CN108977890B - 一种启动子库以及利用其在细菌中构建不同强度表达系统的方法 - Google Patents

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CN108977890B CN201710413338.3A CN201710413338A CN108977890B CN 108977890 B CN108977890 B CN 108977890B CN 201710413338 A CN201710413338 A CN 201710413338A CN 108977890 B CN108977890 B CN 108977890B
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Abstract

本发明涉及一种启动子库，以及利用其在细菌中构建不同表达强度的启动子库的表达系统的方法。所述启动子库包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的启动子序列，其中，n代表a、t、c、g中任一种。本发明的启动子库可在大肠杆菌、嗜盐菌等多种细菌中使用，且表达强度在不同菌之间具有一致性，可作为基本基因元件，用于精细调控基因表达、精细调控代谢通路，具有广泛的应用前景。

Description

一种启动子库以及利用其在细菌中构建不同强度表达系统的 方法
技术领域
本发明涉及一种启动子库，以及利用其在细菌中构建不同表达强度的启动子库的表达系统的方法。
背景技术
发酵工业中，对工业微生物的改造是提升发酵效率、获得新产品、降低发酵成本的基本方法之一。而改造的目的主要是提高微生物生长速率，增加微生物内在的表达效率，提升产品转化率。因此，在菌株内构建稳定高效的表达系统则成为了达到这一目的的有效手段。
启动子是表达系统中的核心部分之一。精细调控启动子的表达强度可以实现生物合成途径及其产品转化率的最优化。为此需要一系列不同表达强度的启动子来组成启动子库，满足不同基因不同表达强度的需求。将某一启动子序列中的碱基进行突变(如改变n个碱基可得到4n种突变)，改变其表达强度，即可得到一组不同强度的启动子库。但是在某一细菌中构建的启动子库不一定适用于其他细菌。
遗传背景清晰、研究较多的细菌(如大肠杆菌)中启动子等基因元件的开发非常成熟，然而将这些细菌中的基因元件转移到其他细菌中时不一定能够正常发挥元件功能，一个启动子库中的启动子在不同细菌中的表达强度可能是不同的，从而制约了根据启动子(或基因元件)在一种细菌中的表现来预测其在其他细菌中表现的需求。
革兰氏阴性菌是对一类细菌的统称，含有多个细菌种类，如盐单胞菌、罗氏真养菌和假单胞菌。这些革兰氏阴性菌可以被视为潜在的工业菌株，可以通过基因改造获得具备表达基因和蛋白的功能，进而成为工业重组菌。
嗜盐菌是一类在高盐浓度下正常生长的细菌。盐单胞菌Halomonas为一类嗜盐菌的统称，包括Halomonas sp.TD01和Halomonas campaniensis LS21等。盐单胞菌已经被证明具有生长速度快、干重高、不需灭菌以及可以进行低成本连续发酵等优点，并且可以高效生产聚羟基脂肪酸酯PHA，具备成为优秀底盘微生物的潜力。
但是对嗜盐菌的分子生物学操作仍处于初始阶段，缺少一套稳定表现的启动子库等基因元件，直接将大肠杆菌中使用的启动子(或基因元件)转移到嗜盐菌中使用，其表现往往不如该启动子(基因元件)在大肠杆菌中的表现。这制约了在嗜盐菌中进一步开发复杂的基因元件和生物合成途径。因此开发一套在不同细菌中性能稳定、可在不同细菌之间转移使用的表达系统是改造工业微生物，开拓发酵工业的当务之急。
现有的启动子库的构建仅涉及在某一种细菌当中的表征和使用，例如在大肠杆菌中构建的启动子库，不清楚在其他细菌中是否有相同的表现(启动子之间的强弱关系和倍数关系)。所以针对某一种细菌就需要单独构建一个启动子库，而没有一个启动子库能够在多种细菌当中使用且有相同表现。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明人进行了广泛深入的研究，最终完成本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种启动子库，该启动子库不同细菌之间(例如，在大肠杆菌和嗜盐菌之间)有很好的表达强度一致性。本发明的另一个目的是提供一种在细菌中构建不同表达强度的启动子库的表达系统的方法。
本发明的再一个目的是提供一种表达系统，其包含上述启动子库中的启动子序列。
根据一个方面，本发明提供了一种启动子库，其包括：
SEQ ID NO:2(atgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccannntagagtttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa)或SEQ ID NO:3(atgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccagtatnnnntttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa)所示的启动子序列，其中，n代表a、t、c、g中任一种。
优选地，本发明的启动子库包括SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:98的启动子序列。更优选地，本发明的启动子库由SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:98的启动子序列组成。
根据还一个方面，本发明提供了一种启动子，其序列为上述的启动子库中的启动子序列。
根据又一个方面，本发明提供了一种表达系统，其包含上述启动子库中的启动子序列。
根据再一个方面，本发明提供了一种在细菌中构建不同表达强度的启动子库的方法，包括如下步骤：构建含有上述启动子库的表达系统，转入不同细菌，定量检测表达效率。
上述的启动子库可以在不同细菌(例如，大肠杆菌和嗜盐菌)当中使用，同一个启动子在不同细菌中的表达强度具有较高的一致性，所述启动子库的表达系统具有不同细菌之间的可迁移性。所述启动子库在不同细菌当中的使用也属于本专利的保护范围。
本发明的方法中，优选地，大肠杆菌可以包括大肠杆菌S17-1及其重组菌。
本发明的方法中，优选地，嗜盐菌可以包括盐单胞菌TD01及其重组菌。
本发明中获得的启动子库的表达系统具有优良的表达效率，可供工业发酵和研究使用。
本发明提供了一种在细菌中构建不同表达强度的启动子库的方法，所构建的启动子库中的启动子的表达强度范围涵盖了10的2次方到5次方(以绿色荧光蛋白为报告基因)。该启动子可在大肠杆菌、嗜盐菌等多种细菌中使用，且表达强度在不同菌之间具有一致性，可作为基本基因元件，用于精细调控基因表达、精细调控代谢通路，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明的含有启动子库的表达系统的构建原理示意图。
图2为实施例中使用的质粒图谱。
图3为显示启动子库在大肠杆菌中表达强度的图。
图4为显示启动子库在嗜盐菌中表达强度的图。
图5为显示启动子库在大肠杆菌和嗜盐菌中的表达强度一致性的图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)大肠杆菌培养基
LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
2)嗜盐菌培养基
60LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),60g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg/mL氨苄青霉素或25μg/mL的氯霉素。
含有启动子库的表达系统的构建原理见图1。图中，箭头代表不同强度的启动子，sfGFP代表绿色荧光蛋白，可以在流式细胞仪下检测荧光强度，通过荧光强度的值来表征启动子的表达强度。
实施例1：大肠杆菌中含启动子库的表达系统的构建
通过苏州泓迅公司，合成启动子区域序列，其中核心序列(即-35box至转录起始位点)为两个BsaI酶切位点，可替换为任意序列。所合成的序列对应为SEQ ID NO:1(agcggataacaatttcacacaggaatgcctccacaccgctcgtcacatcctggagacctcactggaatcccagtatagactttgacctgggtctcagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa)。
用引物扩增上述合成的序列并回收，同时PCR扩增含有sfGFP基因的pSEVA321质粒(Silva-Rocha,R.,de Lorenzo,V.,2013.The Standard European Vector Architecture(SEVA):acoherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryoticphenotypes.NucleicAcidsRes.41,666–675.)作为载体骨架，两个片段用GibsonAssembly(NEB公司购买获得)连接后获得pSEVA321-promoter_back质粒，作为构建启动子库的骨架质粒。质粒结构见图2。使用的引物和对应的产物如下表：
Figure BDA0001313018700000051
用简并引物做无模板的PCR扩增，得到75bp的产物并回收，用BsaI酶切位点通过Golden Gate连接入pSEVA321-promoter_back质粒，得到质粒pSEVA321-promoter_lib1，质粒转入大肠杆菌中得到启动子库。启动子区域对应为SEQ ID NO:2(atgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccannntagagtttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa(n代表a、t、c、g中任意一种))。使用的引物和对应的产物如下表(n为a、t、c、g中任一种)：
Figure BDA0001313018700000052
Figure BDA0001313018700000061
用另一对简并引物做无模板的PCR扩增，得到75bp的产物并回收，用BsaI酶切位点通过Golden Gate连接入pSEVA321-promoter_back质粒，得到质粒pSEVA321-promoter_lib2，质粒转入大肠杆菌中得到启动子库。启动子区域对应为SEQ IDNO:3
(atgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccagtatnnnntttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa)。使用的引物和对应的产物如下表(n为a、t、c、g中任一种)：
Figure BDA0001313018700000062
上述两种启动子库的任意一个阳性克隆都含有一个启动子，其序列对应于SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3，用sfGFP基因作为报告基因。随机选取启动子库中的阳性克隆，测序得到95个不同序列的启动子，具体启动子序列如下(SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:98)：
atgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccagtatcagttttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa(SEQ ID NO:4)
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atgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccagtgtagagtttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa(SEQ ID NO:92)
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上述克隆培养12小时后使用流式细胞仪检测荧光强度，荧光强度范围涵盖了10的2次方至5次方数量级，结果如图3。
下表给出了上述启动子序列在大肠杆菌中的表达强度的结果。
Figure BDA0001313018700000141
Figure BDA0001313018700000151
Figure BDA0001313018700000161
Figure BDA0001313018700000171
Figure BDA0001313018700000181
实施例2：嗜盐菌中含启动子库的表达系统的构建
上述启动子库的质粒分别转入大肠杆菌S17-1(ATCC编号:47055，可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection)，再通过使用接合转化(Fu XZ,Tan D,Aibaidula G,Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014)Development of Halomonas TD01as a hostfor open production of chemicals.Metab Eng 23:78–91)将启动子库的质粒转入嗜盐菌Halomonas sp.TD01(保存于中科院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号CGMCC4353)，得到嗜盐菌中的含启动子库的表达系统。
嗜盐菌在60LB培养基培养12小时后使用流式细胞仪检测荧光强度，荧光强度范围涵盖了10的2次方至5次方数量级，结果如图4。
