KR20140122258A - Rsv 감염의 예방 및 치료를 위한 혼합 항원 및 dna 백신 - Google Patents

Rsv 감염의 예방 및 치료를 위한 혼합 항원 및 dna 백신 Download PDF

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Abstract

본 개시는 RSV 항원 및 상기 RSV 항원을 인코딩하는 DNA를 함유하는 혼합 백신을 사용한 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염 증상들의 치료 및 예방에 관한 것이다.

Description

RSV 감염의 예방 및 치료를 위한 혼합 항원 및 DNA 백신{COMBINED ANTIGEN AND DNA VACCINE FOR PREVENTING AND TREATING RSV INFECTION}
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그 전문이 본원에 참조로 도입된다. 2012. 8. 2. 에 작성된 상기 ASCII 사본은 "030276-9016_SequenceListing_ST25.txt"로 명명되며 116,697바이트 크기이다.
발명 분야
본 발명은 RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 DNA를 함유하는 백신을 이용한 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염의 치료 및 예방에 관한 것이다.
인간 RSV는 폐렴바이러스 속, 파라믹소바이러스 과에 속하며, 어린이 및 노년층에서 하기도 감염들의 주요 원인이지만 3세 미만의 유아들에서 가장 일반적으로 나타난다. 보수적 추정치들에서는 오늘날 USA의 노년층에서 년간 약 330만 건들의 호흡기 질환을 제시한다. 인플루엔자 A 질환과 마찬가지로, RSV 유행병들은 겨울마다 발생하며, RSV의 재감염은 매우 일반적이어서 일생 동안 되풀이된다. RSV에 대한 백신 개발은 매우 중요하지만, 연관된 백신 유도 질환 (VID)으로 인해 RSV에 대해 이용 가능한 안전하고 효과적인 백신이 없다. VID는 RSV 항원들로부터의 증강된 염증성 CD4+ T 세포 반응성으로 인해 피험체들에서 강력한 병리학적 염증 반응에 의해 야기된다.
더 안전하고 효과적인 RSV 백신은 무해해야 하고, 바이러스에 대해 올바른 면역 반응들을 유도해야 한다. 그러나 1960년대에 개발된 최초의 후보 백신인 포르말린 비활성화 RSV (FI-RSV) 백신은 감염에 대한 백신으로 작용하기보다 바이러스에 대해 자연적 후속 노출 후 중증 질환을 유도하였다. 이는 80%의 백신접종 유아들의 입원과 2명의 사망들을 야기했다. 이들 어린이들로부터의 말초 혈액 림프구들은 시험 미감염 또는 RSV 감염 대조군들에 비해 T 림프구 고-반응들을 나타내었다.
FI-RSV 면역화된 후 생 RSV로 시험 감염된 동물 모델들에서 VID의 유사 발병이 드러났다. 마우스들에서 VID의 증강된 조직병리학적 변화들은 RSV 시험 감염 전 CD4+ T 세포들 또는 IL-4의 결핍에 의해 무효화될 수 있어서, FI-RSV-유도된 병리학적 변화들이 상기 동물 모델에서 T 세포에 의해 매개되었음을 또한 제시한다.
RSV의 F 및 G 단백질들은 중요한 중화 및 주요 보호 항원들로 작용하지만, VID를 또한 야기한다. 특히, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) G 당 단백질 (G)로 면역화된 마우스들은 RSV 시험 감염 후 VID를 나타내며 무정형 폐 호산구증을 경험하는 것으로 나타났다. CD4+ T 세포들의 결핍은 중증도가 덜한 질환을 일으켜서, G 항원 내의 서열들이 T 세포 반응들을 과다 자극하는 에피토프들을 함유할 수 있음을 제시한다.
RSV 시험 감염 시 VID가 일어나는 경우 RSV 백신이 필요하지만, 폐의 병리학적 손상으로 또한 이어지는 VID와 같은 과다반응성 반응들을 회피하는 RSV 백신은 제조되지 않았다. RSV 감염에 대한 이상적인 백신은 2가지 요건들에 부합해야 한다: 1) RSV 특이적인 중화 항체들을 유도하고; 2) VID를 일으키는 과도한 T 세포 반응들을 자극하지 않는다. DNA 백신, 아데노바이러스 벡터, Th1형 보강제 및 경구 전달의 이용과 같은 여러 접근들이 평가되었으나, 여태까지 어느 것도 성공적이지 못했다. 따라서, RSV 감염에 대해 중화 항체를 유도하지만 염증성 CD4+ T 세포들을 억제할 백신을 개발하는 것이 당분야에서 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염에 대한 백신에 관한 것으로, 여기서 상기 백신은 iTreg 세포들 (CD4+, CD25-, FoxP3+, IL-10+)을 자극한다. 백신의 RSV 항원성 펩티드는 F 당 단백질, G 당 단백질, 서열 목록 번호 4 (최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열), 서열 목록 번호 25 (최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열) 이들의 기능성 단편들일 수 있다. 상기 백신은 5:1 내지 1:5; 및 1:1 내지 2:1의 질량비의 핵산 및 항원성 펩티드를 가질 수 있다. 본 발명의 백신은 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 RNA, DNA 또는 cDNA일 수 있다. 상기 핵산은 F 당 단백질, G 당 단백질, 서열 목록 번호 4 (최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열), 서열 목록 번호 25 (최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열) 이들의 기능성 단편들로 구성된 군으로부터 선택되는 RSV 항원성 펩티드를 인코딩한다. 상기 DNA는 원형 플라스미드의 선형 발현 카세트로 존재할 수 있다. 상기 플라스미드는 pVAX, pcDNA3.0, 및 proVAX로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 플라스미드는 CMV, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오나인 프로모터, 쥣과 유선 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 및 폴리헤드린 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 전술된 바와 같은 백신 및 백신 투여 장치를 포함하는 백신접종 키트에 관한 것일 수 있다. 상기 키트의 백신 투여 장치는 백신 총, 또는 전기천공 장치일 수 있다. 상기 키트는 최소 침습 전기천공 장치를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 전술된 백신을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것일 수 있다. 상기 방법은 호흡기 세포융합 바이러스 시험 감염 후 기도 고반응성 (AHR)으로부터 피험체를 추가로 보호할 수 있다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 피험체에게 백신을 투여하는 것을 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 중화 항체를 유도하고 염증성 T 세포들을 억제하는 방법에 관한 것이며, 여기서 iTreg 세포들이 유도되고 자가반응성 CD4+ 및 CD8+ T 세포들이 억제된다. 상기 백신은, 예를 들어 최소 침습 전기천공 장치를 이용하여 전기천공에 의해 투여될 수 있고, 여기서 천기천공 경로는 피내 및 근육내로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 피험체에게 전술된 바와 같이 백신을 투여하는 것을 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)에 대해 면역화된 피험체에서 백신 유도 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이며, 여기서 피험체는 자연적 RSV에 감염되기 전에 포르말린 비활성화 RSV (FI-RSV) 또는 RSV 항원으로 면역화되었다. 상기 백신은, 예를 들어 최소 침습 전기천공 장치를 이용하여 전기천공에 의해 투여될 수 있고, 여기서 천기천공 경로는 피내 또는 근육내일 수 있다.
도 1은 NIH/3T3 세포들에서 플라스미드들 proVAX/G의 진핵생물 발현을 나타낸다. proVAX/G로 형질감염 48 시간 후 전체 RNA를 NIH/3T3 세포들에서 추출하였다. RT-PCR을 위해 이용한 주형들은 다음과 같았다: 레인 1, RTs로 형질감염된 NIH/3T3 세포들로부터의 cDNA; 레인 2, proVAX 벡터 대조군으로 형질감염된 세포들; 레인 3, 음성 대조군으로서 형질감염되지 않은 NIH/3T3 세포들로부터의 RNA.
도들 2a-2b는 대장균 BL21(DE3)에서 재조합 단백질 발현의 SDS-PAGE 쿠마시 블루 염색들을 나타낸다. 도들 2a-2b는 레인 M에 단백질 분자량 마커들; 레인 1, 유도되지 않은 대장균 BL21(DE3); 레인 2, 0.5 mM IPTG로 유도된 대장균 BL21(DE3); 레인 3, 유도되지 않은 대장균 BL21(DE3) pET28a(+); 레인 4, 0.5 mM IPTG로 유도된 대장균 BL21(DE3) pET28a, 레인 5, 유도되지 않은 대장균 BL21(DE3) pET28a(+)/G; 레인들 6&10, 0.5 mM IPTG로 유도된 대장균 BL21(DE3) pET28a(+)/G; 레인 7, 정제된 폴리히스티딘-태그화 재조합 단백질; 레인 8, 0.5 mM IPTG 유도와 함께 pET28a(+)/G로 형질변환된 대장균 BL21(DE3) 용해액의 상청액들; 및 레인 9, 0.5 mM IPTG 유도와 함께 pET28a(+)/G로 형질변환된 대장균 BL21(DE3) 용해액의 침강물을 나타낸다.
도 3은 폴리히스티딘-태그화 재조합 G 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 대장균 BL21(DE3) 용해액들은 LB 배지 중에 성장시킨 세포들로부터 수득하였고 0.5 mM IPTG로 유도하였다. 단백질 표본들을 12% SDS-PAGE 상에서 분리하고 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 염소 항-RSV 항체들과 반응시키고 콘쥬게이트된 이차 항-염소 항체들과 반응시켜 가시화하였다. 레인 1, 0.5mM IPTG 유도와 함께 pET28a(+)/G로 형질변환된 대장균 BL21(DE3) 용해액의 상청액들; 레인 2, pET28a(+)/G로 형질변환된 대장균 BL21(DE3) 용해액의 불용성 분획; 레인 3, 니켈 컬럼으로 정제된 재조합 RSV G 단백질.
도들 4a-4b는 체액성 반응의 분석을 나타낸다. 혈청 표본들을 최종 면역화 후 7일째에 Balb/c 마우스들에서 수집하였다. RSV G 특이적 항체 (도 4a) 및 RSV F 특이적 항체 (도 4b)를 UV-비활성화 RSV를 이용하여 ELISA로 결정하였다. 결과들을 3회씩 3개 군들의 데이터 평균으로 나타내고, 오차 막대들은 표준 편차를 나타낸다. 나타낸 데이터는 3회 실험들 중 하나를 요약하며, 모두 유사한 결과들을 나타내었다. 하나의 별표는 p < 0.05를 나타내고, 두 개의 별표는 p < 0.01을 나타낸다.
도 5는 T 세포 반응의 손상이 DNA 및 단백질 백신들의 공동 면역화로 유도됨을 나타낸다. T 세포들은 PSB 또는 proVAX/G 또는 His-G로 면역화되거나 proVAX + His-G (항원-매치되지 않음) 또는 proVAX/G + OVA (항원-매치되지 않음)로 공동 면역화되거나 또는 proVAX/G + His-G (항원-매치됨)로 공동 면역화된 마우스들로부터 단리되었다. 상기 T 세포들을 시험관 내에서 특이적 항원으로 UV-조사 RSV 항원 (좌측 세 번째 데이터열), 비특이적 항원으로 BSA (좌측 두 번째 데이터열), 또는 양성 대조군 자극제로서 PMA + Ion(좌측 첫 번째 데이터열)을 이용하여 재자극하였다. T 세포 증식을 실시예 1에 기재된 바와 같이 결정하였다. 3개의 독립적 실험들로부터의 대표적인 데이터를 나타낸다. 하나의 별표는 P < 0.05를 나타내고, 두 개의 별표는 p < 0.001을 나타낸다.
도들 6a-6b는 면역화된 마우스들의 폐 RSV 역가들을 나타낸다.
도들. 7a-7d는 전체 세포들에 대비하여 RSV 시험 감염 후 존재하는 호산구들, 림프구들 및 단핵구들의 양을 나타낸다. 마우스들에 최종 면역화 후 14일째에 106 TCID50 생 RSV를 비강내 시험 감염하였다. 마우스들을 RSV 시험 감염 후 5일째에 희생시키고 BALs을 분석하였다. 전체 호산구들 (도 7a), 단핵구들 (도 7b), 림프구들 (도 7c) 및 전체 세포들 (도 7d)의 평균 ± SEM을 나타낸다 (군 당 n= 6). 하나의 별표는 PBS 군들 대비 p < 0.05를 나타낸다.
도들 8a-8d는 전체 세포들에 대비하여 RSV 시험 감염 후 존재하는 호산구들, 림프구들 및 단핵구들의 양을 나타낸다. 마우스들에 최종 면역화 후 14일째에 106 TCID50 생 RSV를 비강내 시험 감염하였다. 마우스들을 RSV 시험 감염 후 5일째에 희생시키고 BALs을 분석하였다. 전체 호산구들 (도 8a), 단핵구들 (도 8b), 림프구들 (도 8c) 및 전체 세포들 (도 8d)의 평균 ± SEM을 나타낸다 (군 당 n= 6). 하나의 별표는 PBS 군들 대비 p < 0.05를 나타낸다.
도들 9a-9d는 아세틸콜린 클로라이드의 경정맥내 투여에 반응한 전신 맥파계를 나타낸다. RSV 시험 감염 후 5일째에 다양한 용량들 (x-축)에서 아세틸콜린 클로라이드의 경정맥내 투여에 반응하여 전신 맥파계에 의해 기도 폐색을 측정하고, y-축에 동적 저항 (Rrs) (도들 9a 및 9c) 및 동적 순응도 (Cldyn) (도들 9b 및 9d)로 표시하였다. 시험 미감염 마우스들에는 전-치료 및 시험 감염을 하지 않았다. 하나의 별표는 다른 군들 대비 p < 0.05를 나타낸다.
도들 10a-10h는 헤마톡실린 및 에오신 염색 후 폐 조직들의 조직 검사를 나타낸다. RSV 시험 감염 후 5일째에 마우스들을 안락사시키고 폐 조직들을 제거하여 포르말린 중에 고정하였다. 파라핀 임베딩된 조직의 박편들을 절단하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 대표적 절편 (군 당 6마리 중)을 시험 미감염 마우스들 (도 10a), PBS 마우스들 (도 10b), FI-RSV 마우스들 (도 10c), proVAX/G 마우스들 (도 10d), His-G 마우스들 (도 10e), proVA+His-G 마우스들 (도 10f), proVAX/G+OVA 마우스들 (도 10g) 및 proVAX/G+His-G 마우스들(도 10h)로부터의 조직들에 대해 각각의 배율 (확대 배율, 100X 또는 400X)로 나타낸다.
도들 11a-11h는 헤마톡실린 및 에오신 염색 후 폐 조직들의 조직 검사를 나타낸다. RSV 시험 감염 후 5일째에 마우스들을 안락사시키고 폐 조직들을 제거하여 포르말린 중에 고정하였다. 파라핀 임베딩된 조직의 박편들을 절단하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 대표적 절편 (군 당 6마리 중)을 시험 미감염 마우스들 (도 11a), PBS 마우스들 (도 11b), FI-RSV 마우스들 (도 11c), proVAX/G 마우스들 (도 11d), His-G 마우스들 (도 11e), proVA+His-G 마우스들 (도 11f), proVAX/G+OVA 마우스들 (도 11g) 및 proVAX/G+His-G 마우스들 (도 11h)로부터의 조직들에 대해 각각의 배율 (확대 배율, 100X 또는 400X)로 나타낸다.
도들 12a-12e는 헤마톡실린 및 에오신 염색 후 폐 조직들의 조직 검사를 나타낸다. RSV 시험 감염 후 5일째에 마우스들을 안락사시키고 폐 조직들을 제거하여 포르말린 중에 고정하였다. 파라핀 임베딩된 조직의 박편들을 절단하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 대표적 절편 (군 당 6마리 중)을 시험 미감염 마우스들 (도 12a), PBS 마우스들 (도 12b), FI-RSV 마우스들 (도 12c), proVAX/G 마우스들 (도 12d), His-G 마우스들 (도 12e), proVA+His-G 마우스들 (도 12f), proVAX/G+OVA 마우스들 (도 12g) 및 proVAX/G+His-G 마우스들(도 12h)로부터의 조직들에 대해 각각의 배율 (확대 배율, 100X 또는 400X)로 나타낸다.
도 13은 도 10에 기재된 폐 조직의 조직병리학적 스코어를 나타낸다. 조직병리학적 스코어들 (HPS)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 맹검 방식으로 병리학자가 헤마톡실린 및 에오신 염색 조직에서 평가하였다. 하나의 별표는 다른 군들 대비 p < 0.05를 나타낸다.
도들 14a-14b는 생 RSV로 시험 감염 후 면역화된 마우스들에서의 체중 감소를 나타낸다. RSV 시험 감염 후, 마우스들의 체중을 매일 측정하고, 체중들을 0일의 기준 체중에 대해 표준화하였다. 하나의 별표는 다른 군들 대비 p < 0.05를 나타낸다.
도들 15a-15d는 qPCR로 검사된 RSV 시험 감염 후 5일째 마우스들의 폐 조직들에서의 시토카인 생성을 나타낸다. IL-4 (도 15a), IL-5 (도 15b), IL-13 (도 15c) 및 IFN-γ (도 15d)의 농도들을 측정하였다. 하나의 별표는 p < 0.05를 나타내고, 두 개의 별표는 p < 0.01을 나타내고, 세 개의 별표는 p < 0.001을 나타낸다.
도들 16a-16n은 T 세포 표현형들의 형광-활성화 세포 정렬 (FACS) 분석을 나타낸다. 공동 면역화 유도 iTreg 세포들은 생체 내에서 항원-특이적 T 세포 억제를 매개하고 시험관 내에서 동종이계-혼합 림프구 반응을 저해할 수 있다. 림프구들을 최종 면역화 후 7일째에 마우스들에서 수득하고, 항-CD4-FITC 및 항-CD25-PE Cy5 mAb로 염색한 뒤 항-IL-10-PE 및 항-Foxp3-APC mAbs로 세포내 염색하였다. 도 16a는 SSC-H 대 FSC-H 그래프를 나타낸다. 도 16b는 CD4 대 CD25 그래프를 나타낸다. 도들 16C-16n은 IL-10 (x-축) 및 Foxp3 (y-축) 공동 발현을 나타낸다. CD4+CD25- (R1) (도들 16i-16n) 및 CD4+CD25+ (도들 16c-16h) (R2) T 세포들을 모두 IL-10 및 Foxp3의 공동 발현에 대해 관문화하였다. 세 실험들의 대표 결과들을 나타낸다. 백분율들은 이중 양성 세포들의 백분율을 나타낸다.
