CN105087643A - 重组表达人呼吸道合胞病毒f1蛋白胞外区的方法及表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的方法及表达系统。本发明揭示了一种截短型的人呼吸道合胞病毒F1蛋白，其可成功地进行真核表达并实现大规模生产和纯化。本发明为针对呼吸道合胞病毒的疫苗、治疗性抗体研究提供了研制基础。

Description

重组表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的方法及表达系统

技术领域

本发明属于病毒学和生物工程领域；更具体地，本发明涉及重组表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的方法及表达系统。

背景技术

人呼吸道合胞病毒能够感染婴儿、小孩与老人等免疫力低下群体；引起上呼吸道感染，出现咳嗽、流涕与发烧等感冒样症状，并且还能造成婴幼儿的下呼吸道感染，引起细支气管炎、哮喘与肺炎等疾病，严重时危及生命。

因为该病毒能够诱导感染细胞形成合胞，故名为人呼吸道合胞病毒。F蛋白在感染过程中分裂形成F1与F2两个功能性亚单位，辅助病毒感染细胞；同时F蛋白决定该病毒主要的免疫原性。其中F1蛋白起着主要作用，从分子量上占据了80%的F蛋白，它包含有胞内区、胞膜区与胞外区，直接介导病毒与细胞的融合，胞外区包含了主要的F蛋白抗原决定簇，主导F蛋白与该病毒的免疫原性。

现有技术中，对于人呼吸道合胞病毒F1蛋白的重组表达主要集中在原核系统表达，但是原核表达系统的缺陷是易于产生包涵体，经历变复性步骤之后使得蛋白的三级结构产生破环。而应用真核系统进行表达的一般方法并不易于成功表达。因此，本领域有必要研究开发有利于表达F1蛋白(包含其抗原决定簇)的方法，从而为后续制备疫苗或抗病毒制剂奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供重组表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的方法及表达系统。

在本发明的第一方面，提供一种重组表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的方法，包括：利用果蝇S2细胞作为表达宿主，表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区；其中，所述的人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

在一个优选例中，利用果蝇S2细胞作为表达宿主表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的方法包括：

(1)提供表达载体，所述的表达载体中含有人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的表达盒；

(2)将(1)的表达载体转化果蝇S2细胞，培养转化有所述表达载体的重组果蝇S2细胞，从而表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区。

在另一优选例中，所述的表达盒中包括SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是果蝇表达载体，如pMT质粒，更具体地如pMT/BIP/V5-His-A。

在另一优选例中，培养转化有所述表达载体的重组果蝇S2细胞包括：以大于2×10⁶细胞/ml的接种量将重组果蝇S2细胞接种于培养基中，28±1℃培养，待细胞密度达到1×10⁷细胞/ml后，补加培养基；待细胞密度再次达到1×10⁷细胞/ml后，以诱导剂CdCl₂诱导培养。

在另一优选例中，诱导培养后还包括：收集细胞培养液，离心收集培养上清液，亲和层析纯化。

在本发明的另一方面，提供一种人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区。

在一个优选例中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:3中第2-1132位所示。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组果蝇S2细胞，其包含所述的表达载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、截短的hRSV-F1-1cDNAPCR扩增结果。

图2、截短的hRSV-F1-1基因与pMT/BIP/V5-His-A重组质粒PCR鉴定结果。

图3、转染截短的hRSV-F1-1的S2细胞培养上清的westernblot鉴定。

图4、转染截短的hRSV-F1-2的S2细胞培养上清的westernblot鉴定。第1道是Marker，第2道是转染细胞1没有诱导，第3道是转染细胞1有诱导，第4道是转染细胞2没有诱导，第5道是转染细胞2有诱导。

图5、稳转细胞株细胞培养上清液WesternBlot分析结果。

图6、左图：人截短的hRSV-F1-1蛋白大量纯化考马斯亮蓝结果(第1-2道是S2表达其他蛋白上清的纯化对照图，第3道是Marker1，第4道是截短的hRSV-F1-1的纯化对照图，第5道是Marker2)。右图；人截短的hRSV-F1-1蛋白大量纯化WesternBlot结果(泳道3为Marker，泳道1、2为纯化时往柱子加入洗脱缓冲液以后的第一管与第二管流出液(各2ml)各条带大小如图标示)。

具体实施方式

本发明揭示了一种截短型的人呼吸道合胞病毒F1蛋白的真核表达方法，使用本方法可以实现人呼吸道合胞病毒F1蛋白的大规模生产和纯化，为针对呼吸道合胞病毒的疫苗、治疗性抗体研究提供了研制基础。

