CN116288740B - 一种微生物启动子库及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种微生物启动子库及其应用。本发明的启动子库包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子,其中,n代表a、t、c、g中的任意一种。该启动子库具有较广的强度范围,能够在不同细菌中发挥功能,而且相同启动子在不同细菌中的强度具有较高的一致性,可将其应用于不同的细菌中构建不同表达强度的表达系统,为工程化细菌的构建和细菌的基因表达调控提供了重要的生物元件。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及一种微生物启动子库及其应用。
背景技术
启动子是决定转录起始位置并控制基因表达强度的一类生物元件,是基因表达系统的核心之一。通过启动子的强弱来实现对不同基因活动的控制是一种常用的生物调控手段。由不同强度的启动子组成的启动子库能够很好地满足不同基因表达强度的需求。
大肠杆菌作为微生物研究的模式生物,具有清晰的遗传背景和较为成熟的生物元件系统。但是在某一细菌中构建的生物元件不一定适用于其他细菌,这在一定程度上制约了生物元件的拓展和应用。罗氏真养菌(Ralstonia eutropha,又名杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator))是一种革兰氏阴性菌,可以利用糖类、油脂等多种碳源作为底物,是PHA生产的模式菌株,具有很高的工业化生产潜力。目前,罗氏真养菌工程化改造使用的生物元件大部分直接由大肠杆菌的生物元件直接迁移而来,在这个过程中经常出现生物元件测试结果与原底盘不匹配的问题。生物元件的匮乏直接制约了罗氏真养菌作为工业微生物的开发和应用。因此,开发可以在不同细菌中稳定转移使用的生物元件至关重要。
发明内容
本发明提供一种启动子库及其在不同细菌中的应用。
本发明以一段原始启动子序列为基础,通过将该启动子序列中的碱基进行饱和突变(改变n个碱基可得到4n种突变)改变启动子强度,得到具有较广启动子强度范围、且在不同细菌之间具有较高强度一致性的启动子库。
具体地,本发明提供以下技术方案:
本发明提供一种启动子库,所述启动子库包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子,其中,n代表a、t、c、g中的任意一种。
上述启动子库中的启动子序列具体如下(SEQ ID NO.1,5’-3’):gagaaaattattttaaatttcctcttgacaatgaattcctaaagggatatannntgtggaattgtgagatgag(其中,n代表a、t、c、g中任意一种)。
上述启动子序列具体包含以下几个部分:上游序列(Up-element,下划线序列的上游序列),核心区(下划线标注部分序列,-10区和-35区分别以加粗标注),下游序列(Spacer,下划线序列的下游序列)。其中,核心区部分是启动子发挥“开/关”功能的部分,上游序列(UP-element)可以通过与细菌RNA聚合酶相互作用影响启动子的强度,下游序列为启动子和其他序列的间隔序列。
上述启动子序列中,n可以为a、t、c、g中的任意一种,因此上述启动子序列共包含64种不同的启动子序列。
在本发明的一些实施方式中,所述启动子库包含1-64个启动子。
在本发明的一些实施方式中,所述启动子库包含2-64个启动子。
在本发明的一些实施方式中,所述启动子库包含64个启动子。
在本发明的一些实施方式中,所述启动子库包含核苷酸序列如SEQ ID NO.2-35所示的启动子。
经验证,以上所述的启动子库中的启动子的强度动态范围达103倍(以绿色荧光蛋白为报告基因),可以在不同细菌(例如,大肠杆菌和罗氏真养菌)中发挥功能;且相同启动子在不同细菌中的强度具有较高的一致性,即启动子库具有不同细菌之间的可移植性。
本发明提供一种启动子,所述启动子为以上所述的启动子库中的启动子。
在本发明的一些实施方式中,上述提供的启动子为所述启动子库中的任意一个启动子。
本发明提供一种表达盒,所述表达盒包含以上所述的启动子库中的启动子。
优选地,所述表达盒包含以上所述的启动子库中的至少一个启动子。
本发明中,表达盒是指将启动子与目的基因连接后得到的重组核酸分子。
本发明提供一种载体,所述载体包含以上所述的启动子库中的启动子,或包含以上所述的表达盒。
优选地,所述载体包含以上所述的启动子库中的至少一个启动子。
本发明所述的载体可为质粒载体或病毒载体。优选为表达载体。
本发明提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含以上所述的启动子库中的启动子,或包含以上所述的表达盒,或包含以上所述的载体。