도들 17a-17b는 전체 비장세포들 중 CD4+CD25-Foxp3+IL-10+ (도 17b) 또는 CD4+CD25+Foxp3+IL-10+ (도 17a) T 세포들의 백분율 요약들을 나타낸다. 세 개의 별표는 다른 군들 대비 p < 0.001을 나타낸다.
도 18은 차용 전달된 CD4+CD25- 공여자 T 세포들에 의해 매개되는 억제를 나타낸다. 세포들의 CD4+CD25- 또는 CD4++CD25+ 서브세트들을 proVAX/G + His-G로 공동 면역화된 Balb/c 마우스들로부터 또는 시험 미감염 마우스들로부터 제조하고 시험 미감염 Balb/c 마우스들 내로 차용 전달하였다. 이어서 수신자 마우스들을 전달 후 24시간에 His-G로 면역화하고 면역화 후 7일째에 비장세포들을 단리하는 데 이용하였다. 수신자들의 비장세포들을 특이적 항원으로 UV-조사 RSV 항원을 이용하여 시험관 내에서 재자극하고, 증식 반응들을 MTT 방법으로 측정하였다.
도 19는 차용 전달된 CD4+CD25- 공여자 T 세포들에 의해 매개되는 억제를 나타낸다. 세포들의 CD4+CD25- 또는 CD4++CD25+ 서브세트들을 proVAX/G + His-G로 공동 면역화된 Balb/c 마우스들로부터 또는 시험 미감염 마우스들로부터 제조하고 시험 미감염 Balb/c 마우스들 내로 차용 전달하였다. 이어서 수신자 마우스들을 전달 후 24시간에 His-G로 면역화하고 면역화 후 7일째에 비장세포들을 단리하는 데 이용하였다. 수신자 동물들의 비장세포들을 (반응 세포들로서) MLR을 위해 시험미감염 C57BL/6 마우스들로부터의 미토마이신 C-처리 비장세포들과 (동종이계 자극 세포들로서) 혼합하였다. 하나의 별표는 p < 0.05를 나타내고, 두 개의 별표는 p < 0.01을 나타낸다.
도들 20a-20f는 공동 면역화된 마우스들로부터 CD4+CD25- iTreg 세포들의 차용 전달에 의한 폐 염증 반응의 완화를 나타낸다. CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포들을 최종 면역화 후 7일째에 proVAX/G + His-G (항원-매치됨) 또는 proVAX/G + OVA (항원-매치되지 않음)로 공동 면역화된 마우스들로부터 정제하고 이들을 His-G로 사전 면역화된 마우스들 내에 정맥내 차용 전달한 뒤 RSV 시험 감염하였다. RSV 시험 감염 후 5일째에 마우스들을 안락사시키고 폐 조직들을 제거하여 포르말린 중에 고정하였다. 파라핀 임베딩된 조직의 박편들을 절단하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 대표적 절편 (군 당 6마리 중)을 시험미감염 마우스들 (도 20a), His-G 마우스들 (도 20b), "proVAX/G+His-G 마우스들로부터의 CD4+CD25+" (도 20c), "proVAX/G+His-G 마우스들로부터의 CD4+CD25-" (도 20d), "proVAX/G+OVA 마우스들로부터의 CD4+CD25+" (도 20e), 및 "proVAX/G+OVA 마우스들로부터의 CD4+CD25-" (도 20f)로부터의 조직들에 대해 각각의 배율 (확대 배율, 100X 또는 400X)로 나타낸다.
도 21은 도 20에 기재된 폐 조직의 조직병리학적 스코어들을 나타낸다. 조직병리학적 스코어들 (HPS)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 맹검 방식으로 병리학자가 헤마톡실린 및 에오신 염색 조직에서 평가하였다. 하나의 별표는 p < 0.05를 나타낸다.
상세한 설명
본 발명은 이전의 RSV-항원 면역화로 인한 백신 유도 질환을 억제하면서 RSV 감염으로부터 피험체들의 치료 및 보호를 위한 백신들에 관한 것이다.
백신 유도 질환 (VID)은 자연적 RSV에 감염되기 전에 RSV 항원 (예컨대 F/G 단백질들)으로 면역화되는 경우 대량 림프구들 침윤들, 폐 호산구증 및 2형 시토카인 생성들을 포함하는 염증성 반응들을 악화시키는 시험미감염 개인들의 소인에 기인한다. 그러나, 항체들은 보호에서 중요한 역할을 한다. 중화 항체들의 수동 전달은 면역 결핍 개인들 또는 어린이들을 RSV 감염에 대해 보호할 수 있고, 마우스 모델에서는 항-RSV 중화 모노클로날 항체로의 치료가 RSV 복제를 현저히 감소시켰으며 질환 중증도의 염증성 및 임상적 마커들의 상당한 감소와 연관되었음을 나타내었다. 어린이들에서 수동 면역요법의 높은 비용들로 인해, RSV에 대해 고농도의 중화 항체들을 유도하기 위한 백신이 큰 관심을 받고 있다.
본 발명의 백신은 RSV 감염에 대해 보호하고 RSV 유도 폐 염증성 장애들을 또한 완화하기 위해 RSV 단백질 인코딩 핵산 및 그 인지체-재조합 RSV 단백질을 포함한다. 백신은 포르물린 비활성화-RSV (FI-RSV) 감염만큼 많이 RSV 감염에 대해 중화 항체를 유도함으로써 폐들에서 바이러스 복제의 현저한 감소를 제공하지만, iTreg (CD4+, CD25-, FoxP3+, IL10+) 세포들의 유도에 의해 염증성 T 세포들을 억제하였다. 항원 특이적 iTreg 세포들이 DNA 및 단백질을 함께 이용한 공동 면역화에 의해 유도되었다. iTreg 자극 세포들은 고농도들의 IL-10을 생성하였으며, 이는 중화 항체 생성을 위한 B 세포들의 자극을 제시한다. 상기 전략은 고농도의 중화 항체뿐만 아니라 염증성 T 세포들을 억제하고 발병을 감소시키는 항원-특이적 iTreg 세포들을 유도한다. 따라서 상기 전략은 존재하는 경우 최소의 VID를 가지면서 RSV 감염에 대해 효과적으로 보호할 수 있다.
생체 내에서 iTreg을 유도하는 인지체 항원을 발현하는 핵산 및 단백질을 이용한 공동 면역화의 이용은 몇몇 장점들을 갖는다: 1) 이것이 발현하는 플라스미드와 함께 정의된 단백질 항원의 투여만을 필요로 하므로 비교적 용이하며; 2) 항원 특이적 방식으로 T 세포들을 억제하는 강력한 iTreg을 유도하고; 3) 또한 고농도의 항체들을 유도한다. 상기 접근은 개시된 바와 같이 중화 항체 및 iTreg 세포들 유도의 이중 기능들을 갖는 백신이 VID의 부작용 없이 효과적일 수 있을 것이므로, RSV 백신 개발에 대한 주요 장애를 극복할 수 있다.
1. 정의들
본원에서 사용되는 용어는 특정 구현예들을 설명하는 목적만을 위한 것이며, 제한하기 위한 것이 아니다. 명세서 및 첨부되는 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수 형태들 "a," "and" 및 "the"에는 문맥 상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 참조물들이 포함된다.
본원에서 수치 범위들의 언급에 있어서, 동일한 정확도 농도의 그 사이의 각 개재 숫자가 명시적으로 포함된다. 예를 들어, 6-9의 범위에서, 6 및 9에 부가하여 숫자들 7 및 8이 포함되며, 범위 6.0-7.0에서, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0이 명시적으로 포함된다.
본원에서 사용되는 "기도 고반응성 (AHR)"는 이들이 기도 제한을 유도할 수 있는 자극에 반응하여 너무 쉽게 및/또는 너무 많이 협착될 수 있도록 하는 기도들의 장애를 나타낸다. AHR은 기도들에서의 염증 및 기도 리모델링(예로, 콜라겐 침적에 의해)으로 야기되는 호흡계의 기능적 변경일 수 있다. 기도 제한은 비가역적이거나 가역적일 수 있는 기도들의 협착을 나타낸다. 기도 제한 또는 기도 고반응성은 기도들 내 그리고 주위에서의 콜라겐 침적, 기관지 경련, 기도 평활근 비대, 기도 평활근 수축, 점액 분비, 세포성 침적들, 상피 파괴, 상피 투과성 변경, 평활근 기능 또는 감수성 변경들, 폐 실질의 장애들 및 침윤성 질환들에 의해 야기될 수 있다. 이러한 여러 원인 인자들이 염증과 연관될 수 있다.
본원에서 사용되는 "공통" 또는 "공통 서열" 또는 "최적화 서열"은 특정 항원의 여러 서브타입들의 정렬 분석에 기반하여 구축된 합성 핵산 서열, 또는 대응하는 폴리펩티드 서열을 의미할 수 있다. 상기 서열은 특정 항원의 여러 서브타입들 또는 혈청형들에 대해 광범위한 면역성을 유도하는 데 이용될 수 있다. 합성 항원들, 예컨대 융합 단백질들이 공통 서열들(또는 공통 항원들)에 대해 조작될 수 있다.
핵산 서열들에 대해 본원에서 사용되는 "단편" 또는 "기능성 단편"은 전장 야생형 RSV 항원과 교차 반응하여 포유류에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 이들의 일부를 의미한다. 상기 단편들은 본원에 나타낸 단백질 단편들을 인코딩하는 적어도 하나의 다양한 뉴클레오티드 서열들로부터 선택된 DNA 단편들일 수 있다. 상기 단편은 RSV 항원의 일부를 인코딩하는 핵산 서열일 수 있고, 여기서 상기 일부는 전장 야생형 RSV 항원과 교차 반응하여 포유류에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 에피토프들을 인코딩한다.
폴리펩티드 서열들에 대해 본원에서 사용되는 "단편" 또는 "기능성 단편"은 전장 야생형 RSV 항원과 교차 반응하여 포유류에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 공통 단백질들의 단편들은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 공통 단백질을 포함할 수 있다. 단편은 G 당 단백질 또는 F 당 단백질과 같은 특정 RSV 단백질의 전장 폴리펩티드 항원의 일부인 펩티드 서열일 수 있고, 전장 야생형 RSV 폴리펩티드 항원 서열과 교차 반응하여 포유류에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 에피토프들을 인코딩한다. RSV 단백질의 단편들은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 전장 RSV 단백질을 포함할 수 있고, 면역 반응을 일으킬 수 있다.
본원에서 사용되는 "nTreg 세포들"은 그 주요 기전이 관습적 CD4 및 CD8 T 세포들의 증식 반응들을 저해하는 말초 내성이며 자가면역 및 알러지성 질환들을 억제할 수 있는 T 세포들(CD4+, CD25+, Foxp3+)이다. 전사 인자 Foxp3은 nTreg 세포들의 면역 억제 활성을 위해 필요하고 충분하다. nTreg 세포들은 항원성 시험 감염 또는 항상성 증식에 반응하여 생체 내에서 쉽게 증식하고, 통상적인 CD4 T 세포들에 비해 더 높은 속도의 항상성 분열을 나타낸다. nTreg 세포들은 자가 항원들에 대해 고친화도 T 세포 수용체들을 가져서 이들 세포들이 자가 항원들에 의해 효율적으로 활성화되어 자가반응성 T 세포들을 억제할 수 있도록 한다.
본원에서 사용되는 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 아미노산들의 연결된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성 또는 천연 및 합성의 개질 또는 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 예방, 억제, 진압 또는 완전 제거를 통한 질환으로부터 동물의 보호를 의미할 수 있다. 질환의 예방에는 질환의 개시 전 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것이 관여된다. 질환의 억제에는 질환의 유도 후 그러나 그 임상적 출현 전 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것이 관여된다. 질환의 진압에는 질환의 임상적 출현 후 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것이 관여된다.
본원에서 사용되는 "피험체"는 RSV 백신으로 면역화되는 것을 원하거나 이를 필요로 하는 포유류를 의미할 수 있다. 이는 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스 또는 래트일 수 있다.
본원에서 사용되는 "초항원"은 폴리클로날 T 세포 활성화 및 대량 시토카인 방출을 일으키는 T 세포들의 비특이적 활성화를 유도하는 항원들 군을 의미할 수 있다. 신체 T 세포들의 0.001-0.0001%가 활성화되는 일반 항원 유도 T-세포 반응에 비해, 초항원들은 신체 T 세포들의 20%까지를 활성화할 수 있다. 다수의 활성화된 T-세포들은 초항원 상의 임의의 특정 에피토프에 특이적이지 않은 대량 면역 반응을 일으켜서 적응 면역계의 기본적 강도들 중 하나, 즉 고특이성으로 항원들을 표적화하는 그 능력을 손상시킨다. 보다 중요하게, 다수의 활성화된 T-세포들은 다량의 시토카인들을 분비하며, 이들 중 가장 중요한 것이 인터페론 감마 (IFN-γ)이다. 이처럼 과량의 IFN-γ는 다시 대식구들을 활성화한다. 활성화된 대식구들은 다시 친염증성 시토카인들, 예컨대 IL-1, IL-6 및 TNF-α를 과생성한다. TNF-α는 신체의 염증 반응의 일부로서 특히 중요하다. 정상적인 상황들에서 이것은 저농도들로 국소 방출되고 면역계가 병원체들을 물리치는 것을 돕는다. 그러나 이것이 혈중 고농도들로 전신 방출되는 경우 (초항원 결합으로 야기되는 대량 T 세포 활성화로 인해), 이것은 중증의 생명을 위협하는 증상들, 예를 들어 쇼크 및 다기관 부전을 일으킬 수 있다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 동일한"은 첫 번째 및 두 번째 아미노산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 아미노산들 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%임을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 "변이체"는 아미노산들의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. "생물학적 활성"의 대표적 예들에는 특이적 항체에 의해 결합되거나 면역 반응을 촉진하는 능력이 포함된다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조되는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성들 (예로 친수성, 하전된 영역들의 정도 및 분포)을 갖는 상이한 아미노산을 이용한 아미노산의 대체는 당분야에서 전형적으로 사소한 변화가 관여되는 것으로 인식된다. 이들 사소한 변화들은 당분야에서 이해되는 바와 같이, 아미노산들의 수치요법 지수(hydropathic index)를 고려함으로써, 일부 확인될 수 있다 (Kyte 등, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)). 상기 아미노산의 수치요법 지수는 그의 소수성 및 전하의 고려에 기초한다. 유사한 수치요법 지수들의 아미노산들이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유한다는 것이 당분야에 공지되어 있다. 하나의 측면에서, ±2의 수치요법 지수들을 갖는 아미노산들이 치환된다. 아미노산들의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질들을 생성할 치환들을 밝히는 데 사용될 수 있다. 펩티드의 맥락에서 아미노산들의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 잘 연관되는 것으로 보고된 유용한 척도인 펩티드의 최대 국소 평균 친수성 계산을 허용한다. 유사한 친수성 값들을 갖는 아미노산들의 치환은 당분야에서 이해되는 바와 같이 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩티드들을 생성할 수 있다. 치환들은 서로 ±2 내의 친수성 값들을 갖는 아미노산들로 수행될 수 있다. 아미노산들의 소수성 지수 및 친수성 값은 모두 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 상기 관찰과 일치하게도, 생물학적 기능과 양립 가능한 아미노산 치환들은 아미노산들의 상대적 유사성, 및 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 밝혀진 바와 같이, 상기 아미노산들의 측쇄들에 좌우되는 것으로 이해된다.
2. 백신
본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 항원 및 동일한 RSV 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 후술되는 바와 같이 바이러스 RSV 항원 및 상기 RSV 항원을 인코딩하는 핵산을 모두 이를 필요로 하는 피험체에게 공동 면역화하는 작용을 한다. 상기 백신은 후속 RSV 시험 감염에 대한 항원 특이적 면역 반응을 이를 필요로 하는 피험체에게 제공한다. 항원 특이적 면역 반응은 포르물린 비활성화 RSV (FI-RSV) 백신에 의해 생성되는 농도들과 비견되는 고농도들의 중화 항체를 생성한다. 그러나 상기 백신은 iTreg 세포들 (CD4+, CD25-, FoxP3+, IL10+)이 유도되고 이것이 FI-RSV 백신들로 면역화된 피험체들에 비해 폐 장애의 상당한 감소를 일으킨다는 점에서 FI-RSV 기반 백신과 상이하다. iTreg 자극 세포들은 고농도들의 IL-10을 생성하였으며, 이는 중화 항체 생성을 위한 B 세포들의 자극을 제시한다. iTreg 자극은 RSV 감염에 대한 피험체의 재도입 시 백신 유도 질환의 특징인 전체적인 염증 및 폐들 내로의 T 세포들의 침윤을 더 적게 일으킨다. 상기 백신은 또한 RSV 시험 감염 후 기도 고반응성 (AHR) 또는 기도 폐색으로부터 피험체를 보호하여 환자에서 호흡기 세포융합 바이러스 감염을 예방 및 치료할 수 있다. 상기 백신은 또한 RSV 감염의 폐 조직병리를 완화할 수 있다. 상기 백신은 또한 체중 감소에 대한 저항을 포함하여 생 RSV 시험 감염 후 질환의 중증도를 추가로 감소시킬 수 있다.
FI-RSV는 Th2 (CD4+)형 반응의 활성화로 인해 VID를 유도하며, 이는 B-세포 활성화제 및 다른 관련 시토카인들, 예컨대 IL-3, IL-4, IL-5, CD40 리간드들, IL-10, IL-13 과립구-대식구 집락 자극 인자 (GM-CSF), 및 에오탁신의 방출을 일으킨다. RSV G 당 단백질 (G) 백신들은 Th1형 및 Th2형 반응이 모두 유도되므로 RSV 시험 감염 후 VID를 유도한다. Th1 방출 대식구 활성화 효과기 및 다른 관련 시토카인들, 예컨대 인터페론 감마 (IFN-γ), GM-CSF, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) IL-3, TNF-β 및 IL-2. 상기 백신은 항원 의존적 방식으로 Th1 및 Th2 반응들을 모두 억제하지만, Th2 헬퍼 세포들에 의해 생성되는 것과 유사한 중화 항체 역가들을 생성하여 RSV 감염 농도를 감소시키고 중화를 유도한다.