如本文所用，所述的“截短型的人呼吸道合胞病毒F1蛋白”、“人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区”、“人呼吸道合胞病毒F1蛋白主要胞外区”、“hRSV-F1-1”可互换使用，均指具有SEQIDNO:4氨基酸序列的多肽。

本发明提供了人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区。鉴于现有技术中难以真核表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白的状况，本发明人进行了深入的研究，制备了多种人呼吸道合胞病毒F1蛋白的截短体的编码基因，本发明人意外地发现，编码SEQIDNO:4多肽的序列能够实现在果蝇S2细胞中成功表达，而比该序列更长的截短体基因则无法成功表达。

因此，本发明提供了编码所述的人呼吸道合胞病毒F1蛋白主要胞外区的分离的核酸，也可以是其互补链。编码本发明人呼吸道合胞病毒F1蛋白主要胞外区的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。

在获得了编码带有人呼吸道合胞病毒F1蛋白主要胞外区的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入果蝇S2细胞。最后通过培养转化后的细胞，通过分离纯化得到带有人呼吸道合胞病毒F1蛋白主要胞外区。

因此，本发明还提供了包含编码所述带有人呼吸道合胞病毒F1蛋白主要胞外区的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述带有人呼吸道合胞病毒F1蛋白主要胞外区的表达。“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于真核表达的载体，可参考如Pouwels等，克隆载体：实验室手册(Elsevier最新版)中所描述的。可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。在本发明的一种实施方式中，所述的载体为适用于转化果蝇S2细胞的载体。

此外，含有编码所述带有人呼吸道合胞病毒F1蛋白主要胞外区的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。在本发明中，所述的“重组细胞”是果蝇S2细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。

本发明提供了重组表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的方法，所述方法包括：利用果蝇S2细胞作为表达宿主，表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区。

对比诸如CHO等哺乳动物细胞表达系统，本发明提供的人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的真核表达系统可以方便的用于工业化大规模生产，具有产量高、过程监控容易、质量控制容易与成本低廉等优点。

对比诸如E.coli等原核表达系统，本发明提供的人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的真核表达系统得到的目的蛋白由于具有真核表达系统特有的糖基化修饰，与人呼吸道合胞病毒感染后子代病毒携带的F1蛋白拥有类似的天然构象，具有更好的生物学活性，能够为后续试验研究提供有力的支撑。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、人呼吸道合胞病毒截短F1蛋白cDNA的PCR扩增

1)根据NCBIGenBank核酸数据库提供的人呼吸道合胞病毒(hRSV)A2毒株基因组的基本信息：HumanrespiratorysyncytialvirusstrainA/WI/629-3/06-07，SequenceID:gb|JF920069.1，并获取其DNA序列。

2)从步骤1)获得的DNA序列中截取所需要的F1基因截短片段(相对于GenBank:JX198138.1提供的全长F1基因序列，截短片段位于全长核苷酸序列序列的第1946-3077位)，位于全长氨基酸序列的第153-529位)，获得相对应DNA序列；另外根据果蝇S2表达系统(DrosophialExpressionSystem)使用的表达载体pMT/BIP/V5-His-A(购自英骏公司)的多克隆位点的相应性质，选择合适的酶切位点；再以获取的序列为模板，加上选取的酶切位点，设计用于PCR的上下游引物，引物序列如下(注：下划线分别表示EcoRI和XholI酶切位点)：

正向引物：5’-CGGAATTCTGCTGTATCTAAGGTCCTGC-3’(SEQIDNO:5)；

反向引物：5’-CGCTCGAGAGTAGTTATCATGATATTTGTGGTG-3’(SEQIDNO:6)。

3)以从ATCC购得的人呼吸道合胞病毒标准株A2为模板，因为hRSV为逆转录病毒，借用逆转录获得cDNA；再利用Phusion高保真酶，结合已经设计的引物，以PCR方法获取截短的hRSV-F1-1基因片段，具体PCR体系配比与反应程序如下(参照《分子克隆实验指南》方法使用上述特异性引物对截短的hRSV-F1-1进行扩增)：

i.PCR体系总体积：50μl

ii.PCR程序：

4)PCR产物的检测采用琼脂糖凝胶电泳法进行，所用凝胶为1%琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL2,000DNAMarker(D501A)，电泳结果如图1所示。

5)再通过胶回收的方法回收提取目的基因片段，即截短的hRSV-F1-1回收产物。截短的hRSV-F1-1基因具有SEQIDNO:3所示序列，编码SEQIDNO:4所示的蛋白。

