MX2014003777A - Vacuna de nanoparticulas de proteinas f del rsv recombinantes para el virus respiratorio sincitial. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere, en líneas generales, a las proteína de fusión (F) del virus respiratorio sincitial modificadas o mutadas, y a los métodos para formar y usar las mismas, incluyendo composiciones inmunogénicas tales como vacunas para el tratamiento y/o la prevención de infección por RSV.

Description

VACUNA DE NANOPARTíCULAS DE PROTEÍNAS F DEL RSV RECOMBINATES PARA EL VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. 61/542.040, presentada el 30 de septiemore de 2011, de la Solicitud de Patente Provisional U.S. No.61/542.721, presentada el 3 de octubre de 2011, de la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. 61/611,834, presentada el 16 de marzo de 2012, y de la Solicitud de Patente Provisional U.S. No.61/614.286 presentada el 22 de marzo de 2012, cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Los contenidos del archivo de texto presentado en formato electrónico se incorporan en la presente por referencia en su totalidad: copia en formato legible por computadora del Listado de Secuencias (nombre del archivo: NOW _048_04WO_SeqList.txt, guardado en fecha: 27 de septiembre de 2012; tamaño de archivo: 74 kilobytes).

CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona, en lineas generales, con las proteínas de fusión (F) del virus respiratorio sincitial modificadas o mutadas y con los métodos para formar y usar las mismas incluyendo composiciones inmunogénicas tales como vacunas para el tratamiento y/o la prevención de infección por RSV.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El virus respiratorio sincitial (RSV, del inglés Respiratory Syncytial Virus) es un miembro del género Pneumovirus de la familia Paramyxoviridae . El RSV humano (HRSV del ingles Human Respiratory Syncytial Virus) es la causa principal de enfermedades severas en el tracto respiratorio inferior de infantes y es responsable de la morbidez y mortalidad considerables en los humanos. También se reconoce el RSV como un agente de enfermedad importante en los adultos inmunocomprometidos y en los ancianos. Debido a la resistencia incompleta al RSV en el huésped infectado después de una infección natural, el RSV puede infectar múltiples veces durante la infancia y la vida adulta.

Este virus tiene un genoma comprendido por un ARN de sentido negativo monocatenario, que está íntimamente asociado con la proteína viral para formar la nucleocápsida. La cubierta viral está compuesta por una bicapa lipídica derivada de membrana plasmática que contiene proteínas estructurales codificadas a nivel viral. Una polimerasa viral está envuelta con el virión y transcribe ARN genómico en ARNm. El genoma del RSV codifica tres proteínas estructurales transmembranas, F, G y SH, dos proteínas de matriz, M y M2, tres proteínas de nucleocápsida N, P y I,, y dos proteínas no estructurales, NS1 y NS2.

Se cree que la fusión del HRSV y las membranas celulares tiene lugar en la superficie celular y es un paso necesario para la transferencia de ribonucleoproteína viral en el citoplasma celular durante las fases tempranas de infección. Este proceso es mediado por la proteína de fusión (F), que también promueve la fusión de la membrana de las células infectadas con la de células adyacentes para formar un sincitio característico, que es tanto un efecto citopático prominente como un mecanismo adicional de diseminación viral. Por consiguiente, la neutralización de la actividad de fusión es importante en la inmunidad del huésped. De hecho, se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales desarrollados contra la proteína F neutralizan la infectividad del virus e inhiben la fusión de la membrana (Calder y colaboradores, 2000, Virology 271: 122-131).

La proteína F del RSV comparte características estructurales e identidad de secuencia de aminoácidos limitada pero significativa con las glicoproteínas F de otros paramixovirus . Se sintetiza como un precursor inactivo de 574 aminoácidos (F0) que es glicosilado a nivel co-traducción sobre asparaginas en el retículo endoplasmático, donde se ensambla en homo-oligómeros. Antes de alcanzar la superficie celular, el precursor F0 es escindido por una proteasa en F2 del término N y F1 del término C. Las cadenas F2 y F1 permanecen ligadas en forma covalente por uno o más enlaces disulfuro.

Se ha encontrado que las proteínas F de longitud completa purificadas por inmunoafinidad se acumulan en forma de mácelas (también caracterizadas como rosetas), similares a las observadas con otras glicoproteínas de membrana de virus de longitud completa (Wriglcy y colaboradores, 1986, en Electron Mi croscopy of Proteins, Vol 5, p.103-163, Academic Press, Londres). Bajo microscopía electrónica, las moléculas en las rosetas aparecen ya sea como barras en forma de cono invertido (-70%) o estructuras en forma de pirulí o lollípop (-30%) con sus extremos más anchos proyectándose lejos de los centros de las rosetas. El estado de conformación en barra está asociado con una glicoproteína F en el estado inactivo pre-fusión mientras que el estado de conformación en pirulí está asociado con una glicoproteína F en el estado activo post-fusión.

La microscopía electrónica también se puede usar para distinguir entre las conformaciones pre-fusión y post-fusión (alternativamente designadas "prefusogénicas" y "fusogénicas" ), como lo demuestran Calder y colaboradores, 2000, Virology 271:122-131. La conformación pre-fusión también se puede distinguir de la conformación fusogénica (post-fusión) mediante ensayos de asociación de liposomas. Asimismo, las conformaciones pre-fusión y fusogénicas se pueden distinguir usando anticuerpos (por ej., anticuerpos monoclonales) que reconocen específicamente los epítopos de conformación presentes en una u otra forma pre-fusión o fusogénica de la proteina F del RSV, mas no en otra forma. Dichos epítopos de conformación pueden deberse a la exposición preferencial de un determinante antigénico sobre la superficie de la molécula. En forma alternativa, los epítopos de conformación pueden originarse a partir de la yuxtaposición de aminoácidos que no son contiguos en el polipéptido lineal.

Se ha demostrado previamente que el precursor F se escinde en dos sitios (sitio I, después del residuo 109 y sitio II, después del residuo 136), ambos precedidos por motivos reconocidos por proteasas del tipo furina. El sitio II es adyacente a un péptido de fusión, y la escisión de la proteína F en ambos sitios es necesaria para la fusión de membrana (Gonzalez-Rcyes y colaboradores, 2001, PNAS 98(17): 9859-9864). Cuando se completa la escisión en ambos sitios, se cree que existe una transición de las barras en forma de cono a las barras en forma de pirulí.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Tal como se describe en la presente, los presentes inventores han encontrado que se pueden alcanzar niveles sorprendentemente altos de expresión de la proteína de fusión (F) cuando se realizan ciertas modificaciones a la estructura de la proteína F del RSV. Dichas modificaciones también reducen, de manera inesperada, la toxicidad celular de la proteína F del RSV en una célula huésped. Asimismo, las proteínas F modificadas de la presente invención demuestran una habilidad mejorada para exhibir la morfología de "pirulí" o lollipop post-fusión a diferencia de la morfología de "barra" pre-fusión. Por ende, en un aspecto, las proteínas F modificadas de la presente invención también pueden exhibir inmunogenicidad mejorada en comparación con las proteínas F de tipo salvaje (WT, del inglés Wíld-Type) . Estas modificaciones tienen aplicaciones significativas para el desarrollo de vacunas y métodos para usar dichas vacunas para el tratamiento y/o la prevención de RSV. La presente invención provee proteínas F del RSV recombinantes que demuestran expresión incrementada, toxicidad celular reducida y/o propiedades inmunogénicas afianzadas en comparación con las proteínas F del RSV de tipo salvaje.

En un aspecto, la invención provee proteínas F del RSV recombinantes que comprenden secuencias de aminoácidos modificadas o mutadas en comparación con las proteínas F del RSV de tipo salvaje. En general, estas modificaciones o mutaciones incrementan la expresión, reducen la toxicidad celular y/o afianzan las propiedades inmunogénicas de las proteínas F del RSV en comparación con las proteínas F del RSV de tipo salvaje. En ciertas formas de realización de ejemplo, las proteínas F del RSV son proteínas F del RSV humano.

La proteína F del RSV preferentemente comprende una secuencia de aminoácidos modificada o mutada en comparación con la proteína F del RSV de tipo salvaje (por ej. como se ejemplifica en la SEC ID NO: 2). En una forma de realización, la proteína F del RSV contiene una modificación o mutación en el aminoácido correspondiente a la posición P102 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2). En otra forma de realización, la proteína F del RSV contiene una modificación o mutación en el aminoácido correspondiente a la posición 1379 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2). En otra forma de realización, la proteína F del RSV contiene una modificación o mutación en el aminoácido correspondiente a la posición M447 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

En una forma de realización, la proteína F del RSV contiene dos o más modificaciones o mutaciones en los aminoácidos correspondientes a las posiciones descritas con anterioridad. En otra forma de realización, la proteína F del RSV contiene tres modificaciones o mutaciones en los aminoácidos correspondientes a las posiciones descritas con anterioridad.

En una forma de realización específica, la invención está dirigida a las proteínas F del RSV en donde la prolina en la posición 102 es reemplazada con alanina. En otra forma de realización específica, la invención está dirigida a proteínas F del RSV en donde la isoleucina en la posición 379 es reemplazada con valina. En otra forma de realización específica más, la invención está dirigida a proteínas F del RSV en donde la metionina en la posición 447 es reemplazada con valina. En ciertas formas de realización, la proteína F del RSV contiene dos o más modificaciones o mutaciones en los aminoácidos correspondientes a las posiciones descritas en estas formas de realización específicas. En ciertas otras formas de realización, la proteína F del RSV contiene tres modificaciones o mutaciones en los aminoácidos correspondientes a las posiciones descritas en estas formas de realización específicas. En una forma de realización de ejemplo, la proteína del RSV tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 4.

En una forma de realización, la secuencia codificadora de la proteína F del RSV es optimizada, además, para afianzar su expresión en una célula huésped adecuada. En una forma de realización, la célula huésped es una célula de insecto. En una forma de realización de ejemplo, la célula de insecto es una célula Sf9.

En una forma de realización, la secuencia codificadora del gen F del RSV con codones optimizados es la SEC ID NO: 3. En otra forma de realización, la proteína F del RSV con codones optimizados tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 4.

En una forma de realización, la proteína F del RSV comprende, además, al menos una modificación en el sitio poli (A) críptico de F2. En otra forma de realización, la proteína F del RSV comprende, además, una o más mutaciones de aminoácidos en el sitio de escisión (CS, del inglés Cleavage Si te) primario. En una forma de realización, la proteína F del RSV contiene una modificación o mutación en el aminoácido correspondiente a la posición R133 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2) o la proteína F del RSV con codones optimizados (SEC ID NO: 4). En otra forma de realización, la proteína F del RSV contiene una modificación o mutación en el aminoácido correspondiente a la posición R135 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2) o la proteína F del RSV con codones optimizados (SEC ID NO: 4). En otra forma de realización más, la proteina F del RSV contiene una modificación o mutación en el aminoácido correspondiente a la posición R136 de la proteina F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2) o la proteina F del RSV con codones optimizados (SEC ID NO: 4).

En una forma de realización especifica, la invención está dirigida a proteínas F del RSV en donde la arginina en la posición 133 es reemplazada con glutamina. En otra forma de realización específica, la invención está dirigida a proteínas F del RSV en donde la arginina en la posición 135 es reemplazada con glutamina. En otra forma de realización específica más, la invención está dirigida a proteínas F del RSV en donde la arginina en la posición 136 es reemplazada con glutamina. En ciertas formas de realización, la proteína F del RSV contiene dos o más modificaciones o mutaciones en los aminoácidos correspondientes a las posiciones descritas en estas formas de realización especificas. En cierta otra forma de realización, la proteína F del RSV contiene tres modificaciones o mutaciones en los aminoácidos correspondientes a las posiciones descritas en estas formas de realización específicas. En una forma de realización de ejemplo, la proteína del RSV tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 6.

En otra forma de realización, la proteína F del RSV además comprende una deleción en la mitad N-terminal del dominio de fusión correspondiente a los aminoácidos 137-146 de las SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 6. En una forma de realización de ejemplo, la proteína F del RSV tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 8. En una forma de realización alternativa, la proteína F del RSV tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 10.

También se incluyen dentro del alcance de la invención las proteínas F del RSV, distintas de la proteína F del RSV humano (SEC ID NO: 2), que contienen alteraciones correspondientes a las establecidas anteriormente. Dichas proteínas F del RSV pueden incluir, de manera no taxativa, las proteínas F del RSV de las cepas A de RSV humano, cepas B de RSV humano, cepas de RSV bovino, y cepas de RSV aviar.

En algunas formas de realización, la invención está dirigida a proteínas F del RSV modificadas o mutadas que demuestran expresión incrementada en una célula huésped en comparación con las proteínas F del RSV de tipo salvaje, tal como la exhibida por la SEC ID NO: 2. En otras formas de realización, la invención está dirigida a proteínas F del RSV modificadas o mutadas que demuestran toxicidad celular reducida en una célula huésped en comparación con las proteínas F del RSV de tipo salvaje, tal como la exhibida por la SEC ID NO: 2. En otras formas de realización más, la invención está dirigida a proteínas F del RSV modificadas o mutadas que demuestran propiedades inmunogénicas en comparación con las proteínas F del RSV de tipo salvaje, tales como las exhibidas por SEC ID NO: 2.

En aspectos adicionales, la invención provee composiciones inmunogénicas que comprenden una o más proteínas F del RSV modificadas o mutadas como se describen en la presente. En una forma de realización, la invención provee una micela compuesta por una o más proteínas F del RSV modificadas o mutadas (por ej. una micela F del RSV).

En otra forma de realización, la presente invención provee una partícula de tipo viral (VLP, del inglés Virus Líke Parti le) que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En algunas formas de realización, la VLP además comprende una o más proteínas adicionales.

En una forma de realización, la VLP además comprende una proteína de matriz (M). En una forma de realización, la proteína M deriva de una cepa humana de RSV. En otra forma de realización, la proteína M deriva de una cepa bovina de RSV. En otras formas de realización, la proteína de matriz puede ser una proteína MI de una cepa del virus de la gripe. En una forma de realización, la cepa del virus de la gripe es una cepa del virus de la gripe aviar. En otras formas de realización, la proteina M puede derivar de una cepa del virus de enfermedad de Newcastle (NDV, del inglés Newcastle Disease Virus) .

En formas de realización adicionales, la VLP además comprende la glicoproteina G del RSV. En otra forma de realización, la VLP además comprende la glicoproteina SH del RSV. En otra forma de realización más, la VLP además comprende la proteina nucleocápsida N del RSV.

Las proteínas F del RSV modificadas o mutadas se pueden usar para la prevención y/o el tratamiento de infección por RSV. Por ende, en otro aspecto, la invención provee un método para producir una respuesta inmunitaria contra RSV. El método comprende administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que contiene una proteína F del RSV modificada o mutada a un sujeto, tal como un humano o un animal .

En otro aspecto, la presente invención provee composiciones de vacuna farmacéuticamente aceptables que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada, una mácela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada.

En una forma de realización, la invención comprende una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, la invención incluye una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis efectiva de una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización más, la invención incluye una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis efectiva de una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada.

En otra forma de realización, la invención provee un conjunto o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las formulaciones de vacuna de la invención.

En otra forma de realización, la invención provee un método para formular una composición de vacuna o composición antigénica que induce inmunidad a una infección o al menos un síntoma de enfermedad de la misma a un mamífero, que comprende agregar a la formulación una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En una forma de realización preferida, la infección es una infección por RSV.

Las proteínas F del RSV modificadas o mutadas de la invención son útiles para preparar composiciones que estimulan una respuesta inmunitaria que confiere inmunidad o inmunidad sustancial a agentes infecciosos. Por ende, en una forma de realización, la invención provee un método para inducir inmunidad a infecciones o al menos un síntoma de enfermedad de las mismas en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteina F del RSV modificada o mutada.

En otro aspecto más, la invención provee un método para inducir inmunidad sustancial a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada.

Las composiciones de la invención pueden inducir inmunidad sustancial en un vertebrado (por ej. un humano) cuando se administra al vertebrado. Por ende, en una forma de realización, la invención provee un método para inducir inmunidad sustancial a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, la invención provee un método para vacunar un mamífero contra RSV que comprende administrar al mamífero una cantidad que induce protección de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada.

En otra forma de realización, la invención comprende un método para inducir una respuesta de anticuerpos de protección a una infección o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada.

En otra forma de realización, la invención comprende un método para inducir una respuesta celular de protección a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, la invención comprende un método para inducir una respuesta celular de protección a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una mácela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización más, la invención comprende un método para inducir una respuesta celular de protección a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una VLP, en donde la VLP comprende una proteína F del RSV modificada o mutada.

En otro aspecto más, la invención provee un ácido nucleico aislado que codifica una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención. En una forma de realización de ejemplo, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína F del RSV modificada o mutada se selecciona entre el grupo que consiste en la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, o SEC ID NO: 9.

En otro aspecto más, la invención provee una célula aislada que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención. En una forma de realización de ejemplo, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína F del RSV modificada o mutada se selecciona entre el grupo que consiste en la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 9.

En otro aspecto más, la invención provee un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención. En una forma de realización de ejemplo, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína F del RSV modificada o mutada se selecciona entre el grupo que consiste en la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 9. En una forma de realización, el vector es un vector de baculovirus.

En otro aspecto más, la invención provee un método para formar una proteína F del RSV, que comprende (a) transformar una célula huésped para expresar un ácido nucleico que codifica una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención; y (b) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que conduzcan a la producción de dicha proteina F del RSV. En una forma de realización, el ácido nucleico que codifica una proteína F del RSV modificada o mutada se selecciona entre el grupo que consiste en la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 9. En otra forma de realización, la célula huésped es una célula de insecto. En otra forma de realización más, la célula huésped es una célula de insecto transfectada con un vector de baculovirus que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención.

En otro aspecto más, la invención provee un método para formar una micela de proteína F del RSV, que comprende (a) transformar una célula huésped para expresar un ácido nucleico que codifica una proteina F del RSV modificada o mutada de la invención; y (b) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que conduzcan a la producción de dicha micela de proteina F del RSV. En una forma de realización, el ácido nucleico que codifica una proteina F del RSV modificada o mutada se selecciona entre el grupo que consiste en la SEO ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 9. En una forma de realización, la célula huésped es una célula de insecto. En una forma de realización de ejemplo, la célula huésped es una célula de insecto transfectada con un vector de baculovirus que comprende una proteina F del RSV modificada o mutada de la invención.

En un aspecto, la presente invención está dirigida a una vacuna de nanopartículas de glicoproteinas de superficie de fusión (F) del RSV. En una forma de realización, la vacuna comprende proteina F de longitud completa. En otra forma de realización, la proteina F de longitud completa es escindida en trímeros F1 y F2 con enlaces disulfuro. Los trímeros F1 y F2, en una forma de realización, están presentes en micelas que tienen un diámetro de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 40 nm.

En otro aspecto, se provee un anticuerpo generado por la vacuna de la invención.

En otro aspecto más, se provee un método para vacunar un sujeto que lo necesita. En una forma de realización, el método comprende administrar al sujeto una vacuna de nanoparticulas de glicoproteinas de fusión (F) del RSV recombinantes. En otra forma de realización, la vacuna de nanoparticulas comprende la proteina F de longitud completa. En otra forma de realización más, la proteína F de longitud completa es escindida en trímeros F1 y F2 con enlaces disulfuro. Los trímeros F1 y F2, en una forma de realización, están presentes en micelas que tienen un diámetro de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 40 nm.

En una forma de realización, la vacuna de la invención se administra a una dosis seleccionada entre el grupo que consiste en 5 mg, 15 pg, 30 mg y 60 pg.

En otro aspecto, se provee un método para vacunar un su eto que lo necesita. En una forma de realización, el método comprende administrar al sujeto una vacuna de nanoparticulas de glicoproteinas de fusión (F) del RSV recombinantes que comprende proteína F de longitud completa y un adyuvante. En otra forma de realización el adyuvante es alum.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa la estructura de la proteína F0 del HRSV de tipo salvaje y los sitios de escisión primario (SEQ ID NO: 32) y secundario (SEC ID NO: 33).

La Figura 2 representa las estructuras de proteínas F0 del RSV modificadas con mutaciones del sitio de escisión según se describe en el Ejemplo 3, correspondientes a las SEC ID NO: 28 (KKQKQQ), 29 (GRRQQR), 30 (RAQQ) y 31 (KKQKRQ).

La Figura 3 representa sustituciones conservativas (R133Q, R135Q y R136Q) en el sitio de escisión primario de la proteína F del HRSV BV #541 modificada (SEC ID NO: 6).

La Figura 4 representa la secuencia y estructura de la proteina F del HRSV BV #541 modificada (SEC ID NO: 6).

La Figura 5 representa la secuencia y estructura de la proteína F del HRSV BV #622 modificada (SEC ID NO: 10).

La Figura 6 representa el gel de SDS-PAGE con tinción de coomassie de la proteína F del HRSV BV #622 recombinante purificada, con o sin la presencia de bME.

La Figura 7A representa un análisis de transferencia Western (Western Blo t ) de mutantes de dominio de fusión F del RSV. La Figura 7B representa la inmunotinción de la proteína F del RSV de superficie celular de los mutantes de dominio de fusión F del RSV. La Figura 7C representa la estructura de la proteína F del HRSV BV #683 modificada (SEC ID NO: 8). La Figura 7D representa el clon precursor BV#541 (D0) y los mutantes con supresiones D2 D4, D6, D8, D10 (BV#683), D12, D14, D16 y D18 en el dominio de fusión. BV#541 comprende una proteína en la que la secuencia.de aminoácidos del dominio de fusión comprende desde la posición 137 hasta la 154 de la SEC ID NO: 6). Las secuencias de aminoácidos de las porciones de dominios de fusión de los mutantes por deleción comprenden desde la posición 139 hasta la 154 de la SEC ID NO: 6 (D2), desde la posición 141 hasta la 154 de la SEC ID NO: 6 (D4), desde la posición 143 hasta la 154 de la SEC ID NO: 6 (D6), desde la posición 145 hasta la 154 de la SEC ID NO: 6 (D8), desde la posición 147 hasta la 154 de la SEC ID NO: 6 (D10; BV#683), desde la posición 149 hasta la 154 de la SEC ID NO: 6 (D12), desde la posición 151 hasta la 154 de la SEC ID NO: 6 (D14), o desde la posición 153 hasta la 154 de la SEC ID NO: 6 (D16). El dominio de fusión completo correspondiente a las posiciones 137-154 en la SEC ID NO: 6 se deleciona en el mutante con una deleción D18.

La Figura 8 representa geles de SDS-PAGE con tinción de coomassie de las proteínas F del HRSV BV #622 y BV #683 recombinantes purificadas, con o sin la presencia de bME (lado izquierdo), y sus estructuras.

La Figura 9 representa un gel de SDS-PAGE con tinción de coomassie (lado izquierdo) y un análisis de transferencia Western (lado derecho) de la proteína F del HRSV BV #683 recombinante purificada, con o sin la presencia de bME.

La Figura 10 representa un gel de SDS-PAGE con tinción de coomassie utilizado en el análisis de pureza por densitometria de barrido (lado izquierdo) y una transferencia Western (lado derecho) de la proteina F del HRSV BV #683 recombinante purificada.

La Figura 11 representa imágenes de micelas (rosetas) de la proteina F del HRSV BV #683 reco binante purificada tomadas por microscopía electrónica con tinción negativa.

La Figura 12A representa el análisis por HPLC de fase reversa de la proteína F del HRSV BV #683. La Figura 12B representa el análisis por HPLC de exclusión por tamaño de la proteína F del HRSV BV #683. La Figura 12C representa el análisis de tamaño de partículas de las micelas de la proteína F del HRSV BV #683.

La Figura 13 representa un gel de SDS-PAGE con tinción de coomassie (lado izquierdo) y un análisis de transferencia Western (lado derecho) de las proteínas F del HRSV BV #622 y BV #623 modificadas (SEC ID NO: 21) con o sin co-expresión con las proteínas N de HRSV y M de BRSV en las cosechas de cultivos en bruto (intracelulares) o muestras peletizadas por separación en gradiente de sacarosa al 30%, y las estructuras de BV #622 y BV #623.

La Figura 14 representa un gel de SDS-PAGE con tinción de coomassie (lado izquierdo) y un análisis de transferencia Western (lado derecho) de la proteina F del HRSV BV #622 modificada, BV #636 quimérica en tándem doble (BV #541 + BRSV M), BV #683, BV #684 (BV #541 con dominio YIAL L) y BV #685 (BV #541 con dominio YKKL L) con o sin coexpresión con las proteínas N de HRSV N y M de BRSV M en las muestras de cultivos celulares en bruto (intracelulares), y estructura de cada proteina F del HRSV modificada analizada.

La Figura 15 representa un gel de SDS-PAGE con tinción de coomassie (lado izquierdo) y un análisis de transferencia Western (lado derecho) de la proteina F del RSV BV #622 modificada (SEC ID NO: 10), BV #636 quimérica en tándem doble (BV #541 +BRSV M), BV #683 (SEC ID NO: 8), BV #684 (BV #541 con dominio YIAL L) y BV #685 (BV #541 con dominio YKKL L) con o sin co-expresión con las proteínas N de HRSV y M de BRSV en las muestras peletizadas por separación en gradiente de sacarosa al 30%, y estructura de cada proteina F del HRSV modificada analizada.

Las Figuras 16 A-D representan la estructura, el nombre del clon, la descripción, los resultados de la transferencia Western y de la SDS-PAGE con tinción de coomassie, y la conclusión para cada proteína F del RSV modificada, descrita en el Ejemplo 9.

La Figura 17 representa los procedimientos experimentales del estudio de provocación con RSV descrito en el Ejemplo 10.

