CN107723287B - 一种增强丝蛋白生产制备的表达系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强丝蛋白生产制备的表达系统，所述表达系统含有蛋白的编码序列和突变型tRNA。所述蛋白可以是序列为SEQ ID NO:8的丝蛋白，所述突变型tRNA序列为SEQ ID NO:18所示。本发明表达的丝蛋白力学性质优异，本发明的表达系统有益于增强丝蛋白表达，有助于制造丝蛋白纤维材料。所述突变型tRNA能够显著上调宿主细胞中基因编码区含有多个稀有密码子的蛋白，特别是含有多个稀有密码子的丝蛋白的表达；其效果优于天然识别稀有密码子的tRNA。在此基础上，本发明还提供了利用本发明的突变型tRNA上调宿主细胞中蛋白表达的方法。

Description

一种增强丝蛋白生产制备的表达系统
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。具体地说，本发明涉及一种突变型tRNA及其制备方法以及在上调蛋白表达中的应用。
背景技术
在微生物代谢改造中，人们希望尽可能提高特定蛋白的表达。增强表达的一条途径是增加编码基因的拷贝数或者选择高强度启动子。然而如果目的基因编码区含有多个稀有密码子，由于缺乏某几种tRNA会直接导致翻译错误或中止(任增亮,堵国成,陈坚等.,大肠杆菌高效表达重组蛋白策略[J].中国生物工程杂志,2007,27(9):103-109)。
目前，主要采用以下几种方法来降低这种不利影响：第一，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列下改造碱基序列，使密码子尽量满足宿主菌较高使用率的密码子。第二，可以选择表达低利用率的稀有密码子的宿主菌，如Rosetta(DE3)做宿主；第三,可以表达编码tRNA的基因，使外源蛋白得到高效表达。上述方法有各自的优缺点：第一种方法中，如果同时对多个基因或者染色体上的基因进行密码子优化，那么研究者需要大量工作对其进行代谢改造；第二种方法中，表达宿主受到限制；第三种方法中，在表达编码tRNA的基因后，如何进一步增强表达编码tRNA基因后的蛋白表达，尚不清楚。
因此，本领域急需能够识别稀有密码子，并且能够在宿主细胞中切实上调蛋白表达的tRNA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够识别稀有密码子，并且能够在宿主细胞中切实上调蛋白表达的tRNA以及包含所述tRNA的表达系统和宿主细胞。
本发明的目的还在于提供利用本发明的突变型tRNA上调宿主细胞中蛋白表达的方法。
在第一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸为选自下组的序列：
a)如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；
b)将SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，在反密码子区外经过取代、插入或缺失1-10个碱基，优选的1-5个碱基，更优选的1-3个碱基形成的、并基本具有a)所述核苷酸序列的功能的多核苷酸序列；
c)与a)-b)任意所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在优选的实施方式中，所述分离的多核苷酸是突变型tRNA。
在优选的实施方式中，所述分离的多核苷酸衍生自埃希氏菌属细菌；优选地，衍生自大肠杆菌。
在第二方面，本发明提供一种表达系统，其包含本发明第一方面所述的多核苷酸和编码待表达的蛋白的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述编码待表达的蛋白的核苷酸序列中含有两个以上的稀有密码子GGA。
在具体的实施方式中，所述编码待表达的蛋白的核苷酸序列为选自下组的序列：
a)如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；
b)将SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列，经过取代、插入或缺失1-10个碱基，优选的1-5个碱基，更优选的1-3个碱基形成的、并基本具有a)所述核苷酸序列的功能的多核苷酸序列；
c)与a)-b)任意所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在第三方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明第一方面所述的多核苷酸或第二方面所述的表达系统。
在具体的实施方式中，所述的宿主细胞属于埃希氏菌属(Escherichia)。
在具体的实施方式中，所述的宿主细胞属于大肠杆菌(Escherichia coli)。
在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的表达系统在上调宿主细胞中蛋白表达的用途。