采用如前所述的方法，申请人还制备了截短的hRSV-F1-2基因产物，该基因具有SEQIDNO:1所示序列(位于全长F1因子氨基酸序列的第1892-3077位)，编码SEQIDNO:2所示的蛋白(位于全长F1因子氨基酸序列的第135-529位)。

实施例2、pMT/BIP/V5-His-A-截短的hRSV-F1-1/2重组表达质粒构建

1)利用EcoRI和XholI限制性内切酶分别酶切目的基因片段(前述获得的截短的hRSV-F1-1回收产物)与pMT/BIP/V5-His-A载体，具体体系如下：

(i)目的基因

(ii)pMT/BIP/V5-His-A载体

2)通过琼脂糖凝胶电泳与胶回收获得酶切好的截短的hRSV-F1-1或hRSV-F1-2基因与pMT/BIP/V5-His-A载体。

3)通过T4DNA连接酶将回收的截短的hRSV-F1-1基因或hRSV-F1-2与pMT/BIP/V5-His-A载体片段进行4℃过夜连接，具体体系如下：

4)将连接后体系转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，挑取转化截短的hRSV-F1-1基因片段的六个单克隆，利用琼脂糖凝胶电泳进行菌液PCR检测，结果如图2，可见获得成功转化的菌株。同样，也获得了转化截短的hRSV-F1-2基因片段的单克隆。

5)将前述获得的阳性克隆进行测序检查。通过测序结果与NCBI数据库进行BLAST，序列完全正确，说明载体构建成功，称为pMT/BIP/V5-His-A-截短hRSV-F1-1或pMT/BIP/V5-His-A-截短hRSV-F1-2。

实施例3、果蝇S2细胞稳转细胞系构建

1)转染用质粒准备

取前述经验证正确的转化有pMT/BIP/V5-His-A-截短hRSV-F1和pCoBlast质粒菌株(pCoBlast质粒(购自英俊公司)转化DH5α菌株)扩大培养(200ml)，37℃过夜培养后使用NucleoBondXtraMidiPlus(NucleoBondXtraMidiPlus)提取质粒，并使用NanoDrop测定DNA浓度。

同样，培养pMT/BIP/V5-His-A-截短hRSV-F1-2的重组菌株，提取质粒。

2)转染试剂配制

参照DrosophilaExpressionSystem提供的Protocol和磷酸钙转染真核细胞Protocol准备以下溶液：2XHEPESBufferedSaline(50mMHEPES，1.5mMNa₂HPO₄，280mMNaCl，pH7.1)；2.5MCaCl₂溶液，ddH₂O。

3)转染细胞准备

果蝇S2细胞用六孔板做转染，转染前一天，准备状态好的果蝇S2细胞，2-3×10⁶个/孔S2细胞铺于六孔板中，终体积为3ml，28℃过夜培养。

4)转染

细胞铺板18-20小时后，进行磷酸钙转染。

5)换液

转染18-24h后，将六孔板内的细胞吹打下来转移至15ml离心管内，先用新鲜培养液洗2遍，再加入新鲜培养液，转入新的六孔板内(也可以将两个孔转移至一个25cm²带滤膜细胞培养瓶)。

6)筛选

转染48h后，加入100×Blasticidin，每孔30μl(浓度为25μg/ml)。每天观察细胞状态，视细胞密度等适当补加新鲜培养液。直到Mock组的细胞全部死完，若转染后有成团存在的活细胞，说明转染的pCoBlast转染成功。转染成功的细胞继续用含Blasticidin的培养液培养，直至活细胞数量达到一定的规模。将活细胞转到25cm²的T-flask里面培养。

7)鉴定是否有表达

通过分离具有抗性的成规模的分别转染截短的hRSV-F1-1或hRSV-F1-2的S2细胞培养上清，然后通过westernblot进行鉴定，发现只有转染截短的hRSV-F1-1的S2细胞能够表达蛋白如图3，而在转染hRSV-F1-2的S2细胞上清中无法检测到特异性条带如图4。

8)分离稳转株

利用有限稀释法，将具有抗性的稳定转染两种质粒后S2细胞从中分离出来。

9)鉴定

待活细胞长成规模，并且扩大培养到25cm²T-flask后，加适量诱导剂(200×CdCl₂)诱导目的蛋白表达，诱导4天后通过离心收取上清，并通过TCA沉淀的方法浓缩上清中的蛋白质，再通过WesternBlot方法分析目的蛋白表达，选择目的蛋白表达相对高的单克隆作为稳转细胞株。