상기 백신은 백신접종으로부터 T 세포 (Th1, Th2, Th17) 반응들을 제거한다. 상기 백신 공동-면역화 활성은 iTreg (CD4+, CD25-, Foxp3+) 세포들을 유도한다. iTreg 세포들은 급성 감염에 대한 적응 및 선천 면역 반응들을 모두 조절하고 바이러스 제거 후 염증을 해결하는 역할을 한다. iTreg 자극 세포들은 고농도들의 IL-10을 생성할 수 있고, 이는 중화 항체 생성을 위해 B 세포들을 자극한다. 상기 백신은 nTreg 세포들을 유도하지 않는다. RSV 감염은 실제로 RSV 감염 피험체들에서 CD4+CD25+ nTregs의 결핍을 일으켜서 증가된 체중 손실, 선천 세포들의 기관지폐포 세척(BAL)액 및 폐로의 모집 및 증가된 농도들의 IFN-γ를 생산하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포들을 포함하는 증강된 질환 중증도를 유도한다.
백신으로의 공동-면역화는 피험체를 RSV 시험 감염으로부터 보호할 뿐만 아니라 VID를 야기하는 악화된 폐 염증을 억제하였다. RSV 감염의 예방 및 감소된 VID는 항원 특이적 방식으로 T 세포 회상 증식을 억제할 수 있는 iTreg 세포들 및 고농도들의 항원 특이적 중화 항체 모두의 유도에 기인할 수 있다. 이러한 공동-면역화는 항염증성 시토카인 IL-10의 농도를 상향 조절하면서 RSV-유도 염증성 시토카인들, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-13 및 IFN-γ를 하향 조절하였다.
상기 백신은 RSV 인코딩 핵산 대 RSV 항원을 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10의 질량비로 가질 수 있다. 상기 백신은 RSV 인코딩 핵산 대 RSV 항원을 10:1 내지 1:10, 9:1 내지 1:9, 8:1 내지 8:1, 7:1 내지 1:7, 6:1 내지 1:6, 5:1 내지 1:5, 4:1 내지 1:4, 3:1 내지 1:3, 또는 2:1 내지 1:2의 질량비 범위로 가질 수 있다.
a. 항원
상기 백신은 RSV 항원을 포함할 수 있다. 상기 RSV 항원은 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 상기 핵산은 RSV 항원 또는 이들의 단편을 인코딩하는 DNA, RNA 또는 cDNA일 수 있다. 상기 RSV 항원은 면역 반응을 유도하는 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 상기 항원은 면역계에 의한 항체 생성을 유발할 수 있다. 상기 핵산은 전장 RSV 항원의 단편인 RSV 항원을 인코딩할 수 있고, 면역 반응을 유발할 수 있는 RSV 항원 상에 존재하는 에피토프들을 갖는다. 상기 RSV 항원은 전장 RSV 항원의 단편일 수 있고, 면역 반응을 유발할 수 있는 RSV 항원 상에 존재하는 에피토프들을 갖는다. 이어서 면역 반응에 의해 생성되는 항체가 외인성이고 잠재적으로 해로운 침입자로 간주되는 항원을 사멸하거나 중화시킬 수 있다. RSV 항원은 주조직 적합 복합체 (MHC)에 의해 결합되어 T-세포 수용체에 제시될 수 있는 임의 분자 또는 분자 단편일 수 있다. RSV 항원은 적응 면역 반응을 유발할 수 있는 분자인 면역원일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 RSV 항원은 임의 아형, 예컨대 A 아형 또는 B 아형이나, 임의 균주의 천연 생성 또는 재조합 RSV, 바람직하게는 인간 RSV 균주들로부터 유도될 수 있다. RSV 균주들의 예들에는 비제한적으로 A 아형의 균주들, 예컨대 Long (ATCC® VR-26), A2 (ATCC® VR-1540), RSB1734, RSB5857, RSB6190, RSB6256, RSB642, 및 RSB6614, B 아형의 균주들, 예컨대 B1, 18537, 8/60, 및 9320, S2, RSS-2, RSP112/Sweden/02-03, RSP120/Sweden/02-03, RSP121/Sweden/02-03, RSP122/Sweden/02-03, RSP13/Sweden/02-03), RSP140/Sweden/02-03, RSP16/Sweden/02-03, RSP171/Sweden/02-03, RSP183/Sweden/02-03, RSP191/Sweden/02-03, RSP199/Sweden/02-03, RSP212/Sweden/02-03, RSP41/Sweden/02-03, RSP45/Sweden/02-03, RSP56/Sweden/02-03, RSP58/Sweden/02-03, RSP67/Sweden/02-03 및 RSP94/Sweden/02-03이 포함된다.
본 개시에서는 RSV F 항원을 인코딩하는 DNA 백신과 그 F 단백질을 함께 이용한 공동-면역화 또는 RSV G 항원을 인코딩하는 DNA 백신과 그 G 단백질을 함께 이용한 공동 면역화에 의해 수득되는 보호 유효성을 나타내며, 이는 FI-RSV로 수득되는 것과 비견되는 RSV 시험 감염에 대한 보호를 제공하였다. 다른 RSV 항원들이 유사한 유효성을 가질 수 있다. 상기 보호는 FI-RSV와 유사한 고농도들의 중화 항체 유도에 기인할 수 있지만, 상기 공동-면역화 보호는 iTreg의 유도에 연관되며, 폐들 내로의 T 세포들의 침윤과 염증을 더 적게 일으킨다, 즉 폐 장애를 상당히 감소시킨다.
상기 백신에는 RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 DNA가 포함된다. 일부 구현예들에서, 상기 RSV 항원성 펩티드는 인간 RSV F 및 G 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에서는 또한 상기 항원을 인코딩하는 DNA가 제공된다. 상기 DNA에는 항원을 인코딩하는 인코딩 서열이 포함될 수 있다. 상기 DNA에는 또한 펩티드 결합에 의해 항원에 연결된 링커 또는 태그 서열들을 인코딩하는 추가 서열들이 포함될 수 있다.
(1) RSV F 및 G 항원들
상기 RSV 항원은 인간 RSV 융합 단백질 (또한 본원에서 "RSV F", "RSV F 단백질" 및 "F 단백질"로 나타냄), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 인간 RSV 융합 단백질은 RSV A 아형 및 B 아형 간에 보존된다. RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1 (서열 목록 번호 6)의 위치 5660-7384에 해당하는 서열 목록 번호 26의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV F 단백질 (유전자은행 AAX23994.1; 서열 목록 번호 1) 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV A2 균주의 RSV F 단백질 (유전자은행 AAB59858.1), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV F 단백질, 또는 이들의 단편 또는 변이체의 단량체, 이량체 또는 삼량체일 수 있다. RSV 항원은 최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV F의 아미노산 412-524 또는 이들의 최적화된 아미노산의 서열일 수 있다. RSV 항원은 RSV F의 아미노산 412-524, 또는 이들의 최적화된 아미노산의 서열, 예컨대 서열 목록 번호 25의 이량체의 융합 단백질일 수 있다. RSV 항원은 서열 목록 번호 23, 24 또는 26에 의해 인코딩되는 RSV F 단백질일 수 있다.
RSV F의 융합 후 형태는 면역화된 동물들에서 고역가의 중화 항체들을 생성하고, 동물들을 RSV 시험 감염으로부터 보호한다. 본 발명은 청구되는 백신들에서 상기 면역 반응을 이용한다. 본 발명에 따르면, 상기 RSV F 단백질은 융합-전 형태 또는 융합-후 형태일 수 있다.
RSV 항원은 인간 RSV 부착 당 단백질 (또한 본원에서 "RSV G", "RSV G 단백질" 및 "G 단백질"로 나타냄), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 인간 RSV G 단백질은 RSV A 아형 및 B 아형 간에 상이하다. 항원은 유전자은행 AY911262.1 (서열 목록 번호 6)의 위치 4687-5583에 해당하는 서열 목록 번호 19의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV G 단백질 (유전자은행 AAX23993; 서열 목록 번호 2), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 이다. RSV 항원은 하기로부터의 RSV G 단백질일 수 있다: RSV B 아형 단리체 H5601 (서열 목록 번호 46), RSV B 아형 단리체 H1068 (서열 목록 번호 48), RSV B 아형 단리체 H5598 (서열 목록 번호 50), RSV B 아형 단리체 H1123 (서열 목록 번호 52), 또는 이들의 단편 또는 변이체. RSV 항원은 최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 상기 항원은 RSV G 단백질의 아미노산 67-298 또는 이들의 최적화된 아미노산 서열, 예컨대 서열 목록 번호 4일 수 있다. RSV 항원은 서열 목록 번호들 3, 5, 19, 20, 21, 22, 45, 47, 49, 또는 51에 의해 인코딩되는 RSV G 단백질일 수 있다.
(2) 다른 RSV 항원들
RSV 항원은 인간 RSV 비구조 단백질 1 ("NS1 단백질"), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 상기 RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1 (서열 목록 번호 6)의 위치 99-518에 해당하는 서열 목록 번호 27의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV NS1 단백질 (유전자은행 AAX23987.1; 서열 목록 번호 28), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV 항원은 인간 RSV 비구조 단백질 2 ("NS2 단백질"), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 상기 RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1 (서열 목록 번호 6)의 위치 628-1002에 해당하는 서열 목록 번호 29의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV NS2 단백질 (유전자은행 AAX23988.1; 서열 목록 번호 30), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV 항원은 인간 RSV 뉴클레오캡시드 ("N") 단백질, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1(서열 목록 번호 6)의 위치 1140-2315에 해당하는 서열 목록 번호 31의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV N 단백질 (유전자은행 AAX23989.1; 서열 목록 번호 32), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV 항원은 인간 RSV 인 단백질 ("P") 단백질, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 상기 RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1(서열 목록 번호 6)의 위치 2346-3071에 해당하는 서열 목록 번호 33의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV P 단백질 (유전자은행 AAX23990.1; 서열 목록 번호 34), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV 항원은 인간 RSV 기질 단백질 ("M") 단백질, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1(서열 목록 번호 6)의 위치 3261-4031에 해당하는 서열 목록 번호 35의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV M 단백질 (유전자은행 AAX23991.1; 서열 목록 번호 36), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV 항원은 인간 RSV 소 소수성 ("SH") 단백질, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1(서열 목록 번호 6)의 위치 4302-4496에 해당하는 서열 목록 번호 37의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV SH 단백질 (유전자은행 AAX23992.1; 서열 목록 번호 38), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV 항원은 인간 RSV 기질 단백질 2-1 ("M2-1") 단백질, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1(서열 목록 번호 6)의 위치 7605-8189에 해당하는 서열 목록 번호 39의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV M2-1 단백질 (유전자은행 AAX23995.1; 서열 목록 번호 40), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV 항원은 인간 RSV 기질 단백질 2-2 ("M2-2") 단백질, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 상기 RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1(서열 목록 번호 6)의 위치 8158-8430에 해당하는 서열 목록 번호 41의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV M2-2 단백질 (유전자은행 AAX23997.1; 서열 목록 번호 42), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV 항원은 인간 RSV 폴리머라아제 L ("L") 단백질, 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 상기 RSV 항원은 유전자은행 AY911262.1(서열 목록 번호 6)의 위치 8497-14994에 해당하는 서열 목록 번호 43의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 RSV Long 균주의 RSV L 단백질 (유전자은행 AAX23996.1; 서열 목록 번호 44), 또는 이들의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV 항원은 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2-1, M2-2, 또는 L 단백질의 최적화된 아미노산 서열일 수 있다.
(3) RSV 항원들의 요약
RSV 항원은 인간 RSV 단백질 또는 재조합 항원, 예컨대 인간 RSV 게놈(서열 목록 번호 6)에 의해 인코딩되는 단백질들의 임의 하나일 수 있다. 항원은 서열 목록 번호들 1, 2, 4, 25, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 또는 52의 인간 RSV 또는 재조합 단백질 또는 이들의 공통, 이들의 단편 또는 이들의 변이체일 수 있다. RSV 항원은 서열 목록 번호 3, 5, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 또는 51에 의해 인코딩되는 인간 RSV 또는 재조합 단백질 또는 이들의 공통, 이들의 단편 또는 이들의 변이체일 수 있다.
서열 목록 번호들 1 및 26은 RSV Long 균주의 RSV F 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 2 및 19는 RSV Long 균주의 RSV G 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 3, 5, 20, 21, 및 22는 서열 목록 번호 4의 최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다. 서열 목록 번호 20은 서열 목록 번호 4의 아미노산 서열을 인코딩한다. 서열 목록 번호들 3 및 21은 서열 목록 번호 4의 아미노산 서열을 인코딩하는 원핵생물 (대장균) 코돈-최적화 서열들을 나타내며, 서열 목록 번호들 5 및 22는 서열 목록 번호 4의 아미노산 서열을 인코딩하는 진핵생물 (마우스) 코돈-최적화 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호 6은 RSV Long 균주의 인간 RSV 게놈의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 목록 번호들 23 및 24는 서열 목록 번호 25의 최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다. 서열 목록 번호 23은 서열 목록 번호 25의 아미노산 서열을 인코딩한다. 서열 목록 번호 24는 서열 목록 번호 25의 아미노산 서열을 인코딩하는 원핵생물 (대장균) 코돈-최적화 서열을 나타낸다.
서열 목록 번호들 27 및 28은 RSV Long 균주의 RSV NS1 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 29 및 30은 RSV Long 균주의 RSV NS2 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 31 및 32는 RSV Long 균주의 RSV N 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 33 및 34는 RSV Long 균주의 RSV P 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 35 및 36은 RSV Long 균주의 RSV M 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 37 및 38은 RSV Long 균주의 RSV SH 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 39 및 40은 RSV Long 균주의 RSV M2-1 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 41 및 42는 RSV Long 균주의 RSV M2-2 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 43 및 44는 RSV Long 균주의 RSV L 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 45 및 46은 RSV B 아형 단리체 H5601의 RSV G 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 47 및 48은 RSV B 아형 단리체 H1068의 RSV G 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 49 및 50은 RSV B 아형 단리체 H5598의 RSV G 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
서열 목록 번호들 51 및 52는 RSV B 아형 단리체 H1123의 RSV G 단백질에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다.
b. 벡터들
백신은 항원을 인코딩하는 RSV 핵산을 포함하며, 상기 핵산이 벡터에 배치될 수 있다. 따라서 상기 벡터에는 전술된 항원을 인코딩하는 핵산이 포함될 수 있다. 상기 벡터는 항원을 발현할 수 있다. 상기 벡터는 발현 구축물일 수 있고, 이는 일반적으로 플라스미드로서 특정 유전자를 표적 세포 내로 도입하는 데 사용된다. 일단 발현 벡터가 세포 내에 있으면, 단백질이 유전자에 의해 인코딩되어, 세포성-전사 및 번역 기전의 리보좀 복합체들에 의해 생성된다. 플라스미드는 종종 증강자 및 프로모터 영역들로 작용하는 조절 서열들을 함유하도록 조작되어 발현 벡터 상에 수반되는 유전자의 효율적 전사를 일으킨다. 본 발명의 벡터들은 다량의 안정적인 메신저 RNA를, 이에 따라 단백질들을 발현한다.
항원을 인코딩하는 DNA를 포함하는 특정 DNA 벡터는 RSV G 당 단백질(유전자은행: AY911262.1 (RSV 게놈; 서열 목록 번호 6의 위치 4687-5583에 해당하는 전장 뉴클레오티드 서열; 전장 뉴클레오티드 서열 (서열 목록 번호 19))의 67-298 아미노산에 대한 코딩 영역에 해당하는 proVAX/G (서열 목록 번호 22)이다. 항원을 인코딩하는 DNA를 포함하는 또 다른 특정 DNA 벡터는 RSV F 융합 단백질(유전자은행: AY911262.1 (RSV 게놈; 서열 목록 번호 6의 위치 5660-7384에 해당하는 전장 뉴클레오티드 서열; 전장 F 융합 단백질 뉴클레오티드 서열 (서열 목록 번호 26))의 412-524 아미노산의 코딩 영역의 이량체에 해당하는 proVAX/F (서열 목록 번호 23)이다. 코딩 영역은 코돈 최적화될 수 있다, 즉 멀리 연관된 개체인, 다른 개체에 비해 하나의 개체에서 보다 빈번하게 채용되는 코돈들뿐만 아니라 코작 서열들 및/또는 인트론들을 추가 또는 개질하고/하거나 바람직하지 못한 서열들, 예를 들어 잠재적인 전사 인자 결합 부위들을 제거하기 위한 개질들로 최적화될 수 있다.
벡터들은 발현 신호들, 예컨대 강한 프로모터, 강한 종결 코돈, 프로모터 및 클로닝된 유전자 간의 거리 조정, 및 전사 종결 서열 및 PTIS (이동 번역 개시 서열)의 삽입을 가질 수 있다.
(1) 발현 벡터들
벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 피험체 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 벡터는 종결 신호들에 작동 가능하게 연결될 수 있는 항원 인코딩 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 가질 수 있다. 벡터는 또한 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역을 위해 필요한 서열들을 함유할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 키메라성일 수 있다, 즉 적어도 하나의 그 성분들이 적어도 하나의 그 다른 성분들과 이종성일 수 있다. 발현 카세트에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극들에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도성 프로모터 또는 항상성 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 다세포 개체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다.
(2) 원형 또는 선형 벡터들
벡터는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질변환시키거나 염색체 외 존재할 수 있는 (예로, 복제 기원을 갖는 자가 복제 플라스미드) 원형 플라스미드일 수 있다.
벡터는 DNA를 발현할 수 있고 세포로 하여금 면역계에 의해 인식되는 항원에 대한 서열을 번역할 수 있도록 만드는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 proVAX, 또는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다. 또한, 전기천공을 통해 피험체에 효율적으로 전달되고 하나 이상의 원하는 항원들을 발현할 수 있는 선형 핵산 백신, 또는 선형 발현 카세트 ("LEC")가 본원에서 개시된다. LEC는 임의의 인산 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 하나 이상의 항원들을 인코딩할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 정지 코돈, 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 항원의 발현은 프로모터에 의해 조절될 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자들 및/또는 인산 골격을 함유할 수 없다. LEC는 원하는 항원 유전자 발현에 관련되지 않은 다른 핵산 서열들을 함유할 수 없다.
LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드에서 유래될 수 있다. 플라스미드는 항원을 발현할 수 있다. 플라스미드는 pNP (Puerto Rico/34) 또는 pM2 (New Caledonia/99)일 수 있다. 플라스미드는 DNA를 발현할 수 있고 세포로 하여금 면역계에서 인식되는 항원에 대한 서열을 번역할 수 있도록 하는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 proVAX, 또는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR는 각각 pNP (푸에르토 리코/34) 및 pM2 (뉴 칼레도니아/99)에서 유래될 수 있다. LEC는 항원과 5:1 내지 1:5, 또는 1:1 내지 2:1의 질량비로 조합될 수 있다.