在第五方面，本发明提供一种上调宿主细胞中蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：
1)培养本发明第三方面所述的宿主细胞；和
2)从1)的培养体系中获得表达上调的蛋白。
在优选的实施方式中，所述宿主细胞是埃希氏菌属细菌；优选地，是大肠杆菌。
在优选的实施方式中，所述蛋白可以是宿主细胞的内源性蛋白或外源性蛋白。
在优选的实施方式中，所述蛋白的编码序列中包含两个以上的稀有密码子GGA。
在优选的实施方式中，所述蛋白是氨基酸序列为SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：16的蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了表达glyT和本发明的glyVm对荧光值的影响；其中，1：E1的单位菌浓荧光值；2：E2单位菌浓荧光值；和3：E3单位菌浓荧光值。
图2显示了表达glyT和本发明的glyVm对荧光值的影响；其中，1：E4的单位菌浓荧光值；2：E5单位菌浓荧光值；和3：E6单位菌浓荧光值。
图3显示了SDS-PAGE验证glyT和glyVm回补对蛋白表达的影响；其中，1：Marker；2：E4全菌蛋白；3：E5全菌蛋白；4：E6全菌蛋白。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将识别常用密码子的tRNA的反密码子区域进行改造，使得改造后的突变型tRNA能够识别稀有密码子，这种突变型tRNA能够有效上调宿主细胞中蛋白的表达；发明人进一步发现，这种突变型tRNA上调宿主细胞中蛋白表达的效果甚至远比能识别稀有密码子的天然tRNA更好。在此基础上完成了本发明。
tRNA(转运RNA)
本文所用的术语“转运RNA(Transfer Ribonucleic Acid，tRNA)”具有本领域技术人员常规理解的意义，其是指是具有携带并转运氨基酸功能的小分子核糖核酸。tRNA主要是携带氨基酸，在mRNA指导下合成蛋白质；即，以mRNA为模板，将其中具有密码意义的核苷酸顺序翻译成蛋白质中的氨基酸顺序。
tRNA与mRNA是通过反密码子与密码子相互作用而发生关系的，即，tRNA靠反密码子与mRNA识别。一种tRNA只能携带一种氨基酸，但一种氨基酸可被不止一种tRNA携带。在生物体内，DNA分子上的tRNA基因经过转录生成tRNA前体，然后被加工成成熟的tRNA。
密码子
本文所用的术语“密码子”具有本领域技术人员常规理解的意义，其是指信使RNA分子中每相邻的三个核苷酸编成一组，在蛋白质合成时，代表某一种氨基酸的规律。信使RNA在细胞中能决定蛋白质分子中的氨基酸种类和排列次序。信使RNA分子上的三个碱基决定一个氨基酸。
遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。
本发明的突变型tRNA
在大肠杆菌中，识别甘氨酸的稀有密码子GGA的tRNA的编码基因是glyT。本发明人发现通过改造glyV中反密码子区碱基，将glyV的GCC(glyV序列为SEQ ID NO:1，GCC碱基为其的34-36位碱基)突变为TCC，得到glyV突变体，简称glyVm。这种突变体能够上调宿主细胞中蛋白的表达，其效果甚至优于天然识别甘氨酸的稀有密码子GGA的基因glyT。
因此，为克服因宿主细胞缺乏针对目的基因编码区中所含稀有密码子的tRNA导致翻译错误或中止的缺陷，本发明提供了这样一种突变型tRNA，其反密码子区域碱基为TCC。本发明的突变型tRNA衍生自埃希氏菌属细菌；优选地，本发明的突变型tRNA衍生自大肠杆菌。在具体的实施方式中，本发明的突变型tRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
在本发明的具体的突变型tRNA的基础上，本领域技术人员不难对其作进一步的突变，例如，在反密码子区外作适当突变，从而得到基本具有SEQ ID NO:18所示核苷酸序列的功能的突变体。例如，将SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，在反密码子区外经过取代、插入或缺失1-10个碱基，优选的1-5个碱基，更优选1-3个碱基形成的、并基本具有SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的功能的多核苷酸序列；或者，本领域技术人员也不难获得与SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列或经过上述突变得到的基本具有SEQ ID NO：18所示核苷酸序列的功能的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
此外，本领域技术人员应该理解，本文所用的“本发明的突变型tRNA”、“本发明的多核苷酸”或“分离的多核苷酸”等术语具有相同的含义。而本文所用的术语，“基本具有所述核苷酸序列的功能”也具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指突变后的核苷酸序列能够具有与未突变的原始核苷酸序列相同或相似的功能或活性。例如，突变后的核苷酸序列具有70％、80％、90％、95％、98％、99％的原始核苷酸序列的功能或活性。
