KR20140077169A

KR20140077169A - 호흡기 세포 융합 바이러스에 대한 재조합 나노입자 ｒｓｖｆ 백신

Info

Publication number: KR20140077169A
Application number: KR1020147009538A
Authority: KR
Inventors: 게일 스미스; 잉윈 우; 마이클 마서리; 예 류
Original assignee: 노바백스, 인코포레이티드
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2014-06-23
Also published as: MX2014003777A; US20170319682A1; RU2014117068A; AU2013201495A1; CA2849471A1; BR112014007616A2; CN105381457A; SG11201400999VA; EP2760469A4; IL231637A0; WO2013049342A1; US20150306207A1; JP2014530010A; SG10201602434UA; US20150335730A1; HK1222125A1; EP2760469A1; CN104080476A; US20130122032A1; AU2013201495B2

Abstract

본 발명은 일반적으로 변형 또는 돌연변이 호흡기세포융합바이러스 융합(F) 단백질 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것으로, RSV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 백신들과 같은 면역원성 조성물들을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명은 야생형 RSV F 단백질과 비교하여 변형 또는 돌연변이 아미노산 서열들을 포함하는 재조합 RSV F 단백질을 제공한다. 일반적으로, 이런 변형 또는 돌연변이는 야생형 RSV F 단백질들과 비교하여 RSV F 단백질들의 발현을 증가시키고, 세포 독성을 감소 및/또는 면역원성을 강화시킨다. 특정 예시적 실시태양에서, RSV F 단백질들은 인간 RSV F 단백질들이다.

Description

호흡기 세포 융합 바이러스에 대한 재조합 나노입자 ＲＳＶＦ 백신{Recombinant Nanoparticle RSV F Vaccine for Respiratory Syncytial Virus}

본 발명은 일반적으로 RSV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 백신과 같은 면역성 조성물을 포함하는 변형 또는 돌연변이 호흡기세포융합바이러스(F) 단백질 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

호흡기세포융합바이러스(RSV)는 파라믹소바이러스 과의 뉴모바이러스 속의 일원이다. 인간 RSV(HRSV)는 어린이의 심각한 하기도 질환의 주요 원인이며 인간의 상당한 이환율과 사망률의 원인이 된다. RSV는 면역기능이 떨어진 성인과 노인의 질환의 중요 감염체로 인식된다. 자연적 감염 이후 감염된 숙주에서 RSV에 대한 불완전한 저항력 때문에, RSV는 어린 시절과 성인 동안 여러 번 감염될 수 있다.

이 바이러스는 바이러스 단백질과 단단하게 결합하여 뉴클레오캡시드를 형성하는 단일 가닥 음성극성 RNA로 구성된 게놈을 가진다. 바이러스 외피는 바이러스적으로 암호화된 구조 단백질(virally encoded structural protein)을 포함하는 원형질막 유도 지질 이중층으로 구성된다. 바이러스 중합효소는 비리온으로 채워지고 게놈 RNA를 mRNA로 전사한다. RSV 게놈은 3개의 세포막투과 단백질 F, G 및 SH, 2개의 기질 단백질, M 및 M2, 3개의 뉴클레오캡시드 단백질 N, P 및 L 및 2개의 비 구조 단백질, NS1 및 NS2를 암호화한다.

HRSV와 세포막들의 융합은 세포 표면에서 일어나는 것으로 생각되고 감염의 초기 단계 동안 바이러스 리보뉴클레오프로테인을 세포 세포질 속으로 전달하기 위한 필수적 단계이다. 이 과정은 감염된 세포들의 막과 인접한 세포들의 막의 융합을 촉진하여 특징적인 융합체를 형성하는 융합(F) 단백질에 의해 매개되며, 주요한 세포변성 효과이며 바이러스 확산의 다른 메커니즘이다. 따라서, 융합 활성의 중성화는 숙주 면역성에서 중요하다. 또한, F 단백질에 대항하여 개발한 단클론 항체들은 바이러스 감염성을 중성화하고 막 융합을 억제하는 것으로 나타났다(Calder et al, 2000, Virology 271: 122-131).

RSV의 F 단백질은 다른 파라믹소바이러스의 F 당단백질과 구조적 특징과 제한적이나, 현저한 아미노산 서열 동일성을 공유한다. F 단백질은 호모-올리고머로 결합되는 소포체(endoplasmic reticulum)에 있는 아스파라긴 상에 공동번역으로 당화되는 574개 아미노산의 불활성 전구체(F0)로 합성된다. 세포 표면에 도달하기 전에, FO 전구체는 프로테아제에 의해 N 말단으로부터 F2 및 C 말단으로부터 F1으로 절단된다. F2 및 F1 사슬은 하나 이상의 이황화 결합에 의해 공유결합되어있다.

면역친화력 정제된 전장 F 단백질들은 다른 전장 바이러스 막 당단백질에 의해 발견된 것들과 유사한 미셀 형태(또한 로제트로 간주됨)로 축적되는 것을 발견되었다(Wrigley et al, 1986, in Electron Microscopy of Proteins, VoI 5, p. 103-163, Academic Press, London). 전자현미경 아래에서, 로제트에 있는 분자들은 더 넓은 말단이 로제트의 중앙으로부터 멀어지게 돌출되는 역전된 원뿔 모양 막대(~70%) 또는 막대 사탕 모양(~30%) 구조로 보인다. 막대 입체적 상태는 융합 전 불활성 상태에 있는 F 당단백질과 관련이 있는 반면 막대 사탕 입체적 상태는 융합 후 활성 상태에 있는 F 당단백질과 관련이 있다.

전자현미경은 Calder et al., 2000, Virology 271 :122-131에 설명된 대로, 융합 전 및 융합 후(선택적으로 프리푸소제닉(prefusogenic) 및 푸소제닉(fusogenic)으로 나타냄) 입체적 형태를 구별하는데 사용될 수 있다. 융합 전 형상은 리포솜 결합 분석법에 의해 푸소제닉(융합 후) 입체적 형태와 구별될 수 있다. 또한, 융합 전 및 푸소제닉 형상은 RSV F 단백질의 융합 전 또는 푸소제닉 형태의 하나 또는 다른 하나 상에 존재하나 다른 형태상에 존재하지 않는 입체적 항원결정부위들을 특이적으로 인식하는 항체들(예를 들어, 단클론 항체들)을 사용하여 구별될 수 있다. 이런 입체적 항원결정부위들은 분자의 표면상에 있는 항원결합부위의 차별적인 노출 때문일 수 있다. 또한, 입체적 항원결정부위들은 직선 폴리펩타이드에서 연속적이지 않은 아미노산들의 병치상태로부터 발생할 수 있다.

F 전구체는 퓨린-유사 프로테아제에 의해 인식된 모티프(motifs)에 모두 선행하는 두 위치(위치 I, 잔기 109 이후 및 위치 II, 잔기 136 이후)에서 절단된다. 위치 II는 융합 펩타이드에 인접하고 두 위치에서 F 단백질의 절단이 막 융합을 위해 요구된다(Gonzalez-Reyes et al, 2001, PNAS 98(17): 9859-9864). 절단이 두 위치에서 완료될 때, 원뿔 모양으로부터 막대 사탕 모양 막대로의 전이가 있다고 생각된다.

상기한 문제들을 해결하는 것이다.

본 명세서에 기술한 대로, 본 발명자들은 융합(F) 단백질의 발현의 놀랍게 높은 수준은 특정 변형들이 RSV F 단백질의 구조에 가해질 때 성취될 수 있다는 것을 발견하였다.

이런 변형들은 숙주 세포에서 RSV F 단백질의 세포 독성을 뜻밖에도 감소시킨다. 또한, 본 발명의 변형 F 단백질들은 융합 전 "막대" 형태와 반대로 융합 후 "막대 사탕" 형태를 나타내는 향상된 능력을 나타낸다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 변형 F 단백질들은 야생형 F 단백질들과 비교해서 향상된 면역원성을 나타낼 수 있다. 이런 변형들은 백신들의 개발 및 RSV의 치료 및/또는 예방을 위해 상기 백신들을 사용하는 방법에 대해 상당한 응용분야를 가진다. 본 발명은 야생형 RSV F 단백질들과 비교해서 증가된 발현, 감소된 세포 독성 및/또는 향상된 면역원성을 나타내는 재조합 RSV F 단백질들을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 야생형 RSV F 단백질들과 비교해서 변형 또는 돌연변이 아미노산 서열들을 포함하는 재조합 RSV F 단백질들을 제공한다. 일반적으로, 이런 변형 또는 돌연변이는 야생형 RSV F 단백질들과 비교해서 RSV F 단백질들의 발현을 증가시키고, 세포 독성을 감소시키고, 그리고/또는 면역원성을 향상시킨다. 특정한 예시적 실시태양에서, RSV F 단백질들은 인간 RSV F 단백질들이다.

RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질들(예를 들어, SEQ ID NO:2에 예시된 대로)과 비교해서 변형 또는 돌연변이 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 한 실시태양에서, RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 위치 P102에 해당하는 아미노산에서 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시태양에서, RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 위치 I379에 해당하는 아미노산에서 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시태양에서, RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 위치 M447에 해당하는 아미노산에서 변형 또는 돌연변이를 포함한다.

한 실시태양에서, RSV F 단백질은 상기한 위치들에 해당하는 아미노산들에서 둘 이상의 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시태양에서, RSV F 단백질은 상기한 위치들에 해당하는 아미노산들에서 세 개의 변형 또는 돌연변이를 포함한다.

한 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 위치 102에 있는 프롤린이 알라닌으로 대체된 RSV F 단백질들에 관한 것이다. 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 위치 379에 있는 아이소류신이 발린으로 대체된 RSV F 단백질들에 관한 것이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 위치 447에 있는 메티오닌이 발린으로 대체된 RSV F 단백질들에 관한 것이다. 특정 실시태양들에서, RSV F 단백질은 이런 구체적인 실시태양들에서 기술한 위치들에 해당하는 아미노산에서 둘 이상의 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 특정 실시태양들에서, RSV F 단백질은 이런 구체적인 실시태양들에서 기술한 위치들에 해당하는 아미노산에서 세 개의 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 예시적 실시태양에서, RSV 단백질은 SEQ ID NO:4에 기술된 아미노산 서열을 가진다.

한 실시태양에서, RSV F 단백질의 암호화 서열은 적절한 숙주 세포에서 이의 발현을 향상시키도록 더 최적화된다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 한 예시적 실시태양에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다.

한 실시태양에서, 코돈 최적화 RSV F 유전자의 암호화 서열은 SEQ ID NO:3이다. 다른 실시태양에서, 코돈 최적화 RSV F 단백질은 SEQ ID NO:4에 기술된 아미노산 서열을 가진다.

한 실시태양에서, RSV F 단백질은 F2의 잠재 폴리(cryptic poly)(A) 위치에서 적어도 하나의 변형을 더 포함한다. 다른 실시태양에서, RSV F 단백질은 주요(primary) 절단 위치(CS)에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 더 포함한다. 한 실시태양에서, RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2) 또는 코돈 최적화 RSV F 단백질(SEQ ID NO:4)의 위치 R133에 해당하는 아미노산에서 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시태양에서, RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2) 또는 코돈 최적화 RSV F 단백질(SEQ ID NO:4)의 위치 R135에 해당하는 아미노산에서 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2) 또는 코돈 최적화 RSV F 단백질(SEQ ID NO:4)의 위치 R136에 해당하는 아미노산에서 변형 또는 돌연변이를 포함한다.

한 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 위치 133에 있는 아르기닌이 글루타민으로 대체된 RSV F 단백질들에 관한 것이다. 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 위치 135에 있는 아르기닌이 글루타민으로 대체된 RSV F 단백질들에 관한 것이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 위치 136에 있는 아르기닌이 글루타민으로 대체된 RSV F 단백질들에 관한 것이다. 특정 실시태양들에서, RSV F 단백질은 이런 구체적인 실시태양들에서 기술한 위치들에 해당하는 아미노산에서 둘 이상의 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 특정 실시태양들에서, RSV F 단백질은 이런 구체적인 실시태양들에서 기술한 위치들에 해당하는 아미노산에서 세 개의 변형 또는 돌연변이를 포함한다. 예시적 실시태양에서, RSV 단백질은 SEQ ID NO:6에 기술된 아미노산 서열을 가진다.

다른 실시태양에서, RSV F 단백질은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 137-146에 해당하는 융합 도메인의 N-말단 절반에 결실을 더 포함한다. 한 예시적 실시태양에서, RSV F 단백질은 SEQ ID NO:8에 기술된 아미노산 서열을 가진다. 다른 실시태양에서, RSV F 단백질은 SEQ ID NO:10에 기술된 아미노산 서열을 가진다.

본 발명의 범위 내에 추가로 포함되는 것은 상기한 것에 해당하는 변형을 포함하는 인간 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2) 이외의 RSV F 단백질들이다. 이런 RSV F 단백질들은 인간 RSV의 A 균주, 인간 RSV의 B 균주, 소 RSV의 균주들 및 조류 RSV의 균주들로부터의 RSV F 단백질들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일부 실시태양들에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2에 의해 도시된 것과 같이, 야생형 RSV F 단백질들과 비교하여 숙주 세포에서 증가된 발현을 나타내는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질들에 관한 것이다. 다른 실시태양들에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2에 의해 도시된 것과 같이, 야생형 RSV F 단백질들과 비교하여 숙주 세포에서 감소된 세포 독성을 나타내는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질들에 관한 것이다. 또 다른 실시태양들에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2에 의해 도시된 것과 같이, 야생형 RSV F 단백질들과 비교하여 향상된 면역원성을 나타내는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질들에 관한 것이다.

추가 태양들에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술한 대로 하나 이상의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질들을 포함하는 면역원성 조성물들을 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질들로 구성된 미셀(예를 들어, RSV F 미셀)을 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자(VLP)를 제공한다. 일부 실시태양들에서, VLP는 하나 이상의 추가 단백질을 더 포함한다.

한 실시태양에서, VLP는 기질(M) 단백질을 더 포함한다. 한 실시태양에서, M 단백질은 RSV의 인간 균주로부터 유래된다. 다른 실시태양에서, M 단백질은 RSV의 소 균주로부터 유래된다. 다른 실시태양들에서, 기질 단백질은 인플루엔자 바이러스 균주로부터 유래된 M1 단백질일 수 있다. 한 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스 균주는 조류 인플루엔자 바이러스 균주이다. 다른 실시태양에서, M 단백질은 뉴캐슬병 바이러스(NDV) 균주로부터 유래된다.

추가 실시태양들에서, VLP는 RSV 당단백질 G를 더 포함한다. 다른 실시태양들에서, VLP는 RSV 당단백질 SH를 더 포함한다. 다른 실시태양에서, VLP는 RSV 뉴클레오캡시드 N 단백질을 더 포함한다.

변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질들은 RSV 감염의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 다른 태양에서, 본 발명은 RSV에 대항하여 면역반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 인간 또는 동물 피험자와 같은 피험자에게 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 조성물의 면역학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다.

다른 태양에서, 본 발명은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물을 제공한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 면역원성 제제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 적어도 1회 유효 복용량의 RSV F 미셀을 포함하는 면역원성 제제를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 적어도 1회 유효 복용량의 VLP를 포함하는 면역원성 제제를 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 백신 제제들의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 제제에 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 첨가하는 단계를 포함하여, 포유류에 대한 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대한 면역성을 유도하는 백신 또는 항원 조성물을 제제화하는 방법을 제공한다. 한 바람직한 실시태양에서, 감염은 RSV 감염이다.

본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질은 감염체에 대한 면역성 또는 실질적인 면역성을 제공하는 면역 반응을 자극하는 조성물들을 제조하는데 유용하다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 방법을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 RSV 바이러스 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대해 실질적인 면역성을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물들은 척추동물에 투여될 때 척추동물(예를 들어, 인간)에서 실질적인 면역성을 유도할 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 RSV 바이러스 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대해 실질적인 면역성을 유도하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 포유류에 보호-유도량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여 RSV에 대항하여 포유류를 백신 접종하는 방법을 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여 피험자의 감염 또는 적어도 하나의 증상에 대해 보호 항체 반응을 유도하는 방법을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 투여하는 단계를 포함하여 RSV 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대해 보호 세포 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀을 투여하는 단계를 포함하여 RSV 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대해 보호 세포 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여 RSV 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대해 보호 세포 반응을 유도하는 방법을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 한 예시적 실시태양에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 분리된 핵산은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:9로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 분리된 세포를 제공한다. 한 예시적 실시태양에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 분리된 핵산은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:9로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 한 예시적 실시태양에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 분리된 핵산은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:9로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 벡터는 바큘로바이러스 벡터이다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산을 발현하도록 숙주 세포를 변형하는 단계; 및 (b) 상기 RSV F 단백질의 생산에 도움이 되는 조건들 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 RSV F 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:9로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시태양에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 또 다른 실시태양에서, 숙주 세포는 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 바큘로바이러스 벡터로 트랜스펙트된 곤충 세포이다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산을 발현하도록 숙주 세포를 변형하는 단계; 및 (b) 상기 RSV F 단백질 미셀의 생산에 도움이 되는 조건들 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 RSV F 단백질 미셀을 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:9로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 한 예시적인 실시태양에서, 숙주 세포는 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 바큘로바이러스 벡터로 트랜스펙트된 곤충 세포이다.

한 양태에서, 본 발명은 RSV 융합 표면 당단백질(F) 나노입자 백신에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 백신은 전장 F 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 전장 F 단백질은 이황화물 연결 F1 및 F2 트라이머로 분열된다. 한 실시태양에서, F1 및 F2 트라이머는 약 20nm 내지 약 40nm의 지름을 가진 미셀로 존재한다.

다른 양태에서, 본 발명의 백신에 의해 생성된 항체가 제공된다.

또 다른 양태에서, 필요한 대상을 백신 접종하는 방법이 제공된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 대상에게 재조합 RSV 융합 당단백질(F) 나노입자 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 나노입자 백신은 전장 F 단백질을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 전장 F 단백질은 이황화물 연결 F1 및 F2 트라이머로 분열된다. 한 실시태양에서, F1 및 F2 트라이머는 약 20nm 내지 약 40nm의 지름을 가진 마이셀로 존재한다.

한 실시태양에서, 본 발명의 백신은 5㎍, 15㎍, 30㎍ 및 60㎍으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양으로 투여된다.

다른 양태에서, 필요한 대상을 백신 접종하는 방법이 제공된다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 대상에게 전장 F 단백질 및 항원보강제를 포함하는 재조합 RSV 융합 당단백질(F) 나노입자 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 항원보강제는 칼륨명반(Alum)이다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1은 야생형 HRSV F₀ 단백질의 구조 및 1차(SEQ ID NO: 32) 및 2차(SEQ ID NO: 33) 절단 위치를 도시한다.
도 2는 SEQ ID NOs:28(KKQKQQ), 29(GRRQQR), 30(RAQQ) 및 31(KKQKRQ)에 해당하는 실시예 3에 기술된 대로 절단 위치 돌연변이들을 가진 변형 RSV F₀ 단백질들의 구조들을 도시한다.
도 3은 변형 HRSV F 단백질 BV #541(SEQ ID NO:6)의 1차 절단 위치에서 보존성 치환(R133Q, R135Q 및 R136Q)을 도시한다.
도 4는 변형 HRSV F 단백질 BV #541(SEQ ID NO:6)의 서열과 구조를 도시한다.
도 5는 변형 HRSV F 단백질 BV #622(SEQ ID NO:10)의 서열과 구조를 도시한다.
도 6은 βME의 존재하에서 또는 βME 없이 정제된 재조합 HRSV F 단백질 BV #622의 SDS-PAGE 쿠마시 염색 겔을 도시한다.
도 7a는 RSV F 융합 도메인 돌연변이의 웨스턴 블럿 분석을 도시한다. 도 7b는 RSV F 융합 도메인 돌연변이를 면역염색하는 세포 표면 RSV F 단백질을 도시한다. 도 7c는 변형 HRSV F 단백질 BV #683(SEQ ID NO:8)의 구조를 도시한다. 도 7d는 부모 클론 BV#541(ㅿ0) 및 융합 도메인에 ㅿ2, ㅿ4, ㅿ6, ㅿ8 ㅿ10(BV#683) 결실을 가진 돌연변이를 도시한다. BV#541은 융합 도메인의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 6의 위치 137 내지 154를 포함하는 단백질을 포함한다. 결실 돌연변이의 융합 도메인 부분들의 아미노산 서열들은 SEQ ID NO: 6의 위치 139 내지 154(ㅿ2), SEQ ID NO: 6의 위치 141 내지 154(ㅿ4), SEQ ID NO: 6의 위치 143 내지 154(ㅿ6), SEQ ID NO: 8의 위치 145 내지 154(ㅿ8), SEQ ID NO: 6의 위치 147 내지 154(ㅿ10; BV#683), SEQ ID NO: 6의 위치 149 내지 154(ㅿ12), SEQ ID NO: 6의 위치 151 내지 154(ㅿ14) 또는 SEQ ID NO: 6의 위치 153 내지 154(ㅿ16)을 포함한다. SEQ ID NO: 6에서 위치 137-154에 해당하는 전체 융합 도메인은 ㅿ18 결실을 가진 돌연변이에서 결실된다.
도 8은 βME의 존재하에서 또는 βME 없이 정제된 재조합 HRSV F 단백질 BV #622 및 BV #683의 SDS-PAGE 쿠마시 염색 겔(왼쪽) 및 이들의 구조를 도시한다.
도 9는 βME의 존재하에서 또는 βME 없이 정제된 재조합 HRSV F 단백질 BV #683의 SDS-PAGE 쿠마시 염색 겔(왼쪽) 및 웨스턴 블럿(오른쪽) 분석을 도시한다.
도 10은 정제된 재조합 HRSV F 단백질 BV #683의 농도 분석기에 의한 순도 분석에 사용된 SDS-PAGE 쿠마시 염색 겔(왼쪽) 및 웨스턴 블럿(오른쪽)을 도시한다.
도 11은 음성 염색 전자 현미경에서 찍은 정제된 재조합 HRSV F 단백질 BV #683 미셀들(로제트)의 이미지들을 도시한다.
도 12a는 HRSV F 단백질 BV #683의 역상 HPLC 분석을 도시한다. 도 12b는 HRSV F 단백질 BV #683의 크기 배제 HPLC 분석을 도시한다. 도 12c는 HRSV F 단백질 BV #683 미셀들의 입자 크기 분석을 도시한다.
도 13은 30% 수크로오스 농도구배 분리에 의해 미정제 세포 배양 채취물(세포내) 또는 펠렛화된 샘플들에서 HRSV N 및 BRSV M 단백질들에 의한 공동 발현으로 또는 공동 발현 없이 변형 HRSV F 단백질 BV #622 및 BV #623(SEQ ID NO:21)의 SDS-PAGE 쿠마시-염색 겔(왼쪽)과 웨스턴 블럿(오른쪽) 분석 및 BV #622 및 BV #623의 구조를 도시한다.
도 14는 미정제 세포 배양 채취물(세포내) 샘플에서 HRSV N 및 BRSV M 단백질들에 의한 공동 발현으로 또는 공동 발현 없이 변형 HRSV F 단백질 BV #622, 이중 텐덤 키메릭 BV #636(BV # 541 + BRSV M), BV #683, BV #684(YIAL L-도메인을 가진 BV #541) 및 BV #685(YKKL L-도메인을 가진 BV #541)의 SDS-PAGE 쿠마시-염색 겔(왼쪽)과 웨스턴 블럿(오른쪽) 분석 및 각각의 분석된 변형 HRSV F 단백질의 구조를 도시한다.
도 15는 30% 수크로오스 농도구배 분리에 의해 펠렛화된 샘플들에서 HRSV N 및 BRSV M 단백질들에 의한 공동 발현으로 또는 공동 발현 없이 변형 RSV F 단백질 BV #622(SEQ ID NO:10), 이중 텐덤 키메릭 BV #636(BV # 541 + BRSV M), BV #683(SEQ ID NO:8), BV #684(YIAL L-도메인을 가진 BV #541) 및 BV #685(YKKL L-도메인을 가진 BV #541)의 SDS-PAGE 쿠마시-염색 겔(왼쪽)과 웨스턴 블럿(오른쪽) 분석 및 각각의 분석된 변형 HRSV F 단백질의 구조를 도시한다.
도 16a-d는 실시예 9에 기술된 대로 각각의 변형 RSV F 단백질에 대한 구조, 클론 네임, 설명, 웨스턴 블럿과 SDS-PAGE 쿠마시 결과 및 결론을 도시한다.
도 17은 실시예 10에 기술된 대로 RSV 면역성 검사 연구의 실험 절차를 도시한다.
도 18은 PBS, 생 RSV, FI-RSV, 1 ㎍ PFP, 1 ㎍ PFP + Alum, 10 ㎍ PFP, 10 ㎍ PFP + Alum, 30 ㎍ PFP 및 양성 대조군(항-F 양)으로 면역화된 생쥐의 31일 및 46일에서 RSV 중성화 분석법의 결과를 도시한다.
도 19는 감염성 RSV의 면역성 검사 후 4일에 PBS, 생 RSV, FI-RSV, 1 ㎍ PFP, 1 ㎍ PFP + Alum, 10 ㎍ PFP, 10 ㎍ PFP + Alum, 및 30 ㎍ PFP로 면역화된 생쥐의 폐 조직들에서 RSV 역가를 도시한다.
도 20은 0, 1, 2, 4 및 5주 동안 2 - 8℃에서 저장한 정제된 재조합 RSV F 단백질 BV #683의 쿠마시로 염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한다.
도 21은 생 RSV(RSV), 포르말린 불활성화 RSV(FI-RSV), 칼륨명반이 있는 및 없는 RSV-F 단백질 BV #683(PFP 및 PFP + 칼륨명반 항원 보강제) 및 PBS 대조군으로 면역화 이후 RSV A 및 RSV B 중성화 항체 반응들을 도시한다.
도 22는 생 RSV(RSV), 포르말린 불활성화 RSV(FI-RSV), 칼륨명반이 있는 및 없는 RSV-F 단백질 BV #683(F-미셀(30㎍) 및 F-미셀(30㎍) + 칼륨명반 항원보강제) 및 PBS 대조군으로 면역화된 생쥐들에서 RSV로 면역성 검사 이후 폐 병변을 도시한다.
도 23은 코튼랫들에서 RSV A에 대항하는 중성화 항체 반응들(y축, Log2 역가로 표현) vs. 다양한 백신접종 처리 그룹(x-축)을 나타내는 그래프이다. 각 그룹에 대한 선은 100% 중성화된 종점 역가의 기하학적 평균이다.
도 24는 코튼랫들에서 RSV A에 대항하는 중성화 항체 반응들(y축, Log2 역가로 표현) vs. 다양한 백신접종 처리 그룹(x-축)을 나타내는 그래프이다. 각 그룹에 대한 선은 100% 중성화된 종점 역가의 기하학적 평균이다.
도 25는 코튼랫들의 폐 바이러스 역가(log 10 pfu/조직의 그램) vs. 다양한 백신접종 처리 그룹(x-축)을 나타내는 그래프이다. 바이러스 역가들은 ±SEM으로 나타내어진다.
도 26a는 ELISA 유닛 vs. 백신접종 그룹을 나타내는 그래프이며, RSV F 백신, FI-RSV, 생 RSV 또는 PBS로 치료된 동물들에서 항체 생산을 위한 수단을 제공한다. 도 26b는 RSV-F IgG 역가에 의해 측정된 대로 각 백신 그룹에서 항체 생산을 나타내는 그래프이다. 도 26c는 각 백신접종 그룹에서 RSV에 대항하는 혈청 중성화 항체 역가를 도시하는 그래프이다. 도 26d는 각 백신접종 그룹으로부터 합쳐진 혈청으로부터 팔리비주맙 경쟁적 IgG 역가를 도시하는 그래프이다.
도 27은 본 발명의 나노입자 백신에 의한 처리 및 RSV에 의한 후속 면역성 검사 후 쥐들로부터 수확한 폐 조직의 대표적 현미경 사진이다.
도 28은 팔리비주맙 에피토프(SEQ ID NO: 35) 및 본 발명의 백신에 의해 생산된 항체들 사이의 결합 경쟁을 나타내는 그래프이다.
도 29a는 팔리비주맙 에피토프 펩타이드에 대한 다양한 농도의 Synagis® mAb의 결합을 나타내는 그래프이다. 도 29b는 재조합 RSV F 미셀에 대한 다양한 농도의 Synagis® mAb의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 30은 본 발명의 나노입자 백신들의 면역원성을 검사하기 위해 실행된 다양한 분석법들의 개요를 제공한다.
도 31은 본 발명의 백신으로 치료된 대상들로부터의 인간 혈청을 이용하는 ELISA 연구의 결과들을 나타내는 그래프이다.
도 32는 본 발명의 백신으로 치료된 대상들로부터의 인간 혈청에서 탐지된 항-RSV F(A) 및 항-RSV G(B) IgG를 나타내는 그래프이다.
도 33은 칼륨명반 처리 그룹들에 대한 항-RSV F IgG 수준에 기하학적 평균 배수 증가를 나타내는 그래프이다.
도 34는 다양한 시점, 본 발명의 나노입자 백신에 의한 처리 이전 또는 이후에 대상들에 대한 플라크 감소 중성화 역가를 나타내는 그래프이다.
도 35는 위약 및 30㎍ + 칼륨명반 그룹에서 0일, 30일 및 60일 PRNTs에 대한 역 누적 분포(reverse cumulative distribution)를 나타낸다.
도 36a는 RSV F에 대한 인간 혈청에서 항체들의 접착력을 평가하는데 사용된 BIAcore SPR-기초 항원 결합 분석법에 대한 양성 분석 대조군을 나타낸다. 도 36b는 양성 대조군 팔리비주맙과 비교한 0일 및 위약 대조군으로부터의 혈청에 대한 센서그램을 나타낸다.
도 37은 BIAcore SPR-기초 항원 결합 분석법을 사용하여 측정한, 팔리비주맙 및 백신 그룹으로부터의 대표적 샘플에 대한 결합 곡선을 나타낸다.
도 38은 다양한 치료 그룹에 대한 (1) 항-F IgG(왼쪽 막대) 및 (2) MN(오른쪽 막대) 모두에 대한 항체 역가 수준의 기하학적 평균 상승을 나타내는 그래프이다.
도 39는 다양한 투여량으로 RSV 나노입자 백신을 투여받은 환자들에서 항체 기하학적 평균 역가(GMT)를 나타내는 그래프이다. 항체 반응은 항원 부위 II 펩타이드 254-278에 대한 것이다.
도 40a는 RSV F 단백질 나노입자 백신에 의해 생성된 항체들이 팔리비주맙과 경쟁하는 것을 나타내는 그래프이다. 도 40b는 모든 백신 그룹에서 1차 투여 후 및 2차 투여 후 팔리비주맙 경쟁 항체들을 나타내는 그래프이다.
도 41은 팔리비주맙 경쟁 분석법의 결과들을 나타내는 그래프이다. 결과들은 RSV F 나노입자 백신이 팔리비주맙 결합 부위에 대해 경쟁하는 항체들과 관련된 항체들을 유도하였다는 것을 나타낸다.
도 42는 표시된 단클론 항체들의 RSV F 결합 역가 및 전장 RSV F 항원에 대한 각 단클론 항체를 위한 항체 인식 부위들을 나타낸다.
도 43은 항원보강제를 가진 또는 갖지 않는 FI-RSV, RSV-F 나노입자 백신 또는 생 RSV로 면역화된 코튼랫들로부터의 혈청에서 면역화 후 0일, 28일 및 49일에 항-RSV F IgG 항체 역가를 나타내는 그래프이다.
도 44는 항원보강제를 가진 또는 갖지 않는 FI-RSV, RSV-F 나노입자 백신 또는 생 RSV에 의한 코튼랫들의 면역화 후 0, 28일 및 49일에 중성화 항체 반응들을 나타내는 그래프이다.
도 45는 항원보강제를 가진 또는 갖지 않는 FI-RSV, RSV-F 나노입자 백신 또는 생 RSV로 면역화된 코튼랫들로부터의 혈청에서 융합 억제 역가를 나타내는 그래프이다.
도 46은 항원보강제를 가진 또는 갖지 않는 FI-RSV, RSV-F 나노입자 백신 또는 생 RSV로 면역화된 코튼랫들로부터의 혈청에서 경쟁적 ELISA 역가를 나타내는 그래프이다.
도 47은 도 45는 항원보강제를 가진 또는 갖지 않는 FI-RSV, RSV-F 나노입자 백신 또는 생 RSV로 면역화된 코튼랫들로부터의 혈청에서 표시된 중성화 RSV F 특이적 단클론 항체와 경쟁하는 백신 유도 항체들의 역가를 나타낸다.