(3) 프로모터, 인트론 , 정지 코돈 및 폴리아데닐화 신호
벡터는 프로모터를 가질 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 유도하고 단리된 핵산의 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 전술된 항원성 서열을 전사하는 DNA 의존적 RNA 폴리머라아제를 통한 전사에 필요한 시스-작용 서열 요소이다. 이종성 핵산의 발현을 지시하는 데 사용되는 프로모터의 선택은 구체적 용도에 달려있다. 프로모터는 그 천연 환경에서 전사 개시 부위로부터 존재하는 것과 같이 벡터에서 전사 개시로부터 대략 동일한 거리에 배치될 수 있다. 그러나 상기 거리의 변동은 프로모터 기능의 손실 없이 적용될 수 있다.
프로모터는 전사물의 효율적인 폴리아데닐화, 리보좀 결합 부위들, 및 번역 종결에 필요한 신호들 및 항원을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오나인 프로모터, 쥣과 유선 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵생물 세포들에서 발현에 효과적인 것으로 나타난 또 다른 프로모터일 수 있다.
벡터에는 기능성 스플라이스 공여체 및 수용체 부위들을 갖는 인트론 및 증강자가 포함될 수 있다. 벡터는 효율적인 종결을 제공하기 위해 구조 유전자 하류에 전사 종결 영역을 함유할 수 있다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득될 수 있고 또는 상이한 유전자들에서 수득될 수 있다.
c. 백신의 부형제들 및 다른 성분들
백신은 다른 성분들, 예컨대 전달감염 촉진제, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 보강제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 전달체들, 보강제들, 담체들 또는 희석제들과 같은 기능성 분자들일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 전달감염 촉진제일 수 있고, 여기에는 표면 활성제들, 예컨대 면역 자극 복합체들 (ISCOMS), 프로인트 불완전 보강제, LPS 유사체, 예컨대 모노포스포릴 지질 A, 뮤라밀 펩티드들, 퀴논 유사체들, 전달체들, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질들, 리포좀들, 칼슘 이온들, 바이러스 단백질들, 다중 음이온들, 다중 양이온들 또는 나노입자들, 또는 다른 공지된 전달감염 촉진제들이 포함될 수 있다.
전달감염 촉진제는 다중 음이온, 다중 양이온, 예컨대 폴리-L-글루타메이트 (LGS) 또는 지질일 수 있다. 전달감염 촉진제는 폴리-L-글루타메이트일 수 있다. 폴리-L-글루타메이트는 6 mg/ml 미만의 농도로 백신에 존재할 수 있다. 전달감염 촉진제에는 또한 유전적 구축물과 함께 투여될 수 있는 표면 활성제들, 예컨대 면역 자극 복합체들 (ISCOMS), 프로인트 불완전 보강제, LPS 유사체, 예컨대 모노포스포릴 지질 A, 뮤라밀 펩티드들, 퀴논 유사체들, 및 전달체들, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 그리고 히알루론산이 또한 포함될 수 있다. 일부 구현예들에서, DNA 플라스미드 백신들에는 또한 전달감염 촉진제, 예컨대 지질들, 리포좀들, 예컨대 레시틴 리포좀들 또는 당분야에 공지된 다른 리포좀들, 예컨대 DNA-리포좀 혼합물 (예를 들어 W09324640 참고), 칼슘 이온들, 바이러스성 단백질들, 다중 음이온들, 다중 양이온들 또는 나노입자들, 또는 다른 공지된 전달감염 촉진제들이 포함될 수 있다. 전달감염 촉진제는 다중 음이온, 다중 양이온, 예컨대 폴리-L-글루타메이트 (LGS) 또는 지질이다. 백신 중 전달감염제의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.
약학적으로 허용 가능한 부형제는 보강제일 수 있다. 보강제는 대안적인 플라스미드에서 발현되거나 백신에서 상기 플라스미드와 조합된 단백질들로 전달되는 다른 유전자들일 수 있다. 보강제는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: α-인터페론 (IFN-α), β- 인터페론 (IFN-β), γ- 인터페론, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포 유인 케모카인 (CTACK), 상피 흉선 발현 케모카인 (TECK), 점막 연관 상피 케모카인 (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86, 예컨대 신호 서열이 결실되고 선택적으로 IgE로부터의 신호 펩티드를 포함하는 IL-15. 보강제는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이들의 조합일 수 있다.
유용한 보강제들일 수 있는 다른 유전자들에는 하기를 인코딩하는 것들이 포함된다: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, 돌연변이체 형태들의 IL-18, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파아제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자들, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이들의 기능성 단편들.
백신은 1994. 4. 1.자로 출원된 미국 일련 번호 021,579에 기재된 바와 같은 유전적 백신 촉진제를 추가로 포함할 수 있고, 이 출원서는 참조함으로써 전문이 포함된다.
백신은 사용될 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사형 백신 약학 조성물은 멸균성, 무-발열원 및 무-입자인 것일 수 있다. 등장성 제형물 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제들에는 나트륨 클로라이드, 덱스트로오스, 만니톨, 소르비톨 및 락토오스가 포함될 수 있다. 백신은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액들은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 백신은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제들을 추가로 포함할 수 있다. LGS 또는 다중 양이온들 또는 다중 음이온들을 포함하는 안정화제들은 제형물이 연장된 시기들 동안 실온 또는 상온에서 안정하도록 할 수 있다.
3. 치료 또는 예방을 위한 백신접종 방법
본 발명은 또한 환자에서 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염의 예방 및 치료 방법들에 관한 것이다. 상기 방법에는, 본원에 기재된 바와 같이 RSV에 대한 백신이 필요한 피험체에게 투여하는 것이 포함된다. 백신에는 RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 핵산이 포함된다. 공동-면역화 백신은 비제한적으로 CD4+, CD25-, FoxP3+, IL-10+을 포함하는 iTreg 세포들을 자극할 수 있다.
공동-면역화는 대량의 림프구들 침윤들, 폐 호산구증 및 2형 시토카인 생성들을 포함하는 염증성 반응들의 악화에 대한 시험미감염 개인들의 소인으로 인해 이들이 자연적 RSV에 감염되기 전에 FI-RSV 또는 그 G 항원 또는 그 F 항원으로 면역화될 때 백신 유도 질환 (VID)을 치료 또는 완화하는데 사용될 수 있다. VID 완화는 바이러스 시험 감염 후 폐에서 감소된 조직형태 변화들 및 또는 림프구들 및 호산구들의 증식 및 침윤의 상당한 억제와의 연관에 의해 나타날 수 있다. 예를 들어, VID의 완화는 CD4+CD25-FoxP3+IL-10+ 표현형을 나타내는 G 항원 특이적 iTreg 세포들의 유도에 의해 야기될 수 있다. iTreg 자극 세포들은 고농도들의 IL-10을 생성할 수 있고, 이는 중화 항체 생성을 위해 B 세포들을 자극한다.
공동-면역화는 항-염증성 시토카인 Il-10 농도들의 상향 조절을 유도하면서 RSV-유도 염증성 시토카인들, 예컨대 IL-4, Il-5, IL-13 및 IFN- γ의 하향 조절을 유도할 수 있다.
백신 용량은 1 μg 내지 10 mg 활성 성분/체중 kg/시간일 수 있고, 20 μg 내지 10 mg 성분/체중 kg/시간일 수 있다. 백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일들마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 백신 용량들의 갯수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다.
a. 투여
백신은 약학 분야에서 숙련자들에게 널리 공지된 표준 기법들에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 조성물들은 특정 피험체의 연령, 성별, 체중 및 상태 그리고 투여 경로와 같은 요인들을 고려하여 의학 분야에서 숙련자들에게 널리 공지된 투여량들로 그리고 기법들에 의해 투여될 수 있다. 피험체는 포유류, 예컨대 인간, 말, 소, 돼지, 양, 고양이, 개, 래트, 또는 마우스일 수 있다.
백신은 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여에서, 백신들은 iTreg 반응들을 유도하기 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료적 적용들에서, 백신들은 치료 효과를 야기하기 충분한 양으로 이를 필요로 하는 피험체에 투여된다. 이를 달성하기 적절한 양이 "치료적 유효 용량"으로 정의된다. 상기 목적을 위해 효과적인 양들은 예로, 투여되는 백신 요법의 특정 조성, 투여 방식, 질환의 단계 및 중증도, 환자의 일반 건강 상태, 및 처방의의 판단에 좌우될 것이다.
백신은 [Donnelly 등 (Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)); Felgner 등 (미국 특허 번호 5,580,859, 1996. 12. 3. 허여); Felgner (미국 특허 번호 5,703,055, 1997. 12. 30. 허여); 및 Carson 등 (미국 특허 번호 5,679,647, 1997. 10. 21. 허여)]에 기재된 바와 같이 당분야에 널리 공지된 방법들에 의해 투여될 수 있고, 이들 모두의 내용들은 참조함으로써 이들의 전문이 본원에 포함된다. 백신의 DNA는, 예를 들어 백신 총을 이용하여 개인에게 투여될 수 있는 입자들 또는 비드들에 복합체화될 수 있다. 당분야 숙련자는 생리학적으로 허용 가능한 화합물을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체의 선택이, 예를 들어 발현 벡터의 투여 경로에 달려있다는 것을 알 것이다.
백신들은 다양한 경로들을 통해 투여될 수 있다. 전형적인 전달 경로들에는 비경구 투여, 예로 피내, 근육내 또는 피하 전달이 포함된다. 다른 경로들에는 경구 투여, 비강내, 및 질내 경로들이 포함된다. 특히 백신의 DNA에 있어서, 백신은 개인 조직들의 사이질 공간들로 전달될 수 있다 (Felgner 등, 미국 특허 번호들 5,580,859 및 5,703,055, 이들 모두의 내용들은 참조함으로써 이들의 전문이 본원에 포함됨). 백신은 또한 근육으로 투여될 수 있거나 피내 또는 피하 주사들 또는 경피, 예컨대 이온이동법을 통해 투여될 수 있다. 백신의 표피 투여도 채용될 수 있다. 표피 투여에는 자극제에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 표피 최외층의 기계적 또는 화학적 자극이 관여될 수 있다 (Carson 등, 미국 특허 번호 5,679,647, 그 내용들은 참조함으로써 그 전문이 본원에 포함됨).
백신은 또한 비강 통과들을 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 담체가 고체인 비강 투여에 적합한 제형물들에는, 예를 들어 코로 복용하는 방식으로, 즉 코에 가깝게 유지된 분말 용기로부터 비강 통과를 통한 신속 흡입에 의해 투여되는 약 10 내지 약 500 마이크론 범위의 입자 크기를 갖는 거친 분말이 포함될 수 있다. 제형물은 비강 스프레이, 비강 점적들이거나 분무기에 의한 에어로졸 투여에 의할 수 있다. 제형물에는 백신의 수성 또는 유성 용액들이 포함될 수 있다.
백신은 액체 제조물, 예컨대 현탁액, 시럽 또는 엘릭서일 수 있다. 백신은 또한 비경구, 피하, 피내, 근육내, 정맥내 투여(예로 주사형 투여)를 위한 제조물, 예컨대 멸균 현탁액 또는 에멀션일 수 있다.
백신은 리포좀들, 마이크로스피어들 또는 다른 중합체 매트릭스들 내로 도입될 수 있다 (Felgner 등, 미국 특허 번호 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993), 그 내용들은 참조함으로싸 이들의 전문이 본원에 포함됨). 리포좀들은 인지질들 또는 다른 지질들로 구성될 수 있고, 제조 및 투여가 상대적으로 간단한 무독성의, 생리학적으로 허용가능하고 대사 가능한 담체들일 수 있다.
백신은 전기천공을 통해, 예컨대 미국 특허 번호 7,664,545에 기재된 바와 같이 투여될 수 있으며, 그 내용들은 참조함으로써 본원에 포함된다. 전기천공은 미국 특허 번호들 6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359에 기재된 방법 및/또는 장치에 의할 수 있고, 그 내용들은 참조함으로써 이들의 전문이 본원에 포함된다. 전기천공은 최소 침습 장치를 통해 수행될 수 있다.
최소 침습 전기천공 장치 ("MID")는 신체 조직 내로 전술된 백신 및 연관된 유체의 주사를 위한 장치일 수 있다. 상기 장치는 중공 바늘, DNA 카세트 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있고, 여기서 상기 장치는 상기 신체 조직 내로 바늘의 삽입 동안 신체 조직 내로 DNA를 동시에 (예를 들어 자동으로) 주사하도록 사용되는 유체 전달 수단을 가동하도록 채택된다. 이는 바늘이 삽입된 동안 DNA 및 연관 유체를 주사하는 능력이 신체 조직을 통해 보다 균일한 유체 분포를 야기한다는 장점을 갖는다. 주사 동안 겪는 통증은 DNA가 더 넓은 면적에 걸쳐 주사되는 분포로 인해 감소될 수 있다.
ID는 바늘의 사용 없이 조직 내로 백신을 주사할 수 있다. MID는 백신이 조직 표면을 뚫고 하부 조직 및/또는 근육으로 들어가도록 하는 힘을 갖는 작은 스트림 또는 제트로서 백신을 주사할 수 있다. 작은 스트림 또는 제트 뒤의 힘은 1초의 분획 내에 마이크로개구를 통한 압축 기체, 예컨대 이산화탄소의 팽창에 의해 제공될 수 있다. 최소 침습 전기천공 장치들 및 이들의 사용 방법들의 예들은 공개된 미국 특허 출원 번호 20080234655; 미국 특허 번호 6,520,950; 미국 특허 번호 7,171,264; 미국 특허 번호 6,208,893; 미국 특허 번호 6,009,347; 미국 특허 번호 6,120,493; 미국 특허 번호 7,245,963; 미국 특허 번호 7,328,064; 및 미국 특허 번호 6,763,264에 기재되며, 그 각각의 내용들은 참조함으로써 본원에 포함된다.
MID는 통증 없이 조직을 뚫는 고속 액체 제트를 생성하는 주입기를 포함할 수 있다. 이러한 무바늘 주입기들은 시판된다. 본원에서 이용될 수 있는 무바늘 주입기들의 예들에는 미국 특허 번호들 3,805,783; 4,447,223; 5,505,697; 및 4,342,310에 기재된 것들이 포함되며, 그 각각의 내용들은 참조함으로써 본원에 포함된다.
치료될 조직 내로 무바늘 주입기를 이용해서, 보통 백신의 조직 내 통과를 유도하기 충분한 힘으로 제제의 제트 전달을 가동화하도록 조직 표면과 주입기를 접촉시켜서 직접적 또는 간접적인 전기수송을 위해 적합한 형태로 원하는 백신을 도입 (예로 주사)할 수 있다. 예를 들어, 치료될 조직이 점막, 피부 또는 근육인 경우, 제제를 각질층을 통해 각각 피부층들 내로 또는 하부 조직 및 근육 내로 통과하도록 유도하기 충분한 힘으로 제제가 점막 또는 피부 표면을 향해 발사된다.
무바늘 주입기들은 모든 유형들의 조직들, 특히 피부 및 점막에 백신들을 전달하기 매우 적합하다. 일부 구현예들에서, 무바늘 주입기는 백신을 함유하는 액체를 표면으로 그리고 피험체의 피부 또는 점막 내로 방출하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법들을 이용하여 치료될 수 있는 다양한 조직들 유형들의 대표적 예들에는 췌장, 후두, 비인두, 하인두, 구인두, 입술, 목구멍, 폐, 심장, 신장, 근육, 유방, 결장, 전립선, 흉선, 정소, 피부, 점막 조직, 난소, 혈관들 또는 이들의 임의 조합이 포함된다.
MID는 조직을 전기천공하는 바늘 전극들을 가질 수 있다. 다전극 어레이, 예를 들어 직사각형 또는 사각형 패턴들로 설정된 다중 전극쌍들 간의 펄스화에 의해, 한 쌍의 전극들 간의 펄스화에 비해 개선된 결과들을 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,702,359 ("Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes"의 표제를 가짐)에는 복수의 바늘 쌍들이 치료적 처리 동안 펄스화될 수 있는 바늘들의 어레이가 개시된다. 본원에 그 전체가 참고문헌으로 도입되는 상기 출원에서, 바늘들은 원형 어레이로 배치되었지만 반대 바늘 전극들의 쌍들 간 펄스화를 구현하는 커넥터들 및 스위칭 장치를 갖는다. 세포들로 재조합 발현 벡터들을 전달하기 위한 한 쌍의 바늘 전극들이 사용될 수 있다. 이러한 장치 및 시스템은 미국 특허 번호 6,763,264에 기재되며, 그 내용들은 참조함으로써 본원에 포함된다. 대안적으로, 일반 주사 바늘과 유사한 하나의 바늘을 갖는 전기 천공으로 DNA의 주사를 허용하고 본원에서 사용되는 장치들에 의해 전달되는 것보다 낮은 전압의 펄스들을 적용하여 환자가 경험하는 전기 자극을 감소시키는 하나의 바늘 장치가 사용될 수 있다.
MID는 하나 이상의 전극 어레이들을 포함할 수 있다. 상기 어레이들은 동일한 지름 또는 상이한 지름들의 둘 이상의 바늘들을 포함할 수 있다. 바늘들은 균일하게 또는 불균일하게 떨어져 배치될 수 있다. 바늘들은 0.005 인치 내지 0.03 인치, 0.01 인치 내지 0.025 인치; 또는 0.015 인치 내지 0.020 인치일 수 있다. 바늘은 지름이 0.0175 인치일 수 있다. 바늘들은 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm, 또는 그 이상 떨어져 배치될 수 있다.
MID는 단일 단계로 백신 및 전기천공 펄스들을 전달하는 펄스 생성기 및 둘 이상의 바늘 백신 주입기들로 구성될 수 있다. 펄스 생성기는 플래시 카드로 작동되는 개인용 컴퓨터를 통해 펄스 및 주사 파라미터들의 유연한 프로그래밍뿐만 아니라 전기천공 및 환자 데이터의 통합적 기록 및 저장을 구현할 수 있다. 펄스 생성기는 짧은 시기들 동안 다양한 볼트의 펄스들을 전달할 수 있다. 예를 들어, 펄스 생성기는 100 ms 기간에 3개의 15 볼트 펄스들을 전달할 수 있다. 이러한 MID의 예는 Elgen 1000 시스템 (Inovio Pharmaceuticals)으로, 이는 미국 특허 번호 7,328,064에 기재되며 그 내용들은 참조함으로써 본원에 포함된다.