优选地,所述宿主细胞包含以上所述的启动子库中的至少一个启动子。
在所述宿主细胞中,所述启动子可整合至宿主细胞的染色体上,或者存在于宿主细胞携带的质粒载体上。
以上所述的宿主细胞包括微生物细胞。所述微生物包括但不限于埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、贪铜菌属(例如罗氏真养菌)、棒杆菌属(例如谷氨酸棒杆菌)、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属等。
在本发明的一些实施方式中,所述宿主细胞为大肠杆菌。
在本发明的一些实施方式中,所述宿主细胞为罗氏真养菌。
本发明提供一种重组工程菌,所述重组工程菌包括以上所述的启动子库中的启动子。
优选地,所述重组工程菌包含以上所述的启动子库中的至少一个启动子。
本发明提供以上所述的启动子库或所述启动子或所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞的以下任意一种应用:
(1)在微生物中调控基因转录和/或表达中的应用;
(2)在微生物基因编辑中的应用;
(3)在微生物基因工程改造中的应用;
(4)在用于生产目标产物的工程化微生物构建中的应用;
(5)在利用微生物发酵生产目标产物中的应用。
上述(1)、(2)中,所述基因包括能够编码产生肽或功能RNA的核酸分子。对于基因的种类和序列,本发明没有特殊限制,可为任意想要转录、表达的目的基因。
上述(4)、(5)中,所述目标产物包括化合物、聚合物或蛋白质,包括但不限于聚酯(例如聚羟基脂肪酸酯)、多酚类化合物、氨基酸或其衍生物、有机酸或其衍生物等。
上述(1)-(5)中,所述微生物包括但不限于埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、贪铜菌属(例如罗氏真养菌)、棒杆菌属细菌(例如谷氨酸棒杆菌)、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属、芽孢杆菌属细菌、链霉菌、假单胞菌等。
优选地,所述微生物为大肠杆菌或罗氏真养菌。
本发明提供一种调控基因转录和/或表达的方法,所述方法包括将以上所述的启动子库中的启动子与目标基因可操作性地连接的步骤。
上述调控基因转录和/或表达的方法还包括,将以上所述的启动子库中的启动子与目标基因的连接产物导入宿主细胞的步骤。
本发明提供一种表达系统,其包含以上所述的启动子库中的启动子。
本发明提供一种在微生物中构建不同表达强度的启动子库的方法,所述方法包括将以上所述的包含所述启动子库中的启动子的表达系统转入不同细菌的步骤。
其中,所述微生物包括埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、贪铜菌属(例如罗氏真养菌)。
在本发明的一些实施方式中,通过DNA组装技术构建了上述启动子库的表达系统,并将所述表达系统转入不同的细菌中,定量测试启动子的强度。
本发明的有益效果在于:本发明的启动子库能够覆盖较广的强度范围,可以在不同细菌(例如,大肠杆菌和罗氏真养菌)中发挥功能;且相同启动子在不同细菌中的强度具有较高的一致性,在不同细菌之间具有可移植性,可将其应用于不同的细菌中构建不同表达强度的表达系统,为不同细菌的基因表达调控和工程化细菌的构建提供了重要的生物元件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的含有启动子库的表达系统的构建和测试的原理示意图。
图2为本发明实施例1中的质粒图谱。
图3为本发明实施例1中启动子库在大肠杆菌中的表达强度。
图4为本发明实施例2中启动子库在罗氏真养菌中的表达强度。
图5为本发明实施例2中启动子库在大肠杆菌和罗氏真养菌中的表达强度相关性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明中的附图,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
以下实施例中,所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs(NEB)公司,提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,回收DNA片段的试剂盒购自美国Omega公司,相应的操作步骤严格按照产品说明书进行,所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。
以下实施例中使用的培养基配方如下:
1、大肠杆菌培养基
LB培养基:5g/L酵母提取物,10g/L 蛋白胨,10g/L 氯化钠,其余为水。高温高压蒸汽(121℃,20min)灭菌。
2、罗氏真养菌培养基