La Figura 18 representa los resultados del ensayo de neutralización del RSV el día 31 y el día 46 de ratones inmunizados con PBS, RSV vivos, FI-RSV, 1 mg de PFP, 1 pg de PFP + Alum, 10 pg de PFP, 10 pg de PFP + Alum, 30 pg de PFP y control positivo (anti-F de oveja).

La Figura 19 representa los títulos de RSV en tejidos pulmonares de ratones inmunizados con PBS, RSV vivos, FI-RSV, 1 pg de PFP, 1 pg de PFP + Alum, 10 pg de PFP, 10 pg de PFP + Alum y 30 pg de PFP, 4 días después de la provocación con RSV infeccioso.

La Figura 20 representa un gel de SDS-PAGE con tinción de coomassie de la proteína F del RSV BV #683 recombinante purificada, conservada a 2 - 8 °C durante 0, 1, 2, 4 y 5 semanas.

La Figura 21 representa las respuestas de los anticuerpos neutralizantes de RSV A y RSV B luego de la inmunización con RSV vivo (RSV), con RSV inactivado con formalina (FI-RSV), con proteína F del RSV BV #683 con y sin aluminio (PFP y PFP + Adyuvante de Aluminio), y con controles de PBS.

La Figura 22 representa la patología pulmonar luego de la provocación con RSV en ratas inmunizadas con RSV vivo, con RSV inactivado con for alina (FI-RSV), con proteína F del RSV BV #683 con y sin aluminio (micela F (30 mg) y micela F (30 pg) + Adyuvante de Aluminio), y controles de PBS.

La Figura 23 es un gráfico que muestra las respuestas de los anticuerpos neutralizantes contra RSV A en la rata del algodón (eje y, expresada como Log2 de los títulos) vs. diversos grupos de tratamiento de vacunación (eje x). La línea para cada grupo es la media geométrica del titulo final que neutralizó el 100%.

La Figura 24 es un gráfico que muestra las respuestas de los anticuerpos neutralizantes contra RSV A en la rata del algodón (eje y, expresada como Log2 de los títulos) vs. diversos grupos de tratamiento de vacunación (eje x). La línea para cada grupo es la media geométrica del título final que neutralizó el 100%.

La Figura 25 es un gráfico que muestra los títulos de virus pulmonares de ratas del algodón (expresados como loglO pfu/gramo de tejido) vs. diversos grupos de tratamiento de vacunación (eje x). Los títulos virales se muestran como +SEM.

La Figura 26A es un gráfico que muestra unidades de ELISA vs. grupo de vacunación, y proporciona una medida de la producción de anticuerpos en animales tratados con la vacuna de RSV F, con FI-RSV, con RSV vivos o con PBS. La Figura 26 B es un gráfico que muestra la producción de anticuerpos en cada grupo de vacuna, medida a través del título de IgG de RSV-F. La Figura 26C es un gráfico que representa los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero contra el RSV en cada grupo de vacunación. La Figura 26D es un gráfico que muestra los títulos de IgG competitivos con palivizumab de sueros combinados de cada grupo de vacunación.

En la Figura 27 aparecen micrografías representativas de tejido pulmonar tomado de ratas después del tratamiento con la vacuna de nanopartículas de la invención y una posterior provocación con RSV.

La Figura 28 es un gráfico que muestra la competencia por la unión entre el epitopo de palivizumab (SEC ID NO: 35) y anticuerpos producidos por la vacuna de la presente invención.

La Figura 29A es un gráfico que muestra la unión de diversas concentraciones de mAb Synagis® al péptido epitopo de palivizumab. La Figura 29B es un gráfico que muestra la unión de diversas concentraciones de Synagis® a las micelas F del RSV recombinantes.

La Figura 30 provee esquemas de diversos ensayos llevados a cabo para probar la inmunogenicidad de las vacunas de nanopartículas de la invención.

La Figura 31 es un gráfico que muestra los resultados de un estudio por ELISA utilizando sueros humanos de sujetos tratados con la vacuna de la presente invención.

La Figura 32 es un gráfico que muestra IgG anti-F de RSV (A) y anti-G de RSV (B) detectadas en sueros humanos de sujetos tratados con la vacuna de la presente invención.

La Figura 33 es un gráfico que muestra la media geométrica del factor de aumento en los niveles de IgG anti-F de RSV para los grupos de tratamiento con alum.

La Figura 34 es un gráfico que muestra los títulos de neutralización con reducción de la enfermedad para sujetos en diversos puntos de medición, antes o después del tratamiento con la vacuna de nanopartículas de la invención.

La Figura 35 muestra la distribución acumulativa inversa para PRNTs el Día 0, el Día 30 y el Día 60 en los grupos de placebo y de 30 mg + Alum.

La Figura 36A muestra los controles de ensayo positivos para la prueba de unión al antígeno BIAcore basada en SPR utilizados para evaluar la avidez de los anticuerpos en sueros humanos por la proteína F del RSV. La Figura 36 B muestra un sensograma para sueros desde el Día 0 y los controles de placebo, en comparación con el control positivo palivizumab .

La Figura 37 muestra la curva de unión para palivizumab y una muestra representativa del grupo de vacuna medida utilizando la prueba de unión al antígeno BIAcore basada en SPR.

La Figura 38 es un gráfico que muestra la media geométrica del aumento en los niveles del título de anticuerpos para (1) la IgG anti-F (barra izquierda) y (2) MN (barra derecha) para los diversos grupos de tratamiento.

La Figura 39 es un gráfico que muestra la media geométrica de los títulos (GMT) de anticuerpos en pacientes a los que se administró vacuna de nanopartículas de RSV a diversas dosis. La respuesta de los anticuerpos es contra el sitio antigénico II, péptido 254-278.

La Figura 40A es un gráfico que muestra que los anticuerpos generados por la vacuna de nanopartículas de proteínas F del RSV son competitivos con Palivizumab. La Figura 40B es un gráfico que muestra anticuerpos que compiten con palivizumab después de la dosis 1 y después de la dosis 2 en todos los grupos de vacunas.

La Figura 41 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de competencia con Palivizumab. Los resultados muestran que la vacuna de nanopartículas de proteínas F del RSV indujo anticuerpos que se correlacionan con los anticuerpos que compiten por el sito de unión de Palivizumab .

La Figura 42 muestra los títulos de unión de proteínas F del RSV de los anticuerpos monoclonales indicados y los sitios de reconocimiento de anticuerpos para cada anticuerpo monoclonal en el antígeno F del RSV de longitud completa.

La Figura 43 es un gráfico que muestra el título de anticuerpos IgG anti-F del RSV en sueros de ratas del algodón inmunizadas con FI-RSV, con vacuna de nanopartículas de proteínas F del RSV con o sin adyuvante, o con RSV vivo los Días 0, 28 y 49 posteriores a la inmunización.

La Figura 44 es un gráfico que muestra las respuestas de anticuerpos neutralizantes los Días 0, 28 y 49 posteriores a la inmunización de ratas del algodón con FI-RSV, con vacuna de nanoparticulas de proteínas F del RSV con o sin adyuvante, o con RSV vivo.

La Figura 45 es un gráfico que muestra los títulos de inhibición de la fusión en sueros de ratas del algodón inmunizadas con FI-RSV, con vacuna de nanoparticulas de proteínas F del RSV con o sin adyuvante, o con RSV vivo.

La Figura 46 es un gráfico que muestra los títulos competitivos obtenidos por ELISA en sueros de ratas del alqodón inmunizadas con FI-RSV, con vacuna de nanoparticulas de proteínas F del RSV con o sin adyuvante, o con RSV vivo.

La Figura 47 muestra los títulos de anticuerpos inducidos por vacuna que compiten con el anticuerpo monoclonal neutralizante indicado específico de proteínas F del RSV en sueros de ratas del algodón inmunizadas con FI-RSV, con vacuna de nanopartículas de proteínas F del RSV con o sin adyuvante, o con RSV vivos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA,DE LA INVENCIÓN Definiciones Tal como se usa en la presente el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se usa en combinación con un inmunogen específico (por ej. una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada) en una formulación, aumenta o en su defecto altera o modifica la respuesta inmunitaria resultante. La modificación de la respuesta inmunitaria incluye intensificar o ampliar la especificidad del anticuerpo o las respuestas inmunitarias celulares, o ambos. La modificación de la respuesta inmunitaria también puede significar reducir o suprimir ciertas respuestas inmunitarias específicas a antígenos.

Tal como se usa en la presente, el término "formulación antigénica" o "composición antigénica" se refiere a una preparación que, cuando se administra a un vertebrado especialmente un ave o un mamífero- induce una respuesta inmunitaria.

Tal como se usa en la presente el término "virus de la gripe aviar" se refiere a los virus de la gripe encontrados principalmente en las aves, pero que también pueden infectar humanos u otros animales. En algunos casos, los virus de la gripe aviar se pueden transmitir o diseminar de un humano a otro. Un virus de la gripe aviar que infecta humanos tiene el potencial de causar una pandemia de gripe, es decir, morbidez y/o mortalidad en humanos. Una pandemia ocurre cuando emerge una nueva cepa del virus de la gripe (un virus contra el cual el humano no tiene inmunidad natural), diseminándose más allá de las localidades individuales, posiblemente en todo el mundo, e infectando un gran número de humanos al mismo tiempo.

Tal como se usa en la presente, una "dosis efectiva" generalmente se refiere a una cantidad de una proteina F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteina F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteina F del RSV modificada o mutada de la invención suficiente para inducir inmunidad, prevenir y/o mejorar una infección o reducir al menos un síntoma de una infección o enfermedad y/o afianzar la eficacia de otra dosis de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteina F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. Una "dosis efectiva" puede referirse a la cantidad de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada suficiente para retardar o minimizar el desencadenamiento de una infección o enfermedad. Una "dosis efectiva" también puede referirse a la cantidad de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada que provee un beneficio terapéutico en el tratamiento o seguimiento de una infección o enfermedad. Además, una "dosis efectiva" es la cantidad con respecto a una protelna F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención en forma individual, o en combinación con otras terapias, que provee un beneficio terapéutico en el tratamiento o seguimiento de una infección o enfermedad. Una "dosis efectiva" también puede ser la cantidad suficiente para reforzar la propia respuesta inmunitaria del sujeto (por ej ., la de un humano) contra una exposición posterior a un agente infeccioso o una enfermedad. Los niveles de inmunidad se pueden monitorear, por ej., al medir las cantidades de anticuerpos neutralizantes séricos y/o secretores, por ej., mediante neutralización de placas, fijación de complementos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ensayo de microneutralización, o al medir las respuestas celulares, tales como, de manera no taxativa células T citotóxicas, células presentadoras de antígenos, células T auxiliares, células dendriticas y/u otras respuestas celulares. Las respuestas de las células T se pueden monitorear, por ej., al medir, por ejemplo, la cantidad de células CD4+ y CD8+ presentes usando marcadores específicos mediante citometría de flujo fluorescente o ensayos de células T, tales como, de manera no taxativa, ensayo de proliferación de células T, ensayo citotóxico de células T, ensayo de tetrámero, y/o ensayo ELISPOT. En el caso de una· vacuna, una "dosis efectiva" es aquélla que previene la enfermedad y/o reduce la severidad de los síntomas.

Tal como se usa en la presente, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de una proteína F del RSV modificada o mutada, una mácela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada necesaria o suficiente para alcanzar un efecto biológico deseado. Una cantidad efectiva de la composición seria la cantidad que alcance un resultado seleccionado, y dicha cantidad podría ser determinada como una cuestión de experimentación de rutina por una persona versada en el arte. Por ejemplo, una cantidad efectiva para prevenir, tratar y/o mejorar una infección podría ser esa cantidad necesaria para causar activación del sistema inmunitario, provocando el desarrollo de una respuesta inmunitaria específica a antígenos ante la exposición a una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención. El término también es sinónimo de "cantidad suficiente".

Tal como se usa en la presente, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual los ácidos polinucleicos son transcritos en ARNm y traducidos en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido polinucleico deriva de ADN genómico, la expresión puede -si se selecciona un organismo o célula huésped eucariótica apropiada- incluir empalme del ARNm. En el contexto de la presente invención, el término también comprende la obtención de ARNm del gen F del RSV y proteínas F del RSV que se alcanzan después de su expresión.

Tal como se usa en la presente, el término "proteína F" o "proteína de fusión" o "proteína polipeptídica F" o "proteína polipeptídica de fusión" se refiere a un polipéptido o proteína que tiene toda o una parte de una secuencia de aminoácidos de una proteína polipeptídica de fusión del RSV. En forma similar, el término "proteína G" o "proteína polipeptídica G" se refiere a un polipéptido o proteína que tiene toda o una parte de una secuencia de aminoácidos de una proteína polipeptídica de unión del RSV. Numerosas proteínas de fusión y unión del RSV han sido descritas y son conocidas por las personas versadas en el arte. El documento WO/2008/114149, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad, establece variantes de proteínas F y G de ejemplo (por ejemplo, variantes de origen natural).

Tal como se usa en la presente, los términos "inmunogenes" o "antígenos" se refieren a sustancias tales como proteínas, péptidos y ácidos nucleicos que son capaces de manifestar una respuesta inmunitaria. Ambos términos también abarcan epítopos, y se usan en forma intercambiable.

Tal como se usa en la presente el término "inmunoestimulador" se refiere a un compuesto que potencia una respuesta inmunitaria mediante los propios mensajeros químicos del cuerpo (citoquinas). Estas moléculas comprenden varias citoquinas, linfoquinas y quimioquinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, tales como interferones (IFN-g), interleuquinas (por ej., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores del crecimiento (por ej., factor estimulador de colonias (CSF, del inglés Colony Stimula ting Factor) de granulocitos y macrófagos (GM); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófago, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas del inmunoesti ulador se pueden administrar en la misma formulación que las VLP de la invención, o se pueden administrar por separado. La proteína, o un vector de expresión que codifica la proteína, se puede administrar para producir un efecto inmunoestimulador.

Como se usa en la presente, la frase "formulación inmunogénica" se refiere a una preparación que, cuando se administra a un vertebrado -por ej. un mamífero- induce una respuesta inmunitaria.

Tal como se usa en la presente, el término "agente infeccioso" se refiere a microorganismos que causan una infección en un vertebrado. Por lo general, los organismos son virus, bacterias, parásitos, protozoarios y/u hongos.

Tal como se usa en la presente, los términos "mutado/a", "modificado/a", "mutación" o "modificación" indican cualquier modificación de un ácido nucleico y/o polipéptido que genera un ácido nucleico o polipéptido alterado. Las mutaciones incluyen, por ejemplo, mutaciones, deleciones o inserciones puntuales de residuos únicos o múltiples en un polinucleótido, incluyendo alteraciones que se suscitan dentro de una región codificadora de proteína de un gen así como también alteraciones en regiones fuera de una secuencia codificadora de proteína, tal como, de manera no taxativa, secuencias promotoras o reguladoras. Una alteración genética puede ser una mutación de cualquier tipo. Por ejemplo, la mutación puede constituir una mutación puntual, una mutación de cambio de marco, una inserción o una deleción de una parte o de la totalidad de un gen. En algunas formas de realización, las mutaciones son de origen natural. En otras formas de realización, las mutaciones son el resultado de presión de mutación artificial. En incluso otras formas de realización, las mutaciones en las proteínas F del RSV son el resultado de ingeniería genética.

Tal como se usa en la presente, el término "multivalente" se refiere a composiciones que tienen una o más proteínas/péptidos antigénicos o inmunogenes contra múltiples tipos o cepas de agentes infecciosos o enfermedades.

Tal como se usa en la presente, el término "vacuna farmacéuticamente aceptable" se refiere a una formulación que contiene una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada de la presente invención, que está bajo una forma que es capaz de ser administrada a un vertebrado y que induce una respuesta inmunitaria protectora suficiente para inducir inmunidad a, prevenir y/o mejorar una infección o enfermedad, y/o para reducir al menos un síntoma de una infección o enfermedad, y/o para reforzar la eficacia de otra dosis de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. Típicamente, la vacuna comprende un medio convencional de solución acuosa tamponada o solución salina en el cual la composición de la presente invención es suspendida o disuelta. De esta manera, la composición de la presente invención se puede usar, en forma conveniente, para prevenir, mejorar o de alguna manera tratar una infección. Ante la introducción en un huésped, la vacuna puede provocar una respuesta inmunitaria que incluye, mas no se limita a, la producción de anticuerpos y/o citoquinas y/o la activación de células T citotóxicas, células presentadoras de antígeno, células T auxiliares, células dendríticas y/u otras respuestas celulares.

Tal como se usa en la presente, la frase "respuesta 4O inmunitaria protectora" o "respuesta protectora" se refiere a una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos contra un agente infeccioso o enfermedad, que es exhibida por un vertebrado (por ej., un humano), que previene o mejora una infección o reduce al menos un síntoma de enfermedad de la misma. Las proteínas F del RSV modificadas o mutadas, micelas F del RSV que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada, o VLPs que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención pueden estimular la producción de anticuerpos que, por ejemplo, neutralizan agentes infecciosos, bloquean el ingreso de agentes infecciosos en las células, bloquean la replicación de los agentes infecciosos y/o protegen las células huésped de la infección y destrucción. El término también puede hacer referencia a una respuesta inmunitaria que es mediada por linfocitos T y/u otros glóbulos blancos contra un agente infeccioso o enfermedad, exhibida por un vertebrado (por e ., un humano), que previene o mejora la infección o enfermedad, o reduce al menos un síntoma de la misma.

Tal como se usa en la presente, el término "vertebrado" o "sujeto" o "paciente" se refiere a cualquier miembro del subfilo chordata, que incluye, sin limitaciones, humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos. Los animales de granja tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores tales como ratones, ratas (inclusive ratas del algodón) y cobayos; aves, incluyendo aves domésticas, de tipo salvaje y aves de caza tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos y similares, también son ejemplos no limitativos. Los términos "mamíferos" y "animales" están incluidos en esta definición. Tanto los individuos adultos como los neonatos quedan incluidos. En particular, los infantes y los niños pequeños son su etos o pacientes apropiados para la vacuna contra RSV.

Tal como se usa en la presente, el término "partícula de tipo viral" (VLP) se refiere a una estructura que, en al menos un atributo, se asemeja a un virus pero que no ha demostrado ser infecciosa. Las partículas de tipo viral de acuerdo con la invención no portan información genética que codifica las proteínas de las partículas de tipo viral. En general, las partículas de tipo viral carecen de un genoma viral y, por ende, no son infecciosas. Asimismo, las partículas de tipo viral con frecuencia pueden ser producidas en grandes cantidades mediante expresión heteróloga y pueden ser fácilmente purificadas.

Tal como se usa en la presente el término "VLP quimérica" se refiere a las VLPs que contienen proteínas, o porciones de las mismas, de al menos dos agentes infecciosos diferentes (proteínas heterólogas). Por lo general, una de las proteínas deriva de un virus que puede conducir la formación de VLPs de las células huésped. Los ejemplos, a efectos ilustrativos, son la proteína M del BRSV y/o las proteínas G o F del HRSV. Los términos "VLPs del RSV" y "VLPs quiméricas" se pueden usar en forma intercambiable, cuando sea apropiado.

Tal como se usa en la presente, el término "vacuna" se refiere a una preparación de patógenos muertos o debilitados, o de determinantes antigénicos derivados, que se usa para inducir la formación de anticuerpos o inmunidad contra el patógeno. Una vacuna es administrada para proveer inmunidad a la enfermedad -por ejemplo, gripe- que es causada por los virus de la gripe. Asimismo, el término "vacuna" también se refiere a una suspensión o solución de un inmunogen (por ej. una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada) que es administrada a un vertebrado para producir inmunidad protectora, es decir, inmunidad que previene o reduce la severidad de la enfermedad asociada con la infección . La presente invención provee composiciones de vacuna que son inmunogénicas y pueden proveer protección contra una enfermedad asociada con infección.

Proteínas F del RSV Las proteínas F del RSV y los métodos descritos en la Solicitud de Patente U.S. No.12/ 633. 995, presentada el 9 de diciembre de 2009 (publicada el 23 de septiembre de 2010 como Publicación U.S. No. 2010/0239617), la Solicitud de Patente Provisional U.S. No.61/121.126, presentada el 9 de diciembre de 2008, la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. 61/169.077, presentada el 14 de abril de 2009, y la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. 61/224.787, presentada el 10 de Julio de 2009, se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Dos proteínas de membrana estructurales, las proteínas F y G, son expresadas sobre la superficie del RSV, y se ha demostrado que son blancos de los anticuerpos neutralizantes (Sullender, W., 2000, Clinical Mícrobiology Review 13, 1-15). Estas dos proteínas también son principalmente responsables del reconocimiento viral y la entrada en células blanco; la proteína G se une a un receptor celular específico, y la proteína F promueve la fusión del virus con la célula. La proteína F también es expresada sobre la superficie de las células infectadas y es responsable de la posterior fusión con otras células, lo que genera la formación de sincitios. Por ende, los anticuerpos a la proteina F pueden neutralizar el virus o bloquear la entrada del virus en la célula, o prevenir la formación de sincitios. Si bien se han descrito diferencias estructurales y antigénicas entre los subtipos A y B tanto para la proteina F como para la proteina G, las diferencias antigénicas más significativas residen en la proteina G, donde las secuencias de aminoácidos son solamente 53% homologas y la relación antigénica es del 5% (Walsh y colaboradores (1987) J. Infect . Dis. 155, 1198-1204; y Johnson y colaboradores (1987) Proc. Na ti . Acad. Scí . USA 84,5625-5629). Por el contrario, los anticuerpos creados para la proteina F muestran un alto grado de reactividad cruzada entre los virus de subtipo A y B.

La proteína F del RSV dirige la penetración de RSV mediante fusión entre la proteína de envoltura del virión y la membrana plasmática de la célula huésped. Con posterioridad, en la infección, la proteína F expresada sobre la superficie celular puede mediar la fusión con las células aledañas para formar el sincitio. La proteína F es una proteína de superficie transmembrana tipo I que tiene un péptido señal escindido N-terminal y un ancla de membrana cerca del término C. La proteína F del RSV es sintetizada como un precursor F0 inactivo que se ensambla en un homotrínero y se activa mediante escisión en el complejo trans-Golgi por medio de una endoproteasa celular para formar dos subunidades ligadas por disulfuro, las subunidades F1 y F2. El término N de la subunidad F1 que es creado por escisión contiene un dominio hidrófobo (el péptido de fusión) que se inserta directamente en la membrana blanco para iniciar la fusión. La subunidad F1 también contiene repeticiones en héptadas que se asocian durante la fusión, dirigiendo un cambio de conformación que aproxima las membranas celulares y virales (Collins y Crowe, 2007, Fields Vírology, 5ta ed., D.M Kipe y colaboradores, Lipincott, Williams and Wilkons, p. 1604). SEC ID NO: 2 (No. de acceso Genbank AAB59858) ilustra una proteina F del RSV representativa, que está codificada por el gen ilustrado en SEC ID NO: 1 (No. de acceso Genbank M11486).

En la naturaleza, la proteina F del RSV es expresada como un único precursor polipeptidico, de 574 aminoácidos de longitud, designado "FO". In vi vo, el FO se oligomeriza en el retículo endoplasmático y es procesado a nivel proteolitico por una furina proteasa en dos secuencias de consenso de furina conservadas (sitios de escisión de furina), RARR (SEC ID NO: 23) (secundario) y KKRKRR (SEC ID NO: 24) (primario) para generar un oligómero que está conformado por dos fragmentos con enlace disulfuro. El menor de estos fragmentos se denomina "F2" y se origina de la porción N-terminal del precursor FO. Las personas versadas en el arte han de reconocer que las abreviaturas FO, F1 y F2 comúnmente se designan FO, F1 y F2 en la literatura científica. El mayor, el fragmento F1 C-terminal, ancla la proteína F en la membrana mediante una secuencia de aminoácidos hidrófobos, que son adyacentes a una cola citoplasmática de 24 aminoácidos. Tres dímeros F2-F1 se asocian para formar una proteína F madura, que adopta una conformación prefusogénica metaestable ( "pre-fusión") que se desencadena para someterse a un cambio de conformación ante el contacto con una membrana de la célula blanco. Este cambio de conformación expone una secuencia hidrófoba -conocida como el "péptido de fusión"-que se asocia con la membrana de la célula huésped y promueve la fusión de la membrana del virus, o una célula infectada, con la membrana de la célula blanco.

El fragmento F1 contiene al menos dos dominios de repeticiones en héptadas ( hetpa repea t ) , designados "HRA" y "HRB", y está situado en proximidad al péptido de fusión y los dominios ancla transmembrana, respectivamente. En la conformación pre-fusión, el dímero F2-F1 forma una estructura de tallo y cabeza globular, en la cual los dominios HRA se encuentran en conformación segmentada (extendida) en la cabeza globular. Por el contrario, los dominios HRB forman un tallo enrollado en espiral ( coiled-coíl ) de tres hebras que se extiende desde la región de cabeza. Durante la transición desde la conformación pre-fusión hasta la conformación postfusión, los dominios HRA colapsan y se acercan en proximidad a los dominios HRB para formar un manojo de seis hélices anti-paralelas. En el estado post-fusión, el péptido de fusión y los dominios transmembrana se yuxtaponen para facilitar la fusión de membrana.

Si bien la descripción de conformación provista con anterioridad se basa en el modelado molecular de datos cristalográficos, las distinciones estructurales entre las conformaciones pre-fusión y post-fusión se puede monitorear sin recurrir a la cristalografía. Por ejemplo, se puede usar micrografía electrónica para distinguir entre las conformaciones pre-fusión y post-fusión (alternativamente designadas prefusogénicas y fusogénicas), como lo demuestran Calder y colaboradores, Vírology, 271:122-131 (2000) y Morton y colaboradores, Vírology, 311: 275-288, que se incorporan en la presente por referencia a los fines de sus enseñanzas teenológicas. La conformación pre-fusión también puede distinguirse de la conformación fusogénica (post-fusión) mediante ensayos de asociación de liposomas como los descritos por Connolly y colaboradores, Proc. Nati . Acad.

