列稀释液(1:20-1:2560)，并且与等体积的病毒原液组合，在RT下以指定稀释度温育30分钟，使得抗血清的最终稀释度在(1:40-1:5120)的范围内。病毒原液从浓缩工作原液中进行稀释，以产生每孔预计30个病毒病灶单位。温育后，将血清：病毒混合物添加孔(100μL)，并且允许在35℃下在Vero细胞上1小时的感染。在1小时温育结束后，将粘稠的含有4％FBS和抗生素以及1.2％Avicell的Eagle MEM添加至细胞单层上的血清：病毒混合物，使得每孔的最终体积为200μL。允许感染进行24小时。第二天，通过将整块板和内容物浸入10％福尔马林/PBS中24小时，每个板固定。病毒病灶减少的检测在所固定96孔板上执行。简而言之，板在H2O中冲洗，并且甲醇：过氧化氢添加至该孔，摇晃30分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。淬灭后，板在H2O中冲洗以移除甲醇，并且将5％Blotto(作为封闭液)添加至该孔，持续1小时。关于一级抗体检测，将SARS-CoV-2刺突/RBD抗体(兔，多克隆，SinoBiologicals分类号40592-T62)添加至5％Blotto，并在单层上温育过夜。板以PBS冲洗5次，并且还与山羊抗兔IgG(偶联至辣根过氧化物酶)的二级抗体(Boster生物技术公司(Boster BiologicalTechnology Co.)，#BA1054-0.5)一起在5％Blotto中温育1小时。板以1X PBS中的0.05％吐温冲洗一次，然后在1X PBS中冲洗5次。根据制造商的说明，利用Impact DAB检测试剂盒(Vector Labs#SK-4105)，检测过氧化物酶活性。从每个孔的扫描图像进行手动地计数棕色病灶，并记录，并且确定相比于等同幼稚小鼠血清对照的病灶减少。FRNT50滴度也利用4PL曲线拟合进行计算。
支气管肺泡灌洗液(BAL)细胞通过流式细胞仪的分析执行如下。通过在4℃下以700倍重力将BAL流体离心5分钟，获得了BAL细胞。细胞重悬于500μl的红血细胞裂解缓冲液[ACK缓冲液(10mM KHCO3，pH7.2-7.4，150mM NH4Cl和0.1mM EDTA)]中。1分钟后，2ml的染色介质(PBS+2％胎牛血清)含有2mM EDTA。这种介质培养基称为SME。然后，样本通过穿过70um
Figure GDA0003417796820001551
尼龙滤膜并进入洁净15ml锥形管中进行过滤。在4℃下以700倍重力离心5分钟后，细胞重悬浮于225μl SME中。然后，将25μl的每种样本转移至96孔板中，以用于通过利用Fluoresbrite Carboxylate YG 10μm微球的流式细胞仪进行细胞计数。将其余细胞转移至单独V型底96孔板中以用于抗体染色，以进行流式细胞计数分析。将BAL细胞样本与Fc-Block(1:1000稀释度)一起在暗中4℃下温育10分钟，然后以下述BAL染色板进行染色：自发荧光(空FITC通道)、Ly6G-PE(克隆1A8；1：200稀释)、CD64-PerCP-Cy5.5(克隆X54-5/7.1；1：150稀释)、CD8a-APC(克隆53-6.7；1：200稀释)、CD11c-PE-Cy7(克隆N418；1：200稀释)、CD19-APC-Fire750(克隆6D5；1：200稀释)、CD4-eFluor450(克隆GK1.5；1：200稀释)和AquaLIVE/DEAD(1：1000稀释)。在与混合抗体(总体积50μl)一起在黑暗中4℃下温育20分钟后，细胞以200ul SME进行清洗。然后，细胞重悬于200μl的10％福尔马林中，随后在2天内进行FACSCanto II分析。
纵膈淋巴结通过流式细胞仪的分析执行如下。收集纵膈淋巴结(mLN)并置于24孔板的单独孔中，该孔含有1ml的染色介质(PBS+2％胎牛血清)，并加入2mM EDTA。这种介质称为SME。该mLN通过在两块显微镜载片之间的摩擦而轻轻研磨并粉碎，然后在转移至15ml锥形管中之前以1mlSME冲洗。体积利用SME增加至10ml。然后，在以额外2mlSME冲洗滤波之前，细胞悬浮液通过穿过70um
Figure GDA0003417796820001561
尼龙滤膜并进入洁净15ml锥形管中进行过滤。在4℃下以1800rpm离心5分钟之后，细胞以1mlSME来重悬。将50μl的每种样本转移至96孔板中，以用于通过利用Fluoresbrite Carboxylate YG 10μm微球的流式细胞仪进行细胞计数。将200至250μl的每种样本转移至3个单独V型底96孔板中以用于抗体染色，以进行流式细胞计数分析。mLN组织以3个不同流式面板进行染色。将mLN样本与Fc-Block(1:1000稀释度)一起在黑暗中4℃下温育10分钟，以200ul SME清洗，并且然后以下述3个面板进行染色：骨髓面板包括B220/CD45R-FITC(克隆RA3-6B2；1:200稀释)、Ly6G-PE(克隆1A8；1:200稀释)、CD64-PerCP-Cy5.5(克隆X54-5/7.1；1:150稀释)、CD11b-APC(克隆M1/70；1:200稀释)、CD11c-PE-Cy7(克隆N418；1:300稀释)、Ly6C-APC-Cy7(克隆AL-21；1:200稀释)、MHCII-PB(克隆M5/114.15.4；1:600稀释)、CD3-BV510(克隆17A2；1:200稀释)、CD19-BV510(克隆HIB19；1:200稀释)和Aqua LIVE/DEAD(1:1000稀释)。关于这种骨髓面板染色，细胞与混合抗体(总体积50ul)一起在黑暗中4℃下温育20分钟。然后，在2天内以FACSCanto II分析之前，细胞以200μl SME清洗，并且重悬于200μl的10％福尔马林(固定剂)中。T细胞面板包括CXCR5/CD185-FITC(克隆J252D4；1:50稀释)、PD1/CD279-PE(克隆J43；1:200稀释)、CD8a-PerCP-Cy5.5(克隆53-6.7；1:200稀释)、CD25-PE-Cy7(克隆PC61；1:300稀释)、CD4-AF647(克隆GK1.5；1：200稀释)，CD3-APC-eFluor780(克隆17A2；1：200稀释)，NK1.1-eFlour450(克隆PK136；1：200稀释)和Aqua LIVE/DEAD(1：1000稀释)。关于T细胞面板染色，将细胞与仅抗CXCR5-FITC(总体积30ul；1:50稀释)在黑暗中4℃下温育30分钟，并且然后以200μl SME清洗。然后，细胞与混合抗体的其余部分(总体积50μl)一起在黑暗中4℃下温育15分钟，并且然后以200ul SME清洗。在2天内以FACSCanto II分析之前，细胞重悬于200μl的10％福尔马林(固定剂)中。B细胞面板包括CD95/FAS-FITC(克隆Jo2；1:200稀释)、SPIKE(Covid-19)-PE(1:50稀释)7-AAD(1:1000稀释)、F4/80-PerCP-Cy5.5(克隆BM8；1:200稀释)、CD3-PerCP-Cy5.5(克隆17A2；1:200稀释)、SPIKE(Covid-19)-APC(1:50稀释)、CD38-PE-Cy7(克隆90；1:400稀释)、CD19-APC-Fire750(克隆6D5；1:200稀释)、CD138-BV421(克隆281-2；1:200稀释)和IgD-BV510(克隆11-26c.2a；1:500稀释)。关于B细胞面板染色，将细胞与混合抗体(总体积50ul)一起在黑暗中4℃下温育30分钟，并且然后以200μl SME清洗。细胞重悬于200ul SME中(无固定剂)中，并且立即以FACSCanto II进行分析。
肺部组织通过流式细胞仪的分析执行如下。在添加胶原蛋白酶/DNase之前，利用剪刀将切除肺部切割成很小块。在37℃下温育30分钟之后，肺部匀浆以1ml SME进行稀释。在以10-15mlSME冲洗之前，消化组织通过利用注射器柱塞的平头而在滤网上轻轻磨碎并粉碎。在1800rpm和4℃下离心5分钟之后，将球剂重悬于3ml红血细胞裂解缓冲液[ACK缓冲液(10mM KHCO3，pH7.2-7.4，150mM NH4Cl和0.1mM EDTA)]中。在室温下温育5分钟之后，通过添加3ml SME使裂解缓冲液失活，将样品稀释为1:2。细胞(每种裂解液)通过穿过
Figure GDA0003417796820001571
尼龙滤膜并进入洁净50ml锥形管中进行过滤。在以额外5至10ml SME冲洗之后，在将细胞球剂重悬于1ml SME中之前，将细胞进行离心。每个样品取50μl置于96孔板中，使用Fluoresbrite Carboxylate YG 10μm微球通过流式细胞术进行细胞计数。每个样品取200μl置于3个单独的V型底96孔板中，进行抗体染色，以进行流式细胞检测分析。样品在黑暗中在4℃下与Fc-Block(1：1000稀释度)一起孵育10分钟，然后用200μl SME清洗，然后用与淋巴结相同的3个板染色。
脾细胞通过流式细胞仪的分析执行如下。将脾脏转移至安装于50ml锥形管上的70um细胞滤网中，并且在以10至15ml SME冲洗滤网之前，通过利用注射器柱塞的平头而轻轻研磨并粉碎。在1800rpm和4℃下离心5分钟之后，将颗粒重悬于5ml红血细胞裂解缓冲液[ACK缓冲液(10mM KHCO3，pH7.2-7.4，150mM NH4Cl和0.1mM EDTA)]中。在室温下温育5分钟之后，将20ml SME添加至每种裂解液以稀释ACK缓冲液。然后，细胞通过穿过70um
Figure GDA0003417796820001581
尼龙滤膜进行过滤。过滤物以额外5ml SME进行冲洗。离心之后，将细胞颗粒重悬于20ml SME中。每个样品取50μl置于96孔板中，使用Fluoresbrite Carboxylate YG 10μm微球通过流式细胞术进行细胞计数。每个样品取200μl置于3个单独的V型底96孔板中，进行抗体染色，以进行流式细胞检测分析。样品在黑暗中在4℃下与Fc-Block(1：1000稀释度)一起孵育10分钟，然后用200μl SME清洗，然后用与淋巴结相同的3个板染色。
单次鼻内施用后，表达刺突蛋白(SEQ ID NO：15)的RBD域的复制缺陷Ad5载体证实用以刺激血清中IgG抗体的产生，从而表明诱导了系统性应答以及在支气管肺泡灌洗液中产生IgG和IgA抗体，从而指示诱导如图71A-71C所示的粘膜应答。在不同抗体标记物上观察到剂量应答，其中高剂量疫苗导致最高应答，并且低剂量导致边缘应答，而中等剂量产生中等应答。值得注意的是，在利用单次高剂量疫苗的第14天和第28天，血清中的刺突特异性IgG应答达到极高水平，超过每毫升1毫克，占总血清IgG的大约5％。在第14天使用相同载体进行鼻内加强后，BAL中产生的IgA显著高于第21天和第28天单剂量疫苗IgG应答所诱导的应答，而对IgG应答的影响有限。
如通过病灶减少中和检验(FRNT)所测量，接受单次施用的高剂量疫苗的组的所有10只动物(100％)示出存在针对SARS-CoV-2的中和抗体(图72A-72J)；而在已接受单次施用的中剂量疫苗的组中，仅五分之三的动物(60％)示出了显著中和应答(图73A-73E)。
鼻内施用的疫苗在不同的免疫区室中诱导了先天和适应性免疫细胞的募集和/或增殖。图74A-74L、图75A-75E、图76A-76J和图77A-L分别示出，在单次鼻内施用高剂量疫苗之后，肺部、BAL、纵膈淋巴结和脾脏的免疫细胞的数量变化。重要的是，在肺部、BAL和淋巴结中观察到的以及在脾脏中较小程度地观察到的CD19细胞、记忆B细胞、生发中心(GC)B细胞和/或滤泡辅助T细胞(hf)的数量增加，表明疫苗能够刺激长寿命体液和粘膜抗体应答。另外，在肺、BAL和淋巴结中观察到的以及在脾脏中较小程度地观察到的巨噬细胞，树突状细胞，CD4+和/或CD8+T细胞的增加，表明疫苗能够刺激粘膜和系统性、先天性和细胞介导的免疫应答，这些应答预期在SARS-CoV-2感染的情况下带来好处。未示出以较低剂量疫苗所获得的结果，因为它们示出相似但较低水平的趋势。
实例14.在C57BL/6小鼠中鼻内施用表达S1域的Ad5载体
将表达SARS-CoV-2(SEQ ID NO：13)的刺突抗原的S1域的复制缺陷Ad5载体鼻内施用至C57BL/6小鼠以评估针对SARS-CoV-2的系统性和粘膜免疫的诱导。如表19所示，C57BL/6小鼠以50μl的量以三种不同的剂量接受一次或两次鼻内施用的Ad5载体。在A195缓冲液中，高剂量为1.2E+09ifu/ml(50μL中为6E+08ifu)，中剂量为1.2E+09ifu/ml(50μL中为1E+07ifu)并且低剂量为1.2E+08ifu/ml(50μL中为6E+06ifu)。对照组仅接受鼻内施用的50μl的A195缓冲液。疫苗施用后第7天、第14天、第21天或第28天，根据下表从每组10只动物中采集血清、支气管肺泡灌洗液(BAL)以及包括肺、纵膈淋巴结和脾在内的组织。免疫学读数包括以下测量值：血清和BAL中的SARS-CoV-2刺突抗原特异性IgG、BAL中的SARS-CoV-2刺突抗原特异性IgA、血清中的针对SARS-CoV-2的中性抗体应答，以及肺部、淋巴结、BAL和脾脏在不同时间点的免疫细胞的数量。表21对这些参数进行了总结。
表21
Figure GDA0003417796820001591
实例13B描述了用于量化以下项的方法：血清或BAL样本的SARS-CoV-2刺突IgG和IgA；支气管肺泡灌洗(BAL)细胞、纵膈淋巴结、肺部组织和脾细胞的病灶减少中和检验以及流式细胞计数分析。
单次鼻内施用后，表达刺突蛋白(SEQ ID NO：13)的S1域的复制缺陷Ad5载体被证实刺激了血清中IgG抗体的产生，从而表明诱导系统性应答以及在支气管肺泡灌洗液中产生IgG和IgA抗体，从而指示诱导如图78A-78C所示的粘膜应答。在不同抗体标记物上观察到剂量应答，其中高剂量疫苗导致最高应答，并且低剂量导致边缘应答，而中等剂量产生中等应答。总之，相比于如实例13B所示的以RBD载体所获得的结果，S1载体的血清和BAL中IgG应答为较低的。在第14天使用相同载体进行鼻内加强后，BAL中产生的IgA显著高于第21天和第28天单剂量疫苗IgG应答所诱导的应答，而对IgG应答的影响有限。
如通过病灶减少中和检验(FRNT)所测量，接受单次施用的高剂量疫苗的组的所检验动物的五分之三示出针对SARS-CoV-2的中和抗体的显著诱导(图79A-79E)。在单次中度剂量组中，五分之二的动物(图80B和D)示出了低中和应答(图80A-80E)。
鼻内施用的疫苗在不同的免疫区室中诱导了先天和适应性免疫细胞的募集和/或增殖。图81A-81L、图82A-82E、图83A-83J和图84A-L分别示出，在单次鼻内施用高剂量疫苗之后，肺部、BAL、纵膈淋巴结和脾脏的免疫细胞的数量变化。重要的是，在肺部、BAL和淋巴结中观察到的以及在脾脏中较小程度地观察到的CD19细胞、记忆B细胞、生发中心(GC)B细胞和/或滤泡辅助T细胞(hf)的数量增加，表明疫苗能够刺激长寿命体液和粘膜抗体应答。另外，在肺、BAL和淋巴结中观察到的以及在脾脏中较小程度地观察到的巨噬细胞，树突状细胞，CD4+和/或CD8+T细胞的增加，表明疫苗能够刺激粘膜和系统性、先天性和细胞介导的免疫应答，这些应答预期在SARS-CoV-2感染的情况下带来好处。未示出以较低剂量疫苗所获得的结果，因为它们示出相似但较低水平的趋势。
实例15.在CD-1小鼠中鼻内施用表达RBD域的Ad5载体
将表达SARS-CoV-2的刺突抗原的RBD域的复制缺陷Ad5载体(SEQ ID NO：15)鼻内施用至CD-1小鼠以评估针对SARS-CoV-2的系统性和粘膜免疫的诱导。CD-1小鼠以50μl的量以三种不同的剂量接受一次或两次鼻内施用的Ad5载体。在A195缓冲液中，高剂量为6.7E+09ifu/ml(50μL中为3.35E+08ifu)，中剂量为1.2E+09ifu/ml(50μL中为6E+07ifu)并且低剂量为1.2E+08ifu/ml(50μL中为6E+06ifu)。对照组仅接受鼻内施用的50μl的A195缓冲液。在疫苗后施用第7天、第14天和/或第21天，根据表22从每组10只动物中收集血清和支气管肺泡灌洗液(BAL)。免疫学读数包括以下测量值：血清和BAL中的SARS-CoV-2刺突抗原特异性IgG、BAL中的SARS-CoV-2刺突抗原特异性IgA，以及血清中的针对SARS-CoV-2的中和抗体应答。这些参数汇总于表22中。
表22
Figure GDA0003417796820001611
实例13B描述了用于血清或BAL样本中的SARS-CoV-2刺突IgG和IgA的定量方法以及病灶减少中和检验。
单次鼻内施用后，表达刺突蛋白的S1域的RBD的复制缺陷Ad5载体(SEQ ID NO：15)证实用以刺激血清中IgG抗体的产生，从而表明诱导系统性应答以及在支气管肺泡灌洗液中产生IgG和IgA抗体，从而指示诱导如图85A-85C所示的粘膜应答。在不同抗体标记物上观察到剂量应答，其中高剂量疫苗导致最高应答，并且低剂量导致边缘应答，而中等剂量产生中等应答。在第14天以相同载体的鼻内加强之后，相比于相同剂量的单次施用，对于IgG和IgA应答的影响为有限的。
如通过病灶减少中和检验(FRNT)所测量，接受单次施用的高剂量疫苗的组的十分之八的所检验动物(图92A、图92C-92E和图92G至92J)示出针对SARS-CoV-2的中和抗体的显著诱导(图92A-92J)。
实例16.在CD-1小鼠中鼻内施用表达S1域的Ad5载体
将表达SARS-CoV-2(SEQ ID NO：13)的刺突抗原的S1域的复制缺陷Ad5载体鼻内施用至CD-1小鼠以评估针对SARS-CoV-2的系统性和粘膜免疫的诱导。CD-1小鼠以50μl的量以三种不同的剂量接受单次鼻内施用的Ad5载体。在A195缓冲液中，高剂量为6.7E+09ifu/ml(50μL中为3.35E+08ifu)，中剂量为1.2E+09ifu/ml(50μL中为6E+07ifu)并且低剂量为1.2E+08ifu/ml(50μL中为6E+06ifu)。对照组仅接受鼻内施用的50μl的A195缓冲液。在疫苗后施用第7天、第14天和第21天，根据表23从每组10只动物中收集血清和支气管肺泡灌洗液(BAL)。免疫学读数包括以下测量值：血清和BAL中的SARS-CoV-2刺突抗原特异性IgG、BAL中的SARS-CoV-2刺突抗原特异性IgA、血清中的针对SARS-CoV-2的中和抗体应答。表23对这些参数进行了总结。
表23
Figure GDA0003417796820001621
实例13B描述了用于血清或BAL样本中的SARS-CoV-2刺突IgG和IgA的定量方法以及病灶减少中和检验。
单次鼻内施用后，表达刺突蛋白(SEQ ID NO：13)的S1域的复制缺陷Ad5载体被证实刺激了血清中IgG抗体的产生，从而表明诱导系统性应答以及在支气管肺泡灌洗液中产生IgG和IgA抗体，从而指示诱导如图86A-86C所示的粘膜应答。在不同抗体标记物上观察到剂量应答，其中高剂量疫苗导致最高应答，并且低剂量和和中度剂量导致边缘免疫应答。
实例17.在CD-1小鼠中鼻内施用表达RBD域的Ad5载体
将表达SARS-CoV-2的刺突抗原的RBD域的复制缺陷Ad5载体(SEQ ID NO：15)鼻内施用至CD-1小鼠以评估针对SARS-CoV-2的系统性和粘膜T细胞免疫的诱导。CD-1小鼠以A195缓冲液中的6.7E+09ifu/ml(50μL中为3.35E+08ifu)接受单次鼻内施用的Ad5载体。对照组仅接受鼻内施用的50μl的A195缓冲液。在疫苗施用后的第10天、第14天和第28天，根据表24，收集疫苗组10只小鼠和对照组3只小鼠的肺部和脾脏。免疫读数包括肺部和脾脏的CD4+和CD8+T细胞应答通过流式细胞仪的测量值，肺部和脾脏的T细胞应答通过IFN-γELISpot测定的测量值，以及T细胞细胞因子在以RBD衍生肽的体外调用之后的测量值。
表24
Figure GDA0003417796820001631
脾脏和肺部中的RBD特异性T细胞应答通过IFN-γELISpot的分析执行如下。将脾脏转移至安装于50ml锥形管上的70um细胞滤网中，并且在以10至15ml SME冲洗滤网之前，通过利用注射器柱塞的平头而轻轻研磨并粉碎。在1800rpm和4℃下离心5分钟之后，将颗粒重悬于5ml红血细胞裂解缓冲液[ACK缓冲液(10mM KHCO3，pH7.2-7.4，150mM NH4Cl和0.1mMEDTA)]中。在室温下温育5分钟之后，将20ml SME添加至每种裂解液以稀释ACK缓冲液。然后，细胞通过穿过70um
Figure GDA0003417796820001632
尼龙滤膜进行过滤。过滤细胞以额外5ml SME进行冲洗。离心之后，将细胞颗粒重悬于20ml SME中。每个样品取50μl置于96孔板中，使用FluoresbriteCarboxylate YG 10μm微球通过流式细胞术进行细胞计数。
在添加胶原蛋白酶/DNase之前，利用剪刀将切除肺部切割成很小块。在37℃下温育30分钟之后，肺部匀浆以1ml SME进行稀释。在以10-15mlSME冲洗之前，消化组织通过利用注射器柱塞的平头而在滤网上轻轻磨碎并粉碎。在1800rpm和4℃下离心5分钟之后，将颗粒重悬于3ml红血细胞裂解缓冲液[ACK缓冲液(10mM KHCO3，pH7.2-7.4，150mM NH4Cl和0.1mM EDTA)]中。在室温下温育5分钟之后，通过添加3ml SME使裂解缓冲液失活，将样品稀释为1:2。细胞通过穿过
Figure GDA0003417796820001633
尼龙滤膜并进入洁净50ml锥形管中进行过滤。在以额外5至10ml SME冲洗之后，在将细胞颗粒重悬于1ml SME中之前，将细胞进行离心。每个样品取50μl置于96孔板中，使用Fluoresbrite Carboxylate YG 10μm微球通过流式细胞术进行细胞计数。
关于T细胞应答的分析，通过JPT(德国柏林的JPT肽技术公司(JPT Peptidetechnologies,Berlin,Germany))设计并合成了53条肽的池，通过针对SARS-CoV-2的刺突糖蛋白的RBD(319-541)进行多肽扫描得到上述肽。这些肽的设计长度为15a.a.，并且重叠部分为11a.a。在使用之前，每个小瓶在50μl的DMSO中进行重构，所述每小瓶含有15nmol(约25μg)的每条肽，然后稀释到完整培养基中。
将脾脏和肺部细胞悬浮液(150,000个细胞/孔)置于ELIspot板(Millipore-Sigma)的独立孔中，该板预涂布有抗IFN-γ(AN18，(5μg/ml))。细胞以上文所描述的0.5-2.0μg/肽/ml的RBD肽池进行刺激。刺激24小时后，板以生物素化抗IFN-γ(R4-6A2)进行染色，然后进行清洗步骤，并且与链霉亲和素-ALP一起温育。在以NBT/NCPI底物温育7至10分钟后，检测所分泌IFN-γ。IFN-γ斑点形成细胞的数量从每个孔的数字图像进行手动地计数。统计分析利用Mann-Whitney检验以GraphPad Prism来执行。
肺部组织和脾脏中的CD4+和CD8+T细胞应答通过流式细胞仪的分析执行如下。在存在布雷菲德菌素A的情况下，脾脏和肺部单细胞悬浮液以RBD肽池刺激5小时(5小时，12.5ug/mL浓度)。然后，细胞与荧光染料标记抗体的组合一起在冰上温育，这些荧光染料标记抗体包括抗CD4-V500(克隆GK1.5；1:200稀释)、抗CD8α-APC-Fire750(克隆53-6.7；1：200稀释)、抗CD11a/CD18-Pacific Blue(H155-78；1：200稀释)、抗CD103-PE(M290；1：200稀释)、抗CD69-FITC(H1-2F3；1：200稀释)、抗Ly6G-PerCP-Cy5.5(克隆1A8；1:200稀释)、抗CD64-PerCP-Cy5.5(克隆X54-5/7.1；1:200稀释)、抗B220/CD45R-PerCP(克隆RA3-6B2；1:200稀释)和Red LIVE/DEAD(1：1000稀释)。表面染色后，细胞利用BD BiosciencesCytofix/Cytoperm试剂盒进行透化，并且以抗IFN-γ-PE-Cy7(XMG1.2；1:200稀释)和抗TNF-α-APC(MP6-XT22；1:200稀释)进行染色。在与抗体一起温育之后，在以FACSCanto II分析之前，细胞在12小时内清洗并重悬。统计分析利用Mann-Whitney检验以GraphPad Prism来执行。
使用小鼠特异性
Figure GDA0003417796820001641
多分析物面板试剂盒MT17MAG-47K(Millipore；Sigma)和
Figure GDA0003417796820001642
仪器平台以及相关
Figure GDA0003417796820001643
软件(Luminex公司)，IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17A和TNFα的蛋白水平在培养上清液中进行量化。读数以EMD Millipore公司的
Figure GDA0003417796820001644
Analyst软件的标准版本进行分析。统计分析利用Mann-Whitney检验以GraphPad Prism来执行。
单次鼻内施用后，表达刺突蛋白的RBD域的复制缺陷Ad5载体(SEQ ID NO：15)被证实诱导了肺部和脾脏中IFN-γ产生T细胞的显著产生，如图88A-D所示。在接种后10天和14天，在肺部中进行检测到IFN-γ诱导的RBD特异性T细胞的高频率产生，从而分别达到每百万输入细胞的915和706个斑点的平均应答。参见图88。IFN-γ诱导的RBD特异性T细胞还通过ELISpot在脾脏中被检测到，尽管以相比于肺部的较低频率。这表明，响应于粘膜递送抗原所诱发的功能效应子T细胞可迁移至周边淋巴组织。此外，表达早期活化归巢标志物CD11a和IFN-γ和/或TNF-α的RBD特异性CD4+和CD8+T细胞也以显著水平可见于肺部(图89A至D)和脾脏(图90A至D)中。整联蛋白CD11a(其仅在最近激活T细胞中上调并且需用于组织中的最佳血管粘附和呼吸道内的滞留)的表达(Thatte J,Dabak V,Williams MB,BracialeTJ,Ley K.，“LFA-1对于效应子CD8 T细胞在小鼠肺部中的滞留为必需的(LFA-1isrequired for retention of effector CD8 T cells in mouse lungs.)”，《血液(Blood)》，2003年6月15日；101(12)：4916-22)支持这样的假设：这些细胞最近募集至肺部中。T细胞应答以较高水平可见于肺部中，并且以CD8+T细胞为主。鼻内RBD载体还诱导了肺部中的高水平组织驻留记忆CD4+和CD8+T细胞(TRM)(图91A和图91B)。
为评估疫苗诱导的T细胞是否可表示常驻记忆T细胞(Trm)，对肺部CD4+和CD8+细胞中的Trm标志物CD103和CD69的表达(Takamura S.，“暂时肺部生态位的持久性：肺部常驻记忆性CD8+T细胞的存活策略。(Persistence in Temporary Lung Niches:A SurvivalStrategy of Lung-Resident Memory CD8+T Cells.)”，《病毒免疫学(Viral Immunol.)》，2017年7月/8月；30(6):438-450.doi:10.1089/vim.2017.0016.)进行了评估。与鼻内施用途径一致，观察到表达IFN-γ、TNF-α或两种细胞因子的肺部RBD特异性CD4+和CD8+Trm的诱导(图95)。
数据示出，RBD载体疫苗的鼻内施用诱导了用以产生IFN-γ和TNF-α细胞因子的T细胞能力，这些细胞因子与Th-1偏向细胞应答相关联。此外，我们观察到，该疫苗引发了高频率的抗原特异性CD8+T细胞，这些抗原特异性CD8+T细胞通常关联于对于病毒感染的控制重要的IFN调节T细胞应答。为进一步评估接种小鼠的T细胞的细胞因子产生潜力，我们以RBD肽重新刺激脾脏T细胞48小时，然后利用细胞因子微珠阵列来测量上清液中的细胞因子水平。如预期，我们观察到IFN-γ和TNF-α通过T细胞的诱导。此外，我们发现，相比于媒介物对照治疗小时的T细胞，接种动物的T细胞产生了中度水平的IL-10。重要的是，源自接种小鼠的再刺激细胞的上清液中的白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-13和IL-17a水平等同于含有媒介物对照动物的肽刺激细胞的培养物中的所见水平(图96)。
实例18.在C57BL/6小鼠中鼻内施用表达RBD域的Ad5载体，引发了持久抗体应答。
在近交系C57BL/6小鼠中，通过测定刺突特异性血清IgG应答,评估了随着时间推移，编码SARS-Cov-2的RBD域残基302至543(SEQ ID NO:15)的鼻内复制缺陷Ad5载体的免疫原性。在接种前第0天和接种后第15、30、63和120天(例如，约2周、约1个月、约2个月和约4个月)，血清在单次鼻内接种之后进行收集，如表25所描述。用于量化血清中SARS-CoV-2刺突IgG的方法描述于图13B中。
表25
Figure GDA0003417796820001661
结果示于图97中，其中30倍基线以虚线表示。在第15天检测到所有20只接种动物所检测的刺突特异性IgG应答之后，应答保持稳定，直至第120天，基于Wilcoxon匹配对符号秩检验，不同接种后时间点无统计差异。本实例证实，在接种后30天和120天之间，血清的所测量抗刺突IgG无显著衰减。在实施例中，本文提供了疫苗或RBD载体；当作为单次鼻内剂量施用至哺乳动物时，该疫苗或RBD载体诱导了针对刺突蛋白的抗体应答，该抗体应答持续至少4个月。在一些实施例中，本文提供了疫苗或RBD载体；当作为单次鼻内剂量施用至哺乳动物时，该疫苗或RBD载体诱导了针对刺突蛋白的抗体应答，该抗体应答(考虑到不存在衰减，如在约4个月时所测量)持续至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月，或至少约12个月(一年)。
实例19.在CD-1小鼠中鼻内施用表达RBD域的Ad5载体，引发了骨髓和肺部中的长寿命抗体分泌细胞。
通过测量骨髓(BM)和肺部(其产生刺突特异性IgG和IgA)的RBD特异性浆细胞(抗体分泌细胞；ASC)，在远交系CD-1小鼠中进行评估了编码SARS-Cov-2的RBD域残基302至543(SEQ ID NO:15)的鼻内复制缺陷Ad5载体的免疫原性。在接种后第69天，骨髓和肺部在单次鼻内接种之后进行收集，如表26所描述。
表26
疫苗/媒介物对照 鼻内剂量 每组动物数 免疫接种 样品收集
RBD载体 3.78E+08ifu，30μL 5CD-1 第0天 第69天
通过ELISPOT的检测骨髓(BM)和肺部(产生刺突特异性IgG和IgA)中的RBD特异性ASC的结果汇总如下。骨髓(2个胫骨+2个股骨/小鼠)和肺部细胞的单细胞悬液从接种小鼠进行制备。细胞在完整培养基中连续两次地稀释，并且在事先涂布有纯化的重组RBD蛋白(Sino Biological)的多孔纤维素过滤器ELISPOT板(Millipore)上于37℃下温育5小时。这些组织中存在的浆细胞所分泌的RBD特异性抗体利用AP偶联的山羊抗小鼠IgG Ab(JacksonImmunoResearch)或AP偶联的山羊抗小鼠IgA(Jackson ImmunoResearch)进行检测。ELISPOTS利用S6 Ultra-V分析仪(Cellular技术有限公司)进行成像和计数。
结果示于图98中。RBD特异性ASC在第69天接种小鼠的骨髓识别到。由于这些ASC位于特定地支持ASC的长期存活的生态位，我们预测，由RBD载体所诱导的系统性RBD特异性抗体滴度将为高度持久的。此外，鼻内接种还导致持久ASC群体在肺部的建立，该ASC群体包括可在未来感染部位提供粘膜保护的IgA ASC。已知的是，以呼吸道病毒的感染还可在肺部内建立长寿命ASC，并且这些细胞对于重复感染的早期保护为重要的。因此，合理推测为，这些鼻内疫苗诱导ASC的存在也可向接种动物提供局部保护。在实施例中，本文提供了用于诱导骨髓和肺部常驻记忆抗体分泌细胞的组合物(例如，RBD载体)和方法。在一些实施例中，本文提供了疫苗或RBD载体；当作为单次鼻内剂量施用至哺乳动物时，该疫苗或RBD载体诱导了分泌抗刺突IgG和IgA两者的骨髓和肺部常驻记忆抗体分泌细胞。
实例20.在C57BL/6小鼠中鼻内施用表达RBD域的Ad5载体，诱导了长寿命RBD特异性的记忆B细胞。
在近交系C57BL/6小鼠中，通过测量纵膈淋巴结和RBD特异性浆细胞(抗体分泌细胞；ASC)中的长寿命RBD特异性记忆B细胞，评估了编码SARS-Cov-2的RBD域残基302至543(SEQ ID NO:15)的鼻内复制缺陷Ad5载体的免疫原性。在接种后第168天(例如，24周或6个月)，纵膈淋巴结和骨髓在单次鼻内接种之后进行收集，如表27所描述。幼稚C57BL/6小鼠(n＝5)用作阴性对照。
表27
疫苗/媒介物对照 鼻内剂量 每组动物数 免疫 样品收集
RBD载体 3.78E+08ifu，30μL 5C57BL/6 第0天 第168天
