CN103239734A - 用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗。由DNA疫苗和亚单位疫苗组成;所述DNA疫苗为含有序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的重组表达载体;所述亚单位疫苗为序列表中序列2所示蛋白质。实验证明,本发明所提供的共免疫疫苗能增强免疫动物后的体液免疫反应,还能抑制过强的细胞免疫反应,有效抑制炎症反应,很好的保护哺乳动物的肺部组织及功能不因RSV的感染而被破坏。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗,特别涉及一种由DNA疫苗和亚单位疫苗共同组成的用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)属于副粘病毒科肺病毒属成员,为非节段性单股负链RNA病毒,分为A和B两个亚型。RSV病毒大小约120-300纳米,有包膜,由15222个核苷酸组成,编码10种主要蛋白,分别由三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M 2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NS1和NS2)构成。RSV是全世界范围内引起婴幼儿、免疫缺陷病人和老年人呼吸道感染、毛细支气管肺炎等急性下呼吸道感染的重要病原。美国1979~1997年的统计,每年因RSV感染导致下呼吸道疾病而住院和死亡的婴儿数分别为12.5万和450人,其中死亡率为2%。在我国,不但有RSV散发性感染,还发生过数次大规模爆性流行,2000~2002年间北京1402份婴幼儿患者中,有66.1%的病毒性呼吸道感染是由该病毒引起的。1985~1992年期间先后在我国广州、山西、北京、以及河北和天津等地形成了4次大流行。我国RSV流行主要以A亚型为主,但有的年份B亚型也可为主要优势株。因此,研制安全、有效的呼吸道合胞病毒疫苗是生命科学重大而急迫的问题。2001年世界卫生组织(WHO)已将开发安全有效的呼吸道合胞病毒疫苗列为21世纪需要优先解决的问题之一。
RSV疫苗的研制已有40多年的历史,但是至今仍然没有有效的、被批准使用的疫苗。目前研究的RSV疫苗主要包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗几大类。20世纪60年代研制的福尔马林灭活疫苗(FI-RSV),不仅不能预防RSV感染,反而再感染后使病情加重,甚至有的引起死亡,死者的肺组织内有T细胞浸润。通过对小鼠的研究已经确认FI-RSV诱生的T细胞亚群Th2-类细胞因子是加重病情的原因。随着FI-RSV疫苗研制的失败,人们开始通过人工诱变的方法构建减毒的RSV疫苗。从20世纪70年代至今,人工诱变RSV减毒株仍然没有应用于预防RSV的感染。人工诱变获得的减毒株存在较多的缺陷,并以遗传不稳定性为其主要缺点。亚单位疫苗和重组DNA疫苗是近年RSV疫苗研究的热点,主要以病毒表面糖蛋白F和G作为靶抗原。亚单位疫苗是将病毒抗原基因在大肠杆菌或酵母表达系统中进行蛋白质表达,提纯纯化后制成的。亚单位疫苗能够诱导较高水平的中和性抗体和保护抗体,降低RSV的感染率,但是由病毒引起的下呼吸道疾病的发病率没有明显的降低,这主要是由大量Th2型辅助性T细胞浸润肺部造成的。DNA疫苗又称核酸疫苗,它是将含有编码特定抗原蛋白质的基因序列克隆到合适的质粒载体上,制备成核酸表达载体,通过肌肉注射等方法将其导入机体内,通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,从而激发机体免疫系统产生针对外源蛋白质的特异性免疫应答反应。虽然DNA疫苗可以同时激发机体产生基于免疫球蛋白介导的的体液免疫反应和基于杀伤性T淋巴细胞介导的细胞免疫。但是其诱导的抗体水平,特别是中和抗体水平较低。虽然有研究报道,使用免疫增效剂可以在一定水平上提高DNA疫苗所激发的体液免疫反应,但是提升幅度有限。
因此,对于RSV疫苗的开发工作,特别是开发一种既能诱导较高水平抗体,又能降低疫苗免疫后肺部T淋巴细胞大量浸润的新型疫苗制剂已经成为了迫在眉睫的研究重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗。所述共免疫疫苗是由两种或两种以上疫苗混合而制成的疫苗。
本发明所提供的预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗由DNA疫苗和亚单位疫苗组成;所述DNA疫苗为表达序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的重组表达载体;所述亚单位疫苗为序列表中序列2所示蛋白质。
在实际应用中,所述DNA疫苗和所述亚单位疫苗的使用质量配比为如下a)或b)或c):
a)(1∶5)-(5∶1);
b)(1∶2)-(2∶1);
c)1∶1或1∶2或2∶1。
所述重组表达载体中启动所述序列表中序列2所示蛋白质的编码基因转录的启动子是T7启动子,其核酸序列为5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’。
在本发明的一个实施例中,所述重组表达载体具体为在proVAX质粒的多克隆位点插入序列表中序列2所示蛋白质的编码基因所得到的重组质粒;所述多克隆位点具体为EcoR I和Xba I。
在本发明的实施例中,在所述DNA疫苗中,序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的编码序列具体如序列表中序列1的第7-708位所示,所述DNA疫苗命名为proVAX/G;在所述亚单位疫苗中,序列表中序列2所示蛋白质由编码序列为序列表中序列3的第7-708位所示基因经原核表达得到,所述亚单位疫苗命名为His-G。在本发明的一个实施例中,进行所述原核表达的菌株具体为大肠杆菌BL21(DE3)。