MID는 CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals) 장치 및 시스템일 수 있으며, 이는 신체 또는 식물에서 선택된 조직 세포들 내로 DNA와 같은 거대분자의 도입을 촉진하는 모듈형 전극 시스템이다. 모듈형 전극 시스템은 복수의 바늘 전극들; 피하 바늘; 복수의 바늘 전극들에 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터의 전도성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 운영자는 지지체 구조 상에 실장된 복수의 바늘 전극들을 쥐고 이들을 신체 또는 식물에서 선택된 조직 내로 확실히 삽입할 수 있다. 이어서 거대분자들이 선택된 조직 내로 피하 바늘을 통해 전달된다. 프로그램 가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고 정전류 전기 펄스가 복수의 바늘 전극들로 전달된다. 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극들 간 세포 내로 거대분자들의 도입을 촉진한다. 세포들의 과열로 인한 세포사는 정전류 펄스들의 특성에 의해 조직 내 전력 발산을 제한함으로써 최소화된다. Cellectra 장치 및 시스템이 미국 특허 번호 7,245,963에 기재되며, 그 내용들은 참조함으로써 본원에 포함된다.
Elgen 1000 시스템은 유체 전달 수단; 및 중공 바늘을 제공하는 장치를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 장치는 유체, 본원에 기재된 백신을 상기 신체 조직 내로의 바늘 삽입 동안 신체 조직 내로 동시에 (예를 들어 자동으로) 주사하도록 사용되는 유체 전달 수단을 가동화하도록 채택된다. 그 장점은 바늘이 삽입된 동안 유체를 점진적으로 주사하여 신체 조직을 통해 보다 균일한 유체 분포를 야기하는 능력에 있다. 또한 더 큰 면적에 걸쳐 유체 부피의 분포가 주사되는 것으로 인해 주사 동안 겪는 통증이 감소되는 것으로 여겨진다.
또한, 유체의 자동 주사는 주사되는 실제 유체 용량의 자동 모니터링 및 등록을 촉진한다. 상기 데이터는 필요한 경우 문서화 목적들을 위해 제어 유닛에 의해 저장될 수 있다.
주사 속도는 선형 또는 비선형일 수 있고, 주사는 치료될 피험체의 피부를 통해 바늘들이 삽입된 후 이들이 신체 조직 내로 추가 삽입된 동안 수행될 수 있음이 이해될 것이다.
유체가 본 발명의 장치에 의해 주사될 수 있는 적합한 조직들에는 종양 조직, 피부 또는 간 조직이 포함되지만 근육 조직도 가능하다.
상기 장치는 신체 조직 내로 바늘의 삽입을 유도하기 위한 바늘 삽입 수단을 추가로 포함할 수 있다. 유체 주사 속도는 바늘 삽입 속도에 의해 조절된다. 이는 바늘 삽입 및 유체 주사가 모두 원하는 경우 삽입 속도가 주사 속도와 매치될 수 있도록 조절될 수 있다는 장점을 갖는다. 이는 또한 사용자가 장치를 작동하기 더 쉽게 만들어 준다. 필요한 경우, 신체 조직 내로 바늘의 자동 삽입 수단이 제공될 수 있다.
사용자는 유체 주사를 언제 개시할 지 선택할 수 있다. 그러나, 이상적으로, 주사는 바늘 끝이 근육 조직에 도달하였을 때 개시되며, 장치에는 바늘이 유체 주사를 개시하기 충분한 깊이로 삽입되었을 때를 감지하는 수단이 포함될 수 있다. 이는 바늘이 원하는 깊이 (보통 근육 조직이 시작되는 깊이일 것임)에 도달했을 때 유체 주사가 자동 개시되도록 촉구될 수 있음을 의미한다. 근육 조직이 시작되는 깊이는, 예를 들어 바늘이 피부층을 통과하기 충분한 것으로 간주될 4 mm와 같은 값의 사전 설정 바늘 삽입 깊이로 간주될 수 있다.
감지 수단은 초음파 탐침을 포함할 수 있다. 감지 수단은 임피던스 또는 저항의 변화를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 수단은 신체 조직에서 바늘의 깊이를 기록하기 위한 것이 아닐 수 있으며, 그보다는 바늘이 상이한 유형의 신체 조직으로부터 근육 내로 이동함에 따라 임피던스 또는 저항 변화를 감지하도록 채택될 것이다. 이러한 대안들 중 어느 것이든 주사가 개시될 수 있음을 감지하는 비교적 정확하고 간단한 작동 수단을 제공한다. 필요한 경우 바늘의 삽입 깊이가 추가 기록될 수 있고, 바늘 삽입 깊이가 기록될 때 주사되는 유체의 부피가 결정되도록 유체의 주사를 조절하는데 사용될 수 있다.
장치는 바늘을 지지하기 위한 기재; 및 기재를 수용하는 하우징을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 상기 기재가 하우징에 대해 첫 번째 후방 위치에 있을 때 바늘이 하우징 내에서 후퇴하고, 기재가 하우징 내에서 두 번째 전방 위치에 있을 때 바늘이 하우징 밖으로 연장되도록 상기 기재가 하우징에 대해 이동 가능하다. 이는 하우징이 환자의 피부 상에 라인업될 수 있고, 이어서 바늘들이 기재에 대해 하우징을 이동시킴으로써 환자의 피부 내로 삽입될 수 있으므로 사용자에게 유리하다.
전술된 바와 같이, 바늘이 피부 내로 삽입될 때 유체가 바늘 길이에 걸쳐 균일하게 분포되어 조절되는 속도의 유체 주사를 달성하는 것이 바람직하다. 유체 전달 수단은 조절되는 속도로 유체를 주사하도록 채용되는 피스톤 구동 수단을 포함한다. 피스톤 구동 수단은, 예를 들어 서보 모터에 의해 활성화될 수 있다. 피스톤 구동 수단은 기재가 하우징에 대해 축 방향으로 이동하여 가동될 수 있다. 유체 전달을 위한 대안적 수단이 제공될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 예를 들어, 조절되거나 조절되지 않는 속도로 유체 전달을 위해 짜낼 수 있는 밀폐 용기가 주사기 및 피스톤 시스템 대신 제공될 수 있다.
전술된 장치는 임의 주사 유형을 위해 사용될 수 있다. 그러나 이것이 전기천공 분야에서 특히 유용한 것임이 예상되며, 바늘에 전압을 적용하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 이는 바늘이 전기천공 동안 주사를 위해서뿐만 아니라 전극으로도 사용될 수 있게 한다. 이는 전기장이 주사된 유체와 동일한 면적으로 적용됨을 의미하므로 특히 유리하다. 전통적으로 전기천공에 있어서, 전극을 이전에 주사한 유체와 정확히 정렬하기가 매우 어려워서 사용자는 더 큰 면적에 걸쳐 필요한 것보다 큰 부피의 유체를 주사하고 주사된 물질 및 전기장 간 오버랩을 보장하기 위한 시도로 더 높은 면적에 걸쳐 전기장을 적용하는 경향을 갖는다는 문제가 있었다. 본 발명을 이용하여, 주사되는 유체의 부피 및 적용되는 전기장의 크기를 모두 감소시키면서 전기장과 유체 간 우수한 적합성을 달성할 수 있다.
4. RSV 감염에 대한 백신접종 방법
본 발명은 또한 RSV 감염에 대한 피험체의 백신접종 방법들에 관한 것이다. 상기 방법에는, 본원에 기재된 바와 같이 RSV에 대한 백신이 필요한 피험체에게 투여하는 것이 포함된다. 상기 백신에는 RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 핵산이 포함될 수 있다. 상기 백신은 비제한적으로 CD4+, CD25-, FoxP3+, IL-10+를 포함하는 iTreg 세포들을 자극할 수 있고, 이는 다시 항원-특이적 반응을 생성한다. iTreg 자극 세포들은 고농도들의 IL-10을 생성할 수 있고, 이는 중화 항체 생성을 위해 B 세포들을 자극한다.
5. RSV 감염에 대한 중화 항체의 유도 및 염증성 T 세포들의 억제 방법
본 발명은 또한 피험체에서 RSV 감염에 대한 중화 항체의 유도 및 염증성 T 세포들의 억제 방법들에 관한 것이다. 상기 방법에는, 본원에 기재된 바와 같이 RSV에 대한 백신이 필요한 피험체에게 투여하는 것이 포함된다. 상기 백신에는 RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 핵산이 포함될 수 있다. 상기 백신은 비제한적으로 CD4+, CD25-, FoxP3+, IL-10+을 포함하는 iTreg 세포들을 자극할 수 있다. iTreg 자극 세포들은 고농도들의 IL-10을 생성할 수 있고, 이는 중화 항체 생성을 위해 B 세포들을 자극한다. 염증성 T 세포의 억제에는 iTreg 세포들의 유도가 포함된다.
상기 방법은 전술된 바와 같이 RSV 항원 및 동일한 RSV 항원을 인코딩하는 핵산 둘 다로 피험체를 공동 면역화하여 생성되는 항원 특이적 면역 반응을 이용한다.
6. RSV 시험 감염 후 자가 반응성 CD4 + T 세포 유도의 억제 방법
본 발명은 또한 피험체에서 RSV 시험 감염 후 자가 반응성 CD4+ T 세포 유도의 억제 방법들에 관한 것이다. 상기 방법에는, 본원에 기재된 바와 같이 RSV에 대한 백신이 필요한 피험체에게 투여하는 것이 포함된다. 상기 백신에는 RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 핵산이 포함될 수 있다. 상기 백신은 비제한적으로 CD4+, CD25-, FoxP3+, IL-10+을 포함하는 iTreg 세포들을 자극할 수 있다. iTreg 자극 세포들은 고농도들의 IL-10을 생성할 수 있고, 이는 중화 항체 생성을 위해 B 세포들을 자극한다. 염증성 T 세포의 억제에는 자가 반응성 CD4+ 및 CD8+ T 세포들의 억제가 포함된다.
7. 백신 유도 질환 ( VID )의 완화 방법
본 발명은 또한 VID의 완화 방법들에 관한 것이다. 상기 방법에는, 본원에 기재된 바와 같이 RSV에 대한 백신이 필요한 피험체에게 투여하는 것이 포함된다. 상기 백신에는 RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 핵산이 포함될 수 있다. 상기 백신은 비제한적으로 CD4+, CD25-, FoxP3+, IL-10+을 포함하는 iTreg 세포들을 자극할 수 있다. iTreg 자극 세포들은 고농도들의 IL-10을 생성할 수 있고, 이는 중화 항체 생성을 위해 B 세포들을 자극한다. 상기 피험체는 자연적으로 RSV에 감염되기 전에 포르말린 비활성화 RSV (FI-RSV) 또는 RSV 항원으로 면역화될 수 있다.
8. RSV 시험 감염 후 기도 고반응성 ( AHR )으로부터 피험체의 보호 방법
본 발명은 또한 RSV 시험 감염 후 기도 고반응성 (AHR)으로부터 피험체의 보호 방법들에 관한 것이다. 상기 방법에는, 본원에 기재된 바와 같이 RSV에 대한 백신이 필요한 피험체에게 투여하는 것이 포함된다. 상기 백신에는 RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 핵산이 포함될 수 있다. 상기 백신은 비제한적으로 CD4+, CD25-, FoxP3+, IL-10+을 포함하는 iTreg 세포들을 자극할 수 있다. iTreg 자극 세포들은 고농도들의 IL-10을 생성할 수 있고, 이는 중화 항체 생성을 위해 B 세포들을 자극한다. 상기 피험체는 자연적으로 RSV에 감염되기 전에 포르말린 비활성화 RSV (FI-RSV) 또는 RSV 항원으로 면역화될 수 있다. 상기 방법은 전술된 바와 같이 RSV 항원 및 동일한 RSV 항원을 인코딩하는 핵산 둘 다로 피험체를 공동 면역화하여 생성되는 항원 특이적 면역 반응을 이용한다.
RSV는 RSV에 대해 사전 감작된 피험체에서 AHR을 유발할 수 있다. RSV에 대한 감작은 면역 반응이 RSV에 대해 발생하도록 RSV에 대해 1회 이상 사전 노출된 것을 나타낸다. 미감작 개인이 최초로 RSV에 노출되면 알러지성 반응에 연관된 반응들 (예로 히스타민 방출, 비염, 부종, 혈관확장, 기관지 수축, 기도 염증)이 전형적으로 일어나지 않지만, 일단 세포성 및 체액성 반응이 RSV에 대해 생성되면, 상기 개인은 RSV에 대해 "감작된다". 감작된 피험체가 RSV에 재노출되면, AHR 또는 기도 폐색이 일어날 수 있다. 일단 피험체가 RSV에 대해 감작되면, 각각의 재노출이 알러지성 증상만을 생성하는 것이 아니라 RSV에 대해 생성된 항체 농도 및 RSV에 대한 T 세포 반응 농도를 추가 증가시키기 때문에, RSV에 대한 매 후속 노출 시 알러지성 반응들이 더 악화될 수 있다.
기도 고반응성의 발생 위험을 갖는 피험체는 AHR을 유발하기 충분한 RSV에 노출되었거나 노출 위험을 갖지만 아직까지 측정 가능하거나 검출 가능한 AHR의 특징 또는 증상을 나타내지 않은 피험체다. RSV-유도 AHR의 발생 위험을 갖는 포유류는 이전에 RSV에 감작되었고 AHR을 유발하기 충분한 양의 (즉 RSV의 유발 또는 시험 감염 용량의) RSV에 노출되었거나 노출 위험을 갖지만 아직까지 측정 가능하거나 검출 가능한 AHR의 특징 또는 증상을 나타내지 않은 포유류이다.
염증은 전형적으로 염증에 관여되는 세포들을 조직으로 모집하는 염증성 매개체들 (예로 시토카인들 또는 케모카인들)의 방출을 특징으로 한다. RSV 시험 감염 후의 AHR에는 RSV에 대한 한 유형의 면역 반응 (예로 Th2-형 면역 반응)의 야기가 관여되며, 이는 포유류에서 염증에 관여되는 세포들을 모집하는 염증성 매개체들의 방출을 일으킬 수 있고, 그 존재는 조직 손상 및 때때로 사망으로 이어질 수 있다. Th2-형 면역 반응은 부분적으로 IL-4, IL-5 및 IL-13을 포함하는 시토카인들의 방출을 특징으로 한다.
9. 병용 요법들
본원에서 사용되는 다른 요법들의 투여 측면에서의 용어 "병용"는 둘 이상의 요법의 사용을 나타낸다. "병용"이라는 용어의 사용은 요법들이 감염 피험체에 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 첫 번째 요법은 RSV 감염, 중이염 또는 이에 관련된 호흡기 상태를 가졌거나 가지거나 감수성이 있는 피험체에 대한 두 번째 요법의 투여 전 (예로 1 분, 45 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주, 또는 12 주), 동시적으로, 또는 후 (예로 1 분, 45 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주, 또는 12 주)에 투여될 수 있다. 임의의 추가 요법이 다른 추가적 요법들과 임의 순서로 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 백신들은 하나 이상의 요법들(예로, RSV 감염(예로 급성 RSV 질환 또는 RSV URI 및/또는 LRI, 중이염, 및/또는 증상 또는 호흡기 상태 또는 이에 관련된 다른 증상)의 예방, 치료, 관리 및/또는 완화를 위해 현재 투여되는 본 발명의 백신들이 아닌 요법들)과 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 백신과 병용 투여될 수 있는 요법들의 비제한적인 예들에는 선택적으로 적어도 하나의 TNF 길항제 (예로, 비제한적으로 TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 이들의 융합 단백질들, 또는 소분자 TNF 길항제), 항-류마티스제 (예로, 메토트렉세이트, 오라노핀, 오로티오글루코오스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 히드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노미드, 설파살진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 소염 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제 (예로, 아미노글리코시드, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오로퀴놀론, 마크롤리드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 또 다른 항균제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화성 스테로이드, 당뇨병 관련제, 미네랄, 영양제, 갑상선 제제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 거담제, 항구토제, 항궤양제, 완화제, 항응고제, 에리트로포이에틴 (예로, 에포틴 알파), 필그라스팀 (예로, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀 (GM-CSF, Leukine), 면역 제제, 면역글로불린, 면역억제제 (예로, 바실릭시맵, 시클로스포린, 다클리주맵), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조정제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사제, 유사분열 저해제, 방사선 약제, 항우울제, 항조증제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경작용제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약제, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 저해제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 노르나아제 알파 (Pulmozyme), 시토카인 또는 시토카인 길항제, 또는 미국 약전 및/또는 Physician's Desk Reference에 기재된 임의의 다른 제제로부터 선택되는 적어도 하나를 추가로 포함하는, 이러한 조정, 치료 또는 요법에 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 대한 적어도 하나의 RSV 항체를 포함하는 적어도 하나의 임의의 적합한 유효량의 조성물 또는 약학 조성물이 포함된다. 상기 시토카인들의 비제한적 예들에는 비제한적으로 임의의 IL-1 내지 IL-23이 포함된다. 적합한 투여량들은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예로 Wells 등, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)을 참조한다. 이들 각각의 참고문헌들은 참조함으로써 본원에 포함된다.
10. 키트
본원에서는 피험체의 백신접종을 위해 사용될 수 있는 키트가 제공된다. 상기 키트는 백신을 포함할 수 있고, 여기에는 항원성 펩티드 및 상기 항원성 펩티드를 인코딩하는 DNA 및 MID가 포함된다. 상기 키트는 키트의 사용 및 분석 수행, 모니터링 또는 치료를 위한 지침들이 추가로 포함될 수 있다.
상기 키트는 또한 하나 이상의 용기들, 예컨대 바이알들 또는 병들을 포함할 수 있고, 각각의 용기는 별도의 시약을 함유한다. 상기 키트는 서면 지침들을 추가로 포함할 수 있고, 이는 본원에 기재된 분석, 모니터링, 치료 또는 방법을 어떻게 수행하는지 또는 해석하는지를 설명할 수 있다. 상기 키트는 백신 투여 장치를 추가로 포함할 수 있다. 상기 백신 투여 장치는 백신 총, 백신 투여를 위한 바늘, 또는 백신 전달을 위한 유로에 연결된 전기천공 장치일 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예들에 의해 예시되는 여러 측면들을 갖는다.
실시예들
실시예 1
재료들 및 방법들
다음은 하기 언급되는 실시예들 2-8에서 사용되는 재료들 및 방법들의 설명이다.