정의

본 명세서에서 사용된 대로, "항원 보강제"라는 용어는 제제에서 특이적 면역원(예를 들어, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP)과 조합하여 사용될 때, 결과로 발생하는 면역 반응을 증가 또는 변화 또는 변형하는 화합물을 의미한다. 면역 반응의 변형은 항체 및 세포 면역 반응 각각 또는 모두의 특이성을 강화 또는 확대를 포함한다. 또한 면역 반응의 변형은 특정 항원-특이적 면역 반응을 감소하거나 억제하는 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 대로, "항원 제제" 또는 "항원 조성물"이란 용어는 척추 동물, 특히 새 또는 포유류에 투여될 때, 면역 반응을 일으키는 조합제를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 대로, "조류 인플루엔자 바이러스"라는 용어는 인간 또는 다른 동물들을 감염시킬 수 있으나 주로 새들에서 발견되는 인플루엔자 바이러스를 의미한다. 일부 경우에, 조류 인플루엔자 바이러스들은 전염되거나 인간들 사이에 퍼질 수 있다. 인간들을 감염시키는 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 전염병, 즉, 인간의 질병 유발 및/또는 사망을 일으킬 잠재력을 가진다. 전염병은 인플루엔자 바이러스의 새로운 균주(인간은 고유 면역성을 갖지 않는 바이러스)가 발생할 때, 개별 지역을 넘어, 가능하게는 전세계로 퍼지고 한꺼번에 많은 인간들을 감염시킨다.

본 명세서에서 사용된 대로, "유효 복용량"은 감염을 예방 및/또는 완화하거나 감염 또는 질환의 적어도 하나의 증상을 감소시키고, 및/또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP의 추가 복용량의 효과를 향상시키기 위해, 면역성을 유도하는데 충분한 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP의 양을 일반적으로 의미한다. 유효 복용량은 감염 또는 질환의 개시를 지연 또는 최소화하는데 충분한 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP의 양을 의미할 수 있다. 유효 복용량은 감염 또는 질환의 치료 또는 관리에 치료적 이익을 제공하는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP의 양을 의미할 수 있다. 또한, 유효 복용량은 감염 또는 질환의 치료 또는 관리에 치료적 이익을 제공하는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP 단독에 대한 양 또는 다른 치료제들과 조합한 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP에 대한 양이다. 유효 복용량은 감염체 또는 질환에 뒤이은 노출에 대항하는 피험자(예를 들어, 인간) 자신의 면역 반응을 증가하기에 충분한 양일 수 있다. 면역성의 수준은 중성화 분비 및/또는 혈청 항체의 양을 측정하거나 플라크 중성화(plaque neutralization), 보체 결합(complex fixation), 효소결합면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 미세중화측정법(microneutralization assay)에 의해 또는 세포독성 T 세포 항원 제공 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포 및/또는 다른 세포 반응과 같으나 이에 제한되지 않는 세포 반응들을 측정함으로써 관찰될 수 있다. T 세포 반응들은 형광 유세포 분석기 또는 T-세포 확산 분석법, T-세포 세포독성 분석법, TETRAMER 분석법 및/또는 ELISPOT 분석법과 같으나 이에 제한되지 않는 T 세포 분석법에 의해 특정 마커들을 사용함으로써 존재하는 CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포들의 양을 측정함으로써 관찰될 수 있다. 백신의 경우에, "유효 복용량"은 질환을 예방 및/또는 증상들의 심각성을 감소시키는 양이다.

본 명세서에서 사용된 대로, "유효량"이란 용어는 원하는 생물학적 효과를 구현하는데 필수적인 또는 충분한 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP의 양을 의미한다. 조성물의 유효량은 선택된 결과를 성취하는 양일 수 있고 이런 양은 당업자에 의해 반복 실험에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 감염을 예방, 치료 및/또는 완화하기 위한 유효량은 면역 시스템의 활성화를 일으키는데 필수적인 양일 수 있어서, 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP에 노출되자마자 항원 특이적 면역 반응의 발현을 일으킨다. 이 용어는 "충분한 양"과 동의어이다.

본 명세서에서 사용된 대로, "발현"이란 용어는 다핵산들이 mRNA로 전사되고 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 다핵산이 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은, 적절한 진핵생물 숙주 세포 또는 유기체가 선택되는 경우, mRNA의 접합을 포함한다. 본 발명의 내용에서, 이 용어는 RSV F 유전자 mRNA 및 이의 발현 이후 얻은 RSV F 단백질의 수율을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 대로, "F 단백질" 또는 "융합 단백질" 또는 "F 단백질 폴리펩타이드" 또는 "융합 단백질 폴리펩타이드"라는 용어는 RSV 융합 단백질 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 유사하게, "G 단백질" 또는 "G 단백질 폴리펩타이드"라는 용어는 RSV 부착 단백질 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 수많은 RSV 융합 및 부착 단백질들이 기술되었고 당업자에게 주지되어 있다. 전문이 참조로 포함된 WO/2008/114149는 예시적 F 및 G 단백질 변형체(예를 들어, 자연적으로 발생하는 변형체)를 개시한다.

본 명세서에서 사용된 대로, "면역원" 또는 "항원"이란 용어는 면역 반응을 일으킬 수 있는 단백질, 펩타이드, 핵산과 같은 물질들을 의미한다. 두 용어는 항원결정부위를 포함하며 서로 교환해서 사용된다.

본 명세서에서 사용된 대로, "면역 자극제"라는 용어는 신체의 화학적 메신저(사이토카인)를 통해 면역 반응을 강화하는 조성물을 의미한다. 이런 분자들은 인터페론(IFN-γ), 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13)과 같은 면역 자극 활성, 면역 증강 활성 및 염증 유발 활성을 가진 다양한 사이토카인, 림포카인 및 케모카인; 성장 인자(예를 들어, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage(GM)-colony stimulating factor(CSF)); 및 대식세포 염증 인자, Flt3 리간드, B7.1; B7.2 등과 같은 다른 면역 자극 분자를 포함한다. 면역 자극 분자들은 본 발명의 VLPs와 동일한 제제에 투여될 수 있거나 개별적으로 투여될 수 있다. 단백질 또는 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 면역자극 효과를 일으키기 위해 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 대로, "면역원성 제제"라는 용어는, 예를 들어, 포유류와 같은 척추동물에 투여될 때 면역 반응을 유도할 조합제를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 대로, "감염체"라는 용어는 척추동물에서 감염을 일으키는 미생물들을 의미한다. 주로, 생물들은 바이러스, 박테리아, 기생충, 원생생물 및/또는 곰팡이이다.

본 명세서에서 사용된 대로, "돌연변이된", "변형된", "돌연변이" 또는 "변형"이란 용어는 변형된 핵산 또는 폴리펩타이드를 형성하는 핵산 및/또는 폴리펩타이드의 임의의 변형을 나타낸다. 돌연변이는, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에서 단일 또는 여러 잔기의 점 돌연변이, 결실 또는 삽입을 포함하며, 유전자의 단백질-암호화 영역 내에서 발생하는 변화뿐만 아니라 제어 또는 프로모터 서열들과 같으나 이에 제한되지 않는 단백질-암호화 서열의 바깥 영역에서 변화를 포함한다. 유전적 변화는 임의의 형태의 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 유전자의 전부 또는 일부의 점 돌연변이, 프레임-이동 돌연변이, 삽입 또는 결실을 구성할 수 있다. 일부 실시태양들에서, 돌연변이는 자연적으로 발생한다. 다른 실시태양들에서, 돌연변이는 인공적 돌연변이 압력의 결과이다. 또 다른 실시태양들에서, RSV F 단백질들에서 돌연변이들은 유전 공학의 결과이다.

본 명세서에서 사용된 대로, "다가"라는 용어는 감염체들 또는 질환들의 여러 형태 또는 균주들에 대항하는 하나 이상의 항원 단백질/펩타이드 또는 면역원을 가지는 조성물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 대로, "약학적으로 허용가능한 백신"은 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 포함하는 제제를 의미하며, 척추동물에 투여될 수 있는 형태이며 감염 또는 질환을 예방 및/또는 완화 및/또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP의 다른 복용량의 효능을 향상시키는 면역성을 유도하는데 충분한 보호 면역 반응을 유도한다. 통상적으로 백신은 통상적인 식염수 또는 버퍼 수용액 배지를 포함하며 여기에 본 발명의 조성물은 현탁되거나 용해된다. 이런 형태에서, 본 발명의 조성물은 감염을 예방, 완화 또는 치료하는데 편리하게 사용될 수 있다. 숙주에 주입되자마자, 백신은 항체 및/또는 사이토카인의 생산 및/또는 세포독성 T 세포, 항원 제공 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포 및/또는 다른 세포 반응의 활성화를 포함하나 이에 제한되지 않는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 대로, "보호 면역 반응" 또는 "보호 반응"이란 문구는 감염을 예방 또는 완화하거나 이의 적어도 하나의 질환 증상을 감소시키는 척추동물(예를 들어, 인간)에 의해 나타내어지는 감염체 또는 질환에 대항하는 항체들에 의해 매개된 면역 반응을 의미한다. 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP는 감염체들을 중성화하고, 감염체들이 세포들에 들어가는 것을 봉쇄하고, 감염체들의 복제를 봉쇄하고 그리고/또는 숙주 세포들이 감염되고 파괴되는 것을 보호하는 항체들의 생산을 자극할 수 있다. 이 용어는 감염을 예방 또는 완화하거나 이의 적어도 하나의 질환 증상을 감소시키는 척추동물(예를 들어, 인간)에 의해 나타내어지는 감염체 또는 질환에 대항하는 T-림프구 및/또는 다른 백혈구 세포들에 의해 매개되는 면역 반응을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 대로, "척추 동물" 또는 "피험자" 또는 "환자"는 제한 없이, 인간 및 다른 영장류를 포함하고, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종들과 같은 비인간 영장류를 포함하는 아문 코다타(cordata)의 임의의 일원을 의미한다. 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 가정용 포유류; 생쥐, 쥐(코튼랫 포함) 및 기니 피크와 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물; 닭, 칠면조 및 닭 계통 새, 오리, 거위와 같은 가정용, 야생 및 사냥새를 포함하는 새 등은 비 제한적인 예들이다. "포유류" 및 "동물"이란 용어는 이 정의에 포함된다. 어른 및 신생아들도 포함된다. 특히, 유아 및 어린이는 RSV 백신을 위한 적절한 피험자 또는 환자이다.

본 발명에서 사용된 대로, "바이러스-유사 입자"(VLP)는 감염성인 것으로 입증되지 않았으나 적어도 하나의 기질이 바이러스를 닮은 구조를 의미한다. 본 발명에 따른 바이러스 유사 입자들은 바이러스 유사 입자들의 단백질들을 암호화하는 유전 정보를 갖지 않는다. 일반적으로, 바이러스-유사 입자들은 바이러스 게놈이 없으며, 따라서 비 감염성이다. 또한, 바이러스-유사 입자들은 이형 발현에 의해 다량으로 종종 생산될 수 있고 쉽게 정제될 수 있다.

본 발명에서 사용된 대로, "키메릭 VLP"라는 용어는 적어도 두 개의 다른 감염체(이형 단백질)로부터의 단백질 또는 이의 부분을 포함하는 VLPs를 의미한다. 주로, 단백질들의 하나는 숙주 세포들로부터 VLPs의 형성을 유도할 수 있는 바이러스로부터 유래된다. 설명을 위한 예들은 BRSV M 단백질 및/또는 HRSV G 또는 F 단백질이다. RSV VLPs 및 키메릭 VLPs라는 용어는 적절한 경우 서로 교환해서 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 대로, "백신"이라는 용어는 죽거나 약해진 병원체 또는 병원체에 대항해 항체 또는 면역의 형성을 유도하는데 사용되는 유도된 항원 결정자의 조제품을 의미한다. 백신은 인플루엔자 바이러스에 의해 발생하는 질환, 예를 들어, 인플루엔자에 대한 면역을 제공하도록 주어진다. 또한, "백신"이라는 용어는 보호 면역, 즉 감염과 관련된 질환의 심각함을 예방 또는 감소시키는 면역을 일으키기 위해 척추동물에 투여되는 면역원(예를 들어, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP)의 현탁액 또는 용액을 의미한다. 본 발명은 면역원성이고 감염과 관련된 질환에 대항하여 보호를 제공할 수 있는 백신 조성물을 제공한다.

RSV F 단백질

RSV-F 단백질 및 방법은 2009년 12월9일에 출원된 미국특허출원 일련 No. 12/633,995(미국공개공보 No.2010/0239617로 2010년 9월23일 공개), 2008년 12월9일에 출원된 미국가출원 일련 No. 61/121,126 및 2009년 4월14일에 출원된 미국가출원 일련 No. 61/169,077 및 2009년 7월10일 출원된 미국가출원 일련 No. 61/224,787에 개시되며, 이의 전문은 모든 목적을 위해 전문이 참조로 각각 포함된다.

두 구조 막 단백질, F 및 G 단백질은 RSV의 표면상에서 발현되고 중성화 항체들의 표적들인 것으로 나타났다(Sullender, W., 2000, Clinical Microbiology Review 13, 1-15). 이런 두 단백질은 바이러스 인식과 표적 세포들 속으로의 침투를 주로 초래한다; G 단백질은 특이적 세포 수용체와 결합하고 F 단백질은 바이러스와 세포의 융합을 촉진한다. F 단백질은 감염된 세포들이 표면상에 발현되고 융합체 형성을 유도하는 다른 세포들과의 뒤이은 융합을 초래한다. 따라서, F 단백질에 대한 항체들은 바이러스를 중성화하거나 바이러스의 세포 속으로의 침투를 봉쇄하거나 융합체 형성을 예방할 수 있다. 비록 A 및 B 서브타입 사이의 항원 및 구조 차이들이 G 및 F 단백질 모두에 대해 기술되었으나, 가장 현저한 항원 차이들이 G 단백질 상에 잔존하며, 여기서 아미노산 서열은 단지 53% 동종이고 항원 관련성은 5%이다(Walsh et al. (1987) J. Infect. Dis. 155, 1198-1204; and Johnson et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,5625-5629). 반대로, F 단백질에 대해 발생한 항체들은 서브타입 A 및 B 바이러스들 중에서 높은 등급의 교차-반응성을 나타낸다.

RSV F 단백질은 비리온 외피 단백질과 숙주 세포 원형질막 사이의 융합에 의한 RSV의 침투를 명령한다. 감염 이후에, 세포 표면상에 발현된 F 단백질은 융합체를 형성하기 위해 이웃 세포들과 융합을 매개할 수 있다. F 단백질은 N-말단 절단 신호 펩타이드와 C-말단 근처에 막 앵커를 가진 타입 I 세포막투과 표면 단백질이다. RSV F는 호모트라이머로 결합하고 세포 엔도프로테아제에 의해 트랜스-골지 복합체에서 절단에 의해 활성화되어 2개의 이황화-결합 서브유닛, F₁ 및 F₂ 서브유닛을 생성하는 불활성 F₀ 전구체로서 합성된다. 절단에 의해 생성된 F₁ 서브유닛의 N-말단은 융합을 개시하기 위해 표적 막 속으로 직접 삽입하는 소수성 도메인(융합 펩타이드)를 포함한다. F₁ 서브유닛은 융합하는 동안, 바이러스 및 세포 막들을 매우 가깝게 위치시키는 형상 이동을 일으키는 것과 관련된 헵타드 반복체(heptad repeats)를 포함한다(Collins and Crowe, 2007, Fields Virology, 5^th ed., D.M Kipe et al, Lipincott, Williams and Wilkons, p. 1604). SEQ ID NO:2(GenBank Accession No. AAB59858)는 SEQ ID NO:1(GenBank Accession No. M11486)에 나타낸 유전자에 의해 암호화되는 대표적인 RSV F 단백질을 나타낸다.

자연에서, RSV F 단백질은 FO로 지정된, 단일 펩타이드 전구체, 길이가 574 아미노산으로 발현된다. 생체 내에서, FO는 소포체에서 올리고머화되고 2개의 보존된 퓨린 일치 서열들(퓨린 절단 위치), RARR(SEQ ID NO:23)(2차) 및 KKRKRR(SEQ ID NO:24)(1차)에서 퓨린 프로테아제에 의해 단백질분해적으로 처리되어 2개의 이황화-연결 프레임으로 이루어진 올리고머를 발생시킨다.

이런 프레임들의 더 작은 부분은 F2로 불리고 FO 전구체의 N-말단 부분으로부터 발생한다. 약어 FO, F1 및 F2는 과학 논문에서 F₀, F₁, F₂로 일반적으로 지정된다는 것은 당업자가 인식할 것이다. 더 큰, C-말단 F1 단편은 24개 아미노산 세포질 꼬리에 인접하는 소수성 아미노산들의 서열을 통해 막에 있는 F 단백질과 결합한다. 3개의 F2-F1 다이머들은 결합되어 성숙한 F 단백질을 형성하며, 이 F 단백질은 표적 세포 막과 접촉하자마자 입체적 형상 변화가 일어나도록 유발되는 준 안정성 프리푸소제닉("융합 전") 입체적 형상을 채택한다. 이런 입체적 형상 변화는 숙주 세포막과 결합하고 바이러스 또는 감염된 세포의 막과 표적 세포막의 융합을 촉진하는 융합 펩타이드로 공지된 소수성 서열을 노출한다.

F1 단편은 HRA와 HRB로 지정된 적어도 2개의 헵타드 반복체 도메인을 포함하며, 각각 융합 펩타이드와 세포막투과 앵커 도메인에 인접하게 위치된다. 이런 융합전 입체적 형상에서, F2-F1 다이머는 구형 머리와 줄기 구조를 형성하며, 이 구조에서 HRA 도메인들은 구형 머리에서 분할된(연장된) 입체적 형상이다. 반대로, HRB 도메인들은 머리 영역으로부터 연장되는 세 가닥으로 꼬인 코일 줄기를 형성한다. 융합 전 입체적 형상으로부터 융합 후 입체적 형상으로 전이하는 동안, HRA 도메인들은 파괴되고 HRB 도메인들에 인접하게 위치되어 항-평행 6개 나선형 다발을 형성한다. 융합 후 상태에서, 융합 펩타이드와 세포막투과 도메인들은 인접하여 막 융합을 용이하게 한다.

비록 상기한 형상 설명이 결정학적 데이터의 분자 모델링을 기초로 하지만, 융합전 입체적 형상과 융합후 입체적 형상 사이의 구조적 구별은 결정학을 의지하지 않고 관찰될 수 있다. 예를 들어, 전자현미경은 기술적 교시를 목적으로 참조로 본 명세서에 포함된 Calder et al. , Virology, 271 : 122- 131 (2000) and Morton et al., Virology, 311 : 275-288에 의해 증명된 대로, 융합 전 및 융합 후(선택적으로 프리푸소제닉과 푸소제닉으로 나타냄) 사이를 구별하는데 사용될 수 있다. 융합 전 입체적 형상은 이의 기술적 교시를 목적으로 본 명세서에 참조로 포함된 코놀리 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:17903-17908 (2006)에 의해 기술된 대로 리포솜 결합 분석법에 의해 푸소제닉(융합 후) 입체적 형상과 구별될 수 있다. 또한, 융합 전 및 푸소제닉 입체적 형상은 RSV F 단백질의 융합 전 또는 푸소제닉 형태의 하나 또는 다른 하나 상에 존재하나 다른 형태상에 존재하지 않는 입체적 항원결정부위들을 특이적으로 인식하는 항체들(예를 들어, 단클론 항체들)을 사용하여 구별될 수 있다. 이런 입체적 항원결정부위들은 분자의 표면상에 있는 항원결합부위의 차별적인 노출 때문일 수 있다. 선택적으로, 입체적 항원결정부위들은 직선 폴리펩타이드에서 연속적이지 않은 아미노산들의 병치상태로부터 발생할 수 있다.

변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질

본 발명자들은 융합(F) 단백질의 발현의 놀랍게 높은 수준은 특정 변형들이 RSV F 단백질의 구조에 가해질 때 성취될 수 있다는 것을 발견하였다. 이런 변형들은 숙주 세포에서 RSV F 단백질의 세포 독성을 뜻밖에도 감소시킨다. 또한, 본 발명의 변형 F 단백질들은 융합 전 "막대" 형태와 반대로 융합 후 "막대 사탕" 형태를 나타내는 향상된 능력을 나타낸다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 변형 F 단백질들은 야생형 F 단백질들(예를 들어, GenBank Accession No. AAB59858에 해당하는 SEQ ID NO:2로 예시됨)과 비교해서 향상된(예를 들어, 강화된) 면역원성을 나타낼 수 있다. 이런 변형들은 백신들의 개발 및 RSV의 치료 및/또는 예방을 위해 상기 백신들을 사용하는 방법에 대한 상당한 응용분야를 가진다.

본 발명에 따라, 임의의 수의 돌연변이가 천연 또는 야생형 RSV F 단백질에 가해질 수 있고 한 바람직한 양태에서, 수회 돌연변이가 가해져서 천연 또는 야생형 RSV F 단백질과 비교해서 개선된 발현 및/또는 면역원성 특성들을 가져올 수 있다. 이런 돌연변이는 점 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 결실 및 삽입을 포함하며, 하나 이상(예를 들어, 하나, 둘, 셋 또는 넷 등)의 돌연변이가 바람직하다.