其中,序列表中序列2由233个氨基酸组成。由序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质在真核细胞中的编码基因如序列表中序列1的第7-708位所示(对应所述DNA疫苗),序列1的第7-708位即为序列2所示蛋白质的编码序列。由序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质在原核细胞(如大肠杆菌)中的编码基因如序列表中序列3第7-708位所示(对应所述亚单位疫苗),序列3的第7-708位即为序列2所示蛋白质的编码序列。
上述预防和/或治疗合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗在制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述预防和/或治疗合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗在制备具有如下1)-8)中任一所述功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围:
1)提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性IgG抗体水平;
2)提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性中和抗体水平;
3)抑制哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性T淋巴细胞增殖;
4)诱导哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞的产生;所述调节性T细胞的表型为CD4+CD25-Foxp3+IL-10+;
5)降低哺乳动物的呼吸道合胞病毒的病毒载量;
6)抑制哺乳动物的炎症细胞的增殖;
7)降低呼吸道合胞病毒感染哺乳动物所产生的呼吸阻力;
8)降低呼吸道合胞病毒对哺乳动物肺部组织的损伤。
所述炎症细胞为如下细胞中的至少一种:嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞。
所述哺乳动物可为小鼠,在本发明的实施例中,所述小鼠具体为BALB/c小鼠。
实验证明,用本发明所提供的预防和/或治疗合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗按照如下方法免疫小鼠:第0、15和30天,每只小鼠分别前后三次肌肉注射proVAX/G与His-G的混合物(共100μl)。结果显示,本发明所提供的预防和/或治疗合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗(proVAX/G和His-G)能够提高呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性IgG抗体水平;提高呼吸道合胞病毒特异性中和抗体水平;抑制呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性T淋巴细胞增殖;诱导呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞(CD4+CD25-Foxp3+IL-10+)的产生;降低呼吸道合胞病毒的病毒载量;抑制炎症细胞(嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)的增殖;预防呼吸道合胞病毒感染产生呼吸阻力;预防呼吸道合胞病毒感染破坏肺部组织。
本发明与现有技术相比,其优点在于:
1、本发明将联合免疫技术应用于呼吸道合胞病毒疫苗的开发研究中。实验证明,本发明所提供的预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗不但能增强免疫动物后的体液免疫反应,同时还能抑制过强的细胞免疫反应,有效和特异性的抑制炎症相关反应。
2、本发明将呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G的基因进行了修饰,经过全基因密码子优化,在大肠杆菌原核表达系统中成功高效表达,并且通过亲和层析的方法,方便、大量的获得了G蛋白抗原。为新型RSV疫苗的研究开发指出了新的方向。
3、本发明的新型疫苗,技术成熟,成本低,无副作用,易于推广。
附图说明
图1为proVAX/G转入BHK细胞后反转录PCR检测结果。其中,泳道1代表转染proVAX/G的BHK细胞,泳道2代表转染proVAX空载体的BHK细胞,泳道3代表未转染质粒的BHK细胞。
图2为SDS-PAGE电泳检测重组蛋白(G蛋白)在大肠杆菌中的表达及纯化结果。其中,A中泳道M为蛋白marker;泳道1是无诱导下E.coli BL21(DE3)裂解液;泳道2是在IPTG 0.5mM诱导下E.coli BL21(DE3)裂解液;泳道3是无诱导下BL21(DE3)/pET-28a(+)裂解液;泳道4是在IPTG 0.5mM诱导下BL21(DE3)/pET-28a(+)裂解液;泳道5是无诱导下BL21(DE3)/pET-28a(+)-G裂解液;泳道6是在IPTG 0.5mM诱导下E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-G菌体裂解后的总蛋白(可溶性蛋白加包涵体蛋白);泳道7是BL21(DE3)/pET-28a(+)-G裂解液上清经过镍柱纯化后的蛋白。B中泳道M为蛋白marker;泳道8是IPTG 0.5mM诱导下BL21(DE3)/pET-28a(+)-G裂解液上清(可溶性蛋白);泳道9是IPTG 0.5mM诱导下BL21(DE3)/pET-28a(+)-G裂解液的沉淀物(包涵体蛋白)。
图3为Western Blot检测重组蛋白(G蛋白)的抗原性。其中,泳道1为可溶性蛋白;泳道2为包涵体蛋白;泳道3为纯化后的重组蛋白His-G。