在本发明的突变型tRNA的基础上，本发明提供编码所述突变型tRNA的核苷酸序列；以及一种表达系统，其包含本发明的突变型tRNA或编码该突变型tRNA的核苷酸序列以及编码待表达的蛋白的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，本发明的“编码待表达的蛋白的核苷酸序列”是指所述序列中含有两个或两个以上的稀有密码子GGA的编码核苷酸序列。在优选的实施方式中，本发明的“待表达的蛋白”包括但不限于编码基因具有55个稀有密码子GGA的蚕丝蛋白(序列为SEQID NO：8)，编码基因具有2个稀有密码子GGA的绿色荧光蛋白(序列为SEQ ID NO：16)。
基于本发明的内容，本领域技术人员知晓，上述的蛋白可以是宿主细胞的内源性蛋白或外源性蛋白。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含本发明的突变型tRNA或编码所述突变型tRNA的核苷酸序列或本发明的表达系统。在具体的实施方式中，所述宿主细胞是埃希氏菌属细菌；优选大肠杆菌。
本发明的埃希氏菌和大肠杆菌可以使用在Neidhardt等(Neidhardt，F.C.等，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，American Society forMicrobiology，Washington D.C.，1208，表1)中报道的埃希氏菌属细菌，例如大肠杆菌。大肠杆菌野生型菌株的实例包括，但不限于，K12菌株和其衍生物、MG1655菌株(ATCCNo.47076)，和W3110菌株(ATCC No.27325)。这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United States of America)获得。
基于本发明的内容，本领域技术人员可以知晓，本发明的突变型tRNA、编码所述突变型tRNA的核苷酸序列、本发明的表达系统或本发明的宿主细胞可以用于上调蛋白的表达。在具体的实施方式中，所述用途是在埃希氏菌属细菌；优选地，在大肠杆菌中上调蛋白的表达。
本发明的上调宿主细胞中蛋白表达的方法包括以下步骤：
1)培养本发明的宿主细胞；和
2)从1)的培养体系中获得表达上调的蛋白。
在具体的实施方式中，所述宿主细胞是埃希氏菌属细菌；优选地，是大肠杆菌。
本发明的优点
1.本发明的突变型tRNA能够显著上调宿主细胞中蛋白的表达，特别是基因编码区含有多个稀有密码子的蛋白；
2.本发明的突变型tRNA上调宿主细胞中蛋白的表达的效果优于天然识别稀有密码子的tRNA；和
3.本发明的突变型tRNA对于基因编码区仅含有两个GGA稀有密码子的蛋白也具备显著的上调作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.pACYC-tRNAT和pACYC-tRNAVm的构建
人工合成含有glyV突变体的基因片段(序列为SEQ ID NO:2，该序列含有glyV突变体序列、表达元件以及构建载体所需的碱基序列，其中glyV突变体序列为SEQ ID NO:18)，命名为含有glyVm的基因片段。以5’-gaaccgacgaccgggtcgaa-3’(SEQ ID NO:3)和5’-agggcagggtcgttaaatag-3’(SEQ ID NO:4)为引物，以质粒pACYC184(BioVector,北京)为模板，扩增得到约4.2kb片段,经过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，得到的核酸片段命名为pACYC184扩增片段。利用载体构建试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme，南京)，根据试剂盒说明书步骤，将上述2个片段，pACYC184扩增片段和人工合成含有glyVm的基因片段，重组形成完整质粒，得到的质粒命名为pACYC-tRNAVm。
人工合成含有glyT的基因片段(序列SEQ ID NO:5，该序列含有glyT基因序列、表达元件以及构建载体所需的碱基序列，其中glyT基因序列为SEQ ID NO:6)，命名为含有glyT的基因片段。利用载体构建试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme，南京)，根据试剂盒标准步骤，将上述2个片段，pACYC184扩增片段和人工合成含有glyT的基因片段，重组形成完整质粒，得到的质粒命名为pACYC-tRNAT。
实施例2.融合蛋白表达质粒pBAD-GX55-GFP的构建
待检测的目的蛋白序列为蚕丝蛋白序列(简称GX55)，GX55序列含有55个稀有密码子GGA，GC含量60％。增强型荧光蛋白GFP作为信号蛋白，位于蚕丝蛋白下游融合表达，通过荧光进行方便快速的检测。