Scí . USA, 103:17903-17908 (2006), que también se incorpora en la presente por referencia a los fines de sus enseñanzas teenológicas. Asimismo, las conformaciones prefusogénicas y fusogénicas se pueden distinguir usando anticuerpos (por ej., anticuerpos monoclonales) que específicamente reconocen los epítopos de conformación presentes en una u otra entre la forma pre-fusión o fusogénica de la proteína F del RSV, pero no en la otra forma. Dichos epítopos de conformación pueden deberse a la exposición preferencial de un determinante antigénico sobre la superficie de la molécula. En forma alternativa, los epítopos de conformación pueden originarse a partir de la yuxtaposición de aminoácidos que no son contiguos en el polipéptido lineal.

Proteínas F del RSV modificadas o mutadas Los presentes inventores han encontrado que se pueden alcanzar niveles sorprendentemente altos de expresión de la proteína de fusión (F) cuando se realizan modificaciones específicas a la estructura de la proteína F del RSV. Dichas modificaciones también reducen en forma inesperada la toxicidad celular de la proteína F del RSV en una célula huésped. Asimismo, las proteínas F modificadas de la presente invención demuestran una habilidad mejorada para exhibir la morfología de "pirulí" o lollípop post-fusión en contraposición con la morfología de "barra" pre-fusión. Por ende, en un aspecto, las proteínas F modificadas de la presente invención también pueden exhibir inmunogenicidad mejorada (por ej. afianzada) en comparación con las proteínas F de tipo salvaje (por ej. ejemplificadas por SEC ID NO: 2, que corresponde al No. de acceso Genbank AAB59858). Estas modificaciones tienen aplicaciones significativas para el desarrollo de vacunas y métodos para usar dichas vacunas para el tratamiento y/o la prevención del RSV.

De acuerdo con la invención, se puede realizar cualquier número de mutaciones a las proteínas F del RSV nativas o de tipo salvaje y, en un aspecto preferente, se pueden realizar múltiples mutaciones que generan expresión y/o propiedades inmunogénicas mejoradas en comparación con las proteínas F del RSV nativas o de tipo salvaje. Dichas mutaciones incluyen mutaciones puntuales, mutaciones de cambio de marco, deleciones, e inserciones, con una o más (por ej., una, dos, tres, o cuatro, etc.) mutaciones preferidas.

La proteína polipeptídica F nativa se puede seleccionar entre cualquier proteína F de una cepa A de RSV, cepa B de RSV, cepa A de HRSV, cepa B de HRSV, cepa de BRSV, o cepa de RSV aviar, o de variantes de las mismas (tal como se definió con anterioridad) . En ciertas formas de realización de ejemplo, la proteína polipeptídica F nativa es la proteína F representada por SEC ID NO: 2 (No. de acceso de GenBank AAB59858). Para facilitar el entendimiento de esta divulgación, todas las posiciones de residuos de aminoácidos, independientemente de la cepa, se dan con respecto a (es decir, la posición del residuo de aminoácido corresponde a) la posición del aminoácido de la proteína F de ejemplo. Las posiciones de aminoácidos comparables de la proteína F de otras cepas de RSV pueden ser determinadas con facilidad por parte de las personas medianamente versadas en el arte al alinear las secuencias de aminoácidos de la cepa de RSV seleccionada con aquella de la secuencia de e emplo usando algoritmos de alineación ampliamente conocidos y fácilmente disponibles (tales como BLAST, por ej., que usa parámetros por defecto). Numerosos ejemplos adicionales de proteínas polipeptídicas F de diferentes cepas de RSV se revelan en el documento WO/2008/114149 (que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad). Las variantes adicionales se pueden obtener a través de derivas genéticas, o pueden ser producidas de manera artificial usando mutagenesis dirigida a sitio o aleatoria, o mediante recombinación de dos o más variantes pre-existentes. Dichas variantes adicionales también son adecuadas en el contexto de las proteínas F del RSV modificadas o mutadas que se revelan en la presente.

Las mutaciones se pueden introducir en las proteínas F del RSV de la presente invención usando cualquier metodología conocida para las personas versadas en el arte. Las mutaciones se pueden introducir en forma aleatoria al llevar a cabo, por ejemplo, una reacción PCR en presencia de manganeso como cofactor de ion de metal divalente. En forma alternativa, se puede usar mutagenesis dirigida a oligonucleótidos para crear las proteínas F del RSV mutantes o modificadas, lo que permite toda clase posible de cambios de pares de base en cualquier sitio determinado a lo largo de la molécula de ADN codificadora. En general, esta téenica implica recocer un oligonucleótido complementario (excepto por una o más discordancias) a una secuencia de nucleótidos monocatenaria que codifica la proteína F del RSV de interés. El oligonucleótido discordante es luego extendido por ADN polimerasa, generando una molécula de ADN bicatenaria que contiene el cambio deseado en secuencia en una hebra. Los cambios en secuencia pueden, por ejemplo, generar la deleción, sustitución o inserción de un aminoácido. El polinucleótido bicatenario puede luego insertarse en un vector de expresión apropiado, y un polipéptido mutante o modificado puede, por ende, ser producido. La mutagenesis dirigida a oligonucleótidos descrita con anterioridad puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante PCR.

Proteínas del RSV adicionales La invención también comprende partículas de tipo viral (VLPs) de RSV que comprenden una proteina F del RSV modificada o mutada que puede formularse en vacunas o formulaciones antigénicas para proteger a los animales vertebrados (por ej. humanos) contra infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad de la misma. En algunas formas de realización, la VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada comprende, además, proteínas del RSV adicionales, tales como M, N, G y SH. En otras formas de realización, la VLP que comprende una proteina F del RSV modificada o mutada comprende, además, proteínas de cepas heterolólogas de virus, tales como proteínas del virus de la gripe HA, NA y MI. En una forma de realización, la proteína del virus de la gripe MI deriva de una cepa del virus de la gripe aviar.

La proteína N del RSV se une ajustadamente tanto al ARN genómico como al ARN anti-genómico intermediario replicativo para formar nucleocápsida ribonucleasa resistente. Las SEC ID NO: 16 (de tipo salvaje) y 18 (codones optimizados) ilustran secuencias de aminoácidos representativas de la proteína N del RSV y SEC ID NOs: 15 (de tipo salvaje) y 17 (codones optimizados) ilustran secuencias de ácido nucleico representativas que codifican la proteína N del RSV. En esta invención se incluyen las proteínas N del RSV que son al menos aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%,· aproximadamente 70% o aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idénticas a SEC ID NO: 18, y todos los fragmentos y variantes (incluyendo las proteínas quiméricas) de las mismas.

La proteina M del RSV es una proteína virión interna no glicosilada que se acumula en la membrana plasmática que interactúa con la proteína E del RSV y otros factores durante la morfogénesis del virus. En ciertas formas de realización preferidas, la proteína M del RSV es una proteína M del RSV bovino (BRSV). SEC ID NOs: 12 (de tipo salvaje) y 14 (codones optimizados) ilustran secuencias de aminoácidos representativas de la proteína M del BRSV y SEC ID NOs: 11 (de tipo salvaje) y 13 (codones optimizados) ilustran secuencias de ácido nucleico representativas que codifican la proteína M del BRSV. En esta invención se incluyen las proteínas M del RSV (incluyendo, en forma no taxativa, BRSV) que son al menos aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% aproximadamente 96% aproximadamente 97% aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idénticas a las SEC ID NO: 12 y 14, y todos los fragmentos y variantes (incluyendo las proteínas quiméricas) de las mismas.

La proteína G del RSV es una glicoproteína transmembrana tipo II con una única región hidrófoba cerca del extremo N-terminal que sirve tanto como péptido señal no escindido cuanto como un ancla de membrana, dejando dos tercios C-terminales de la molécula orientados en forma externa. La proteína G del RSV también se expresa como una proteína segregada producida por inicio de traducción en el segundo AUG en el ORF (aproximadamente en el aminoácido 48), que yace dentro de la señal/ancla. La mayor parte del ectodominio de la proteína G del RSV es altamente divergente entre las cepas de RSV { Id. , p.1607). La SEC ID NO: 26 ilustra una proteína G del RSV representativa, que es codificada por la secuencia génica ilustrada en la SEC ID NO: 25. En esta invención se incluyen proteínas G del RSV que son al menos aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idénticas a la SEC ID NO: 26, y todos los fragmentos y variantes (incluyendo las proteínas quiméricas) de las mismas.

La proteína SH del RSV es una proteína transmembrana tipo II que contiene 64 (subgrupo A RSV) ó 65 residuos de aminoácidos (subgrupo B RSV). Algunos estudios han sugerido que la proteína SH del RSV puede participar en la fusión viral o en el cambio de la permeabilidad de membrana. No obstante, los RSV que carecen del gen SH son viables, causan formación de sincitios y se desarrollan tan bien como los virus de tipo salvaje, lo que indica que la proteína SH no es necesaria para la entrada del virus en las células huésped o la formación de sincitios. La proteína SH del RSV ha demostrado tener habilidad para inhibir señalización de TNF-a. La SEC ID NO: 27 ilustra una secuencia de aminoácidos representativa de la proteína SH del RSV. En esta invención se incluyen proteínas SH del RSV que son al menos aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idénticas a la SEC ID NO: 27, y todos los fragmentos y variantes (incluyendo las proteínas quiméricas) de las mismas.

Vacunas para RSV En la actualidad el único enfoque aprobado para la profilaxis de la enfermedad de RSV es la inmunización pasiva. Se obtuvo evidencia inicial que sugiere un rol protector para IgG a partir de las observaciones que implican anticuerpo materno en hurones (Prince, G. A., Ph.D. diss., University of California, Los Ángeles, 1975) y humanos (Lambrecht y colaboradores, (1976) J. Infect . Di s. 134, 211-217; y Glezen y colaboradores (1981) J. Pedia tr. 98,708-715). Hemming y colaboradores (Morell y colaboradores, eds., 1986, Clínícal Use of Intravenous Immunoglobulins Academic Press, Londres, en páginas 285 a 294) reconocieron la posible utilidad del anticuerpo para RSV en el tratamiento o la prevención de infección por RSV durante estudios que comprenden la farmacocinética de una inmunoglobulina intravenosa (IVIG, del inglés Intravenous Immunoglobulín ) en neonatos bajo sospecha de sepsis neonatal. Notaron que un infante, cuyas secreciones respiratorias arrojaron RSV, se recuperó rápidamente después de infusión de IVIG. El análisis posterior del lote de IVIG reveló un titulo inusualmente alto de anticuerpo neutralizante de RSV. Este mismo grupo de investigadores examinó luego la habilidad de la inmunoglobulina o suero hiper-inmune, enriquecidos con anticuerpo neutralizante de RSV, para proteger ratas del algodón y primates contra infección por RSV (Prince y colaboradores (1985) Virus Res. 3, 193-206; Prince y colaboradores (1990) J. Virol . 64, 3091- 3092. Los resultados de estos estudios sugieren que el anticuerpo neutralizante de RSV administrado en forma profiláctica inhibió la replicación en el tracto respiratorio de RSV en las ratas del algodón. Cuando se administró en forma terapéutica, el anticuerpo para RSV redujo la replicación viral pulmonar tanto en ratas del algodón como en un modelo de primate no humano. Asimismo, la infusión pasiva de suero inmune o globulina inmune no produjo patología pulmonar afianzada en ratas del algodón posteriormente provocadas con RSV.

Como la infección por RSV se puede prevenir al proveer anticuerpos neutralizantes a un vertebrado, una vacuna que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada puede inducir -cuando se administra a un vertebrado- anticuerpos neutralizantes in vivo. Las proteínas F del RSV modificadas o mutadas se usan favorablemente para la prevención y/o el tratamiento de infección por RSV. Por ende, otro aspecto de esta invención se refiere a un método para producir una respuesta inmunitaria contra RSV. El método comprende administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que contiene una proteína F del RSV modificada o mutada a un sujeto (tal como un humano o un animal). La administración de una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición produce una respuesta inmunitaria específica para los epítopos presentes en la proteina F del RSV modificada o mutada. Dicha respuesta inmunitaria puede incluir respuestas de células B (por ej., la producción de anticuerpos neutralizantes) y/o respuestas de células T (por ej., la producción de citoquinas). Preferentemente, la respuesta inmunitaria producida por la proteína F del RSV modificada o mutada incluye elementos que son específicos para al menos un epítopo de conformación presente en la proteína F del RSV modificada o mutada. En una forma de realización, la respuesta inmunitaria es específica para un epítopo presente en una proteína F del RSV que se encuentra en el estado activo post-fusión como "pirulí" o lollípop. Las proteínas F del RSV y las composiciones se pueden administrar a un su eto sin reforzar la enfermedad viral después del contacto con el RSV. Preferentemente, las proteínas F del RSV modificadas o mutadas que se revelan en la presente y las composiciones inmunogénicas formuladas de manera adecuada producen una respuesta inmunitaria inclinada a Thl que reduce o previene la infección con un RSV y/o reduce o previene una respuesta patológica después de la infección con un RSV.

En una forma de realización, las proteínas F del RSV de la presente invención se encuentran en forma de micelas (por ej . rosetas). Las micelas obtenibles de acuerdo con la invención consisten en aglomerados de las proteínas espículas ( spike ) F inmunogénicamente activas que tienen una estructura de tipo roseta. Las rosetas son visibles en el microscopio de electrones (Calder y colaboradores, 2000, Virology 271: 122-131). Preferentemente, las mácelas de la presente invención que comprenden proteínas F del RSV modificadas o mutadas exhiben la morfología de "pirulí" que indica el estado activo post-fusión. En una forma de realización, las micelas son purificadas después de la expresión en una célula huésped. Cuando se administran a un sujeto, las micelas de la presente invención preferentemente inducen anticuerpos neutralizantes. En algunas formas de realización, las micelas se pueden administrar con un adyuvante. En otras formas de realización, las micelas se pueden administrar sin un adyuvante.

En otra forma de realización, la invención comprende partículas de tipo viral (VLPs) de RSV que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada que se puede formular en vacunas o formulaciones antigénicas para proteger a los animales vertebrados (por ej. humanos) contra la infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad de la misma. La presente invención también se refiere a VLPs de RSV y vectores que comprenden genes de RSV de tipo salvaje y mutados, o una combinación de los mismos, derivados de diferentes cepas del virus de RSV que, cuando son transfectados en células huésped, producen partículas de tipo viral (VLPs) que comprenden proteínas de RSV.

En algunas formas de realización, las partículas de tipo viral de RSV también pueden comprender al menos una proteína de matriz viral (por ej. un proteína M del RSV). En una forma de realización, la proteina M deriva de una cepa humana de RSV. En otra forma de realización, la proteína M deriva de una cepa bovina de RSV. En otras formas de realización, la proteína de matriz puede ser una proteína MI de una cepa del virus de la gripe. En una forma de realización, la cepa del virus de la gripe es una cepa del virus de la gripe aviar. En una forma de realización preferida, la cepa del virus de la gripe aviar es la cepa H5N1 A/Indonesia/5/05. En otras formas de realización, la proteína de matriz puede ser del Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV).

En algunas formas de realización, las VLPs pueden comprender, además, una proteína G del RSV. En una forma de realización, la proteína G puede ser del grupo A del HRSV. En otra forma de realización, la proteína G puede ser del grupo B del HRSV. En incluso otra forma de realización, la proteína G del RSV G puede derivar del grupo A y/o grupo B del HRSV.

En algunas formas de realización, las VLPs pueden comprender, además, una proteína SH del RSV. En una forma de realización, la proteína SH puede ser del grupo A del HRSV. En otra forma de realización, la proteína SH puede ser del grupo B del HRSV. En incluso otra forma de realización, la proteína SH del RSV puede derivar del grupo A y/o grupo B del HRSV.

En algunas formas de realización, las VLPs pueden comprender, además, una proteína N del RSV. En una forma de realización, la proteína N puede ser del grupo A del HRSV. En otra forma de realización, la proteína N puede ser del grupo B del HRSV. En incluso otra forma de realización, la proteína N del RSV puede derivar del grupo A y/o grupo B del HRSV.

En otras formas de realización, las VLPs pueden comprender uno o más inmunogenes heterólogos, tales como hemaglutinina (HA) y/o neuraminidasa (NA) de la gripe.

En algunas formas de realización, la invención también comprende combinaciones de diferentes proteínas M, F, N, SH y/o G del RSV de cepas iguales y/o diferentes en una o más VLPs. Asimismo, las VLPs pueden incluir una o más moléculas adicionales para el afianzamiento de una respuesta inmunitaria.

En otra forma de realización de la invención, las VLPs del RSV pueden portar agentes tales como ácidos nucleicos, ARN de interferencia pequeño, microARN, agentes quimioterapéuticos, agentes de imagen y/u otros agentes que necesitan ser suministrados a un paciente.

Las VLPs de la invención son útiles para preparar vacunas y composiciones inmunogénicas. Un rasgo importante de las VLPc es la habilidad para expresar proteínas de superficie de interés para que el sistema inmunitario de un vertebrado induzca una respuesta inmunitaria contra la proteína de interés. No obstante, no todas las proteínas se pueden expresar sobre la superficie de las VLPs. Pueden existir muchas razones por las cuales ciertas proteínas no son expresadas, o son deficientemente expresadas, sobre la superficie de las VLPs. Una razón es que la proteína no esté dirigida a la membrana de una célula huésped o que la proteína no tenga un dominio transmembrana. Como ejemplo, las secuencias cercanas al término carboxilo de la hemaglutinina de la gripe pueden ser importantes para la incorporación de la HA en la bicapa lipídica de las nucleocápsidas de envoltura del virus de la gripe maduras y para el ensamblado de la interacción del trímero de HA con la proteína de matriz MI del virus de la gripe (Ali, y colaboradores, (2000) J. Virol .74, 8709-19).

Por ende, una forma de realización de la invención comprende VLPs quiméricas que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos un inmunogen que normalmente no es expresado de manera eficiente sobre la superficie celular o que no es una proteína del RSV normal.

En una forma de realización, la proteína F del RSV modificada o mutada se puede fusionar con un inmunogen de interés. En otra forma de realización, la proteina F del RSV modificada o mutada se asocia con el inmunogen a través del dominio transmembrana y cola citoplasmática de una proteina membrana de superficie viral heteróloga, por ej., proteina de envoltura de MMTV.

Otras VLPs quiméricas de la invención incluyen VLPs que comprenden una proteina F del RSV modificada o mutada y al menos una proteina de un agente infeccioso heterólogo. Los ejemplos de agentes infecciosos heterólogos incluyen, de manera no taxativa: un virus, una bacteria, un protozoario, un hongo y/o un parásito. En una forma de realización, el inmunogen de otro agente infeccioso es una proteina viral heteróloga. En otra forma de realización, la proteina de un agente infeccioso heterólogo es una proteina asociada a envoltura. En otra forma de realización, la proteína de otro agente infeccioso heterólogo es expresada sobre la superficie de las VLPs. En otra forma de realización, la proteína de un agente infeccioso comprende un epítopo que genera una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado. En una forma de realización, la proteína de otro agente infeccioso es co-expresada con una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, la proteína de otro agente infeccioso se fusiona a una proteina F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, solamente una porción de una proteina de otro agente infeccioso se fusiona a una proteina F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, solamente una porción de una proteina de otro agente infeccioso se fusiona a una porción de una proteina F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, la porción de la proteina de otro agente infeccioso fusionada a la proteina F del RSV modificada o mutada es expresada sobre la superficie de las VLPs.

La invención también comprende variantes de las proteínas expresadas sobre o en las VLPs de la invención. Las variantes pueden contener alteraciones en las secuencias de aminoácidos de las proteínas constituyentes. El término "variante" con respecto a una proteína se refiere a una secuencia de aminoácidos que es alterada por uno o más aminoácidos con respecto a la secuencia de referencia. La variante puede tener cambios "conservativos", en donde un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ej., reemplazo de leucina con isoleucina. En forma alternativa, una variante puede tener cambios "no conservativos", por ej., reemplazo de una glicina con un triptófano. Las variaciones menores análogas también pueden incluir deleción o inserción de aminoácidos, o ambas.

El asesoramiento para determinar qué residuos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar o delecionar sin eliminar la actividad biológica o inmunológica se puede encontrar usando programas de computación ampliamente conocidos en el arte, por ejemplo, el programa informático DNASTAR.

Es posible que ocurran variantes naturales debido a mutaciones en las proteínas. Estas mutaciones pueden generar variabilidad antigénica dentro de los grupos individuales de agentes infecciosos, por ejemplo gripe. Por ende, una persona infectada con, por ejemplo, una cepa del virus de la gripe desarrolla anticuerpos contra ese virus; a medida que aparecen cepas de virus más nuevas, los anticuerpos contra las cepas más viejas ya no reconocen el virus más nuevo y puede ocurrir re-infección. La invención comprende toda variabilidad antigénica y genética de las proteínas de los agentes infecciosos para hacer VLPs.

Los textos generales que describen téenicas biológicas moleculares, que son aplicables a la presente invención, tales como clonación, mutación, cultivo celular y similares, incluyen Berger y Kimmel, Guíde to Molecular Cloning Techniques , Methods ín Enzymology , volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3ra Ed.), Vol. 1-3, Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook") y Curren t Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel y colaboradores, eds. r Current Protocols, un trabajo conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wilcy & Sons, Inc., ("Ausubel"). Estos textos describen la mutagenesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados con, por ej ., la clonación y mutación de moléculas F y/o G de RSV, etc. Por ende, la invención también comprende el uso de métodos conocidos de manipulación de proteínas y teenología de ADN recombinante para mejorar o alterar las características de las proteínas expresadas sobre o en las VLPs de la invención. Varios tipos de mutagenesis se pueden usar para producir y/o aislar ácidos nucleicos variantes que codifican moléculas de proteínas y/o para modi ficar/mutar adicionalmente las proteínas en o sobre las VLPs de la invención. Estos incluyen, de manera no taxativa, mutagenesis puntual aleatoria, dirigida a sitio, recombinación homologa (barajado de ADN), mutagenesis que usa moldes que contienen uracilo, mutagenesis dirigida a oligonucleótidos , mutagenesis de ADN por modificación con fosforotioato, mutagenesis que usan ADN dúplex con espacios o similares. Los métodos adecuados adicionales incluyen reparación de discordancia puntual, mutagenesis que usa cepas huéspedes deficientes de reparación, restricción-selección y restricción-purificación mutagenesis por deleción mutagenesis por síntesis génica total, reparación de separación de hebras dobles, y similares. La mutagenesis, por ej., que comprende construcciones quiméricas, también está incluida en la presente invención. En una forma de realización, la mutagenesis puede ser guiada mediante información conocida de la molécula de origen natural o molécula de origen natural alterada o mutada, por ej., secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura cristalina o similares.

La invención además comprende variantes de proteínas que muestran actividad biológica sustancial, por e ., capaces de producir una respuesta de anticuerpos efectiva cuando se expresan sobre o en las VLPs de la invención. Dichas variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas de acuerdo con las reglas generales conocidas en el arte por tener poco efecto sobre la actividad.

Los métodos para clonar las proteínas son conocidos en el arte. Por ejemplo, el gen que codifica una proteína específica del RSV se puede aislar mediante RT-PCR a partir de ARNm políadenilado extraído de células que fueron infectadas con un virus RSV. El gen producto resultante se puede clonar como inserción de ADN en un vector. El término "vector" se refiere al medio por el cual un ácido nucleico se puede propagar y/o transferir entre organismos, células o componentes celulares. Los vectores incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos, pro-virus, fagémidos, transposones, cromosomas artificiales y similares, que se replican en forma autónoma o pueden integrarse en un cromosoma de una célula huésped. Un vector también puede ser un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucleótido compuesto tanto de ADN como de ARN dentro de la misma hebra, un ADN o ARN poli-lisina-conjugado, un ADN liposoma-conjugado, o similares, que no se replica de manera autónoma. En la mayoría de las formas de realización comunes, mas no en todas, los vectores de la presente invención son plásmidos o bácmidos .

Por ende, la invención comprende nucleótidos que codifican proteínas, incluyendo moléculas quiméricas, clonadas en un vector de expresión que se puede expresar en una célula que induce las formación de las VLPs de la invención. Un "vector de expresión" es un vector, tal como un plásmido, que es capaz de promover la expresión, así como también la replicación, de un ácido nucleico incorporado en el mismo. Típicamente, el ácido nucleico a ser expresado está "ligado en forma operativa" a un promotor y/o potenciador, y está sometido al control regulador de trascripción por el promotor y/o potenciador. En una forma de realización, los nucleótidos codifican una proteina F del RSV modificada o mutada (tal como se analizó con anterioridad). En otra forma de realización, el vector además comprende nucleótidos que codifican las proteínas M y/o G del RSV. En otra forma de realización, el vector además comprende nucleótidos que codifican las proteínas M y/o N del RSV. En otra forma de realización, el vector además comprende nucleótidos que codifican las proteínas M, G y/o N del RSV. En otra forma de realización, el vector además comprende nucleótidos que codifican una proteína M del BRSV y/o proteínas N del RSV. En otra forma de realización, el vector además comprende nucleótidos que codifican una proteína M y/o G del BRSV, o una proteína HA y/o NA del virus de la gripe. En otra forma de realización, los nucleótidos codifican una proteína F del RSV y/o G del RSV modificada o mutada con una proteína HA y/o NA del virus de la gripe. En otra forma de realización, el vector de expresión es un vector de baculovirus.