图4为ELLISA检测联合免疫后小鼠的IgG抗体水平检测。A中,以紫外灭活RSV作为ELISA包被抗原,1表示PBS对照组(组1);2表示FI-RSV组(组2);3表示DNA疫苗组(proVAX/G,组3);4表示亚单位疫苗组(His-G,组4);5表示亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5);6表示DNA疫苗加无关蛋白组(proVAX/G+OVA,组6);7表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1∶1共免疫组(proVAX/G+His-G,组7)。B中,以原核表达产物His-G作为ELISA检测抗原,1表示PBS对照组(组1);7表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1∶1共免疫组(proVAX/G+His-G,组7)8表示DNA疫苗组加亚单位疫苗2∶1共免疫组(组8),9表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1∶2共免疫组(组9)。
图5为联合免疫抑制抗原特异性细胞免疫反应的T淋巴细胞扩增的检测结果。其中,1表示阳性对照组(小鼠细胞,PMA+Ion刺激);2表示阴性对照组(小鼠细胞,BSA刺激);3表示PBS对照组(组1);4表示DNA疫苗组(proVAX/G,组3);5表示亚单位疫苗组(His-G,组4);6表示亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5);7表示DNA疫苗加无关蛋白组(proVAX/G+OVA,组6);8表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1∶1共免疫组(proVAX/G+His-G,组7);9表示DNA疫苗组加亚单位疫苗2∶1共免疫组(组8);10表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1∶2共免疫组(组9)。
图6为流式细胞仪检测联合免疫后抗原特异性调节性T细胞iTreg(CD4+CD25-Foxp3+IL-10+)的产生情况。其中,A为流式细胞检测结果,A1为PBS对照组(组1);A2为DNA疫苗组(proVAX/G,组3);A3为亚单位疫苗组(His-G,组4);A4为亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5);A5为DNA疫苗加无关蛋白组(proVAX/G+OVA,组6);A6为DNA疫苗组加亚单位疫苗1∶1共免疫组(proVAX/G+His-G,组7);A1-A6中右上角的数值表示Foxp3+和IL-10+占CD4+CD25-iTreg细胞的百分含量。B为CD4+/CD25-的T细胞中Foxp3+IL-10+表型的百分含量的柱状图,具体的,1表示PBS对照组(组1);2表示DNA疫苗组(proVAX/G,组3);3表示亚单位疫苗组(His-G,组4);4表示亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5);5表示DNA疫苗加无关蛋白组(proVAX/G+OVA,组6);6表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1∶1共免疫组(proVAX/G+His-G,组7)。
图7为RSV病毒攻击免疫后小鼠,小鼠肺部冲洗液炎症相关细胞的数量分析。其中,A为嗜酸性粒细胞;B为单核细胞;C为淋巴细胞;D为总细胞。A-D中1均表示没有攻毒的小鼠;2均表示PBS对照组(组1);3均表示FI-RSV组(组2);4均表示DNA疫苗组(proVAX/G,组3);5均表示亚单位疫苗组(His-G,组4);6均表示亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5);7均表示DNA疫苗加无关蛋白OVA对照组(proVAX/G+OVA,组6);8均表示DNA疫苗加亚单位疫苗1∶1共免疫组(proVAX/G+His-G,组7)。
图8为RSV病毒攻击免疫后小鼠,小鼠肺功能检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、DNA疫苗的制备
呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G(简称G蛋白)经过真核细胞密码子优化后,通过全基因合成的方法获得。将含有呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G编码基因的DNA片段(如序列表中序列1所示,其中第7-708位为G蛋白的编码序列,编码序列表中序列2所示蛋白)用限制性内切酶EcoR I和Xba I酶切,连接到经相同酶切的真核表达载体proVAX(Xiaogang Du,Guoxing Zheng,Huali Jin,Youmin Kang,Junpeng Wang,ChongXiao,Shuo Zhang,Mingyu Liu,Lin Zhao,Aoshuang Chen and Bin Wang.The adjuvanteffects of co-stimulatory molecules on cellular and memory responses to HBsAg DNAvaccination.J.Gene Medicine,2007;9:136-146.)上,形成重组质粒。将所得重组质粒用限制性内切酶EcoR I和Xba I酶切后,经琼脂糖凝胶电泳得到大小约为708bp目的片段,和大小约为3600bp的载体片段,与预期结果相一致。通过测序进一步证实所得到的重组质粒已经成功插入呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G的编码基因,将其命名为proVAX/G。proVAX/G中,由T7启动子驱动呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G编码基因的转录。质粒纯化使用德国Qiagen公司去内毒素质粒大量提取试剂盒(EndoFreePlasmid Giga kit)按其说明书进行提取,获得所述重组质粒proVAX/G即为DNA疫苗。