TYGA培养基:5g/L酵母提取物,10g/L 蛋白胨,3g/L葡萄糖,3g/L 硫酸铵,其余为水。高温高压蒸汽(121℃,20min)灭菌。
在实际培养过程中,可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性,如100μg/mL氨苄青霉素或20μg/mL的四环素。
以下实施例中,含有启动子库的表达系统的原理示意图见图1。启动子调控绿色荧光蛋白的表达,通过流式细胞仪检测荧光强度,进而以荧光强度的值来定量表征启动子的强度。
实施例1 大肠杆菌中含启动子库的表达系统的构建和测试
通过药明康德公司合成包含启动子原始序列(编号为0),sfGFP基因等测试序列的pBBR1质粒(质粒结构见图2),以此质粒作为模板,通过PCR扩增获得两个片段,引物和扩增产物信息如表1所示。
表1
其中, lib-P25-F为简并引物(n代表a、t、c、g中任意一种),通过该设计在启动子-10区引入3个碱基的饱和突变以构建启动子库。将PCR得到两个片段经过纯化后,以GibsonAssembly的连接方式得到pBBR1-promoter_lib25,质粒转入大肠杆菌中得到启动子库。启动子库中的启动子序列如下(SEQ ID NO.1):
gagaaaattattttaaatttcctcttgacaatgaattcctaaagggatatannntgtggaattgtgagatgag(n代表a、t、c、g中任意一种)。
转化后得到的大肠杆菌中,每个阳性单克隆中包含一个启动子,其序列对应于SEQID NO.1,随机选取启动子库中的阳性克隆,测序后确定序列。共得到34个不同的启动子序列(按照启动子编号顺序,序列分别如SEQ ID NO.2-35所示,表2)。
表2
将上述含有不同启动子的大肠杆菌阳性克隆在LB培养基中活化培养后用流式细胞仪检测荧光强度,荧光强度动态范围达103倍,结果如图3所示。含有上述启动子序列的大肠杆菌的荧光强度值如表3所示。
表3
实施例2 罗氏真养菌中含启动子库的表达系统的构建和测试
将实施例1中构建的上述启动子库的质粒通过接合转化转入罗氏真养菌,得到含启动子库的表达系统。将含有不同启动子的罗氏真养菌在TYGA培养基中活化培养后用流式细胞仪检测荧光强度,荧光强度动态范围达103倍,结果如图4所示。含有上述启动子序列的罗氏真养菌的荧光强度值如表4所示。
表4
以启动子库中同一个启动子在大肠杆菌中的表达强度为横轴,在罗氏真养菌中表达强度为纵轴,制作散点图,并对所有的点作拟合曲线,确定系数R2达到0.8703,结果如图5所示。结果表明,本发明的启动子库在大肠杆菌和罗氏真养菌之间具有很好的表达强度一致性。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种启动子库,其特征在于,所述启动子库由如下启动子组成,所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其中,n代表a、t、c、g中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的启动子库,其特征在于,所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2-35所示。
3.一种启动子,其特征在于,所述启动子为权利要求1或2所述的启动子库中的启动子。
4.一种表达盒,其特征在于,所述表达盒包含权利要求1或2所述的启动子库中的启动子。
5.一种载体,其特征在于,所述载体包含权利要求1或2所述的启动子库中的启动子,或包含权利要求4所述的表达盒。
6.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包含权利要求1或2所述的启动子库中的启动子,或包含权利要求4所述的表达盒,或包含权利要求5所述的载体;
所述宿主细胞为大肠杆菌或罗氏真养菌。
7.一种重组工程菌,其特征在于,所述重组工程菌包括权利要求1或2所述的启动子库中的启动子;
所述重组工程菌为大肠杆菌或罗氏真养菌。
8.权利要求1或2所述的启动子库或权利要求3所述的启动子或权利要求4所述的表达盒或权利要求5所述的载体或权利要求6所述的宿主细胞的以下任意一种应用:
(1)在微生物中调控基因转录和/或表达中的应用;
(2)在微生物基因编辑中的应用;
(3)在微生物基因工程改造中的应用;
(4)在用于生产目标产物的工程化微生物构建中的应用;
(5)在利用微生物发酵生产目标产物中的应用;
所述微生物为大肠杆菌或罗氏真养菌。
9.一种在大肠杆菌或罗氏真养菌中调控基因转录和/或表达的方法,其特征在于,所述方法包括将权利要求1或2所述的启动子库中的启动子与目标基因可操作性地连接的步骤。
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