천연 F 단백질 폴리펩타이드는 RSV A 균주, RSV B 균주, HRSV A 균주, HRSV B 균주, BRSV 균주 또는 조류 RSV 균주의 임의의 F 단백질 또는 (위에서 정의한 대로) 이의 변형체로부터 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 천연 F 단백질 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2(GenBank Accession No. AAB59858)로 나타내어진 F 단백질이다. 본 발명을 잘 이해하기 위해서, 균주와 무관하게, 모든 아미노산 잔기 위치들은 예시적 F 단백질의 아미노산 위치에 대해(즉, 아미노산 잔기 위치에 해당하는) 제공된다. 다른 RSV 균주로부터의 F 단백질의 필적할만한 아미노산 위치들은 선택된 RSV 균주의 아미노산 서열들을 쉽게 구입할 수 있고 주지된 정렬 알고리즘(예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST)을 사용하는 예시적 서열의 아미노산 서열들과 정렬함으로써 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 다른 RSV 균주들로부터의 F 단백질 폴리펩타이드들의 여러 다른 예들은 (전문이 참조로 본 명세서에 포함된) WO/2008/114149에 개시된다. 추가 변형체들은 유전적 부동(genetic drift)을 통해 발생할 수 있거나 위치 지정 또는 무작위 돌연변이를 사용하거나 둘 이상의 이미 존재하는 변형체들의 재조합에 의해 인공적으로 생산될 수 있다. 이런 추가 변형체들은 본 명세서에서 개시된 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질의 내용에 적합하다.

돌연변이들은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 RSV F 단백질들 속에 도입될 수 있다. 돌연변이들은, 예를 들어, 2가 금속 이온 보조인자로서 망간의 존재하에서 PCR 반응을 수행함으로써 무작위로 도입될 수 있다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이는 암호화 DNA 분자를 따라 임의의 결정된 위치에서 염기쌍 변화들의 모든 가능한 종류를 허용하는 돌연변이 또는 변형 RSV F 단백질을 형성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이 기술은 올리고뉴클레오티드 상보체(하나 이상의 미스매치 제외)를 관심 RSV F 단백질을 암호화하는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열에 어닐링하는 단계를 포함한다. 미스매치된 올리고뉴클레오티드는 DAN 폴리머라제에 의해 연장되어, 한 가닥에서 서열의 원하는 변화를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자를 생성한다. 서열의 변화들은, 예를 들어, 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입을 일으킬 수 있다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 적절한 발현 벡터 속에 삽입될 수 있고, 따라서 돌연변이 또는 변형 폴리펩타이드가 생성될 수 있다. 상기한 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이는, 예를 들어, PCR을 통해 수행될 수 있다.

추가 RSV 단백질

본 발명은 RSV 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대항하여 척추동물(예를 들어, 인간)을 보호하기 위한 백신 또는 항원 제제로 제제화될 수 있는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV 바이러스-유사 입자(VLPs)를 포함한다. 일부 실시태양들에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP는 M, N, G 및 SH와 같은 추가 RSV 단백질을 더 포함한다. 다른 실시태양들에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP는 인플루엔자 바이러스 단백질 HA, NA 및 M1과 같은 균주의 이형 균주로부터의 단백질들을 더 포함한다. 한 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스 단백질 M1은 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유래된다.

RSV N 단백질은 게놈 RNA와 복제 중간 항-게놈 RNA 모두에 단단히 결합하여 RNAse 저항성 뉴클레오캡시드를 형성한다. SEQ ID NOs:16(야생형) 및 18(코돈-최적화)은 RSV N 단백질의 대표적 아미노산 서열들을 나타내며 SEQ ID NOs:15(야생형) 및 17(코돈-최적화)은 RSV N 단백질을 암호화하는 대표적 핵산 서열들을 나타낸다. 본 발명에 포함된 것은 SEQ ID NO:18과 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 RSV N 단백질들 및 이의 모든 단편들과 변형체(키메릭 단백질을 포함)이다.

RSV M 단백질은 바이러스 형태 형성 동안 RSV F 단백질 및 다른 인자들과 상호작용하는 원형질막에 축적되는 비-당화 내부 비리온 단백질이다. 특정 바람직한 실시태양들에서, RSV M 단백질은 소 RSV(BRSV) M 단백질이다. SEQ ID NOs:12(야생형) 및 14(코돈-최적화)는 BRSV M 단백질의 대표적 아미노산 서열들을 나타내며 SEQ ID NOs:11(야생형) 및 13(코돈-최적화)은 BRSV M 단백질을 암호화하는 대표적 핵산 서열들을 나타낸다. 본 발명에 포함된 것은 SEQ ID NO:12 및 14와 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 RSV(BRSV를 포함하나 이에 제한되지 않음) M 단백질들 및 이의 모든 단편들과 변형체(키메릭 단백질을 포함)이다.

RSV G 단백질은 절단되지 않은 신호 펩타이드와 막 앵커 모두로서 작용하여, 분자의 C-말단 2/3가 외부로 향하게 하는 N-말단 단부 근처의 단일 소수성 영역을 가진 II형 세포막투과 당단백질이다. RSV G는 신호/앵커 내에 놓인 ORF(DIR 아미노산 48)에 있는 제 2 AUG에서 번역 개시로부터 발생하는 분비된 단백질로 발현된다. RSV G의 엑토도메인의 대부분은 RSV 균주들 사이에서 매우 다양하다(Id., p. 1607). SEQ ID NO:26은 SEQ ID NO:25에 나타낸 유전자 서열에 의해 암호화되는 대표적 RSV G 단백질을 나타낸다. 본 발명에 포함된 것은 SEQ ID NO:26과 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 RSV G 단백질들 및 이의 모든 단편들과 변형체(키메릭 단백질을 포함)이다.

RSV의 SH 단백질은 64(RSV 서브그룹 A) 또는 65 아미노산 잔기(RSV 서브그룹 B)를 포함하는 타입 II 세포막투과 단백질이다. 일부 연구들은 RSV SH 단백질은 바이러스 융합 또는 막 투과성 변화에 역할을 가질 수 있다고 주장하였다. 그러나, SH 유전자가 없는 RSV는 생존가능하며, 융합체 형성을 일으키고 야생형 바이러스처럼 잘 자라서, SH 단백질은 바이러스의 숙주 세포들 속으로의 침투 또는 융합체 형성에 필수적이지 않다는 것을 나타낸다. RSV의 SH 단백질은 TNF-α 시그널링을 억제하는 능력을 나타낸다. SEQ ID NO:27은 RSV SH 단백질의 대표적 아미노산 서열을 나타낸다. 본 발명에 포함된 것은 SEQ ID NO:27과 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 RSV SH 단백질들 및 이의 모든 단편들과 변형체(키메릭 단백질을 포함)이다.

RSV 백신

현재, RSV 질환의 예방법에 대한 유일하게 승인된 방법은 수동적 면역화이다. IgG에 대한 보호 역할을 나타내는 최초 증거는 흰담비(Prince, G. A., Ph.D. diss., University of California, Los Angeles, 1975) 및 인간(Lambrecht et al, (1976) J. Infect. Dis. 134, 211-217; and Glezen et al. (1981) J. Pediatr. 98,708-715)에서 어머니 항체와 관련된 관찰로부터 얻었다. 헤밍 등(Morell et al, eds., 1986, Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins, Academic Press, London at pages 285-294)은 신생아 패혈증을 가진 것으로 의심되는 신생아들에서 정맥 면역글로불린(IVIG)의 약동학과 관련된 연구들 동안 RSV 감염의 치료 또는 예방에서 RSV 항체의 가능성 있는 용도를 인식하였다. 이들은 폐 분비물에 RSV이 포함된 한 유아가 IVIG 주사 후 빠르게 회복되었다는 것을 알았다. IVIG 로트의 나중 분석은 RSV 중성화 항체의 현저하게 높은 역가를 나타내었다. 이 동일 그룹의 조사원들은 RSV 감염에 대항하여 코튼랫 및 영장류를 보호하기 위해, RSV 중성화 항체에 풍부한 고 면역 혈청 또는 면역글로불린의 능력을 검사하였다(Prince et al (1985) Virus Res. 3, 193-206; Prince et al (1990) J. Virol. 64, 3091-3092). 이런 연구들의 결과는 예방적인 면으로 고려한 RSV 중성화 항체는 코튼랫에서 RSV의 기도 복제를 억제하였다는 것을 나타내었다. 치료적으로 고려할 때, RSV 항체는 코튼랫과 비인간 영장류 모델 모두에서 폐 바이러스 복제를 감소시켰다. 게다가, 면역 혈청 또는 면역 글로불린의 수동적 주사는 뒤이어 RSV로 면역성 검사를 한 코튼랫에서 증가된 폐 병변을 생성하지 않았다.

RSV 감염은 척추동물에 중성화 항체들을 제공함으로써 예방될 수 있기 때문에, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 백신은, 척추 동물에 중성화 항체들을 생체 내로 투여할 때, 유발될 수 있다. 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질은 RSV 감염의 예방 및/또는 치료에 유리하게 사용된다. 따라서, 본 발명의 다른 태양은 RSV에 대항하여 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 조성물의 면역학 유효량을 피험자(예를 들어, 인간 또는 동물 피험자)에게 투여하는 단계를 포함한다. 면역학적 유효량의 조성물의 투여는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 상에 존재하는 항원결정부위들에 특이적인 면역 반응을 유발한다. 이런 면역 반응은 B 세포 반응(예를 들어, 중성화 항체들의 생산) 및/또는 T 세포 반응(예를 들어, 사이토카인의 생산)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질에 의해 유발된 면역 반응은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 상에 존재하는 적어도 하나의 입체적 항원결정부위에 특이적인 원소들을 포함한다. 한 실시태양에서, 면역 반응은 "막대 사탕" 융합 후 활성 상태에서 발견된 RSV F 단백질 상에 존재하는 항원결정부위에 특이적이다. RSV F 단백질들과 조성물들은 RSV와 접촉 이후 바이러스 질환을 강화시키지 않으며 피험자에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질들과 적절하게 제제화된 면역원성 조성물들은 RSV에 의한 감염을 감소 또는 예방하고 그리고 및/또는 RSV와 접촉 이후 이상 반응을 감소 또는 예방하는 Th1 편향 면역 반응(biased immune response)을 유발한다.

한 실시태양에서, 본 발명의 RSV F 단백질들은 미셀들(예를 들어, 로제트) 형태로 발견된다. 본 발명에 따라 얻은 미셀들은 로제트-유사 구조를 가진 면역학적으로 활성인 F 스파이크(spikes) 단백질의 응집체들로 구성된다. 로제트들은 전자현미경으로 보인다(Calder et al, 2000, Virology 271 : 122-131). 바람직하게는, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 본 발명의 미셀들은 융합 후 활성 상태를 나타내는 "막대 사탕" 형태를 나타낸다. 한 실시태양에서, 미셀들은 숙주 세포에서 발현 이후 정제된다. 피험자에게 투여될 때, 본 발명의 미셀들은 중성화 항체들을 유발하는 것이 바람직하다. 일부 실시태양들에서, 미셀들은 항원 보강제와 함께 투여될 수 있다. 다른 실시태양들에서, 미셀들은 항원 보강제 없이 투여될 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 RSV 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대항하여 척추동물(예를 들어, 인간)을 보호하기 위한 백신 또는 항원 제제로 제제화될 수 있는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV 바이러스-유사 입자(VLPs)를 포함한다. 본 발명은 또한 야생형 및 돌연변이 RSV 유전자들 또는 숙주 세포들 속에 트랜스펙트될 때, RSV 단백질들을 포함하는 바이러스 유사 입자들(VLPs)을 생산할 RSV 바이러스의 다른 균주들로부터 유래된 이의 조합을 포함하는 RSV VLPs 및 벡터들에 관한 것이다.

일부 실시태양들에서, RSV 바이러스 유사 입자들은 적어도 하나의 바이러스 기질 단백질(예를 들어, RSV M 단백질)을 더 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, M 단백질은 RSV의 인간 균주로부터 유래된다. 다른 실시태양에서, M 단백질은 RSV의 소 균주로부터 유래된다. 다른 실시태양들에서, 기질 단백질은 인플루엔자 바이러스의 균주로부터의 M1 단백질일 수 있다. 한 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스의 균주는 조류 인플루엔자 균주이다. 한 바람직한 실시태양에서, 조류 인플루엔자 균주는 H5N1 균주 A/Indonesia/5/05이다. 다른 실시태양들에서, 기질 단백질은 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로부터 유래된 것일 수 있다.

일부 실시태양들에서, VPLs는 RSV G 단백질을 더 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, G 단백질은 HRSV 그룹 A로부터 유래된 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, G 단백질은 HRSV 그룹 B로부터 유래된 것일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, RSV G 단백질은 HRSV 그룹 A 및/또는 HRSV 그룹 B로부터 유래된 것일 수 있다.

일부 실시태양들에서, VLPs는 RSV SH 단백질을 더 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, SH 단백질은 HRSV 그룹 A로부터 유래된 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, SH 단백질은 HRSV 그룹 B로부터 유래된 것일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, RSV SH 단백질은 HRSV 그룹 A 및/또는 HRSV 그룹 B로부터 유래된 것일 수 있다.

일부 실시태양들에서, VLPs는 RSV N 단백질을 더 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, N 단백질은 HRSV 그룹 A로부터 유래된 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, N 단백질은 HRSV 그룹 B로부터 유래된 것일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, RSV N 단백질은 HRSV 그룹 A 및/또는 HRSV 그룹 B로부터 유래된 것일 수 있다.

다른 실시태양들에서, 본 발명의 VLPs는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 및/또는 뉴라미니다제(NA)와 같은 하나 이상의 이형 면역원들을 더 포함할 수 있다.

일부 실시태양들에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 VLPs에서 동일 및/또는 다른 균주들로부터의 다른 RSV M, F, N, SH 및/또는 G 단백질들의 조합을 포함한다. 또한, VLPs는 면역 반응의 강화를 위한 하나 이상의 추가 분자들을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에서, RSV VLPs는 핵산, siRNA, microRNA, 화학치료제, 조영제, 및/또는 환자에게 전달될 다른 물질들과 같은 물질들을 운반할 수 있다.

본 발명의 VLPs는 백신 및 면역원성 조성물을 제조하는데 유용하다. VLPs의 한 중요한 특징은 관심 표면 단백질들을 발현하는 능력이고 그 결과 척추동물의 면역 시스템은 관심 단백질에 대항하여 면역 반응을 유도한다. 그러나, 모든 단백질들이 VLPs의 표면상에서 발현될 수 없다. 왜 특정 단백질들이 VLPs의 표면상에서 발현되지 않는지 또는 불충분하게 발현되는지에 대한 여러 이유들이 있을 수 있다. 한 가지 이유는 단백질은 숙주 세포의 막으로 향하지 않는다는 것이고 또는 단백질은 세포막투과 도메인을 갖지 않는다는 것이다. 예를 들어, 인플루엔자 헤마글루티닌의 카복실 말단 근처의 서열들은 HA를 성숙한 인플루엔자 외피 뉴클레오캡시드의 지질 이중층 속에 포함시키고 HA 트라이머 상호작용과 인플루엔자 기질 단백질 M1의 회합에 중요할 수 있다(Ali, et al, (2000) J. Virol. 74, 8709-19).

따라서, 본 발명의 한 실시태양은 RSV로부터의 변형 또는 돌연변이 F 단백질 및 세포 표면상에서 정상적으로는 효과적으로 발현되지 않거나 정상적인 RSV 단백질이 아닌 적어도 하나의 면역원을 포함하는 키메릭 VLPs를 포함한다. 한 실시태양에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질은 관심 면역원과 융합될 수 있다. 다른 실시태양에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질은 이형 바이러스 표면 막 단백질, 예를 들어, MMTV 외피 단백질의 세포막투과 도메인과 세포질 꼬리를 통해 면역원과 결합한다.

본 발명의 다른 키메릭 VLPs는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 이형 감염체로부터의 적어도 하나의 단백질을 포함하는 VLPs를 포함한다. 이형 감염체의 예들은 바이러스, 박테리아, 원생동물, 곰팡이 및/또는 기생충을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 다른 감염체로부터의 면역원은 이형 바이러스 단백질이다. 다른 실시태양에서, 이형 감염체로부터의 단백질은 외피-결합 단백질이다. 다른 실시태양에서, 다른 이형 감염체로부터의 단백질은 VLP의 표면상에 발현된다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 척추동물에서 보호 면역 반응을 일으킬 항원결정부위를 포함한다. 한 실시태양에서, 다른 감염체로부터의 단백질은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질과 공동 발현된다. 다른 실시태양에서, 다른 감염체로부터의 단백질은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질에 융합된다. 다른 실시태양에서, 다른 감염체로부터의 단백질의 단지 일부가 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질에 융합된다. 다른 실시태양에서, 다른 감염체로부터의 단백질의 단지 일부가 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질의 일부에 융합된다. 다른 실시태양에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질에 융합된 다른 감염체로부터의 단백질의 일부가 VLPs의 표면상에 발현된다.

또한 본 발명은 본 발명의 VLPs 상에 또는 그 안에 발현된 상기 인플루엔자 단백질들의 변형체들을 포함한다. 상기 변형체들은 구성 단백질들의 아미노산 서열들에서의 변형을 포함할 수 있다. 단백질에 대해 "변형체"라는 용어는 기준 서열에 대해 하나 이상의 아미노산으로 변형된 아미노산 서열을 의미한다. 상기 변형체는 "보존성" 변화를 가질 수 있고, 여기서 치환된 아미노산은, 예를 들어 류신의 아이소류신에 의한 대체와 같은 유사한 구조적 특성 또는 화학적 특성을 가진다. 선택적으로, 변형체는, 예를 들어, 글리신의 트립토판에 의한 대체와 같은 "비보존성" 변화를 가질 수 있다. 유사한 적은 변형은 아미노산 결실 또는 삽입 또는 모두를 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 제거하지 않고 어떤 아미노산 잔기들이 치환, 삽입 또는 결실될 것인지를 결정하는 지침은, 예를 들어, DNASTAR 소프트웨어와 같은 당업계에 주지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 발견할 수 있다.

자연 변형체들은 단백질들에서 돌연변이 때문에 발생할 수 있다. 이런 돌연변이는, 예를 들어 인플루엔자인 감염체들의 개개의 그룹 내에서 항원 변이를 유도할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 인플루엔자 균주에 감염된 사람은 그 바이러스에 대항하는 항체를 생성하고, 새로운 바이러스 균주들이 발생함에 따라, 오래된 균주들에 대항하는 항체들은 더 이상 새로운 바이러스를 인식하지 않고 재감염이 발생할 수 있다. 본 발명은 VLPs를 제조하기 위한 감염체들로부터의 단백질들의 모든 항원 및 유전적 변이를 포함한다.

본 발명에 사용할 수 있는, 복제, 돌연변이, 세포 배양 등과 같은 분자 생물학 기술을 개시하는 일반적인 원문은 베르거 및 키멜, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); 샘브룩 등, Molecular Cloning Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 2000 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. 아우스벨 등, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel")을 포함한다. 이런 원문은 돌연변이유발(mutagenesis), 벡터, 프로모터의 용도 및 RSV의 F 및/또는 G 분자 등의 복제 및 돌연변이에 관련된 많은 다른 관련 주제를 개시한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 VLPs 상에 또는 그 안에 발현된 단백질들의 특성을 향상 또는 변형하는 단백질 가공 및 재조합 DNA 기술의 공지된 방법을 사용하는 것을 포함한다. 다양한 형태의 돌연변이유발은 단백질 분자들을 암호화하는 변형체 핵산들을 생산 및/또는 분리 및/또는 본 발명의 VLPs 상에 또는 안에 단백질들을 추가로 변형/돌연변이 하는데 사용될 수 있다. 이들은 특정부위 돌연변이유발, 무작위 지점 돌연변이유발, 동형 재조합(DNA 셔플링), 주형을 함유하는 우라실을 사용하는 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발, 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발, 간격-이중 DNA(gapped-duplex DNA) 등을 사용하는 돌연변이유발을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 적절한 방법은 점 불일치 회복(point mismatch repair), 회복-부족 숙주(repair-deficient host strains), 제한-선택 및 제한-정제를 사용하는 돌연변이유발, 결실 돌연변이유발, 전체 유전자 합성, 이중-가닥 파괴 회복 등에 의한 돌연변이유발을 포함한다. 예를 들어, 키메릭 구조체가 관여하는 돌연변이유발도 본 발명에 포함된다. 한 실시태양에서, 돌연변이유발은 선척적으로 발생한 분자 또는 후천성 또는 돌연변이로 자연적으로 발생하는 분자의 공지된 정보, 예를 들어, 서열, 서열 비교, 물리적 특성, 결정 구조 등에 의해 안내될 수 있다.

본 발명은 실질적인 생물학적 활성, 예를 들어, 본 발명의 VLP 상에 또는 그 안에 발현될 때 유효 항체 반응을 유발할 수 있는 생물학적 활성을 나타내는 단백질 변형체들을 포함한다. 이런 변형체들은 활성에 적은 효과를 미치도록 당업계에 공지된 일반적인 규칙에 따라 선택된 결실, 삽입, 역전, 반복 및 치환을 포함한다.

상기 단백질들을 복제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 특정 RSV 단백질을 암호화하는 유전자는 RSV 바이러스에 감염된 세포들로부터 추출한 폴리아데실화된 mRNA로부터 RT-PCR에 의해 분리될 수 있다. 결과로 얻은 생성물 유전자는 벡터 속에 DNA 삽입으로 복제될 수 있다. "벡터"라는 용어는 핵산이 유기체, 세포 또는 세포 구성물 사이에서 전파 및/또는 운반될 수 있는 수단을 의미한다. 벡터들은 자율적으로 복제하거나 숙주 세포의 염색체 속에 통합될 수 있는 플라스미드, 바이러스, 박테리아파아지, 프로-바이러스, 파이지미드, 트랜스폼, 인공 염색체 등을 포함한다. 벡터는 자율적으로 복제되지 않는 네이키드(naked) RNA 폴리뉴클레오티드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오티드, 동일한 가닥 내에 DNA 및 RNA 모두로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 폴리-리신-접합 DNA 또는 RNA, 펩티드-접합 DNA 또는 RNA, 리포솜-접합 DNA 등일 수 있다. 전부가 아닌 많은 일반적인 실시태양에서, 본 발명의 벡터들은 플라스미드 또는 백미드이다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 VLPs의 형성을 유도하는 세포에서 발현될 수 있는 발현 벡터 속에 복제된 키메릭 분자들을 포함하는 단백질들을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함한다. "발현 벡터"는 발현을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 그 안에 포함된 핵산의 복제를 촉진할 수 있는 플라스미드와 같은 벡터이다. 통상적으로, 발현될 핵산은 프로모터 및/또는 인핸서에 "작동가능하게 연결되고", 프로모터 및/또는 인핸서에 의해 전사 조절 제어된다. 한 실시태양에서, 뉴클레오티드는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화한다(상기한 대로). 다른 실시태양에서, 벡터는 M 및/또는 G RSV 단백질들을 암호화하는 뉴클레오티드를 더 포함한다. 다른 실시태양들에서, 벡터는 M 및/또는 N RSV 단백질들을 암호화하는 뉴클레오티드를 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 벡터는 M, G 및/또는 N RSV 단백질들을 암호화하는 뉴클레오티드를 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 벡터는 BRSV M 단백질 및/또는 N RSV 단백질들을 암호화하는 뉴클레오티드를 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 벡터는 BRSV M 및/또는 G 단백질들 또는 인플루엔자 HA 및/또는 NA 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드를 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 뉴클레오티드는 인플루엔자 HA 및/또는 NA 단백질을 가진 RSV F 및/또는 RSV G 단백질을 암호화한다. 다른 실시태양에서, 발현 벡터는 바큘로바이러스 벡터이다.

본 발명의 일부 실시태양에서, 단백질은 침묵 치환, 첨가 또는 결실을 일으키나 암호화된 단백질의 특성 또는 활성 또는 어떻게 단백질들이 만들어지는 지를 변화시키지 않는 변형을 포함하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 변형체들은, 예를 들어, 특정 숙주에 대한 코돈 발현(Sf9 세포와 같은 곤충 세포에 의해 선호되는 것들에 대한 인간 mRNA에서 코돈의 변화)을 최적화하는 것과 같은 다양한 이유로 생산될 수 있다. 전문이 참조로 포함된 미국특허공보 제 2005/0118191호 참조.

또한, 뉴클레오티드는 정확한 암호 영역이 복제되고 어떠한 원치 않는 돌연변이도 포함하지 않도록 하기 위해 서열화될 수 있다. 뉴클레오티드는 임의의 세포에서 발현을 위해 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스) 속에 하위복제될 수 있다. 상기는 어떻게 RSV 바이러스 단백질들이 복제될 수 있는지의 단지 한 가지 예이다. 당업자는 다른 방법들도 사용할 수 있고 가능하다는 것을 알고 있다.

또한 본 발명은 F, M, G, N, SH 또는 이의 부분 및/또는 상기한 키메릭 분자를 포함하는 RSV 구조 유전자들을 암호화하는 RSV 뉴클레오티드들을 포함하는 구조체 및/또는 벡터를 제공한다. 벡터는, 예를 들어, 파아지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. F, M, G, N, SH 또는 이의 부분 및/또는 상기한 키메릭 분자를 포함하는 RSV 구조 유전자들을 포함하는 RSV 구조 유전자들을 포함하는 구조체 및/또는 벡터는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터(또는 다른 바큘로바이러스), 파이지 람바다 PL 프로모터, E. coli lac, phoA 및 tac 프로모터와 같은 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 하며, SV40 초기 및 나중 프로모터, 및 레트로바이러스 LTRs의 프로모터들은 제한적이지 않은 예이다. 다른 적절한 프로모터들은 숙주 세포 및/또는 원하는 발현 속도에 따라 당업자에게 알려질 것이다. 발현 구조체들은 전사 개시, 종결을 위한 부위 및 전사된 영역에, 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 더 포함할 것이다. 구조체들에 의해 발현된 전사체들의 암호 부분은 초기에 번역 개시 코돈 및 번역될 폴리펩타이드의 단부에 적절하게 위치한 종결 코돈을 포함하는 것이 바람직할 것이다.

발현 벡터들은 적어도 하나의 선택가능한 마커를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이런 마커들은 다이하이드로폴레이트 환원효소, G418 또는 진핵세포 배양을 위한 네오미신 저항 유전자(neomycin resistance gene) 및 E. coli 및 다른 박테리아 배양을 위한 테트라사이클린, 카나미신, 또는 임피실리닌 저항 유전자를 포함한다. 벡터들 중에서 바큘로바이러스, 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스, 카나리폭스 바이러스, 포울폭스 바이러스, 라쿤폭스 바이러스, 스윈폭스 바이러스 등), 아데노바이러스(예를 들어, 카닌 아데노바이러스), 헤르페스바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터가 바람직하다. 본 발명에 사용될 수 있는 다른 벡터들은 pQE70, pQE60 및 pQE-9, p블루스크립트 벡터, 파아지스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함하는 박테리아에 사용하기 위한 벡터를 포함한다. 진핵 벡터들 중에서 pFastBac1 pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl and pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL이 바람직하다. 다른 적절한 벡터들은 당업자가 쉽게 알 수 있을 것이다. 한 실시태양에서, 변형 또는 돌연변이 RSV F 유전자뿐만 아니라 M, G, N, SH에 대한 유전자 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 키메릭 분자를 포함하는 RSV 유전자들을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 pFastBac이다.