关于RBD特异性B细胞记忆的流式细胞仪分析，B细胞抗体面板包括CD95/FAS-FITC(克隆Jo2；1：200稀释)、SARS-CoV-2RBD-PE(1：200稀释)、SARS-CoV-2RBD-APC(1：200稀释)、7-AAD(1：1000稀释)、CD3-PerCP-Cy5.5(克隆17A2；1:200稀释)、CD38-PE-Cy7(克隆90；1:400稀释)、CD19-APC-Fire750(克隆6D5；1:200稀释)、CD138-BV421(克隆281-2；1:200稀释)和IgD-NV510(克隆11-26c.2a；1:500稀释)。细胞与混合抗体(总体积50μl)一起在黑暗中4℃下温育20分钟，并且然后以200ul SME清洗。细胞重悬于200ul SME中(无固定剂)中，并且立即以FACSCanto II进行分析。
RBD特异性记忆B细胞的结果示于图99中。图99B示出，相比于幼稚动物，接种动物的纵膈淋巴结所存在的RBD特异性记忆B细胞的绝对数量更高。在单次鼻内施用RBD载体之后168天，检测到抗原特异性记忆B细胞的存在，有力表明了由鼻内疫苗所诱导的RBD特异性B的长寿命性质。存在于纵膈淋巴结中的RBD特异性记忆B细胞将完全适合于快速地响应于呼吸道感染，诸如SARS-CoV-2。
骨髓中ASC的测量遵循与实例19所描述的相同方法。结果示于图100中。在单次鼻内施用RBD载体后168天内，在大多数动物的骨髓中检测到产生IgG和IgA抗体的长寿命RBD特异性ASC。
讨论--以S1和RBD腺病毒载体的单次剂量鼻内接种在小鼠中诱导了针对SARS-CoV-2的快速和持久的系统性和粘膜免疫
在将编码S1域(残基16至685)(SEQ ID NO:13)或RBD域(残基302至543)(SEQ IDNO:15)(来自SARS-CoV-2菌株(登录号为QHD43416.1))的复制缺陷Ad5载体单次施用至近交系C57BL/6和远交系CD-1小鼠之后，S1和RBD载体的免疫原性通过测量血清和支气管肺泡灌洗液(BAL)中刺突特异性抗体水平的诱导来评估。如上文所描述，每种疫苗以三(3)种不同剂量水平(高、中或低)进行评估。在第0天的单次疫苗施用之后，在第7至28天(C57BL/6)或第7至21天(CD-1)之间收集血清和支气管肺泡灌洗(BAL)样本。SARS-CoV-2刺突的特异性IgG和IgA抗体在血清和BAL样本中利用刺突细胞计数微珠阵列进行测量。在活体病毒中和测定中测量了这些疫苗引发抗体的功能。除了针对SARS-CoV-2诱导强大的中和抗体应答和粘膜IgA外，RBD还刺激了系统性和粘膜细胞介导的免疫应答，该免疫应答特征在于T辅助子1(Th1)型细胞因子谱和通过能够产生细胞因子的CD4+和CD8+T细胞(包括肺部常驻记忆T(Trm)细胞)的诱导。
在两种品系的小鼠中检测到系统性刺突特异性IgG抗体应答，该小鼠接受S1载体或RBD载体疫苗的单次鼻内施用。图78和图85。在中度和高疫苗剂量下，相比于S1载体，RBD载体诱导了适度较大的血清刺突特异性IgG应答，这种效应相比于CD-1小鼠在C57BL/6小鼠中更明显。此外，S1或RBD载体的鼻内施用导致两个品系的小鼠的BAL中刺突特异性IgG的快速升高。还证实了IgA在S1或RBD的单次鼻内给药后的诱导。在鼻内施用之后，由RBD载体(编码SEQ ID NO.15)所诱导的系统性刺突特异性抗体应答也证实为持久的，接种后多达120天内未出现随着时间的下降迹象，如实例18所示。参见图97。此外，鼻内接种还导致持久RBD特异性ASC和长寿命B细胞群体在肺部环境的建立，该群体包括可向接种动物提供局部保护的IgA ASC。参见图98至图100。
利用野生型SARS-CoV-2分离株USA-WA1/2020，引发针对SARS-CoV-2的中和抗体应答的S1载体或RBD载体的鼻内施用在感染容许性Vero E6细胞中以病灶中和减少检验(FNRT)(与板块减少中和检验(PRNT)类似)进行测量。分析包括C57BL/6小鼠在利用中度或高疫苗剂量接种S1和RBD之后4周的样本，和CD-1小鼠在以高疫苗剂量的RBD载体接种之后3周的样本(图94A)。在所有评估条件下，相比于S1载体的利用，鼻内施用的RBD载体引发了显著较大中和滴度。在最高剂量下，RBD载体的鼻内接种在10/10只C57BL/6和8/10只CD-1小鼠中诱导了高于背景的中和抗体应答，中值滴度分别为563和431(图94A)。中和抗体应答的水平与独立动物所测量的刺突特异性血清IgG应答的幅值紧密相关(图94B)，从而指示，RBD载体施用后的强大抗体应答与潜在保护性中和抗体的生成相关联。
实例13、实例15和实例17证实，本发明疫苗组合物(例如，编码SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD序列(SEQ ID NO:15)的腺病毒载体疫苗，配置用于鼻内施用)在近交系和远交系小鼠中均为高度免疫原性的，并且引发了强大的系统性和局部粘膜抗体和T细胞应答。在单次鼻内接种之后，通过诱导功能抗体(其中和了容许性细胞的野生型SARS-CoV-2感染)以及粘膜IgA和能够产生细胞因子的肺部CD4+和CD8+T细胞，RBD载体组合物引发了针对SARS-CoV-2刺突的强力且集中的免疫应答。RBD载体组合物所诱导的细胞介导应答偏向于抗病毒应答，如通过高比率的抗原特异性CD8+T细胞和包括IFN-γ和TNF-α的细胞因子表达所证实。常驻记忆CD8+T细胞群体在肺部的建立补充了针对刺突蛋白的粘膜IgA抗体的强大诱导，并且代表了对于RBD载体组合物的整体免疫应答的重要补充。这些数据还指示，由于鼻内施用的腺病毒载体的使用所诱导的抗病毒应答，RBD载体疫苗组合物的鼻内施用不引发潜在有害Th2应答，而是诱导了预期抗病毒T细胞应答。参见美国专利No.9,605,275。总的来说，该数据示出，鼻内施用的表达SARS-CoV-2刺突RBD序列(SEQ ID NO:15)的复制缺陷Ad5载体在系统性和粘膜部位这两方面均产生体液和细胞免疫应答，特别是在肺部内，该处是感染和临床疾病的主要位点。
虽然某些实施例已根据优选实施例进行描述，但是应当理解，对于本领域的技术人员而言将发生变化和修改。因此，所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围内的所有此类等效变型。
序列表
<110> 艾天穆股份有限公司
<120> 冠状病毒免疫原性组合物和其用途
<130> ALT2029.PCT
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<160> 476
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<210> 1
<211> 29903
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2完整基因组
<400> 1
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240
cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac 300
acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg 360
agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg 420
cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa 480
acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact 540
cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg 600
cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 660
tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga 720
tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga 780
actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg 840
ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 900
atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg 960
tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca 1020
gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1080
ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1140
gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg 1200
caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1260
gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga 1320
aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1380
atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1440
cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1500
ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560
ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620
aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800
aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860
tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920
tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980
aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040
taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100
gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160
agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat 2220
ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280
ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340
tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400
ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520
aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580
agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640
aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2700
cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760
agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820
acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2880
ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3000
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3120
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3420
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3480
aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3600
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3660
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3720
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3780
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3840
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3900
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4020
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4080
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4140
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4200
gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260
gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4320
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4380
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4500
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4560
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4620
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4680
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4740
ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4800
agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4920
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5040
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5100
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5160
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5220
cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5280
caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5340
acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5400
acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5460
gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5520
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5580
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5640
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5700
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5820
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5880
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 5940
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6180
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6240
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6300
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6480
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6540
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6600
attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6660
tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6720
aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6780
ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6840
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6900
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 6960
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7020
tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7080
ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7140
tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7200
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7260
tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag 7320
ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta 7440
tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg 7500
ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag 7560
gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg 7620
tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7680
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7740
tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800
ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac 7860
taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7920
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 7980
agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga 8040
tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8100
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8160
ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt 8220
tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa 8280
ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc 8460
tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca 8580
gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8640
tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760
tgattttgac acatggttta gccagcgtgg tggtagttat actaatgaca aagcttgccc 8820
attgattgct gcagtcataa caagagaagt gggttttgtc gtgcctggtt tgcctggcac 8880
gatattacgc acaactaatg gtgacttttt gcatttctta cctagagttt ttagtgcagt 8940
tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc 9000
ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata 9060
ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac 9120
acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc 9180
tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
agaagctggt gtttgtgtat ctactagtgg tagatgggta cttaacaatg attattacag 9300
atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac 9360
accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat 9420
tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg 9480
tgaatacagt catgtagttg cctttaatac tttactattc cttatgtcat tcactgtact 9540
ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt 9600
gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt 9660
cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720
tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780
tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa 9900
taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc 10020
accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc 10080
atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg 10140
tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtg atctgcacct ctgaagacat 10200
gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca 10260
ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct 10320
taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg 10380
acagactttt tcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc 10440
tatgaggccc aatttcacta ttaagggttc attccttaat ggttcatgtg gtagtgttgg 10500
ttttaacata gattatgact gtgtctcttt ttgttacatg caccatatgg aattaccaac 10560
tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca 10620
aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta 10680
cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800
actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa 10860
agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga 10920
tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt 10980
gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt 11040
agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt 11100
accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160
gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac 11280
tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact 11340
aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat 11400
gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 11460
catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 11520
gtttttggcc agaggtattg tttttatgtg tgttgagtat tgccctattt tcttcataac 11580
tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg 11640
ttactttggc ctcttttgtt tactcaaccg ctactttaga ctgactcttg gtgtttatga 11700
ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa 11760
gaatagcata gatgccttca aactcaacat taaattgttg ggtgttggtg gcaaaccttg 11820
tatcaaagta gccactgtac agtctaaaat gtcagatgta aagtgcacat cagtagtctt 11880
actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt 11940
ccagttacac aatgacattc tcttagctaa agatactact gaagcctttg aaaaaatggt 12000
ttcactactt tctgttttgc tttccatgca gggtgctgta gacataaaca agctttgtga 12060
agaaatgctg gacaacaggg caaccttaca agctatagcc tcagagttta gttcccttcc 12120
atcatatgca gcttttgcta ctgctcaaga agcttatgag caggctgttg ctaatggtga 12180
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aggattaaac aacctaaata gaggtatggt acttggtagt ttagctgcca cagtacgtct 13020
acaagctggt aatgcaacag aagtgcctgc caattcaact gtattatctt tctgtgcttt 13080
tgctgtagat gctgctaaag cttacaaaga ttatctagct agtgggggac aaccaatcac 13140
taattgtgtt aagatgttgt gtacacacac tggtactggt caggcaataa cagttacacc 13200
ggaagccaat atggatcaag aatcctttgg tggtgcatcg tgttgtctgt actgccgttg 13260
ccacatagat catccaaatc ctaaaggatt ttgtgactta aaaggtaagt atgtacaaat 13320
acctacaact tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt aaaaacacag tctgtaccgt 13380
ctgcggtatg tggaaaggtt atggctgtag ttgtgatcaa ctccgcgaac ccatgcttca 13440
gtcagctgat gcacaatcgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca 13500
ccgtgcggca caggcactag tactgatgtc gtatacaggg cttttgacat ctacaatgat 13560
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gctgataaca aatttgcact gacttgcttt agcactcaat ttgcttttgc ttgtcctgac 27600