En algunas formas de realización de la invención, las proteínas pueden comprender mutaciones que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades de la proteína codificada o cómo se forman las proteínas. Las variantes de nucleótidos se pueden producir por una variedad de razones, por ej. para optimizar la 7 O expresión de codones para un huésped particular (cambio de codones en el ARNm humano por los preferidos por las células de insecto tales como células Sf9). Véase la publicación de patente estadounidense 2005/0118191, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Además, los nucleótidos se pueden secuenciar para asegurar que se hayan clonado las regiones codificadoras correctas y que no contengan ninguna mutación indeseada. Los nucleótidos se puede subclonar en un vector de expresión (por ej. baculovirus) para la expresión en cualquier célula. Lo anterior es sólo un ejemplo de cómo se pueden clonar las proteínas virales del RSV. Una persona versada en el arte entiende que otros métodos son posibles y se encuentran disponibles.

La invención también provee construcciones y/o vectores que comprenden nucleótidos de RSV que codifican los genes estructurales de RSV, incluyendo F, M, G, N, SH, o sus porciones, y/o cualquier molécula quimérica descrita con anterioridad. El vector puede ser, por ejemplo, un vector fágico, plasmidico, viral o retroviral. Las construcciones y/o vectores que comprenden genes estructurales de RSV, incluyendo F, M, G, N, SH, o sus porciones, y/o cualquier molécula quimérica descrita con anterioridad, deberían estar ligados en forma operativa a un promotor apropiado, tal como el promotor de polihedrina de AcMNPV (u otro baculovirus), promotor PL lambda fágico, los promotores lac, phoA y tac de E. colí, los promotores tempranos y tardíos de SV40, y los promotores de LTRs retrovirales son ejemplos no limitativos. Otros promotores adecuados serán conocidos por la persona versada en el arte según la célula huésped y/o la tasa de expresión deseada. Las construcciones de expresión contienen, además, sitios para el inicio y la finalización de la trascripción y, en la región transcrita, un sitio de unión del ribosoma para la traducción. La porción codificadora de los transcriptos expresados por las construcciones incluyen preferentemente un codón de inicio de traducción al comienzo y un codón de finalización posicionado en forma apropiada al final del polipéptido a ser traducido.

Los vectores de expresión incluyen preferentemente al menos un marcador seleccionadle. Dichos marcadores incluyen resistencia a dihidrofolato reductasa, G418 o neomicina para cultivo de células eucarióticas y genes de resistencia a tetracielina, kanamicina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias. Entre los vectores preferidos se encuentran los vectores virales, tales como baculovirus, virus de la viruela o poxvírus (por e ., virus vacuna, virus de la viruela aviar virus de la viruela de los canarios virus de la viruela de las aves de corral, virus de la viruela del mapache, virus de la viruela porcina, etc.), adenovirus (por ej., adenovirus canino), herpesvirus y retrovirus. Otros vectores que se pueden usar con la invención comprenden vectores para uso en bacterias, que comprenden pQE70, pQE60 y pQE-9, vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Entre los vectores eucarióticos preferidos se encuentran pFastBacl pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL. Otros vectores adecuados serán fácilmente advertidos por la persona versada en el arte. En una forma de realización, el vector que comprende nucleótidos que codifican genes del RSV, incluyendo genes F del RSV modificados o mutados, así como también genes para M, G, N, SH o sus porciones, y/o cualquier molécula quimérica descrita con anterioridad, es pFastBac.

Las construcciones recombinantes mencionadas con anterioridad se podrían usar para transfectar, infectar o transformar y pueden expresar proteínas del RSV, incluyendo una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos un inmunogen. En una forma de realización, la construcción recombinante comprende proteínas F, M, G, N, SH del RSV modificadas o mutadas, o sus porciones, y/o cualquier molécula quimérica descrita con anterioridad, en células eucarióticas y/o células procarióticas. Por ende, la invención provee células huésped que comprenden un vector (o vectores) que contiene/n ácidos nucleicos que codifican genes estructurales de RSV, incluyendo proteínas F del RSV modificadas o mutadas; y al menos un inmunogen tal como, de manera no taxativa G, N, y SH del RSV, o sus porciones, y/o cualquier molécula descrita con anterioridad, y permiten la expresión de genes, incluyendo F, G, N, M, o SH del RSV, o sus porciones, y/o cualquier molécula descrita con anterioridad en la célula huésped bajo condiciones que permiten la formación de las VLPs.

Entre las células huésped eucarióticas se encuentran las células huésped de levadura, insecto, ave, planta, C. elegans (o nematodo) y mamífero. Los ejemplos no limitativos de células de insecto son: células de Spodoptera frugiperda (Sf), por ej. Sf9, Sf21, células de Trichoplusía ni , por ej. células High Five, y células de Drosophila S2. Los ejemplos de células huésped fúngicas (incluyendo levadura) son S . cerevisiae, Kluyveromyces lactis ( K . lactis) , especies de Candida que incluyen C. albi cans y C. glabrata , Aspergill us nídulans, Schí zosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoras, y Yarrowia lipolytica . Los ejemplos de células de mamíferos son las células COS, células de riñón de hámster bebé, células L de ratón, células LNCaP, células de ovario de hámster chino (CHO, del inglés Chínese Hámster Ovary) células de riñón embrionario humano (HEK, del inglés Human Embryonic Kidney) , y células de mono verde Africano, células CV1, células HeLa, células MDCK, células Vero y células Hep-2. Los ovocitos de Xenopus laevis, u otras células de origen anfibio, también pueden ser utilizados. Los ejemplos de células huésped procarióticas incluyen células bacterianas, por ejemplo, E. coli , B. subtilí s, Salmonella typhi y micobacterias.

Los vectores, por ej ., vectores que comprenden polinucleótidos de una proteina F del RSV modificada o mutada; y al menos un inmunogen que incluye, mas no se limita a G, N, o SH de RSV o sus porciones, y/o cualquier molécula descrita con anterioridad, se pueden transfectar en células huésped de acuerdo con métodos ampliamente conocidos en el arte. Por ejemplo, la introducción de ácidos nucleicos en células eucarióticas se puede realizar mediante co-precipitación de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección y transfección mediante el empleo de reactivos de transfección de polia ina. En una forma de realización, el vector es un baculovirus recombinante. En otra forma de realización, el baculovirus recombinante es transfectado en una célula eucariótica. En una forma de realización preferida, la célula es una célula de insecto. En otra forma de realización, la célula de insecto es una célula Sf9.

Esta invención también provee construcciones y métodos que incrementan la eficiencia de la producción de VLP. Por ejemplo, la adición de secuencias lideres a F, M, G, N, SH de RSV o sus porciones, y/o cualesquiera moléculas quiméricas o heterólogas descritas con anterioridad, puede mejorar la eficiencia del transporte de proteínas dentro de la célula. Por ejemplo, una secuencia señal heteróloga se puede fusionar a F, M, G, N, SH, o sus porciones, y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita con anterioridad. En una forma de realización, la secuencia señal puede derivar del gen de una célula de insecto y fusionada a M, F, G, N, SH, o sus porciones, y/o cualesquiera moléculas quiméricas o heterólogas descritas con anterioridad. En otra forma de realización, el péptido señal es una secuencia señal de chitinasa, que funciona de manera eficiente en sistemas de expresión de baculovirus.

Otro método para incrementar la eficiencia de la producción de VLP es la optimización de codones en nucleótidos que codifican RSV, incluyendo una proteina F del RSV modificada o mutada, M, G, N, SH o sus porciones, y/o cualesquiera moléculas quiméricas o heterólogas descritas con anterioridad para un tipo celular específico. Para los i ejemplos de optimización de codones en ácidos nucleicos para expresión en célula Sf9, ver las SEC ID No: 3, 5, 7, 9, 13, 17, 19 y 25.

La invención también provee métodos para producir VLPs. Los métodos comprenden expresar genes de RSV que incluyen una proteina F del RSV modificada o mutada, y al menos una proteina adicional, que incluye mas no se limita a M, G, N, SH de RSV o sus porciones, y/o cualesquiera moléculas quiméricas o heterólogas descritas con anterioridad bajo condiciones que permiten la formación de VLP. Según el sistema de expresión y la célula huésped seleccionada, las VLPs son producidas al desarrollar células huésped transformadas por un vector de expresión bajo condiciones mediante las cuales las proteínas recombinantes son expresadas y las VLPs son formadas. En una forma de realización, la invención comprende un método para producir una VLP, que comprende transfectar vectores que codifican al menos una proteína F del RSV modificada o mutada en una célula huésped adecuada y expresar la proteina F del RSV modificada o mutada bajo condiciones que permiten la formación de VLP. En otra forma de realización, la célula eucariótica se selecciona entre el grupo que consiste en células de levadura, insecto, anfibio, ave o mamífero. La selección de las condiciones de cultivo apropiadas se encuentra dentro del conocimiento de la persona medianamente versada en el arte.

Los métodos para cultivar células manipuladas para producir las VLPs de la invención incluyen, de manera no taxativa, téenicas de cultivo celular en lote, de alimentación en lote, continuo y de perfusión. El cultivo celular se refiere al desarrollo y la propagación de células en un bioreactor (una cámara de fermentación) donde las células se propagan y expresan proteínas (por ej. proteínas recombinantes) para la purificación y el aislamiento. Típicamente, el cultivo celular se realiza bajo condiciones estériles de atmósfera y temperatura controladas. Un bioreactor es una cámara usada para cultivar células en el cual se pueden monitorear las condiciones ambientales tales como temperatura, atmósfera, agitación y/o pH. En una forma de realización, el bioreactor es una cámara de acero inoxidable. En otra forma de realización, el bioreactor es una bolsa de plástico pre-esterilizada (por e . Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ). En otra forma de realización, las bolsas de plástico pre-esterilizadas son bolsas de aproximadamente 50 L a 1000 L.

Las VLPs luego se aíslan usando métodos que conservan la integridad de las mismas, tales como mediante centrifugación en gradiente, por ej., cloruro de cesio, sacarosa e iodixanol, así como también téenicas de purificación estándares que incluyen, por ej., intercambio iónico y cromatografía de filtración de gel.

El siguiente es un ejemplo de cómo las VLPs de la invención se pueden formar, aislar y purificar. Por lo general, las VLPs son producidas a partir de líneas celulares recombinantes manipuladas para crear VLPs cuando las células se desarrollan en cultivo celular (ver párrafos anteriores). La persona versada en el arte entendería que existen métodos adicionales que se pueden usar para formar y purificar las VLPs de la invención; por ende, la invención no se limita al método descrito.

La producción de las VLPs de la invención puede comenzar sembrando células Sf9 (no infectadas) en matraces de agitación, permitiendo que las células se expandan y aumenten a escala a medida que las células crecen y se multiplican (por ejemplo de un matraz de 125 mi a una bolsa Wave de 50 L) . El medio usado para cultivar la célula es formulado para la línea celular apropiada (preferentemente, medio libre de suero, por ej. medio de insecto ExCell-420, JRH). A continuación, las células son infectadas con baculovirus recombinante a la multiplicidad más eficiente de infección (por ej. desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 unidades formadoras de placas por célula). Una vez que se produjo la infección, la proteina F del RSV modificada o mutada, M, G, N, SH, o sus porciones, y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita con anterioridad, se expresan a partir del genoma del virus, se autoensamblan en las VLPs y son segregadas de las células aproximadamente 24 a 72 horas después de la infección. En general, la infección es más eficiente cuando las células están en fase logarítmica intermedia de crecimiento (4-8 c 106 células/ml) y son al menos aproximadamente 90% viables.

Las VLPs de la invención se pueden cosechar aproximadamente 48 a 96 horas después de la infección, cuando los niveles de las VLPs en el medio de cultivo celular están cerca del máximo pero antes de la lisis celular extensiva. La densidad y la viabilidad de la célula Sf9 al momento de la cosecha puede ser de aproximadamente 0.5* 106 células/ml hasta aproximadamente 1.5 * 106 células/ml con al menos 20% de viabilidad, tal como se ilustra mediante el ensayo de exclusión con tinte. A continuación, el medio se extrae y se clarifica. Se puede agregar NaCl al medio a una concentración de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 1.0 M, preferentemente a aproximadamente 0.5 M, para evitar la aglomeración de las VLPs. La extracción de células y restos celulares del medio de cultivo celular que contiene las VLPs de la invención se puede alcanzar mediante filtración de flujo tangencial (TFF del inglés, Tangential Flow Fil tratíon ) con un cartucho de filtro de fibra hueca de 0.5 ó 1.00 mm de uso único pre-esterilizado, o dispositivo similar.

A continuación, las VLPs en el medio de cultivo clarificado se pueden concentrar mediante ultrafiltración usando un cartucho de fibra hueca de peso molecular limite de 500.000, descartable, pre-esterilizado. Las VLPs concentradas se pueden diafiltrar contra 10 volúmenes de solución salina tamponada en fosfato (PBS del inglés, Phosphate-Buffered Salíne) pH 7.0 a 8.0, que contiene NaCl 0.5 M para extraer los componentes residuales del medio.

Las VLPs concentradas, diafiltradas, se pueden purificar adicionalmente en un gradiente de sacarosa discontinuo de 20% a 60% en un tampón o buffer de PBS de pH 7.2 con NaCl 0.5 M mediante centrifugación a 6,500 c g durante 18 horas a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 10 °C. Por lo general, las VLPs forman una banda visible distintiva entre aproximadamente 30% a aproximadamente 40% de sacarosa o en la interfaz (en un gradiente de paso de 20% y 60%) que se puede recolectar del gradiente y almacenar. Este producto se puede diluir de tal manera que comprenda 200 mm de NaCl en preparación para el próximo paso en el proceso de purificación. Este producto contiene VLPs y puede contener partículas intactas de baculovirus.

La purificación adicional de las VLPs se puede alcanzar mediante cromatografía de intercambio aniónico, o centrifugación isopíenica en lecho de sacarosa al 44%. En la cromatografía de intercambio aniónico, la muestra del gradiente de sacarosa (ver arriba) se carga en una columna que contiene un medio con un anión (por e . Matrix Fractogel EMD TMAE) y se eluye mediante un gradiente de sal (de aproximadamente 0.2 M a aproximadamente 1.0 M de NaCl) que puede separar la VLP de los otros contaminantes (por ej. baculovirus y ADN/ARN). En el método de lecho de sacarosa, la muestra que comprende las VLPs se agrega a un lecho de sacarosa al 44% y se centrifuga durante aproximadamente 18 horas a 30.000 g. Las VLPs forman una banda en el tope de la sacarosa al 44%, mientras que el baculovirus se precipita al fondo y las proteínas contaminantes permanecen en la capa de sacarosa al 0% en el tope. Se recolecta el pico o banda de VLP.

El baculovirus intacto puede ser inactivado, si se desea. La inactivación puede ser alcanzada mediante métodos químicos, por ejemplo, formalina o b-propiolactona (BPL). La extracción y/o la inactivación del baculovirus intacto se puede lograr en gran medida al usar métodos cromatográficos y de precipitación selectiva conocidos en el arte, tal como se ejemplificó con anterioridad. Los métodos de inactivación comprenden incubar la muestra que contiene las VLPs en 0.2% de BPL durante 3 horas a una temperatura entre aproximadamente 25 °C y aproximadamente 27 °C. El baculovirus también se puede inactivar al incubar la muestra que contiene las VLPs a 0.05% de BPL a 4 °C durante 3 días, luego a 37 °C durante una hora.

Después del paso de inactivación/extracción, el producto que comprende VLPs se puede someter a otro paso de diafiltración para extraer cualquier reactivo del paso de inactivación y/o cualquier sacarosa residual, y colocar las VLPs en el tampón deseado (por ej. PBS). La solución que comprende VLPs se puede esterilizar mediante métodos conocidos en el arte (por ej. filtración estéril) y almacenar en el refrigerador o congelador.

Las téenicas anteriores se pueden realizar a través de una variedad de escalas. Por ejemplo, desde matraces T, matraces de agitación, botellas de centrifugación hasta bioreactores de escala industrial. Los bioreactores pueden comprender un tanque de acero inoxidable o bien una bolsa de plástico pre-esterilizada (por ejemplo, el sistema vendido por Wave Biotech, Bridgewater, NJ). Una persona versada en el arte sabrá qué es más deseable para su propósito.

La expansión y la producción de los vectores de baculovirus de expresión y la infección de células con baculovirus recombinantes para producir VLPs de RSV recombinantes se pueden alcanzar en células de insecto, por ejemplo, células de insecto Sf9 como las descritas anteriormente. En una forma de realización, las células son células SF9 infectadas con baculovirus recombinante manipulado para producir VLPs de RSV.

Formulaciones farmacéuticas o de vacuna, y administración Las composiciones farmacéuticas útiles en la presente contienen un portador farmacéuticamente aceptable, incluyendo cualquier diluyente o excipiente adecuados, que incluye cualquier agente farmacéutico que no induce en sí mismo la producción de una respuesta inmunitaria perjudicial para el vertebrado que recibe la composición, y que se puede administrar sin toxicidad indebida, y una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención. Tal como se usa en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobado por el organismo reglamentario del gobierno estatal o federal, o que se encuentra en la lista de la farmacopea estadounidense, farmacopea europea u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en mamíferos, y más particularmente en humanos.

Estas composiciones pueden ser útiles como una vacuna y/o composición antigénica para inducir una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado.

La invención incluye una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende VLPs que comprenden al menos una proteína F del RSV modificada o mutada, y al menos una proteína adicional, incluyendo, de manera no taxativa M, G, N, SH de RSV, o sus porciones, y/o cualesquiera moléculas quiméricas o heterólogas descritas con anterioridad. En una forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que comprenden al menos una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos un inmunogen adicional. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que comprenden al menos una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos una proteína M del RSV. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que comprenden al menos una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos una proteína M del BRSV. F,n otra forma de realización, la composición vacuna de farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que comprenden al menos una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos una proteína MI del virus de la gripe. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que comprenden al menos una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos una proteína MI del virus de la gripe aviar.

En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que además comprenden una proteína G del RSV, incluyendo, de manera no taxativa, una proteína G del HRSV, BRSV o RSV aviar. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que además comprenden proteína N del RSV, incluyendo, de manera no taxativa, una proteína N del HRSV, BRSV o RSV aviar. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que además comprenden proteína SH del RSV, incluyendo, de manera no taxativa, una proteína SH del HRSV, BRSV o RSV aviar.

En otra forma de realización, la invención incluye una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende VLPs quiméricas tales como VLPs que comprenden una proteina M del BRSV y una proteína F del RSV modificada o mutada y/o proteína G, H, o SH de RSV y opcionalmente proteína HA o NA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína HA o NA proteína se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteina F y/o G del RSV.

La invención también incluye una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, tal como se describió con anterioridad.

En una forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos una proteína adicional. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que además comprenden proteína M del RSV, tales como, de manera no taxativa una proteína M del BRSV. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que además comprenden proteína G del RSV, incluyendo, de manera no taxativa, una proteína G del HRSV. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que además comprenden proteína N del RSV, incluyendo, de manera no taxativa, una proteína N del HRSV, BRSV o RSV aviar. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que además comprenden proteína SH del RSV incluyendo, de manera no taxativa, una proteína SH del HRSV, BRSV o RSV aviar. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que comprenden proteína M del BRSV y proteína F y/o G del grupo A del HRSV. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que comprenden proteína M del BRSV y proteína F y/o G del grupo B del HRSV. En otra forma de realización, la invención incluye una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende VLPs quiméricas tales como VLPs que comprenden proteína M quimérica de un BRSV y opcionalmente proteína HA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína M se fusiona a la proteína HA del virus de la gripe. En otra forma de realización, la invención incluye una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende VLPs quiméricas tales como VLPs que comprende proteína M de BRSV, y una proteína quimérica F y/o G de un RSV y opcionalmente una proteína HA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína HA quimérica del virus de la gripe se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína F y/o G del RSV. En otra forma de realización, la invención incluye una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende VLPs quiméricas tales como VLPs que comprenden una proteína M del BRSV y una proteína F y/o G quimérica de un RSV y opcionalmente una proteina HA o NA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína HA o NA se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteina F y/o G del RSV.

La invención también incluye una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende una VLP quimérica que comprende al menos una proteína del RSV. En una forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable incluye VLPs que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos un inmunogen de un agente infeccioso heterólogo o célula enferma. En otra forma de realización, el inmunogen de un agente infeccioso heterólogo es una proteína viral. En otra forma de realización, la proteína viral de un agente infeccioso heterólogo es una proteína asociada a envoltura. En otra forma de realización, la proteína viral de un agente infeccioso heterólogo es expresada sobre la superficie de las VLPs. En otra forma de realización, la proteína de un agente infeccioso comprende un epítopo que genera una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado.

La invención también incluye un kit para inmunizar un vertebrado, tal como un humano, que comprende VLPs que comprenden al menos una proteina del RSV. En una forma de realización el kit incluye VLPs que comprenden una proteina F del RSV modificada o mutada. En una forma de realización, el kit además comprende una proteína M del RSV tal como una proteína M del BRSV. En otra forma de realización, el kit además comprende una proteína G del RSV. En otra forma de realización, la invención incluye un kit que comprende VLPs que comprenden una proteína M quimérica de un BRSV y opcionalmente una proteína HA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína M se fusiona a la proteína M del BRSV. En otra forma de realización, la invención incluye un kit que comprende VLPs que comprenden una proteína M quimérica de un BRSV, una proteína F y/o G del RSV y un inmunogen de un agente infeccioso heterólogo. En otra forma de realización, la invención incluye un kit que comprende VLPs que comprenden una proteína M de un BRSV, una proteína F y/o G quimérica del RSV y opcionalmente una proteína HA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína HA se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína F o G del RSV. En otra forma de realización, la invención incluye un kit que comprende VLPs que comprenden proteína M de un BRSV, una proteína F y/o G quimérica del RSV y opcionalmente una proteína HA o NA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína HA se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína F y/o G del RSV.

En una forma de realización, la invención incluye una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis efectiva de una proteina F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, la invención incluye una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis efectiva de una micela F del RSV que comprende una proteina F del RSV modificada o mutada. En incluso otra forma de realización, la invención incluye una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis efectiva de una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, tal como se describió con anterioridad.

La formulación inmunogénica de la invención incluye una proteina F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, de manera no taxativa: solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, tampón acuoso de solución isotónica estéril, y combinaciones de los mismos. Un análisis exhaustivo de los portadores, diluyentes u otros excipientes farmacéuticamente aceptables se presenta en Remington ' s Pharmaceuti cal Sciences (Mack Pub. Co. N.J. edición actual). La formulación deberla ajustarse al modo de administración. En una forma de realización preferida, la formulación es adecuada para administración a humanos; preferentemente, es estéril, no particulada y/o no pirogénica.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH. La composición puede estar en forma sólida, tales como un polvo liofilizado adecuado para reconstitución, una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida, o polvo. La formulación oral puede incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

La invención también provee un conjunto o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las formulaciones de vacuna de la invención. En una forma de realización preferida, el kit comprende dos recipientes, uno que contiene una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteina F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, y el otro que contiene un adyuvante. Asociado con dicho(s) recipiente (s) se puede encontrar un aviso en la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, en donde dicho aviso refleja la aprobación por parte del organismo de la fabricación, el uso o la venta para administración a humanos.

La invención también contempla que la formulación esté envasada en un recipiente herméticamente sellado, tal como una ampolla o sachet que indica la cantidad de composición. En una forma de realización, la composición es suministrada como un líquido; en otra forma de realización, como un polvo liofilizado esterilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado, y puede ser reconstituido, por ej., con agua o solución salina a la concentración apropiada para la administración a un sujeto.

En una forma de realización alternativa, la composición es suministrada en forma líquida en un recipiente herméticamente sellado que indica la cantidad y concentración de la composición. Preferentemente, la forma líquida de la composición es suministrada en un recipiente herméticamente sellado en al menos aproximadamente 50 qg/ml, más preferentemente al menos aproximadamente 100 mg/ml, al menos aproximadamente 200 pg/ml, al menos 500 pg/ml, o al menos 1 mg/mi.

Como ejemplo, las VLPs quiméricas del RSV que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada de la invención se administran en un monto o cantidad efectiva (tal como se definió con anterioridad) suficiente para estimular una respuesta inmunitaria, cada respuesta contra una o más cepas de RSV. La administración de la proteína F del RSV modificada o mutada, una icela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o VLP de la invención produce inmunidad contra RSV. Típicamente, la dosis se puede ajustar dentro de este rango sobre la base de, por ej., la edad, la condición física, el peso corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, y otros factores clínicos. La formulación de vacuna profiláctica se administra sistémícamente, por ej., mediante inyección subcutánea o intramuscular usando una aguja y una jeringa, o un dispositivo de inyección sin aguja. En forma alternativa, la formulación de vacuna se administra por vía intranasal, ya sea mediante gotas, aerosol en partículas grandes (superiores a aproximadamente 10 micrones), o spray en el tracto respiratorio superior. Si bien cualesquiera de las vías de suministro anteriores genera una respuesta inmunitaria, la administración intranasal confiere el valor agregado de producir inmunidad de la mucosa en el sitio de entrada de muchos virus, incluyendo el RSV y virus de la gripe.

Por ende, la invención también comprende un método para formular una vacuna o composición antigénica que induce inmunidad a una infección o al menos un síntoma de enfermedad de la misma a un mamífero, que comprende agregar a la formulación una dosis efectiva de una proteina F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En una forma de realización, la infección es una infección por RSV.