人工合成含有蛋白GX55的基因序列(序列为SEQ ID NO:7，该序列含有GX55编码基因序列、表达元件以及构建载体所需的碱基序列，其中GX55基因的核酸序列为SEQ ID NO:8，基因编码蛋白序列为SEQ NO 9)，命名为含有GX55基因的片段。人工合成含有黄色荧光蛋白GFP基因序列的片段(序列为：SEQ ID NO:10，该序列含有GFP编码基因序列、表达元件以及构建载体所需的碱基序列，其中编码GFP蛋白的核酸序列为SEQ ID NO:11，GFP蛋白序列为SEQ ID NO:12)，命名为含有GFP编码基因的片段。
以5’-TTTCTCCATACCCGTTTTTT-3’(SEQ ID NO:13)和5’-CAGTAGAGAGTTGCGATAAA-3’(SEQ ID NO:14)为引物，以pBAD18载体(优宝生物，长沙)为模板，利用Phusion高保真酶(Phusion，赛默飞世尔科技，中国)，依据说明书方法，扩增后回收约4.6kb核酸片段，命名为pBAD18载体扩增片段。
利用载体构建试剂盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(Vazyme，南京)，根据试剂盒说明书步骤，将上述3个片段，“含有GX55基因的片段”、“含有GFP编码基因的片段”和“pBAD18载体扩增片段”，重组形成完整质粒，得到的质粒命名为pBAD-GX55-GFP。
实施例3双质粒(pACYC-tRNAVm和pBAD-GX55-GFP)共转宿主菌
将质粒pACYC184和质粒pBAD-GX55-GFP共同转化至宿主菌E.coli K12中，利用含有氨苄青霉素和四环素的平板筛选阳性克隆，提质粒后进行PCR扩增和测序验证，得到验证正确的含有双质粒的重组菌株命名为E1。
将质粒pACYC-tRNAT和质粒pBAD-GX55-GFP共同转化至宿主菌E.coli K12中，利用含有氨苄青霉素和四环素的平板筛选阳性克隆，提质粒后进行PCR扩增和测序验证，得到验证正确的含有双质粒的重组菌株命名为E2。
将质粒pACYC-tRNAVm和质粒pBAD-GX55-GFP共同转化至宿主菌E.coli K12中，利用含有氨苄青霉素和四环素的平板筛选阳性克隆，提质粒后进行PCR扩增和测序验证，得到验证正确的含有双质粒的重组菌株命名为E3。
实施例4 GX55蛋白诱导表达与检测
分别将重组菌株E1,E2和E3接种至含有5ml M9培养基(分子克隆实验指南第三版，1596页)的试管中，37℃培养，12小时。取1ml培养液，转接至含有20ml M9培养基的摇瓶中，37℃培养6h，随后加入终浓度10mM的L-阿拉伯糖作为诱导剂，诱导表达16h。诱导结束后，采用连续波长多功能酶标仪(型号：MD Flexstation3，美谷分子仪器，上海)，在600nm条件下测定菌液的菌浓度，在488nm/520nm条件下测定荧光值，计算荧光值/菌浓度，得到单位菌浓度的荧光值。OD值和荧光值均为三个平行实验的平均值。
荧光值/菌浓度测定结果显示，见表1。较之未对照的菌株，表达glyT和glyVm会使荧光值有提升，且表达glyVm效果比glyT更好(图1)。
表1 E1、E2和E3菌株的OD值和荧光值
菌株 E1 E2 E3
荧光/OD 192 229 327
OD值 0.751 0.759 0.702
实施例5.模式蛋白表达质粒pBAD-GGAGGA-GFP的构建
待检测的目的蛋白序列为含有两个稀有密码子GGA的荧光蛋白序列，荧光蛋白GFP作为检测蛋白，可通过荧光进行方便快速的检测。
人工合成的含有2个GGA的GFP序列(序列为：SEQ ID NO:15，该序列含有“含有2个GGA的GFP”蛋白的编码基因序列、表达元件以及构建载体所需的碱基序列，含有2个GGA的GFP编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:16，含有2个GGA的GFP的蛋白序列为SEQ ID NO:17)，命名为GGAGGA-GFP片段。
以5’-TTTCTCCATACCCGTTTTTT-3’(SEQ ID NO:13)和5’-CAGTAGAGAGTTGCGATAAA-3’(SEQ ID NO:14)为引物，以pBAD18载体(优宝生物，长沙)为模板，利用Phusion高保真酶(Phusion，赛默飞世尔科技，中国)，依据说明书标准方法，扩增后回收约4.6kb核酸片段，命名为pBAD18载体扩增片段。
利用载体构建试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme，南京)，根据试剂盒标准步骤，将上述2个片段，“GGAGGA-GFP片段”和“pBAD18载体扩增片段”，重组形成完整质粒，得到的质粒命名为pBAD-GGAGGA-GFP。
实施例6双质粒(pACYC-tRNAVm和pBAD-GGAGGA-GFP)共转宿主菌
将质粒pACYC184和质粒pBAD-GGAGGA-GFP共同转化至宿主菌E.coli K12中，利用含有氨苄青霉素和四环素的平板筛选阳性克隆，提质粒后进行PCR扩增和测序验证，得到验证正确的含有双质粒的重组菌株命名为，E4。