ggcgtaaaac acgtctatca gttacgtgcc agatcagttt cacctaaact gttcatcaga 27660
caagaggaag ttcaagaact ttactctcca atttttctta ttgttgcggc aatagtgttt 27720
ataacacttt gcttcacact caaaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgact 27780
tctatttgtg ctttttagcc tttctgctat tccttgtttt aattatgctt attatctttt 27840
ggttctcact tgaactgcaa gatcataatg aaacttgtca cgcctaaacg aacatgaaat 27900
ttcttgtttt cttaggaatc atcacaactg tagctgcatt tcaccaagaa tgtagtttac 27960
agtcatgtac tcaacatcaa ccatatgtag ttgatgaccc gtgtcctatt cacttctatt 28020
ctaaatggta tattagagta ggagctagaa aatcagcacc tttaattgaa ttgtgcgtgg 28080
atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct 28140
gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt 28200
cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa 28260
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 29903
<210> 2
<211> 7096
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2 多聚蛋白
<400> 2
Met Glu Ser Leu Val Pro Gly Phe Asn Glu Lys Thr His Val Gln Leu
1 5 10 15
Ser Leu Pro Val Leu Gln Val Arg Asp Val Leu Val Arg Gly Phe Gly
20 25 30
Asp Ser Val Glu Glu Val Leu Ser Glu Ala Arg Gln His Leu Lys Asp
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Gly Thr Cys Gly Leu Val Glu Val Glu Lys Gly Val Leu Pro Gln Leu
50 55 60
Glu Gln Pro Tyr Val Phe Ile Lys Arg Ser Asp Ala Arg Thr Ala Pro
65 70 75 80
His Gly His Val Met Val Glu Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Ile Gln
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Tyr Gly Arg Ser Gly Glu Thr Leu Gly Val Leu Val Pro His Val Gly
100 105 110
Glu Ile Pro Val Ala Tyr Arg Lys Val Leu Leu Arg Lys Asn Gly Asn
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Lys Gly Ala Gly Gly His Ser Tyr Gly Ala Asp Leu Lys Ser Phe Asp
130 135 140
Leu Gly Asp Glu Leu Gly Thr Asp Pro Tyr Glu Asp Phe Gln Glu Asn
145 150 155 160
Trp Asn Thr Lys His Ser Ser Gly Val Thr Arg Glu Leu Met Arg Glu
165 170 175
Leu Asn Gly Gly Ala Tyr Thr Arg Tyr Val Asp Asn Asn Phe Cys Gly
180 185 190
Pro Asp Gly Tyr Pro Leu Glu Cys Ile Lys Asp Leu Leu Ala Arg Ala
195 200 205
Gly Lys Ala Ser Cys Thr Leu Ser Glu Gln Leu Asp Phe Ile Asp Thr
210 215 220
Lys Arg Gly Val Tyr Cys Cys Arg Glu His Glu His Glu Ile Ala Trp
225 230 235 240
Tyr Thr Glu Arg Ser Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Gln Thr Pro Phe Glu
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Ile Lys Leu Ala Lys Lys Phe Asp Thr Phe Asn Gly Glu Cys Pro Asn
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Phe Val Phe Pro Leu Asn Ser Ile Ile Lys Thr Ile Gln Pro Arg Val
275 280 285
Glu Lys Lys Lys Leu Asp Gly Phe Met Gly Arg Ile Arg Ser Val Tyr
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Met Lys Cys Asp His Cys Gly Glu Thr Ser Trp Gln Thr Gly Asp Phe
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Val Lys Ala Thr Cys Glu Phe Cys Gly Thr Glu Asn Leu Thr Lys Glu
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Gly Arg Thr Ile Ala Phe Gly Gly Cys Val Phe Ser Tyr Val Gly Cys
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Cys Asn His Thr Gly Val Val Gly Glu Gly Ser Glu Gly Leu Asn Asp
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Gly Asp Phe Lys Leu Asn Glu Glu Ile Ala Ile Ile Leu Ala Ser Phe
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Ser Ala Ser Thr Ser Ala Phe Val Glu Thr Val Lys Gly Leu Asp Tyr
485 490 495
Lys Ala Phe Lys Gln Ile Val Glu Ser Cys Gly Asn Phe Lys Val Thr
500 505 510
Lys Gly Lys Ala Lys Lys Gly Ala Trp Asn Ile Gly Glu Gln Lys Ser
515 520 525
Ile Leu Ser Pro Leu Tyr Ala Phe Ala Ser Glu Ala Ala Arg Val Val
530 535 540
Arg Ser Ile Phe Ser Arg Thr Leu Glu Thr Ala Gln Asn Ser Val Arg
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Val Leu Gln Lys Ala Ala Ile Thr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Gln Tyr
565 570 575
Ser Leu Arg Leu Ile Asp Ala Met Met Phe Thr Ser Asp Leu Ala Thr
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Lys Pro Val Leu Asp Trp Leu Glu Glu Lys Phe Lys Glu Gly Val Glu
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Leu Gly Glu Thr Phe Val Thr His Ser Lys Gly Leu Tyr Arg Lys Cys
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Val Lys Ser Arg Glu Glu Thr Gly Leu Leu Met Pro Leu Lys Ala Pro
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Val Gln Gly Tyr Lys Ser Val Asn Ile Thr Phe Glu Leu Asp Glu Arg
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885 890 895
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Tyr Ile Lys Asn Ala Asp Ile Val Glu Glu Ala Lys Lys Val Lys
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Pro Thr Val Val Val Asn Ala Ala Asn Val Tyr Leu Lys His Gly
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Val Gly Gly Ser Cys Val Leu Ser Gly His Asn Leu Ala Lys His
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Ala Cys Val Glu Glu Val Thr Thr Thr Leu Glu Glu Thr Lys Phe
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Leu His Thr Gln Val Val Asp Met Ser Met Thr Tyr Gly Gln Gln
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Tyr Tyr Arg Ala Arg Ala Gly Glu Ala Ala Asn Phe Cys Ala Leu
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Ile Leu Ala Tyr Cys Asn Lys Thr Val Gly Glu Leu Gly Asp Val
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Cys Lys Arg Val Leu Asn Val Val Cys Lys Thr Cys Gly Gln Gln
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Leu Ser Tyr Glu Gln Phe Lys Lys Gly Val Gln Ile Pro Cys Thr
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Asp Asp Leu Asn Gln Leu Thr Gly Tyr Lys Lys Pro Ala Ser Arg
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Glu Leu Lys Val Thr Phe Phe Pro Asp Leu Asn Gly Asp Val Val
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Lys Ser Glu Asp Ala Gln Gly Met Asp Asn Leu Ala Cys Glu Asp
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Cys Leu Gly Ser Leu Ile Tyr Ser Thr Ala Ala Leu Gly Val Leu
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Asn Trp Asn Cys Val Asn Cys Asp Thr Phe Cys Ala Gly Ser Thr
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Phe Ile Ser Asp Glu Val Ala Arg Asp Leu Ser Leu Gln Phe Lys
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Leu Asp Asn Leu Arg Ala Asn Asn Thr Lys Gly Ser Leu Pro Ile
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Asn Val Ile Val Phe Asp Gly Lys Ser Lys Cys Glu Glu Ser Ser
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2630 2635 2640
Ser Asp Val Glu Thr Lys Asp Val Val Glu Cys Leu Lys Leu Ser
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2660 2665 2670
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Gly Ala Cys Ile Asp Cys Ser Ala Arg His Ile Asn Ala Gln Val
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Met Ser Leu Ser Glu Gln Leu Arg Lys Gln Ile Arg Ser Ala Ala
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Ala Gly Gly Ile Val Ala Ile Val Val Thr Cys Leu Ala Tyr Tyr
3050 3055 3060
Phe Met Arg Phe Arg Arg Ala Phe Gly Glu Tyr Ser His Val Val
3065 3070 3075
Ala Phe Asn Thr Leu Leu Phe Leu Met Ser Phe Thr Val Leu Cys
3080 3085 3090
Leu Thr Pro Val Tyr Ser Phe Leu Pro Gly Val Tyr Ser Val Ile
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Tyr Leu Tyr Leu Thr Phe Tyr Leu Thr Asn Asp Val Ser Phe Leu
3110 3115 3120
Ala His Ile Gln Trp Met Val Met Phe Thr Pro Leu Val Pro Phe
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Trp Ile Thr Ile Ala Tyr Ile Ile Cys Ile Ser Thr Lys His Phe
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Tyr Trp Phe Phe Ser Asn Tyr Leu Lys Arg Arg Val Val Phe Asn
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Gly Val Ser Phe Ser Thr Phe Glu Glu Ala Ala Leu Cys Thr Phe
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Leu Leu Asn Lys Glu Met Tyr Leu Lys Leu Arg Ser Asp Val Leu
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Tyr Lys Tyr Phe Ser Gly Ala Met Asp Thr Thr Ser Tyr Arg Glu
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Ala Ala Cys Cys His Leu Ala Lys Ala Leu Asn Asp Phe Ser Asn
3230 3235 3240
Ser Gly Ser Asp Val Leu Tyr Gln Pro Pro Gln Thr Ser Ile Thr
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Ser Ala Val Leu Gln Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser
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Gly Lys Val Glu Gly Cys Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr
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Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His Asn Phe Leu Val Gln Ala
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Asn Arg Phe Thr Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met
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Leu Ala Arg Gly Ile Val Phe Met Cys Val Glu Tyr Cys Pro Ile
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6635 6640 6645
Ser Arg Asn Leu Gln Glu Phe Lys Pro Arg Ser Gln Met Glu Ile
6650 6655 6660
Asp Phe Leu Glu Leu Ala Met Asp Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Lys
6665 6670 6675
Leu Glu Gly Tyr Ala Phe Glu His Ile Val Tyr Gly Asp Phe Ser
6680 6685 6690
His Ser Gln Leu Gly Gly Leu His Leu Leu Ile Gly Leu Ala Lys
6695 6700 6705
Arg Phe Lys Glu Ser Pro Phe Glu Leu Glu Asp Phe Ile Pro Met
6710 6715 6720
Asp Ser Thr Val Lys Asn Tyr Phe Ile Thr Asp Ala Gln Thr Gly
6725 6730 6735
Ser Ser Lys Cys Val Cys Ser Val Ile Asp Leu Leu Leu Asp Asp
6740 6745 6750
Phe Val Glu Ile Ile Lys Ser Gln Asp Leu Ser Val Val Ser Lys
6755 6760 6765
Val Val Lys Val Thr Ile Asp Tyr Thr Glu Ile Ser Phe Met Leu
6770 6775 6780
Trp Cys Lys Asp Gly His Val Glu Thr Phe Tyr Pro Lys Leu Gln
6785 6790 6795
Ser Ser Gln Ala Trp Gln Pro Gly Val Ala Met Pro Asn Leu Tyr
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Lys Met Gln Arg Met Leu Leu Glu Lys Cys Asp Leu Gln Asn Tyr
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Gly Asp Ser Ala Thr Leu Pro Lys Gly Ile Met Met Asn Val Ala
6830 6835 6840
Lys Tyr Thr Gln Leu Cys Gln Tyr Leu Asn Thr Leu Thr Leu Ala
6845 6850 6855
Val Pro Tyr Asn Met Arg Val Ile His Phe Gly Ala Gly Ser Asp
6860 6865 6870
Lys Gly Val Ala Pro Gly Thr Ala Val Leu Arg Gln Trp Leu Pro
6875 6880 6885
Thr Gly Thr Leu Leu Val Asp Ser Asp Leu Asn Asp Phe Val Ser
6890 6895 6900
Asp Ala Asp Ser Thr Leu Ile Gly Asp Cys Ala Thr Val His Thr
6905 6910 6915
Ala Asn Lys Trp Asp Leu Ile Ile Ser Asp Met Tyr Asp Pro Lys
6920 6925 6930
Thr Lys Asn Val Thr Lys Glu Asn Asp Ser Lys Glu Gly Phe Phe
6935 6940 6945
Thr Tyr Ile Cys Gly Phe Ile Gln Gln Lys Leu Ala Leu Gly Gly
6950 6955 6960
Ser Val Ala Ile Lys Ile Thr Glu His Ser Trp Asn Ala Asp Leu
6965 6970 6975
Tyr Lys Leu Met Gly His Phe Ala Trp Trp Thr Ala Phe Val Thr
6980 6985 6990
Asn Val Asn Ala Ser Ser Ser Glu Ala Phe Leu Ile Gly Cys Asn
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Tyr Leu Gly Lys Pro Arg Glu Gln Ile Asp Gly Tyr Val Met His
7010 7015 7020
Ala Asn Tyr Ile Phe Trp Arg Asn Thr Asn Pro Ile Gln Leu Ser
7025 7030 7035
Ser Tyr Ser Leu Phe Asp Met Ser Lys Phe Pro Leu Lys Leu Arg
7040 7045 7050
Gly Thr Ala Val Met Ser Leu Lys Glu Gly Gln Ile Asn Asp Met
7055 7060 7065
Ile Leu Ser Leu Leu Ser Lys Gly Arg Leu Ile Ile Arg Glu Asn
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Asn Arg Val Val Ile Ser Ser Asp Val Leu Val Asn Asn
7085 7090 7095
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<211> 1273
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2 表面糖蛋白
<400> 3
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
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Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
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50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
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Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
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165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
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Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
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Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
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Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
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610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
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740 745 750
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820 825 830
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Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
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Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
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Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
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Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
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Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
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Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
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Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
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Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
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Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
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1130 1135 1140
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Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
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Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
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Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
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Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
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Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2 ORF3A
<400> 4
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Gln Gly Glu Ile Lys Asp Ala Thr Pro Ser Asp Phe Val Arg Ala Thr
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Ala Thr Ile Pro Ile Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Ile Val
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Gly Val Ala Leu Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Ser Lys Ile Ile Thr