使用invitrogen公司的LipofectamineTM2000试剂将上述制备所得的proVAX/G转染到真核细胞BHK细胞(ATCC)中:BHK细胞消化后计数,稀释至107个细胞/mL,加入1块24孔板细胞培养板中,2mL/孔。37℃,5%CO2培养24小时。待细胞长至汇合度约70%-80%时,将细胞用无血清培养基洗三次,加入无血清的新鲜RPMI-1640培养基待转染。用RPMI-1640培养基溶解质粒,调节其浓度为1μg/μl,与LipofectamineTM2000混合充分,转染具体操作见LipofectamineTM2000说明书。未转染质粒的BHK细胞为空白对照组。培养24-48h后,将细胞用胰蛋白酶消化后,收集到EP管中,2000rpm离心10min,弃上清,提取细胞总RNA,反转录成cDNA,通过PCR扩增,验证了目的基因表达,PCR扩增所用引物为5’-CCGGAATTCATGCATAAGGTGACTCCTA-3’和5’-GCTCTAGATTACTGCCGTGGGGTGTTT-3’。
结果如图1所示,转染了proVAX/G的BHK细胞中检测到大小约为700bp的目的条带(G蛋白的编码序列);而转染了proVAX空载体的BHK细胞以及未转染质粒的BHK细胞均未检测到目的条带。
以上技术的详细描叙可在Sambrook等人的″Molecular Cloning″(第二版1998,ColdSpring Harbor Laboratory Press,纽约)和厉朝龙等编,《生物化学与分子生物学实验技术》浙江大学出版社查寻。
实施例2、亚单位疫苗的制备
呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G经过大肠杆菌细胞密码子优化后,通过全基因合成的方法获得。将含有呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G编码基因的DNA片段(如序列表中序列3所示,其中第7-708位为G蛋白的编码序列,编码序列表中序列2所示蛋白)用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切,连接到经相同酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,形成重组质粒。将所得重组质粒用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切后,经琼脂糖凝胶电泳得到大小约为708bp目的片段,和大小约为5400bp的载体片段,与预期结果相一致。通过测序进一步证实所得到的重组质粒已经成功插入呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G的编码基因,将其命名为pET-28a(+)-G。
用pET-28a(+)-G转化大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3),转化后的菌株命名为BL21(DE3)/pET-28a(+)-G(同时设置转化pET-28a(+)空载体的BL21(DE3)对照,转化后的菌株命名为BL21(DE3)/pET-28a(+))。使用异丙基巯基半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)表达,诱导的具体条件为:挑取过夜生长的单菌落,接种于LB培养基中,37℃震荡培养至对数生长期(OD600=0.5),加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,于37℃诱导4小时。
将在上述条件下诱导所得的菌体(BL21(DE3)/pET-28a(+)-G和BL21(DE3)/pET-28a(+))裂解后,进行SDS-PAGE电泳检测(同时设置未诱导的对照),具体操作如下:使用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗菌体3次,10000rpm离心5分钟回收菌体沉淀,使用小体积PBS重悬菌体,超声裂解,取出少量裂解物SDS-PAGE检测上样备用,其余裂解物13000rpm离心10分钟,将上清吸入另一个管中(可溶性蛋白),沉淀物中加入等体积的PBS(包涵体蛋白),重悬。取等量上清和沉淀SDS-PAGE检测。结果如图2中A和B所示,转化了重组质粒pET-28a(+)-G的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃、0.5mM IPTG诱导4h可以得到大量原核表达的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G(约35kDa)。
用Western Blot方法鉴定上述原核表达产物的抗原性是否与天然蛋白一致。具体方法为:将上述样品经SDS-PAGE电泳分离后,转移到PVDF膜上,使用5%脱脂奶粉封闭过夜,一抗使用商业化山羊抗RSV多克隆抗体(美国Meridian公司),二抗使用牛抗羊HRP(美国Santa Cruz公司)。检测结果如图3所示,上述原核表达产物,无论是上清中的可溶性蛋白(图3泳道1),沉淀中的包涵体蛋白(图3泳道2)均可以与商业化山羊抗RSV多克隆抗体(美国Meridian公司)杂交产生反应,显示大小一致的目的条带(约35kDa),可见上述原核表达产物与天然蛋白具有一致的抗原性。
将经过SDS-PAGE和Western Blot鉴定的原核表达产物(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)进行亲和层析纯化,具体方法为:将超声后的上清过填充有His-tag亲和纯化树脂的层析柱,待目的蛋白与树脂结合后,加入200mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白。SDS-PAGE鉴定结果(图2A中第7泳道)表明,经亲和层析纯化后,所述原核表达产物(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)目的条带单一,有效的去除了杂蛋白;WesternBlot鉴定结果(图3中第3泳道)显示经亲和层析纯化后,所述原核表达产物(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)仍保留有与天然蛋白G相一致的抗原性。纯化后的原核表达产物(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)即为亚单位疫苗,命名为His-G。