동물들 및 세포들에 있어서, 6-8 주령 자성 Balb/c 마우스들을 Animal Institute of the Chinese Medical Academy (Beijing, China)에서 구입하고, 12 시간 광 주기 하에 관리하고 무병원체 음식 및 물을 공급하였다. 모든 동물 프로토콜들은 중국 농업 대학 동물 복지 위원회 (Animal Welfare Committee of China Agricultural University)의 승인을 받았다. NIH/3T3 세포주 (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA CCL-1658) 및 HEp-2 (ATCC, CCL-23) 세포들을 37℃ 및 5% CO2로 설정된 가습 배양기에서 10% 소 태아 혈청 (FCS) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco/BRL)이 보강된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (Gibco/BRL, NY, USA) 중에 유지하였다.
박테리아 균주들 및 플라스미드들에 있어서, 대장균 TOP10 (TIANGEN Biotech LTD, Beijing, China)을 조작을 위한 숙주 균주로 사용하였고 대장균 BL21 (DE3) (TIANGEN)을 발현 균주로 사용하였다. 진핵생물 발현 벡터 proVAX는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 hCG-β 리더 서열과 함께 본 실험실에서 앞서 구축하였다 (Du 등, The Journal of Gene Medicine 9: 136-146 (2007)). 원핵생물 발현 벡터 pET28a(+) (Novagen Inc, WI, USA)는 T7 프로모터를 함유하며 폴리히스티딘 태그에 융합된 재조합 단백질의 발현을 허용한다. 모든 박테리아 배양들은 적절한 경우 카나마이신이 보강된 Luria-Bertani 배지 (Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd., Shanghai, China)를 이용하여 진탕 플라스크들에서 수행하였다. 단백질 발현은 Invitrogen (CA, USA)에서 구입한 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 유도하였다.
플라스미드 구축 및 진핵생물 발현에 있어서, RSV G 당단백질의 최적화된 버전의 아미노산들 67-298을 인코딩하는 유전자를 사용하였다 (전장 RSV G 뉴클레오티드 서열은 유전자은행: AY911262.1 (RSV 게놈; 서열 목록 번호 6)의 위치 4687 5583에 해당함; RSV G 당단백질 아미노산 서열 (유전자은행 AAX23993; 서열 목록 번호 2); RSV G 당단백질 뉴클레오티드 서열 (서열 목록 번호 19)). 최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 목록 번호 20)이 마우스-코돈 최적화되었으며 (서열 목록 번호 22) 외주 합성되었다 (Sangon, Shanghai, China). 코돈 최적화는 G 단편의 드문 코돈들을 제거했을 뿐만 아니라 N-말단의 66 아미노산 막통과 도메인도 제거하였다 (Ghildyal 등, Journal of General Virology 86: 1879-1884 (2005)). 코돈 최적화된 유전자를 EcoR I 및 Xho I 제한 부위들에서 진핵생물 발현 벡터 proVAX 내로 서브클로닝하고 proVAX/G로 명명하였다. 그 정확성을 제한 절단들 및 염기서열분석으로 확인하였다. 정제된 플라스미드를 제조업체의 지침들 (Invitrogen, CA, USA)에 따라 리포펙타민으로 NIH/3T3 세포들 내에 형질감염시켰다. 형질감염체들을 48h 후 수확하고, 전체 세포 RNA를 전술된 프로토콜 (Jin 등, Vaccine 22: 2925-2935 (2004))에 따라 추출하였다. 관심 유전자의 발현을 하기 특이적 프라이머 세트들을 이용하여 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR)으로 검출하였다: 전방 프라이머, 5'-ATGCATAAGGTGACTCCT-3' (서열 목록 번호 7), 후방 프라이머, 5'-TTACTGCCGTGGGGTGTT-3' (서열 목록 번호 8).
SV F 융합 단백질의 최적화된 버전의 아미노산들 412-524를 인코딩하는 유전자를 사용하였다 (전장 RSV F 융합 단백질 뉴클레오티드 서열은 유전자은행: AY911262.1 (서열 목록 번호 6)의 5660-7384에 해당함, RSV F 융합 단백질은 아미노산 서열 (유전자은행 AAX23994.1; 서열 목록 번호 1); RSV F 융합 단백질 뉴클레오티드 서열 (서열 목록 번호 26)). 최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 목록 번호 23)은 원핵생물 (즉, 대장균) 발현에 대해 코돈 최적화되었다 (서열 목록 번호 24).
플라스미드 구축 및 원핵생물 발현에 있어서, RSV G 당단백질의 67-298에서 아미노산들을 인코딩하는 원핵생물 코돈 최적화된 유전자 (서열 목록 번호 21)가 유사한 절차에 의해 원핵생물 발현 벡터 내로 서브클로닝되고 pET28a(+)/G로 명명되었다. RSV F의 412-524에서 아미노산들을 인코딩하는 원핵생물 코돈 최적화된 유전자 (서열 목록 번호 24)가 유사한 절차에 의해 원핵생물 발현 벡터 내로 서브클로닝되고 pET28a(+)/F로 명명되었다. 그 정확성을 제한 절단들 및 염기서열분석으로 확인하였다. 대장균 BL21 (DE3) 적격 세포들을 표준 방법 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn : by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 에 따라 pET28a(+)/G로 형질변환시키고 단백질 발현을 0.5 mmol/L IPTG로 37℃에서 유도하였다. 4 시간 후, 세포들을 수집하고, 세척하고, PBS 중에 재현탁하였다. 가용성 분획 및 봉입체들을 함유하는 불용성 분획을 초음파 분쇄 후 세포들로부터 단리하였다. 재조합 단백질은 제조업체의 매뉴얼에 따라 Ni-NTA Superflow 컬럼 (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)을 통해 Biologic DuoFlowTM 크로마토그래피 시스템 (Bio-Rad, CA, USA) 상에서 통과시켜 정제하였다. 정제된 단백질을 12% SDS-PAGE로 분석하였다.
웨스턴 블롯 분석에 있어서, 단백질 표본들을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동하고 Bio-Rad 트랜스블롯 장치 (Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 니트로셀룰로오스 막 상으로 옮겼다. 2% BSA가 혼합된 PBST 중에서 하룻밤 동안 블로킹한 뒤, 막을 4℃에서 2 시간 동안 1:2000으로 희석하여 염소 항-RSV 항혈청(Meridian, Me, USA)으로 배양하였다. 막을 150 mM PBST로 3회 세척한 뒤 RT에서 1 시간 동안 1:1000으로 희석하여 블로킹 완충액 (2% BSA가 혼합된 PBST) 중에서 소 항-염소 IgG-HRP 접합체(Santa Cruz, CA, USA)로 배양하였다. 면역 복합체들을 제조업체의 지침(GE Healthcare Europe, Uppsala, Sweden)에 따라 ECL 방법에 의해 검출하였다.
RSV 스톡 제조에 있어서, RSV Long 균주를 ATCC (catalog no. VR-26)에서 입수하고 5% CO2의 가습 분위기 중 37℃에서 HEp-2 세포들에서 증식시켰다. 바이러스들을 4:1의 감염 다중도(m.o.i.)로 DMEM 중 세포들에 첨가하였다. 1 시간 후, 2% FCS를 포함하는 DMEM을 플라스크에 첨가하고 세포들의 감염을 3-4일 동안 모니터링하였다. 4℃, 3,000 × g에서의 원심분리에 의해 RSV를 수확하여 세포 파편을 제거하고, 분취하고, 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
포르말린 비활성화 RSV(FI-RSV)는 Kim 등, American Journal of Epidemiology 89: 422-434 (1969)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 간략하게, 1부의 포르말린 (대략 37% - 40%)을 4,000 부의 청정 바이러스 용해액과 함께 37℃에서 3일 동안 배양하고, 50,000 × g에서 1 시간 동안 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 바이러스를 최소 필수 배지 (MEM) 중에 1:25로 희석한 뒤 알루미늄 히드록시드 (4 mg/ml)로 침전시키고, 원래 부피의 1/100의 무혈청 MEM 중에 재현탁하여 4℃에 보관하였다.
면역화 및 마우스들의 시험 감염에 있어서, 면역화를 위한 플라스미드 DNA를 제조업체의 권장사항들에 따라 EndoFree 플라스미드 Giga 키트(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 단리하였다. 플라스미드들 및 재조합 단백질들을 모두 PBS 중에 용해하였다. 백신접종을 위해, 마우스들을 표 1에 기재된 바와 같이 군 당 9마리씩의 군들로 무작위로 나누었다. 마우스들을 0, 14 및 28일째에 FI-RSV, 플라스미드, 플라스미드 + 단백질 또는 식염수 용액 중 하나로 근육내 면역화하였다. 면역화 전 및 후에 2주 간격으로 마우스들에서 채혈하였다. 마우스들을 최종 면역화 후 14일째에 RSV (106 TCID50 /50 μl)로 비강내에서 시험 감염하였다. 시험 감염 후 매일 마우스들의 체중을 측정하였다. 데이터를 시험 감염 0일째에 기준 체중들의 백분율들로 표시하였다. 마우스들을 5일 후 희생시키고, 폐 바이러스 역가들 및 기관지폐포액들 중 백혈구 침윤에 대해 분석하였다.
표 1. 면역화 군들
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항체들의 분석에 있어서, 바이러스에 대한 항체들을 효소 연관 면역흡착 분석(ELISA)으로 분석하였다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트들을 4℃에서 웰 당 100 μl씩의 0.05 M 비카르보네이트 완충액 (pH 9.6) 중 UV-비활성화 RSV로 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트들을 1 시간 동안 37℃에서 5% BSA-PBST로 블로킹하고, 세척하고, 37℃에서 1 시간 동안 연속 희석된 혈청으로 배양하였다. 홀스래디쉬 페록시다아제(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 접합된 이차 염소 항-마우스 IgG를 1:1000으로 희석하여 각 웰에 첨가하고 1 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 10 mg의 TMB 정제를 0.025 M 인산-시트레이트 완충액 중에 용해시키고, 발색을 위해 각 웰에 첨가하였다. 2 M H2SO4의 첨가 후, 플레이트를 450 nm에서 플레이트 측정기 (Magellan; Tecan Group, Maennedorf, Switzerland)로 판독하였다. 항체 역가들은 2.1의 컷오프로 후/시험 미감염 혈청의 절대 비로 표시하였다.
바이러스 중화 분석에 있어서, 바이러스 중화 분석은 개질들을 포함하여 전술된 대로 수행하였다 (Singh 등, Vaccine 25: 6211-6223 (2007); Anderson 등 J Clin Microbiol 22: 1050-1052 (1985)). 간략하게, 혈청들을 총 100 μl PBS 중 2배씩 연속 희석하고, 56℃에서 30 분 동안 열로 비활성화하고 4℃에서 2 시간 동안 바이러스 3 × 103 TCID50와 배양하였다. 2% FCS가 보강된 100 μl DMEM 중 대략 5×104 HEp-2 세포들을 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 바이러스-혈청 혼합물을 적절한 웰들에 첨가하고, 37℃ 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 그 뒤, 플레이트들을 PBS 중 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 PBS 중 80% 냉 아세톤으로 고정한 뒤 3% 블로킹 완충액으로 블로킹하였다. 염소 항-RSV 항체 (Meridian, ME, USA)를 적절한 웰들에 첨가하고 37℃에서 60 분 동안 배양하였다. 3회 세척들 후, 소 항-염소 IgG-HRP (Santa Cruz, CA, USA)를 첨가하고, 효소 반응을 진행시켜 평균 OD들을 450 nm/630 nm에서 판독하였다. 중화 역가는 RSV 활성의 50% 감소를 나타내는 혈청 희석도의 역함수를 외삽하여 웰들의 평균 OD로부터 계산되었다.
바이러스 정량에 있어서, 폐들을 RSV 감작 후 5일째에 면역화된 마우스들로부터 수확한 뒤 균질화하고 2000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 이들 표본들로부터의 무세포 상청액들을 액체 질소 중에 급속 냉동하고, 바이러스를 해동 표본들에서 적정하였다. 간략하게, 2% FCS-DMEM 중 각 평가 표본의 연속 log10 희석물들을 3 × 103 HEp-2 세포들/웰을 함유하는 마이크로타이터 플레이트들에 첨가하고 37℃에서 5% CO2로 배양하였다. 5일째에 웰들을 융합체 형성에 대한 시각적 검사로 스코어링하였다. 종점들을 Karber 방법으로 계산하였다. 각 현탁액에 존재하는 바이러스의 양을 기하 평균 바이러스 역가(GMT; log10 TCID50/g)로 표시하였다.
유세포측정 분석에 있어서, T 세포들을 단리하고 4℃에서 30 분 동안 피코에리트린-(PE-), 플루오레신 이소티오시아네이트- (FITC-) 또는 알로피코시아닌- (APC-) 접합체 mAbs로 염색하였다. 세포내 염색을 위해, T 세포들을 8 시간 동안 시험관 내에서 G 단백질(10 μg/ml)로 자극한 뒤 2 시간 동안 모넨신(100 μg/ml)으로 처리하였다. 세포들을 4℃에서 30 분 동안 PBS 중 Fc-Block(BD Pharmingen, San Diego, USA)으로 블로킹한 뒤 4% 파라포름알데히드로 고정하고 사포닌으로 투과화하였다. 세포들을 APC-표지 항-FoxP3 또는 PECy5-표지 항-CD25 항체, FITC-표지 항-CD4 항체 또는 PE-표지 항-IL-10 항체(BD Pharmingen, San Diego, USA)를 포함하는 적절한 농도들의 항체들로 4℃에서 30분 동안 세포내 염색하였다. 세포들을 세척하고 Cell QuestPro 소프트웨어(BD Bioscience, San Jose, USA)를 이용하여 FACScalibur로 분석하였다.
T 세포 증식 분석에 있어서, 비장들을 최종 면역화 후 7일째에 면역화된 마우스들로부터 제거하고, 단일 T 세포 현탁액들을 제조하는 데 사용하였다 (Tim. Journal of Immunological Methods 65: 55-63 (1983)). 단일 림프구 현탁액들을 3개씩 96-웰 플레이트들에서 5 × 104 세포들/웰로, RPMI-1640 + 5% FCS 중에 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하고, 양성 대조군으로 0.1 μg/ml의 포볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) + 1 μg/ml 이오노마이신 (Ion), 특이적 항원으로서 10 μg/ml UV-조사 RSV 항원, 미관련 항원으로 2 μg/ml 소 혈청 알부민(BSA)과 함께, 또는 음성 대조군으로 항원 없이 48 시간 동안 자극하였다. T 세포 증식은 MTT 방법을 이용하여 평가하였고, 플레이트들의 OD 값들을 MTT와의 4 시간 배양 후 플레이트 리더 (Magellan; Tecan Austria GmbH)에 의해 570 nm에서 읽었다(Wang 등, Vaccine 18: 1227-1235(2000)). 데이터를 배지로 자극된 3개씩의 웰들의 평균 측정치로 나눈 항원으로 자극된 3개씩의 웰들의 평균 측정치로 계산되는 자극 지수(SI)로 표시하였다.
세포 단리 및 차용 전달에 있어서, 단일 비장세포 현탁액들이 마우스 비장으로부터 제조되었다. CD4+CD25+ 또는 CD4+CD25- T 세포들을 MagCellect 마우스 CD4+CD25++ T 세포 단리 키트를 이용하여 제조업체의 프로토콜(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)에 따라 단리 및 정제하였다. 생성되는 CD4+CD25+, 및 CD4+CD25- T 세포 현탁액들은 유세포측정(FACSCalibur, BD Bioscience, San Jose, USA)에서 결정되는 바와 같이 >90% 순수하였다. CD4+CD25-, 4 × 105/마우스 (약 6 ×104 iTreg 세포들) 또는 CD4+CD25+, 2 × 105/마우스(약 1.8 ×105 nTreg 세포들)을 마우스들 내로 정맥내 차용 전달하였다.
혼합된 림프구 반응에 있어서, CD4+CD25+ 또는 CD4+CD25- T 세포 모집단들을 상기 세포 단리 하에 기재된 바와 같이 Balb/c 마우스들로부터 정제하고 반응 세포들로 사용하였다. 자극 세포들은 항-CD3 모노클로날 항체(eBioscience, CA, USA)를 이용한 패닝에 의해 시험 미감염 C57BL/6 마우스들의 비장으로부터 단리하여 T 세포들을 결실시키고 사용 전에 미토마이신 C로 추가 처리하였다. 반응 및 자극 세포들을 1:1, 1:3부터 1:10까지 (Balb/c 반응 세포 : C57BL/6 자극 세포) 다양한 비들로 혼합하고, 3개씩의 웰들에 웰 당 2 ×105의 총 세포들로 접종하여 48 시간 동안 배양하였다. 반응은 플레이트 리더 (Magellan; Tecan Group, Maennedorf, Switzerland) 상에서 490 nm에서의 OD 값들 측정치를 이용하여 MTS/PMS 열량측정 분석(Kang 등, Vaccine 23: 5543-5550 (2005))에 의해 측정하였다.
실시간 PCR에 있어서, 전체 mRNA를 RSV 시험 감염 후 5일째에 면역화된 마우스들로부터 단리된 폐들 표본들로부터 추출하였다. cDNA를 ABI7400 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)에서 Fast Start SYBR Green mix(Roche)를 이용해서 정량적 실시간 PCR을 측정하는 동안 역전사 PCR 및 SYBR Green 도입에 의해 합성하였다. 사용된 프라이머들을 표 2에 기재한다.
표 2. 실시간 PCR 프라이머들 (5'-3')
Figure pct00002

Figure pct00003

맥파계에 있어서, 제조업체의 매뉴얼에 따라 마우스들을 전신 맥파계(모델 AniRes2005; Beijing Bestlab Technology Co. Beijing, China)에 배치하여 호흡계 동적 저항 (Rrs) 및 순응도 (Cldyn) 값들을 측정하였다. 간략하게, 마우스들을 RSV 시험 감염 후 5일째에 마취하였다. 기관절개를 수행하고, 기관을 호흡기에 연결하였다. 기계적 호흡을 수행하고, 동적 기도압 (ΔP) 및 챔버 부피 (ΔV)를 기록하고, 각각 200 μl씩의 다양한 용량들의 아세틸콜린 클로라이드 (mg)의 경정맥내 투여 후 피크 저항 및 순응도를 Rrs = ΔP/ (ΔV/ΔT) 및 Clydn = ΔV/ΔP 로 자동 측정하였다(Jin 등, European Journal of Immunology 38: 2451-2463 (2008)). 기관지폐포 세척액 (BAL) 수집에 있어서, 시험 감염 후 5일째에 마우스들을 안락사시키고 기관 절개를 수행하여 큰 기도들을 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 1 ml PBS로 세척하였다. 기관지폐포 세척액 (BAL)을 원심분리하고 상청액을 제거하였다. BAL 펠렛을 재현탁하고, 총 세포 계수를 FACS로 수득하였다. 세포들을 Wright의 Giemsa(Lichen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China)로 염색하고 세포 유형들을 형태학적 기준에 의해 확인하였다. 감별 계수를 위해 슬라이드 당 적어도 2백개의 전체 세포들을 조사하였다.