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Leu Lys Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Ser Lys Gly Val His Phe Val
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Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Val Tyr Ser His Leu Leu Leu
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Val Ala Ala Gly Leu Glu Ala Pro Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Val
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Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn Phe Val Arg Ile Ile Met Arg Leu Trp
115 120 125
Leu Cys Trp Lys Cys Arg Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn
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Tyr Phe Leu Cys Trp His Thr Asn Cys Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr
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Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr Ser Thr Gln Leu Ser Thr Asp Thr Gly
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Glu Glu His Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Val
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Asn Pro Val Met Glu Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser
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Val Pro Leu
275
<210> 5
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2 包膜
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Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
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Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
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Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
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Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
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Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val
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<211> 218
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2 膜糖蛋白
<400> 6
Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu
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Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile
20 25 30
Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile
35 40 45
Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys
50 55 60
Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile
65 70 75 80
Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe
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Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe
100 105 110
Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile
115 120 125
Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile
130 135 140
Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp
145 150 155 160
Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu
165 170 175
Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly
180 185 190
Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr
195 200 205
Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala
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<212> PRT
<213> 未知
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<223> SARS-CoV-2 ORF6
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Ile Ile Met Arg Thr Phe Lys Val Ser Ile Trp Asn Leu Asp Tyr Ile
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Ile Asn Leu Ile Ile Lys Asn Leu Ser Lys Ser Leu Thr Glu Asn Lys
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Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Glu Gln Pro Met Glu Ile Asp
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<211> 121
<212> PRT
<213> 未知
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<223> SARS-CoV-2 ORF7a
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Met Lys Ile Ile Leu Phe Leu Ala Leu Ile Thr Leu Ala Thr Cys Glu
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Leu Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys
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<213> 未知
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His Gln Glu Cys Ser Leu Gln Ser Cys Thr Gln His Gln Pro Tyr Val
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Val Asp Asp Pro Cys Pro Ile His Phe Tyr Ser Lys Trp Tyr Ile Arg
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Val Gly Ala Arg Lys Ser Ala Pro Leu Ile Glu Leu Cys Val Asp Glu
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Ala Gly Ser Lys Ser Pro Ile Gln Tyr Ile Asp Ile Gly Asn Tyr Thr
65 70 75 80
Val Ser Cys Leu Pro Phe Thr Ile Asn Cys Gln Glu Pro Lys Leu Gly
85 90 95
Ser Leu Val Val Arg Cys Ser Phe Tyr Glu Asp Phe Leu Glu Tyr His
100 105 110
Asp Val Arg Val Val Leu Asp Phe Ile
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<211> 419
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2 核衣壳磷蛋白
<400> 10
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Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
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Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
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Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
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Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
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Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
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Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
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His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
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Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
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Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
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Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
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Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
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Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
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Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
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Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
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Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
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Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
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Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
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Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
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Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
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Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
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Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
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<211> 38
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2 ORF10
<400> 11
Met Gly Tyr Ile Asn Val Phe Ala Phe Pro Phe Thr Ile Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Leu Cys Arg Met Asn Ser Arg Asn Tyr Ile Ala Gln Val Asp Val
20 25 30
Val Asn Phe Asn Leu Thr
35
<210> 12
<211> 1285
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2 刺突蛋白
<400> 12
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gly Thr Gly Ser Val Asn Leu Thr Thr
20 25 30
Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val
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Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln
50 55 60
Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile
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His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu
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Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile
100 105 110
Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser
115 120 125
Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu
130 135 140
Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn
145 150 155 160
Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn
165 170 175
Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu
180 185 190
Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn
195 200 205
Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu
210 215 220
Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp
225 230 235 240
Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu
245 250 255
His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala
260 265 270
Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu
275 280 285
Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala
290 295 300
Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val
305 310 315 320
Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu
325 330 335
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu
340 345 350
Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys
355 360 365
Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala
370 375 380
Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn
385 390 395 400
Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly
405 410 415
Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp
420 425 430
Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp
435 440 445
Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu
450 455 460
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
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485 490 495
Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
500 505 510
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515 520 525
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
530 535 540
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545 550 555 560
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<220>
<223> SARS-CoV-2 刺突蛋白
<400> 24
Gly Pro Pro Leu Ser Ser Ser Leu Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu Tyr Ile Val Met Gly Leu Thr Val Leu
20 25 30
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
35 40 45
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
50 55 60
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
65 70 75 80
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
85 90 95
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
100 105 110
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
130 135 140
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
145 150 155 160
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
165 170 175
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
180 185 190
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
195 200 205
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
210 215 220
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
225 230 235 240
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
245 250 255
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
260 265 270
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
275 280 285
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
290 295 300
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
305 310 315 320
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
325 330 335
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
340 345 350
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
355 360 365
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
370 375 380
Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met
385 390 395 400
Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys
405 410 415
Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser
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Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
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<220>
<223> SARS-CoV-2 刺突蛋白
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<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV-2 刺突蛋白
<400> 26
Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe
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<213> 未知
<220>
<223> 肽
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Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
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Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Trp
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<213> 未知
<220>
<223> 肽
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Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu
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<211> 9
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<213> 未知
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<223> 肽
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Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val
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<211> 9
<212> PRT
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<220>
<223> 肽
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Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala
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<211> 9
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<223> 肽
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<213> 未知
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<223> 肽
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Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe
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Ala
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<220>
<223> 肽
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Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe
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Phe
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<213> 未知
<220>
<223> 肽
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Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu
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<211> 9
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<213> 未知
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Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu
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Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu
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Pro Lys
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Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu
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Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg
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Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
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Gly Met
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Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr
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Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe
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Pro Glu Pro Thr Ile Asp Glu Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val
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<223> 肽
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 207
Lys Gln Phe Asp Thr Tyr Asn Leu Trp
1 5
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 208
Leu Leu Asp Asp Phe Val Glu Ile Ile
1 5
<210> 209
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 209
Leu Leu Leu Asp Asp Phe Val Glu Ile
1 5
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 210
Leu Leu Met Pro Ile Leu Thr Leu Thr
1 5
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 211
Leu Met Ile Glu Arg Phe Val Ser Leu
1 5
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<211> 9
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<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 212
Leu Gln Leu Gly Phe Ser Thr Gly Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 213
Leu Val Leu Ser Val Asn Pro Tyr Val
1 5
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<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 214
Met Leu Trp Cys Lys Asp Gly His Val
1 5
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<211> 9
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<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 215
Met Met Ile Ser Ala Gly Phe Ser Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 216
Met Val Met Cys Gly Gly Ser Leu Tyr Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 217
Asn Leu Trp Asn Thr Phe Thr Arg Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 218
Asn Met Leu Arg Ile Met Ala Ser Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 219
Ala Thr Val Val Ile Gly Thr Ser Lys
1 5
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 220
Arg Ile Leu Gly Ala Gly Cys Phe Val
1 5
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 221
Arg Leu Tyr Tyr Asp Ser Met Ser Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 222
Arg Gln Leu Leu Phe Val Val Glu Val
1 5
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 223
Ser Ser Asn Val Ala Asn Tyr Gln Lys
1 5
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 224
Thr Leu Ile Gly Asp Cys Ala Thr Val
1 5
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 225
Thr Leu Val Pro Gln Glu His Tyr Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 226
Thr Met Ala Asp Leu Val Tyr Ala Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 227
Thr Thr Leu Pro Val Asn Val Ala Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 228
Val Leu Gln Ala Val Gly Ala Cys Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 229
Val Leu Trp Ala His Gly Phe Glu Leu
1 5
<210> 230
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 230
Val Met Cys Gly Gly Ser Leu Tyr Val
1 5
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 231
Val Val Asp Lys Tyr Phe Asp Cys Tyr
1 5
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 232
Val Val Tyr Arg Gly Thr Thr Thr Tyr
1 5
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 233
Tyr Leu Asp Ala Tyr Asn Met Met Ile
1 5
<210> 234
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 234
Tyr Leu Asn Thr Leu Thr Leu Ala Val
1 5
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 235
Tyr Gln Lys Val Gly Met Gln Lys Tyr
1 5
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 236
Tyr Thr Met Ala Asp Leu Val Tyr Ala
1 5
<210> 237
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 237
Tyr Val Phe Cys Thr Val Asn Ala Leu
1 5
<210> 238
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 238
His Leu Val Asp Phe Gln Val Thr Ile
1 5
<210> 239
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 239
His Pro Leu Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu
1 5 10
<210> 240
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 240
Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val
1 5
<210> 241
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 241
Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys Glu Pro Cys
1 5 10 15
<210> 242
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 242
Cys Glu Leu Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val
1 5 10
<210> 243
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 243
Ser Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg
1 5
<210> 244
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 244
Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro Leu
1 5 10
<210> 245
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 245
Ala Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile
1 5
<210> 246
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 246
Ala Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met Leu Ile Ile Phe Trp
1 5 10 15
<210> 247
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 247
Phe Leu Ala Phe Leu Leu Phe Leu Val
1 5
<210> 248
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 248
Phe Leu Ala Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu
1 5 10
<210> 249
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 249
Phe Leu Ala Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met Leu Ile Ile
1 5 10 15
<210> 250
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 250
Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met
1 5
<210> 251
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 251
Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met Leu
1 5 10
<210> 252
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 252
Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met Leu Ile Ile Phe Trp Phe
1 5 10 15
<210> 253
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 253
Phe Leu Val Leu Ile Met Leu Ile Ile
1 5
<210> 254
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 254
Phe Leu Val Leu Ile Met Leu Ile Ile Phe Trp Phe Ser Leu Glu
1 5 10 15
<210> 255
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 255
Phe Tyr Leu Cys Phe Leu Ala Phe Leu
1 5
<210> 256
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 256
Phe Tyr Leu Cys Phe Leu Ala Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 257
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 257
Ile Asp Phe Tyr Leu Cys Phe Leu Ala Phe
1 5 10
<210> 258
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 258
Ile Met Leu Ile Ile Phe Trp Phe Ser Leu
1 5 10
<210> 259
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 259
Leu Ala Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met Leu Ile Ile Phe
1 5 10 15
<210> 260
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 260
Leu Phe Leu Val Leu Ile Met Leu Ile Ile Phe Trp Phe Ser Leu
1 5 10 15
<210> 261
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 261
Leu Ile Asp Phe Tyr Leu Cys Phe Leu
1 5
<210> 262
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 262
Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met Leu
1 5
<210> 263
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 263
Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met Leu Ile
1 5 10
<210> 264
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 264
Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met Leu Ile Ile Phe Trp Phe Ser
1 5 10 15
<210> 265
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 265
Met Leu Ile Ile Phe Trp Phe Ser Leu
1 5
<210> 266
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 266
Tyr Leu Cys Phe Leu Ala Phe Leu Leu
1 5
<210> 267
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 267
Tyr Leu Cys Phe Leu Ala Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu Ile Met
1 5 10 15
<210> 268
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 268
Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr
1 5 10
<210> 269
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 269
Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile
1 5
<210> 270
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 270
Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr
1 5 10
<210> 271
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 271
Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val
1 5
<210> 272
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 272
Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
1 5 10
<210> 273
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 273
Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg
1 5 10 15
<210> 274
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 274
Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1 5 10
<210> 275
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 275
Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr
1 5
<210> 276
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 276
Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
1 5
<210> 277
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 277
Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr
1 5
<210> 278
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 278
Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala
1 5 10 15
<210> 279
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 279
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
1 5 10
<210> 280
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 280
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr
1 5 10 15
<210> 281
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 281
Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr
1 5
<210> 282
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 282
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val
1 5
<210> 283
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 283
Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln
1 5 10 15
Leu
<210> 284
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 284
Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr
1 5 10 15
Trp
<210> 285
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 285
Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser
1 5 10 15
Leu
<210> 286
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 286
Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His
1 5 10 15
Gly Lys
<210> 287
<211> 28
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 287
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr
20 25
<210> 288
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 288
Gly Thr Thr Leu Pro Lys
1 5
<210> 289
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 289
Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 290
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 290
Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe
1 5 10 15
Ala
<210> 291
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 291
Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe
1 5 10 15
Asn
<210> 292
<211> 20
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 292
Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys
1 5 10 15
Asp Lys Lys Lys
20
<210> 293
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 293
Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr
1 5
<210> 294
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 294
Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe
1 5 10 15
Phe
<210> 295
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 295
Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val
1 5 10 15
Glu
<210> 296
<211> 19
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 296
Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln
1 5 10 15
Gly Asn Phe
<210> 297
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 297
Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
1 5
<210> 298
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 298
Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 299
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 299
Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg
1 5 10 15
Leu
<210> 300
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 300
Leu Leu Pro Ala Ala Asp
1 5
<210> 301
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 301
Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
1 5
<210> 302
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 302
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 303
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 303
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe
1 5
<210> 304
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 304
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly
1 5 10
<210> 305
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 305
Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile
1 5 10 15
Asn
<210> 306
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 306
Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln
1 5
<210> 307
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 307
Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr
1 5 10 15
Glu
<210> 308
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 308
Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg
<210> 309
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 309
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1 5 10 15
Asp
<210> 310
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 310
Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly
1 5 10 15
Met
<210> 311
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 311
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
1 5 10 15
Gln
<210> 312
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 312
Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp
1 5
<210> 313
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 313
Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala
1 5 10 15
Ile
<210> 314
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 314
Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu
1 5 10 15
<210> 315
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 315
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 316
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 316
Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Arg
<210> 317
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 317
Gln Gln Phe Gly Arg Asp
1 5
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<211> 22
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 318
Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gly Ser Gln
20
<210> 319
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 319
Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 320
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 320
Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys
1 5
<210> 321
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 321
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
1 5 10 15
Gln
<210> 322
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 322
Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr
1 5 10 15
<210> 323
<211> 28
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 323
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr
20 25
<210> 324
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 324
Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser
1 5
<210> 325
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 325
Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile
1 5 10 15
Arg
<210> 326
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 326
Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg
1 5 10 15
<210> 327
<211> 17
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 表位
<400> 327
Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln
1 5 10 15
Lys
<210> 328
<211> 66
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 328
Val Gly Asp Ser Ala Glu Val Ala Val Lys Met Phe Asp Ala Tyr Val
1 5 10 15
Asn Thr Phe Ser Ser Thr Phe Asn Val Pro Met Glu Lys Leu Lys Thr
20 25 30
Leu Val Ala Thr Ala Glu Ala Glu Leu Ala Lys Asn Val Ser Leu Asp
35 40 45
Asn Val Leu Ser Thr Phe Ile Ser Ala Ala Arg Gln Gly Phe Val Asp
50 55 60
Ser Asp
65
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<211> 41
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 329
Met Ser Tyr Glu Asp Gln Asp Ala Leu Phe Ala Tyr Thr Lys Arg Asn
1 5 10 15
Val Ile Pro Thr Ile Thr Gln Met Asn Leu Lys Tyr Ala Ile Ser Ala
20 25 30
Lys Asn Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly
35 40
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 330
Asp Ile Val Lys Thr Asp Gly Thr Leu Met Ile Glu Arg Phe Val Ser
1 5 10 15
Leu Ala Ile Asp Ala Tyr Pro Leu Thr Lys His Pro Asn Gln Glu Tyr
20 25 30
Ala Asp Val Phe His Leu Tyr Leu Gln Tyr Ile Arg Lys Leu His Asp
35 40 45
Glu Leu Thr Gly His Met Leu Asp Met Tyr Ser Val Met Leu Thr Asn
50 55 60
Asp Asn Thr Ser Arg Tyr Trp Glu Pro Glu Phe Tyr Glu Ala Met Tyr
65 70 75 80
Thr Pro His Thr Val Leu Gln
85
<210> 331
<211> 46
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 331
Ala Val Cys Arg His His Ala Asn Glu Tyr Arg Leu Tyr Leu Asp Ala
1 5 10 15
Tyr Asn Met Met Ile Ser Ala Gly Phe Ser Leu Trp Val Tyr Lys Gln
20 25 30
Phe Asp Thr Tyr Asn Leu Trp Asn Thr Phe Thr Arg Leu Gln
35 40 45
<210> 332
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 332
Asn Phe Asn Val Leu Phe Ser Thr Val Phe Pro Pro Thr Ser Phe Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Arg Lys Ile Phe Val Asp Gly Val Pro Phe Val Val Ser
20 25 30
Thr Gly Tyr His Phe Arg Glu Leu Gly Val Val His Asn Gln Asp Val
35 40 45
Asn Leu His Ser Ser Arg Leu Ser Phe Lys Glu Leu Leu Val Tyr Ala
50 55 60
Ala Asp Pro Ala Met His Ala Ala Ser Gly Asn Leu Leu Leu Asp Lys
65 70 75 80
Arg Thr Thr Cys Phe Ser Val Ala Ala Leu Thr Asn Asn Val Ala Phe
85 90 95
Gln Thr
<210> 333
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 333
Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr
1 5 10 15
Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile
20 25 30
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35 40 45
Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr
50 55 60
Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met
65 70 75 80
Tyr Ile Cys
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<211> 70
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 334
Asp Lys Ser Val Tyr Tyr Thr Ser Asn Pro Thr Thr Phe His Leu Asp
1 5 10 15
Gly Glu Val Ile Thr Phe Asp Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Arg
20 25 30
Glu Val Arg Thr Ile Lys Val Phe Thr Thr Val Asp Asn Ile Asn Leu
35 40 45
His Thr Gln Val Val Asp Met Ser Met Thr Tyr Gly Gln Gln Phe Gly
50 55 60
Pro Thr Tyr Leu Asp Gly
65 70
<210> 335
<211> 82
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 335
Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp
1 5 10 15
Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr
20 25 30
Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala
35 40 45
Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val
50 55 60
Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile
65 70 75 80
Gly Lys
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<211> 117
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 336
Asp Ala Val Val Tyr Arg Gly Thr Thr Thr Tyr Lys Leu Asn Val Gly
1 5 10 15
Asp Tyr Phe Val Leu Thr Ser His Thr Val Met Pro Leu Ser Ala Pro
20 25 30
Thr Leu Val Pro Gln Glu His Tyr Val Arg Ile Thr Gly Leu Tyr Pro
35 40 45
Thr Leu Asn Ile Ser Asp Glu Phe Ser Ser Asn Val Ala Asn Tyr Gln
50 55 60
Lys Val Gly Met Gln Lys Tyr Ser Thr Leu Gln Gly Pro Pro Gly Thr
65 70 75 80
Gly Lys Ser His Phe Ala Ile Gly Leu Ala Leu Tyr Tyr Pro Ser Ala
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Arg Ile Val Tyr Thr Ala Cys Ser His Ala Ala Val Asp Ala Leu Cys
100 105 110
Glu Lys Ala Leu Lys
115
<210> 337
<211> 84
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 337
Cys Arg Glu His Glu His Glu Ile Ala Trp Tyr Thr Glu Arg Ser Glu
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Glu Leu Gln Thr Pro Phe Glu Ile Lys Leu Ala Lys Lys
20 25 30
Phe Asp Thr Phe Asn Gly Glu Cys Pro Asn Phe Val Phe Pro Leu Asn
35 40 45
Ser Ile Ile Lys Thr Ile Gln Pro Arg Val Glu Lys Lys Lys Leu Asp
50 55 60
Gly Phe Met Gly Arg Ile Arg Ser Val Tyr Pro Val Ala Ser Pro Asn
65 70 75 80
Glu Cys Asn Gln
<210> 338
<211> 85
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 338
Ala Ala Tyr Val Asp Asn Ser Ser Leu Thr Ile Lys Lys Pro Asn Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Val Leu Gly Leu Lys Thr Leu Ala Thr His Gly Leu Ala
20 25 30
Ala Val Asn Ser Val Pro Trp Asp Thr Ile Ala Asn Tyr Ala Lys Pro
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Phe Leu Asn Lys Val Val Ser Thr Thr Thr Asn Ile Val Thr Arg Cys
50 55 60
Leu Asn Arg Val Cys Thr Asn Tyr Met Pro Tyr Phe Phe Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Gln Leu Cys Thr
85
<210> 339
<211> 86
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 339
Ile Ala Asp Lys Tyr Val Arg Asn Leu Gln His Arg Leu Tyr Glu Cys
1 5 10 15
Leu Tyr Arg Asn Arg Asp Val Asp Thr Asp Phe Val Asn Glu Phe Tyr
20 25 30
Ala Tyr Leu Arg Lys His Phe Ser Met Met Ile Leu Ser Asp Asp Ala
35 40 45
Val Val Cys Phe Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Gln Gly Leu Val Ala Ser
50 55 60
Ile Lys Asn Phe Lys Ser Val Leu Tyr Tyr Gln Asn Asn Val Phe Met
65 70 75 80
Ser Glu Ala Lys Cys Trp
85
<210> 340
<211> 80
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 340
Arg Gln Phe His Gln Lys Leu Leu Lys Ser Ile Ala Ala Thr Arg Gly
1 5 10 15
Ala Thr Val Val Ile Gly Thr Ser Lys Phe Tyr Gly Gly Trp His Asn
20 25 30
Met Leu Lys Thr Val Tyr Ser Asp Val Glu Asn Pro His Leu Met Gly
35 40 45
Trp Asp Tyr Pro Lys Cys Asp Arg Ala Met Pro Asn Met Leu Arg Ile
50 55 60
Met Ala Ser Leu Val Leu Ala Arg Lys His Thr Thr Cys Cys Ser Leu
65 70 75 80
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<211> 80
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 341
Gly His Phe Asp Gly Gln Gln Gly Glu Val Pro Val Ser Ile Ile Asn
1 5 10 15
Asn Thr Val Tyr Thr Lys Val Asp Gly Val Asp Val Glu Leu Phe Glu
20 25 30
Asn Lys Thr Thr Leu Pro Val Asn Val Ala Phe Glu Leu Trp Ala Lys
35 40 45
Arg Asn Ile Lys Pro Val Pro Glu Val Lys Ile Leu Asn Asn Leu Gly
50 55 60
Val Asp Ile Ala Ala Asn Thr Val Ile Trp Asp Tyr Lys Arg Asp Ala
65 70 75 80
<210> 342
<211> 92
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 342
Leu His Pro Thr Gln Ala Pro Thr His Leu Ser Val Asp Thr Lys Phe
1 5 10 15
Lys Thr Glu Gly Leu Cys Val Asp Ile Pro Gly Ile Pro Lys Asp Met
20 25 30
Thr Tyr Arg Arg Leu Ile Ser Met Met Gly Phe Lys Met Asn Tyr Gln
35 40 45
Val Asn Gly Tyr Pro Asn Met Phe Ile Thr Arg Glu Glu Ala Ile Arg
50 55 60
His Val Arg Ala Trp Ile Gly Phe Asp Val Glu Gly Cys His Ala Thr
65 70 75 80
Arg Glu Ala Val Gly Thr Asn Leu Pro Leu Gln Leu
85 90
<210> 343
<211> 55
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 343
Asp Thr Asn Val Leu Glu Gly Ser Val Ala Tyr Glu Ser Leu Arg Pro
1 5 10 15
Asp Thr Arg Tyr Val Leu Met Asp Gly Ser Ile Ile Gln Phe Pro Asn
20 25 30
Thr Tyr Leu Glu Gly Ser Val Arg Val Val Thr Thr Phe Asp Ser Glu
35 40 45
Tyr Cys Arg His Gly Thr Cys
50 55
<210> 344
<211> 96
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 344
Asp Lys Arg Thr Thr Cys Phe Ser Val Ala Ala Leu Thr Asn Asn Val
1 5 10 15
Ala Phe Gln Thr Val Lys Pro Gly Asn Phe Asn Lys Asp Phe Tyr Asp
20 25 30
Phe Ala Val Ser Lys Gly Phe Phe Lys Glu Gly Ser Ser Val Glu Leu
35 40 45
Lys His Phe Phe Phe Ala Gln Asp Gly Asn Ala Ala Ile Ser Asp Tyr
50 55 60
Asp Tyr Tyr Arg Tyr Asn Leu Pro Thr Met Cys Asp Ile Arg Gln Leu
65 70 75 80
Leu Phe Val Val Glu Val Val Asp Lys Tyr Phe Asp Cys Tyr Asp Gly
85 90 95
<210> 345
<211> 107
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 345
Lys Val Thr Phe Gly Asp Asp Thr Val Ile Glu Val Gln Gly Tyr Lys
1 5 10 15
Ser Val Asn Ile Thr Phe Glu Leu Asp Glu Arg Ile Asp Lys Val Leu
20 25 30
Asn Glu Lys Cys Ser Ala Tyr Thr Val Glu Leu Gly Thr Glu Val Asn
35 40 45
Glu Phe Ala Cys Val Val Ala Asp Ala Val Ile Lys Thr Leu Gln Pro
50 55 60
Val Ser Glu Leu Leu Thr Pro Leu Gly Ile Asp Leu Asp Glu Trp Ser
65 70 75 80
Met Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe Asp Glu Ser Gly Glu Phe Lys Leu Ala
85 90 95
Ser His Met Tyr Cys Ser Phe Tyr Pro Pro Asp
100 105
<210> 346
<211> 80
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 346
Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser
1 5 10 15
Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val
20 25 30
Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg
35 40 45
Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser
50 55 60
Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp
65 70 75 80
<210> 347
<211> 91
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 347
Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys
1 5 10 15
His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala
20 25 30
Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe
35 40 45
Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu
85 90
<210> 348
<211> 102
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 348
Glu Ala Val Lys Thr Gln Phe Asn Tyr Tyr Lys Lys Val Asp Gly Val
1 5 10 15
Val Gln Gln Leu Pro Glu Thr Tyr Phe Thr Gln Ser Arg Asn Leu Gln
20 25 30
Glu Phe Lys Pro Arg Ser Gln Met Glu Ile Asp Phe Leu Glu Leu Ala
35 40 45
Met Asp Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Lys Leu Glu Gly Tyr Ala Phe Glu
50 55 60
His Ile Val Tyr Gly Asp Phe Ser His Ser Gln Leu Gly Gly Leu His
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gly Leu Ala Lys Arg Phe Lys Glu Ser Pro Phe Glu Leu
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Glu Asp Phe Ile Pro Met
100
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<211> 97
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 349
Ser Gln Ala Trp Gln Pro Gly Val Ala Met Pro Asn Leu Tyr Lys Met
1 5 10 15
Gln Arg Met Leu Leu Glu Lys Cys Asp Leu Gln Asn Tyr Gly Asp Ser
20 25 30
Ala Thr Leu Pro Lys Gly Ile Met Met Asn Val Ala Lys Tyr Thr Gln
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Leu Cys Gln Tyr Leu Asn Thr Leu Thr Leu Ala Val Pro Tyr Asn Met
50 55 60
Arg Val Ile His Phe Gly Ala Gly Ser Asp Lys Gly Val Ala Pro Gly
65 70 75 80
Thr Ala Val Leu Arg Gln Trp Leu Pro Thr Gly Thr Leu Leu Val Asp
85 90 95
Ser
<210> 350
<211> 77
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 350
Asp Cys Val Val Leu His Ser Tyr Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Gln Leu Ser Thr Asp Thr Gly Val Glu His Val Thr Phe
20 25 30
Phe Ile Tyr Asn Lys Ile Val Asp Glu Pro Glu Glu His Val Gln Ile
35 40 45
His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Val Asn Pro Val Met Glu Pro
50 55 60
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65 70 75
<210> 351
<211> 37
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 351
Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn Val Ser Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn Leu Asn Ser Ser Arg Val
20 25 30
Pro Asp Leu Leu Val
35
<210> 352
<211> 124
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 352
Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro
1 5 10 15
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85 90 95
Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp His
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln
115 120
<210> 353
<211> 85
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肽
<400> 353
Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro Leu Ala Asp Asn
1 5 10 15
Lys Phe Ala Leu Thr Cys Phe Ser Thr Gln Phe Ala Phe Ala Cys Pro
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65 70 75 80
Lys Arg Lys Thr Glu
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Ala
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Pro Gln Leu Glu Met Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Thr Ile Glu Val
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Arg Thr Asn Val Tyr Leu Ala Val Phe Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Lys
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Thr Ser Lys Thr Thr Val Ala Ser Leu Ile Asn Thr Leu Asn Asp Leu
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Met Arg Thr Phe Lys Val Ser Ile Trp Asn Leu Asp Tyr Ile Ile Asn
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Gly Val Ser Phe Ser Thr Phe Glu Glu Ala Ala Leu Cys Thr Phe
3170 3175 3180
Leu Leu Asn Lys Glu Met Tyr Leu Lys Leu Arg Ser Asp Val Leu
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Leu Pro Leu Thr Gln Tyr Asn Arg Tyr Leu Ala Leu Tyr Asn Lys
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Tyr Lys Tyr Phe Ser Gly Ala Met Asp Thr Thr Ser Tyr Arg Glu