实施例3、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物后的抗体水平检测
一、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物的实验
模式动物:6-8周龄雌性BALB/c小鼠,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,为清洁级,分9组,每组5只。
免疫用疫苗及对照:PBS、作为灭活病毒疫苗的代表福尔马林灭活疫苗FI-RSV(107TCID50RSV病毒(美国ATCC,catalog no.VR-26TM,经甲醛72小时37℃反应后,利用50000g高速离心1小时纯化制得)、DNA疫苗proVAX/G、亚单位疫苗His-G、DNA疫苗的空载体对照proVAX与亚单位疫苗His-G的等质量混合物、DNA疫苗proVAX/G与无关蛋白的卵白蛋白OVA(Sigma公司产品)的等质量混合物、发明技术组(共免疫)DNA疫苗proVAX/G与亚单位疫苗His-G的等质量混合物,及DNA疫苗与亚单位疫苗按照质量计配比为2∶1和1∶2的混合物。
实验分组及各组的免疫情况见表1。每种疫苗或对照溶解在PBS中,分别于第0天,15天和30天注射3针,每只小鼠每次肌肉注射100微升。
表1DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫小鼠的实验分组及各组的免疫情况
组别 | 第一次免疫 | 第二次免疫 | 第三次免疫 |
1 | 100μl PBS | 100μl PBS | 100μl PBS |
2 | 50μl FI-RSV+50μl PBS | 50μl FI-RSV+50μl PBS | 50μl FI-RSV+50μl PBS |
3 | 100μg proVAX/G | 100μg proVAX/G | 100μg proVAX/G |
4 | 100μg His-G | 100μg His-G | 100μg His-G |
5 | 100μg proVAX+100μg His-G | 100μg proVAX+100μg His-G | 100μg proVAX+100μg His-G |
6 | 100μg proVAX/G+100μg OVA | 100μg proVAX/G+100μg OVA | 100μg proVAX/G+100μg OVA |
7 | 100μg proVAX/G+100μg His-G | 100μg proVAX/G+100μg His-G | 100μg proVAX/G+100μg His-G |
8 | 200μg proVAX/G+100μg His-G | 200μg proVAX/G+100μg His-G | 200μg proVAX/G+100μg His-G |
9 | 100μg proVAX/G+200μg His-G | 100μg proVAX/G+200μg His-G | 100μg proVAX/G+200μg His-G |
二、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物后的抗体水平检测
在上述步骤一末次免疫后第7天,用ELISA法检测各组小鼠血清中的IgG抗体水平。具体操作如下:
1、血清分离:将采集到的血液置于37℃温箱放置2小时,待凝集后,置于离心机中,3000rpm离心10分钟,彻底分离血清后,将血清小心吸出,置于-80℃保存。
2、ELISA检测:以紫外线灭活的RSV病毒(美国ATCC,catalog no.VR-26TM)或实施例2纯化后所得的原核表达产物(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)His-G包被96孔酶标板,其中,病毒的包被浓度为2.5μg/ml,蛋白的包被浓度为5μg/ml;4℃过夜,3%牛血清白蛋白37℃封闭2h;PBST(将吐温20溶于PBS,使吐温20的终浓度为0.05%)洗涤4次;将小鼠血清按2倍梯度稀释,37℃孵育1h;PBST洗涤4次,每次5分钟;加羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgG抗体(Sigma)(按1∶4000稀释),37℃孵育1h。每孔加入底物TMB,37℃避光显色5-15min,每孔加入50μl终止液(2mol/LH2SO4)终止显色,置于450nm/620nm测定每孔光密度值。各组中每只小鼠每个稀释度的血清设置3个复孔。同时以未经注射的健康小鼠的血清作为阴性对照。
3、计算抗体滴度:根据上述步骤2所测得的数值,计算出抗体滴度。具体的计算方法为:实验组和阴性对照组光吸收比值≥2.0时最大的血清稀释倍数。所述实验组是指上述表1中组2-组9中的任一组。
结果如图4所示:PBS对照组(组1)小鼠血清中的IgG水平最低,表明基本上不具备免疫效果;FI-RSV作为阳性对照组(组2),产生了较高的IgG水平;DNA疫苗组(组3)和亚单位疫苗组(组4)以及DNA疫苗和亚单位疫苗1∶1共免疫组(组7)均产生一定水平的IgG,并且亚单位疫苗组(组4)和DNA疫苗和亚单位疫苗1∶1共免疫组(组7)产生的IgG水平高于DNA疫苗组(图4中A)。DNA疫苗和亚单位疫苗的使用质量配比在1∶1(组7)、2∶1(组8)和1∶2(组9)产生的IgG水平差异不显著(图4中B)。
上述结果表明,呼吸道合胞病毒DNA疫苗和亚单位疫苗共免疫(组7-9)能够诱导机体产生很高的体液免疫反应。
实施例4、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物后的中和抗体水平检测
一、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物的实验
不设置DNA疫苗和亚单位疫苗的使用质量配比为2∶1(组8)和1∶2(组9),其余同实施例3的步骤一。
二、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物后的中和抗体水平检测
