CN116622702A - 一种人工设计的新型枯草芽孢杆菌终止子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工设计的新型枯草芽孢杆菌终止子及其应用，属于基因工程技术领域。本发明首先对不同的终止子的活性进行表征，接下来使用不同终止子测定平台对终止子的终止次效率进行测定，得到了一系列可提高目的蛋白产量的新型终止子，以绿色荧光蛋白基因作为终止子上游基因，以红色荧光蛋白基因作为终止子下游基因，表征终止子对上下游基因的调控水平。结果表明，这些新型终止子对于提高上游基因表达量和抑制下游基因表达量都有良好的效果。将一系列不同终止子应用于纳豆激酶和普鲁兰酶重组蛋白表达中，结果表明，这些终止子有助于提高蛋白的酶活和蛋白表达量的提升，这对在枯草芽孢杆菌中生产目的蛋白具有重要的应用价值。
Description
本申请是针对原申请号为：CN 202011451933.4，原申请日为2020年12月09日，发明名称为枯草芽孢杆菌人工终止子及其应用的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种人工设计的新型枯草芽孢杆菌终止子及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
转录终止子是位于基因或操纵子的下游，负责RNA聚合酶的解离和释放出转录的RNA从而起到终止转录的一段RNA序列。在原核生物中，转录终止子有两种类型，一种是蛋白因子依赖型，需要在蛋白因子的辅助下才能发挥作用，且消耗ATP；另一种是不依赖任何蛋白因子，仅依赖其自身的反向回文序列和poly-U形成的发夹结构发挥作用，也称为内在终止子。转录终止子由于其特殊的二级结构，常位于基因的3’端，因此在维持mRNA稳定性和提高mRNA的半衰期方面起到重要作用。终止子终止转录是使RNA聚合酶脱离转录复合物，可提高RNA聚合酶的利用效率，也能提高基因的表达量。之前，对于终止子的研究主要集中在大肠杆菌当中，只有小部分文献提及在其他微生物中的应用，如酿酒酵母等。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主。因此，提供一种能够调控枯草芽孢杆菌中基因表达、稳定、高活性的终止子，对于制备目的蛋白，尤其是食品领域中用到的蛋白，具有重要的应用价值，因此如何得到一种高效的、兼容性好的、可调节蛋白表达的枯草芽孢杆菌人工终止子系统成为研究的热点。
发明内容
为了得到一种高效的、兼容性好的、可调节蛋白表达的枯草芽孢杆菌人工终止子系统，本发明提供了一种调控基因表达的元件，所述元件为T5、T24、T31、T42、T52终止子，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了上述T5、T24、T31、T42、T52终止子在基因表达中的应用，所述应用为，将终止子置于需表达的基因的下游，与基因共表达。
在本发明的一种实施方式中，所述基因为编码纳豆激酶的基因，或编码天冬氨酸裂解酶的基因。
本发明还提供了一种含有上述元件的载体。
本发明还提供了表达上述载体的基因工程菌。
本发明还提供了一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法，将上述元件与目的蛋白基因共表达。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis 168、Bacillus subtilis WB400、Bacillus subtilis WB600或Bacillus subtilis WB800。
在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括酶。
本发明还提供了上述的调控元件或基因工程菌在制备目的蛋白中的应用。
本发明还提供了上述的调控元件或基因工程菌在食品、制药或化工领域的应用。
有益效果
本发明首先对单终止子的活性进行表征，发现添加T31终止子比不添加终止子时，上游GFP表达量提高了1.98倍，下游mcherry表达量降低了33.8倍。以绿色荧光蛋白基因作为终止子上游基因，以红色荧光蛋白基因作为终止子下游基因，表征终止子对上下游基因的调控水平。结果表明，这些终止子对于抑制下游基因表达量都有很好的效果，如添加终止效率最低的T42终止子时，比对照的下游mcherry表达量下降了1.43倍。将本发明中的终止子放在不同的基因环境中，所测得的终止效率几乎不变，且同样可以达到抑制下游基因表达量的目的。通过将不同终止强度的终止子作为基因表达的3’端元件，得到了不同表达量的目的蛋白，这对在枯草芽孢杆菌中生产目的蛋白具有重要的应用价值。