以启动子库中同一个启动子在嗜盐菌中的表达强度为横轴，在大肠杆菌中表达强度为纵轴，作散点图，并对所有的点作拟合曲线，拟合度R2达到0.9802，结果如图5。说明启动子库在大肠杆菌和嗜盐菌之间有很好的表达强度一致性。
下表给出了上述启动子序列在嗜盐菌中的表达强度的结果。
Figure BDA0001313018700000182
Figure BDA0001313018700000191
Figure BDA0001313018700000201
Figure BDA0001313018700000211
Figure BDA0001313018700000221
SEQUENCE LISTING
<110> 北京蓝晶微生物科技有限公司
<120> 一种启动子库以及利用其在细菌中构建不同强度表达系统的方法
<130> DI17-0586-XC37
<160> 105
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列1
<400> 1
agcggataac aatttcacac aggaatgcct ccacaccgct cgtcacatcc tggagacctc 60
actggaatcc cagtatagac tttgacctgg gtctcagctg tcaccggatg tgctttccgg 120
tctgatgagt ccgtgaggac gaaacagcct ctacaaataa ttttgtttaa 170
<210> 2
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列2
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(51)
<223> n是a, c, g, 或 t
<400> 2
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccann ntagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 3
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列3
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(56)
<223> n是a, c, g, 或 t
<400> 3
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atnnnntttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 4
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 4
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcagttttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 5
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 5
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcccttttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 6
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 6
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atctgttttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 7
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 7
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcacgtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 8
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 8
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcacctttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 9
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 9
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt attggctttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 10
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 10
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcaattttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 11
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 11
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atctggtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 12
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 12
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atctcttttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 13
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 13
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atctattttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 14
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 14
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atgacctttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 15
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 15
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atccactttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 16
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 16
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcgactttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 17
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 17
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atggattttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 18
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 18
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atgagatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 19
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 19
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcacatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 20
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 20
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcagatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 21
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 21
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcttttttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 启动子序列
<400> 22
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atgcagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
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atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt attccatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atgacatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atcgcatttg 60
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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<212> DNA
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 62
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccaca gtagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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<212> DNA
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<220>
<223> 启动子序列
<400> 63
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 64
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 65
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 65
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 66
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 66
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataaggtttg 60
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 67
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 67
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 68
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 68
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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<212> DNA
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<220>
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<400> 69
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 70
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 70
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccacc ttagagtttg 60
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 71