在上述步骤一末次免疫后第7天,按照实施例3步骤二的方法分离小鼠血清,将得到的血清过滤除菌后,按2倍梯度进稀释,取100μl稀释过的血清与75μl的RSV病毒(3×103TCID50)混合,将混合物加入每孔铺有5×104个Hep-2细胞(ATCC,产品目录号CCL-23)的96孔细胞培养板。步骤一7个免疫组各组中每只小鼠每个稀释度的血清设置3个复孔。同时设置只加75μl的RSV病毒的阳性对照。在37℃5%CO2的条件下培养3天后,将细胞固定。ELISA法检测不同孔中病毒的载量。在450nm/620nm测定出每孔光密度值后,以低于阳性对照OD450/OD620数值的1/2所对应的最大稀释度作为该组的中和抗体滴度。
7个免疫组小鼠血清的中和抗体滴度详见表2(对不同免疫组小鼠血清中和抗体数值取1g的对数)。其中,PBS对照组(组1)中和抗体水平最低,表明基本没有中和抗体产生;DNA疫苗组(组3)和DNA疫苗加无关蛋白组(组6)虽可以产生中和抗体,但是与FI-RSV对照组(组2),亚单位疫苗组(组4)和亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G)(组5),以及DNA疫苗加亚单位疫苗1∶1共免疫组(组7)相比,中和抗体水平较低;FI-RSV对照组(组2)产生的中和抗体水平最高,其他包含有His-G抗原的免疫组(组4、5、7)次之,说明His-G抗原可以诱发机体产生较高水平的中和抗体。
表2小鼠血清的中和抗体滴度
组别 | 抗原 | 中和抗体滴度 |
1 | PBS对照 | 0.418±0.052 |
2 | FI-RSV | 3.710±0.036 |
3 | proVAX/G | 1.867±0.089 |
4 | His-G | 3.354±0.026 |
5 | proVAX+His-G | 3.454±0.038 |
6 | proVAX/G+OVA | 1.935±0.046 |
7 | proVAX/G+His-G | 3.463±0.042 |
实施例5、共免疫抑制呼吸道合胞病毒疫苗细胞免疫反应的T淋巴细胞扩增的检测
一、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物的实验
不设置FI-RSV组(组2),其余同实施例3的步骤一。
二、联合免疫抑制呼吸道合胞病毒疫苗细胞免疫反应的T淋巴细胞扩增的检测
在上述步骤一末次免疫后第7天处死小鼠,在无菌条件下,取小鼠脾脏,研碎,用红细胞裂解液除去红细胞,并过尼龙柱除去B细胞制成单细胞悬液(T淋巴细胞),PBS液洗3次,离心并进行细胞计数,用1640培养基调整细胞浓度到1×106个/ml,每组细胞悬液分3份加入96孔培养板中,每孔细胞总数为4×105个。其中一份(组1-组7小鼠细胞)加实施例2制备所得的G抗原(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)至终浓度为5μg/ml(实验组),一份(小鼠细胞)加终浓度为0.1μg/ml PMA(佛波酯)和1μg/ml Ion(离子霉素)(阳性对照),一份(小鼠细胞)加BSA至终浓度为2μg/ml(阴性对照),培养48h后,每孔加入20μl的MTT(四甲基偶氮唑盐),培养4h后,2000rpm离心5分钟,弃细胞上清,添加100μL DMSO(二甲基亚砜),37℃温箱放置15分钟后,酶标仪读取490nm处的OD值,计算刺激指数(stimulated index,SI),SI=(实验组OD-培养基OD)/(细胞OD-培养基OD)。其中,实验组OD是指G抗原刺激的细胞读取的OD值;培养基OD是指培养基读取的OD值;细胞OD是指未经G抗原刺激的细胞(阴性对照)读取的OD值。
结果如图5,PMA+Ion和BSA各是5只小鼠的平均值±标准差,其它组为5只实验组内小鼠的平均值±标准差;*表示P<0.05所示,由于PMA+Ion具有强烈的刺激T细胞的效应,通常已经远远超过了常规的或新型的抗原的刺激效应,因此作为阳性对照的PMA+Ion表现出最强的刺激T细胞的效应;BSA的阴性对照组和PBS对照组基本上刺激T细胞的效应很低,表明以上物质如果不联合抗原,几乎不能对T细胞产生明显的刺激;DNA疫苗组(proVAX/G,组3)和DNA疫苗加无关蛋白OVA对照组(proVAX/G+OVA,组6)均产生高水平的刺激T细胞的效应,这表明DNA疫苗(proVAX/G)具有较强的细胞免疫效果,并且OVA基本上未产生明显的抑制免疫效果。另外,亚单位疫苗组(His-G,组4)和亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5)均产生相对较低的刺激T细胞的效应。DNA疫苗加亚单位疫苗质量比1∶1共免疫组(组7)刺激T细胞的效应最弱(P<0.001),DNA疫苗加亚单位疫苗质量比1∶2(组9)共免疫组次之,DNA疫苗加亚单位疫苗质量比2∶1(组8)表现出一定的刺激T细胞的效应,说明这一配比抑制效应不完全。这一结果说明共免疫疫苗可以有效抑制抗原特异性的细胞免疫反应,且DNA疫苗和亚单位疫苗质量配比为1∶1(组7)时最佳。
实施例6、流式细胞仪检测联合免疫后抗原特异性调节性T细胞iTreg(CD4+CD25-Foxp3+IL-10+)的产生情况
一、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物的实验
不设置DNA疫苗和亚单位疫苗的使用质量配比为2∶1(组8)和1∶2(组9),其余同实施例3的步骤一。
二、流式细胞仪检测联合免疫后抗原特异性调节性T细胞iTreg(CD4+CD25-Foxp3+IL-10+)的产生情况
在上述步骤一末次免疫后第7天处死小鼠,按实施例5步骤二的方法得到T淋巴细胞。将2×106个T淋巴细胞放入15mL离心管中,2000rpm离心5分钟,弃上清,加入50μl PBS重新悬浮细胞,加入终浓度为0.5mg/ml的抗Fcγ抗体(eBioscience公司,美国,cat.14-0161-81)4℃封闭15min,PBS洗3次,抗CD4-FITC,抗CD25-PE抗体,抗IL-10-PE-Cy5-抗体和抗Foxp3-APC抗体(eBioscience公司)4℃染色30min,PBS洗3次,流式细胞仪检测。
