CN117186246B - 一种重组纤连蛋白Pro.FN及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组纤连蛋白Pro.FN1和Pro.FN2，还公开了其制备方法和应用。本发明通过将胶原结合位点与纤维蛋白与肝素结合位点连接，形成新的重组纤连蛋白，实现重组纤连蛋白的可溶性表达，也有助于纤连蛋白与胶原蛋白结合，解决了原核表达系易形成包涵体的问题。构建的重组纤连蛋白具有良好的生物学活性。
Description
技术领域
本发明涉及重组纤连蛋白Pro.FN1、Pro.FN2及其制备方法和应用，属于蛋白表达技术领域。
背景技术
天然纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种广泛存在于血液、体液及各种组织中的高分子糖蛋白，分子质量为450ku，由两个分子质量为220ku的亚基通过链间二硫键连接而成的二聚体。整个分子形状是由两条相似的A链及B链组成，呈V形。其亚基有6个致密的球状体。它既是细胞活动过程中的调节因子，也是维持和指导组织结构和ECM(细胞外基质)组成的重要支架蛋白，具有生长因子的作用。纤连蛋白是细胞外基质的重要组成部分，通过与细胞表面受体及细胞外基质分子的相互作用，促进细胞粘附、迁移，促进创伤修复，因此，纤连蛋白在医学、美容、护肤领域有广泛的应用前景。
目前FN的获得主要通过两条途径：一是从生物的组织细胞或体液中提取；二是运用基因工程技术构建表达载体，利用宿主表达重组FN。由于天然FN(氨基酸序列的NCBI编号为9606，网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？lvl＝0&id＝9606)分子量大，全序列表达可行性低，主要是选取FN不同功能的结构域进行表达或组合表达，以获得具有不同功能的重组FN。天然提纯FN工艺复杂、成本高，且产品分子量大使其推广应用受到了限制。而利用基因工程技术表达外源基因已成为获取目的蛋白的高效途径之一，根据表达载体和宿主菌的不同，主要分为原核表达和真核表达。原核表达系统虽成本低廉，但该系统存在容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低等缺陷，而本发明其中的一种重组纤连蛋白是以可溶性蛋白形式表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组纤连蛋白Pro.FN。
本发明采用的技术方案：
一种重组纤连蛋白Pro.FN1，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
前述的重组纤连蛋白Pro.FN1的编码基因，优选的，其序列如SEQ ID No.1所示。
前述的重组纤连蛋白Pro.FN1的表达载体。
前述的重组纤连蛋白Pro.FN1的表达宿主菌。
前述的重组纤连蛋白Pro.FN1的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)构建前述的表达载体，将其转化到表达宿主菌中；
(2)培养表达宿主菌，诱导重组纤连蛋白Pro.FN1表达；
(3)纯化表达产物，得到重组纤连蛋白Pro.FN1。
本发明还公开了一种重组纤连蛋白Pro.FN2，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
前述的重组纤连蛋白Pro.FN2的编码基因，优选的，其序列如SEQ ID No.7所示。
前述的重组纤连蛋白Pro.FN2的表达载体。
前述的重组纤连蛋白Pro.FN2的表达宿主菌。
前述的重组纤连蛋白Pro.FN1或Pro.FN2在辅助细胞培养中的应用，可以将其添加到细胞培养基中，以促进细胞增殖和贴壁。
本发明的有益效果：
本发明通过将胶原结合位点与纤维蛋白与肝素结合位点连接，形成新的重组纤连蛋白，实现重组纤连蛋白的可溶性表达，也有助于纤连蛋白与胶原蛋白结合，解决了原核表达系易形成包涵体的问题。构建的重组纤连蛋白具有良好的生物学活性。
附图说明
图1为pet30a-Pro.FN1-His6的质粒图谱；
图2为pet30a-Pro.FN2-His6的质粒图谱；
图3为重组纤连蛋白诱导表达结果SDS-PAGE电泳图：M是分子量Marker；
第1泳道是DE3-pet30a-Pro.FN1-His6菌株不诱导的上清；
第2泳道是DE3-pet30a-Pro.FN1-His6菌株不诱导的沉淀；
第3泳道是DE3-pet30a-Pro.FN1-His6菌株诱导的上清；
第4泳道是DE3-pet30a-Pro.FN1-His6菌株诱导的沉淀；
第5泳道是DE3-pet30a-Pro.FN2-His6菌株不诱导的上清；
第6泳道是DE3-pet30a-Pro.FN2-His6菌株不诱导的沉淀；
第7泳道是DE3-pet30a-Pro.FN2-His6菌株诱导的上清；
第8泳道是DE3-pet30a-Pro.FN2-His6菌株诱导的沉淀。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：重组纤连蛋白的设计和制备
1.构建FN基因表达载体：
本实施例构建了一种重组纤连蛋白。
从人源纤连蛋白片段中筛选出一段胶原结合位点，命名为Pro.FN1，其氨基酸序列如Seq ID NO.2所示，结合位点的核心区域的核苷酸序列如Seq ID NO.3所示，优化过的编码核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。
筛选出人源纤连蛋白的纤维蛋白与肝素结合位点的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示，该结合位点的核心区域的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示。