10)筛选结果分析

通过WesternBlot方法分析，获得稳定表达人截短的hRSV-F1-1蛋白的细胞株，通过有限稀释一共得到七株能够稳定存活的细胞，其中六株能够表达截短的hRSV-F1蛋白(约为49KDa)。

WesternBlot使用抗体：一抗：His-Tag(2A8)MousemAb(Abmart，M20001S)；二抗：Anti-MouseIgG(H+L)Antibody，HumanSerumandandPeroxidaseLabeled(KPL，074-1806)。

如图5，从WesternBlot结果分析，人截短的hRSV-F1蛋白分泌表达于细胞培养液中，条带大小约49kD，与预测的蛋白大小接近。

通过WesternBlot试验鉴定，在得到的七株能够稳定传代的抗性稳转细胞株中，一共有六株细胞具有分泌表达人截短的hRSV-F1蛋白的特性，其中2、5与6号细胞表达量较高，可以作为放大表达纯化的稳转细胞株。

实施例4、人截短的hRSV-F1-1蛋白大量诱导表达及纯化

1)大量诱导表达

取步骤3中得到的稳定转染细胞株6号扩大培养，从25cm²T-Flask转移至75mlFlask，待细胞密度达到1×10⁷细胞/ml后，将两个75cm²T-Flask的总细胞去接种至3LSpinnerFlask中，里面加有300ml培养基，接种细胞密度应大于2×10⁶细胞/ml。28℃培养三天后，对转瓶中细胞进行计数，待细胞密度达到1×10⁷细胞/ml后，向转瓶中补加培养基至500ml。28℃培养，每天计数，待细胞密度达到1×10⁷细胞/ml后，向其中加入诱导剂(200×CdCl₂)。3-4后天离心收集细胞培养液。

2)培养液浓缩

取上述细胞培养液4℃，8000rpm/min离心15min收集细胞培养上清液，0.45μm滤膜过滤后向培养上清液中加入蛋白酶抑制剂PMSF，使终浓度为1mM。然后利用Millipore公司30KDa50ml浓缩管进行离心浓缩，一般500ml样品用六只管子。

500ml浓缩到最后体积为50ml左右。

3)蛋白纯化

使用GE公司HisGraviTrapColumn，通过亲和层析的方法对人截短的hRSV-F1-1蛋白进行纯化。纯化过程如下：HisGraviTrap预装柱→10ml纯水清洗→10ml结合缓冲液平衡→上样→10ml洗涤缓冲液清洗→10ml洗提缓冲液洗脱，每1ml流出液收集一管→10ml纯水清洗→10ml20%乙醇清洗→5ml20%乙醇柱子置4℃储存。纯化后收集的洗脱液可使用超滤管(截留分子量30KDa)浓缩。

4)纯化结果分析

图6所示为人截短的hRSV-F1-1蛋白稳转细胞株大量诱导表达及纯化结果，其中左边图为考马斯亮蓝染色结果；右边图为WesternBlot结果。

5)纯化后蛋白质定量

根据HisGraviTrapColumn与亲和层析纯化方法特性，结合每次收集的加入洗脱缓冲液后的流出液的体积，决定对前10ml左右的流出液采用Bradford蛋白定量技术进行定量试验，结果显示每升细胞培养上清能得到10mg人截短的hRSV-F1-1蛋白(10mg/L)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种重组表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的方法，其特征在于，包括：利用果蝇S2细胞作为表达宿主，表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区；其中，所述的人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用果蝇S2细胞作为表达宿主表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的方法包括：

(1)提供表达载体，所述的表达载体中含有人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区的表达盒；

(2)将(1)的表达载体转化果蝇S2细胞，培养转化有所述表达载体的重组果蝇S2细胞，从而表达人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达盒中包括SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，培养转化有所述表达载体的重组果蝇S2细胞包括：

以大于2×10⁶细胞/ml的接种量将重组果蝇S2细胞接种于培养基中，28±1℃培养，待细胞密度达到1×10⁷细胞/ml后，补加培养基；待细胞密度再次达到1×10⁷细胞/ml后，以诱导剂CdCl₂诱导培养。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，诱导培养后还包括：收集细胞培养液，离心收集培养上清液，亲和层析纯化。

6.一种人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

7.一种多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求6所述的人呼吸道合胞病毒F1蛋白胞外区。

8.如权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:3中第2-1132位所示。

9.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求7或8所述的多核苷酸。

10.一种重组果蝇S2细胞，其特征在于，其包含权利要求9所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求7或8所述的多核苷酸。