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 71
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataacctttg 60
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 73
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<210> 74
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 74
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccaag gtagagtttg 60
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cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 75
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataccctttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 76
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 76
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagg ttagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 77
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 77
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataaagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 78
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 78
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataagctttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 79
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 79
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccaat gtagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 80
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 80
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atatcctttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 81
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 81
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataacatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 82
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 82
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atatattttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 83
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 83
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataaactttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 84
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 84
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atagactttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 85
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 85
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataagatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 86
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 86
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataccatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 87
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 87
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atagaatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 88
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 88
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atactatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 89
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 89
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataatatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 90
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 90
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccatt gtagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 91
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 91
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atataatttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 92
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 92
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt gtagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 93
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 93
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atatagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 94
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 94
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atatactttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 95
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 95
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccatg ctagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 96
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 96
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccatg gtagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 97
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 97
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccatg atagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 98
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列
<400> 98
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccatg ttagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P011
<400> 99
agcggataac aatttcacac agga 24
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P071
<400> 100
aagcacatcc ggtgacagct 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P070
<400> 101
agctgtcacc ggatgtgctt 20
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P018
<400> 102
tcctgtgtga aattgttatc cgct 24
<210> 103
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P072
<400> 103
taaaggtctc atcctgttgc gttcactgga atccca 36
<210> 104
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P073
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(39)
<223> n是a, c, g, 或 t
<400> 104
ttagggtctc acagcttgct cgcaggtcaa actctannnt gggattccag tgaa 54
<210> 105
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P074
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(35)
<223> n是a, c, g, 或 t
<400> 105
ttagggtctc acagcttgct cgcaggtcaa annnnatact gggattccag tgaa 54

Claims (8)

1.一种启动子库，其由以下启动子序列组成：
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的启动子序列，其中，n代表a、t、c、g中任一种。
2.根据权利要求1所述的启动子库，其包括SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:98的启动子序列。
3.根据权利要求1所述的启动子库，其由SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:98的启动子序列组成。
4.一种启动子，其序列为权利要求1所述的启动子库中的启动子序列。
5.一种在细菌中构建不同表达强度的启动子库的方法，包括如下步骤：构建含有权利要求1所述的启动子库的表达系统，转入大肠杆菌和盐单胞菌，定量检测表达效率。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，大肠杆菌选自大肠杆菌S17-1及其重组菌。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，盐单胞菌选自盐单胞菌TD01及其重组菌。
8.一种表达系统，其包含权利要求1所述的启动子库中的启动子序列。
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