将质粒pACYC-tRNAT和质粒pBAD-GGAGGA-GFP共同转化至宿主菌E.coli K12中，利用含有氨苄青霉素和四环素的平板筛选阳性克隆，提质粒后进行PCR扩增和测序验证，得到验证正确的含有双质粒的重组菌株命名为，E5。
将质粒pACYC-tRNAVm和质粒pBAD-GGAGGA-GFP共同转化至宿主菌E.coli K12中，利用含有氨苄青霉素和四环素的平板筛选阳性克隆，提质粒后进行PCR扩增和测序验证，得到验证正确的含有双质粒的重组菌株命名为，E6。
实施例7GFP蛋白诱导表达与检测
分别将重组菌株E4,E5和E6接种至含有5ml M9培养基(分子克隆实验指南第三版，1596页)的试管中，37℃培养，12小时。取1ml培养液，转接至含有20ml M9培养基的摇瓶中，37℃培养6h，加入终浓度10mM的L-阿拉伯糖作为诱导剂，诱导表达16h。诱导结束后，采用连续波长多功能酶标仪(型号：MD Flexstation3，美谷分子仪器，上海)，在600nm条件下测定菌液的菌浓度，在488nm/520nm条件下测定荧光值，计算荧光值/菌浓度，得到单位菌浓度的荧光值。OD值和荧光值为三个平行实验的平均值。
荧光值/菌浓度测定结果显示，见表2。较之未对照的菌株，表达glyT和glyVm会使荧光值有提升，且表达glyVm效果比glyT更好(图2)。
表2 E3、E4和E5菌株的OD值和荧光值
菌株 E4 E5 E6
荧光/OD 4579 8437 9933
OD值 0.769 0.685 0.746
SDS-PAGE蛋白电泳图谱显示，泳道1为Marker，条带自上而下依次为188、98、62、49、38、28kDa，目的蛋白GFP大小约为26.8kDa，目的条带在预期位置。泳道3、4的目的蛋白条带表达量均高于泳道2，说明与空载体pACYC184相比，回补tRNAT和tRNAVm均有效果；泳道4的目的蛋白含量较之泳道3更高，说明glyVm的回补效果比glyT更显著(图3)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (17)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；
或与SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸是突变型tRNA的基因。
3.如权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸衍生自埃希氏菌属细菌。
4.如权利要求3所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸衍生自大肠杆菌。
5.一种表达系统，其包含权利要求1中所述的多核苷酸和编码待表达的蛋白的核苷酸序列。
6.权利要求5所述的表达系统，其特征在于，所述编码待表达的蛋白的核苷酸序列中含有两个以上的稀有密码子GGA。
7.权利要求5所述的表达系统，其特征在于，所述编码待表达的蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；
或与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸或权利要求5-7中任一项所述的表达系统。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞属于埃希氏菌属(Escherichia)。
10.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞属于大肠杆菌(Escherichia coli)。
11.权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸或权利要求5-7中任一项所述的表达系统在上调宿主细胞中蛋白表达的用途。
12.一种上调宿主细胞中蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：
1) 培养权利要求8-10中任一项所述的宿主细胞；和
2) 从1)的培养体系中获得表达上调的蛋白。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是埃希氏菌属细菌。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。
15.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述蛋白可以是宿主细胞的内源性蛋白或外源性蛋白。
16.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述蛋白的编码序列中包含两个以上的稀有密码子GGA。
17.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述蛋白是氨基酸序列为SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：16的蛋白。
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