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Ala Ala Cys Cys His Leu Ala Lys Ala Leu Asn Asp Phe Ser Asn
3230 3235 3240
Ser Gly Ser Asp Val Leu Tyr Gln Pro Pro Gln Thr Ser Ile Thr
3245 3250 3255
Ser Ala Val Leu Gln Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser
3260 3265 3270
Gly Lys Val Glu Gly Cys Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr
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Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu Asp Asp Val Val Tyr Cys Pro Arg
3290 3295 3300
His Val Ile Cys Thr Ser Glu Asp Met Leu Asn Pro Asn Tyr Glu
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Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His Asn Phe Leu Val Gln Ala
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Gly Asn Val Gln Leu Arg Val Ile Gly His Ser Met Gln Asn Cys
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Val Leu Lys Leu Lys Val Asp Thr Ala Asn Pro Lys Thr Pro Lys
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Arg Pro Asn Phe Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Asn Gly Ser Cys
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Gly Ser Val Gly Phe Asn Ile Asp Tyr Asp Cys Val Ser Phe Cys
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Asn Arg Phe Thr Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met
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Gly Pro Leu Ser Ala Gln Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys
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Ala Ser Leu Lys Glu Leu Leu Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr
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Ile Leu Gly Ser Ala Leu Leu Glu Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp
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Leu Leu Gly Val Gly Gly Lys Pro Cys Ile Lys Val Ala Thr Val
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Ser Ser Gln Ala Trp Gln Pro Gly Val Ala Met Pro Asn Leu Tyr
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Lys Met Gln Arg Met Leu Leu Glu Lys Cys Asp Leu Gln Asn Tyr
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Gly Asp Ser Ala Thr Leu Pro Lys Gly Ile Met Met Asn Val Ala
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Lys Tyr Thr Gln Leu Cys Gln Tyr Leu Asn Thr Leu Thr Leu Ala
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Val Pro Tyr Asn Met Arg Val Ile His Phe Gly Ala Gly Ser Asp
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Lys Gly Val Ala Pro Gly Thr Ala Val Leu Arg Gln Trp Leu Pro
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Thr Gly Thr Leu Leu Val Asp Ser Asp Leu Asn Asp Phe Val Ser
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Asp Ala Asp Ser Thr Leu Ile Gly Asp Cys Ala Thr Val His Thr
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Ser Val Ala Ile Lys Ile Thr Glu His Ser Trp Asn Ala Asp Leu
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<210> 411
<211> 242
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<213> 未知
<220>
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<223> SARS-CoV 刺突蛋白
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<210> 413
<211> 242
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV 刺突蛋白
<400> 413
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<223> 分泌型膜锚定荧光素酶
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<223> SARS-CoV 刺突蛋白
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Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
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Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
165 170 175
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
180 185 190
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
195 200 205
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
210 215 220
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
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Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
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<223> SARS Co-V 刺突蛋白
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<223> SARS Co-V 刺突蛋白
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Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
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<213> 未知
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<223> SARS-CoV 刺突蛋白
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245 250 255
Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
260 265 270
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Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
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885 890 895
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
900 905 910
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
915 920 925
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
930 935 940
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
945 950 955 960
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln
965 970 975
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
980 985 990
Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser
995 1000 1005
Val Asn Phe Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1010 1015 1020
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly
1025 1030 1035
Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile
1040 1045 1050
Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val
1055 1060 1065
Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys
1070 1075 1080
Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
1085 1090 1095
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
1100 1105 1110
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
1115 1120 1125
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
1130 1135 1140
Thr Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
1145 1150 1155
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
1160 1165 1170
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
1175 1180 1185
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
1190 1195 1200
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
1205 1210 1215
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln
1220 1225 1230
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
1235 1240 1245
Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn
1250 1255 1260
Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1265 1270 1275
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu
1280 1285 1290
Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu
1295 1300 1305
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
1310 1315 1320
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
1325 1330 1335
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
1340 1345 1350
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
1355 1360 1365
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
1370 1375 1380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
1385 1390 1395
Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
1400 1405 1410
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
1415 1420 1425
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
1430 1435 1440
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
1445 1450 1455
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr
1460 1465 1470
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly
1475 1480 1485
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
1490 1495 1500
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val
1505 1510 1515
Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe
1520 1525
<210> 476
<211> 1567
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> SARS-CoV 刺突蛋白
<400> 476
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
1 5 10 15
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
20 25 30
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
35 40 45
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
50 55 60
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
65 70 75 80
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
85 90 95
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
100 105 110
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
115 120 125
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
130 135 140
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
145 150 155 160
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
165 170 175
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
180 185 190
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
195 200 205
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
210 215 220
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
225 230 235 240
Thr Phe Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Arg Ser Val Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val
260 265 270
Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu
275 280 285
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu
290 295 300
Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys
305 310 315 320
Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala
325 330 335
Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn
340 345 350
Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly
355 360 365
Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp
370 375 380
Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp
385 390 395 400
Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg
405 410 415
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
420 425 430
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu
435 440 445
Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
450 455 460
Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu
465 470 475 480
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
485 490 495
Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe Gly Ser Gly Gly Gly
500 505 510
Gly Ser Arg Arg Lys Arg Ser Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
515 520 525
Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr
530 535 540
Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn
545 550 555 560
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
565 570 575
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
580 585 590
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
595 600 605
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
610 615 620
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
625 630 635 640
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
645 650 655
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
660 665 670
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
675 680 685
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
690 695 700
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
705 710 715 720
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
725 730 735
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
740 745 750
Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val
755 760 765
Asn Phe Thr Phe Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Arg Ser
770 775 780
Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe
785 790 795 800
Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro
805 810 815
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
820 825 830
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
835 840 845
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
850 855 860
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
865 870 875 880
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile
885 890 895
Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile
900 905 910
Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
915 920 925
Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn
930 935 940
Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
945 950 955 960
Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly
965 970 975
Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
980 985 990
Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
995 1000 1005
Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
1010 1015 1020
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe Gly
1025 1030 1035
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Arg Ser Val Gly Gly Gly
1040 1045 1050
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu
1055 1060 1065
Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu
1070 1075 1080
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
1085 1090 1095
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
1100 1105 1110
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
1115 1120 1125
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
1130 1135 1140
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
1145 1150 1155
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
1160 1165 1170
Thr Gly Thr Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
1175 1180 1185
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
1190 1195 1200
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
1205 1210 1215
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
1220 1225 1230
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr
1235 1240 1245
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly
1250 1255 1260
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
1265 1270 1275
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val
1280 1285 1290
Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1295 1300 1305
Ser Arg Arg Lys Arg Ser Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1310 1315 1320
Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln
1325 1330 1335
Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe
1340 1345 1350
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
1355 1360 1365
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
1370 1375 1380
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe
1385 1390 1395
Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp
1400 1405 1410
Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly
1415 1420 1425
Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala
1430 1435 1440
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
1445 1450 1455
Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
1460 1465 1470
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
1475 1480 1485
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
1490 1495 1500
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
1505 1510 1515