Si bien la estimulación de la inmunidad con una dosis única es posible, se pueden administrar dosis adicionales, por medio de la misma vía, o una vía diferente, para alcanzar el efecto deseado. En los neonatos e infantes, por ejemplo, se pueden requerir administraciones múltiples para alcanzar niveles suficientes de inmunidad. La administración puede continuar a intervalos durante toda la niñez, según sea necesario para mantener niveles suficientes de protección contra infecciones, por e . infección por RSV. En forma similar, los adultos que son particularmente susceptibles a infecciones repetidas o serias, tales como, por ejemplo, los trabajadores al servicio de la salud, los trabajadores en guarderías, los miembros de familia de niños pequeños, los ancianos, y los individuos con función cardiopulmonar comprometida pueden requerir inmunizaciones múltiples a fin de establecer y/o mantener las respuestas inmunitarias protectoras. Los niveles de inmunidad inducida se pueden monitorear, por ejemplo, al medir las cantidades de anticuerpos neutralizantes secretores y séricos, y las dosis se pueden ajustar o las vacunaciones se pueden repetir tanto como sea necesario para alcanzar y mantener los niveles deseados de protección.

Los métodos para administrar una composición que comprende una proteina F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada (por ej. vacunas y/o formulaciones antigénicas) incluyen, de manera no taxativa, administración parenteral (por ej ., intradérmica, intramuscular, intravenosa y subcutánea), epidural, y en mucosa (por ej., por vía intranasal y oral o pulmonar o mediante supositorios). En una forma de realización específica, las composiciones de la presente invención se administran por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea, transdérmica o intradérmica. Las composiciones se pueden administrar mediante cualquier vía conveniente; por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de los recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ej ., mucosa oral, colon, conjuntiva, nasofaringe, orofaringe, vagina, uretra, vejiga urinaria y mucosa intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. En algunas formas de realización, las vías de administración intranasales u otras vías de administración en mucosa de una composición de la invención pueden inducir un anticuerpo u otra respuesta inmunitaria que es sustancialmente superior a la de otras vías administración. En otra forma de realización, las vías de administración intranasales u otras vías de administración de una composición de la invención pueden inducir un anticuerpo u otra respuesta inmunitaria que induce protección cruzada contra otras cepas del RSV. La administración puede ser sistémica o local.

En incluso otra forma de realización, la vacuna y/o formulación inmunogénica se administra de manera tal esté dirigida a los tejidos de las mucosas a fin de producir una respuesta inmunitaria en el sitio de inmunización. Por ejemplo, los tejidos de las mucosas tales como el tejido linfoide asociado al intestino (GALT, del inglés Gut Associated Lymphoid Tissue) puede ser tomado como blanco para inmunización al usar la administración oral de composiciones que contienen adyuvantes con propiedades dirigidas a mucosas particulares. Los tejidos de las mucosos adicionales también pueden tomarse como blanco, tales como tejido linfoide nasofaríngeo (NALT, del inglés Nasopharyngeal Lymphoid Tissue) y tejido linfoide asociado a los bronquios (BALT, del inglés Bronchial -Associated Lymphoid Tissue) .

Las vacunas y/o formulaciones inmunogénicas de la invención también se pueden administrar de acuerdo con un programa de dosificación, por ejemplo, una administración inicial de la composición de vacuna con posteriores administraciones de refuerzo. En las formas de realización particulares, se administra una segunda dosis de la composición en cualquier momento que abarca desde las dos semanas hasta un año, preferentemente desde aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 6 meses, después de la administración inicial. Asimismo, se puede administrar una tercera dosis después de la segunda dosis y desde aproximadamente tres meses hasta aproximadamente dos años, o incluso más tarde, preferentemente desde aproximadamente 4, aproximadamente 5, o aproximadamente 6 meses, o aproximadamente 7 meses hasta aproximadamente un año después de la administración inicial. La tercera dosis se puede administrar opcionalmente cuando se detectan niveles bajos o nulos de inmunoglobulinas especificas en suero y/u orina o de las mucosas del sujeto después de la segunda dosis. En una forma de realización preferente, se administra una segunda dosis aproximadamente un mes después de la primera administración, y se administra una tercera dosis aproximadamente seis meses después de la primera administración. En otra forma de realización, la segunda dosis se administra aproximadamente seis meses después de la primera administración. En otra forma de realización, las composiciones de la invención se pueden administrar como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, las composiciones de la invención se pueden formular con otras composiciones inmunogénicas, antivirales y/o antibióticas.

La dosis de la composición farmacéutica puede ser determinada fácilmente por la persona versada en el arte, por ejemplo, al identificar en primer lugar las dosis efectivas para producir una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica, por ej., al medir el titulo sérico de las inmunoglobulinas virus-especificas o al medir la relación inhibitoria de los anticuerpos en muestras séricas, o muestras urinarias, o secreciones de mucosas. Las dosis pueden ser determinadas a partir de estudios en animales. Una lista no limitativa de los animales usados para estudiar la eficacia de las vacunas incluyen cobayos, hámsteres, hurones, chinchillas, ratones y ratas del algodón. La mayoría de los animales no son huéspedes naturales para los agentes infecciosos pero aún así pueden servir en los estudios de varios aspectos de la enfermedad. Por ejemplo, cualesquiera de los animales anteriores pueden recibir una vacuna candidato, por ej. proteínas F del RSV modificadas o mutadas, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o VLPs de la invención, para caracterizar parcialmente la respuesta inmunitaria inducida y/o para determinar si se han producido anticuerpos neutralizantes. Por ejemplo, se han llevado a cabo muchos estudios en el modelo de ratón porque los ratones tienen tamaño pequeño y representan costos bajos que permiten a los investigadores realizar estudios a mayor escala.

Asimismo, se pueden realizar estudios clínicos en humanos para determinar la dosis efectiva preferida para los humanos por parte de la persona versada en el arte. Dichos estudios clínicos son estudios de rutina ampliamente conocidos en el arte. La dosis precisa a ser empleada también dependerá de la vía de administración. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de las curvas dosis-respuesta derivadas de los sistemas de evaluación en animales o ín vi tro .

Como también es ampliamente conocido en el arte, la inmunogenicidad de una composición particular puede ser afianzada por el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmunitaria, conocidos como "adyuvantes". Los adyuvantes han sido usados en forma experimental para promover un incremento generalizado en la inmunidad contra antigenos desconocidos (por ej., la patente estadounidense No. 4.877.611). Los protocolos de inmunización han usado adyuvantes para estimular respuestas durante muchos años, y como tales, los adyuvantes son ampliamente conocidos para la persona medianamente versada en el arte. Algunos adyuvantes afectan la manera en la cual se presentan los antigenos. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria se incrementa cuando los antígenos proteicos son precipitados por alum. El emulsionamiento de antígenos también prolonga la duración de la presentación de los antígenos. La inclusión de cualquier adyuvante descrita en Vogel y colaboradores, A Compendi um of Vaccine Adjuvants and Excipíents (2da Edición), que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos, está contemplada dentro del alcance de esta invención.

Los adyuvantes de ejemplo incluyen adyuvante de Freund completo (un estimulador no específico de la respuesta inmunitaria que contiene Mycobacteri um tuberculosi s muertos), adyuvante de Freund incompleto y adyuvante de hidróxido de aluminio. Otros adyuvantes comprenden GMCSP, BCG, hidróxido de aluminio, compuestos MDP, tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP (MTP-PE), lípido A, y monofosforil lípido A (MPL, del inglés Monophosphoryl Lipid A) . RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, MPL, dimicolato de trehalosa (TDM, del inglés Trehalose Dimycolate) y esqueleto de pared celular (CWS, del inglés Cell Wall Skeleton) en una emulsión al 2% de escualeno/Tween 80 también están contemplados. También se pueden usar MF-59, Novasomes® y antígenos MHC.

En una forma de realización de la invención, el adyuvante es una vesícula lipídica paucilamelar que tiene aproximadamente dos a diez bicapas dispuestas en forma de cubiertas sustancialmente esféricas separadas por capas acuosas que rodean una cavidad central amorfa grande libre de bicapas lipídicas. Las vesículas lipídicas paucilamelares pueden actuar para estimular la respuesta inmunitaria de varias maneras, como estimuladores no específicos, como portadores para el antígeno, como portadores de adyuvantes adicionales, y combinaciones de los mismos. Las vesículas lipídicas paucilamelares actúan como inmunoestimuladores no específicos cuando, por ejemplo, se prepara una vacuna al entremezclar el antígeno con las vesículas preformadas de manera que el antígeno permanezca extracelular a las vesículas. Al encapsular un antígeno dentro de la cavidad central de la vesícula, la vesícula actúa tanto como un inmunoestimulador cuanto como un portador para el antígeno.

En otra forma de realización, las vesículas están conformadas principalmente de vesículas no fosfolipídicas. En otra forma de realización, las vesículas son Novasomes®. Las Novasomes® son vesículas no fosfolipídicas paucilamelares que oscilan entre aproximadamente 100 n y aproximadamente 500 nm. Comprenden Brij 72, colesterol, ácido oleico y escualeno. Se ha demostrado que las vesículas Novasomes® son un adyuvante efectivo para los antígenos de la gripe (véase las patentes estadounidenses No. 5.629.021, 6.387.373 y 4.911.928, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos).

Las composiciones de la invención también se pueden formular con "inmunoestimuladores". Estos son los mensajeros químicos propios del cuerpo (citoquinas) para incrementar la respuesta del sistema inmunitario. Los inmunoestimuladores incluyen, de manera no taxativa, varias citoquinas, linfoquinas y quimioquinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, tales como interleuquinas (por ej., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento (por e ., factor estimulante de colonias (CSF, del inglés Colony Stimulating Factor) de granulocitos y macrófagos (GM)); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras se pueden administrar en la misma formulación que las composiciones de la invención, o se pueden administrar por separado. La proteina, o bien un vector de expresión que codifica la proteína, se puede administrar para producir un efecto inmunoestimulador. Por ende, en una forma de realización, la invención comprende formulaciones antigénicas y vacunas que comprenden un adyuvante y/o un inmunoestimulador.

Métodos para estimular una respuesta inmunitaria Las proteínas F del RSV modificadas o mutadas, las micelas F del RSV que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada, o las VLPs de la invención son útiles para preparar composiciones que estimulan una respuesta inmunitaria que confiere inmunidad o inmunidad sustancial a agentes infecciosos. Tanto la inmunidad de las mucosas como la inmunidad celular pueden contribuir a la inmunidad a agentes infecciosos y a la enfermedad. Los anticuerpos segregados localmente en el tracto respiratorio superior son un factor principal en la resistencia a la infección natural. La inmunoglobulina A secretora (slgA, del inglés Secretory Immunoglobulin A) está implicada en la protección del tracto respiratorio superior y la IgG sérica en la protección del tracto respiratorio inferior. La respuesta inmunitaria inducida por una infección protege contra la re-infección con el mismo virus o una cepa viral antigénicamente similar. Por ejemplo, el RSV sufre cambios frecuentes e impredecibles; por ende, después de una infección natural, el período efectivo de protección provisto por la inmunidad del huésped puede solamente ser efectivo durante pocos años contra las nuevas cepas de los virus que circulan en la comunidad.

Por ende, la invención comprende un método para inducir inmunidad a infecciones o al menos un síntoma de enfermedad de las mismas en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En una forma de realización, el método comprende administrar VLPs que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos una proteína adicional. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que además comprenden una proteína M del RSV, por ejemplo, una proteína M del BRSV. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que además comprenden una proteína N del RSV. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que además comprenden una proteína G del RSV. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que además comprenden una proteína SH del RSV. En otra forma de realización el método comprende administrar VLPs que además comprenden una proteína F y/o G del grupo A y/o grupo B del HRSV. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que comprenden una proteína M de BRSV y una proteína quimérica F y/o G del RSV o proteína de envoltura del MMTV, por ejemplo, proteína HA o NA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína HA y/o NA se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína F y/o G del RSV o proteína de envoltura del MMTV. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que comprenden una proteína M del BRSV y una proteína quimérica F y/o G del RSV y opcionalmente una proteína HA o NA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína HA o NA se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína F y/o G del RSV. En otra forma de realización, el sujeto es un mamífero. En otra forma de realización, el mamífero es un humano. En otra forma de realización, las VLPs del RSV son formuladas con un adyuvante o inmunoestimulador.

En una forma de realización, la invención comprende un método para inducir inmunidad a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, la invención comprende un método para inducir inmunidad a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En incluso otra forma de realización, la invención comprende un método para inducir inmunidad a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de VLPs del RSV, en donde las VLPs comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada, proteínas M, G, SH, y/o N. En otra forma de realización, un método para inducir inmunidad a infección por RSV o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, comprende administrar al menos una dosis efectiva de VLPs del RSV, en donde la VLPs consiste esencialmente en proteína M del BRSV (incluyendo proteína M quimérica), y proteínas F, G, y/o N del RSV. Las VLPs pueden comprender proteínas adicionales y/o contaminantes proteicos del RSV en concentraciones insignificantes. En otra forma de realización, un método para inducir inmunidad a infección por RSV o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, comprende administrar al menos una dosis efectiva de VLPs del RSV, en donde las VLPs consisten en proteína M del BRSV (incluyendo proteína M quimérica), y proteínas G y/o F del RSV. En otra forma de realización, un método para inducir inmunidad a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, comprende administrar al menos una dosis efectiva de VLPs del RSV que comprende proteínas del RSV, en donde las proteínas del RSV consisten en proteína M del BRSV (incluyendo proteína M quimérica), y proteínas F, G, y/o N, incluyendo proteínas F, G, y/o N quiméricas. Estas VLPs contienen proteína M del BRSV (incluyendo proteína M quimérica), y proteínas F, G, y/o N del RSV y pueden contener constituyentes celulares adicionales tales como proteínas celulares, proteínas baculovirus, lípidos, carbohidratos, etc., pero no contienen proteínas adicionales del RSV (diferentes de los fragmentos de proteína M del BRSV (incluyendo proteína M quimérica), y proteínas F, G, y/o N del BRSV/RSV. En otra forma de realización, el sujeto es un vertebrado. En una forma de realización el vertebrado es un mamífero. En otra forma de realización, el mamífero es un humano. En otra forma de realización, el método comprende inducir inmunidad a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad al administrar la formulación en una dosis. En otra forma de realización, el método comprende inducir inmunidad a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad al administrar la formulación en múltiples dosis.

La composición se puede administrar en un rango de dosis de proteínas adecuado. En algunos aspectos, el rango de dosis de proteínas tiene un límite superior de aproximadamente 100 mg, aproximadamente 80 pg, aproximadamente 60 pg, aproximadamente 30 pg, aproximadamente 15 pg, aproximadamente 10 pg, o aproximadamente 5 pg. En otros aspectos, el rango de dosis tiene un límite inferior de aproximadamente 30 pg, aproximadamente 15 pg, aproximadamente 5 pg, o aproximadamente 1 mg. Por ende, los rangos adecuados incluyen, por ejemplo de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 100 pg, de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 80 pg, de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 60 pg, de aproximadamente 15 pg a aproximadamente 60 pg, de aproximadamente 30 pg a aproximadamente 60 pg, y de aproximadamente 15 pg a aproximadamente 30 pg de proteína.

Tal como se usa en toda esta descripción, el término "aproximadamente" significa + 10% del valor indicado.

La invención también comprende inducir inmunidad a una infección, o al menos un síntoma de la misma, en un sujeto, causada por un agente infeccioso, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En una forma de realización, el método comprende administrar VLPs que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada y al menos una proteina de un agente infeccioso heterólogo. En una forma de realización, el método comprende administrar VLPs que comprenden una proteina F del RSV modificada o mutada y al menos una proteina del mismo agente infeccioso o un agente infeccioso heterólogo. En otra forma de realización, la proteina del agente infeccioso heterólogo es una proteina viral. En otra forma de realización, la proteina del agente infeccioso es una proteina asociada a envoltura. En otra forma de realización, la proteina del agente infeccioso es expresada sobre la superficie de las VLPs. En otra forma de realización, la proteina del agente infeccioso comprende un epitopo que genera una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado. En otra forma de realización, la proteina del agente infeccioso puede asociarse con proteina M del RSV tal como proteina M del BRSV, proteina F, G y/o N del RSV. En otra forma de realización, la proteina del agente infeccioso se fusiona a una proteina del RSV tal como una proteina M del BRSV, proteina F, G y/o N del RSV. En otra forma de realización, solamente una porción de una proteina del agente infeccioso se fusiona a una proteina del RSV tal como una proteína M del BRSV, proteina F, G y/o N del RSV. En otra forma de realización, solamente una porción de una proteina del agente infeccioso se fusiona a una porción de una proteina del RSV tal como una proteina M del BRSV, proteina F, G y/o N del RSV. En otra forma de realización, la porción de la proteina del agente infeccioso fusionada a la proteina del RSV es expresada sobre la superficie de las VLPs. En otra forma de realización, la proteina del RSV, o porción de la misma, fusionada a la proteina del agente infeccioso se asocia con la proteina M del RSV. En otra forma de realización, la proteina del RSV, o porción de la misma, deriva de la proteína F, G, N y/o P del RSV. En otra forma de realización, las VLPs quiméricas además comprenden proteína N y/o P del RSV. En otra forma de realización, las VLPs quiméricas comprenden más de una proteína del mismo agente infeccioso y/o un agente infeccioso heterólogo. En otra forma de realización, las VLPs quiméricas comprenden más de una proteína de agente infeccioso, por ende crean una VLP multivalente .

Las composiciones de la invención pueden inducir inmunidad sustancial en un vertebrado (por ej. un humano) cuando se administran al vertebrado. La inmunidad sustancial se genera por una respuesta inmunitaria contra las composiciones de la invención que protege o mejora la infección o al menos reduce un síntoma de infección en el vertebrado. En algunos casos, si el vertebrado es infectado, la infección será asintomática. La respuesta puede no ser una respuesta completamente protectora. En este caso si el vertebrado es infectado con un agente infeccioso, el vertebrado experimentará síntomas reducidos o una duración más corta de los síntomas en comparación con un vertebrado no inmunizado.

En una forma de realización, la invención comprende un método para inducir inmunidad sustancial a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, la invención comprende un método para vacunar un mamífero contra RSV que comprende administrar al mamífero una cantidad que induce protección de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En una forma de realización, el método comprende administrar VLPs que además comprenden una proteína M del RSV, tal como proteína M del BRSV. En otra forma de realización, el método además comprende administrar VLPs que comprenden proteína G del RSV, por ejemplo una proteína G del HRSV. En otra forma de realización, el método además comprende administrar VLPs que comprenden la proteína N del grupo A de HRSV. En otra forma de realización, el método además comprende administrar VLPs que comprenden la proteína N del grupo B de HRSV. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que comprenden proteína M quimérica del BRSV y proteína F y/o G derivada del RSV en donde la proteína F y/o G se fusiona a la transmembrana y cola citoplasmática de la proteína M. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que comprenden proteína M del BRSV y proteína quimérica F y/o G del RSV en donde la proteína F y/o G se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína HA y/o NA del virus de _la gripe. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que comprenden proteína M del BRSV y proteína quimérica F y/o G del RSV y opcionalmente una proteína HA y/o NA del virus de la gripe en donde la proteína F y/o G se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína HA. En otra forma de realización, el método comprende administrar VLPs que comprenden proteína M del BRSV y proteína quimérica F y/o G del RSV, y opcionalmente una proteína HA y/o NA del virus de la gripe, en donde la proteína HA y/o NA se fusiona al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína F y/o G del RSV.

La invención también comprende un método para inducir inmunidad sustancial a una infección, o al menos un sintoma de enfermedad en un sujeto causada por un agente infeccioso, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En una forma de realización, el método comprende administrar VLPs que además comprenden una proteína M del RSV, tal como proteína M del BRSV, y al menos una proteína de otro agente infeccioso. En una forma de realización, el método comprende administrar VLPs que además comprenden una proteína M del BRSV y al menos una proteína del mismo agente infeccioso o un agente infeccioso heterólogo. En otra forma de realización, la proteína del agente infeccioso es una proteína viral. En otra forma de realización, la proteína del agente infeccioso es una proteína asociada a envoltura. En otra forma de realización, la proteína del agente infeccioso es expresada sobre la superficie de las VLPs. En otra forma de realización, la proteína del agente infeccioso comprende un epítopo que generará una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado. En otra forma de realización, la proteína del agente infeccioso se puede asociar con la proteína M del RSV. En otra forma de realización, la proteína del agente infeccioso se puede asociar con la proteína M del BRSV. En otra forma de realización, la proteína del agente infeccioso se fusiona a una proteína del RSV. En otra forma de realización, solamente una porción de una proteína del agente infeccioso se fusiona a una proteína del RSV. En otra forma de realización, solamente una porción de una proteína del agente infeccioso se fusiona a una porción de una proteína del RSV. En otra forma de realización, la porción de la proteína del agente infeccioso fusionada a la proteína del RSV es expresada sobre la superficie de las VLPs. En otra forma de realización, la proteína del RSV, o porción de la misma, fusionada a la proteína del agente infeccioso se asocia con la proteína M del RSV. En otra forma de realización, la proteína del RSV, o porción de la misma, fusionada a la proteína del agente infeccioso se asocia con la proteína M del BRSV. En otra forma de realización, la proteína del RSV, o porción de la misma, deriva de la proteína F, G, N y/o P del RSV. En otra forma de realización, las VLPs además comprenden proteína N y/o P del RSV. En otra forma de realización, las VLPs comprenden más de una proteína del agente infeccioso. En otra forma de realización, las VLPs comprenden más de una proteína de agente infeccioso, por ende crean una VLP multivalente.

En otra forma de realización, la invención comprende un metodo para inducir una respuesta de anticuerpos de protección a una infección o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, tal como se describió con anterioridad.

Tal como se usa en la presente, un "anticuerpo" es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancial o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, así como también los genes de región variable de inmunoglobulina miríada. Las cadenas livianas se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par con una cadena "liviana" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El término N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antigeno. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas.

En una forma de realización, la invención comprende un método para inducir una respuesta celular de protección a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra forma de realización, la invención comprende un método para inducir una respuesta celular de protección a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En incluso otra forma de realización, la invención comprende un método para inducir una respuesta celular de protección a infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una VLP, en donde la VLP comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, tal como se describió con anterioridad. La inmunidad mediada por células también juega un papel fundamental en la recuperación de la infección por RSV y puede prevenir las complicaciones asociadas con el RSV. Se han detectado linfocitos celulares específicos para RSV en la sangre y las secreciones del tracto respiratorio inferior de los sujetos infectados. La histolisis de las células infectadas por RSV es mediada por CTLs junto con anticuerpos específicos para RSV y complementos. La respuesta citotóxica primaria es detectable en la sangre después de 6-14 días y desaparece hacia el día 21 en los individuos infectados o vacunados (Ennis y colaboradores, 1981). La inmunidad mediada por células también juega un papel fundamental en la recuperación de la infección por RSV y puede prevenir las complicaciones asociadas con el RSV. Se han detectado linfocitos celulares específicos para RSV en la sangre y las secreciones del tracto respiratorio inferior de los sujetos infectados.

Tal como se mencionó con anterioridad, las composiciones inmunogénicas de la invención previenen o reducen al menos un síntoma de infección por RSV en un sujeto. Los síntomas del RSV son ampliamente conocidos en el arte. Estos incluyen rinorrea, dolor de garganta, dolor de cabeza, ronquera, tos, esputo, fiebre, estertores, sibilancia y disnea. Por ende, el método de la invención comprende la prevención o reducción de al menos un síntoma asociado con infección por RSV. Una reducción en un síntoma se puede determinar en forma subjetiva o en forma objetiva, por ej. autoevaluación por parte un sujeto, mediante evaluación del médico o al realizar un examen o una medición apropiados (por ej. temperatura corporal), que incluyen, por e ., evaluación de la calidad de vida, progreso ralentizado de una infección por RSV o síntomas adicionales, severidad reducida de los síntomas del RSV o ensayos adecuados (por ej. ensayo de activación de célula T y/o título de anticuerpo). La evaluación objetiva comprende evaluaciones tanto en animales como en humanos.

Esta invención además se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que no deberían considerarse limitativos. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes publicadas citadas a lo largo de esta solicitud, así como también las figuras y el listado de secuencias, se incorporan en la presente por referencia para todos los propósitos.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Generación de bácmidos recombinantes, transfección de células de insecto para formar reservas de virus recombinantes, purificación de placas e infección de células de insecto con reserva de virus primaria.

Para construir virus recombinantes, los genes virales de interés se optimizaron con codones para la expresión de células de insecto Sf9 y se clonaron en vectores pFastBac™.

Una vez que las construcciones deseadas fueron identificadas y purificadas, se congeló en hielo un vial de células competentes MAX Efficiency® DHlOBac™ para cada construcción. Se agregó aproximadamente 1 ng (5 ml) del ADN plasmidico de construcción pFastBac™ deseado a las células y se mezcló suavemente. Las células se incubaron en hielo durante 30 minutos. A esto le siguió el choque de calor de las células durante 45 segundos a 42 °C sin agitación. Posteriormente, los tubos fueron transferidos al hielo y enfriados durante 2 minutos. Posteriormente se agregaron 900 ml de medio S.O.C. a temperatura ambiente a cada tubo. Los tubos se colocaron en un agitador a 37 °C a 225 rpm durante 4 horas. Para cada transformación de pFastBac™, se prepararon diluciones seriales a diez veces de las células (10-1, 10-2 y 10-3) usando medio S.O.C. Con posterioridad, se colocaron 100 m? de cada dilución en una placa de medio LB agar que contenia 50 mg/ml de kanamicina, 7 pg/ml de gentamicina, 10 pg/ml de tetracielina, 100 pg/ml de Bluo-gal, y 40 pg/ml de IPTG. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 °C. Se recogieron las colonias blancas para análisis.

Se formaron diferentes ADNs bacmidicos a partir de lo descrito con anterioridad para cada construcción y se aislaron . Estos ADNs se precipitaron y agregaron a las células Sf9 durante 5 horas.