조직병리에 있어서, 폐 조직들을 완충 포르말린 중에 고정하고, 횡단면들 (두께, 5 μm)을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 조직병리학적 스코어(HPS)는 5가지 상이한 파라미터들의 등급화에 근거하였다: (i) 세기관지 주위 및 기관지 침윤물들, (ii) 세기관지 및 기관지 관강 삼출물들, (iii) 혈관 주위 침윤물들, (iv) 단핵구들의 양, 및 (v) 실질 폐렴. HPS 시스템은 0 내지 21의 값들을 부여하였다; 스코어가 높을수록 폐에서의 염증성 변화들이 큰 것이다(Jafri 등, Journal of Infectious Diseases 189: 1856-1865 (2004); Mejias 등, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 48: 1811-1822 (2004)). HPS는 시편들을 채취한 동물들의 감염 상태를 알지 못하는 병리학자가 결정하였다.
통계 분석에 있어서, 결과들은 평균 ± 평균의 표준 오차 (S.E.M.)로 나타낸다. 스튜던트 t 및 비-파라미터성 평가 분석을 데이터 분석에 이용하였다. p < 0.05의 값이 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.
실시예 2
DNA 및 단백질 백신들의 발현
진핵생물 발현 구축물들 proVAX/G 및 proVAX/F를 별도로 NIH/3T3 세포들 내로 형질감염시켜 발현을 확인하였다. RT-PCR에 의한 G-특이적 mRNA의 분석으로 효율적인 발현을 확인하였다(도 1). 원핵생물 발현 구축물들 pET28a(+)/G 및 pET28a(+)/F를 대장균 BL21 (DE3) 내로 형질변환시키고 생성되는 재조합 단백질을 Biologic DuoFlowTM 크로마토그래피 시스템 상에서 Ni-NTA Superflow 로 정제하였다(pET28a(+)/G를 도들 2a-2b에 나타냄). 생성된 G 단백질 및 F 단백질의 정체는 특이적 염소 항-RSV 폴리클로날 항혈청들을 이용한 웨스턴 블롯으로 확인되었다(G 단백질의 정체를 도 3에 나타냄).
실시예 3
항체 반응들
7마리의 Balb/c 마우스들의 군들을 0, 14 및 28일에 근육내 면역화하고, 바이러스에 대한 IgG 항체 농도를 최종 면역화 후 7일째에 ELISA로 결정하였다. 별도로 제공된 proVAX/G 및 His-G를 양성 대조군으로서 proVAX/G + His-G 단백질 및 FI-RSV와 비교하였다. 또한, 별도로 제공된 proVAX/F 및 His-F를 양성 대조군으로서 proVAX/F + His-F 단백질 및 FI-RSV와 비교하였다. 추가 대조군 마우스들은 proVAX (빈 벡터) + His-G, proVAX (빈 벡터) + His-F, proVAX/G + 미관련 단백질 (오발부민; OVA), proVAX/F + 미관련 단백질 (오발부민; OVA) 또는 PBS를 받았다. PBS로 면역화된 마우스들을 제외한 모든 면역화 군들이 검출 가능한 IgG 항체들(양성:: ODExp/ODPre > 2.1)을 생성하였다. FI-RSV 면역화된 마우스들에서 가장 높은 농도가 달성되었지만, proVAX/G + His-G, His-G 단독 또는 His-G + proVAX로 면역화 군들은 유사한 농도들의 항체 반응을 생성하였다. proVAX/F + His-F, His-F 단독 또는 His-F + proVAX로 면역화 군들도 항체 반응을 생성하였다. 가장 낮은 농도들은 proVAX/G, proVAX/G + OVA, proVAX/F 또는 proVAX/F + OVA 군들에서 생성되었다(도들 4a-4b).
동물들 및 인간들에서의 연구들은 더 높은 농도의 중화 항체가 RSV 감염에 대해 더 높은 농도의 보호와 연관됨을 나타내었다. 따라서 RSV를 중화하는 혈청 항체들의 능력을 평가하였다. 혈청 중화 역가는 다음과 같이 결정되었다: 최종 면역화 후 7일째에 면역화된 마우스들에서 수집된 풀링 혈청들을 이용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 RSV 중화 역가를 결정하였다. 폐 RSV 역가는 다음과 같이 결정하였다: 나타낸 항원들로 면역화된 후 RSV (106 TCID50)로 시험 감염된 마우스들로부터의 폐 표본들을 이용하여 RSV를 수집하였다. 바이러스 역가를 실시예 1에 기재되고 실시예 5에서 논의된 바와 같이 결정하였다. 데이터는 적어도 6개의 반복물들을 표준 오차와 함께 나타낸다 (표 3). 표 3에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 FI-RSV 백신접종은 가장 높은 중화 항체 농도를 제공하였다; 반면 His-G, proVAX+His-G, proVAX/G+His-G, His-F, proVAX+His-F, 및 proVAX/F+His-F 면역화 군들로부터의 항혈청들은 상당히 더 높고 유사한 농도의 중화 항체들을 나타내었다. 따라서, 결합 항체의 농도가 대략 중화 활성에 근사하였다.
표 3. 혈청 중화 역가 및 폐 RSV 역가 ( log 10 )
Figure pct00004

Figure pct00005

실시예 4
항원 매치된 DNA 및 단백질 백신들을 이용한 공동 면역화에 의한 자가 반응성 CD4 + T 세포의 억제
RSV 시험 감염 시의 중증 VID는 자가 반응성 CD4+ T 세포들의 유도에 의해 매개되며, 항원-매치된 DNA 및 단백질 백신들을 이용한 공동-면역화는 항체 반응들이 아닌 항원-특이적 T 세포를 손상시키는 것으로 나타났으므로, 최종 면역화 후 7일째에 UV-조사된 RSV 항원에 대한 시험관 내에서 T 세포 증식 반응들을 조사하였다. 가장 낮은 농도의 증식 반응이 proVAX/G+His-G로 공동 면역화된 마우스들로부터 단리된 T 세포들에서 관찰된 반면, 강한 증식 반응들이 PBS 또는 BSA 음성 대조군들을 제외한 다른 면역화 군들로부터 단리된 T 세포들에서 관찰되었다(도 5). 강한 증식 반응들이 proVAX/G 면역화 군에서 단리된 T 세포들에서 관찰되어, 세포성 면역 반응이 상기 군에서 잘 야기되었음을 나타내었다. 항원 매치되지 않은 대조군들로서 proVAX/G+OVA, 또는 His-G+proVAX 벡터를 이용한 공동-면역화들은 상기 반응에 대해 임의의 미관련 벡터 또는 단백질 영향들을 드러내지 않았다. 상기 결과는 DNA 백신 플러스 단백질, proVAX/G+His-G를 이용한 공동-면역화가 T 세포 증식 반응을 우선적으로 억제하는 데 있어서 고유하였음을 나타낸다.
실시예 5
RSV 시험 감염 후 바이러스 부하 감소로서 측정되는 보호
최종 면역화 후 2주째에 마우스들을 RSV로 106 TCID50 (50 μl)/동물로 비강내에서 시험 감염하였다(표 3 및 도들 6a-6b 참고). 바이러스 부하가 폐들에서 피크가 되었을 때 감작 후 5일째에 폐 표본들 및 BALs에서 바이러스 역가들을 정량하였다. RSV는 PBS 대조군 마우스들에서 5.107 ± 0.0994 log10 TCID50/폐 조직 g의 상당한 역가들로 복제하였다. FI-RSV, His-G, proVAX+His-G, 또는 proVAX/G+His-G로 면역화된 마우스들은 PBS, proVAX/G 및 proVAX/G+OVA 면역화 군들에 비해 현저한 바이러스 역가 감소들을 나타내었다(표 3 및 도 6a). His-F, proVAX+His-F, 또는 proVAX/F+His-F로 면역화된 마우스들은 또한 PBS, proVAX/F 및 proVAX/F+OVA 면역화 군들에 비해 바이러스 역가 감소들을 나타내었다(표 3 및 도 6b). 상기 보호는 명백히 중화 항체 역가들과 연관되었다(표 3).
실시예 6
공동-면역화된 마우스들로부터의 VID 제거
RSV 감작 후 기도 고반응성 (AHR)으로부터 동물들을 보호하기 위한 공동-면역화 전략의 능력을 조사하였다. 세포들을 BALs에서 단리하고 염색하고, 현미경으로 분석하여 RSV 시험 감염 후 존재하는 호산구들, 림프구들 및 단핵구들의 양을 측정하였다. 도들 7a-7d에 나타낸 바와 같이, 염증 세포들의 침윤은 다른 면역화 군들에 비해 proVAX/G + His-G 공동-면역화 군에서 현저히 더 적어서, RSV G 항원들을 이용한 공동 면역화가 마우스들을 RSV 감염으로부터 보호하고 폐 염증 반응을 완화시킴을 시사한다. 유사하게, 염증 세포들의 침윤이 다른 면역화 군에 비해 proVAX/F+His-F 공동-면역화 군에서 더 적었다. (도들 8a-8d). FI-RSV 또는 His-G 또는 proVAX+His-G로 면역화된 군들의 폐들은 RSV 시험 감염 후 대량 침윤들을 나타내었다.
침윤으로 인해, RSV 감염 마우스들에서 상당한 기도 폐색이 발생하였다. 군들 간 상기 기도 폐색들의 정도를 평가하기 위해, RSV 시험 감염 후 5일째에 다양한 용량들의 아세틸콜린 클로라이드의 경정맥내 투여에 의한 자극 동안 전신 맥파계를 수행하였다. 도들 9a-9B에 나타낸 바와 같이, 아세틸콜린 자극에 반응하여 최저값의 Rrs 및 Cldyn가 proVAX/G + His-G 공동 면역화 군에서 나타났다; 반면, PBS 대조군들에 비해 FI-RSV 또는 His-G 또는 proVAX+His-G로 면역화된 마우스들에서 Rrs 및 Cldyn 값들이 크게 증가되었다. 상기 결과는 기도 폐색이 proVAX/G+His-G 공동-면역화들에 의해 완화되었음을 나타내었다. 유사한 결과들이 proVAX/F+His-F 공동-면역화 군에 대해 나타났다(도들 9c-9d).
상기 완화를 폐 절편들의 조직병리학적 분석을 통해 추가 평가하였다. PBS 대조군은 감작 후 5일째에 RSV 감염의 조직병리학적 특징들을 나타내었다(도들 10a-10h, 도들 11a-11h, 및 도들 12a-12e). RSV 복제는 고밀도의 림프구 침윤물을 갖는 현저한 폐 염증을 일으켰다. 고밀도 림프구 침윤이 혈관 주위 및 기관지 주위 영역들 모두에서 주지되었다. proVAX/G, proVAX/G+OVA 또는 PBS로 면역화된 마우스들에 비해, FI-RSV 또는 His-G 또는 proVAX+His-G로 면역화된 마우스들이 현저히 더 높은 조직병리학적 스코어들(HPS)을 제공하며 (도 13), 고밀도 기관지 주위 및 혈관 주위 주변 침윤물들 및 중증 폐렴을 보였다(도들 10a-10h). 그러나, proVAX/G+His-G로 면역화된 마우스들은 현저히 더 적은 폐 염증 반응을 나타내었으며, 폐 HPS 값들이 다른 군들에 비해 현저히 더 낮았다. 이 결과들은 proVAX/G+His-G 또는 proVAX/F+His-F를 이용한 공동-면역화가 RSV 감염의 폐 조직병리를 완화시킬 수 있음을 추가로 나타내었다.
호흡기 기능의 손상에 더하여 RSV 감염은 체중에 큰 영향을 미칠 수 있다. 생 RSV로 시험 감염 후, 마우스들의 체중을 매일 측정하였다. 모든 면역화 군들은 감작 후 첫번째 날에 비해 빠른 체중 감소 개시(2일)를 가졌으나, proVAX/G+His-G 공동 면역화 군들은 시험 감염 후 5 내지 7일째에 다른 군들에 비해 통계적으로 더 적은 체중 감소를 나타내었다(도 14a, p < 0.05). 대조적으로, 시험 감염 후 8 내지 9일째에 FI-RSV 또는 His-G 또는 proVAX+His-G로 면역화된 마우스들은 다른 군들에 비해 더 큰 체중 감소가 있었다. 따라서, proVAX/G+His-G를 사용한 공동-면역화는 생 RSV 시험 감염 후 질환의 경중도를 실질적으로 감소시킬 수 있다. 유사한 결과들이 proVAX/F+His-F 공동 면역화 군들에서 나타났다(도 14b).
FI-RSV-유도 VID는 이전에 Th2형 반응의 활성화와 연관이 있는 것으로 나타났다. 시토카인 프로필들이 공동 면역화 요법들에 의해 영향받았는지를 조사하기 위해, qPCR을 사용하여 RSV 시험 감염 후 5일째에 폐 조직들에서 시토카인들의 농도들을 분석하였다. 도들 15a-15d에 나타낸 바와 같이, His-G 또는 proVAX+His-G-면역화 군들에서 평가되는 거의 모든 시토카인들의 농도들은 FI-RSV 면역화 군에서와 유사했다; 반면 proVAX/G+His-G로 공동 면역화된 마우스들은 최저 농도들의 이 시토카인들을 생성하였다. 이는 Th1 및 Th2 반응들이 모두 공동-면역화에 의해 억제되었음을 나타낸다. proVAX/G 또는 proVAX/G+OVA로 면역화된 마우스들은 더 높은 농도들의 IFN-γ 발현을 나타내어, DNA 백신접종이 Th1을 향해 극화된 면역성을 유발했을 수 있음을 시사한다.
실시예 7
RSV -G 특이적 iTreg 세포들이 T 세포 반응들을 손상시킴
DNA 및 단백질 백신들을 이용한 공동 면역화로 유도되는 손상된 T 세포 반응은 CD4+CD25-IL-10+FoxP3+ iTreg 세포들의 유도 때문이었음이 앞서 나타났다. 공동 면역화 군에서 관찰되는 손상된 T 세포 반응들 및 편향된 시토카인 발현들이 iTreg 세포들의 유도에 기인하였는지를 결정하기 위해, 최종 공동-면역화 후 7일째에 T 세포 표현형들을 FACS로 분석하였다. 상기 결과들은 비장에서 CD4+CD25-IL-10+FoxP3+ iTreg 세포들의 모집단이 실제로 다른 군들에 비해 proVAX/G+His-G로 공동 면역화된 마우스들에서 상당히 더 높은 농도로 (p<0.001) 유도되었음을 나타내었다(도들 16a-16n 및 도들 17a-17b). 대조적으로, nTreg 대조군으로서, 각 군으로부터의 CD4+CD25+ T 세포들은 FoxP3 및 IL-10을 모두 크게 발현하였으나, 이들의 농도에 있어서 군들 간 유의차는 없었다.
CD4+CD25- iTreg 세포들을 차용 전달하여 생체 내에서 관찰되는 VID 완화에서의 이들의 역할을 평가하였다. 시험 미감염 Balb/c 마우스들은 공동 면역화된 마우스들로부터 수득된 CD4+CD25- iTreg 세포들을 받았다. 대조군들은 시험 미감염 마우스들로부터 제조된 nTreg 모집단으로서 CD4+CD25+ 세포들을 받았다. 이어서 수신자 마우스들을 His-G 항원에 대해 면역화하고, 상기 면역화에 대한 이들의 반응들을 시험관 내에서 T 세포 증식 분석들 및 MLR로 평가하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, proVAX/G+His-G로 공동 면역화되었던 Balb/c 마우스들에서 단리된 CD4+CD25- iTreg 세포들을 받은 마우스들로부터의 비장세포들은 T 반응 세포 회상 면역 반응들을 크게 저해하였다. 동일한 비장세포들은 동종이계 APC들에 반응하는 증식도 저해하였으나(도 19), 시험 미감염 공여자들로부터 유래된 상응하는 CD4+CD25- 세포들은 증식을 저해하지 않았다. 면역화된 마우스들로부터 CD4+CD25+ nTreg 세포들을 받은 마우스들로부터 유래된 비장 세포들 및 시험 미감염 마우스들로부터 CD4+CD25+ nTreg 세포들을 받은 마우스들로부터 유래된 세포들은 T 세포 증식을 동일하게 잘 억제할 수 있어서, 전달된 nTreg 세포들에 의한 비특이적 억제를 시사한다. 이 결과들은 proVAX/G+His-G를 사용한 공동 면역화가 항원 의존적 방식으로 T 세포 반응을 손상시키는 CD4+CD25- IL-10+FoxP3+ iTreg 세포들을 유도할 수 있었음을 시사하였다.
실시예 8
CD4 + CD25 - T 세포들의 차용 전달이 Ag -특이적 염증을 정지시킴
CD4+CD25- iTreg 및 CD4+CD25+ nTreg 세포들을 proVAX/G+His-G 또는 proVAX/G+OVA (항원-매치되지 않은 대조군)으로 공동 면역화된 마우스들로부터 정제하고, 이전에 His-G로 면역화된 마우스들 내로 정맥내 차용 전달하였다. 마우스들을 7일 후에 RSV 감염으로 시험 감염하였다. proVAX/G+His-G로 공동 면역화된 마우스들로부터 CD4+CD25- iTreg 세포들을 받은 마우스들에서는 림프구 침윤이 크게 감소되었으나 proVAX/G+OVA 면역화 마우스들로부터의 세포들을 받은 마우스들에서는 그렇지 않았다(도들 20a-20f). 조직학적 분석은 항원 특이적 CD4+CD25- iTreg 세포들(도들 20a-20f 및 도 21)을 받은 군들에서 더 적은 염증 세포 침윤들을 드러내었다. CD4+CD25+ nTreg 세포들을 받은 군들에서도 조직병리학적 결과의 유사한 개선들이 관찰되었으나, nTreg로부터의 개선은 항원 특이성을 나타내지 않았다.