附图说明
图1：终止子终止效率的表征，其中G-mch-5、G-mch-24、G-mch-31、G-mch-42、G-mch-52分别表示在质粒pBp43-GFP-mcherry的GFP与mcherry之间插入终止子T5、T24、T31、T42、T52后，测定的各终止子的终止效率。
图2：终止子终止效率报告基因表达量的表征，其中M：蛋白质分子量标准；G-mch-0：未加终止子；G-mch-5，G-mch-24，G-mch-31，G-mch-42，G-mch-52分别表示在质粒pBp43-GFP-mcherry的GFP与mcherry之间插入终止子T5、T24、T31、T42、T52后，测定的各个不同元件中上下游蛋白质的表达量。
图3：终止子上游GFP荧光强度的表征，其中control表示参照质粒，G-mch-5、G-mch-24、G-mch-31、G-mch-42、G-mch-52分别表示在质粒pBp43-GFP-mcherry的GFP与mcherry之间插入终止子T5、T24、T31、T42、T52后，测定的各终止子的上游GFP荧光强度。
图4：终止子下游mcherry荧光强度的表征，其中control表示参照质粒，G-mch-5、G-mch-24、G-mch-31、G-mch-42、G-mch-52分别表示在质粒pBp43-GFP-mcherry的GFP与mcherry之间插入终止子T5、T24、T31、T42、T52后，测定的各终止子的下游mcherry荧光强度。
图5：终止子元件兼容性的验证，其中inRBS-5、inRBS-24、inRBS-31、inRBS-42、inRBS-52分别表示在质粒pBp43-GFP-ins-mcherry的GFP与mcherry之间插入终止子T5、T24、T31、T42、T52后，测定的各终止子的终止效率。
图6：终止子终止效率报告基因表达量的表征，其中M：蛋白质分子量标准；inRBS-0：未加终止子；inRBS-5，inRBS-24，inRBS-31，inRBS-42，inRBS-52分别表示在质粒pBp43-GFP-ins-mcherry的GFP与mcherry之间插入终止子T5、T24、T31、T42、T52后，测定的各个不同元件中上下游蛋白质的表达量。
图7：终止子上游GFP荧光强度的表征，其中control表示参照质粒，其中inRBS-5、inRBS-24、inRBS-31、inRBS-42、inRBS-52分别表示在质粒pBp43-GFP-ins-mcherry的GFP与mcherry之间插入终止子T5、T24、T31、T42、T52后，测定的各终止子的上游GFP荧光强度。
图8：终止子下游mcherry荧光强度的表征，其中control表示参照质粒，其中inRBS-5、inRBS-24、inRBS-31、inRBS-42、inRBS-52分别表示在质粒pBp43-GFP-ins-mcherry的GFP与mcherry之间插入终止子T5、T24、T31、T42、T52后，测定的各终止子的下游mcherry荧光强度。
图9：终止子用于纳豆激酶表达量的表征，其中M：蛋白质分子量标准；NK-0：未加终止子；NK-5，NK-24，NK-31，NK-42，NK-52分别表示在纳豆激酶基因的3’末端添加终止子T5、T24、T31、T42、T52之后，测定的各终止子上游纳豆激酶的表达量。
图10：终止子用于天冬氨酸酶表达量的表征，其中M：蛋白质分子量标准；AspA-0：未加终止子；AspA-5，AspA-24，AspA-31，AspA-42，AspA-52分别表示在天冬氨酸酶基因的3’末端添加终止子T5、T24、T31、T42、T52之后，测定的各终止子上游天冬氨酸酶的表达量。
具体实施方式
下述实施例涉及的培养基如下：
Luria-Bertani(LB)液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，pH7.0。LB固体培养基：LB液体培养基里加入1.5％琼脂粉。
Terrific-Broth(TB)培养基:12g/L蛋白胨，24g/L酵母提取物，4g/L NaCl，17mMKH2PO4，72mM K2HPO4，pH 7.0。
SPⅠ培养基(20mL)：9.8mL SP-A溶液，9.8mL SP-B溶液，200μL 50％葡萄糖溶液，200μL 100×CAYE溶液，现用现混。