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
1520 1525 1530
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
1535 1540 1545
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val
1550 1555 1560
Asn Phe Thr Phe
1565

Claims (92)

1.一种包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体的免疫原性组合物，其中所述rdAd载体选自：
a)缺乏编码外源性非腺病毒抗原的编码序列的rdAd载体；
b)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原的SARS-CoV-2抗原编码序列，任选地其中所述抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)；
c)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2以外的感染性病原体的至少一种外源性抗原；
d)a)和b)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
e)b)和c)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
e)a)、b)和c)任一者的所述载体的任一者的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
g)b)中两种不同类型的rdAd载体的组合，其中每种类型的rdAd载体包括表达盒，所述表达盒编码不同于由所述组合中的其它类型的rdAd载体所编码的抗原的至少一种SARS-CoV-2抗原，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
所述免疫原性组合物配置成在哺乳动物受试者中诱导针对SARS-CoV-2的中和抗体和/或细胞免疫应答，所述免疫原性组合物施用至所述哺乳动物受试者。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述表达盒包括用于刺突(S)蛋白或所述刺突蛋白的S1域的SARS-CoV-2抗原编码序列。
3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述表达盒包括选自由以下项组成的组的SARS-CoV-2抗原编码序列：SEQ ID NO:3；与SEQ ID NO:3具有至少80％同源性和/或同一性的序列；SEQ ID NO:12所示序列；与SEQ ID NO:12具有至少80％同源性和/或同一性的序列；SEQ ID NO:15；与SEQ ID NO:15具有至少80％同源性和/或同一性的序列；SEQ IDNO:446；与SEQ ID NO:446具有至少80％同源性和/或同一性的序列；SEQ ID NO:412-417的任一者；SEQ ID NO:438-445的任一者；和SEQ ID NO:475-476或460的任一者；与SEQ IDNO:412-417，SEQ ID NO:438-445和SEQ ID NO:475-476和460的任一者具有至少80％同源性和/或同一性的序列。
4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列编码刺突蛋白序列，所述刺突蛋白序列包括以下项：其中S1/S2可裂解位点和/或S2'对蛋白质组降解耐受的序列，和/或其中融合肽已缺失或修饰以防止其融合活性的序列，和/或其中胞内域已被修饰或部分地修饰以更改内质网保留基序的序列，任选地包括编码序列，所述编码序列编码包括以下项的至少一者的序列：所述S1/S2裂解位点处的NSPQQAQSVAS(SEQ IDNO:451)、NSPSGAGSVAS(SEQ ID NO:456)或NSP-----VAS(SEQ ID NO:461)，所述S2'裂解位点处的KRSFIADA(SEQ ID NO:453)、PSKPSKQSF(SEQ ID NO:457)、PSKPSKNSF(SEQ ID NO:458)、PSKPSNASF(SEQ ID NO:459)，或SRLDPPEAEV(SEQ ID NO:455)，和/或表1和/或表2中所呈现的任何序列修饰。
5.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列为SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示序列，或其免疫原性片段。
6.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列至少编码SEQ ID NO:3的氨基酸331-527。
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列编码刺突蛋白受体结合域(RBD)序列，所述刺突蛋白受体结合域(RBD)序列包括下述取代的一者或多者：K417N、K417T、R403K、N439K、G446V、G446S、L452R、G476A、S477N、T478K、E484D、T478I、E484K、F490S、Q493R、S494P、P499H和/或N501Y。
8.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列编码刺突蛋白受体结合域(RBD)序列，或其免疫原性片段；和/或包括以下项的氨基酸序列：SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:412-417、SEQ ID NO:438-445、SEQ ID NO:475-476、SEQ ID NO:446和SEQ ID NO:460；或其免疫原性片段。
9.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体的所述表达盒还包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2结构蛋白包膜(E)、膜(M)或核衣壳(N)的一者或多者。
10.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，包括额外复制缺陷腺病毒载体，所述额外复制缺陷腺病毒载体包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2结构蛋白包膜(E)、膜(M)或核衣壳(N)的一者或多者。
11.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体的所述表达盒包括SEQ ID NO:411的修饰形式的编码序列，其包括：
氨基酸333-388、390-395、397-399、401-411、413-415、417-419、424、426-435、437、439-442、444-446、449、450、452、453、455-463、465、467-473、475-479、481-486、490、491、493-495、499-510和/或513-526中的任何一者或多者的一个或多个取代；氨基酸367、403、417、439、446、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、490、493、494、495、496、499、500、501、502、503、504和/或505中的任何一者或多者的一个或多个取代；选自由以下项组成的组的一个或多个取代：氨基酸367(V)被F、I、L S或A取代、氨基酸403(R)被K或S取代、417(K)被N或T取代、氨基酸439(N)被K取代、氨基酸446(G)被V、S或A取代、氨基酸449(Y)被N取代、氨基酸452(L)被L、M或Q取代、氨基酸453(Y)被F取代、氨基酸455(L)被F取代、氨基酸456(F)被L取代、氨基酸470(T)被I、A或N取代、氨基酸473(Y)被V取代、氨基酸475(A)被V取代、氨基酸476(G)被S或A取代、氨基酸477(S)被N、R、T、G、A或I取代、氨基酸476(G)被S或A取代、氨基酸477(S)被N、R、T、G、A或I取代、氨基酸478(T)由I、K、R或A取代、氨基酸484(E)被Q、K、D、A或R取代、氨基酸486(F)被L或S取代、氨基酸490(F)被L或S取代、氨基酸493(Q)被L或R取代、氨基酸494(S)被P或L取代、氨基酸495(Y)被N或F取代、氨基酸496(G)被V或S取代、氨基酸499(P)被H，S或R取代、氨基酸500(T)被I取代、氨基酸501(N)被Y、T或S取代、氨基酸502(G)被R、D或C取代、氨基酸503(V)被L、I或F取代、氨基酸504(G)被V、D或S取代、氨基酸505(Y)被H、E、W或C取代。
12.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中SARS-CoV-2之外的感染性病原体的至少一种抗原来源于流感病毒。
13.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，包括a)-c)的所述rdAd载体的任何两者的组合。
14.根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物为两部分组合物，所述两部分组合物含有包括a)-c)的rdAd载体的至少一种组合物和包括a)-c)的不同rdAd载体的至少第二组合物。
15.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，还配置成针对SARS-CoV-2诱导粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合。
16.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述编码序列至少编码一个或多个B细胞表位、一个或多个CD8+T细胞表位，和/或一个或多个CD4+T细胞表位。
17.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述编码序列对于所述哺乳动物受试者进行密码子优化。
18.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述中和抗体针对哺乳动物受试者的SARS-CoV-2感染为血清保护的，任选地其中所述哺乳动物受试者为人类。
19.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为人腺病毒，任选地Ad5或Ad26。
20.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为牛腺病毒、犬腺病毒、非人灵长类腺病毒、鸡腺病毒、猪或猪型腺病毒。
21.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为E1、E3和/或E4缺失或破坏的腺病毒。
22.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原编码序列编码一个或多个肽，所述一个或多个肽包括表3A的一个或多个T细胞表位，表3B的一组或多组T细胞表位，或SEQ ID NO:27-282；和/或SEQ ID NO:25-68的一个或多个B细胞表位；和/或SEQ ID NO:328-369的一者或多者；任选地其中所述肽进行串联，并且通过两个至十个氨基酸的连接子氨基酸序列来分开。
23.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述rdAd载体还包括至少一种分子佐剂，所述分子佐剂选自由以下项组成的组：一种或多种多肽或肽，所述多肽或肽作用为共刺激组分；一种或多种细胞因子；一种或多种趋化因子；一种或多种免疫抑制蛋白；一种或多种TLR激动剂，任选地其中所述一种或多种TLR激动剂选自由SEQ ID NO:463-474；和其组合组成的组。
24.根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述rdAd载体包括至少一个多核苷酸序列，所述至少一个多核苷酸序列编码至少一种SARS-CoV-2阻断蛋白；其中所述至少一个多核苷酸序列编码至少一种肽或多肽：所述肽或多肽诱导免疫应答，所述免疫应答干扰所述SARS-CoV-2S蛋白与其细胞受体的结合，直接地干扰所述SARS-CoV-2S蛋白与其细胞受体的结合，为RBD结合剂，为ACE2结合剂，和/或既为RBD结合剂又为ACE2结合剂。
25.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据任一项前述权利要求所述的免疫原性组合物的rdAd载体。
26.一种rdAd载体，所述rdAd载体在宿主细胞表达权利要求25所述的多核苷酸时产生。
27.一种包含根据权利要求26所述的rdAd载体的组合物。
28.一种药物制剂，所述药物制剂包括有效量的根据权利要求1至24所述的免疫原性组合物，和药学上可接受的稀释剂或载体，任选地其中所述稀释剂为磷酸盐缓冲盐水。
29.根据权利要求28所述的药物制剂，所述药物制剂配置用于非侵入性施用。
30.根据权利要求28或29所述的药物制剂，所述药物制剂配置用于鼻内施用至所述哺乳动物受试者。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂施用至所述哺乳动物受试者，诱导了所述哺乳动物受试者的保护性免疫应答，任选地诱导了粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的药物制剂，其中所述药学上可接受载体为喷雾或气溶胶形式。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的药物制剂，其中所述有效量为至少107个病毒颗粒(vp)，至少108个病毒颗粒(vp)，或至少109个病毒颗粒(vp)。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的药物制剂，所述药物制剂配置为单次鼻内剂量。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的药物制剂，所述药物制剂配置为两次或更多次鼻内剂量。
36.一种适用于单次剂量鼻内施用至人受试者的药物制剂，所述药物制剂包括：
根据权利要求1至31所述的免疫原性组合物的有效量的至少107个病毒颗粒(vp)，所述免疫原性组合物包括至少一个复制缺陷腺病毒载体，所述复制缺陷腺病毒载体包括表达盒，所述表达盒包括至少编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)或其至少一个免疫原性片段的编码序列，其中所述有效量诱导了粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合；和，
药学上可接受稀释剂或载体。
37.根据权利要求36所述的药物制剂，其中所述制剂配置成向所述人受试者提供针对SARS-CoV-2的血清保护至少6个月或优选9个月。
38.根据权利要求36或37所述的药物制剂，其中所述编码序列对于所述人受试者进行密码子优化。
39.一种用于鼻内施用的药物剂型，所述药物剂量包括：
喷雾或气溶胶形式的药学可接受载体，所述药学可接受载体与根据权利要求1至27所述的免疫原性组合物进行混合，其中所述剂量被配置为用于鼻内施用并非侵入性地诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答。
40.根据权利要求39所述的药物剂型，其中所述免疫原性组合物包括有效量的至少107个病毒颗粒(vp)，至少108个病毒颗粒(vp)，或至少109个病毒颗粒(vp)。
41.根据权利要求39所述的药物剂型，其中所述有效量诱导了粘膜、体液和T细胞保护性免疫应答的组合。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的药物剂型，其被配置为单次剂量以诱导针对冠状病毒的保护性免疫应答。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的药物剂型，其被配置为两次或更多次剂量以诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答。
44.一种用于诱导针对冠状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至27所述的免疫原性组合物施用至哺乳动物受试者。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述免疫应答针对SARS-CoV-2为保护性的。
46.一种用于诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的方法，所述方法包括将根据权利要求28至38中任一项所述的药物制剂或根据权利要求39至43所述的药物剂型施用至哺乳动物受试者。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述免疫应答针对SARS-CoV-2为保护性的。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，所述方法包括将有效量的所述免疫应答组合物鼻内施用至所述哺乳动物受试者，其中所述免疫应答提供针对SARS-CoV-2攻击的保护。
49.一种在人类受试者中诱导针对冠状病毒的粘膜、体液和/或T细胞保护性免疫应答的组合的方法，所述方法包括：
向人受试者鼻内施用单次剂量的根据权利要求28至38中任一项所述的冠状病毒(SARS-CoV-2)药物制剂或根据权利要求39至43所述的药物剂型，其中所述施用诱导了针对SARS-CoV-2的血清抗体、粘膜抗体和T细胞，任选地由此所述人受试者受血清保护至少约6个月或优选9个月。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述血清保护持续至少12个月、至少13个月或至少14个月。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，还包括向所述人类施用一种或多种抗细胞因子试剂以预防和/或治疗SARS-CoV-2，任选地其中所述一种或多种抗细胞因子试剂包括一种或多种抗IL-1α试剂、一种或多种抗IL-5试剂、一种或多种抗IL-6试剂、一种或多种抗IL-12试剂、一种或多种抗IL-17试剂、一种或多种抗MCP-1试剂、一种或多种抗TNF-α试剂、一种或多种抗GM-CSF试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种抗细胞因子试剂不包括一种或多种抗MIPa试剂和/或一种或多种抗RANTES试剂。
53.根据权利要求51所述的方法，其中：
所述一种或多种抗细胞因子试剂基本上与所述有效量的所述免疫原性组合物共同施用；
所述一种或多种抗细胞因子试剂基本上未与所述有效量的所述免疫原性组合物一起施用；
所述免疫原性组合物一次施用至所述哺乳动物并且所述一种或多种抗细胞因子试剂多次施用；或
所述免疫原性组合物与所述一种或多种抗细胞因子试剂一起共同施用至所述哺乳动物，并且所述一种或多种抗细胞因子试剂随后施用至所述哺乳动物。
54.一种治疗或抑制哺乳动物的呼吸道病毒感染症状的方法，所述呼吸道病毒感染引起白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1-α(IL-1α)和/或白细胞介素-12(IL-12)在所述哺乳动物的肺部中的升高表达，所述方法包括：向所述受试者鼻内施用有效量的表达或未表达SARS-CoV-2抗原的E1和E3缺失的腺病毒载体，由此在所述载体的施用之后，IL-6、IL-1α和/或IL-12在所述肺部的表达得以减少，从而缓解所述症状至多约28天。
55.根据权利要求54所述的方法，其中在所述载体的施用之后，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IFN-γ和/或RANTES的表达在所述肺部中增加。
56.根据权利要求54所述的方法，其中在所述载体的施用之后，巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)和/或RANTES的表达未减少。
57.一种在患有或可能患有呼吸道病毒感染的有需要的哺乳动物受试者中诱导抗病毒免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者鼻内施用有效量的表达或未表达SARS-CoV-2抗原的E1和E3缺失的腺病毒载体，其中在所述施用步骤之后，所述抗病毒免疫应答增加了单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和/或干扰素α(IFN-γ)的表达。
58.根据权利要求44至57中任一项所述的方法，其中在施用E1和E3缺失的腺病毒载体之前、基本上同时或之后，向受试者施用一种或多种额外抗SARS-CoV-2药剂，任选地其中所述一种或多种额外药剂选自由氯喹、阿奇霉素、瑞德西韦和其组合组成的组。
59.根据权利要求44至58中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者在向其施用所述药物制剂之前感染了SARS-CoV-2。
60.根据权利要求44至59中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者为人类。
61.一种包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体的免疫原性组合物，其中所述rdAd载体选自：
a)缺乏编码外源性非腺病毒抗原的编码序列的rdAd载体；
b)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原的SARS-CoV-2抗原编码序列，任选地其中所述抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)；
c)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2以外的感染性病原体的至少一种外源性抗原；
d)a)和b)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
e)b)和c)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
e)a)、b)和c)任一者的所述载体的任一者的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
g)b)的两种不同类型的rdAd载体的组合，其中每种类型的rdAd载体包括表达盒，所述表达盒编码不同于由所述组合中的其它类型的rdAd载体所编码的抗原的至少一种SARS-CoV-2抗原，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
所述免疫原性组合物配置成在哺乳动物受试者中诱导针对SARS-CoV-2的中和抗体和/或细胞免疫应答，所述免疫原性组合物施用至所述哺乳动物受试者；
以用于SARS-CoV-2的治疗或预防。
62.包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体的免疫原性组合物的用途，其中所述rdAd载体选自：
a)缺乏编码外源性非腺病毒抗原的编码序列的rdAd载体；
b)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码至少一种SARS-CoV-2抗原的SARS-CoV-2抗原编码序列，任选地其中所述抗原包括SARS-CoV-2刺突(S)蛋白受体结合域(RBD)；
c)包括表达盒的rdAd载体，所述表达盒包括编码序列，所述编码序列编码SARS-CoV-2以外的感染性病原体的至少一种外源性抗原；
d)a)和b)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
e)b)和c)的所述载体的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
e)a)、b)和c)任一者的所述载体的任一者的组合，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
g)b)的两种不同类型的rdAd载体的组合，其中每种类型的rdAd载体包括表达盒，所述表达盒编码不同于由所述组合中的其它类型的rdAd载体所编码的抗原的至少一种SARS-CoV-2抗原，其中所述rdAd载体一起或单独地施用；
所述免疫原性组合物配置成在哺乳动物受试者中诱导针对SARS-CoV-2的中和抗体和/或细胞免疫应答，所述免疫原性组合物施用至所述哺乳动物受试者；
所述用途特征在于制备用于治疗或预防SARS-CoV-2的药物。
63.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括复制缺陷腺病毒(rdAd)载体，所述rdAd载体包括编码SEQ ID NO:446或变体的核酸序列，所述变体包含与SEQ ID NO:446至少90％或至少95％的同一性。
64.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO:15。
65.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO:13。
66.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码以下项的一者或多者：SEQ ID NO:412-417、SEQ ID NO:438-445、SEQ ID NO:475-476和SEQ ID NO:460。
67.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码包括SEQ ID NO:3的一个或多个点突变的序列。
68.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码包括一个或多个突变的序列，所述一个或多个突变处于位置333-388、390-395、397-399、401-411、413-415、417-419、424、426-435、437、439-442、444-446、449、450、452、453、455-463、465、467-473、475-479、481-486、490、491、493-495、499-510或513-526，其中氨基酸编号对应于SEQ IDNO:411。
69.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码包括一个或多个突变的序列，所述一个或多个突变处于氨基酸位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504和/或505，其中氨基酸的编号对应于SEQ ID NO:411。
70.根据权利要求68所述的免疫原性组合物，其中所述一个或多个突变选自以下项：氨基酸417(K)被N取代的、氨基酸446(G)被V、S或A取代、氨基酸449(Y)被N取代、氨基酸453(Y)被F取代、氨基酸455(L)被F取代、氨基酸456(F)被L取代、氨基酸473(Y)被V取代、氨基酸475(A)被V取代、氨基酸476(G)被S或A取代、氨基酸477(S)被N、R、T、G、A或I取代、氨基酸484(E)被Q、K、D、A或R取代、氨基酸486(F)被L或S取代、氨基酸453(Y)被F取代、氨基酸493(Q)被L或R取代、氨基酸495(Y)被N或F取代、氨基酸500(T)被I取代、氨基酸501(N)被Y、T或S取代、氨基酸502(G)被R、D或C取代、氨基酸503(V)被L、I或F取代，或氨基酸505(Y)被H、E、W或C取代，其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:411。
71.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码包括一个或多个突变的序列，所述一个或多个突变选自K417T、K417N、E484K、L452R和/或N501Y，其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:411。
72.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码以下项的一者或多者：SEQ ID NO:412-417。
73.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述核酸序列编码以下项的一者或多者：SEQ ID NO:438-443或460。
74.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中编码SEQ ID NO:446的所述核酸序列还包括由核酸序列所编码的前导序列，编码前导序列的所述核酸序列编码选自SEQ ID NO:418至437的序列。
75.根据权利要求63至74中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述编码序列对于哺乳动物受试者进行密码子优化。
76.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为牛腺病毒、犬腺病毒、非人灵长类腺病毒、鸡腺病毒、猪或猪型腺病毒，或人腺病毒。
77.根据权利要求76所述的免疫原性组合物，其中所述非人灵长类腺病毒为黑猩猩或大猩猩腺病毒。
78.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述复制缺陷腺病毒载体为人腺病毒。
79.根据权利要求78所述的免疫原性组合物，其中所述人腺病毒为Ad5或Ad26。
80.一种药物制剂，所述药物制剂包括有效量的根据权利要求63所述的免疫原性组合物，所述组合物包括至少一种药学上可接受稀释剂或载体，任选地其中所述稀释剂为磷酸盐缓冲盐水。
81.根据权利要求80所述的药物制剂，所述药物制剂被配置用于非侵入性或鼻内施用，任选地其中所述药学上可接受载体为喷雾或气溶胶形式。
82.一种用于诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求63所述的免疫原性组合物施用至人类。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述有效量为至少108个病毒颗粒(vp)，至少109个病毒颗粒(vp)，或至少1010个病毒颗粒(vp)。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述免疫原性组合物鼻内地施用。
85.根据权利要求82所述的方法，其中在施用至人受试者之后，针对SARS-CoV-2的所述免疫应答持续至少6个月、至少9个月或至少12个月。
86.根据权利要求82所述的方法，其中针对SARS-CoV-2的所述免疫应答包括在施用所述免疫原性组合物之后所诱导的针对SARS-CoV-2的粘膜IgA和/或T细胞应答。
87.根据权利要求82所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了轻度或中度COVID-19相关疾病的发病率。
88.根据权利要求82所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了重度COVID-19相关疾病的发病率。
89.根据权利要求82所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了COVID-19相关疾病的严重度。
90.根据权利要求82所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了SARS-CoV-2感染的发病率。
91.根据权利要求82所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了无症状COVID-19的发病率。
92.根据权利要求82所述的方法，其中在施用至所述人受试者之后，所述有效量的所述免疫原性组合物减小了SARS-CoV-2的传播。
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