将人源纤连蛋白的胶原结合位点与人源纤连蛋白的纤维蛋白与肝素结合位点通过linker连接，得到的重组蛋白命名为Pro.FN2，其氨基酸序列如Seq ID NO.6所示，编码核苷酸序列如Seq ID NO.7所示。
将序列7委托北京六合华大基因科技有限公司进行密码子优化与基因片段合成，并将合成后的基因片段插入pMV载体中，得到对应的重组质粒pMV-Pro.FN2-His6。
利用引物1：TTTAAGAAGGAGATATACATatgccacatccacaaccgc(SEQ ID NO.8)和引物2：TTGTTAGCAGCCGGATCTCAgtgatggtggtggtggtga(SEQ ID NO.9)，以pMV-Pro.FN2-His6质粒为模板扩增得到重组纤连蛋白Pro.FN1的编码基因，纯化后，利用Gibson assembly技术无缝克隆到pet30a表达载体上，得到重组pet30a-Pro.FN1-His6表达质粒，图谱如图1所示。经PCR和DNA测序验证正确后提取质粒保存。
利用引物1：TTTAAGAAGGAGATATACATatgccacatccacaaccgc(SEQ ID NO.8)和引物3：ATGCTGCTGGCTACCCTGTGgtgatggtggtggtggtga(SEQ ID NO.10)，以pMV-Pro.FN2-His6质粒为模板扩增重组纤连蛋白Pro.FN1的编码基因，纯化后，利用Gibson assembly技术无缝克隆到pet30a表达载体上，得到重组pet30a-Pro.FN2-His6表达质粒，其图谱如图2所示。经PCR和DNA测序验证正确后提取质粒保存。
2重组表达质粒的转化
将上述两组重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌，具体过程为：①取1μL的该质粒于100μL的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min；②将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min；③向该混合物中加入500μL无抗性的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)，37℃，220rpm条件下培养1h；④取200μL该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/mL卡那霉素)上；⑤将平板倒置培养于37℃恒温箱中，培养约16h，待长出清晰可见的单菌落。
实施例2：重组纤连蛋白的诱导表达
从上述LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程单菌落，置于含有卡那霉素抗生素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h；
按照1％接种量转接至20ml LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h；
按照5％接种量转接至30ml LB液体培养基中，37℃、220rpm培养，OD 600值达到0.6～0.8时，加入0.5mM IPTG在18℃进行诱导表达20h。
分别取未诱导菌液、诱导完成的菌液30mL，4℃、12000×g、10min离心收集菌体；10ml PBS重悬菌体后4℃、12000×g、10min离心收集菌体；再取30ml PBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎；
超声完成后，取1ml破碎液4℃、12000×g、2min离心分离上清及沉淀，用1ml PBS复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各80μl，加入5×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况，电泳结果如图3所示。由图3可知，pet30a-Pro.FN2-His6重组蛋白能够在大肠肝菌种以可溶性的形式成功表达，而pet30a-Pro.FN1-His6是以不可溶的包涵体形式存在。
实施例3：重组纤连蛋白的纯化
将实施例2中筛选得到的含重组质粒pet30a-Pro.FN1-His6与pet30a-Pro.FN2-His6的纤连蛋白高表达菌种进行扩大培养与纯化操作；
将单菌落接种至50mlLB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h；
按照5％接种量转接至1L LB液体培养基中，37℃、220rpm培养4h后，加入0.5mMIPTG在18℃进行诱导表达20h。
将上述发酵液，经离子交换、亲和层析、盐析后，纯化得到重组纤连蛋白，具体为：
将发酵液离心收集菌体，按照菌液：破碎液＝1：2；所述破碎液为1*PBS缓冲液；
重悬后使用高压均质仪破碎菌悬液；其中，高压均质仪机先用200bas压力破碎，再用750bas破碎两次；
(3)将破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃、12000rpm、30min，离心收集上清；
(4)将离心后的上清使用抽滤装置进行过滤，经0.22μm滤膜过滤，得到重组纤连蛋白原液；
(5)采用Ni柱亲和层析的方法对重组人纤连蛋白进行纯化，选用层析填料为NiSeplife FF(TED)，平衡缓冲液A：(20mM Tris、500mM NaCl、20mM imidazole)，洗脱缓冲液B：(20mM Tris、500mM NaCl、500mM imidazole)。采用阶段梯度洗脱。洗脱梯度如表1所示：