iTreg(CD4+CD25-Foxp3+IL-10+)的产生情况如图6所示:PBS对照组(组1),DNA疫苗组(proVAX/G,组3)和DNA疫苗加无关蛋白OVA对照组(proVAX/G+OVA,组6),亚单位疫苗组(His-G,组4)和亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5)诱导出的iTreg(CD4+CD25-Foxp3+IL-10+)数量很少,基本上属于机体本底水平存在的iTreg;相比于以上组合,DNA疫苗加亚单位疫苗1∶1共免疫组(proVAX/G+His-G,组7)诱导出的iTreg数量最多(P<0.001)。
上述结果表明,共免疫呼吸道合胞病毒DNA疫苗和亚单位疫苗能够很好的诱导抗原特异性调节性T细胞的产生。
实施例7、RSV病毒攻击免疫后小鼠,小鼠肺病毒载量检测
一、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物的实验
不设置DNA疫苗和亚单位疫苗的使用质量配比为2∶1(组8)和1∶2(组9),其余同实施例3的步骤一。
二、RSV病毒攻击免疫后小鼠,小鼠肺病毒载量检测
在上述步骤一末次免疫后第7天,按照5×105TCID50每只小鼠的病毒量,通过滴鼻使小鼠感染RSV病毒,5天之后将小鼠处死,取肺组织,匀浆后,使用TCID50滴定法检测小鼠肺部病毒载量。具体操作如下:在离心管中将病毒液作连续10倍的稀释,从10-1到10-10;将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中,每一稀释度接种一纵排共8孔,每孔接种100μl;在每孔加入细胞悬液100μl,使细胞量达到2×105~3×105个/ml,设正常细胞对照,正常细胞对照作两纵排,即100μl生长液+100μl细胞悬液。逐日观察并记录结果,一般需要观察5-7天;按Karber法计算结果。
小鼠肺部病毒载量如表3所示,PBS对照组(组1)小鼠肺部病毒载量最高,说明在没有先前注射疫苗保护的情况下,实验动物出现了比较严重的病毒感染;DNA疫苗组(proVAX/G,组3)和DNA疫苗加无关蛋白OVA对照组(proVAX/G+OVA,组6)较PBS对照组(组1)病毒载量有一定水平的下降,但是仍然处于较高水平,说明这两种疫苗对小鼠的保护能力有限;FI-RSV对照组病毒载量最低,DNA疫苗和亚单位疫苗1∶1共免疫组(组7)的病毒载量次之;这一结果与实施例3中小鼠血清中的IgG抗体水平(图4)相比,各组之间的趋势恰相反,这表明疫苗诱发机体产生的抗体(IgG)水平的强弱直接与病毒感染后的病毒清除相关。
表3小鼠肺部病毒载量
组别 | 抗原 | 病毒载量 |
1 | PBS对照 | 5.107±0.0994 |
2 | FI-RSV | 1.543±0.1233 |
3 | proVAX/G | 3.790±0.2479 |
4 | His-G | 2.217±0.3005 |
5 | proVAX+His-G | 2.023±0.1468 |
6 | proVAX/G+OVA | 3.300±0.2887 |
7 | proVAX/G+His-G | 1.850±0.1041 |
实施例8、RSV病毒攻击免疫后小鼠肺部冲洗液炎症相关细胞的数量检测
一、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物的实验
不设置DNA疫苗和亚单位疫苗的使用质量配比为2∶1(组8)和1∶2(组9),其余同实施例3的步骤一。
二、RSV病毒攻击免疫后小鼠肺部冲洗液炎症相关细胞的数量检测
在上述步骤一末次免疫后第7天,按照5×105TCID50每只小鼠的病毒量,通过滴鼻使小鼠感染RSV病毒,5天之后将小鼠处死,使用瑞氏-吉姆萨染色法,分析肺灌洗液中炎症相关细胞的组成情况(同时设置没有攻毒的小鼠作为阴性对照)。具体操作如下:用1ml PBS冲洗小鼠肺部,将冲洗液离心以获得细胞,然后使用小体积PBS重悬细胞,使用瑞氏-吉姆萨染液对细胞染色后,镜检观察并计数。其中,嗜酸性粒细胞被染成桔红色,单核细胞被染成灰蓝色,淋巴细胞被染成淡蓝色。总细胞为能够观察到的所有细胞。
结果如图7所示:没有攻毒的小鼠(阴性对照组)肺部灌洗液中无论是嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞还是总细胞的数量都很少,说明肺部没有明显的炎症反应;PBS对照组(组1),FI-RSV组(组2),DNA疫苗组(proVAX/G,组3)和DNA疫苗加无关蛋白OVA对照组(proVAX/G+OVA,组6),亚单位疫苗组(His-G,组4)和亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5)小鼠肺灌洗液中炎症细胞的数量较多。其中FI-RSV组(组2),亚单位疫苗组(His-G,组4)和亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5)炎症细胞的数量甚至多于PBS对照组(组1),这是该类型疫苗所诱发的典型的炎症增强症状;相比于以上组合,DNA疫苗加亚单位疫苗1∶1共免疫组(组7)小鼠肺灌洗液中炎症细胞的数量明显降低(P<0.05)。说明共免疫可以有效抑制炎症相关反应的发生。
实施例9、RSV病毒攻击免疫后小鼠肺功能检测
一、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物的实验
不设置DNA疫苗和业单位疫苗的使用质量配比为2∶1(组8)和1∶2(组9),其余同实施例3的步骤一。
二、RSV病毒攻击免疫后小鼠肺功能检测
在上述步骤一末次免疫后第7天,按照5×105TCID50每只小鼠的病毒量,通过滴鼻使小鼠感染RSV病毒,5天之后使用呼吸机(AniRes2005,北京贝兰博科技有限公司产品)分析小鼠肺部呼吸阻力情况(同时设置没有攻毒的小鼠作为阴性对照)。具体操作请见产品说明。呼吸阻力越高,表明小鼠肺功能越差;相反,呼吸阻力越小,表明肺功能越好。