G 항원을 인코딩하는 DNA 백신 및 G 단백질 백신으로 공동 면역화된 마우스들로부터 유래된 CD4+CD25- 세포들은 생 RSV 시험 감염 후 나타나는 VID를 현저히 감소시킨다(도들 20a-20f 및 도 21). 미스매치된 백신접종 요법들로부터 His-G 면역화된 마우스들 내로 전달받은 CD4+CD25- 세포들은 감염 시 더 심한 중증도의 임상적 개시를 일으켜서, 항원-매치되지 않은 대조군들로부터의 이 세포들이 iTreg 세포들의 부재를 겪으며 효과기 T 세포들을 함유한다는 것을 시사하는 것을 유의한다(도들 20a-20f 및 도 21).
RSV G 항원-발현 DNA 백신 및 그 G 단백질을 (proVAX/G+His-G) 사용한 공동-면역화는 마우스들에 있어서 RSV 시험 감염으로부터 보호할 뿐만 아니라 VID를 야기하는 악화된 폐 염증을 억제도 하였다. RSV 감염의 예방 및 감소된 VID는 명백히 고농도들의 항원 특이적 중화 항체 및 항원 특이적 방식으로 T 세포 회상 증식을 억제할 수 있는 iTreg 세포들의 유도에 모두 기인하였다. 이러한 공동-면역화는 항염증성 시토카인 IL-10의 농도를 상향 조절하면서 RSV-유도 염증성 시토카인들, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-13 및 IFN-γ를 하향 조절하였다.
공동 면역화된 마우스들 또는 미스매치 대조군들로부터 유래된 CD4+CD25+ 세포들(nTreg)은 전달 후 수신자들에서 염증성 세포 침윤들을 감소시킬 수 있었지만 (도들 20a-20f 및 도 21), 이들은 전반적인 비특이적 억제만을 제공했다. 아마도 이들의 염증 억제는 nTreg이 유도 가능한 모집단이 아니고 면역 거대환경에 의존하는 유연성을 갖기 때문에 생체 내에서로 제한된다. 예를 들어, 상당한 수들의 nTreg 세포들을 생체 내에서 또는 생체 외에서 유도하기는 어렵다. 또한, 전반적 면역억제능은 암 발생 위험을 증가시키고 감염들의 기회를 생성할 수 있다.
<110> INOVIO PHARMACEUTICALS, INC. <120> COMBINED ANTIGEN AND DNA VACCINE FOR PREVENTING AND TREATING RSV INFECTION <130> 030276-9016-WO00 <150> CN201210030325.5 <151> 2012-02-10 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 574 <212> PRT <213> Human respiratory syncytial virus <400> 1 Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Asn 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Thr Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val 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cgcatctatt 600 agccaggtga acgagaaaat caaccagagc ctggcgttca tccgcaaatc cgacgaactg 660 ctgcacaacg ttaacgctgg caaatccacc acgaactaa 699 <210> 25 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 25 Met Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn 1 5 10 15 Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val 20 25 30 Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr 35 40 45 Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile 50 55 60 Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala 65 70 75 80 Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile 85 90 95 Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr 100 105 110 Thr Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr 115 120 125 Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser 130 135 140 Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val 145 150 155 160 Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr 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acatcaccaa tccacacaaa ctcagccaca 360 atatcaccca atacaaaatc agaaacacac catacaacag cgcaaaccaa aggcagaatc 420 accactccaa cacagaccaa caagccaagc acaaaaccac gtccaaaaat tccaccaaaa 480 aaagatgatt accattttga agtgttcaac ttcgttccct gtagtatatg tggcaacaat 540 cgactttgca aatccatctg caaaacaata ccaagcaaca aaccaaagaa aaaaccaacc 600 atcaaaccta caaacaaacc aactaccaaa accacaaaca aaatagaccc aaaaacacca 660 gccaaaacac cgaaaaaaga aactaccacc aacccaacaa aaaaaccaac cctcaagatc 720 acagaaaaag acaccagcac ttcacaatcc actatgctcg acacaaccaa accaaatcac 780 acaatccaac agcaatacct ccactcaacc acccccgata acacacccaa ctccacacaa 840 acacccacag catccgagcc ctccacatca aactcaaccc aagaagtcta gtcacatgct 900 tagttattc 909 <210> 46 <211> 293 <212> PRT <213> Human respiratory syncytial virus <400> 46 Met Ser Lys His Lys Asn Gln Arg Thr Ala Arg Thr Leu Glu Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Ile Val Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Arg 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Ala Leu Ser Val Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ile Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Val Thr Val Ser Thr Ile Lys 65 70 75 80 Asn His Thr Glu Lys Asn Ile Thr Thr Tyr Leu Thr Gln Val Ser Pro 85 90 95 Glu Arg Val Ser Pro Ser Lys Gln Pro Thr Thr Thr Ser Pro Ile His 100 105 110 Thr Asn Ser Ala Thr Ile Ser Pro Asn Thr Lys Ser Glu Thr His His 115 120 125 Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Pro Thr Gln Thr Asn 130 135 140 Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Pro Lys Ile Pro Pro Lys Lys Asp Asp 145 150 155 160 Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn 165 170 175 Asn Arg Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro 180 185 190 Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr 195 200 205 Thr Asn Lys Ile Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Thr Pro Lys Lys Glu 210 215 220 Thr Thr Thr Asn Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu Lys Ile Thr Glu Lys 225 230 235 240 Asp Thr Ser Thr Ser Gln Ser Thr Met Leu Asp Thr Thr Lys Pro Asn 245 250 255 His Thr Ile Gln Gln Gln Tyr Leu His Ser Thr Thr Pro Asp Asn Thr 260 265 270 Pro Asn Ser Thr Gln Thr Pro Thr Ala Ser Glu Pro Ser Thr Ser Asn 275 280 285 Ser Thr Gln Glu Val 290 <210> 47 <211> 975 <212> DNA <213> Human respiratory syncytial virus <400> 47 aatgcaacca tgtccaaaca caagaatcaa cgcactgcca ggactctaga aaagacctgg 60 gatactctta atcatctaat tgtaatatcc tcttgtttat acaaattaaa tttaaaatct 120 atagcacaaa tagcactatc agttttggca atgataatct caacctctct cataattgca 180 gccataatat tcatcatctc tgccaatcac aaagttacac taacaactgt cacagttcaa 240 acaataaaaa accacactga gaaaaacatc accacttacc ttactcaagt ctcaccagaa 300 agggttagcc catccaaaca acccacaacc acaccaccaa tccacacaaa ctcagccaca 360 atatcaccta atacaagatc agaaacacac catacaacag cacaaaccaa aggcagaacc 420 accactccga cacagaacaa caagccaagc acaaaaccac gtccaaaaaa tccaccaaaa 480 aaaccaaaag atgattacca ttttgaagtg ttcaacttcg ttccctgtag tatatgtggc 540 aacaatcaac tctgcaaatc catttgcaaa acaataccaa gcaataaacc aaagaaaaaa 600 ccaaccataa aacccacaaa caaaccaccc accaaaacca caaccaaaag agacccaaaa 660 acactagcca aaacactgaa aaaagaaacc accatcaacc caacaaaaaa accaaccccc 720 aagaccacag aaagagacac cagtacccca caatccactg tgctcgacac aaccacatca 780 aaacacacag gaagagacac cagcacctca caatccattg tgctcgacac aaccacatca 840 aaacacacaa tccaacagca atccctctac tcaaccaccc ccgaaaacac acccaactcc 900 acacaaacgc ccacagcatc cgagccctcc acatcaaatt ccacccaaaa actctagtca 960 catgcttagt tattc 975 <210> 48 <211> 315 <212> PRT <213> Human respiratory syncytial virus <400> 48 Met Ser Lys His Lys Asn Gln Arg Thr Ala Arg Thr Leu Glu Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Ile Val Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Ala Leu Ser Val Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ile Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Val Thr Val Gln Thr Ile Lys 65 70 75 80 Asn His Thr Glu Lys Asn Ile Thr Thr Tyr Leu Thr Gln Val Ser Pro 85 90 95 Glu Arg Val Ser Pro Ser Lys Gln Pro Thr Thr Thr Pro Pro Ile His 100 105 110 Thr Asn Ser Ala Thr Ile Ser Pro 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syncytial virus <400> 49 aatgcaacca tgtccaaaca caagaatcaa cgcactgcca ggactctaga aaagacctgg 60 gatactctta atcatctaat tgtaatatcc tcttgtttat acaggttaaa tttaaaatct 120 atagcacaaa tagcactatc agtattggca atgataatct caacctctct cataattgca 180 gccataatat tcatcatctc tgccaatcac aaagttacac taacaacggt cacagtttca 240 acaataaaaa gccacactga aaaaaacatc accacttacc ttactcaagt ctcaccagaa 300 agggttagcc catccaaaca acccacaacc acatcaccaa tccacacaaa ctcagccaca 360 atatcaccca atacaaaatc agaaacacac catacaacag cacaaaccaa aggcagattc 420 accactccaa cacagaccaa caagccaagc acaaaaccac gtccaaaaat tccaccaaaa 480 aaagatgatt accattttga agtgttcaac ttcgttccct gtagtatatg tggcaacaat 540 cgactttgca aatccatctg caaaacaata ccaagcaaca aaccaaagaa aaaaccaacc 600 atcaaaccta caaacaaacc aaccaccaaa accacaaaca aaatagaccc aaaaacacca 660 gccaaaacac cggaaaaaga aactaccacc aactcaacaa aaaaaccaac cctcaagatc 720 acagaaaaag acaccagcac ctcacaatcc actatgctcg acacaaccac accaaatcac 780 acaatccaac agcaatccct ccactcaacc acccccgata acacacccaa ctccacacaa 840 acacccacag catccgagcc ctccacatca aactcaaccc aaaaagtcta gtcacatgct 900 tagttattc 909 <210> 50 <211> 293 <212> PRT <213> Human respiratory syncytial virus <400> 50 Met Ser Lys His Lys Asn Gln Arg Thr Ala Arg Thr Leu Glu Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Ile Val Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Arg 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Ala Leu Ser Val Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ile Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Val Thr Val Ser Thr Ile Lys 65 70 75 80 Ser His Thr Glu Lys Asn Ile Thr Thr Tyr Leu Thr Gln Val Ser Pro 85 90 95 Glu Arg Val Ser Pro Ser Lys Gln Pro Thr Thr Thr Ser Pro Ile His 100 105 110 Thr Asn Ser Ala Thr Ile Ser Pro Asn Thr Lys Ser Glu Thr His His 115 120 125 Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Phe Thr Thr Pro Thr Gln Thr Asn 130 135 140 Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Pro Lys Ile Pro Pro Lys Lys Asp Asp 145 150 155 160 Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn 165 170 175 Asn Arg 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acccacaacc acaccaccaa tccacacaaa ctcagccaca 360 acatcaccca acacaaaatc agaaacacac catacaacag cacaaaccaa aggcagaacc 420 accactccaa cacagaacaa caagccaagc acaaaaccac gtccaaaaaa tccaccaaaa 480 aaaccaaaag atgattacca ttttgaagtg ttcaacttcg ttccctgtag tatatgtggc 540 aacaatcaac tttgcagatc catctgcaaa acaataccaa gcaataaacc aaagaaaaaa 600 ccaaccatca aacccacaaa caaaccaccc accaaaacca caaacaaaag agacccaaaa 660 acaccagcaa aaccactgaa aaaagaaacc accaccaacc caacaaaaaa accaaccccc 720 aagaccacag aaagagactc cagcacttca caatccactg tgctcgacac aaccacatca 780 aaacacacaa tccaacagca atccctccac tcaaccaccc ccgaaaacac acccaactcc 840 acacaaacac ccacagcatc cgagccctcc acatcaaatt ccacccaaga accctagtca 900 catgcttagt tattc 915 <210> 52 <211> 295 <212> PRT <213> Human respiratory syncytial virus <400> 52 Met Ser Lys His Lys Asn Gln Arg Thr Ala Arg Thr Leu Glu Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Ile Val Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Ala Leu Ser Val Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ile Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Val Thr Val Gln Thr Ile Lys 65 70 75 80 Asn His Thr Glu Lys Asn Ile Thr Ser Tyr Leu Thr Gln Val Ser Pro 85 90 95 Glu Arg Ala Ser Pro Ser Lys Gln Pro Thr Thr Thr Pro Pro Ile His 100 105 110 Thr Asn Ser Ala Thr Thr Ser Pro Asn Thr Lys Ser Glu Thr His His 115 120 125 Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Thr Thr Thr Pro Thr Gln Asn Asn 130 135 140 Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Pro Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Gly Asn Asn Gln Leu Cys Arg Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn 180 185 190 Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Pro Thr 195 200 205 Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Pro Leu Lys 210 215 220 Lys Glu Thr Thr Thr Asn Pro Thr Lys Lys Pro Thr Pro Lys Thr Thr 225 230 235 240 Glu Arg Asp Ser Ser Thr Ser Gln Ser Thr Val Leu Asp Thr Thr Thr 245 250 255 Ser Lys His Thr Ile Gln Gln Gln Ser Leu His Ser Thr Thr Pro Glu 260 265 270 Asn Thr Pro Asn Ser Thr Gln Thr Pro Thr Ala Ser Glu Pro Ser Thr 275 280 285 Ser Asn Ser Thr Gln Glu Pro 290 295 <210> 53 <211> 1725 <212> DNA <213> Human respiratory syncytial virus <400> 53 atggagttgc taatcctcaa agcaaatgca attaccacaa tcctcactgc agtcacattt 60 tgttttgctt ctggtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 120 agcaaaggct atcttagtgc tctgagaact ggttggtata ccagtgttat aactatagaa 180 ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa 240 caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca 300 ccaccaacaa acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac 360 aatgccaaaa aaaccaatgt aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggtttt 420 ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcgttgctg tatctaaggt cctgcaccta 480 gaaggggaag tgaacaagat caaaagtgct ctactatcca caaacaaggc tgtagtcagc 540 ttatcaaatg gagttagtgt cttaaccagc aaagtgttag acctcaaaaa ctatatagat 600 aaacaattgt tacctattgt gaacaagcaa agctgcagca tatcaaatat agaaactgtg 660 atagagttcc aacaaaagaa caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat 720 gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttac atgttaacta atagtgaatt attgtcatta 780 atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata 840 gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaaag aggaagtctt agcatatgta 900 gtacaattac cactatatgg tgttatagat acaccctgtt ggaaactaca cacatcccct 960 ctatgtacaa ccaacacaaa agaagggtcc aacatctgtt taacaagaac tgacagagga 1020 tggtactgtg acaatgcagg atcagtatct ttcttcccac aagctgaaac atgtaaagtt 1080 caatcaaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaaataaat 1140 ctctgcaatg ttgacatatt caaccccaaa tatgattgta aaattatgac ttcaaaaaca 1200 gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 1260 aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgcgat 1320 tatgtatcaa ataaagggat ggacactgtg tctgtaggta acacattata ttatgtaaat 1380 aagcaagaag gtaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440 ttagtattcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaacga 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Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570

Claims (24)

  1. RSV 항원성 펩티드 및 상기 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염에 대한 백신에 있어서, 상기 백신이 iTreg 세포들(CD4+, CD25-, FoxP3+, IL-10+)을 자극하는 백신.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 RSV 항원성 펩티드가 F 당단백질, G 당단백질, 서열 목록 번호 4 (최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열), 서열 목록 번호 25 (최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열) 및 이들의 기능성 단편들로 구성된 군으로부터 선택되는 백신.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산이 DNA이고, 상기 DNA가 F 당단백질, G 당단백질, 서열 목록 번호 4 (최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열) 서열 목록 번호 25 (최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열) 및 이들의 기능성 단편들로 구성된 군으로부터 선택되는 RSV 항원성 펩티드를 인코딩하는 백신.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 DNA가 원형 플라스미드의 선형 발현 카세트로 존재하는 백신.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 플라스미드가 pVAX, pcDNA3.0, 및 proVAX로 구성된 군으로부터 선택되는 백신.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 플라스미드가 CMV, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오나인 프로모터, 쥣과 유선 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 및 폴리헤드린 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 프로모터를 추가로 포함하는 백신.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 및 항원성 펩티드가 5:1 내지 1:5; 및 1:1 내지 2:1로 구성된 군으로부터 선택되는 질량비인 백신.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 백신이 그 백신이 필요한 피험체 내로 전기천공될 수 있는 백신.
  9. 청구항 1의 백신 및 백신 투여 장치를 포함하는 백신접종 키트.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 백신 투여 장치가 백신 총, 바늘 및 전기천공 장치로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 전기천공 장치가 최소 침습 전기천공 장치인 키트.
  12. 환자에서 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 청구항 1의 백신이 필요한 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 피험체가 호흡기 세포융합 바이러스 시험 감염 후 기도 고반응성(AHR)으로부터 추가로 보호되는 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 RSV 항원성 펩티드가 F 당단백질, G 당단백질, 서열 목록 번호 4 (최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열) 서열 목록 번호 25 (최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열) 및 이들의 기능성 단편들로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 백신이 천기천공에 의해 투여되는 방법.
  16. 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 중화 항체의 유도 및 염증성 T 세포들의 억제 방법에 있어서, 청구항 1의 백신을 상기 백신이 필요한 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  17. 청구항 17에 있어서, 염증성 T 세포의 억제가 iTreg 세포들의 유도 및 자가 반응성 CD4+ 및 CD8+ T 세포들의 억제를 포함하는 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 RSV 항원성 펩티드가 F 당단백질, G 당단백질, 서열 목록 번호 4 (최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열), 서열 목록 번호 25 (최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열) 및 이들의 기능성 단편들로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대해 면역화된 피험체에서 백신 유도 질환의 치료 또는 예방 방법에 있어서, 청구항 1의 백신을 상기 백신이 필요한 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 피험체가 자연적 RSV에 감염되기 전에 포르말린 비활성화 RSV (FI-RSV) 또는 RSV 항원으로 면역화되는 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 RSV 항원성 펩티드가 F 당단백질, G 당단백질, 서열 목록 번호 4 (최적화된 아미노산의 RSV G 아미노산 서열), 서열 목록 번호 25 (최적화된 아미노산의 RSV F 아미노산 서열) 및 이들의 기능성 단편들로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 백신이 전기천공을 통해 투여되는 방법.
  23. 청구항 19에 있어서, 상기 전기천공 경로가 피내 및 근육내로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 청구항 19에 있어서, 상기 백신이 최소 침습 전기천공 장치로 전기천공되는 방법.
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