상기 재조합 구조체들은 트랜스펙트, 인펙트 또는 트랜스폼하는데 사용될 수 있고 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 적어도 하나의 면역원을 포함하는 RSV 단백질들을 발현할 수 있다. 한 실시태양에서, 재조합 구조체는 진핵생물 세포들 및/또는 원핵생물 세포들 속에, 변형 또는 돌연변이 RSV F, M, G, N, SH 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 분자를 포함한다. 따라서, 본 발명은 변형 또는 돌연변이 RSV F; RSV G, N 및 SH와 같으나 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 면역원 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 분자를 포함하는 RSV 구조 유전자를 암호화하고, VLPs의 형성을 허용하는 조건하에서 숙주 세포에서 RSV F, G, N, M 또는 SH 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 분자를 포함하는 유전자들의 발현을 허용하는 핵산들을 포함하는 벡터(또는 벡터들)를 포함하는 숙주 세포들을 제공한다.

진핵 숙주 세포들은 효모, 곤충, 조류, 식물, 꼬마선충(또는 선충) 및 포유류 숙주 세포이다. 곤충 세포의 비제한적인 예는 예를 들어, Sf9, Sf21과 같은 Spodoptera frugiperda (Sf) 세포, 하이 파이브 세포와 같은 Trichoplusia ni 세포 및 Drosophila S2 세포들이다. 곰팡이(효모 포함) 숙주 세포들의 예는 S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis(K. lactis), C. albicans 및 C. glabrata , Aspergillus nidulans , Schizosaccharomyces pombe(S. pombe), Pichia pastoris , 및 Yarrowia lipolytica를 포함하는 칸디다균의 종들이다. 포유류 세포들의 예는 COS 세포, 아기 햄스터 신장 세포, 쥐 L 세포, LNCaP 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 및 아프리카 녹색 원숭이 세포, CV1 세포, HeLa 세포, MDCK 세포, Vero 및 Hep-2 세포들이다. 아프라카발톱개구리(Xenopus laevis oocyte) 또는 양서류 출처의 다른 세포들도 사용될 수 있다. 원핵 숙주 세포들은, 예를 들어, 대장균(E. coli , B. subtilis), 살모넬라티피균(Salmonella typhi) 및 마이코박테리아와 같은 박테리아 세포를 포함한다.

벡터들, 예를 들어, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질; RSV G, N 또는 SH와 같으나 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 면역원 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 키메릭 분자를 포함하는 적어도 하나의 면역원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터들은 당업계에 주지된 방법에 따라 숙주 세포들 속으로 트랜스펙트될 수 있다. 예를 들어, 진핵 세포 속에 핵산을 주입하는 것은 인산칼슘-공동 침지, 전기천공, 미세주사, 리포펙션(lipofection) 및 폴리아민 트랜스펙션 시약을 사용하는 트랜스펙션에 의할 수 있다. 한 실시태양에서, 벡터는 재조합 바큘로바이러스이다. 다른 실시태양에서, 재조합 바큘로바이러스는 진핵 세포 속으로 트랜스펙트된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 세포는 곤충 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 곤충 세포는 Sf9 세포이다.

본 발명은 또한 VLP 생산의 효율을 증가시킬 구조체 및 방법을 제공한다. 예를 들어, RSV F, M, G, N, SH 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 키메릭 또는 이형 분자들에 리더 서열들을 첨가하면 세포 내에 단백질 수송의 효율을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 이형 신호 서열은 F, M, G, N, SH 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 키메릭 또는 이형 분자들에 융합될 수 있다. 한 실시태양에서, 신호 서열은 곤충 세포의 유전자로부터 유래될 수 있고 F, M, G, N, SH 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 키메릭 또는 이형 분자들에 융합될 수 있다. 다른 실시태양에서, 신호 펩타이드는 키티나아제 신호 서열이며, 바큘로바이러스 발현 시스템에서 효과적으로 작동한다.

VLP 생산의 효율을 증가시키는 다른 방법은 RSV F 단백질, M, G, N, SH 또는 이의 부분 및/또는 특정 세포 형태에 대해 상기한 임의의 키메릭 또는 이형 분자들을 포함하는 RSV를 암호화하는 뉴클레오티드를 코돈 최적화하는 것이다. Sf9 세포에서 발현을 위한 코돈 최적화 핵산들의 예는 SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 13, 17, 19 및 25를 참조하라.

본 발명은 VLPs의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 VLPs의 형성을 허용하는 조건하에서 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 RSV F, G, N, M 또는 SH 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 키메릭 또는 이형 분자들을 포함하는 RSV 유전자들을 발현하는 단계를 포함한다. 선택된 발현 시스템과 숙주 세포에 따라, VLPs는 재조합 단백질들이 발현되고 VLPs가 형성되는 조건하에서 발현 벡터에 의해 변형된 숙주 세포들을 성장시킴으로써 생산된다. 한 실시태양에서, 본 발명은 VLP의 생산 방법을 포함하며, 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 암호화하는 벡터들을 적절한 숙주 세포 속에 트랜스펙팅하고 VLPs의 형성을 허용하는 조건하에서 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 발현하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 진핵 세포는 효모, 곤충, 양서류, 조류 또는 포유류 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 적절한 성장 조건의 선택은 당해 기술 내에 또는 당업자 내에 있다.

본 발명의 VLPs를 생산하도록 가공된 세포들을 성장시키는 방법은 배치(batch), 배치-패드(batch-fed), 연속적 및 살포 세포 배양 기술을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 세포 배양은 세포 전파 및 정제와 분리를 위한 단백질(예를 들어, 재조합 단백질)을 발현하는 생물 반응기(발효 챔버)에서 세포들의 성장과 전파를 의미한다. 통상적으로, 세포 배양은 생물 반응기에서 살균되고, 제어된 온도 및 대기압 조건하에서 수행된다. 생물 반응기는 온도, 대기압, 교반 및/또는 pH와 같은 환경 조건이 관찰되는 세포를 배양하는데 사용된 챔버이다. 한 실시태양에서, 상기 생물 반응기는 스테인리스 강 챔버이다. 다른 실시태양에서, 상기 생물 반응기는 선-살균 플라스틱 가방(Cellbag® Wave Biotech, Bridgewater, NJ)이다. 다른 실시태양에서, 상기 선-살균 플라스틱 가방은 약 50L 내지 1000L 가방이다.

VLPs는 염화칼슘, 수크로오스 및 아이오딕사놀과 같은 기울기 원심분리뿐만 아니라, 예를 들어, 이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피를 포함하는 표준 정제 기술과 같이, VLPs의 완전한 상태를 보존하는 방법을 사용하여 분리된다.

다음은 본 발명의 VLPs가 어떻게 제조되고, 분리되고 정제될 수 있는 지의 예이다. 주로 VLPs는 세포들이 세포 배양액에서 성장할 때 VLP를 생성하기 위해 가공된 재조합 세포주로부터 생산된다(상기 참조). VLPs의 생산은 도 26에 도시도니 계획에 의해 성취될 수 있다. 당업자는 본 발명의 VLPs를 제조하고 정제하는데 사용될 수 있는 다른 방법이 있다는 것을 알 수 있어서, 본 발명은 개시된 방법에 제한되지 않는다.

본 발명의 VLPs의 생산은 진탕기 플라스크 속에 Sf9 세포(감염되지 않음)를 공급함으로써 시작될 수 있고, 세포들이 성장하고 증대(예를 들어, 125ml 플라스크부터 50L 웨이브 백까지)됨에 따라 세포들을 팽창시키고 증가시킨다. 세포를 성장시키는데 사용된 배지는 적절한 세포주(바람직하게는, 혈청 제거 배지, 예를 들어, 곤충 배지 ExCell-420, JRH)를 위해 제제화된다. 다음으로, 상기 세포들은 가장 효율적인 감염 다중도에서 (예를 들어, 세포당 약 1 내지 약 3 플라크 형성 단위(plaque forming units)) 재조합 바큘로바이러스로 감염된다. 일단 감염이 발생하면, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, M, G, N, SH 또는 이의 부분 및/또는 상기한 임의의 키메릭 또는 이형 분자는 바이러스 게놈으로부터 발현되고, VLPs 속에 자가 결합하고 대략 감염 24 내지 72 시간 후 세포로부터 분리된다. 주로, 감염은 세포들이 성장의 중간-로그 단계(4-8 x 10⁶ cells/ml)에 있고 적어도 약 90% 살아있을 때 가장 효과적이다.

본 발명의 VLPs는 세포 배양 배지에서 VLPs의 양은 최대 세포 용해 전의 최대에 근접하는 때인 대략 감염 48 내지 96 시간 후 채취될 수 있다. 채취할 때의 Sf9 세포 밀도 및 생존 능력은 색소 배제법에 의해 나타내어진 대로, 적어도 약 20% 생존 능력을 가진 약 0.5 x 10⁶ cells/ml 내지 약 1.5 x 10⁶ cells/ml일 수 있다. 다음으로, 배지는 제거되고 정화된다. NaCl은 VLP 응집을 피하기 위해, 약 0.4 내지 약 1.0M, 바람직하게는 약 0.5M의 농도로 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 VLPs를 함유하는 세포 배양 배지로부터 세포 및 세포 파편을 제거하는 것은 일회용의 선-살균된 다공성 섬유 0.5 또는 1.00㎛ 필터 카트리지 또는 소형 장치에 의한 접선 유량 적정(TFF)에 의해 수행될 수 있다.

다음으로, 정화된 배양 배지에 있는 VLPs는 일회용의 선-살균된 500,000 분자량 컷오프 다공성 섬유 카트리지를 사용하는 초미세여과에 의해 농축될 수 있다. 농축된 VLPs는 잔류 배지 성분들을 제거하기 위해 0.5M NaCl을 함유하는 pH 7.0 내지 8.0 인산 버퍼 식염수(PBS) 10 볼륨에 대해 정용여과될 수 있다.

농축되고, 정용여과된 VLPs는 약 4℃ 내지 약 10℃에서 18시간 동안 6,500 x g에서 원심분리하여 0.5M NaCl를 가진 pH 7.2 PBS 버퍼에서 20% 내지 60% 불연속 수크로오스 구배(sucrose gradient) 상에서 더 정제될 수 있다. 주로 VLPs는 구배로부터 수집되거나 저장될 수 있는 약 30% 내지 약 40% 또는 계면(20% 내지 60% 단계 구배에서) 사이에 뚜렷하게 눈에 보이는 밴드를 형성할 것이다. 이 생성물은 정제 공정에서 다음 단계를 위한 조제품에 200mM의 NaCl을 포함하도록 희석될 수 있다. 이 생성물은 VLPs를 함유하고 손상되지 않은 바큘로바이러스 입자들을 함유할 수 있다.

VLPs의 추가 정제는 이온 교환 크로마토그래피 또는 44% 동밀도 수크로오스 쿠션 원심분리에 의해 성취될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피에서, 수크로오스 구배(상기 참조)로부터의 샘플은 음이온을 가진 배지를 함유하는 컬럼(예를 들어, Matrix Fractogel EMD TMAE)에 충전되고 VLP를 다른 오염물질(예를 들어, 바큘로바이러스 및 DNA/RNA)로부터 분리할 수 있는 염 구배(약 0.2M 내지 약 1.0M의 NaCl)를 통해 용출된다. 수크로오스 쿠션 방법에서, VLPs를 포함하는 샘플은 44% 수크로오스 쿠션에 첨가되고 30,000g에서 약 18시간 동안 원심분리된다. VLPs는 44% 수크로오스의 상부에 밴드를 형성하는 반면, 바큘로바이러스는 바닥에 침전되고 다른 오염 단백질들은 상부에 0% 수크로오스 층에 남는다. VLP 피크 또는 밴드는 수집된다.

손상되지 않은 바큘로바이러스는 원한다면, 불활성화된다. 불활성화는, 예를 들어 포르말린 또는 β-프로피오 락톤(BPL)과 같은 화학적 방법에 의해 성취될 수 있다. 손상되지 않은 바큘로바이러스의 제거 및/또는 불활성화는 선택적 침전화 및 위에서 예시한 당업계에 공지된 크로마토그래피 방법을 사용하여 대부분 성취될 수 있다. 불활성화의 방법들은 약 25℃ 내지 약 27℃에서 3시간 동안 0.2%의 BPL에 VLPs를 함유하는 샘플을 배양하는 것을 포함한다. 또한 바큘로바이러스는 3일 동안 4℃, 그런 후에 1시간 동안 37℃에서 0.05% BPL에서 VLPs를 함유하는 샘플을 배양함으로써 불활성화될 수 있다.

불활성화/제거 단계 후에, VLPs를 포함하는 생성물은 불활성화 단계로부터 임의의 시약 및/또는 잔여 수크로오스를 제거하고 VLPs를 원하는 버퍼(예를 들어, PBS) 속에 위치시키는 다른 정용여과(diafiltration) 단계를 통과할 수 있다. VLPs를 포함하는 용액은 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 살균 여과)에 의해 살균되고 냉장고 또는 냉동고에 저장될 수 있다.

상기 기술들은 여러 단계를 걸쳐 실행될 수 있다. 예를 들어, T-플라스크, 진탕기-플라스크, 스피너 병, 산업용 크기의 생물 반응기. 생물 반응기는 스테인리스 강 탱크 또는 선-살균 플라스틱 가방(Wave Biotech, Bridgewater, NJ에 의해 판매되는 시스템)을 포함할 수 있다. 당업자는 이를 위해 가장 바람직한 것을 알 것이다.

바큘로바이러스 발현 벡터의 팽창 및 생산 및 재조합 RSV VLPs를 생산하는 재조합 바큘로바이러스를 가진 세포의 감염은 상기한 대로 Sf9 곤충 세포와 같은 곤충 세포들에서 수행될 수 있다. 한 실시태양에서, 세포들은 RSV VLPs를 생산하기 위해 가공된 재조합 바큘로바이러스로 감염된다.

약학적 또는 백신 제제 및 투여

유용한 약학적 조성물들은 이 조성물을 투여받는 척추 동물에 해로운 면역 반응을 자체로 유발하지 않는 임의의 약학적 물질을 포함하고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 적절한 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 운반자 및 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 포함한다. 본 발명에서 사용된 대로, "약학적으로 허용가능한"이란 용어는 연방 정부 또는 주 정부의 규제 위원회에 의해 승인되고 미국 약전, 유럽 약전 또는 척추 동물 및 더욱 구체적으로 인간에 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열되는 것을 의미한다. 이런 조성물들은 척추 동물에 보호 면역 반응을 유도하기 위한 백신 및/또는 항원 조성물로서 효과적일 수 있다.

본 발명은 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 RSV M, G, N, SH 또는 이의 부분 및 상기한 임의의 키메릭 또는 이형 분자들을 포함하나 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 추가 단백질을 포함하는 VLPs를 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물을 포함한다. 한 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 적어도 하나의 추가 면역원을 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 적어도 하나의 RSV M 단백질을 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 적어도 하나의 BRSV M 단백질을 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 적어도 하나의 인플루엔자 M1 단백질을 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 적어도 하나의 조류 인플루엔자 M1 단백질을 포함하는 VLPs를 포함한다.

다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 HRSV, BRSV 또는 조류 RSV G 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 RSV G 단백질을 더 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 HRSV, BRSV 또는 조류 RSV N 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 RSV N 단백질을 더 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 HRSV, BRSV 또는 조류 RSV SH 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 RSV SH 단백질을 더 포함하는 VLPs를 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 BRSV M 및 RSV로부터 유래된 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및/또는 G, H 또는 SH 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 또는 NA 단백질을 포함하는 VLPs와 같은 키메릭 VLPs를 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물을 포함하며, HA 또는 NA 단백질은 RSV F 및/또는 G 단백질의 세포막투과 도메인과 세포질 꼬리에 융합된다.

본 발명은 또한 상기한 대로 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물을 포함한다.

한 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 적어도 하나의 추가 단백질을 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 BRSV M 단백질과 같으나 이에 제한되지 않는 RSV M 단백질을 더 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 HRSV G 단백질과 같으나 이에 제한되지 않는 RSV G 단백질을 더 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 HRSV, BRSV 또는 조류 RSV N 단백질과 같으나 이에 제한되지 않는 RSV N 단백질을 더 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 HRSV, BRSV 또는 조류 RSV SH 단백질과 같으나 이에 제한되지 않는 RSV SH 단백질을 더 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 BRSV M 단백질 및 HRSV 그룹 A로부터의 F 및/또는 G 단백질을 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 BRSV M 단백질 및 HRSV 그룹 B로부터의 F 및/또는 G 단백질을 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 BRSV로부터의 키메릭 M 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 단백질을 포함하는 VLPs와 같은 키메릭 VLPs를 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물을 포함하며, M 단백질은 인플루엔자 HA 단백질에 융합된다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 BRSV M 및 RSV로부터의 키메릭 F 및/또는 G 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 단백질을 포함하는 VLPs와 같은 키메릭 VLPs를 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물을 포함하며, 키메릭 인플루엔자 HA 단백질은 RSV F 및/또는 G 단백질의 세포막투과 도메인과 세포질 꼬리에 융합된다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 BRSV M 및 RSV로부터의 키메릭 F 및/또는 G 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 또는 NA 단백질을 포함하는 VLPs와 같은 키메릭 VLPs를 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물을 포함하며, HA 또는 NA 단백질은 RSV F 및/또는 G 단백질의 세포막투과 도메인과 세포질 꼬리에 융합된다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 RSV 단백질을 포함하는 키메릭 VLP를 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물을 포함한다. 한 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 백신 조성물은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 이형 감염체 또는 죽은 세포로부터의 적어도 하나의 면역원을 포함하는 VLPs를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이형 감염체로부터의 면역원은 바이러스 단백질이다. 다른 실시태양에서, 이형 감염체로부터의 바이러스 단백질은 외피 결합 단백질이다. 다른 실시태양에서, 이형 감염체로부터의 바이러스 단백질은 VLPs의 표면상에서 발현된다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 척추동물에서 보호 면역 반응을 일으킬 항원결정부위를 포함한다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 RSV 단백질을 포함하는 VLPs를 포함하는, 인간 피험자와 같은 척추동물을 면역화하기 위한 키트를 포함한다. 한 실시태양에서, 키트는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLPs를 포함한다. 한 실시태양에서, 키트는 BRSV M 단백질과 같은 RSV M 단백질을 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 키트는 RSV G 단백질을 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 BRSV로부터의 키메릭 M 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 단백질을 포함하는 VLPs를 포함하는 키트를 포함하며, M 단백질은 BRSV M에 융합된다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 BRSV, RSV F 및/또는 G 단백질로부터의 키메릭 M 단백질 및 이형 감염체로부터의 면역원을 포함하는 VLPs를 포함하는 키트를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 BRSV로부터의 M 단백질, 키메릭 RSV F 및/또는 G 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 단백질을 포함하는 VLPs를 포함하는 키트를 포함하며, HA 단백질은 RSV F 또는 G 단백질의 세포막투과 도메인과 세포질 꼬리에 융합된다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 BRSV로부터의 M 단백질, 키메릭 RSV F 및/또는 G 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 또는 NA 단백질을 포함하는 VLPs를 포함하는 키트를 포함하며, HA 단백질은 RSV F 및/또는 G 단백질의 세포막투과 도메인과 세포질 꼬리에 융합된다.

한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 면역원성 제제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀을 포함하는 면역원성 제제를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기한 대로 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 포함하는 면역원성 제제를 포함한다.

본 발명의 면역원성 제제는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체들은 식염수, 버퍼 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 살균 등장성 수성 버퍼 및 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 담체들, 희석제들 및 다른 부형제들의 철저한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. N.J. current edition)에 제공된다. 상기 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 제제는 인간에 대한 투여에 적합한데, 바람직하게는 살균되고, 미립자가 아니고 및/또는 발열성이 아니다.

원한다면, 상기 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 재조합에 적합한 동결건조 분말과 같은 고체 형태, 액체 용액, 서스펜션, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 서방성 제제 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체들을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 백신 제제들의 성분들의 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 키트는 2개의 용기를 포함하며, 하나는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 포함하고, 다른 하나는 항원 보강제를 포함한다. 의약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규율하는 정부 기관에 의해 처방된 형태의 공지는 이런 용기(들)에 결합될 수 있고, 상기 공지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의해 승인을 나타낸다.

또한 본 발명은 제제는 조성물의 양을 나타내는 앰플(ampoule) 또는 사체트(sachette)와 같은 밀봉된 용기에 포장되도록 규정한다. 한 실시태양에서, 조성물은 액체로 공급되고, 다른 실시태양에서는, 밀봉된 용기에 있는 건조 살균된 동결건조 분말 또는 물 제거 농축물로 공급되며, 예를 들어, 물 또는 식염수로 피험자에게 투여하기 위해 적절한 농도로 재구성될 수 있다.

다른 실시태양에서, 조성물은 조성물의 양과 농도를 나타내는 밀봉된 용기에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게는, 조성물의 액체 형태는 적어도 약 50㎍/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 약 100㎍/ml, 적어도 약 200㎍/ml, 적어도 500㎍/ml, 또는 적어도 1mg/ml로 밀봉된 용기에 공급된다.

예를 들어, 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 키메릭 RSV VLPs는 RSV의 하나 이상의 균주에 대항하는 면역 반응을 자극하기에 충분한 유효량 또는 양(위에서 정의)으로 투여된다. 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 VLP의 투여는 RSV에 대항하여 면역성을 유발한다. 통상적으로, 복용량은, 예를 들어, 나이, 신체 상태, 체중, 성별, 음식, 투여 시간 및 다른 임상적 인자를 기초로 하여 이 범위 내에서 조절될 수 있다. 예방 백신 제제는 바늘 및 주사를 사용하여 피하 또는 근육내 주사 또는 바늘 없는 주사 장치에 의해 전신으로 투여된다. 선택적으로, 백신 제제는 상기도 속으로의 방울, 큰 입자 에어로졸(약 10 마이크론보다 큼) 또는 분사에 의해 비강으로 투여된다. 전달의 상기 경로 중 임의의 것은 면역 반응을 일으키는 반면에, 비강 투여는 RSV와 인플루엔자를 포함하는 여러 바이러스의 침투 위치에서 점막 면역을 유발하는 증가된 효과를 제공한다.

따라서, 본 발명은 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 제제에 첨가하는 단계를 포함하여, 포유류의 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유발하는 백신 또는 항원 조성물을 제제화하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, 감염은 RSV 감염이다.

1회 복용량에 의한 면역성의 자극이 가능하지만, 원하는 효과를 얻기 위해서, 동일하거나 다른 경로를 통해 추가 복용량이 투여될 수 있다. 신생아 및 유아에서, 예를 들어, 충분한 수준의 면역을 유발하기 위해 복수의 투여가 필요할 수 있다. 투여는, 예를 들어, RSV 감염인 감염에 대항하는 충분한 수준의 보호를 유지하기 위해 필요한 경우, 유년 시기에 걸쳐 간격을 주고 계속될 수 있다. 이와 유사하게, 예를 들어, 보건 요원, 어린이집 교사, 어린이들의 가족 구성원, 노인 및 손상된 심폐소생 기능을 가진 개인들과 같이 반복되거나 심각한 인플루엔자 감염에 특히 영향받기 쉬운 어른들은 보호 면역 반응을 일으키고 및/또는 유지하기 위해 다수의 면역이 필요할 수 있다. 유도된 면역성의 수준은 보호의 원하는 수준을 유발하고 유지하기 위해 필요한 것과 같이, 예들 들어, 중화 분비선 및 혈청 항체 및 조절된 복용량 또는 반복된 백신 접종의 양을 측정함으로써 관찰될 수 있다.

변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 포함하는 조성물(예를 들어, 백신 및/또는 항원 제제)을 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 내피, 근육내, 정맥 및 피하), 경막외 및 점막(예를 들어, 비강 및 경구 또는 폐 경로 또는 좌약)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시태양에서, 상기 조성물은 근육내, 정맥, 피하, 경구 또는 피내로 투여된다. 상기 조성물은, 예를 들어, 주입 또는 일시 주사, 상피 또는 점막 안쪽(예를 들어, 구강 점막, 결장, 결막, 비인강, 인두중앙부, 질, 요로, 방광, 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 임의의 편리한 경로에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적으로 활성인 물질과 함께 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물의 투여의 비강 또는 다른 점막 경로는 다른 투여 경로보다 실질적으로 높은 항체 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물의 투여의 비강 또는 다른 점막 경로는 RSV의 다른 균주들에 대항하는 교차 보호를 유도할 항체 또는 다른 면역 반응을 유도할 수 있다. 투여는 전신 또는 국부적일 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 백신 및/또는 면역원성 제제는 면역화의 부위에 면역 반응을 유발하도록 점막 조직을 표적으로 하는 방식으로 투여된다. 예를 들어, 장 관련 림프양 조직(gut associated lymphoid tissue)(GALT)과 같은 점막 조직은 특정 표적화 특성들을 가진 항원 보강제를 함유하는 조성물의 경구 투여를 사용함으로써 면역화를 위한 표적이 될 수 있다. 비인두 림프양 조직(nasopharyngeal lymphoid tissue(NALT)) 및 기관지 관련 림프양 조직(bronchial-associated lymphoid tissue(BALT))과 같은 다른 점막 조직도 표적이 될 수 있다.

본 발명의 백신 및/또는 면역원성 제제는 최초 백신 조성물을 투여하고 뒤이어 투여를 강화하는 것과 같은 복용 계획에 따라 투여될 수 있다. 특정한 실시태양에서, 조성물의 두 번째 복용은 최초 투여 후 2주 내지 1년 중 어느 때, 바람직하게는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5 내지 약 6개월에 투여된다. 또한, 세 번째 복용은 두 번째 복용 후 및 최초 투여 후 약 3개월 내지 약 2년 이상, 바람직하게는 약 4, 약 5, 또는 약 6개월 또는 약 7개월 내지 약 1년에 투여될 수 있다. 세 번째 복용은 두 번째 복용 후 피험자의 혈청 및/또는 소변 또는 점막 분비물에 특정 면역글로블린이 없거나 적은 양의 특정 면역글로블린이 탐지될 때 경구로 투여될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 제 2 복용은 제 1 투여 후 약 1달에 투여되고 세 번째 복용은 제 1 투여 후 약 6개월에 투여된다. 다른 실시태양에서, 두 번째 복용은 제 1 투여 후 약 6개월에 투여된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물들은 조합 치료의 일부로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물들은 다른 면역원성 조성물, 항바이러스 및/또는 항생물질과 함께 제제화될 수 있다.

약학적 조성물의 복용량은, 예를 들어, 바이러스 특이적 면역글로블린의 혈청 역가를 측정하거나 혈청 샘플 또는 소변 샘플 또는 점막 분비물에서 항체들의 억제 비율을 측정함으로써 예방 또는 치료 면역 반응을 유발하는데 효과적인 복용량을 먼저 확인함으로써 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 상기 복용량은 동물 연구들로부터 결정될 수 있다. 백신들의 효과를 연구하는데 사용된 동물들의 비 제한적인 예는 기니 피크, 햄스터, 흰담비, 친칠라, 생쥐 및 코튼랫을 포함한다. 대부분의 동물들은 감염체들에 대한 자연 숙주가 아니나 질환들의 다양한 양태의 연구에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 동물들 중 임의의 것은 유도된 면역 반응을 부분적으로 특징화 및/또는 어떤 중화 항체들이 생산되는 지를 결정하기 위해, 본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP와 같은 백신 후보를 복용할 수 있다. 예를 들어, 생쥐는 작고 비용이 저렴해서 연구자들이 큰 스케일로 연구를 수행할 수 있기 때문에 많은 연구들이 생쥐 모델에서 수행되고 있다.