Con posterioridad, se infectaron 30 mi de células de insecto Sf9 (2 x 106 células/ml) con baculovirus que expresaban proteínas de interés virales con 0.3 mi de eluato de placa y se incubaron durante 48-72 horas. Aproximadamente 1 mi de cultivo en bruto (células + medio) y cosechas del cultivo clarificado se guardaron para el análisis de expresión y el resto se guardó a los efectos de la purificación.

Ejemplo 2 Expresión, purificación y análisis de proteínas F del HRSV modificadas Los genes que codifican las proteínas F del HRSV modificadas de interés fueron sintetizados in vi tro como oligonucleótidos superpuestos, clonados y expresados en células huésped. La clonación y expresión de los genes F del RSV modificados se alcanzaron siguiendo los métodos conocidos en el arte.

Se recogieron y confirmaron las placas recombinantes que contenían proteínas virales de interés. El virus recombinante luego se amplificó mediante infección de células de insecto Sf9. En algunos casos, las células de insecto Sf9 fueron co infectadas mediante un virus recombinante que expresaba la proteína F modificada y otro virus recombinante que expresaba otras proteínas virales (por ej., proteína M del BRSV y/o proteína N del HRSV). Un cultivo de células de insecto fue infectado a ~3 MOI (multiplicidad de infección, del inglés Mul tiplici ty of Infection = ffu virus o pfu/célula) con baculovirus que portaba varias construcciones. El cultivo y el sobrenadante se cosecharon 48-72 horas post-infección. La cosecha en bruto, aproximadamente 30 mL, fue clarificada mediante centrifugación durante 15 minutos a aproximadamente 800 x g. Las cosechas de células en bruto resultantes que contenían proteína F del HRSV modificada se purificaron tal como se describió con anterioridad.

Las proteínas F del HRSV modificadas de interés se purificaron a partir de las cosechas de cultivo de células de insecto Sf9 infectadas. Se usó agente tensoactivo no iónico Tergitol® NP-9 (Nonilfenol Etoxilato) en un protocolo de extracción de proteína de membrana. La cosecha en bruto extraída se purificó adicionalmente al someterse a cromatografía de intercambio aniónico, afinidad a lectina de la lenteja/HIC, y cromatografía de intercambio catiónico.

La expresión de proteínas fue analizada por SDS-PAGE y teñida para el total de proteínas mediante tinte Coomassie. Se cargaron volúmenes iguales de muestras celulares a partir de la cosecha en bruto y tampón de muestra 2x que contenía bME (beta-mercaptoetanol), aproximadamente 15 a 20 ml (aproximadamente 7.5 a 10 ml del cultivo)/corrida, sobre un gel SDS Laemmli.

En algunos casos, en lugar de la cromatografía, se concentraron las proteínas F del HRSV modificadas en las cosechas celulares en bruto mediante el método de separación en gradiente de sacarosa al 30%, y luego se analizaron mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie, o análisis de transferencia Western usando anticuerpo monoclonal anti-F RSV.

La cosecha celular en bruto que contenía las proteínas F recombinantes modificadas, las proteínas F recombinantes purificadas, o las proteínas F recombinantes concentradas por gradiente de sacarosa pueden analizarse, además, mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpo monoclonal anti-F RSV y/o anticuerpo policlonal anti-F RSV.

Ejemplo 3 Gen F del HRSV modificado que codifica la proteina F BV # 541 Los intentos iniciales por expresar la proteína F del HRSV de longitud completa no lograron alcanzar niveles altos de expresión. La secuencia génica F usada en la expresión fue la SEC ID NO: 1 (gen F del HRSV de tipo salvaje, No. de acceso Genbank M11486). Codifica un precursor inactivo (F0) de 574 aa. Este precursor es escindido dos veces por proteasas de tipo furina durante la maduración para obtener dos polipéptidos con enlace disulfuro, subunidad F2 del término N y F1 del término C (Figura 1). Los dos sitios de escisión se encuentran en los residuos 109 y 136, que están precedidos por motivos de reconocimiento de furina (RARR, aa 106-109 (SEC ID NO: 23) y KKRKRR, aa 131-136 (SEC ID NO: 24)). La secuencia génica F de SEC ID NO: 1 contiene uso de codones subóptimo para expresión en células de insecto Sf9 y aloja 3 errores, produciendo una proteína que puede exhibir plegamiento menos que óptimo (SEC ID NO: 2, No. de acceso Genbank AAB59858). Asimismo, se identificó un posible sitio de poli (A) adenilación (ATAAAA) en la región que codifica la subunidad F2. Además, la secuencia génica F de tipo salvaje es aproximadamente 65% rica en AT, mientras que la relación GC-AT deseada de una secuencia génica en el sistema de expresión de células de insecto Sf9 es de aproximadamente 1:1.

Con el objeto de superar los niveles deficientes de expresión de proteína F del HRSV, se diseñó una nueva secuencia génica F para que: (a) los tres errores de secuenciamiento de GenBank se corrigieran; (b) el sitio poli (A) críptico en la región que codifica la subunidad F2 se modificara; (c) los codones génicos F se optimizaran; y (d) el gen F codificara una proteína F modificada con sitio de escisión primario inactivado.

Los tres errores de aminoácidos corregidos fueron P102A, I379V y M447V. El sitio poli (A) críptico en el gen F del HRSV fue corregido sin cambiar la secuencia de aminoácidos.

El esquema de optimización de codones se basó en los siguientes criterios: (1) abundancia de aminoacil-tARNs para un codón particular en especie de lepidópteros de células de insecto para un determinado aminoácido tal como lo describe Levin, D.B. y colaboradores ( 10urnal of General Virology, 2000, vol.81, pp. 2313-2325), (2) mantenimiento de relación GC-AT en secuencias génicas a aproximadamente 1:1, (3) mínima introducción de estructuras de ADN de tallo-lazo o palindrómicas, y (4) mínima introducción de secuencias de elementos represivos de trascripción y post-trascripción. Un ejemplo de secuencia génica F optimizada se ilustró como la SEC ID NO: 19 (RSV-F BV #368).

Para inactivar el sitio de escisión primario (Io CS, KKRKRR, aa 131-136) de proteína F del HRSV, el sitio de reconocimiento de furina fue mutado ya sea a KKQKQQ (SEC ID NO: 28) o GRRQQR (SEC ID NO: 29). Varias proteínas F modificadas con dichas mutaciones en sitio de escisión fueron evaluadas para determinar la eficiencia para evitar la escisión. La Figura 2 muestra varias de las proteínas F modificadas que fueron evaluadas. Los resultados indican que el sitio de escisión primario de la proteina F del HRSV puede ser inactivado mediante tres cambios de aminoácidos conservativos R133Q, R135Q y R136Q. Estos cambios de aminoácidos conservativos de Arginina (R) que es una molécula de carga polar, a Glutamina (Q) que es una molécula de carga neutra, alteraron el estado de carga en estos sitios y evitaron la escisión mediante proteasas del tipo furina (ver la Figura 3), al tiempo que conservaron la estructura 3D de la proteína F. Evitar la escisión a Io CS generó la disminución de la actividad de fusión de membrana de la proteína F.

Una secuencia génica F del HRSV modificada de ejemplo, no limitativa, diseñada de manera tal que contenga todas las modificaciones mencionadas con anterioridad, se ilustra en la Figura 4. Este gen F modificado (SEC ID NO: 5, RSV-F BV #541) codifica una proteina F modificada de SEC ID NO: 6. La secuencia génica se sintetizó ín ví tro como oligonucleótidos superpuestos, se clonó y expresó en las células huésped. La proteína F del HRSV modificada BV #541 se purificó a partir de las cosechas de cultivo de células de insecto Sf9 infectadas y se analizó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie. El método de purificación y análisis SDS-PAGE se describe en el Ejemplo 2. El nivel de expresión de la proteína F del RSV-F BV #541 (por ej. proteína F 541) se mejoró en comparación con la proteína F0 de tipo salvaje en células de insecto Sf9.

Ejemplo 4 Proteína F del HRSV modificada con deleción parcial de dominio de fusión de subunidad F1 Para mejorar en mayor medida la expresión de la proteína F del RSV, se diseñaron genes F del HRSV modificados adicionales que comprendieron las siguientes modificaciones: (a) los tres errores de secuenciamiento de GenBank fueron corregidos; (b) el sitio poli (A) críptico en la región que codifica la subunidad F2 fue modificado; (c) los codones génicos F fueron optimizados; y (d) la secuencias de nucleótidos que codifican el dominio de fusión de subunidad F1 fueron parcialmente delecionadas . En un experimento, la secuencia de nucleótidos que codifica los primeros 10 aminoácidos del dominio de fusión de subunidad F1 fue delecionada (correspondiente a los aminoácidos 137-146 de la SEC ID NO: 2).

Un gen F del RSV modificado de ejemplo, no limitativo, que comprende dichas modificaciones se ilustra en la Figura 5, designado como SEC ID NO: 9 (RSV-F BV #622, por ej. proteína F 622), que codifica una proteína F modificada de SEC ID NO: 10. La proteina F modificada del HRSV BV #622 se purificó a partir de las cosechas de cultivo de células de insecto Sf9 infectadas, y se analizó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie. El método de purificación y análisis SDS-PAGE se describe en el Ejemplo 2. Se observaron niveles altos de expresión de proteina F del HRSV BV #622, tal como se ilustra en el análisis SDS-PAGE en la Figura 6.

Ejemplo 5 Proteina F del HRSV modificada tanto con sitio de escisión primario inactivado como con deleción parcial de dominio de fusión F1 Para determinar si la combinación del sitio de escisión primario inactivado y la deleción parcial del dominio de fusión F1 puede promover adicionalmente la expresión de la proteina F del RSV, particularmente en las células de insecto Sf9, se diseñó otro gen F del RSV modificado que comprendía las siguientes modificaciones: (a) los tres errores de secuenciamiento de GenBank fueron corregidos; (b) el sitio poli (A) críptico en la región que codifica la subunidad F2 fue modificado; (c) los codones génicos F fueron optimizados; (d) el sitio de escisión primario fue inactivado; y (e) la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de fusión de subunidad F1 fue parcialmente delecionada.

En un experimento, la secuencia de nucleótidos que codifica los primeros 10 aminoácidos del dominio de fusión de subunidad F1 fue delecionada (correspondiente a los aminoácidos 137-146 de la SEC ID NO: 2).

Un gen F del RSV modificado de ejemplo, no limitativo, en el cual los primeros 10 aminoácidos del dominio de fusión de subunidad F1 fueron delecionados (correspondientes a los aminoácidos 137-146 de la SEC ID NO: 2) se ilustra en la Figura 7A, designado como SEC ID NO: 7 (RSV-F BV #683, por e j . proteína F 683), que codifica la proteína F modificada de SEC ID NO: 8. La proteína F del RSV BV #683 modificada (por ej . proteína F 683) se purificó a partir de las cosechas de cultivo de células de insecto Sf9 infectadas, y se analizó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie. El método de purificación y análisis SDS-PAGE se describe en el E emplo 2. Se alcanzaron otras mejoras en los niveles de expresión, tal como se ilustra en el análisis SDS-PAGE en la Figura 8.

Ejemplo alternativo 5 Deleciones del dominio de fusión de proteína F del HRSV modificada Las deleciones en el dominio de fusión F1 de los aminoácidos D2, D4, D6, D8, DIO, D12, D14, D16 o D18 de Phel37 - Vall54 fueron introducidas en el clon #541 (Figura 7A). Las células Sf9 infectadas con baculovirus que expresaban estos mutantes de deleción se analizaron en cuanto a la proteina F del RSV extraída de las células infectadas con un detergente no iónico (Figura 7B) y mediante análisis FACS de células teñidas para F RSV (Figura 7C). Las deleciones de hasta 10 aminoácidos Phel37 - Serl46 (Figura 7A D2, D4, D6, D8 y D10) incrementaron el nivel de F1 soluble extraído de las células en relación con el clon precursor BV#541 (Figura 7B). Se observó una pérdida drástica en el RSV F soluble con deleciones crecientes del dominio de fusión de más de 10 aminoácidos, posiblemente debido al plegamiento erróneo de la molécula. En forma consistente con estos resultados, las construcciones con las deleciones de aminoácidos D2, D6 y D10 del péptido de fusión F1 desplegaron la expresión de superficie celular más alta de F RSV (Figure 7C).

Ejemplo 6 Expresión y purificación de la proteína F del HRSV BV #683 modificada La proteína F del HRSV BV #683 modificada (por ej. proteína F 683, SEC ID NO: 8) fue expresada en el sistema de expresión de baculovirus tal como se describe en el Ejemplo 1, y se recolectaron y confirmaron las placas recombinantes que expresaban la proteína F del HRSV BV #683. El virus recombinante se amplificó luego mediante infección de células de insecto Sf9. Un cultivo de células de insecto fue infectado a ~3 MOI (multiplicidad de infección = ffu virus o pfu/célula) con baculovirus. El cultivo y el sobrenadante se cosecharon 48-72 horas post-infección. La cosecha en bruto, aproximadamente 30 mL, fue clarificada mediante centrifugación durante 15 minutos a aproximadamente 800 x g. Las cosechas de células en bruto resultantes que contenían proteína F del HRSV BV #683 se purificaron tal como se describió con anterioridad.

La proteína F del HRSV BV #683 se purificó a partir de las cosechas de cultivo de células de insecto Sf9 infectadas. Se usó agente tensioactivo no iónico Tergitol® NP-9 (Nonilfenol Etoxilato) en un protocolo de extracción de proteína de membrana. La extracción en bruto además se purificó al someterse a cromatografía de intercambio aniónico, afinidad a lectina de la lenteja/HIC, y cromatografía de intercambio catiónico La proteína F del HRSV BV #683 purificada se analizó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie y análisis de transferencia Blot usando anticuerpo monoclonal anti-F RSV como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados se ilustran en la Figura 9. Se alcanzaron niveles de expresión excelentes de la proteina F del HRSV BV #683 (por ej. proteina F 683, SEC ID NO: 8). Se estimó que el nivel de expresión fue superior a 10 mg/1 en cultivo celular en bruto, y la proteína F BV #683 recuperada fue de aproximadamente 3.5 mg/1 de cultivo celular. En algunos casos, se alcanzaron niveles de expresión superiores a 20 mg/L y se recuperaron aproximadamente 5 mg/1 de proteína F BV #683 modificada (ver la Figura 10). La pureza de la proteína F BV #683 recuperada alcanzó más del 98% tal como se determinó mediante densitometría de barrido (ver Figura 10).

Ejemplo 7 Micelas (rosetas) de proteina F del HRSV BV #683 purificada La proteína F del HRSV BV #683 purificada fue analizada mediante microscopía electrónica de tinción negativa (ver la Figura 11). La proteínas F se aglomeraron en forma de micelas (rosetas), similares a las observadas para la proteína F del HRSV de tipo salvaje (Calder y colaboradores, 2000, Virology 271, páginas 122-131), y otras glicoproteíñas de membrana de virus de longitud completa (Wriglcy y colaboradores, Academic Press, Londres, 1986, vol. 5, pp. 103-163). Bajo microscopía electrónica, las proteínas espículas ( spike) F exhibieron morfología de barra en forma de pirulí o lollípop con sus extremos más anchos proyectándose lejos de los centros de las rosetas (Figura 11).

Ejemplo 7 Alternativo Análisis por HPLC de mácelas de proteína F del HRSV BV #683 purificada (rosetas) Se analizó la proteina purificada F del HRSV BV #683 mediante HPLC. El análisis de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) mostró micelas F del RSV purificadas consistentes en 90.1% de F1+F2 con un tiempo de retención de 11.195 minutos y en 9.9% de polipéptido F1 con un tiempo de retención de 6.256 min (Figura 12A). El pico de F1+F2 a los 11.195 minutos mostró un pico doble, lo cual sugiere diferentes especies de glicosilación. Las identidades de F1+F2 y F1 fueron confirmadas mediante análisis de SDS-PAGE y transferencia Western de fracciones aisladas de picos de HPLC. La determinación de masa intacta mediante espectrometría de masa mostró que los pesos moleculares de F1 y F1+F2 fueron de 50 KDa y 61 Kda, respectivamente, similar a los pesos moleculares anticipados.

Las nanopartínulas de proteína F RSV purificadas se analizaron aún más utilizando cromatografía de exclusión por tamaño HPLC (SEC). Las nanopartículas de proteína F del RSV constaron principalmente de F1 y F2 unidos covalentemente (Figura 12B; F1+F2) con un nivel bajo de subunidades F1 libres. F1+F2 representó el 95.8% del área total del pico y F1 representó el 3.8% del área total del pico. Se estimó que la pureza de las partículas de proteína F del RSV es ³ 98%. El pico de F1+F2 fue eluido en el volumen vacío de esta columna de SEC y el pico de F1 tuvo una masa de aproximadamente 180 Kda, tal como se esperaba para los trímeros de F1. Un estudio de ultracentrifugación analítica (AUC) mostró que la mayoría de las especies en las nanopartículas de proteína F del RSV tuvieron un peso molecular entre aproximadamente 1 millón de Da y aproximadamente 8 millones de Da.

La longitud del trímero único fue de aproximadamente 20 nm, y el diámetro de partícula de la micela fue de aproximadamente 40 nm (ver Figura 12C). Estos resultados indicaron que la proteína F del HRSV BV #683 tiene la estructura 3D correcta para una proteína activa nativa.

En resumen, se ha diseñado, expresado y purificado una proteína F del HRSV recombinante modificada (por ej., BV #683). Esta proteína F de longitud completa modificada es glicosilada. Las modificaciones del sitio de escisión primario y del dominio de fusión juntos refuerzan en gran medida el nivel de expresión de la proteína F. Asimismo, esta proteína F modificada se puede escindir en las subunidades F1 y F2, que están ligadas por disulfuro. Los trímeros de las subunidades F1 y F2 forman espículas ( spikes) en forma de pirulí o lollipop de 19,6 nm y partículas de 40,2 nm. Asimismo, esta proteína F modificada es altamente expresada en células de insecto Sf9. La pureza de las micelas > 98% se alcanza después de la purificación. El hecho de que las espículas de esta proteina modificada tengan una morfología de pirulí o lollipop, que además puede formar partículas de micelas de 40 nm, indica que la proteína F BV #683 modificada tiene la estructura 3D correcta de una proteína nativa.

Ejemplo 8 Co-expresión de proteína F del HRSV modificada con proteína M del BRSV y/o N del HRSV en la producción de VLP La presente invención también provee VLPs que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada. Dichas VLPs son útiles para inducir anticuerpos neutralizantes a antígenos proteicos virales y, por ende, se pueden administrar para establecer inmunidad contra RSV. Por ejemplo, dichas VLPs pueden comprender una proteína F del RSV modificada, y proteínas M del BRSV y/o N del HRSV. Los codones de los genes que codifican proteínas M del BRSV (SEC ID NO: 14) o N del HRSV (SEC ID NO: 18) se pueden optimizar para la expresión en células de insecto. Por ejemplo, una secuencia génica M del BRSV optimizada se ilustra en la SEC ID NO: 13 y una secuencia génica N del RSV optimizada se ilustra en la SEC ID NO: 17.

En un experimento, una proteina F BV #622 modificada y otra proteína F BV #623 modificada (SEC ID NO: 21, modificada de tal manera que ambos sitios de escisión sean inactivados) fueron expresadas ya sea en forma individual o bien coexpresadas con proteína N del HRSV y proteína M del BRSV. Ambas cosechas celulares en bruto que contenían VLPs (intracelular) y sedimentos de VLPs que se recolectaron mediante separación en gradiente de sacarosa al 30% fueron analizadas mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie, y análisis de transferencia Western usando anticuerpo monoclonal anti-F RSV. La Figura 13 ilustra la estructura de las proteínas F BV #622 y BV #623 modificadas, y los resultados de los análisis SDS-PAGE y transferencia Western. La proteína BV #622 fue altamente expresada por sí misma o bien co-expresada con proteína N del HRSV y proteína M del BRSV, mientras que la proteína BV #623 tuvo una expresión muy deficiente, lo que indica que la inactivación de ambos sitios de escisión inhibe la expresión de la proteína F.

En otro experimento, la proteína F BV #622 modificada, el gen en tándem doble BV #636 (BV #541 + BRSV M), BV #683, BV #684 (BV #541 con dominio L YIAL introducido en el término C) , y BV #685 (BV #541 con dominio L YKKL introducido en el término C) se expresaron ya sea en forma individual, o se co- expresaron con proteína N del HRSV y proteína M del BRSV. El dominio tardío o dominio L (del inglés La te Domaín) es una secuencia conservada en retrovirus, y se presenta dentro de Gag actuando en conjunto con proteínas celulares para liberar en forma eficiente viriones de la superficie de la célula (Ott y colaboradores, 2005, Journal of Vírology 19 : 9038-9045). La estructura de cada proteína F modificada se ilustra en la Figura 14. Ambas cosechas celulares en bruto que contenían VLPs (intracelula ) y sedimentos de VLPs que se recolectaron mediante separación en gradiente de sacarosa al 30% fueron analizadas mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie, y análisis de transferencia Western usando anticuerpo monoclonal anti-F RSV. La Figura 14 muestra los resultados de los análisis SDS-PAGE y transferencia Western de las cosechas celulares en bruto que contenían VLPs (intracelular), y la Figura 15 muestra los resultados de los análisis SDS-PAGE y transferencia Western de los sedimentos de VLPs recolectados a partir de la separación en gradiente de sacarosa al 30%. Las proteínas BV #622 y BV #683 fueron altamente expresadas por sí mismas o bien co-expresadas con proteína N del HRSV y proteína M del BRSV, mientras que las proteínas BV #636, BV #684, y BV #685 tuvieron expresión deficiente.

Ejemplo 9 Detección de proteínas F del HRSV quiméricas con expresión alta Se realizaron intentos por detectar proteínas F del RSV adicionales que pudieran ser expresadas altamente en forma soluble en las células de insecto y pudieran formar VLPs con mejor rendimiento. Se diseñaron, expresaron y analizaron varios genes F. Se usaron análisis de transferencia Western y SDS-PAGE para evaluar la expresión.

Las Figuras 16A a 16D resumen la estructura, nombre del clon, descripción, resultados de análisis de transferencia Western/Coomassie y conclusión para cada clon F del HRSV quimérico.

Tal como indicaron los resultados, la proteína F de tipo salvaje de longitud completa fue expresada en forma deficiente; las proteínas F del HRSV quiméricas que contienen subunidad F1 pero no F2 se pudieron expresar bien, pero los productos fueron ya sea insolubles -lo que pudo deberse al plegamiento erróneo- o bien no se pudieron ensamblar con otras proteínas virales para formar VLPs con buen rendimiento después de las co-infecciones. La inactivación del sitio de escisión primario en forma individual no generó incrementos sustanciales en la expresión, pero se alcanzó mejor expresión cuando la inactivación del sitio de escisión primario se combinó con otras modificaciones tales como deleción del sitio poli (A) críptico y corrección de los errores de aa de GenBank (por ej., BV #541). La introducción del dominio L YKKL en el término C de BV #541 reforzó la secreción de las VLPs que contenían la proteína F modificada en aproximadamente 2-3 veces en co-expresión con las proteínas M del BRSV y N del HRSV. Los resultados además mostraron que un gen quimérico en tándem doble que consistía en los genes BV #541 y M del BRSV desplegaron tanto expresión intracelular mejorada como rendimiento de VLPs mejorado en comparación con la co-infección de las proteínas BV #541 y M del BRSV, lo que indica que la proteína M del BRSV puede facilitar la producción de VLPs que contienen una proteína F del HRSV modificada en células de insecto cuando se expresan en tándem. Un gen quimérico en tándem triple que consistía en BV #541, M del BRSV y N del HRSV tuvo expresión intracelular incluso mayor y rendimiento de VLPs mucho mejor en comparación con el gen quimérico en tándem doble mencionado con anterioridad o co-infección de proteínas BV #541, M del BRSV y N del HRSV. Además, los resultados sugirieron que la proteína F del HRSV BV#683 quimérica (por ej. proteína F 683, SEC ID NO: 8) tuvo la mejor expresión intracelular. La expresión de un gen quimérico en tándem doble que consistía en genes BV#683 y M de BRSV, o un gen quimérico en tándem triple que consistía en genes BV#683, M del BRSV y N del HRSV también está contemplado en la presente. Estos genes quiméricos en tándem doble y en tándem triple deberían mejorar, además, la producción de VLPs en comparación con la co-infección.

E emplo 10 Ensayo de neutralización de RSV y estudios de provocación con RSV en ratones Para evaluar la eficiencia de una vacuna que comprende proteína F del HRSV BV #683 modificada para evitar la infección por RSV, se llevaron a cabo ensayos de neutralización y estudios de provocación con RSV en ratones. Los procedimientos experimentales se ilustran en la Figura 17.

Los grupos de ratones (n=10) fueron inyectados por vía intramuscular (salvo por RSV vivo) con placebo (solución de PBS ), RSV vivo (administrado por vía intranasal), vacuna de RSV inactivado con formalina (FI-RSV, por sus siglas en inglés Formalín Inactí va ted RSV) , 1 mg de partículas F purificadas (FP del inglés Purified F Parti le, proteína F BV #683 modificada), 1 pg de partículas F purificadas con alum (PFP + Alum), 10 pg de partículas F purificadas, 10 pg de partículas F purificadas con alum (PFP + Alum), o 30 pg de partículas F purificadas el día 0 y el día 21. Cada grupo inmunizado fue provocado con RSV vivo el día 42 (21 dias después de la segunda inmunización). Se cosechó suero de ratón de cada grupo el dia 0, día 31 (10 días después de la segunda inmunización), y el día 46 (4 días después de la provocación con RSV vivo).