呼吸阻力检测结果如图8所示:在5个计量梯度的氯化乙酰胆碱的刺激下,没有攻毒的小鼠(阴性对照组)肺部呼吸阻力都较弱,说明其肺功能较好。PBS对照组(组1),FI-RSV组(组2),DNA疫苗组(proVAX/G,组3)和DNA疫苗加无关蛋白OVA对照组(proVAX/G+OVA,组6),亚单位疫苗组(His-G,组4)和亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5)小鼠在氯化乙酰胆碱计量达到0.1mg的刺激时,肺部呼吸阻力激增。FI-RSV组(组2)呼吸阻力最大,亚单位疫苗组(His-G,组4)和亚单位疫苗加真核表达载体组(proVAX+His-G,组5)次之。以上结果说明没有疫苗保护或疫苗保护效果较弱的情况下,RSV病毒感染会破坏小鼠的肺功能;FI-RSV疫苗和亚单位疫苗组(His-G)会加剧这一情况的发生。DNA疫苗加亚单位疫苗1∶1共免疫组(组7)小鼠在受到不同计量氯化乙酰胆碱的刺激后,较其他注射组小鼠,呼吸阻力没有明显的上升(P<0.05),与未攻毒的小鼠(阴性对照组)类似,说明DNA疫苗加亚单位疫苗共免疫可以保护小鼠肺功能不被病毒破坏。
实施例10、RSV病毒攻击免疫后小鼠组织切片
一、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物的实验
不设置DNA疫苗和亚单位疫苗的使用质量配比为2∶1(组8)和1∶2(组9),其余同实施例3的步骤一。
二、RSV病毒攻击免疫后小鼠组织切片
在上述步骤一末次免疫后第7天,按照5×105TCID50每只小鼠的病毒量,通过滴鼻使小鼠感染RSV病毒,5天之后将小鼠处死,取肺组织切片,苏木精-伊红染色(H&E)后,观察小鼠肺部组织的病变情况(同时设置没有攻毒的小鼠作为阴性对照)。具体操作如下:将小鼠处死后,取肺组织,至于10%福尔马林中固定3-7天,经过脱水,石蜡包埋,切片,苏木精-伊红染色,封片几步后,在显微镜下观察。另外,对小鼠肺部病理进行打分,打分标准为:(1)细支气管周围和支气管浸润;(2)细支气管和细支气管腔渗出液;(3)血管周围浸润;(4)单核细胞数量;(5)薄壁组织肺炎。以上5种情况又各分为严重(4分),较重(3分),一般(2分),轻微(1分),具体参见RespiratorySyncytial Virus Induces Pneumonia,Cytokine Response,Airway Obstruction,and ChronicInflammatory Infiltrates A ssociated with Long-Term Airway Hyperresponsiveness in Mice。
结果如图9所示:未攻毒的小鼠(阴性对照组)肺部在血管周围和支气管周围没有明显的淋巴细胞浸润,支气管腔未见明显渗出液残留,未见薄壁组织肺炎,说明肺部没有病变的发生;PBS对照组(组1),FI-RSV组(组2),DNA疫苗组(proVAX/G,组3)和DNA疫苗加无关蛋白OVA对照组(proVAX/G+OVA,组6),亚单位疫苗组(His-G,组4)和亚单位疫苗加真核表达载体组(proVAX+His-G,组5)小鼠肺部均出现不同程度的病变。特别是FI-RSV组(组2),亚单位疫苗组(His-G,组4)和亚单位疫苗加真核表达载体组(proVAX+His-G,组5)的病变情况最严重(图9中的A);肺部病理打分(以上五方面打分总和)情况(图9中的B)显示,这3组的病变情况甚至高于PBS对照组,说明注射这类疫苗后,当机体再次遇到病毒感染,肺部会出现较严重的病理反应;与其他组相比,DNA疫苗加亚单位疫苗1∶1共免疫组(组7)小鼠肺部没有出现明显的病理反应,病理打分明显低于其他注射组(P<0.05)。说明DNA疫苗加亚单位疫苗共免疫对小鼠产生了较好的保护效果。
Claims (10)
1.预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗,由DNA疫苗和亚单位疫苗组成;所述DNA疫苗为表达序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的重组表达载体;所述亚单位疫苗为序列表中序列2所示蛋白质。
2.根据权利要求1所述的共免疫疫苗,其特征在于:所述DNA疫苗和所述亚单位疫苗的使用质量配比为如下a)或b)或c):
a)(1∶5)-(5∶1);
b)(1∶2)-(2∶1);
c)1∶1或1∶2或2∶1。
3.根据权利要求1或2所述的共免疫疫苗,其特征在于:所述重组表达载体中启动所述序列表中序列2所示蛋白质的编码基因转录的启动子是T7启动子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的共免疫疫苗,其特征在于:所述重组表达载体为在proVAX质粒的多克隆位点插入序列表中序列2所示蛋白质的编码基因所得到的重组质粒。
5.根据权利要求1-4中任一所述的共免疫疫苗,其特征在于:在所述DNA疫苗中,所述序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的编码序列如序列表中序列1的第7-708位所示。
6.根据权利要求1所述的共免疫疫苗,其特征在于:在所述亚单位疫苗中,序列表中序列2所示蛋白质由编码序列为序列表中序列3的第7-708位所示基因经原核表达得到。
7.根据权利要求6所述的共免疫疫苗,其特征在于:所述原核表达为在大肠杆菌中表达。
8.权利要求1-7中任一所述的共免疫疫苗在制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病产品中的应用。
9.权利要求1-7中任一所述的共免疫疫苗在制备具有如下1)-8)中至少一种功能的产品中的应用:
1)提高呼吸道合胞病毒特异性IgG抗体水平;
2)提高呼吸道合胞病毒特异性中和抗体水平;
3)抑制呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性T淋巴细胞增殖;
4)诱导呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞的产生;所述调节性T细胞的表型为CD4+CD25-Foxp3+IL-10+;
5)降低呼吸道合胞病毒的病毒载量;
6)抑制炎症细胞的增殖;
7)降低呼吸道合胞病毒感染所产生的呼吸阻力;
8)降低呼吸道合胞病毒对患者肺部组织的损伤。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述炎症细胞为如下细胞中的至少一种:嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。
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