또한, 인간 임상 연구들은 당업자에 의해 인간에 대한 바람직한 유효량을 결정하는데 수행될 수 있다. 이런 임상 연구들은 일상적이고 당업계에 주지되어 있다. 사용될 정확한 복용량은 투여 경로에 의존할 것이다. 유효량은 생체 외 또는 동물 검사 시스템으로부터 유도된 복용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.

당업계에 주지된 것과 같이, 특정 조성물의 면역성은 항원 보강제로 알려진, 면역 반응의 비특이적 자극제를 사용함으로써 향상될 수 있다. 항원 보강제는 알려지지 않은 항원들에 대항하는 면역의 일반적인 증가를 실험적으로 향상시키기 위해 사용되었다(예를 들어, 미국특허 제 4,877,611호). 면역화 프로토콜은 수년 동안 반응들을 자극하는 항원 보강제를 사용하였고, 항원 보강제는 당업자에게 주지되어 있다. 일부 항원 보강제는 항원들이 존재하는 방식에 영향을 준다. 예를 들어, 면역 반응은 단백질 항원들이 칼륨명반에 의해 침지될 때 증가한다. 항원의 에멀션화는 항원 존재 기간을 연장한다. 전문이 참조로 포함된 보겔 등.,"A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2^nd Edition)에 개시된 임의의 항원 보강제의 삽입은 본 발명의 범위 내로 생각된다.

예시적인, 항원 보강제는 완전한 프로인트 항원 보강제(죽은 마이코박테리아 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 함유하는 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프로인트 항원 보강제 및 수산화알루미늄 항원 보강제를 포함한다. 다른 항원 보강제들은 GMCSP, BCG, 수산화알루미늄, thur-MDP 및 nor-MDP와 같은 MDP 화합물, CGP (MTP-PE), 지질 A 및 모노포스포릴 지질 A(MPL)를 포함한다. 박테리아, MPL, 트레할로스 다이마이콜레이트(TDM) 및(CWS) 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀션 속의 세포벽 골격(CWS)으로부터 추출된 3개 구성요소를 함유하는 RIBI가 고려된다. MF-59, 노바솜^®, MHC 항원도 사용될 수 있다.

본 발명의 한 실시태양에서, 항원 보강제는 지질 이중층이 제거된 큰 비결정 중앙 공동을 둘러싸는 수성층에 의해 분리된 실질적으로 구형 덮개 형태로 배열된 2개 내지 10개 이중층을 가진 파우실라멜라 지질소포(paucilamellar lipid vesicle)이다. 파우실라멜라 지질소포는 비특이적 자극제, 항원에 대한 운반자, 다른 항원 보강제의 운반자 및 이의 조합과 같은 여러 방식으로 면역 반응을 자극하는 역할을 할 수 있다. 파우실라멜라 지질소포는 백신이 미리형성된 소포를 가진 항원을 혼합하여 제조될 때, 비특이적 면역 자극제로 작용하여 항원은 소포에 대해 세포외에 남게 된다. 소포의 중앙 공동 내의 항원을 캡슐화함으로써 소포는 면역 자극제 및 항원을 위한 운반자로 작용한다. 다른 실시태양에서, 소포는 비 인지질 소포로 주로 제조된다. 다른 실시태양에서, 소포는 노바솜^®이다. 노바솜^®은 약 100nm 내지 약 500nm의 파우실라멜라 비 인지질 소포이다. 이들은 Brij 72, 콜레스테롤, 올레산 및 스쿠알렌을 포함한다. 노바솜은 인플루엔자 항원을 위한 효과적인 항원 보강제로 증명되었다(전문이 참조로 본 발명에 포함된 미국특허 제 5,629,021호, 제 6,387,373호 및 제 4,911,928호 참조).

본 발명의 조성물들은 "면역 자극제"와 함께 제제화될 수 있다. 이들은 면역 시스템의 반응을 증가시키기 위한 신체 자신의 화학적 메신저(사이토카인)이다. 면역 자극제들은 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13)과 같은 면역 자극 활성, 면역 증강 활성 및 염증 유발 활성을 가진 다양한 사이토카인, 림포카인 및 케모카인; 성장 인자(예를 들어, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage(GM)-colony stimulating factor(CSF)); 및 대식세포 염증 인자, Flt3 리간드, B7.1, B7.2 등과 같은 다른 면역자극분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 면역 자극 분자들은 본 발명의 조성물들과 동일한 제제에 투여될 수 있거나 개별적으로 투여될 수 있다. 단백질 또는 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 면역자극 효과를 일으키기 위해 투여될 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 항원 보강제 및/또는 면역 자극제를 포함하는 항원 및 백신 제제를 포함한다.

면역 반응을 자극하는 방법

본 발명의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 VLP는 감염체에 대해 면역성 또는 실질적인 면역성을 제공하는 면역 반응을 자극하는 조성물들을 제조하는데 유용하다. 점막 및 세포 면역은 감염체 및 질환에 대한 면역성에 기여할 수 있다. 상기도에 국부적으로 분비된 항체들은 자연 감염에 대한 저항에서 주요한 인자이다. 분비형 면역글로빈 A(sIgA)은 상부 호흡기의 방어에 관여하고 혈청 IgG는 하기도의 보호에 관여한다. 감염에 의해 유도된 면역 반응은 동일한 바이러스 또는 항원적으로 유사한 바이러스 균주에 의한 재감염에 대항하여 보호한다. 예를 들어, RSV는 빈번하고 예측할 수 없는 변화를 한다; 따라서, 자연 감염 후, 숙주의 면역성에 의해 제공되는 유효한 보호기간은 군서를 순환하는 바이러스의 새로운 균주에 대항하여 단지 수년 동안 유효할 것이다.

따라서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 적어도 하나의 추가 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 BRSV M 단백질인 RSV M 단백질을 더 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 RSV N 단백질을 더 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 RSV G 단백질을 더 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 RSV SH 단백질을 더 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 HRSV 그룹 A 및/또는 그룹 B로부터의 F 및/또는 G 단백질을 더 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 BRSV로부터의 M 단백질 및 키메릭 RSV F 및/또는 G 단백질 또는 MMTV 외피 단백질, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 또는 NA 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함하며, HA 및/또는 NA 단백질은 RSV F 및/또는 G 단백질 또는 MMTV 외피 단백질의 세포막투과 도메인 및 세포질 꼬리에 융합된다. 다른 실시태양에서, BRSV로부터의 M 단백질 및 키메릭 RSV F 및/또는 G 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 또는 NA 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함하며, HA 및/또는 NA 단백질은 RSV F 및/또는 G 단백질의 세포막투과 도메인 및 세포질 꼬리에 융합된다. 다른 실시태양에서, 피험자는 포유류이다. 다른 실시태양에서, 포유류는 인간이다. 다른 실시태양에서, RSV VLPs는 항원 보강제 또는 면역 자극제와 함께 제제화된다.

한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 RSV 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 방법을 포함한다. 다른 실시태양에서, 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀을 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 RSV 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 방법을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 적어도 1회 유효 복용량의 RSV VLPs를 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 RSV 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 방법을 포함하며, VLPs는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, M, G, SH 및/또는 N 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 피험자의 RSV 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 방법은 적어도 1회 유효 복용량의 RSV VLPs를 투여하는 단계를 포함하며, VLPs는 BRSV M(키메릭 M 포함) 및 RSV F, G 및/또는 N 단백질로 필수적으로 이루어진다. VLPs는 미미한 농도의 추가 RSV 단백질 및/또는 단백질 오염물을 포함한다. 다른 실시태양에서, 피험자의 RSV 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 방법은 적어도 1회 유효 복용량의 RSV VLPs를 투여하는 단계를 포함하며, VLPs는 BRSV M(키메릭 M 포함) 및 RSV G 및/또는 F로 이루어진다. 다른 실시태양에서, 피험자의 RSV 감염 또는 이의 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 방법은 RSV 단백질들을 포함하는 적어도 1회 유효 복용량의 RSV VLPs를 투여하는 단계를 포함하며, RSV 단백질은 BRSV M(키메릭 M 포함), 키메릭 F, G 및/또는 N 단백질을 포함하는 F, G 및/또는 N 단백질로 이루어진다. 이런 VLPs는 BRSV M(키메릭 M 포함), RSV F, G 및/또는 N 단백질을 포함하고 세포 단백질, 바큘로바이러스 단백질, 지질, 탄수화물 등과 같은 추가 세포 구성물을 포함할 수 있으나 추가 RSV 단백질(BRSV M(키메릭 M 포함)의 단편 이외), BRSV/RSV F, G 및/또는 N 단백질을 포함하지 않는다. 다른 실시태양에서, 피험자는 척추동물이다. 한 실시태양에서, 척추동물은 포유류이다. 다른 실시태양에서, 포유류는 인간이다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 1회 복용량으로 제제를 투여하여 RSV 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 수회 복용량으로 제제를 투여하여 RSV 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대해 면역성을 유도하는 단계를 포함한다.

조성물은 적절한 단백질 복용량 범위에서 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 단백질 복용량 범위는 약 100㎍, 약 80㎍, 약 60㎍, 약 30㎍, 약 15㎍, 약 10㎍ 또는 약 5㎍의 상한을 가진다. 다른 양태에서, 복용량 범위는 약 30㎍, 약 15㎍, 약 5㎍ 또는 약 1㎍의 하한을 가진다. 따라서, 적절한 범위는, 예를 들어, 단백질의 약 1㎍ 내지 약 100㎍, 약 5㎍ 내지 약 80㎍, 약 5㎍ 내지 약 60㎍, 약 15㎍ 내지 약 60㎍, 약 30㎍ 내지 약 60㎍ 및 약 15㎍ 내지 약 30㎍을 포함한다.

명세서 전체에서 사용된 것과 같이, 용어 "약"은 표시된 값의 ±10%를 의미한다.

본 발명은 또한 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여, 감염체에 의해 유발된 피험자의 감염 또는 이의 적어도 하나의 증상에 대해 면역성을 유도하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 이형 감염체로부터의 적어도 하나의 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질 및 동일 또는 이형 감염체로부터의 적어도 하나의 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 이형 감염체로부터의 단백질은 바이러스 단백질이다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 외피 결합 단백질이다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 VLPs의 표면상에서 발현된다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 척추동물에서 보호 면역 반응을 일으킬 항원결정부위를 포함한다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 BRSV M 단백질, RSV F, G 및/또는 N 단백질과 같은 RSV M 단백질과 결합할 수 있다. 한 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 BRSV M 단백질, RSV F, G 및/또는 N 단백질과 같은 RSV 단백질에 융합된다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질의 단지 부분은 BRSV M 단백질, RSV F, G 및/또는 N 단백질과 같은 RSV 단백질의 부분에 융합된다. 다른 실시태양에서, RSV 단백질에 융합된 감염체로부터의 단백질의 부분은 VLPs의 표면상에서 발현된다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질에 융합된 RSV 단백질 또는 이의 부분은 RSV M 부분과 결합한다. 다른 실시태양에서, RSV 단백질 또는 이의 부분은 RSV F, G, N 및/또는 P로부터 유래된다. 다른 실시태양에서, 키메릭 VLPs는 RSV부터의 N 및/또는 P 단백질을 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 키메릭 VLPs는 동일 및/또는 이형 감염체로부터의 하나 이상의 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 키메릭 VLPs는 하나 이상의 감염체 단백질을 포함하여, 다가 VLP를 형성한다.

본 발명의 조성물은 척추동물에 투여될 때 척추동물(예를 들어, 인간)에서 실질적인 면역성을 유도할 수 있다. 실질적인 면역성은 척추동물의 감염을 보호 또는 완화하거나 감염의 증상을 적어도 감소시키는 본 발명의 조성물들에 대항하는 면역 반응으로부터 얻는다. 일부 실시태양들에서, 척추동물이 감염된 경우, 감염은 자각증상이 없을 것이다. 반응은 완전한 보호 반응이 아닐 수 있다. 이런 경우에, 척추동물이 감염체로 감염된 경우, 척추동물은 비-면역화된 척추동물과 비교해서 감소된 증상 또는 더 짧은 기간의 증상을 경험할 것이다.

한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 RSV 바이러스 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대해 실질적인 면역성을 유도하는 방법을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 보호-유도량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 포유류에게 투여하는 단계를 포함하여 RSV에 대항하여 포유류를 백신접종하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 BRSV M 단백질과 같은 RSV M 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 HRSV G 단백질과 같은 RSV G 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 HRSV 그룹 A로부터의 N 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 HRSV 그룹 B로부터의 N 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 BRSV로부터의 키메릭 M 단백질 및 RSV로부터 유래된 F 및/또는 G 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함하며, F 및/또는 G 단백질은 M 단백질의 세포막투과 도메인과 세포질 꼬리에 융합된다. 다른 실시에서, 이 방법은 BRSV로부터의 M 단백질 및 키메릭 RSV F 및/또는 G 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함하며, F 및/또는 G 단백질은 인플루엔자 HA 및/또는 NA 단백질의 세포막투과 도메인 및 세포질 꼬리에 융합된다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 BRSV로부터의 M 단백질 및 키메릭 RSV F 및/또는 G 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 HA 및/또는 NA 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함하며, F 및/또는 G 단백질은 인플루엔자 HA 단백질의 세포막투과 도메인 및 세포질 꼬리에 융합된다. 다른 실시태양에서, 이 방법은 BRSV로부터의 M 단백질 및 키메릭 RSV F 및/또는 G 단백질 및 선택적으로 인플루엔자 HA 및/또는 NA 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함하며, HA 및/또는 NA 단백질은 RSV F 및/또는 G 단백질의 세포막투과 도메인 및 세포질 꼬리에 융합된다.

본 발명은 또한 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여, 감염체에 의해 유발된 피험자의 감염 또는 이의 적어도 하나의 증상에 대해 실질적인 면역성을 유도하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 BRSV M 단백질과 같은 RSV M 단백질 및 다른 감염체로부터의 적어도 하나의 단백질을 더 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 BRSV M 단백질 및 동일 또는 이형 감염체로부터의 적어도 하나의 단백질을 포함하는 VLPs를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 바이러스 단백질이다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 외피 결합 단백질이다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 VLPs의 표면상에서 발현된다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 척추동물에서 보호 면역 반응을 일으킬 항원결정부위를 포함한다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 BRSV M 단백질과 결합할 수 있다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질은 RSV 단백질에 융합된다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질의 단지 부분은 RSV 단백질의 부분에 융합된다. 다른 실시태양에서, RSV 단백질에 융합된 감염체로부터의 단백질의 부분은 VLPs의 표면상에서 발현된다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질에 융합된 RSV 단백질 또는 이의 부분은 RSV M 부분과 결합한다. 다른 실시태양에서, 감염체로부터의 단백질에 융합된 RSV 단백질 또는 이의 부분은 BRSV M 부분과 결합한다. 다른 실시태양에서, RSV 단백질 또는 이의 부분은 RSV F, G, N 및/또는 P로부터 유래된다. 다른 실시태양에서, VLPs는 RSV부터의 N 및/또는 P 단백질을 더 포함한다. 다른 실시태양에서, VLPs는 감염체로부터의 하나 이상의 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, VLPs는 하나 이상의 감염체 단백질을 포함하여, 다가 VLP를 형성한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 상기한 대로 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질, 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀 또는 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 감염 또는 이의 적어도 하나의 증상에 대한 보호 항체 반응을 유도하는 방법을 포함한다.

본 발명에 사용된 대로, "항체"는 면역글로블린 유전자 또는 면역글로블린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 또는 부분적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질이다. 인식된 면역글로블린 유전자들은 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 상수 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 면역글로블린 변형가능 영역 유전자를 포함한다. 가벼운 사슬은 카파 또는 람다로 분류된다. 무거운 사슬은 감마, 뮤, 알파, 델파 또는 입실론으로 분류되고, 각각 면역글로불린 집단, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 통상적인 면역글로블린(항체) 구조 단위는 테트라머를 포함한다. 각 테트라머는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 이루어지고, 각 쌍은 "가벼운"(약 25kD) 및 "무거운" 사슬(약 50-70kD)을 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 이상의 아미노산의 변형가능 영역을 정의한다. 항체들은 손상되지 않은 면역글로블린 또는 다양한 펩티다제에 의해 소화되어 생산된 여러 잘 특성화된 단편으로 존재한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 RSV 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대한 보호 세포 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 RSV F 미셀을 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 RSV 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대한 보호 세포 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 복용량의 VLP를 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 RSV 감염 또는 적어도 하나의 질환 증상에 대한 보호 세포 반응을 유도하는 방법을 포함하며, VLP는 상기한 대로 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함한다.세포-매개 면역성은 RSV 감염으로부터 회복에 역할을 하며 RSV-관련 합병증을 예방할 수 있다. RSV-특이적 세포 림프구들은 감염된 피험자의 혈액 및 하기도 분비물에서 탐지되었다. RSV-감염 세포들의 세포분해는 RSV-특이적 항체들 및 보체와 협력하여 CTLs에 의해 매개된다. 주요 세포분해 반응은 6-14일 후 혈액에서 탐지할 수 있고 감염되거나 백신 접종된 개인에서 21일에 사라진다(Ennis et al., 1981). 세포-매개 면역성은 RSV 감염으로부터 회복에 역할을 하며 RSV-관련 합병증을 예방할 수 있다. RSV-특이적 세포 림프구들은 감염된 피험자의 혈액 및 하기도 분비물에서 탐지되었다.

상기한 대로, 본 발명의 면역원성 조성물들은 피험자의 RSV 감염의 적어도 하나의 증상을 예방 또는 감소한다. RSV의 증상들은 당업계에 주지되어 있다. 증상들은 콧물, 인후통, 애성(hoarseness), 기침, 가래, 열, 수포음, 천명음(wheezing) 및 호흡곤란을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 RSV 감염과 관련된 적어도 하나의 증상의 예방 또는 감소시키는 것을 포함한다. 증상의 감소는, 예를 들어, 피험자에 의한 자가진단, 의사진단 또는 예를 들어, 삶의 질 진단, 인플루엔자 감염 또는 다른 증상의 느린 진행, RSV 증상의 감소된 심각함 또는 적절한 측정법(예를 들어, 항체 역가 및/또는 T-세포 활성 측정법)을 포함하는 적절한 측정법 또는 측정(예를 들어, 체온)을 수행하는 것과 같이 주관적으로 또는 객관적으로 결정될 수 있다. 객관적인 진단은 동물 및 인간 진단을 포함한다.

본 발명은 제한적으로 생각해서는 안 되는 다음 실시태양들에 의해 더욱 기술된다. 본 출원 전체에서 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허출원들의 내용뿐만 아니라 도면 및 염기서열은 본 발명에 참조로 포함된다.

실시예들

재조합 백미드 생성, 재조합 바이러스 원료를 제조하기 위한 곤충 세포들의 트렌스펙션, 플라크 정제 및 주요 바이러스 원료에 의한 곤충 세포들의 감염

재조합 바이러스를 제조하기 위해서, 관심 바이러스 유전자들을 Sf9 곤충 세포 발현을 위해 코돈 최적화하였고 pFastBac^TM 벡터들 속으로 복제하였다.

일단 원하는 구조체들을 확인하고 정제하고, 각 구조체를 위한 MAX Efficiency® DHlOBac^TM 컴피턴트 셀(competent cells)의 한 병을 얼음 위에서 해동하였다. 대략 1ng(5㎕)의 원하는 pFastBac^TM 구조체 플라스미드 DNA를 세포들에 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 세포들을 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 이후에 교반 없이 42℃에서 45초 동안 세포들의 열-충격을 가하였다. 다음으로, 튜브들을 얼음으로 옮기고 2분 동안 냉각하였다. 뒤이어 900㎕의 실온 S.O.C 배지를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브들을 4시간 동안 225rpm과 37℃에서 교반기에 놓았다. 각각의 pFastBac^TM변형을 위해서, 세포들의 10배 연속 희석물(10-1, 10-2 및 10-3)을 S.O.C 배지를 사용하여 제조하였다. 다음으로, 100㎕의 각 희석물을 50㎍/ml 카나마이신, 7㎍/ml 젠타마이신, 10㎍/ml 테트라사이클린, 100㎍/ml Bluo-gal 및 40㎍/ml IPTG를 포함하는 LB 한천 판에 덮었다. 판들을 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 흰색 군체들을 골라서 분석하였다.

위로부터 얻은 다른 백미드 DNAs를 각 구조체를 위해 제조하였고 분리하였다. 이런 DNAs를 침전시키고 Sf9 세포들에 5시간 동안 첨가하였다.

다음으로, 30ml의 Sf9 곤충 세포들(2 x 10⁶ cells/ml)을 0.3ml의 플라크 용출물과 함께 관심 바이러스 단백질을 발현하는 바큘로바이러스로 감염시키고 48-72시간 동안 배양하였다. 대략 1ml의 미정제 배양액(세포 + 배지)과 정제된 배양액 채취물을 발현 분석을 위해 저장하였고 나머지는 정제 목적을 위해 저장하였다.

실시예 2

변형 HRSV F 단백질들의 발현, 정제 및 분석

관심 변형 HRSV F 단백질들을 암호화하는 유전자들을 오버래핑 올리고뉴클레오티드(overlapping oligonucleotides)로서 생체 외에서 합성하였고 숙주 세포들에서 복제하고 발현하였다. 변형 RSV F 유전자들의 복제 및 발현은 당업계에 공지된 방법들에 따라 완성하였다.

관심 바이러스 단백질들을 포함하는 재조합 플라크를 고르고 확인하였다. 재조합 바이러스를 Sf9 곤충 세포들의 감염에 의해 증폭하였다. 일부 경우에, Sf9 곤충 세포들을 변형 F 단백질을 발현하는 재조합 바이러스와 다른 바이러스 단백질(예를 들어, BRSV M 단백질 및/또는 HRSV N 단백질)을 발현하는 다른 재조합 바이러스에 의해 공동 감염시켰다. 곤충 세포들의 배양액을 다양한 구조체들을 가진 바큘로바이러스로 ~3 MOI(Multiplicity of infection = virus ffu or pfu/cell)로 감염시켰다. 배양액과 상청액을 감염 후 48-72 시간에 채취하였다. 대략 30mL의 미정제 채취물을 대략 800 x g에서 15분 동안 원심분리에 의해 정제하였다. 변형 HRSV F 단백질을 포함하는 결과로 얻은 미정제 세포 채취물들을 다음과 같이 정제하였다.

관심 변형 HRSV F 단백질들을 감염된 Sf9 곤충 세포 배양액 채취물들로부터 정제하였다. 비 이온성 계면활성제 Tergitol® NP-9(노닐페놀 에톡실레이트)를 막 단백질 추출 프로토콜에 사용하였다. 미정제 추출물을 음이온 교환 크로마토그래피, 렌틸 렉틴 친화성/HIC 및 양이온 교환 크로마토그래피를 통과시킴으로써 추가로 정제하였다.

단백질 발현을 SDS-PAGE에 의해 분석하였고 쿠마시 염색에 의해 전체 단백질들을 염색하였다. 미정제 채취물로부터의 동일한 부피의 세포 샘플들과 βME(베타-머캡토에탄올)을 포함하는 2x 샘플 버퍼를 SDS 라엠밀리 겔(Laemmli gel) 위에 대략 15 내지 20㎕(약 7.5 내지 10㎕의 배양액)을 채웠다.

일부 경우에서, 크로마토그래피 대신에, 미정제 세포 채취물들에 있는 변형 HRSV F 단백질들을 30% 수크로오스 구배 분리 방법에 의해 농축한 후 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 또는 항-RSV F 단클론 항체를 사용하는 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다.

변형 재조합 F 단백질, 정제 재조합 F 단백질 또는 수크로오스 구배에 의해 농축된 재조합 F 단백질을 포함하는 미정제 세포 채취물을 항-RSV F 단클론 항체 및/또는 항-RSV F 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블럿에 의해 추가로 분석하였다.

실시예 3

F 단백질 BV #541을 암호화하는 변형 HRSV F 유전자

전장 HRSV F 단백질을 발현하려는 최초 시도들은 높은 수준의 발현을 얻는데 성공하지 못한 것으로 입증되었다. 발현에 사용된 F 유전자 서열은 SEQ ID NO:1(야생형 HRSV F 유전자, GenBank Accession No. M11486)이었다. 이것은 574 aa의 불활성 전구체(F₀)를 암호화한다. 이 전구체는 두 이황화-연결 폴리펩타이드, N 말단으로부터의 서브유닛 F₂ 및 C 말단으로부터의 F₁을 생성하기 위해 성숙분열 동안 퓨린-유사 프로테아제에 의해 2회 절단된다(도 1). 두 절단 위치들은 퓨린-인식 모티프(SEQ ID NO:23) 및 KKRKRR, aa 131-136(SEQ ID NO:24)보다 선행하는 잔기 109 및 136에 있다. SEQ ID NO:1의 F 유전자 서열은 Sf9 곤충 세포들에서 발현을 위한 부최적 코돈 사용을 포함하고 3개 에러를 포함하여, 최적 접힘 미만을 나타낼 수 있는 단백질을 생성한다(SEQ ID NO: 2, GenBank Accession No. AAB59858). 또한, 가능한 폴리(A) 아데닐화 위치(ATAAAA)를 F₂ 서브유닛을 암호화하는 지역에서 확인하였다. 또한, 야생형 F 유전자 서열은 대략 65% AT 리치이고, Sf9 곤충 세포 발현 시스템에서 유전자 서열의 원하는 GC-AT 비율은 대략 1:1이다.

HRSV F 단백질의 나쁜 발현 수준을 극복하려는 시도에서, 새로운 F 유전자 서열은

(a) 세 개의 젠뱅크 시퀀싱 에러를 수정하고;

(b) F2 서브유닛을 암호화하는 지역에 있는 잠재 폴리(A) 위치를 변형하고;

(c) F 유전자 코돈들을 최적화하고;

(d) F 유전자가 불활성화 주요 절단 위치를 가진 변형 F 단백질을 암호화하도록 설계하였다.

3개의 수정된 아미노산 에러들은 P102A, I379V 및 M447V이었다. HRSV F 유전자에서 잠재 폴리(A) 위치는 아미노산 서열을 변화시키지 않고 수정하였다. 코돈 최적화 계획은 다음 기준을 기초로 하였다:(1) 레빈, D.B 등(Journal of General Virology, 2000, vol. 81, pp. 2313-2325)에 의해 기술된 대로 소정의 아미노산을 위한 곤충 세포들의 인시목(lepidopteran) 종들에서 특정 코돈을 위한 아미노아실-tRNAs의 풍부함, (2) 대략 1:1로 유전 서열들에서 GC-AT 비율의 유지, (3) 앞뒤 상동 또는 스템-루프 구조의 최소 도입 및 (4) 전사 및 전사 후 억제 요소 서열들의 최소 도입. 최적화된 F 유전자 서열의 한 예는 SEQ ID NO:19(RSV-F BV #368)로 도시된다.