Se analizó el suero de ratón de cada grupo de tratamiento para registrar la presencia de anticuerpos de neutralización anti-RSV. Las diluciones de suero de los ratones inmunizados se incubaron con RSV infeccioso en placas de microtitulación de 96 cavidades. El suero fue diluido de 1:20 a 1:2560. Se mezcló 50 ml de suero diluido con 50 ml de virus RSV vivo (400 pfu) en cada cavidad. La mezcla virus/suero se incubó primero durante 60 minutos a temperatura ambiente, y luego se mezcló con 100 m? de células HEp-2 y se incubó durante 4 días. El número de placas de virus infecciosos se contó luego después de la tinción con cristal violeta. El título de neutralización para cada muestra de suero se definió como el inverso de la dilución más alta de suero que produjo 100% de neutralización de RSV (por ej., sin placas) y se determinó para cada animal. La media geométrica del título de anticuerpo neutralizante en suero el día 31 (10 días después del refuerzo) y el día 46 (4 días después de la provocación con RSV vivo) se gráfico para cada grupo de vacuna. La Figura 18 muestra los resultados de los ensayos de neutralización. Los resultados indicaron que 10 yg ó 30 yg de proteína F purificada produjeron título de neutralización muy superior en comparación con el RSV vivo. Además, los títulos de neutralización de las PFP se afianzaron con la co-administración de adyuvante de alum.

Se llevaron a cabo estudios de provocación con RSV para determinar si la inmunización podía prevenir y/o inhibir la replicación del RSV en los pulmones de los animales inmunizados. La cantidad de RSV en los pulmones de los ratones inmunizados se determinó mediante ensayos de placas usando células HEp-2. Los grupos de ratones inmunizados mencionados con anterioridad fueron infectados con 1 x 106 pfu de RSV infeccioso, cepa Long, por vía intranasal el día 42 (11 días después de la segunda inmunización). El día 46 (4 días después de la infección por RSV), se extrajeron los pulmones de los ratones, se pesaron y homogeneizaron. El tejido de pulmón homogeneizado fue clarificado. El sobrenadante de la solución clarificada fue diluido y sometido a ensayos de placas usando células HEp-2 para determinar el título de RSV en el tejido pulmonar (calculado como pfu/g de tejido pulmonar). Los resultados se ilustran en la Figura 19, lo que indica que todos los ratones inmunizados con proteína F del RSV BV #683 recombinante tuvieron RSV indetectable en los pulmones, e incluso 1 yg de proteína F del HRSV BV #683 recombinante purificada sin adyuvante exhibió eficiencia excelente para inhibir la replicación del RSV (reducida más de 1000 veces en comparación con el placebo).

Para determinar la estabilidad de la vacuna de PFP de RSV usada con anterioridad, la vacuna se almacenó a una temperatura comprendida entre 2 y 8 °C durante 0, 1, 2, 4 y 5 semanas, y luego se analizó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie (Figura 20). Los resultados muestran que la vacuna de PFP de RSV es estable a una temperatura comprendida entre 2 y 8 °C y no existe degradación detectable.

Ejemplo 11 Actividad de micela F del RSV recombinante en ratas del algodón En este ejemplo, los grupos incluyeron ratas del algodón inmunizadas los días 0 y 21 con RSV vivo (RSV), RSV inactivado con formalina (FI-RSV), proteína F del RSV BV #683 con y sin aluminio (PFP y PFP + Adyuvante de aluminio), y controles de PBS.

Tal como se ilustra en la Figura 21, la inmunización con 30 mg de la vacuna de micela F (proteina F del RSV BV #683, es decir, proteína F 683, SEC ID NO: 8), con y sin aluminio produjo respuestas de anticuerpos neutralizantes consistentes después de la exposición tanto a RSV A como a RSV B.

Asimismo se observó que el aluminio afianzó de manera significativa la respuesta de anticuerpos. Asimismo, los anticuerpos neutralizantes se incrementaron después de un refuerzo el dia 46 o el día 49 en RSV A y RSV B, respectivamente.

Sí bien se observó patología pulmonar significativa en las ratas inmunizadas con RSV inactivado con formalina (FI-RSV), no se observó afianzamiento de la enfermedad con la vacuna de micela F (Figura 22). El uso de la vacuna de micela F y la vacuna de micela F con adyuvante produjo menores puntajes de inflamación (4.0 y 2.8, respectivamente) que el grupo de control de infección primaria por RSV (PBS + prueba de RSV) (5.8). Tal como se destacó con anterioridad, el grupo tratado con FI-RSV tuvo un puntaje de inflamación superior que el grupo de control de infección primaria por RSV (PBS + provocación con RSV) (9.0 versus 5.8). Además, el grupo tratado con FI-RSV tuvo un puntaje de inflamación promedio significativamente superior (9.0) que los grupos de control con placebo no provocados, RSV vivo + provocación con RSV, micela F + provocación con RSV, y micela F + aluminio + provocación con RSV.

Ejemplo 12 Eficacia preclínica de la vacuna de nanoparticulas de F RSV en ratas Se estudió la eficacia de la vacuna de nanopartículas de F RSV en la rata del algodón.

Se evaluaron las respuestas de los anticuerpos neutralizantes contra RSV-A en ratas del algodón inmunizadas con vacuna de F RSV ± alum.

En un estudio, se inmunizó a ratas del algodón con uno de los siguientes grupos de tratamiento: (1) PBS; (2) RSV; RSV FI-RSV inactivado con formalina; (4) vacuna de nanopartículas de F RSV (1 mg + alum) (5) vacuna de nanopartículas de F RSV (6 pg + alum) (6) vacuna de nanopartículas de F RSV (30 pg + alum) Se extrajo sangre de las ratas en los días 21 y 49. Se estudió el suero obtenido a partir del día 49 contra RSV-A en ensayos de neutralización utilizando una prueba de neutralización por reducción de placas. Los resultados de este experimento se brindan en la Figura 23. La Figura 23 es un gráfico que muestra títulos de neutralización vs. cada grupo de tratamiento respectivo. La línea para cada grupo de tratamiento indica la media geométrica del título de punto final que neutralizó el 100 % del virus RSV-A. Los resultados indicaron que la vacuna de la invención neutralizó el RSV en mayor grado que el RSV y el FI-RSV.

En otro estudio, las ratas del algodón fueron inmunizadas con uno de los siguientes grupos de tratamiento. (1) PBS; (2) RSV; (3) FI-RSV; (4) vacuna de nanoparticulas de F RSV (1 mg) (5) vacuna de nanoparticulas de F RSV (1 pg + alum) (6) vacuna de nanoparticulas de F RSV (10 pg) (7) vacuna de nanoparticulas de F RSV (10 pg + alum) (8) vacuna de nanoparticulas de F RSV (30 pg) Las ratas del algodón fueron inmunizadas el dia 0 y el dia 21 a la 1 con uno de los grupos de tratamiento anteriores. Posteriormente se extrajo sangre de las ratas el dia 31. Se analizaron los sueros de todos los grupos contra RSV-A en un ensayo de CPE. La Figura 24 muestra las respuestas de los anticuerpos neutralizantes contra RSV-A en ratas del algodón, expresado como Log2 de los títulos, vs. el grupo de vacunación respectivo (eje x). La vacuna de la invención neutralizó el RSV en un grado mayor que el RSV y el FI-RSV. Adicionalmente, las vacunas de nanoparticulas administradas con alum produjeron títulos de neutralización mayores que las vacunas de nanoparticulas sin alum.

En otro experimento, las ratas del algodón fueron inmunizadas con uno de los siguientes grupos de tratamiento: (1) PBS; ( 2 ) RSV; ( 3 ) FI-RSV; (4) vacuna de nanopartículas de F RSV (1 pg) (5) vacuna de nanopartículas de F RSV (1 mg + alum) (6) vacuna de nanopartículas de F RSV (6 pg) (7) vacuna de nanopartículas de F RSV (6 pg + alum) (8) vacuna de nanopartículas de F RSV (30 pg) (9) vacuna de nanopartículas de F RSV (30 pg + alum) Las ratas del algodón fueron inmunizadas con uno de los grupos de tratamiento con vacunas (1)—(9) el día 0 y el día 21, y posteriormente se las expuso al virus de la cepa RSV A el día 49.

Se cosecharon tejidos pulmonares el día 54 (n=8/grupo). Luego se homogeneizó el tejido y se evaluó para constatar la presencia del virus RSV utilizando un ensayo de monocapas de células Hep-2 en placa para detectar el virus infeccioso. La Figura 25 muestra que el anticuerpo neutralizante producido por las nanopartículas de F RSV fue efectivo para evitar la replicación del virus RSV en los pulmones de los animales sometidos a dicho virus. En la Figura 25, los títulos de RSV están expresados como loglO de u.f.p./por gramo de tejido pulmonar.

También se realizó un ensayo ELISA con los sueros de las ratas tratadas con los nueve grupos de vacunación anteriores para determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-RSV. Se reunieron las muestras de suero para los animales en cada grupo y se sometieron a un ensayo ELISA. Los resultados se proveen en las Figuras 26A y 26B medidos en unidades de ELISA (correspondiente a un titulo del 50% en una curva de dilución ajustada por 4 parámetros; Figura 26A) o título de IgG contra RSV-F (Figura 26B). Los animales tratados con la vacuna de la presente invención produjeron un número mayor de anticuerpos anti-RSV detectables que los animales tratados con RSV o FI-RSV. Adicionalmente, el alum aumentó la respuesta de los anticuerpos.

Se evaluó la actividad funcional de los anticuerpos anti-F RSV en un ensayo de neutralización de RSV calculando la dilución de los antisueros capaz de inhibir el 100% de la actividad citopática de RSV en monocapas de células HEp-2. La inmunización con todas las dosis de nanopartículas de F RSV sin adyuvante dio como resultado el desarrollo de anticuerpos neutralizantes contra RSV (Figura 26C). En concordancia con los resultados para la IgG anti-F RSV, la co-administración de fosfato de aluminio como adyuvante aumentó los títulos de anticuerpos neutralizantes contra RSV en 3.5 - 18 veces. Los títulos de anticuerpos neutralizantes con RSV vivo fueron comparables con el grupo asignado a la dosis ba a de RSF F con adyuvante y es probable que un componente fuera dirigido contra la proteína G de RSV. Los sueros de las ratas del algodón inmunizadas con RSV (FI-RSV) inactivado con formalina no exhibieron actividad neutralizante (Figura 26C; FI-RSV).

Se ha mostrado que el sitio antigénico II en la proteina F RSV es el blanco de acción de palivizumab, un anticuerpo monoclonal neutralizante humanizado contra RSV utilizado en la profilaxis para la prevención de la enfermedad por RSV. Para determinar si los anticuerpos dirigidos contra el sitio antigénico II fueron inducidos mediante inmunización con nanoparticulas de F RSV, se realizó un ensayo ELISA competitivo con palivizumab utilizando el suero reunido de los animales individuales dentro de cada grupo. Los sueros obtenidos de los animales vivos tratados con RSV, los animales inmunizados con FI-RSV o los animales de control con PBS no inhibieron la unión a palivizumab (Figura 26D). Por el contrario, los sueros agrupados obtenidos de animales inmunizados con nanoparticulas contra F RSV tuvieron niveles elevados de anticuerpo que inhibieron la unión de Palivizumab a F RSV (Figura 26D). Este resultado se alcanzó para todos los grupos provenientes de todas las dosis, con o sin fosfato de aluminio como adyuvante. Estos datos demuestran que la proteína F de RSV estimula anticuerpos con la misma especificidad que palivizumab.

Histopatologia También se estudió la histopatología de la rata del algodón provocada con RSV. Las ratas del algodón fueron inmunizadas con uno de los siguientes grupos de vacunación el día 0 y el día 21: (1) vacuna de nanopartícula de F RSV (1 mg , 6 pg o 30 pg; +/- alum) (2) FI-RSV (3) RSV (4) PBS (5) PBS Las ratas de los grupos (1)—(4) fueron luego provocadas con la cepa A del virus de RSV el día cuarenta y nueve. Las ratas del grupo (5) no fueron provocadas con el virus. Se aisló tejido pulmonar cinco días después de la provocación. Los te idos se congelaron, se cortaron y se colorearon con hematoxilina y eosina. Se brindan micrográficos representativos para indicar afección por peribronquiolitis en los animales de control y 30 pg + alum en los grupos de vacuna (Figura 27).

Los cortes se evaluaron de forma ciega utilizando una puntuación de 0 a 4 (inflamación 0=nula; l=mínima; 2=leve; 3=moderada; 4=máxima) a fin de incrementar la gravedad para cada uno de los siguientes 5 parámetros: a) bronquiolitis; b) vasculitis; c) bronquitis; d) alveolitis y e) neumonitis intersticial (tal como se describe en Prince GA, y colaboradores (1986) J Virol 57: 721-728). Se agregó el valor resumido para cada uno de los cinco parámetros para llegar a una única puntuación resumida para cada animal. Las puntuaciones resumidas para cada grupo fueron utilizadas para llegar a una puntuación promedio total /grupo expresada como la media aritmética ± SEM.

El análisis de las puntuaciones de histopatologia para los varios grupos experimentales (Tabla 1) demostraron que el FI-RSV exacerbó la inflamación ante la provocación posterior con el virus vivo. La puntuación total de histopatologia para FI-RSV fue muy superior que la observada para los animales no inmunes provocados con RSV (promedio 5.63; p<0.0001, prueba t). No se observó un aumento significativo en la patología en ninguno de los grupos inmunizados contra F RSV en presencia o ausencia de alum en relación a los grupos de control. Las ratas del algodón infectadas con RSV y expuestas a RSV tuvieron una puntuación promedio de 0.75. Las siguientes puntuaciones más bajas de histopatologia de 1.13 y 1.43 correspondieron a los grupos asignados a vacuna con adyuvante inmunizados respectivamente con 6 gg o 30 gg de nanopartículas contra F RSV (Tabla 1).

Estos datos demuestran que la vacuna de nanoparticulas de F RSV con adyuvante inhibe la inflamación pulmonar luego de la provocación con RSV.

Tabla 1. Parámetros histopatológicos pulmonares en ratas del algodón inmunizadas Ejemplo 13 Eficacia preclinica de la vacuna de nanopartículas de F RSV en ratones Se cubrieron placas para ELISA con micelas de F RSV en una concentración de 2 mg/mL. Se mezclaron los sueros obtenidos antes de la inmunización y los sueros reunidos del día 28 provenientes de ratones inmunizados el día 0 con 30 pg de F RSV con alum con 50 ng/mL de péptidos del epitopo biotina-Palivizumab. Luego se efectuaron diluciones seriales a estas muestras que se incubaron en placa para ELISA recubierta con F RSV purificada. Se utilizó estreptavidina para determinar la unión de Palivizumab en la placa.

En la Figura 28 se presenta una curva de regresión logística no ponderada de cuatro parámetros. Los resultados indicaron que los anticuerpos producidos por la vacuna de nanopartículas de la invención compitieron con el péptido Palivizumab para unirse al blanco RSV.

Ejemplo 14 Ensayo de vacuna de nanopartículas de RSV-Palivizumab Se ensayó la unión de la vacuna de nanopartículas de RSV de la invención a Synagis.

Unión del mAb de Synagis al Péptido del Epitopo de Palivizumab. Se cubrieron placas para ELISA con estreptavidina en concentración de 5 pg/mL. El péptido Palivizumab en concentración de 1 pg/mL se unió a la placa de la estreptavidina a través de un ligador de biotina. Se efectuaron cuatro diluciones en serie de Synagis® a una concentración de 10 mg/mL y se incubaron con el péptido en la placa. Se detectó la unión de Synagis® utilizando una reacción anti HRP humana. Los resultados se brindan en la Figura 29A (gráfico de la izquierda).

Unión de Synagis® a micelas de F RSV recombinantes. Se cubrieron placas para ELISA con 2pg/ml de antigeno de micelas de F RSV. Se diluyó Synagis® en una concentración de 10 pg/mL en forma seriada cuatro veces y se sometió a reacción con F RSV en la placa. La reacción con anti HRP humana se utilizó para determinar la unión de Synagis a las micelas de F RSV. Se presenta una curva de regresión logística no ponderada de cuatro parámetros (Figura 29B, gráfico de la derecha). Los resultados indicaron que Synagis® reconoció y se unió a la vacuna de la invención.

Ejemplo 15 Seguridad clínica de la vacuna de nanopartículas de F RSV Se realizó un ensayo de Fase 1, aleatorizado, con observador ciego, controlado con placebo para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de la vacuna de nanopartículas de RSV en adultos sanos según un esquema de escalamiento de dosis.

Se administró a 150 adultos sanos dos inmunizaciones el dia 0 y el día 30. Los grupos de tratamiento se brindan en la Tabla 2, más abajo. Los datos demográficos y la disposición de los sujetos se brindan en las Tablas 3 y 4, respectivamente: Se evidenciaron eventos adversos (AEs, tanto locales como sistémicos) a los 1-7 dias posteriores a la i munización.

Se informó dolor local para el 6.7% de los pacientes a los que se administró placebo. Entre el 15% y el 55% de los pacientes en los grupos de vacuna informó dolor. Un sujeto informó dolor grave (30 mg + tratamiento con alum). No hubo efecto de respuesta según la dosis.

Se informó sensibilidad a la palpación por el 10% de los pacientes a los que se administró placebo. Entre el 20% y el 55% de los pacientes en los grupos de vacuna informó sensibilidad a la palpación. Un sujeto informó sensibilidad grave a la palpación (60 pg + tratamiento con alum). No hubo efecto de respuesta según la dosis.

Se informó cefalea para el 16.7% de los pacientes a los que se administró placebo. Entre el 10% y el 35% de los pacientes en los grupos asignados a vacunas informó sensibilidad a la palpación. No hubo efecto de respuesta según la dosis.

La vacuna fue bien tolerada en términos generales. La mayoría de los eventos adversos fueron dolor local y sensibilidad a la palpación que en la mayoría de los casos fueron leves. Los eventos adversos locales fueron más en los grupos asignados a vacunas en comparación con placebo. No se registró tendencia a eventos adversos sobre la base de la dosis de la vacuna. Adicionalmente, no se registraron eventos adversos graves relacionados con la vacuna.

Ejemplo 16 Inmunogenicidad de la vacuna de nanopartículas de F RSV El ensayo de Fase 1 se realizó tal como se estipuló en el Ejemplo 15.

Se evaluó la inmunogenicidad de los virus de las nanopartículas de RSV. En la Figura 30 se brinda el esquema de varios ensayos utilizados para evaluar la inmunogenicidad.

ELISA para F RSV/Péptido de Synagis (Palivizumab) Grupos de Grupo 5 mV + 15 mg 30 pg 30 pg 60 pg 60 pg Se cubrieron placas para ELISA con estreptavidina en una concentración de 5 mg/mL. El péptido Palivizumab en una concentración de 1 pg/mL se unió a Estreptavidina. Se introdujeron sueros humanos de su etos tratados con la vacuna de la invención en las placas. Luego se agregó un anticuerpo secundario (anti HRP humana) para detectar IgG anti-F RSV contra el péptido Palivizumab.

La Figura 31 brinda los resultados de este estudio. Cada uno de los grupos de tratamiento de la vacuna de nanopartículas produjo mucha más IgG RSV que el grupo de control, y los grupos asignados a recibir alum funcionaron mejor que los grupos que no lo recibieron. En la Figura 31, cada grupo de tratamiento incluye tres mediciones: (1) sueros del dia 1 (barra de la izquierda), (2) sueros del dia 30 (barra del medio), (3) sueros del dia 60 (barra de la derecha).

ELISA para IgG anti-F RSV Grupos de Placebo 5 gg + 15 gg 30 gg 30 gg 60 gg 60 gg Las placas para ELISA se recubrieron con 2 mg/mL de F RSV o antígeno G del RSV. Se introdujeron en las placas los sueros humanos de su etos tratados con la vacuna de la invención seguido por provocación con RSV. Luego se agregó un anticuerpo secundario (anti HRP humano) para detectar anti-F RSV o IgG anti-G RSV en los sueros humanos.

Cada uno de los grupos de tratamiento de vacuna de nanopartículas produjo anticuerpos IgG contra F RSV en todos los momentos de medición que se estudiaron (Figura 32A). En contraste, los grupos de tratamiento de vacuna indujeron la producción de cantidades insignificantes de anticuerpos anti- G RSV (Figura 32B). En la Figura 32 A y B, cada grupo de tratamiento incluye tres mediciones: (1) sueros del día 1 (barra de la izquierda), (2) sueros del día 30 (barra del medio), (3) sueros del día 60 (barra de la derecha).

Los resultados de este experimento también se muestran en las Tablas 5A y 5B, más abajo. La Tabla 5A muestra la media geométrica de los niveles de IgG en todos los grupos. El factor de aumento de la media geométrica en los niveles de IgG también se gráfico para los grupos asignados a alum (Figura 33). Se logró una respuesta significativa relacionada con la dosis (p<0.05). La Tabla 5B muestra los resultados del ensayo ELISA (expresados como Unidades de ELISA) para sujetos individuales en el grupo de 60 mg + Alum.

GMT es el título de la media geométrica. [1] Valor de P obtenido de la prueba de t de valores de título transformados a log (base 10) que compara el grupo de tratamiento especificado con el grupo de RSV-F 30 mg sin adyuvante. [2] Valor de P obtenido de la prueba de t de valores de título transformados a log (base 10) que compara el grupo de tratamiento especificado con el grupo de RSV-F 60 pg sin adyuvante. [3] Valor de P obtenido de la prueba de t de valores de título transformados a log (base 10) que compara el grupo de tratamiento especificado con el grupo de Placebo.

Título de Neutralización por Reducción de Placas de RSV (PRNTs) Los resultados de estos experimentos se brindan en la Figura 34 y la Figura 35. La Figura 34 muestra que los anticuerpos en el día 60 fueron muy superiores que el placebo para todos los grupos. Los valores del título de neutralización por reducción de placas (PRNT, por sus siglas en inglés Plaque Reduction Neutralizíng Tí ters) luego de la inmunización en los grupos asignados a vacunas excedieron los niveles gue se habían estimado como protectores en los ancianos, niños y lactantes.

La Figura 35 muestra la distribución acumulativa inversa de PRNTs para el Día 0, Día 30 y Día 60 en los grupos de placebo y 30 mg + Alum. Los títulos mínimos del día 0 fueron 5 log2 y el título mínimo posterior a la inmunización con nanopartículas de F RSV recombinante del día 60 fue 8.5 log2.

Ejemplo 17 Avidez de los anticuerpos Inducidos por la vacuna de nanopartículas de F RSV El ensayo de Fase 1 se realizó como se estipula en el Ejemplo 15.

Se determinó la avidez de los anticuerpos en los sueros humanos por F RSV utilizando un sistema de medición BIAcore basado en SPR. La proteína F del RSV fue inmovilizada en la superficie del sensor y los sueros fueron pasados sobre F RSV inmovilizada. Se midió la unión de F RSV inmovilizada sobre la base de la masa molecular en la superficie del sensor . Se midieron las velocidades de asociación y disociación en función del tiempo y se graficaron en un sensograma, y se calculó la constante de disociación a partir de las velocidades de asociación y disociación.

La Figura 36 muestra los controles para el ensayo de BIAcore basado en SPR. La Figura 36A muestra las velocidades de asociación (k-On), velocidades de disociación (k-Off), y las constantes de disociación (KD) para los controles positivos de anticuerpos de palivizumab y los sueros de referencia de RSV (disponibles de BEI Resources y descritos en Yang y colaboradores, 2007, Biologi cal s 35; 183-187). La Figura 36B muestra un sensograma para demostrar los resultados negativos desde el Día 0 y los sueros de control con placebo del ensayo de Fase 1, en contraste con el control positivo con palivizumab.

La Figura 37 muestra las curvas de unión para el anticuerpo de palivizumab y una persona representativa que recibirá la vacuna (ID del sujeto # 1112, día 30).

Los resultados del estudio para 13 sujetos en el grupo de 60 mg de vacuna + adyuvante se muestran en la Tabla 6, más abajo. El Día 30, la KD para esos 13 sujetos varió de 0.11 pmol a 992 pmol; el Día 60, la KD varió de 0.00194 pmol a 675 pmol. Por ende, la avidez de los anticuerpos en los sueros humanos por F RSV se encontró, como el control del anticuerpo de palivizumab, en el rango de los picomoles.

Ejemplo 18 Anticuerpos IgG del tipo de Palivizumab inducidos por la vacuna de nanoparticulas de F RSV Se realizó un ensayo de Fase 1 tal como se estipula en el Ejemplo 15.

Se midieron los anticuerpos IgG del tipo de Palivizumab (anticuerpos que compiten con el péptido del epitopo de palivizumab para unirse a F RSV) en los sueros de 13 su etos asignados al grupo de 60 mg + adyuvante por medio de un ensayo de unión competitivo. Los resultados, exhibidos en la Tabla 7 de abajo, indicaron que los anticuerpos del tipo de Palivizumab se encontraron bien por encima de los niveles de protección (>40pg/mL) en todos los sujetos estudiados tanto en el Día 30 como en el Día 60.

Ejemplo 18 Inmunogenicidad de una vacuna de nanopartículas de proteína F del RSV recombinante fabricada en células de insectos: inducción de actividad del tipo de Palivizumab en sujetos humanos La vacuna administrada en este ejemplo constó de nanopartículas que comprendían la proteina F de longitud casi completa y que estaban ensambladas en trímeros. La proteína F fue producida en células de insecto Sf9 infectadas con un baculovirus recombinante. Las células fueron U sadas y solubilizadas con detergente, y la proteina F fue purificada cromatográficamente. El antigeno fue administrado mediante inyección intramuscular con o sin adsorción a ALP04.

Se enrolaron adultos sanos (N = 150; edad promedio 31.3 años; 59% de mujeres) en 6 cohortes, cada una de las cuales incluía 20 destinatarios de vacuna activa y 5 de placebo. Las sustancias de prueba se administraron en series de 2 dosis con un intervalo de 30 días.