表1洗脱梯度
| 流速 | 比例 | 柱体积 | 备注 |
| 1ml/min | 0％B | 5 | 平衡 |
| 1ml/min | 5％B | 3 | 洗杂 |
| 1ml/min | 12％B | 4 | 洗杂 |
| 1ml/min | 50％B | 4 | 目的条带 |
| 1ml/min | 100％B | 4 | - |
(6)将上一步收集的目的产物，按1:1000比例加入凝血酶(thrombin)，25℃，反应16h。将反应后产物进行Ni柱纯化，第一步：平衡柱子：流速1ml/min，其中平衡缓冲液A：(20mM Tris、500mM NaCl、20mM imidazole)，第二步：上样，上样流速0.5ml/min。第三步：收集样品，得到纯化后的重组纤连蛋白。
实施例4：重组纤连蛋白的生物活性检测
重组纤连蛋白促细胞增殖活性测定：
依据纤连蛋白对小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/c 3T3细胞)的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3细胞的生长状况因纤连蛋白生物学活性的不同而不同，以此检测纤连蛋白的生物学活性。具体测定过程为：
(1)BALB/c 3T3细胞接种于96孔细胞培养板中(5000个细胞/孔)，37℃，5％ CO2细胞培养箱培养24h；
(2)换用DMEM无血清培养基继续培养12h；
(3)分别加入低浓度和高浓度实验组重组纤连蛋白Pro.FN2(SEQ ID NO.7)和阳性对照组重组纤连蛋白Pro.FN1(SEQ ID NO.1)的表达纯化组分以及PBS(阴性对照组)，低浓度是指培养基中的蛋白终浓度1μg/ml，高浓度是指培养基中的蛋白终浓度10μg/ml，继续培养48～72h；
(4)每孔加入10μL CCK-8试剂，37℃，5％ CO2细胞培养箱孵育2h后取出；
(5)用酶标仪读取96孔板在450nm和630nm的吸光值，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果。
相对促细胞增殖率＝(实验组450nm吸光值-阴性对照组450nm吸光值)/阴性对照组450nm吸光值×100％。结果如表2所示。
表2：相对促细胞增值率检测结果
实验结果表明，本发明的重组纤连蛋白pet30a-Pro.FN1-His6与pet30a-Pro.FN2-His6均可促进细胞增值，pet30a-Pro.FN2-His6更能有效的促进细胞增值。
2.重组纤连蛋白促细胞粘附活性测定
所述细胞粘附活性测定的具体过程为：
(1)实验组Pro.FN2和阳性对照组Pro.FN1蛋白溶液浓度为1μg/ml(低浓度)和10μg/ml(高浓度)，96孔细胞培养板每孔加入50μL样品溶液，37℃放置2h，对照孔加50μLPBS。
(2)BALB/c 3T3细胞用胰酶消化，计数，每孔加入5×104个细胞。37℃CO2培养箱培养2h；
(3)PBS洗3遍，洗去未粘附的细胞，再加入200μLDMEM培养基；
(4)每孔加入10μL CCK-8试剂，37℃，5％ CO2细胞培养箱孵育2h后取出；
(5)用酶标仪读取96孔板在450nm和630nm的吸光值，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果；
(6)促细胞粘附率＝(实验组450nm吸光值-阴性对照组450nm吸光值)/阴性对照组450nm吸光值×100％。结果如表3所示。
表3促细胞黏附率检测结果
| 组别 | 孔数 | 促细胞黏附率(％) |
| 低浓度实验组 | 6 | 19.8±1.7 |
| 高浓度实验组 | 6 | 36.7±1.9 |
| 低浓度阳性对照组 | 6 | 12.8±1.7 |
| 高浓度阳性对照组 | 6 | 21.2±1.5 |
实验结果表明，本发明的重组纤连蛋白pet30a-Pro.FN1-His6与pet30a-Pro.FN2-His6均可促进细胞黏附，pet30a-Pro.FN2-His6更能有效的促进细胞黏附。
Claims (10)
1.一种重组纤连蛋白Pro.FN1，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的重组纤连蛋白Pro.FN1的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其序列如SEQ ID No.1所示。
4.权利要求1所述的重组纤连蛋白Pro.FN1的表达载体。
5.权利要求1所述的重组纤连蛋白Pro.FN1的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)构建权利要求4所述的表达载体，将其转化到表达宿主菌中；
(2)培养表达宿主菌，诱导重组纤连蛋白Pro.FN1表达；
(3)纯化表达产物，得到权利要求1所述的重组纤连蛋白Pro.FN1。
6.一种重组纤连蛋白Pro.FN2，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
7.权利要求6所述的重组纤连蛋白Pro.FN2的编码基因。
8.根据权利要求7所述的编码基因，其特征在于其序列如SEQ ID No.10所示。
9.权利要求6所述的重组纤连蛋白Pro.FN2的表达载体。
10.权利要求1所述的重组纤连蛋白Pro.FN1或权利要求6所述的重组纤连蛋白Pro.FN2在辅助细胞培养中的应用。
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