HRSV F 단백질의 주요 절단 위치(1°CS, KKRKRR, aa 131-136)를 불활성화하기 위해서, 퓨린 인식 위치를 KKQKQQ(SEQ ID NO:28) 또는 GRRQQR(SEQ ID NO:29)로 돌연변이시켰다. 이런 절단 위치 돌연변이를 가진 여러 변형 F 단백질들을 절단 방지의 효과를 측정하기 위해 평가하였다. 도 2는 평가된 몇 개의 변형 F 단백질들을 보여준다. 결과들은 HRSV F 단백질의 주요 절단 위치는 세 개의 보존성 아미노산 변화 R133Q, R135Q 및 R136Q에 의해 불활성화될 수 있다는 것을 나타낸다. 극성-하전 분자인 아르기닌(R)로부터 극성-중성 분자인 글루타민(G)으로의 이런 보존성 아미노산 변화들은 이런 위치들에서 전하 상태를 변화시켰고 퓨린-유사 프로테아제에 의한 절단을 예방하면서(도 3 참조), F 단백질 3D 구조를 여전히 보존하였다. 1°CS에서 절단의 예방은 F 단백질의 감소된 막 융합 활성을 발생시켰다.

상기한 모든 변형들을 갖도록 설계된 비 제한적인 예시적 변형 HRSV F 유전자 서열은 도 4에 도시된다. 이 변형 F 유전자(SEQ ID NO:5, RSV-F BV #541)는 SEQ ID NO:6의 변형 F 단백질을 암호화한다. 이 유전자 서열을 오버래핑 올리고뉴클레오티드로서 생체 외에서 합성하였고 숙주 세포들에서 복제하고 발현하였다. 변형 HRSV F 단백질 BV #541을 감염된 Sf9 곤충 세포 배양액 채취물로부터 정제하였고, 쿠마시에 의해 염색된 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 정제 및 SDS-PAGE 분석 방법은 실시예 2에 기술된다. F 단백질 RSV-F BV #541(예를 들어, F 단백질 541)의 발현 수준은 Sf9 곤충 세포들에서 야생형 F₀ 단백질과 비교해서 향상되었다.

실시예 4

F ₁ 서브유닛 융합 도메인 부분 결실을 가진 변형 HRSV F 단백질

RSV F 단백질의 발현을 추가로 향상시키기 위해서, 추가로 변형된 HRSV F 유전자들은 다음 변형을 포함하도록 설계하였다:

(a) 세 개의 젠뱅크 시퀀싱 에러를 수정하였다;

(b) F2 서브유닛을 암호화하는 지역에 있는 잠재 폴리(A) 위치를 변형하였다;

(c) F 유전자 코돈들을 최적화하였다;

(d) F₁ 서브유닛 융합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들은 부분적으로 결실되었다. 한 실험에서, F₁ 서브유닛 융합 도메인의 처음 10개 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 결실시켰다(SEQ ID NO:2의 아미노산 137-146에 해당).

상기 변형들을 포함하는 비 제한적인 예시적 변형 RSV F 유전자는 도 5에 도시되고, SEQ ID NO:10의 변형 F 단백질을 암호화하는 SEQ ID NO:9(RSV-F BV #622, 예를 들어, F 단백질 622)로 지정하였다. 이 변형 HRSV F 단백질 BV #622를 감염된 Sf9 곤충 세포 배양액 채취물로부터 정제하였고 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 정제 및 SDS-PAGE 분석 방법은 실시예 2에 기술된다. 도 6의 SDS-PAGE에 나타낸 대로, HRSV F 단백질 BV #622의 높은 발현 수준을 관찰하였다.

실시예 5

불활성화된 주요 절단 위치 및 F ₁ 융합 도메인 부분 결실을 가진 변형 HRSV F 단백질

불활성화된 주요 절단 위치와 F₁ 융합 도메인 부분 결실의 조합이, 특히 Sf9 곤충 세포들에서 RSV F 단백질의 발현을 추가로 촉진하는 지를 측정하기 위해서, 다른 변형 RSV F 유전자를 다음 변형을 포함하여 설계하였다:

(a) 세 개의 젠뱅크 시퀀싱 에러를 수정하였다;

(c) F 유전자 코돈들을 최적화하였다;

(d) 주요 절단 위치를 불활성화하였다; 및

(e) F₁ 서브유닛 융합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들은 부분적으로 결실되었다. 한 실험에서, F₁ 서브유닛 융합 도메인의 처음 10개 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 결실시켰다(SEQ ID NO:2의 아미노산 137-146에 해당).

F₁ 서브유닛 융합 도메인의 처음 10개 아미노산이 결실된 비 제한적인 예시적 변형 RSV F 유전자(SEQ ID NO:2의 아미노산 137-146에 해당)는 도 7a에 도시되며, SEQ ID NO:8의 변형 F 단백질을 암호화하는 SEQ ID NO:7(RSV-F BV #683, 예를 들어, F 단백질 683)로 표시된다. 이 변형 RSV F 단백질 BV #683(예를 들어, F 단백질 683)을 감염된 Sf9 곤충 세포 배양액 채취물로부터 정제하였고 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 정제 및 SDS-PAGE 분석 방법은 실시예 2에 기술된다. 도 8의 SDS-PAGE에 나타낸 대로, 발현 수준들에 추가 증가를 성취하였다.

다른 실시예 5

변형 HRSV F 단백질 융합 도메인 결실

Phe137 - Val154로부터의 ㅿ2, ㅿ4, ㅿ6, ㅿ8, ㅿ10, ㅿ12, ㅿ14, ㅿ16 또는 ㅿ18 아미노산의 F1 융합 도메인에서 결실들을 클론#541 속에 도입하였다(도 7a). 이런 결실 돌연변이들을 발현하는 바큘로바이러스로 감염된 Sf9 세포들을 비 이온성 세제(도 7b) 및 RSV F에 대해 염색된 세포들의 FACS 분석(도 7c)으로 감염된 세포들로부터 추출한 RSV F 단백질에 대해 분석하였다. 최대 10개 아미노산 Phe137 - Ser146의 결실(도 7a ㅿ2, ㅿ4, ㅿ6, ㅿ8 및 ㅿ10)은 부모 클론 BV#541에 비례하여 세포들로부터 추출된 가용성 F1의 수준을 증가시켰다(도 7b). 가용성 RSV F에서 급격한 손실은 분자의 mis-접힘 때문에 10개 아미노산 초과의 융합 도메인의 증가하는 결실과 함께 관찰되었다. 이런 결과들과 일치하여, F1 융합 펩타이드의 ㅿ2, ㅿ6 및 ㅿ10 아미노산 결실을 가진 구조체들은 RSV F의 최고 세포 표면 발현을 나타내었다(도 7c).

실시예 6

변형 HRSV F 단백질 BV #683의 발현과 정제

변형 HRSV F 단백질 BV #683(예를 들어, F 단백질 683, SEQ ID NO:8)을 실시예 1에서 기술한 대로 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현하였고 HRSV F 단백질 BV #683을 발현하는 재조합 플라크 고르고 확인하였다. 재조합 바이러스를 Sf9 곤충 세포들의 감염에 의해 증폭하였다. 곤충 세포들의 배양액을 바큘로바이러스로 ~3 MOI(Multiplicity of infection = virus ffu or pfu/cell)로 감염시켰다. 배양액과 상청액을 감염 후 48-72 시간에 채취하였다. 대략 30mL의 미정제 채취물을 대략 800 x g에서 15분 동안 원심분리에 의해 정제하였다. HRSV F 단백질 BV #683을 포함하는 결과로 얻은 미정제 세포 채취물들을 다음과 같이 정제하였다.

HRSV F 단백질 #683을 감염된 Sf9 곤충 세포 배양액 채취물들로부터 정제하였다. 비 이온성 계면활성제 Tergitol® NP-9(노닐페놀 에톡실레이트)를 막 단백질 추출 프로토콜에 사용하였다. 미정제 추출물을 음이온 교환 크로마토그래피, 렌틸 렉틴 친화성/HIC 및 양이온 교환 크로마토그래피를 통과시킴으로써 추가로 정제하였다.

정제된 HRSV F 단백질 BV #683을 실시예 2에 기술한 대로 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE와 항-RSV F 단클론 항체를 사용하는 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 결과들은 도 9에 도시된다. HRSV F 단백질 BV #683(예를 들어, F 단백질 683, SEQ ID NO:8)의 우수한 발현 수준을 얻었다. 발현 수준은 미정제 세포 배양액에서 10mg/L이었고, 회수한 F 단백질 BV #683은 약 3.5mg/L 세포 배양액이었다고 평가되었다. 일부 경우에 20 mg/L 이상의 발현 수준을 얻었고 약 5mg/L 변형 F 단백질 BV #683을 회수하였다(도 10 참조). 회수된 F 단백질 BV #683의 순도는 농도 측정기에 의해 측정된 대로 98% 이상에 도달하였다(도 10 참조).

실시예 7

정제된 HRSV F 단백질 BV #683 미셀( 로제트 )

정제된 HRSV F 단백질 BV #683을 음성 염색 전자 현미경에 의해 분석하였다(도 11 참조). F 단백질은 야생형 HRSV F 단백질(Calder et al., 2000, Virology 271, pp. 122-131) 및 다른 전장 바이러스 막 당단백질(Wrigley et al., Academic Press, London, 1986, vol. 5, pp. 103-163)에 대해 관찰된 것과 유사한 미셀(로제트) 형태로 응집되었다. 전자 현미경 아래에서, F 스파이크는 막대사탕-모양 막대 형상을 나타내었고 이들의 더 넓은 말단이 로제트의 중심으로부터 떨어져 돌출되었다(도 11).

다른 실시예 7

정제된 HRSV F 단백질 BV #683 미셀(로제트)의 HPLC 분석

정제된 HRSV F 단백질 BV #683을 HPLC로 분석하였다. 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 분석은 11.195분의 잔류 시간에서 90.1% F1+F2 및 6.256분의 잔류 시간에서 9.9% F1 폴리펩타이드로 이루어진 정제된 RSV F 미셀을 나타내었다(도 12a). 11.195분에서 F1+F2 피크는 이중 피크를 나타내었고, 이는 다른 당화 종들을 암시한다. F1+F2 및 F1의 동일성을 SDS-PAGE 및 분리된 HPLC 피크 분획의 웨스턴 블럿 분석에 의해 확인하였다. 질량분석법에 의한 온전한 질량 결정(intact mass determination)은 F1 및 F1+F2가 예상된 분자량과 유사한 각각 50KDa 및 61Kda의 분자량을 가졌다는 것을 나타내었다.

정제된 RSV F 나노입자들을 HPLC 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 추가로 분석하였다. RSV F 나노입자들은 주로 낮은 수준의 유리 F1 서브유닛을 가진 공유결합된 F1 및 F2(도 12b; F1+F2)로 이루어졌다. F1+F2는 전체 피크 면적의 95.8%이었고 F1은 전체 피크 면적의 3.8%이었다. RSV F 입자들의 순도는 ≥98%으로 예상되었다. F1+F2 피크를 이 SEC 컬럼의 틈새 부피(void volume)에서 용출되었고 F1 피크는 F1 트라이머에 대해 예상된 대로, 약 180Kda의 질량을 가졌다. 분석 초원심분리(AUC) 연구는 RSV F 나노입자들에서 대대수 종들은 약 100만 Da 내지 약 8백만 Da의 분자량을 가졌다는 것을 나타내었다.

단일 트라이머의 길이는 약 20nm이었고, 미셀 입자 지름은 약 40nm이었다(도 12 참조). 이런 결과들은 HRSV F 단백질 BV #683이 천연, 활성 단백질에 대해 정확한 3D 구조를 가진다는 것을 나타내었다.

요약하면, 변형 재조합 HRSV F 단백질(예를 들어, BV #683)을 설계하고, 발현시키고 정제하였다. 이 변형 전장 F를 당화하였다. 주요 절단 위치와 융합 도메인의 변형들은 함께 F 단백질의 발현 수준을 크게 향상시켰다. 또한, 이 변형 F 단백질은 이황화-결합인 F₁과 F₂ 서브유닛으로 절단될 수 있다. F₁과 F₂ 서브유닛의 트라이머는 19.6nm의 막대사탕-모양 스파이크 및 40.2nm의 입자들을 형성한다. 또한, 이 변형 F 단백질은 Sf9 곤충 세포들에서 높게 발현된다. >98%의 미셀들의 순도는 정제 후에 얻었다. 이 변형 단백질의 스파이크들은 40nm의 미셀들을 추가로 형성할 수 있는 막대 사탕 형상을 가진다는 사실은, 변형 F 단백질 BV # 683은 천연 단백질의 정확한 3D 구조를 가진다는 것을 나타낸다.

실시예 8

VLP 생산에서 BRSV M 및/또는 HRSV N에 의한 변형 HRSV F 단백질의 공동 발현

본 발명은 또한 변형 또는 돌연변이 RSV F 단백질을 포함하는 VLPs를 제공한다. 이런 VLPs는 바이러스 단백질 항원들에 대한 중성화 항체들을 유도하는데 유용하여 RSV에 대항하여 면역성을 일으키도록 투여될 수 있다. 예를 들어, 이런 VLPs는 변형 RSV F 단백질 및 BRSV M 및/또는 HRSV N 단백질을 포함할 수 있다. BRSV M(SEQ ID NO:14) 또는 HRSV N(SEQ ID NO:18) 단백질들을 암호화하는 유전자들의 코돈들은 곤충 세포들에서 발현을 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 최적화된 BRSV M 유전자 서열은 SEQ ID NO:13에 도시되고 최적화된 RSV N 유전자 서열은 SEQ ID NO:17에 도시된다.

한 실험에서, 변형 F 단백질 BV #622와 다른 변형 F 단백질 BV #623(SEQ ID NO:21, 두 절단 위치들이 불활성화되도록 변형)은 단독으로 발현되거나 HRSV N 단백질 및 BRSV M 단백질로 공동 발현되었다. VLPs(세포내) 및 30% 수크로오스 구배 분리에 의해 수집한 VLPs 펠릿을 포함하는 미정제 세포 채취물들은 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE와 항-RSV F 단클론 항체를 사용하는 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 도 13은 변형 F 단백질 BV #622 및 BV #623의 구조 및 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿 분석의 결과들을 도시한다. BV #622는 자체로 높게 발현되거나 HRSV N 단백질 및 BRSV M 단백질로 공동 발현된 반면, BV #623은 매우 나쁜 발현을 가져서, 두 절단 위치의 불활성화가 F 단백질 발현을 억제하는 것을 나타내었다.

다른 실험에서, 변형 F 단백질 BV #622, 이중 텐덤 유전자 BV #636(BV #541 + BRSV M), BV #683, BV #684(C 말단에 도입된 YIAL L-도메인을 가진 BV #541) 및 BV #685(C 말단에 도입된 YKKL L-도메인을 가진 BV #541)은 단독으로 발현되거나 HRSV N 단백질 및 BRSV M 단백질로 공동 발현되었다. L-도메인(레잇 도메인(Late domain))은 레트로바이러스에서 보존된 서열이고 세포의 표면으로부터 비리온들을 효과적으로 방출하기 위해 세포 단백질들과 함께 작용하는 Gag 내에 제공된다(Ott et al, 2005, Journal of Virology 79: 9038-9045). 각 변형 F 단백질의 구조는 도 14에 도시된다. VLPs(세포내) 및 30% 수크로오스 구배 분리에 의해 수집한 VLPs 펠릿을 포함하는 미정제 세포 채취물들은 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE와 항-RSV F 단클론 항체를 사용하는 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 도 14는 VLPs(세포내)를 포함하는 미정제 세포 채취물들의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 분석의 결과들을 도시하며 도 15는 30% 수크로오스 구배 분리에 의해 수집한 VLPs 펠릿의 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿 분석을 도시하였다. BV #622와 BV #683은 자체로 높게 발현되거나 HRSV N 단백질과 BRSV M 단백질로 공동 발현된 반면, BV #636, BV #684 및 BV #685는 나쁜 발현을 가졌다.

실시예 9

높은 발현을 가진 키메릭 HRSV F 단백질들의 스크리닝

곤충 세포들에서 가용 형태로 높게 발현될 수 있고 더 좋은 수율로 VLPs를 형성할 수 있는 추가 RSV F 단백질들을 스크리닝하기 위한 노력들이 이루어졌다. 다양한 유전자들을 설계하였고, 발현하였고 분석하였다. 웨스턴 블럿과 SDS-PAGE 모두를 사용하여 발현을 평가하였다.

도 16a 내지도 16d는 각각의 키메릭 HRSV F 클론에 대한 구조, 클론 이름, 설명, 웨스턴 블럿/쿠마시 분석 결과 및 결론을 요약한다.

결과가 나타낸 대로, 야생형 전장 F 단백질은 나쁘게 발현되었고; F₁을 포함하나 F₂ 서브유닛을 포함하지 않는 키메릭 HRSV F 단백질들은 잘 발현될 수 있으나 생성물들은 잘못 접힘 때문에 불용성이었거나 공동 감염 후 우수한 수율을 가진 VLPs를 형성하기 위해 다른 바이러스 단백질들과 회합하지 않았다. 주요 절단 위치 단독의 불활성화는 발현에 실질적인 증가를 가져오지 않았고, 우수한 발현은 주요 절단 위치의 불활성화가 잠재 폴리(A) 위치의 결실과 젠뱅크 aa 에러(예를 들어, BV #541)의 수정과 같은 다른 변형과 결합하였을 때 얻었다. BV #541의 C 말단 속으로 YKKL L-도메인의 도입은 BRSV M 및 HRSV N 단백질과 공동 발현에서 약 2-3배를 위해 변형 F 단백질을 포함하는 VLPs의 분비를 향상시켰다. 결과들은 BV #541과 BRSV M 유전자로 이루어진 이중 텐덤 키메릭 유전자는 BV #541과 BRSV M 단백질들의 공동 감염과 비교하여 모두 향상된 세포내 및 VLPs 수율을 나타내었다는 것을 추가로 보여주어, BRSV M 단백질은 텐텀으로 발현될 때 곤충 세포들에서 변형 HRSV F 단백질을 포함하는 VLPs의 생산을 촉진할 수 있다는 것을 나타내었다. BV #541, BRSV M 및 HRSV N으로 이루어진 삼중 텐덤 키메릭 유전자(triple tendem chimeric gene)는 상기한 이중 텐덤 키메릭 유전자 또는 BV #541과 BRSV M 단백질들의 공동 감염과 비교하여 더 높은 세포내 및 훨씬 좋은 VLPs 수율을 가졌다. 또한, 결과들은 키메릭 HRSV F 단백질 BV #683(예를 들어, F 단백질 683, SEQ ID NO:8)은 최고의 세포내 발현을 가졌다는 것을 나타내었다. BV #683과 BRSV M 유전자들로 이루어진 이중 텐덤 키메릭 유전자 또는 BV #683, BRSV M 및 HRSV N 유전자들로 이루어진 삼중 텐덤 키메릭 유전자의 발현이 본 발명에서 구현된다. 이런 이중 및 삼중 텐덤 키메릭 유전자는 공동 감염과 비교하여 VLP 생산을 추가로 향상시켜야 한다.

실시예 10

생쥐에서 RSV 중성화 분석법 및 RSV 면역성 검사 연구

RSV 감염을 억제하는데 변형 HRSV F 단백질 BV #683을 포함하는 백신의 효능을 검사하기 위해서, 중성화 분석법과 RSV 면역성 검사 연구를 생쥐에서 수행하였다. 실험 절차들은 도 17에 도시된다.

생쥐의 그룹(n=10)에 위약(PBS 용액), 생 RSV(비강으로 제공), 포르말린 비활성화 RSV 백신(FI-RSV), 1㎍ 정제 F 입자들(PFP, 변형 F 단백질 BV #683), 1㎍ 정제 F 입자들과 칼륨명반(PFP + Alum), 10㎍ 정제 F 입자들, 10㎍ 정제 F 입자들과 칼륨명반(PFP + Alum) 또는 30㎍ 정제 F 입자들로 0일 및 21일 근육내(생 RSV 제외)로 주사하였다. 각각의 면역화된 그룹을 42일(제 2 면역화 후 21일)에 생 RSV로 면역성 검사하였다. 각 그룹으로부터의 생쥐 혈청을 0일, 31일(제 2 면역화 후 10일) 및 46일(생 RSV에 의한 면역성 검사 후 4일)에 채취하였다.

각 치료 그룹으로부터의 생쥐 혈청을 항-RSV 중성화 항체들이 존재하는 지에 대해 분석하였다. 면역화된 생쥐의 혈청의 희석물들을 96웰 미세적정 판에서 감염성 RSV로 배양하였다. 혈청을 1:20로부터 1:2560으로 희석하였다. 50㎕ 희석된 혈청을 각 웰에서 50㎕ 생 RSV 바이러스(400pfu)와 혼합하였다. 바이러스/혈청 혼합물을 실온에서 60분 동안 먼저 배양한 후 100㎕ HEp-2 세포와 혼합하였고 4일 동안 배양하였다. 감염성 바이러스 플라크의 수를 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 계수하였다. 각 혈청 샘플에 대한 중성화 역가는 100% RSV 중성화(예를 들어, 플라크 없음)를 일으킨 혈청의 최고 희석의 역원으로 정의하였고 각 동물에 대해 측정하였다. 31일(부스트 후 10일) 및 46일(생 RSV로 면역성 검사 후 4일)에서 기하학적 평균 혈청 중성화 항체 역가(geometric mean serum neutralizing antibody titer)를 각 백신 그룹에 대해 그래프로 그렸다. 도 18은 중성화 분석법의 결과들을 도시한다. 이 결과들은 10㎍ 또는 30㎍ 정제 F 단백질은 생 RSV와 비교하여 훨씬 높은 중성화 역가를 생성한다는 것을 나타낸다. 또한, PFP의 중성화 역가는 칼륨명반 항원 보강제의 공동 투여에 의해 증가한다.

RSV 면역성 검사 연구들은 면역화가 면역화된 동물들의 폐에서 RSV 복제를 예방 및/또는 억제할 수 있는지를 측정하기 위해 수행하였다. 면역화된 생쥐들의 폐에서 RSV의 양은 HEp-2 세포들을 사용하는 플라크 분석법에 의해 측정하였다. 상기한 생쥐의 면역화된 그룹들을 42일(제 2 면역화 후 11일)에 1 x 10⁶ pfu의 감염성 RSV 긴 균주로 비강으로 감염시켰다. 46일(RSV 감염 후 4일)에, 생쥐의 폐들을 제거하고, 계량하고 균질화하였다. 균질화된 폐 조직을 정제하였다. 정제된 용액의 상청액을 희석하고 폐 조직에 있는 RSV 역가(pfu/g 폐 조직으로 계산)를 측정하기 위해 HEp-2 세포들을 사용하여 플라스 분석을 하였다. 결과들은 도 19에 도시되며, 재조합 RSV F 단백질 BV #683으로 면역화된 모든 생쥐는 폐에 탐지할 수 없는 RSV를 가졌으며 항원 보강제 없는 1㎍ 정제된 재조합 HRSV F 단백질 BV #683은 RSV 복제를 억제하는데 우수한 효과를 나타내었다(위약과 비교해서 1000배보다 많이 감소하였다).

위에서 사용된 RSV PFP 백신의 안정성을 측정하기 위해서, 백신을 0, 1, 2, 4 및 5주 동안 2-8℃로 저장하였고 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE로 분석하였다(도 20). 결과들은 이 RSV PFP 백신은 2-8℃에서 매우 안정하고 탐지가능한 열화는 없다는 것을 나타낸다.

실시예 11

코튼랫에서 재조합 RSV F 미셀 활성

이 실시예에서, 동물 그룹들은 0일 및 21일에 생 RSV(RSV), 포르말린 불활성화 RSV(FI-RSV), 칼륨명반이 있는 및 없는 RSV-F 단백질 BV #683(PFP 및 PFP + 칼륨명반 항원 보강제) 및 PBS 대조군에 의한 면역화를 포함하였다.

도 21에 도시된 대로, 칼륨명반이 있는 및 없는 F-미셀 백신(RSV-F 단백질 BV #683, 즉, F 단백질 683, SEQ ID NO:8)의 30㎍에 의한 면역화는 RSV A 및 RSV B에 노출된 후 강한 중성화 항체 반응들을 일으켰다. 또한, 칼륨명반은 항체 반응을 현저하게 향상시킨다는 것을 관찰하였다. 또한, 중성화 항체들은 각각 RSV A 및 RSV B에서 46일 또는 49일에 부스트 이후 증가하였다.

현저한 폐 병변이 포르말린 불활성화 RSV(FI-RSV)로 면역화된 쥐들에서 발견된 반면, F-미셀 백신으로는 질환의 증가가 나타내지 않았다(도 22). F-미셀 백신 및 항원 보강제를 가진 F-미셀 백신의 사용은 주요 RSV 감염(PBS + RSV 면역성 검사) 대조군(5.8)보다 더 낮은 염증 점수(각각 4.0 및 2.8)를 나타내었다. 상기한 대로, FI-RSV 치료된 그룹은 주요 RSV 감염(PBS + RSV 면역성 검사) 대조군보다 더 높은 감염 점수를 가졌다(9.0 대 5.8). 또한, FI-RSV 치료된 그룹은 면역성 검사되지 않은 위약 대조군, 생 RSV + RSV 면역성 검사(challenge), F-미셀 + RSV 면역성 검사 및 F-미셀 + 칼륨명반 + RSV 면역성 검사보다 현저하게 높은 평균 감염 점수(9.0)를 가졌다.

실시예 12

쥐들에서 RSV F 나노입자 백신의 임상전 효능

RSV F 나노입자 백신의 효능을 코튼랫들에서 테스트하였다.

RSV-A에 대한 중성화 항체 반응들을 RSV F 백신±칼륨명반으로 면역화된 코튼랫들에서 평가하였다.

한 연구에서, 코튼랫들을 다음 치료 그룹들 중 하나로 면역화하였다:

(1) PBS;

(2) RSV;

(3) 포르말린 불활성화-RSV(FI-RSV);

(4) RSV F 나노입자 백신(1㎍ + 칼륨명반)

(5) RSV F 나노입자 백신(6㎍ + 칼륨명반)

(6) RSV F 나노입자 백신(30㎍ + 칼륨명반)

그런 후에 21일 및 49일에 쥐들로부터 사혈하였다. 49일의 혈청을 플라크 감소 중성화 테스트를 사용하여 중성화 분석법에서 RSV-A에 대해 테스트하였다. 이 실험의 결과들은 도 23에 제공된다. 도 23은 중성화 역가 vs. 각 개별 치료 그룹을 나타내는 그래프이다. 각 치료 그룹에 대한 선은 RSV-A 바이러스 100%를 중성화한 종점 역가의 기하학적 평균을 나타낸다. 결과들은 본 발명의 백신은 RSV를 RSV 및 FI-RSV보다 더 큰 정도로 중성화하였다는 것을 나타내었다.