El antígeno F RSV fue estudiado en dosis de 5, 15, 30 y 60 mg adsorbido sobre A1P04, y de 30 y 60pg sin adyuvante. Se controló la seguridad mediante el seguimiento de los síntomas locales y sistémicos durante 7 días luego de la administración de cada dosis, y la comprobación de eventos adversos no manifestados durante 6 meses. Los anticuerpos funcionales fueron evaluados utilizando la neutralización por reducción de placas (PRN) y ensayos de microneutralización (MN) (los cuales arrojaron resultados similares) y ensayos ELISA para antigenos múltiples como más abajo.

Los resultados del ensayo indicaron que las respuestas a la MN parecieron demorar las respuestas anti-F (Figura 38). Las respuestas de los anticuerpos a la MN ocurrieron en los grupos asignados a las sustancias activas, pero las respuestas anti-F fueron mucho más dinámicas. Mientras que los títulos de IgG anti-F del estado inicial duraron un rango de tiempo más limitado, los títulos de microneutralización (MN) del estado inicial variaron en un rango de >32 veces. La vacuna indujo respuestas sustanciales a la MN en sujetos con bajos valores de MN en el estado inicial (la media geométrica aumenta 3.9 veces en los sujetos ubicados en el 1/3 más bajo de la población), pero los aumentos globales estuvieron limitados por el 1/3 de sujetos con valores elevados en el estado inicial (donde se notaron respuestas <2 veces la inicial).

Los resultados del ensayo también mostraron que la vacuna de nanopartículas de F RSV produjo respuestas de anticuerpos al sitio antigénico II, Péptido 254-278 (Figura 39). El péptido sintético F-RSV 254-278, que alberga los epítopos de palivizumab y motavizumab fue biotinizado e inmovilizado en placas cubiertas con estreptavidina. Se incubaron diluciones seriadas de los sueros con las placas cubiertas de péptido. Se detectó la IgG unida luego de lavar con IgG de cabra anti humana conjugada con enzimas. Los títulos previos a la inmunización fueron uniformemente bajos, pero aumentaron 5 a 15 veces al recibir la vacuna de nanopartículas de RSV-F.

La Figura 40 y la Tabla 8 muestran los resultados de un ensayo ELISA competitivo con palivizumab con suero humano antes y después de la inmunización con nanopartículas de F-RSV. Las placas para ELISA fueron recubiertas con antígeno proteico F RSV en concentración de 2 mg/mL. Los sueros antes y después de la inmunización se diluyeron en forma seriada, se les adicionó 50 ng/mL de palivizumab biotinizado, y se incubaron en las placas recubiertas. Se utilizó estreptavidina conjugada en enzimas para detectar el palivizumab unido a la placa. Se generó un ajuste de cuatro parámetros y se interpoló la dilución del suero que dio un rendimiento del 50% de inhibición de la unión de palivizumab. Los anticuerpos que compitieron con Palivizumab estuvieron presentes con un título bajo en los sueros de adultos normales, pero aumentaron de manera significativa por la inmunización con la vacuna de nanopartículas de F RSV (Figura 40A). La Figura 40B muestra el aumento de la media geométrica en la inhibición de la unión de palivizumab luego de la administración de la dosis 1 y la dosis 2 en todos los grupos de sujetos. El adyuvante incrementó la inhibición de palivizumab de sueros inducida por la vacuna, y el grupo asignado a 60 mV + adyuvante exhibió los niveles más elevados de inhibición de palivizumab.

Tabla 8. Concentración de anticuerpo competitivo con Palivizumab en muestras de suero de los sujetos del estudio Los resultados del ensayo también indicaron que la inducción de anticuerpos anti-F RSV se correlacionó con la presencia de anticuerpos que compitieron por el sitio de unión de palivizumab (Figura 41). A pesar de los títulos anti-F presentes el Día 0, los sueros de la mayoría de los adultos jóvenes sanos arrojaron valores iguales o cercanos a los del ensayo de competencia de palivizumab LLOQ. El Día 60, los destinatarios de placebo tuvieron una distribución inalterada, pero las personas que iban a ser vacunadas con activo (en rojo) mostraron un aumento de los anticuerpos anti-F con el enriquecimiento de especificidades competitivas con palivizumab.

El palivizumab no marcado, agregado al suero normal, alcanzó un 50% de inhibición en el ensayo ELISA competitivo con una concentración de 2.1 mg/mL. Este resultado se utilizó en la Tabla 9 para calcular un equivalente aproximado de actividad "tipo palivizumab" en el suero de las personas que iban a ser vacunadas. En paralelo, también se adicionó palivizumab a los sueros de 5 adultos normales en tres niveles diferentes, y se determinó el efecto en el título de MN; se muestran los aumentos en GMTs sobre la base de 2 réplicas efectuadas en cada uno de los 2 días diferentes.

Las respuestas inmunológicas anti proteina F a la nanopartícula de proteína F del RSV derivada de células de insectos fueron enriquecidas en anticuerpos contra el sitio antigénico II de la proteína F altamente conservada clínicamente importante, que contiene los sitios de unión a palivizumab y motavizumab.

Los niveles de actividad del tipo de palivizumab alcanzados por la vacuna fueron acordes con los que han sido eficaces cuando la misma se administra en forma pasiva a lactantes.

Ejemplo 19 Los anticuerpos monoclonales específicos de F RSV se unen al antlgeno de la vacuna de nanopartículas de F RSV En el arte se conocen varios anticuerpos monoclonales neutralizantes de F RSV que están descritos, por ejemplo, en Crowe JE y colaboradores, Virology 252; 373 (1998), y en Beeler y colaboradores, Journal of Virology 63; 2941 (1989), y ambos están incorporados en el presente a modo de referencia. La Figura 42 muestra una representación esquemática de las regiones de reconocimiento del anticuerpo del antigeno de la vacuna de F RSV, que son el Sitio I, Sitio II y Sitio IV/V/IV.

El antígeno de la vacuna de F RSV se colocó en placas a una concentración de 2 mg/mL. Los anticuerpos monoclonales específicos de RSV fueron diluidos en forma seriada cuatro veces e incubados con el antígeno de la vacuna de F RSV, y se detectó la unión de anticuerpos utilizando HRP anti-ratón. Como muestra la Figura 42, el antígeno de la vacuna logró producir la unión de varios anticuerpos neutralizantes de F RSV, incluyendo los anticuerpos que se unen al Sitio I, II o IV/V/VI del antígeno.

Ejemplo 20 Respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna de nanoparticulas de F RSV en ratas del algodón En este ejemplo, la eficacia de la vacuna de F RSV se estudió en mayor medida en cuatro grupos de ratas del algodón hembra (5 por grupo). Los animales del grupo 1 recibieron dos vacunaciones intramusculares, una el Día 0 y una el Día 28, con virus de RSV inactivado por formalina (FI-RSV) adsorbido en alum a una dilución de 1:25. Los animales en el Grupo 2 recibieron vacunaciones intramusculares el Día 0 y el Día 28 con 30 gg de la vacuna recombinante de nanoparticulas de RSV-F, formulada con adyuvante (2.4 mg/mL AIP04). Los animales en el Grupo 3 recibieron las dos vacunaciones con 30 gg de vacuna recombinante de nanoparticulas de RSV-F en ausencia de adyuvante. Los animales en el Grupo 4 fueron infectados intranasalmente con 105 uf.p. de RSV-A2 (0.05 mL por narina) el Día 0 y Día 28. Las muestras de suero se recolectaron de todos los animales los Días 0, 28 y 49.

Las muestras de suero policlonal provenientes de ratas del algodón inmunizadas e infectadas fueron diluidas en forma seriada cinco veces e incubadas con el antígeno de F RSV, y colocadas en placas a una concentración de 2 gg/mL. Se detectó el anticuerpo unido utilizando HRP anti-rata. Como muestra la Figura 43, la vacuna de F RSV indujo anticuerpos IgG anti-RSV robustos en las ratas del algodón. Ambos grupos de vacunas de F RSV produjeron títulos de IgG mayores en comparación con la inmunización con FI-RSV o la infección con RSV A2 en los Días 28 y 49. La presencia de adyuvante aumentó aún más el título de IgG tanto en el Día 28 como en el Día 49 (Figura 43).

Se estudiaron las respuestas de los anticuerpos neutralizantes en las ratas del algodón utilizando un ensayo de infección en la línea celular Hep-2. Las diluciones del suero se incubaron con RSV infeccioso en placas, luego la mezcla de RSV/suero se incubó con células Hep-2. Se contó el número de placas de virus infecciosos y se calcularon los títulos de neutralización como la inversa de la mayor dilución del suero que produjo el 50% de la inhibición de la infección por RSV.

El suero del Día 0 no exhibió títulos de neutralización mensurables en ninguno de los grupos. Los grupos de FI-RSV no exhibieron títulos de neutralización en ningún momento predeterminado de medición. El Día 49, los ratones infectados con RSV A2 exhibieron niveles similares de anticuerpo neutralizante en relación con los animales inmunizados con F RSV en ausencia de adyuvante. Los títulos de neutralización más elevados se detectaron el Día 49 en el grupo asignado a vacuna de F RSV + adyuvante, lo cual indica que los títulos de neutralización fueron inducidos más robustamente en los animales que recibieron vacuna contra F RSV en presencia de adyuvante (Figura 44).

Para determinar si la neutralización está inhibida por la presencia de F RSV, los sueros de ratas del algodón se pre-incubaron con 20 mg/mL de BSA, proteína F de RSV, proteína G de RSV o ambos, proteína F y G de RSV, antes de la incubación con células Hep-2 en el ensayo de neutralización. Como muestra la Tabla 11, la pre-incubación con proteína F de RSV redujo los títulos de neutralización hasta niveles indetectables o casi indetectables en los sueros provenientes de los ratones infectados con RSV A2 como así también en los ratones inmunizados con la vacuna contra F RSV, con o sin adyuvante.

Tabla 11. La neutralización de RSV es inhibida por la presencia de la proteína F de RSV Se utilizó un ensayo de inhibición de la fusión en células Hep-2 para probar la capacidad de los anticuerpos inducidos por FI-RSV, vacuna de F RSV con o sin adyuvante o RSV A2 vivo para inhibir la infección con RSV mediada por fusión. Las células Hep-2 se incubaron brevemente con RSV vivo antes de la incubación de las células con diluciones del suero de cada grupo. Se contó el número de placas con virus infecciosos y la inhibición de la fusión se expresó como el valor inverso de la dilución que dio como resultado un 50% de inhibición de la formación de placa. La Figura 45 muestra que la infección de células Hep-2 mediada por fusión fue inhibida por los sueros del Dia 49 provenientes de ratas infectadas o de ratas inmunizadas con vacuna de F RSV, con o sin adyuvante. Sin embargo, la inhibición de la fusión se vio incrementada por la presencia de adyuvante. Además, en la medición del Día 28, solo los sueros provenientes de ratas inmunizadas con vacuna de F RSV con adyuvante inhibieron la fusión. La pre-incubación de los sueros de rata con proteína F del RSV anuló la capacidad de inhibición de la fusión en todos los grupos, como muestra la Tabla 12, lo cual indica que la inhibición de la fusión estaba mediada por anticuerpos específicos para F RSV.

Tabla 12. La inhibición de la fusión está anulada por la presencia de la proteína F del RSV Se evaluaron las muestras de suero provenientes de animales individuales en relación con la capacidad de competir con el anticuerpo monoclonal de palivizumab para unirse a F RSV. Se incubaron diluciones en serie de muestras de suero con palivizumab biotinizado antes de la incubación con F RSV unido a placa, y luego se detectó el palivizumab unido con avidina-HRP. Los datos se expresaron como el valor inverso del título de la media geométrica de los anticuerpos que exhibieron el 50% de la inhibición de la unión de palivizumab. Los sueros obtenidos de los animales inmunizados con FI-RSV no inhibieron la unión de palivizumab. Se observó una mínima inhibición de la unión de palivizumab con los sueros de animales tratados con RSV vivo. En contraste, los sueros de animales inmunizados con vacuna de F RSV exhibieron que compiten con palivizumab por unirse a las nanoparticulas de F RSV y dicha competencia fue reforzada aún más con los sueros provenientes de los animales que también recibieron adyuvante (Figura 46).

También se evaluaron los sueros de las ratas del algodón provenientes de animales dentro de cada grupo en relación con la capacidad de inhibir la unión de otros anticuerpos monoclonales específicos de F RSV. Se determinó la inhibición mediada por suero de la unión de los anticuerpos 1107, 1153, 1243, 1112 o 1269, que se unen a los Sitios I (1243), II (1107 y 1153) o IV, V, VI (1112 y 1269), de la proteína F de RSV. Se incubaron diluciones en serie de los sueros de cada grupo con los anticuerpos biotinizados 1107, 1153, 1112, 1269 o 1243 antes de la incubación con F RSV unida a placa, y luego se realizó la detección con avidina-HRP. Se calcularon los títulos correspondientes al 50% de la inhibición como el valor inverso de la mayor dilución a la cual la unión a F RSV se inhibió al 50%. Como muestra la Figura 47, la inhibición de la unión de anticuerpos monoclonales específicos neutralizantes de F RSV a F RSV se vio incrementada con los sueros provenientes de ratas inmunizadas con la vacuna de F RSV en comparación con las ratas inmunizadas con FI-RSV o RSV-A2 vivo, y aumentó aún más en presencia de adyuvante.

Se comparó la avidez de los anticuerpos anti-RSV inducidos por inmunización con la vacuna de nanopartículas de F RSV en relación a la avidez de los anticuerpos anti-RSV inducidos por inmunización con FI-RSV. Se efectuaron ensayos ELISA directos en los cuales se incubaron diluciones en serie de los sueros de la rata del algodón en placas con antígeno RSV unido y se midieron los niveles de anticuerpo unido antes o después de efectuar el paso de lavado con urea 7 molar. Los anticuerpos en los sueros provenientes de los animales inmunizados con la vacuna de nanoparticulas de F RSV exhibieron una mayor avidez por RSV en comparación con los anticuerpos en los sueros de los animales inmunizados con FI-RSV (Figura 48). Un porcentaje mayor de los anticuerpos específicos de RSV en los sueros de los animales inmunizados con la vacuna tuvieron gran avidez tal como muestra la cantidad de anticuerpo unido antes y después de efectuar el lavado con urea (Figura 48 y Tabla 13).

Tabla 13. O.D. 450 y anticuerpos con elevado porcentaje de avidez en animales inmunizados con la vacuna de nanoparticulas de F RSV versus animales inmunizados con FI- RSV La descripción detallada anterior ha sido brindada solamente un entendimiento más claro y no deberían desprenderse limitaciones innecesarias a partir de la misma, en la medida que las modificaciones serán obvias para las personas versadas en el arte. No se admite que la información provista en la presente sea arte previo o relevante para las invenciones reivindicadas en la presente, o que cualquier publicación específica o implícitamente aludida sea arte previo.

A menos que se definan de manera contraria, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por la persona medianamente versada en el arte al cual esta invención pertenece.

Si bien la solicitud ha sido dividida en secciones para dirigir la atención del lector a las formas de realización específicas, dichas secciones no deberían considerarse como una división entre las formas de realización. Las enseñanzas de cada sección y las formas de realización descritas en las mismas son aplicables a otras secciones.

Si bien la invención ha sido descrita en relación con las formas de realización específicas de la misma, ha de entenderse que puede comprender otras modificaciones y que esta solicitud está destinada a cubrir cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo dichas desviaciones de la presente divulgación como quedan entendidas o son de práctica habitual dentro del arte al cual la invención pertenece y como puedan ser aplicadas a los rasgos esenciales establecidos en la presente con anterioridad y como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (76)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como prioridad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión (F) del virus respiratorio sincitial (RSV) caracterizada porque comprende al menos una modificación o mutación que incrementa la expresión de dicha proteína F del RSV en una célula huésped.

2. Una proteína F del RSV caracterizada porque comprende al menos una modificación o mutación que reduce la toxicidad celular de dicha proteína F del RSV en una célula huésped.

3. Una proteína F del RSV caracterizada porque comprende al menos una modificación o mutación que afianza las propiedades inmunogénicas de dicha proteína F del RSV en comparación con una proteína F del RSV sin modificar.

4. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha proteína F además comprende una sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácidos correspondiente al residuo de prolina 102 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

5. La proteína F del RSV de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque dicho residuo de prolina 102 es reemplazado con un residuo de alanina.

6. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, caracterizada porque además comprende una sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácidos correspondiente al residuo de isoleucina 379 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

7. La proteína F del RSV de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque dicho residuo de isoleucina 379 es reemplazado con un residuo de valina.

8. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizada porque además comprende una sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácidos correspondiente al residuo de metionina 447 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

9. La proteína F del RSV de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque dicho residuo de metionina 447 es reemplazado con un residuo de valina.

10. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque dicha proteina F del RSV asume una morfología de pirulí o lollipop.

11. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, caracterizada porque comprende una mutación que inactiva al menos un sitio de escisión de furina.

12. La proteína F del RSV de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque dicho sitio de escisión de furina es el sitio de escisión primario.

13. La proteina F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, caracterizada porque dicha inactivación de al menos un sitio de escisión de furina se logra al introducir al menos una sustitución de aminoácidos en las posiciones correspondientes a arginina 133, arginina 135 y arginina 136 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

14. La proteína F del RSV de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque al menos dos sustituciones de aminoácidos son introducidas en las posiciones correspondientes a arginina 133, arginina 135 y arginina 136 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

15. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14, caracterizada porque tres sustituciones de aminoácidos son introducidas en las posiciones correspondientes a arginina 133, arginina 135 y arginina 136 de la proteina F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

16. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque dicho residuo de arginina 133 es reemplazado con glutamina.

17. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizada porque dicho residuo de arginina 135 es reemplazado con glutamina.

18. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizada porque dicho residuo de arginina 136 es reemplazado con glutamina.

19. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reívindicaciones 4 a 18, caracterizada porque dicha proteína F del RSV comprende, además, al menos una modificación del sitio poli(A) críptico de F2.

20. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 19, caracterizada porque dicha proteína F del RSV comprende, además, una deleción en la mitad N-terminal del dominio de fusión correspondiente, aproximadamente, a los aminoácidos 137-146 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

21. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha modificación o mutación se selecciona entre el grupo que consiste en: (i) inactivación de al menos un sitio de escisión de furina; (ii) una modificación del sitio poli(A) críptico de F2; Y (iii) una deleción en la mitad N-terminal del dominio de fusión correspondiente, aproximadamente, a los aminoácidos 137-146 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

22. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha proteína F del RSV aloja al menos dos mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en: (i) al menos una sustitución de aminoácidos en las posiciones correspondientes a prolina 102, isoleucina 379 y metionina 447 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2); (ii) inactivación de al menos un sitio de escisión de furina; (iii) una modificación del sitio poli(A) críptico de F2; Y (iv) una deleción en la mitad N-terminal del dominio de fusión correspondiente, aproximadamente, a los aminoácidos 137-146 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO:

23. La proteina F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha proteina F del RSV aloja al menos tres mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en: (i) al menos una sustitución de aminoácidos en las posiciones correspondiente a prolina 102, isoleucina 379 y metionina 447 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2); (ii) inactivación de al menos un sitio de escisión de furina; (iii) una modificación del sitio poli(A) críptico de F2; Y (iv) una deleción en la mitad N-terminal del dominio de fusión correspondiente, aproximadamente, a los aminoácidos 137-146 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

24. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha proteína F del RSV aloja cuatro mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en: (i) al menos una sustitución de aminoácidos en las posiciones correspondientes a prolina 102, isoleucina 379 y metionina 447 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2); (ii) inactivación de al menos un sitio de escisión de furina; (iii) una modificación del sitio poli(A) críptico de F2; Y (iv) una deleción en la mitad N-terminal del dominio de fusión correspondiente, aproximadamente, a los aminoácidos 137-146 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

25. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizada porque dicha proteína F del RSV aloja al menos dos sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a prolina 102, isoleucina 379 y metionina 447 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

26. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizada porque dicha proteína F del RSV aloja tres sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a prolina 102, isoleucina 379 y metionina 447 de la proteína F del RSV de tipo salvaje (SEC ID NO: 2).

27. Una proteína F del RSV caracterizada porque es codificada por la secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 9.

28. Una proteina F del RSV caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 10.

29. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizada porque dicha proteína F del RSV exhibe expresión incrementada en una célula huésped en comparación con una proteína F del RSV de tipo salvaje.

30. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizada porque dicha proteína F del RSV exhibe propiedades inmunogénicas afianzadas en comparación con una proteína F del RSV de tipo salvaje.

31. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula eucariótica.

32. La proteína F del RSV de acuerdo con la reivindicación 31, caracterizada porque dicha célula eucariótica es una célula de insecto.

33. La proteína F del RSV de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizada porque dicha célula de insecto es una célula Sf9.

34. La proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, caracterizada porque dicha proteína F del RSV deriva de una cepa de RSV seleccionada entre el grupo que consiste en una cepa A del RSV humano, una cepa B del RSV humano, cepas del RSV bovino, y cepas del RSV aviar.

35. Una micela purificada caracterizada porque comprende una o más proteínas F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.

36. Una partícula de tipo viral (VLP, del inglés Virus-Like Partí ale) caracterizada porque comprende una proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.

37. La VLP de acuerdo con la reivindicación 36, caracterizada porque además comprende una proteina de matriz (M).

38. La VLP de acuerdo con la reivindicación 37 caracterizada porque dicha proteína M deriva de una cepa humana del RSV.

39. La VLP de acuerdo con la reivindicación 37, caracterizada porque dicha proteína M deriva de una cepa bovina del RSV.

40. La VLP de acuerdo con la reivindicación 37 caracterizada porque dicha proteína M es proteína MI de una del virus de la gripe.

41. La VLP de acuerdo con la reivindicación 40, caracterizada porque dicha cepa del virus de la gripe es una cepa del virus de la gripe aviar.

42. La VLP de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizada porque dicha cepa del virus de la gripe aviar es una cepa H5N1.

43. La VLP de acuerdo con la reivindicación 42, caracterizada porque dicha cepa H5N1 es A/Indonesia/5/05.

44. La VLP de acuerdo con la reivindicación 37, caracte izada porque dicha proteína M deriva de una cepa del Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV).

45. La VLP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 44, caracterizada porque además comprende la glicoproteína del RSV (G).

46. La VLP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 45, caracterizada porque además comprende la glicoproteína del RSV (SH).

47. La VLP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 46, caracterizada porque además comprende la proteína nucleocápsida del RSV (N).

48. La VLP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 47 caracterizada porque la VLP es expresada en una célula eucariótica bajo condiciones que permiten la formación de las VLPs.

49. La VLP de acuerdo con la reivindicación 49, caracterizada porque la célula eucariótica se selecciona entre el grupo que consiste en células de levaduras, insectos, anfibios, aves, mamíferos o plantas.

50. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende una proteina F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.

51. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende una micela purificada de acuerdo con la reivindicación 35.

52. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende una VLP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 49.

53. Una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende una proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizada porque la proteína F del RSV es capaz de producir una respuesta inmunitaria en un huésped.

54. Una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende una micela purificada de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizada porque la micela es capaz de producir una respuesta inmunitaria en un huésped.

55. Una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende una VLP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 49, caracterizada porque la VLP es capaz de producir una respuesta inmunitaria en un huésped.

56. Un kit caracterizado porque comprende una proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.

57. Un kit para inmunizar un sujeto humano contra una infección viral caracterizado porque comprende una micela purificada de acuerdo con la reivindicación 35.

58. Un kit para inmunizar un sujeto humano contra una infección viral caracterizado porque comprende una VLP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 49.

59. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 56, caracterizado porque la infección viral es una infección por RSV.

60. Un método para vacunar un mamífero contra una infección viral caracterizado porque comprende administrar la proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un sujeto humano.

61. Un método para vacunar un mamífero contra una infección viral caracterizado porque comprende administrar una micela purificada de acuerdo con la reivindicación 35 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un sujeto humano.

62. Un método para vacunar un mamífero contra una infección viral caracterizado porque comprende administrar una VLP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 49 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un sujeto humano.

63. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 60 a 62, caracterizado porque la formulación farmacéuticamente aceptable comprende un adyuvante.

64. El método de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizado porque el adyuvante es un liposoma no fosfolipídico.

65. Un método para generar una respuesta inmunitaria contra una infección viral caracterizado porque comprende administrar la proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un sujeto humano.

66. Un método para generar una respuesta inmunitaria contra una infección viral caracterizado porque comprende administrar una micela purificada de acuerdo con la reivindicación 35 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un sujeto humano.

67. Un método para generar una respuesta inmunitarla contra una infección viral caracterizado porque comprende administrar una VLP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 49 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un sujeto humano.

68. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica una proteina F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30.

69. Una célula aislada caracterizada porque comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 68.

70. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 68.

71. Un método para formar una proteina F del RSV, caracterizado porque comprende: (a) transformar una célula huésped para expresar un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 68; y (b) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que conduzcan a la producción de dicha proteina F del RSV.

72. Un método para formar una micela de proteina F del RSV, caracterizado porque comprende: (a) transformar una célula huésped para expresar un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 68; y (b) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que conduzcan a la producción de dicha micela de proteina F del RSV.

73. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 71 a 72, caracterizado porque dicha célula huésped es una célula de insecto.

74. El método de acuerdo con la reivindicación 73, caracterizado porque dicha célula de insecto es una célula de insecto transfectada con un vector de baculovirus que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 68.

75. Un método para prevenir la replicación viral en el pulmón de un animal, caracterizado porque comprende administrar una proteína F del RSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 a dicho animal.

76. El método de acuerdo con la reivindicación 75, caracterizado porque la proteína F del RSV se administra por vía intramuscular.