다른 연구에서, 코튼랫들을 다음 치료 그룹들 중 하나로 면역화하였다:

(1) PBS;

(2) RSV;

(3) FI-RSV;

(4) RSV F 나노입자 백신(1㎍)

(5) RSV F 나노입자 백신(1㎍ + 칼륨명반)

(6) RSV F 나노입자 백신(10㎍)

(7) RSV F 나노입자 백신(10㎍ + 칼륨명반)

(8) RSV F 나노입자 백신(30㎍)

상기 치료 그룹들 중 하나로 0일 및 21일에 코튼랫들을 면역화하였다. 뒤이어 31일에 쥐들을 사혈하였다. 모든 그룹들로부터의 혈청을 CPE 분석법에서 RSV-A에 대해 테스트하였다. 도 24는 Log2 역가로 표현된 코튼랫에서 RSV-A에 대한 중성화 항체 반응들 vs. 개별 백신접종 그룹(x-축)을 나타낸다. 본 발명의 백신은 RSV를 RSV 및 FI-RSV보다 더 큰 정도로 중성화하였다. 또한, 칼륨명반이 투여된 나노입자 백신들은 칼륨명반이 없는 나노입자 백신들보다 더 큰 수의 중성화 역가를 나타내었다.

다른 실험에서, 코튼랫들을 다음 치료 그룹들 중 하나로 면역화하였다:

(1) PBS;

(2) RSV;

(3) FI-RSV;

(4) RSV F 나노입자 백신(1㎍)

(5) RSV F 나노입자 백신(1㎍ + 칼륨명반)

(6) RSV F 나노입자 백신(6㎍)

(7) RSV F 나노입자 백신(6㎍ + 칼륨명반)

(8) RSV F 나노입자 백신(30㎍)

(9) RSV F 나노입자 백신(30㎍ + 칼륨명반)

코튼랫들을 0일 및 21일에 백신 치료 그룹 (1)-(9) 중 하나로 면역화하였고, 뒤이어 49일에 RSV A 균주 바이러스로 면역성 검사를 하였다.

폐 조직들을 54일에 수집하였다(n=8/그룹). 그런 후에 조직을 균질화하고 감염성 바이러스를 탐지하기 위해 Hep-2 단층 플라크 분석법을 사용하여 RSV 바이러스의 존재에 대해 평가하였다. 도 25는 RSV F 나노입자들에 의해 유발된 중성화 항체들은 면역성 검사된 동물들의 폐에서 RSV 바이러스 복제를 예방하는데 효과적이었다는 것을 나타낸다. 도 25에서, RSV 역가는 log10 pfu/폐 조직의 그램 당으로 표현된다.

또한 ELISA 분석법을 항-RSV 항체들의 존재 또는 부존재를 결정하도록 상기 9개 백신접종 그룹들로 치료된 쥐 혈청에 대해 실행하였다. 각 그룹에서 동물들에 대한 혈청을 합쳤다. 결과들은 ELISA 유닛(4개의 변수 적합 희석 곡선(parameter fit dilution curve)에 대한 50% 역가에 해당; 도 26a) 또는 RSV-F IgG 역가(도 26b)에 의해 측정한 대로 도 26a 및 26b에 제공된다. 본 발명의 백신으로 치료된 동물들은 RSV 또는 FI-RSV로 치료된 동물들보다 큰 수의 탐지가능한 항-RSV 항체들을 생산하였다. 또한, 칼륨명반은 항체 반응을 증가시켰다.

항-RSV F 항체의 기능적 활성을 HEp-2 세포 단층에 대한 100% RSV 세포병변 활성을 억제할 수 있는 항혈청의 희석을 측정함으로써 RSV 중성화 분석법에서 평가하였다. 항원보강되지 않은 RSV F 나노입자들의 모든 복용량에 의한 면역화는 RSV중성화 항체의 개발을 초래하였다(도 26c). 항-RSV F IgG에 대한 결과들과 일치하여, 인산알루미늄 항원보강제의 공동 투여는 RSV 중성화 항체 역가를 3.5 - 18배 증가시켰다. 생 RSV에 의해 유도된 중성화 항체 역가는 낮은 복용량 RSF F 항원보강 그룹에 필적하였고 성분은 RSV G 단백질로 향해졌다. 포르말린 불활성화 RSV(FI-RSV)로 면역화된 코튼랫들로부터의 혈청은 중성화 활성을 나타내지 않았다(도 26c; FI-RSV).

RSV F 단백질 상의 항원 부위 II는 RSV 질병의 예방을 위한 예방법에 사용된 인간화된 RSV 중성화 단클론 항체인 팔리비주맙의 표적인 것으로 나타났다. 항원 부위 II로 향해진 항체들이 RSV F 나노입자들에 의한 면역화에 의해 유도되었는지를 결정하기 위해서, 각 그룹 내의 개별 동물들로부터 합쳐진 혈청을 사용하는 팔리비주맙 경쟁 ELISA를 실행하였다. 생 RSV 치료 동물, FI-RSV 면역화 동물 또는 PBS 대조군 동물로부터 얻은 혈청은 팔리비주맙 결합을 억제하지 않았다(도 26d). 반대로, RSV F 나노입자들로 면역화된 동물들로부터 얻은 혈청 풀(pools)은 RSV F에 대한 팔리비주맙의 결합을 억제한 높은 수준의 항체를 가졌다(도 26d). 이 결과는 인산알루미늄 항원보강제와 함께 또는 없이 모든 복용량으로부터 풀에 대해 얻었다. 이런 데이터는 RSV F 단백질은 팔리비주맙과 동일한 특이성으로 항체들을 자극한다는 것을 증명한다.

조직생리학

RSV에 의해 면역성 검사된 코튼랫의 조직생리학을 또한 연구하였다. 0일 및 21일에 다음 백신접종 그룹 중 하나로 코튼랫들을 면역화하였다:

(1) RSV F 나노입자 백신(1㎍, 6㎍ 또는 30㎍; +/- 칼륨명반)

(2) FI-RSV

(3) RSV

(4) PBS

(5) PBS

그룹(1)-(4)으로부터의 쥐들은 뒤이어 49일에 RSV A 균주 바이러스로 면역성 검사하였다. 그룹(5)으로부터의 쥐들은 바이러스로 면역성 검사를 하지 않았다. 폐 조직은 면역성 검사 후 5일에 분리하였다. 조직을 동결하고, 절단하여 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 대표적 현미경 사진들은 대조군 동물 및 30㎍ + 칼륨명반 백신 그룹에서 세기관지주위염 질환을 나타내기 위해 제공된다(도 27).

(Prince GA, et al. (1986) J Virol 57: 721-728)에 기술된 대로) 다음 5개 변수: a) 세기관지염; b) 혈관염; c) 기관지염; d) 폐포염 및 e) 간질성 폐렴의 각각에 대한 심각성이 증가하는 순서로 0 내지 4의 점수(0 = 없음; 1=최소; 2=약함; 3=중간; 4=최대 염증)를 사용하여 블라인드 방식으로 슬라이드들을 평가하였다. 5개 변수들 중 각각에 대한 개략 값을 함께 더하여 각 동물에 대한 단일 개략 값에 도달하였다. 각 그룹에 대한 개략 점수를 사용하여 산술 평균±SEM으로 표현된 전체 평균 점수/그룹에 도달하였다.

다양한 실험 그룹들에 대한 조직생리학 점수들의 분석(표 1)은 FI-RSV가 생 바이러스에 의한 후속 면역성 검사에 기초하여 염증을 악화시켰다는 것을 증명하였다. FI-RSV에 대한 전체 조직생리학 점수는 RSV에 의해 면역성 검사된 비 면역 동물들에 대해 관찰된 것보다 현저하게 높았다(평균 5.63; p<0.001, t-테스트). 대조군에 비례하여 칼륨명반의 존재 또는 부존재에서 임의의 RSV F 면역화 그룹에서 병변의 현저한 증가는 관찰되지 않았다. RSV로 감염되고 RSV로 면역성 검사된 코튼랫들은 0.75의 평균 점수를 가졌다. 1.13 및 1.43의 다음 최저 조직생리학 점수는 6㎍ 및 30㎍ RSV F 나노입자들로 각각 면역화된 항원보강된 백신 그룹들에 있었다(표 1). 이런 데이터는 항원보강된 RSV F 나노입자 백신은 RSV 면역성 검사 후 폐 염증을 억제한다는 것을 입증한다.

면역화된 코튼랫들에서 폐 조직생리학적 변수들

각 조직생리학 변수에 대한 전체 점수
치료	세기관지염	혈관염	기관지염	페포염	폐렴	평균, 전체 수단
PBS 단독	0	0	1	0	0	0.13
PBS+Chal	5	0	10	5	1	2.63
RSV+Chal	1	1	2	2	0	0.75
FI-RSV+Chal	15	0	19	9	2	5.63
1㎍ RSV-F+Chal	6	0	9	2	0	2.13
칼륨명반을 가진 1㎍ RSV-F+Chal	7	5	7	5	0	3.43
6㎍ RSV-F+Chal	5	0	11	3	0	2.71
칼륨명반을 가진 6㎍ RSV-F+Chal	0	0	7	2	0	1.13
30㎍ RSV-F+Chal	6	2	13	6	1	3.50
칼륨명반을 가진 30㎍ RSV-F+Chal	1	0	6	3	0	1.43

실시예 13

생쥐에서 RSV F 나노입자 백신의 임상전 효과

ELISA 판들을 2㎍/mL의 RSV F 미셀로 코팅하였다. 면역 전 혈청 및 칼륨명반을 가진 30㎍ RSV F로 0일에 면역화된 생쥐로부터의 28일 혈청의 풀을 50ng/mL 비오틴-팔리비주맙 에피토프 펩타이드와 혼합하였다. 그런 후에 이런 샘플들을 연속적으로 희석하고 정제된 RSV F 코팅 ELISA 판으로 배양하였다. 스트렙타비딘을 사용하여 판에 결합된 팔리비주맙을 측정하였다.

미가중 4개 변수 로그 회귀 곡선이 도 28에 제공된다. 결과들은 본 발명의 나노입자 백신에 의해 생산된 항체들은 표적 RSV와 결합하기 위한 팔리비주맙 펩타이드와 경쟁하였다는 것을 나타내었다.

실시예 14

RSV 나노입자 백신- 팔리비주맙 분석법

본 발명의 RSV 나노입자 백신의 시나지스에 대한 결합을 분석하였다.

팔리비주맙 에피토프 펩타이드에 대한 시나지스 mAb 의 결합. ELISA 판들을 5㎍/mL의 스트렙타비딘으로 코팅하였다. 1㎍/mL의 팔리비주맙 펩타이드를 비오틴 링커를 통해 스트렙타비딘에 대한 판에 결합시켰다. 10㎍/mL의 시나지스^®를 연속적으로 4배 희석하고 판 위의 펩타이드에 배양하였다. 항 인간 HRP 반응을 사용하여 시나지스^®결합을 탐지하였다.결과들은 도 29a(왼쪽 그래프)에 제공된다.

재조합 RSV F 미셀에 대한 시나지스 ^® 의 결합. ELISA 판들을 2㎍/mL RSV F 미셀 항원으로 코팅하였다. 10㎍/mL 농도의 시나지스^®를 연속적으로 4배 희석하고 판 위의 RSV F에 반응시켰다. 항 인간 HRP 반응을 사용하여 RSV F 미셀에 대한 시나지스결합을 측정하였다. 미가중 4개 변수 로그 회귀 곡선이 제공된다(도 29b, 오른쪽 그래프). 결과들은 시나지스^®가 본 발명의 백신을 인식하고 결합하였다는 것을 나타내었다.

실시예 15

RSV F 나노입자 백신의 임상적 안전성

단계 1 무작위, 관찰자 블라인드 위약 제어 시험을 실행하여 복용량 증가 방식으로 건강한 성인들에서 RSV 나노입자 백신의 안전성과 면역원성을 평가하였다.

150명의 건강한 성인들에 0일 및 30일에 2회 면역접종으로 투여하였다. 치료 그룹은 아래 표 2에 제공된다. 대상들에 대한 인구 통계 및 대상 성질이 각각 표 3 및 4에 제공된다.

무리	그룹 지정	대상들의 수	RSV 나노입자 복용량	칼륨명반 복용량
무리 1 (N=25)	A	20	5㎍	1.2 mg
무리 1 (N=25)	E	5	0㎍	0 mg
무리 2 (N=25)	B	20	15㎍	1.2 mg
무리 2 (N=25)	E	5	0㎍	0 mg
무리 3 (N=25)	C	20	30㎍	1.2 mg
무리 3 (N=25)	E	5	0㎍	0 mg
무리 4 (N=25)	D	20	30㎍	0 mg
무리 4 (N=25)	E	5	0㎍	0 mg
무리 5 (N=25)	F	20	60㎍	1.2 mg
무리 5 (N=25)	E	5	0㎍	0 mg
무리 6 (N=25)	G	20	60㎍	0 mg
무리 6 (N=25)	E	5	0㎍	0 mg

백신 그룹	위약 (그룹 1)	5㎍ + 칼륨명반 (그룹 2)	15㎍ + 칼륨명반 (그룹 3)	30㎍ + 칼륨명반 (그룹 4)	30㎍ (그룹 5)	60㎍ + 칼륨명반 (그룹 6)	60㎍ (그룹 7)
대상의 # (n)	30	20	20	20	20	20	20
나이(연)
평균 (SD)	29.0 (6.92)	35.6 (7.70)	34.9 (9.20)	29.7 (7.41)	31.5 (8.41)	26.4 (5.59)	33.5 (8.55)
최소, 최대	19, 47	20, 49	20, 49	20, 46	18, 48	19, 43	20, 49
나이 그룹 (%) 18-30	66.7%	20.0%	30.0%	60.0%	50.0%	85.0%	45.0%
나이 그룹 (%) 31-40	30.0%	65.0%	45.0%	30.0%	40.0%	10.0%	30.0%
Age group (%) 41-49	3.3%	15.0%	25.0%	10.0%	10.0%	5.0%	25.0%
성별(%)
남성	40.00%	50.00%	55.00%	35.00%	55.00%	25.00%	25.00%
여성	60.00%	50.00%	45.00%	65.00%	45.00%	75.00%	75.00%

대상 성질(숫자(대상 숫자의 백분율))
무작위	30 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)
안전성	30 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)	20 (100.0)
수정된 치료 의향 (Modified Intent-to-Treat (MiTT))	28 (93.3)	19 (95.0)	19 (95.0)	20 (100.0)	18	18	20 (100.0
계획서 순응(Per-protocol)	26 (86.7)	17 (85.0)	16 (80.0)	18 (90.0)	17 (85.0)	13 (63.0)	18 (90.0)

부작용(AEs, 국소 및 전신 모두)이 면역화 1-7일 후에 유도되었다.

국소 통증은 위약 투여 환자들의 6.7%로 보고되었다. 백신 그룹들의 15% 내지 55%의 환자들은 통증을 보고하였다. 한 대상은 심한 통증을 보고하였다(30㎍+칼륨명반 치료). 복용량 반응 효과가 없었다.

압통은 위약 투여 환자들의 10%로 보고되었다. 백신 그룹들의 20% 내지 55%의 환자들이 압통을 보고하였다. 한 대상은 심한 압통을 보고하였다(60㎍+칼륨명반 치료). 복용량 반응 효과가 없었다.

두통은 위약 투여 환자들의 16.7%로 보고되었다. 백신 그룹들의 10% 내지 35%의 환자들이 압통을 보고하였다. 복용량 반응 효과가 없었다.

백신을 전체적으로 잘 견뎠다. 대다수의 부작용은 국소 통증 및 압통이었고 대다수는 약했다. 국소 부작용은 위약과 비교하여 백신 그룹에서 더 높았다. 백신의 복용량을 기초로 한 부작용 경향이 없었다. 또한, 백신 관련 심각한 부작용들이 없었다.

실시예 16

RSV F 나노입자 백신의 면역원성

실시예 15에 제공된 대로, 단계 1 시험을 실행하였다.

RSV 나노입자 바이러스들의 면역원성을 분석하였다. 면역원성을 분석하는데 사용된 다양한 분석법에 대한 계획이 도 30에 제공된다.

RSV F/ 시나지스 ( 팔리비주맙 ) 펩타이드 ELISA

ELISA 판들을 5㎍/mL의 스트렙타비딘으로 코팅하였다. 1㎍/mL의 팔리비주맙 펩타이드를 스트렙타비딘에 결합시켰다. 본 발명의 백신으로 치료한 대상들로부터의 인간 혈청을 판들에 주입하였다. 그런 후에 2차 항체(항 인간 HRP)를 첨가하여 팔리비주맙 펩타이드에 대항하는 항-RSV F IgG를 탐지하였다.

도 31은 이 연구의 결과들을 제공한다. 나노입자 백신 치료 그룹들의 각각은 대조군보다 현저하게 많은 RSV IgG를 생산하였고 칼륨명반 그룹들은 비-칼륨명반 그룹들보다 더 좋게 실행하였다. 도 31에서, 각 치료 그룹은 3개 측정을 포함한다: (1) 1일의 혈청(왼쪽 막대), (2) 30일의 혈청(중간 막대), (3) 60일의 혈청(오른쪽 막대).

항- RSV F IgG ELISA

ELISA 판들을 2㎍/mL RSV F 또는 RSV G 항원으로 코팅하였다. 본 발명의 백신으로 치료 한 후 RSV로 면역성 검사한 대상들로부터의 인간 혈청을 판들에 주입하였다. 그런 후에 2차 항체(항 인간 HRP)를 첨가하여 인간 혈청에서 항-RSV F 또는 항-RSV G IgG를 탐지하였다.

나노입자 백신 치료 그룹들의 각각은 검사된 모든 시점들에서 RSV F에 대항하여 IgG 항체들을 생산하였다(도 32a). 반대로, 백신 치료 그룹들은 소량의 항-RSV G 항체들의 생산을 유도하였다(도 32b). 도 32a 및 b에서, 각 치료 그룹은 3개 측정을 포함한다: (1) 1일의 혈청(왼쪽 막대), (2) 30일의 혈청(중간 막대), (3) 60일의 혈청(오른쪽 막대).

이 시험의 결과들은 또한 아래 표 5a 및 5b에 제공된다. 표 5a는 모든 그룹에서 IgG 수준의 기하학적 평균을 나타낸다. IgG 수준에서 기하학적 평균 배수 상승은 또한 칼륨명반 그룹에 대해 도표로 나타내었다(도 33). 현저한 복용량 반응을 얻었다(p<0.05). 표 5b는 60㎍ + 칼륨명반 그룹에서 개별 대상들에 대한 ELISA의 결과(ELISA 유닛(unit)으로 표현)를 나타낸다.

[표 5a]

[표 5b]

RSV 플라크 감소 중성화 역가( PRNTs )

이런 시험들의 결과들이 도 34 및 35에 제공된다. 도 34는 60일 항체들이 모든 그룹들에 대한 위약보다 현저하게 높았다는 것을 나타낸다. 백신 그룹들에서 면역화 후 PRNTs는 성인, 어린이 및 유아에서 보호성인 것으로 예측된 수준을 초과하였다.

도 35는 위약 및 30㎍ + 칼륨명반 그룹에서 0일, 30일 및 60일 PRNTs에 대한 역 누적 분포를 나타낸다. 0일에서 최소 역가는 5log₂이었고 60일에서 RSV F 재조합 나노입자들에 의한 면역화 후 최소 역가는 8.5log₂이었다.

실시예 17

RSV F 나노입자 백신에 의해 유도된 항체들의 접착력

단계 1 시험을 실시예 15에 제공된 대로 실행하였다.

RSV F에 대한 인간 혈청에서 항체들의 접착력을 BIAcore SPR-기반 측정 시스템을 사용하여 측정하였다. RSV F 단백질을 센서 표면상에 고정하였고 혈청을 고정된 RSV F 위로 통과시켰다. 고정된 RSV F에 대한 결합은 센서 표면상의 분자량을 기초로 측정하였다. 결합 속도와 해리 속도는 시간의 함수로 측정하여 센서그램 상에 도표로 나타내었고, 해리 상수는 결합 속도와 분리 속도로부터 계산하였다.

도 36은 BIAcore SRP-기반 분석을 위한 대조군을 제공한다. 도 36a는 양성 대조군 팔리비주맙 항체 및 RSV 참조 혈청(BEI 리소스로부터 구입가능하며 Yang et al. 2007, Biologicals 35; 183-187에 기술됨)에 대한 결합 속도(k-On), 해리 속도(k-Off) 및 해리 상수(KD)를 나타낸다. 도 36b는 양성 대조군 팔리비주맙과 대조하여, 단계 1 시험으로부터의 0일 및 위약 대조군 혈청으로부터 음성 결과들을 입증하는 센서그램을 나타낸다.

도 37은 팔리비주맙 항체 및 대표적 예방접종자(대상 ID# 1112, 30일)에 대한 결합 곡선을 제공한다.

60㎍ 백신 + 항원보강제 그룹에서 13명 대상에 대한 연구의 결과들은 아래 표 6에 제공된다. 30일에, 이런 13명 대상에 대한 KD는 0.11pmol 내지 992pmol이며; 60일에, KD는 0.00194pmol 내지 675pmol이었다. 따라서, RSV F에 대한 인간 혈청에서 항체들의 결합력은, 팔리비주맙 항체 대조군과 같이, 피코몰 범위에 있었다.

	KD
대상 ID	30일	60일
1104	1.76 E-12	8.26 E-13
1105	3.92 E-13	8.23 E-14
1107	3.91 E-13	2.24 E-14
1108	6.80 E-13	1.94 E-15
1109	9.92 E-10	NA
1110	1.35 E-10	1.62 E-10
1112	2.29 E-12	3.64 E-13
1113	2.72 E-13	9.02 E-14
1115	4.21 E-13	6.75 E-10
1117	4.93 E-13	4.18 E-13
1119	1.11 E-13	1.55 E-13
1120	1.23 E-13	1.70 E-13
11024	6.18 E-13	4.79 E-13
팔리비주맙	0.95 E-10

실시예 18

RSV F 나노입자 백신에 의해 유도된 팔리비주맙 -유사 IgG 항체들

단계 1 시험을 실시예 15에 제공된 대로 실행하였다. 60㎍ 백신 + 항원보강제 그룹에서 13명 대상으로부터의 혈청에서 팔리비주맙-유사 IgG 항체들(RSV F와 결합하기 위해 팔리비주맙 에피토프 펩타이드와 결합하는 항체들)을 경쟁 결합 분석법을 통해 측정하였다. 아래 표 7에 제공된 결과들은 팔리비주맙-유사 항체들은 30일 및 60일에 테스트된 모든 대상에서 보호 수준보다 매우 높았다(≥40㎍/mL)는 것을 나타내었다.

	팔리비주맙 -유사 IgG (㎍/ ml )
대상 ID	30일	60일
1104	57	66
1105	85	106
1107	208	312
1108	169	116
1109	177	253
1110	106	134
1112	190	203
1113	337	315
1115	109	131
1117	76	261
1119	96	140
1120	77	122
11024	94	124

실시예 18

곤충 세포들에서 제조된 재조합 RSV F 단백질 나노입자 백신의 면역원성: 인간 대상들에서 팔리비주맙 -유사 활성의 유도

이 실시예에서 투여된 백신은 트라이머로 결합된 거의 전장인 F 단백질을 포함하는 나노입자들을 포함한다. F 단백질은 재조합 바큘로바이러스로 감염된 Sf9 곤충 세포들에서 생산되었다. 세포들을 용해하고 세제로 가용화하였고, F 단백질을 크로마토그래피로 정제하였다. 항원을 근육내 주사로, ALPO₄에 흡착하거나 하지 않은 상태로 투여하였다.

건강한 성인(N = 150; 평균 나이 31.3년; 59% 여성)을 6 무리로 등록하였고, 각각은 20명의 활성 백신 수여자 및 5명 위약 수여자를 포함한다. 테스트 제품은 30일 간격으로 2회 연속 복용량으로 제공되었다.

RSV F 항원을 AlPO₄에 흡착된 5, 15, 30 및 60㎍ 및 항원보강제 없는 30 및 60㎍의 복용량으로 테스트하였다. 안전성은 각 복용 후 7일 동안 국소 및 전신 증상을 유도하고 6개월 동안 유도되지 않은 부작용의 평가에 의해 관찰하였다. 기능성 항체들은 아래와 같이 복수 항원에 대한 플라크 감소 중성화(PRN) 및 미세중성화(MN) 분석법(유사한 결과들을 제공) 및 ELISA 분석법을 사용하여 평가하였다.

시험의 결과들은 MN 반응들은 항-F 반응을 지연하는 것으로 보이는 것을 나타내었다(도 38). MN 항체 반응들은 활성 그룹에서 발생하였으나, 항-F 반응들은 훨신 더 활동적이었다. 기준 항-F IgG 역가는 더욱 제한된 범위에 걸쳐 있었던 반면, 기준 미세중성화(MN)역가는 >32배 범위로 변했다. 백신은 낮은 MN 기준으로 대상들에서 상당한 MN 반응들을 유도하였으나(집단의 최저 1/3의 반응보다 기하학적 평균 3.9배 증가), 전체 배수 증가는 높은 기준 값(<2 배수 반응이 표시되었다)을 가진 대상들의 1/3로 제한되었다.

시험의 결과들은 또한 RSV F 나노입자 백신이 항원 부위 II 펩타이드 254-278에 대한 항체 반응들을 유도하였다는 것을 나타내었다(도 39). 팔리비주맙 및 모타비주맙 에피토프를 숨겨주는 합성 RSV-F 펩타이드 254-278을 비오티닐화하고 스트렙타비딘-코팅판들에 고정하였다. 혈청의 연속 희석액을 펩타이드 코팅판들로 배양하였다. 결합된 IgG를 효소-컨쥬게이트 염소 항-인간 IgG로 세척 후 탐지하였다. 면역화 이전 역가는 균일하게 낮았으나, RSV-F 나노입자 백신의 수여로 5배 내지 15배 증가하였다.

도 40 및 표 8은 RSV-F 나노입자 면역화 이전 및 이후 인간 혈청에 의한 팔리비주맙 경쟁 ELISA의 결과들을 나타낸다. ELISA 판들을 2㎍/mL의 RSV F 단백질 항원으로 코팅하였다. 면역화 이전 및 이후 혈청을 연속적으로 희석하고, 50ng/mL 비오티닐화 팔리비주맙을 첨가한 후, 코팅판들에서 배양하였다. 효소-컨쥬게이트 스트렙타비딘을 사용하여 판에 결합된 팔리비주맙을 탐지하였다. 4개 파라미터 핏 (parameter fit)을 생성하였고 50% 팔리비주맙 결합 억제를 나타내는 혈청 희석을 삽입하였다. 팔리비주맙과 경쟁하는 항체들은 정상 성인 혈청에 낮은 역가로 존재하였으나, RSV F 나노입자 백신에 의한 면역화에 의해 현저하게 증가하였다(도 40a). 도 40b는 모든 대상 그룹들에서 복용 1 후 및 복용 2 후 팔리비주맙 결합 억제에서 기하학적 평균 배수 증가를 나타낸다. 항원보강제는 백신 유도 혈청의 팔리비주맙 억제를 강화하였고 60ug + 항원보강제 그룹은 최고 수준의 팔리비주맙 억제를 나타내었다.

연구 대상 혈청 샘플들에서 팔리비주맙-경쟁 항체의 농도

		위약	5㎍ + AlP0 ₄	15㎍ + AlP0 ₄	30㎍ + AlP0 ₄	30㎍	60㎍ + AlP0 ₄	60㎍
		(N=26)	(N=17)	(N=16)	(N=18)	(N=17)	(N=13)	(N=18)

연구 1일	N	26	17	16	18	17	13	18
	GMT	11	12	14	10	14	14	20
	95% CI	10, 12	10, 16	11, 20	NA , NA	21, 20	10, 20	13, 31

연구 30일	N	26	17	16	18	17	13	18
	GMT	13	70	81	105	112	227	174
	95% CI	11, 17	41, 120	61, 107	80, 137	69, 180	167, 308	117, 260

연구 60일	N	26	17	16	18	17	13	18
	GMT	14	111	128	142	100	337	157
	95% CI	11, 18	75, 162	103, 161	114, 175	69, 145	254, 448	108, 230

시험의 결과들은 또한 항-RSV F 항체들의 유도는 팔리비주맙 결합 부위와 경쟁했던 항체들의 존재와 상관이 있었다는 것을 나타내었다(도 41). 항-F 역가가 0일에 존재함에도 불구하고, 대부분의 건강한 젊은 성인 혈청은 팔리비주맙 경쟁 분석법 LLOQ의 값 또는 근처 값을 나타내었다. 60일에, 위약 수여자들은 변하지 않는 분포를 가졌으나, 능동적 예방접종자들(적색)은 팔리비주맙 경쟁 특이성의 강화와 함께 항-F 항체들에 증가를 나타내었다.

정상 혈청에 첨가된 표지되지 않은 팔리비주맙은 2.1㎍/mL의 경쟁 ELISA에서 50% 억제를 성취하였다. 이것은 표 9에서 백신 혈청에서 "팔리비주맙-유사" 활성의 대략의 등가물을 계산하는데 사용되었다. 유사하게, 팔리비주맙은 3개의 다른 수준에서 5명의 정상 성인 혈청에 첨가되었고 MN 역가에 대한 영향을 측정하였다; 두 다른 날의 각각에 2개의 복제물을 기초로 한 GMTs에 증가는 표 9와 10에 나타난다.

대상 혈청에서 50% 억제 GMTs 및 계산된 팔리비주맙 유사 활성

	위약	5㎍ + Al	15㎍ + Al	30㎍ 단독	30㎍+ Al	60㎍	60㎍ + Al
0일 GMT (95% CI)	6 (5-6)	6 (5-8)	7 (5-10)	7 (5-10)	5 (-)	10 (7-15)	7 (5-10)
0일 "팔리비주맙 당량"(㎍/mL)	11	13	15	15	10	21	15
Day 60 GMT (95% CI)	7 (6-9)	55(38-81)	64 (51-80)	50 (34-73)	71 (57-88)	79 (54-115)	169(127-224)
60일 "팔리비주맙 당량"(㎍/mL)	15	116	135	106	149	165	337
0일 GMT (95% CI)	6 (5-6)	6 (5-8)	7 (5-10)	7 (5-10)	5 (-)	10 (7-15)	7 (5-10)

인간 성인 혈청에서 MN 활성에 대한 정의된 팔리비주맙 주입의 영향

	기준 MN GMT	팔리비주맙이 첨가된 MN GMT에 대한 배수 증가
팔리비주맙	0	40㎍/mL	80㎍/mL	120㎍/mL
혈청 1	64	2.2	3.8	4.8
혈청 2	136	1.3	2.1	2.7
혈청 3	192	1.5	2.0	2.1
혈청 4	342	1.1	1.3	1.4
혈청 5	456	0.9	1.0	1.3

곤충 세포-유도 RSV F 단백질 나노입자에 대한 항-F 단백질 면역 반응들은 팔리비주맙 및 모타비주맙 결합 부위를 포함하는 잘 보존되고 임상적으로 중요한 F 단백질 항원 부위 II에 대한 항체들에서 강화되었다.

백신에 의해 성취된 팔리비주맙 유사 활성의 수준들은 유아들에게 수동적으로 투여될 때 효과적이었던 수준들과 같았다.

실시예 19

RSV F-특이적 단클론 항체들은 RSV F 나노입자 백신 항원에 결합한다

다양한 RSV F 중성화 단클론 항체들은 당업계에 공지되어 있고, 모든 목적을 위해 참조로 본 발명에 포함되는, 예를 들어, Crowe JE et al., Virology 252; 373 (1998) 및 Beeler et al., Journal of Virology 63; 2941 (1989)에 기술된다. 도 42는 부위 I, 부위 II 및 부위 IV/V/IV인 RSV F 백신 항원의 항체 인식 지역들의 개략적 묘사를 나타낸다.

RSV F 백신 항원을 2㎍/mL로 판에 놓았다. RSV-특이적 단클론 항체들을 4배 연속 희석하였고 RSV F 백신 항원으로 배양하였고 항체 결합은 항-생쥐 HRP를 사용하여 탐지하였다. 도 42에 도시된 대로, 백신 항원은 항원의 부위 I, II 또는 IV/V/VI에 결합하는 항체들을 포함하는 여러 중성화 RSV F 항체들의 결합을 유도할 수 있었다.

실시예 20

코튼랫에서 RSV F 나노입자 백신-유도 면역 반응들

이 실시예에서, RSV F 백신의 효능은 암컷 코튼랫(그룹당 5마리)의 4 그룹에서 추가로 테스트하였다. 그룹 1 동물들을 0일에 1회 그리고 28일에 1회, 2회 근육내 백신 접종하였고, 포르말린 불활성화 RSV 바이러스(FI-RSV)를 1:25 희석으로 칼륨명반 상에 흡착하였다. 그룹 2의 동물들을 항원보강제(2.4mg/mL AIPO₄)로 제제화된 30㎍의 재조합 RSV-F 나노입자 백신으로 0일 및 28일에 근육내 백신 접종하였다. 그룹 3의 동물들을 항원보강제 없이 30㎍의 재조합 RSV-F 나노입자 백신으로 2회 백신 접종하였다. 그룹 4의 동물들을 0일 및 28일에 10⁵ p.f.u의 RSV-A2(콧구멍 당 0.05mL)로 비강으로 감염시켰다. 혈청을 0, 28 및 49일에 모든 동물로부터 수집하였다.

면역화되고 감염된 코튼랫으로부터의 다클론 혈청 샘플들을 5배 연속적으로 희석시키고 RSV F 항원으로 배양하고, 2㎍/mL로 판에 놓았다. 결합된 항체를 항-쥐 HRP를 사용하여 탐지하였다. 도 43에 도시된 대로, 두 RSV F 백신 그룹들은 28일 및 49일에 FI-RSV에 의한 면역화 또는 RSV V2에 의한 감염과 비교하여 더 높은 IgG 역가를 유도하였다. 항원보강제의 존재는 28일 및 49일에 IgG 역가를 더 증가시켰다(도 43).

코튼랫들에서 중성화 항체 반응들을 Hep-2 세포주 감염 분석법을 사용하여 테스트하였다. 혈청 희석액을 판에서 감염성 RSV로 배양한 후, RSV/혈청 혼합물을 Hep-2 세포들로 배양하였다. 감염성 바이러스 플라크의 숫자를 계수하고, 중성화 역가를 감염의 50% RSV 억제를 일으키는 혈청의 최고 희석의 역수로 계산하였다.

0일 혈청은 어떠한 그룹에서도 측정가능한 중성화 역가를 나타내지 않았다. FI-RSV 그룹들은 어떠한 시점에도 중성화 역가를 나타내지 않았다. 49일에, RSV A2로 감염된 생쥐들은 항원보강제 없이 RSV F로 면역화된 생쥐들에 대한 중성화 항체의 유사한 수준을 나타내었다. 최고 중성화 역가들을 RSV F 백신 + 항원보강제 그룹에서 49일에 탐지하였고, 중성화 역가는 항원보강제의 존재하에서 RSV F 백신을 투여받은 동물들에서 가장 강하게 유도되었다는 것을 나타낸다(도 44).

중성화가 RSV-F의 존재에 의해 억제되는 지를 측정하기 위해서, 코튼랫 혈청들을, 중성화 분석법에서 Hep-2 세포들로 배양하기 전에, 20㎍/mL의 BSA, RSV F 단백질, RSV G 단백질 또는 RSV F 및 RSV G 단백질로 사전 배양하였다. 표 11에 도시된 대로, RSV F 단백질에 의한 사전 배양은 중성화 역가를 RSV A2-감염 생쥐뿐만 아니라 항원보강제가 있거나 없는 RSV F 백신으로 면역화된 생쥐로부터의 혈청에서 탐지할 수 없거나 거의 탐지할 수 없는 수준으로 감소시켰다.

RSV의 중성화는 RSV F 단백질의 존재에 의해 억제된다

코튼랫 샘플	BSA + 혈청	RSVF + 혈청	RSVG + 혈청	RSV G + RSV F + 혈청
FI-RSV	<20	<20	<20	<20
RSVF-Adj	1280	40	640	20
RSV F	320	<20	320	<20
RSV-A2 감염	160	40	40	<20

Hep-2 세포주 융합 억제 분석법을 사용하여 융합-매개 RSV 감염을 억제하는 FI-RSV, 항원보강제가 있거나 없는 RSV F 백신 또는 생 RSV A2에 의해 유도된 항체들의 능력을 테스트하였다. Hep-2 세포들을 각 그룹으로부터의 혈청 희석에 의한 세포들의 배양 이전에 생 RSV로 간단하게 사전 배양하였다. 감염성 바이러스 플라크들의 숫자를 계수하였고, 융합 억제는 플라크 형성의 50% 억제를 초래하는 희석의 역수로 표현되었다. 도 45는 Hep-2 세포들의 융합-매개 감염은 감염된 쥐들 또는 항원보강제가 있거나 없는 RSV F 백신으로 면역화된 쥐들로부터의 49일 혈청에 의해 억제되었다는 것을 나타낸다. 그러나, 융합 억제는 항원보강제의 존재에 의해 향상되었다. 또한, 28일 시점에서, 항원보강제가 있는 RSV F 백신에 의해 면역화된 쥐들로부터의 혈청만이 융합을 억제하였다. RSV F 단백질에 의한 쥐 혈청의 사전 배양은 표 12에 나타낸 대로, 모든 그룹에서 융합 억제 능력을 없앴고, 융합의 억제는 RSV F-특이적 항체들에 의해 매개되었다는 것을 나타낸다.

융합 억제는 RSV-F 단백질의 존재에 의해 없어진다

코튼랫 샘플	BSA	RSVF
FI-RSV	<20	<20
RSVF-Adj	2560	20
RSV F	40	<20
RSV-A2 감염	20	20
RSV-A2/RSV F	80	20
RSVF/RSV-A2	160	20

개별 동물들로부터의 혈청 샘플들을 RSV F에 결합하기 위해 팔리비주맙 단클론 항체와 경쟁하는 능력에 대해 분석하였다. 혈청 샘플들의 연속 희석액들을 판-결합(plate-bound) RSV F에 의한 배양 이전 비오티닐화 팔리비주맙으로 배양하였고, 아비딘-HRP에 의한 결합된 팔리비주맙의 탐지가 이어졌다. 데이터는 팔리비주맙 결합의 50% 억제를 나타낸 항체들의 기하학적 평균 역가의 역수로 표현되었다. FI-RSV 면역화 동물들로부터 얻은 혈청들은 팔리비주맙 결합을 억제하지 않았다. 팔리비주맙 결합의 최소 억제는 생 RSV로 치료된 동물들로부터의 혈청으로 관찰되었다. 반대로, RSV F 백신에 의해 면역화된 동물들로부터의 혈청들은 RSV F 나노입자들에 결합하기 위해 팔리비주맙과 경쟁을 나타내었고, 경쟁은 항원보강제를 투여받은 동물들로부터의 혈청으로 추가로 강화되었다(도 46).

각 그룹 내의 동물들로부터의 코튼랫 혈청들을 다른 RSV-F-특이적 단클론 항체들의 결합을 억제하는 능력에 대해 평가하였다. RSV F 단백질의 위치 I(1243), II(1107 및 1153) 또는 IV, V, VI(1112 및 1269)에 결합하는 항체 1107, 1153, 1243, 1112 또는 1269의 결합의 혈청 매개 억제를 측정하였다. 각 그룹으로부터의 혈청의 연속 희석액을 판-결합 RSV F에 의한 배양 이전 비오티닐화 항체들 1107, 1153, 1112, 1269 또는 1243으로 배양하였고, 아비딘-HRP에 의한 탐지가 이어졌다. 50% 억제 역가를 RSV F에 대한 결합이 50% 억제된 최고 희석의 역수로 계산하였다. 도 47에 도시된 대로, RSV F에 대한 중성화 RSV F-특이적 단클론 항체 결합의 억제는 FI-RSV 또는 생 RSV-A2에 의해 면역화된 쥐들과 비교하여 RSV F 백신으로 면역화된 쥐들로부터의 혈청으로 강화되었다.

RSV F 나노입자 백신에 의한 면역화에 의해 유도된 항-RSV 항체들의 접착력을 FI-RSV에 의한 면역화에 의해 유도된 항-RSV 항체들의 접착력과 비교하였다. 코튼랫 혈청의 연속 희석액을 결합 RSV 항원으로 판들에서 배양하고 7몰 우레아 세척 단계 이전 또는 이후 결합된 항체의 수준들을 측정하는 직접 ELISA를 실행하였다. RSV F 나노입자 백신 면역화 동물들로부터의 혈청에서 항체들은 FI-RSV 면역화 동물들로부터의 혈청에서 항체들과 비교하여 RSV에 대해 더 높은 접착력을 나타내었다(도 48). 우레아 세척 이전 및 이후 결합된 항체의 양에 의해 나타낸 대로(도 48 및 표 13), 백신 면역화 동물들로부터의 혈청에서 RSV-특이적 항체들의 더 큰 백분율은 높은 접착력이었다.

RSV F 나노입자 백신 면역화 vs FI-RSV 면역화 동물에서 O.D. 450 및 백분율 고 접착력 항체들

우레아 세척 이전	5630	603,000
우레아 세척 이후	1014	275,690
% 고 접착력	20	46

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본 발명은 그의 특정한 실시태양들과 관련하여 설명되었으나, 추가적인 변경이 이뤄질 수 있으며, 본 출원은 일반적으로 발명의 원리에 따라서 발명의 임의의 변경, 사용 또는 적용을 포함하는 것으로 의도되고, 본 명세서로부터 출발하여 발명이 속하는 분야에서 공지 또는 통상적인 수행, 전술한 필수적인 특징 및 하술하는 첨부된 발명의 범위에 적용될 수 있는 것으로 이해될 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Novavax, Inc. Smith, Gale Wu, Yingyun Massare, Michael Liu, Ye <120> Recombinant Nanoparticle RSV F Vaccine for Respiratory Syncytial Virus <130> NOVV-048/04WO <150> US 61/542,040 <151> 2011-09-30 <150> US 61/542,721 <151> 2011-10-03 <150> US 61/611,834 <151> 2012-03-16 <150> US 61/614,286 <151> 2012-03-22 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1725 <212> DNA <213> respiratory syncytial virus <400> 1 atggagttgc taatcctcaa agcaaatgca attaccacaa tcctcactgc agtcacattt 60 tgttttgctt ctggtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 120 agcaaaggct atcttagtgc tctgagaact ggttggtata ccagtgttat aactatagaa 180 ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa 240 caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca 300 ccaccaacaa acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac 360 aatgccaaaa aaaccaatgt aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggtttt 420 ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcgttgctg tatctaaggt cctgcaccta 480 gaaggggaag tgaacaagat caaaagtgct 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cacgtgagtt ttcagtaaat gccggcgtta ctacccccgt ctccacgtac 720 atgcttacaa actcggaatt gctcagtctg attaacgaca tgcctatcac taatgatcag 780 aagaagctta tgtctaacaa cgtgcaaatt gtccgccagc aaagctattc catcatgtca 840 atcattaaag aggaagtgtt ggcgtacgta gttcagctcc cactgtacgg agtcatcgac 900 accccgtgct ggaagcttca tacctcgccc ttgtgtacga caaatactaa agagggttct 960 aacatttgcc tcaccaggac ggatcgaggc tggtattgcg ataacgctgg aagtgtgagc 1020 ttcttccctc aagcagaaac atgtaaggta cagtccaata gagttttttg cgacactatg 1080 aactcactga cccttccatc tgaggtcaat ttgtgtaacg tcgatatctt caacccgaag 1140 tacgactgca aaattatgac gtccaagaca gatgtgtcga gtagcgtaat cacttcactc 1200 ggtgccatcg tttcttgcta cggcaagacc aaatgtacgg cttccaataa gaaccgtgga 1260 attatcaaaa cattctcgaa cggttgcgac tatgtcagca ataagggcgt ggacactgtg 1320 agtgtaggaa acaccctgta ctacgttaac aagcaagaag gtaaatcact gtatgtcaag 1380 ggcgagccca ttatcaattt ttacgatcct cttgtgttcc catccgacga gttcgatgcg 1440 tctatcagcc aggtaaacga aaagattaac cagtccttgg catttatccg caaatcggac 1500 gagctcctgc acaatgttaa 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Claims

숙주 세포에서 호흡기세포융합바이러스(RSV) 융합(F) 단백질의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이를 포함하는 것인 RSV F 단백질.
숙주 세포에서 호흡기세포융합바이러스(RSV) 융합(F) 단백질의 세포 독성을 감소시키는 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이를 포함하는 것인 RSV F 단백질.
변형되지 않은 호흡기세포융합바이러스(RSV) 융합(F) 단백질과 비교해서 RSV F 단백질의 면역원 특성들을 향상시키는 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이를 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 프롤린 102 잔기에 해당하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 4 항에 있어서,
상기 프롤린 102 잔기는 알라닌 잔기로 대체되는 것인 RSV F 단백질.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 아이소류신 379 잔기에 해당하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 6 항에 있어서,
상기 아이소류신 379 잔기는 발린 잔기로 대체되는 것인 RSV F 단백질.
제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 메티오닌 447 잔기에 해당하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 8 항에 있어서,
상기 메티오닌 447 잔기는 발린 잔기로 대체되는 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은 막대 사탕 형상을 가지는 것인 RSV F 단백질.
제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 퓨린 절단 위치를 불활성화하는 돌연변이를 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 11 항에 있어서,
상기 퓨린 절단 위치는 주요 절단 위치인 RSV F 단백질.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
적어도 하나의 퓨린 절단 위치의 상기 불활성화는 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 아르기닌 133, 아르기닌 135 및 아르기닌 136에 해당하는 위치들에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 유도함으로써 완성되는 것인 RSV F 단백질.
제 13 항에 있어서,
적어도 두 개의 아미노산 치환은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 아르기닌 133, 아르기닌 135 및 아르기닌 136에 해당하는 위치들에서 유도되는 것인 RSV F 단백질.
제 14 항에 있어서,
적어도 세 개의 아미노산 치환은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 아르기닌 133, 아르기닌 135 및 아르기닌 136에 해당하는 위치들에서 유도되는 것인 RSV F 단백질.
제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아르기닌 133은 글루타민으로 대체되는 것인 RSV F 단백질.
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아르기닌 135는 글루타민으로 대체되는 것인 RSV F 단백질.
제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아르기닌 136은 글루타민으로 대체되는 것인 RSV F 단백질.
제 4 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은 F2의 잠재 폴리(A) 위치의 적어도 하나의 변형을 더 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 4 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 약 아미노산 137-146에 해당하는 융합 도메인의 N-말단 절반에서 결실을 더 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변형 또는 돌연변이는
(i) 적어도 하나의 퓨린 절단 위치의 불성화;
(ii) F2의 잠재 폴리(A) 위치의 변형; 및
(iii) 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 약 아미노산 137-146에 해당하는 융합 도메인의 N-말단 절반에서 결실로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은
(i) 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 프롤린 102, 아이소류신 379 및 메티오닌 447에 해당하는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환;
(ii) 적어도 하나의 퓨린 절단 위치의 불성화;
(iii) F2의 잠재 폴리(A) 위치의 변형; 및
(iv) 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 약 아미노산 137-146에 해당하는 융합 도메인의 N-말단 절반에서 결실로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 두 개의 돌연변이를 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은
(i) 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 프롤린 102, 아이소류신 379 및 메티오닌 447에 해당하는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환;
(ii) 적어도 하나의 퓨린 절단 위치의 불성화;
(iii) F2의 잠재 폴리(A) 위치의 변형; 및
(iv) 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 약 아미노산 137-146에 해당하는 융합 도메인의 N-말단 절반에서 결실로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 세 개의 돌연변이를 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은
(i) 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 프롤린 102, 아이소류신 379 및 메티오닌 447에 해당하는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환;
(ii) 적어도 하나의 퓨린 절단 위치의 불성화;
(iii) F2의 잠재 폴리(A) 위치의 변형; 및
(iv) 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 약 아미노산 137-146에 해당하는 융합 도메인의 N-말단 절반에서 결실로 이루어진 그룹으로부터 선택된 네 개의 돌연변이를 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 프롤린 102, 아이소류신 379 및 메티오닌 447에 해당하는 위치들에서 적어도 두 개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 RSV F 단백질.
제 21 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질(SEQ ID NO:2)의 프롤린 102, 아이소류신 379 및 메티오닌 447에 해당하는 위치들에서 세 개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 RSV F 단백질.
SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:9로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 암호화된 것인 RSV F 단백질.
SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 암호화된 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질과 비교해서 숙주 세포에서 증가된 발현을 나타내는 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은 야생형 RSV F 단백질과 비교해서 강화된 면역원성을 나타내는 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 진핵세포인 RSV F 단백질.
제 31 항에 있어서,
상기 진핵세포는 곤충 세포인 RSV F 단백질.
제 32 항에 있어서,
상기 곤충 세포는 Sf9 세포인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RSV F 단백질은 인간 RSV의 A 균주, 인간 RSV의 B 균주, 소 RSV의 균주 및 조류 RSV의 균주로 이루어진 그룹으로부터 선택된 RSV 균주로부터 유래되는 것인 RSV F 단백질.
제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 RSV F 단백질을 포함하는 것인 정제된 미셀.
제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 RSV F 단백질을 포함하는 것인 바이러스 유사 입자(VLP).
제 36 항에 있어서,
기질(M) 단백질을 더 포함하는 것인 VLP.
제 37 항에 있어서,
상기 M 단백질은 RSV의 인간 균주로부터 유래되는 것인 VLP.
제 37 항에 있어서,
상기 M 단백질은 RSV의 소 균주로부터 유래되는 것인 VLP.
제 37 항에 있어서,
상기 M 단백질은 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 M1인 VLP.
제 40 항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스 균주는 조류 인플루엔자 바이러스 균주인 VLP.
제 41 항에 있어서,
상기 조류 인플루엔자 바이러스 균주는 H5N1 균주인 VLP.
제 42 항에 있어서,
상기 H5N1 균주는 A/Indonesia/5/05인 VLP.
제 37 항에 있어서,
상기 M 단백질은 뉴캐슬병 바이러스(NDV) 균주로부터 유래되는 것인 VLP.
제 36 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV 당단백질(G)을 더 포함하는 것인 VLP.
제 36 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV 당단백질(SH)을 더 포함하는 것인 VLP.
제 36 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV 뉴클레오캡시드 단백질(N)을 더 포함하는 것인 VLP.
제 36 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
VLP는 VLPs의 형성을 허용하는 조건하에서 진핵세포에서 발현되는 것인 VLP.
제 49 항에 있어서,
진핵세포는 효모, 곤충, 양서류, 조류, 포유류 또는 식물 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 VLP.
제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 RSV F 단백질을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제 35 항에 따른 정제된 미셀을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제 36 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 따른 VLP를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 RSV F 단백질을 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물로서, 상기 RSV F 단백질은 숙주에서 면역 반응을 유발할 수 있는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물.
제 35 항에 따른 정제된 미셀을 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물로서, 상기 미셀은 숙주에서 면역 반응을 유발할 수 있는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물.
제 36 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 따른 VLP를 포함하는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물로서, 상기 VLP는 면역 반응을 유발할 수 있는 약학적으로 허용가능한 백신 조성물.
제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 RSV F 단백질을 포함하는 바이러스 감염에 대항하여 인간 피험자를 면역화하기 위한 키트.
제 35 항에 따른 정제된 미셀을 포함하는 바이러스 감염에 대항하여 인간 피험자를 면역화하기 위한 키트.
제 36 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 따른 VLP를 포함하는 바이러스 감염에 대항하여 인간 피험자를 면역화하기 위한 키트.
제 54 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
바이러스 감염은 RSV 감염인 키트.
약학적으로 허용가능한 제제 속 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 RSV F 단백질을 인간 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 바이러스 감염에 대항하여 포유류를 백신 접종하는 방법.
약학적으로 허용가능한 제제 속 제 35 항의 정제된 미셀을 인간 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 바이러스 감염에 대항하여 포유류를 백신 접종하는 방법.
약학적으로 허용가능한 제제 속 제 36 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항의 VLP를 인간 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 바이러스 감염에 대항하여 포유류를 백신 접종하는 방법.
제 60 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서,
약학적으로 허용가능한 제제는 항원 보강제를 포함하는 포유류를 백신 접종하는 방법.
제 63 항에 있어서,
항원 보강제는 비-인지질 리포솜인 포유류를 백신 접종하는 방법.
약학적으로 허용가능한 제제 속 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 RSV F 단백질을 인간 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 바이러스 감염에 대항하여 면역 반응을 일으키는 방법.
약학적으로 허용가능한 제제 속 제 35 항의 정제된 미셀을 인간 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 바이러스 감염에 대항하여 면역 반응을 일으키는 방법.
약학적으로 허용가능한 제제 속 제 36 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항의 VLP를 인간 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 바이러스 감염에 대항하여 면역 반응을 일으키는 방법.
제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 RSV F 단백질을 암호화하는 것인 분리된 핵산.
제 68 항의 핵산을 포함하는 것인 분리된 세포.
제 68 항의 핵산을 포함하는 것인 벡터.
(a) 제 68 항의 핵산을 발현시키기 위해 숙주 세포를 변형하는 단계; 및
(b) RSV F 단백질의 생산에 도움이 되는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 RSV F 단백질의 제조 방법.
(a) 제 68 항의 핵산을 발현시키기 위해 숙주 세포를 변형하는 단계; 및
(b) RSV F 단백질 미셀의 생산에 도움이 되는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 RSV F 단백질 미셀의 제조 방법.
제 71 항 또는 제 72 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 곤충 세포인 방법.
제 73 항에 있어서,
상기 곤충 세포는 제 68 항의 핵산을 포함하는 바큘로바이러스 벡터로 트렌스펙트된 곤충 세포인 방법.
제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 RSV F 단백질을 동물에 투여하는 단계를 포함하여 동물의 폐에서 바이러스 복제를 억제하는 방법.
제 75 항에 있어서,
RSV F 단백질은 근육내로 투여되는 것인 방법.