SPⅠI培养基(6mL)：5.88mL SPⅠ培养基，60μL 50mM CaCl2溶液，60μL 250mM MgCl2溶液，现用现混。
SP-A溶液：4g/L(NH4)2SO4，28g/L K2HPO4·3H2O，12g/L KH2PO4，2g/L二水柠檬酸钠。
SP-B溶液：0.4g/L MgSO4·7H2O。
100×CAYE溶液：20g/L Casamino acid，100g/L Yeast Extract。
100×EGTA溶液：3.8g/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)。
LB液体培养基及含有1.5％琼脂的LB固体培养基用于菌体筛选、培养和表征。TB培养基用于NK的分泌表达。
下述实施例中所涉及的枯草芽孢杆菌168转化方法如下：
挑单菌落枯草芽孢杆菌168接种至2mL的SP I培养基中，37℃摇床培养12-14h，得到种子液；按照1％(v/v)的接种量将种子液接种至5mL SP I培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD600。当OD600为1.0时，按照1％(v/v)的接种量将菌液转接至2mL的SPⅠI培养基中，于37℃、200rpm摇床孵育1.5h；向管中加入20μL 100×EGTA(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、200r/min摇床中培养10min后每1.5mL离心管分装500μL；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、200r/min的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液100μL均匀涂相应的选择性平板，37℃过夜培养12-14h。
下述实施例中所涉及的检测方法：
绿色荧光蛋白GFP荧光检测：
将检测样品12000r/min离心5min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，最后用等体积PBS缓冲液重悬菌液，取200μL至96孔酶标板，放入Synergy TM H4荧光酶标仪检测荧光。程序设置为：600nm检测菌体浓度；激发光495nm，发射光525nm，增益60，检测荧光强度。
红色荧光蛋白mcherry荧光检测：
红色荧光蛋白mcherry荧光检测样品12 000rpm离心5min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用等体积PBS悬液菌体，取200μL至96孔酶标板，放入Synergy TM H4荧光酶标仪检测荧光。程序设置为：600nm检测菌体浓度；激发光587nm，发射光610nm，增益80，检测荧光强度。
终止效率的测定方法：
在这里我们用终止效率(TE)量化未通过终止子元件的转录延伸复合物的比例。破坏所有到达的转录复合物的终止子元件的TE值为100。GFP和mcherry的间隔序列的TE为0。因为表达的荧光报告基因的蛋白水平并不能直接用于测量TE值。我们用下游mcherry(FIDW)与上游GFP(FIUP)的荧光比值来估计终止子通读率(TR)。即TR＝FIDW/FIUP。使用标准化测试序列(即GFP和mcherry的间隔序列)建立了参考通读值(TRREF)，然后将所有TR测量值标准化：TRNORM＝TR/TRREF，并通过以下方式估算终止效率，TE＝100*(1-TRNORM)。
SDS-PAGE检测方法：
取出保藏的甘油菌划线至TB固体平板，37℃过夜培养后，挑取单菌落至试管，37℃培养8h-10h。按照初始细胞密度OD600＝0.05接种到含50mL TB培养基的250mL锥形瓶中，37℃，200r/min培养24h。
纳豆激酶的SDS-PAGE检测：
吸取发酵液1mL，12000r/min离心2min，吸取200μL上清，然后加入50μL的5×Loading buffer，沸水浴10min，上样检测。
天冬氨酸裂解酶的SDS-PAGE检测：
将培养基中的培养液取出1mL，12000r/min离心2min，收集菌体，用1×PBS缓冲液清洗3次，再加入含有1mg/mL溶菌酶的TE缓冲液悬浮，于37℃温浴2h。超声破碎，工作时长3s，间歇时间2s，直至菌悬液澄清透明。1 2000r/min离心20min，取200μL上清，然后加入50μL的5×Loading buffer，沸水浴10min，上样检测。
实施例1：终止子质粒构建和荧光蛋白重组表达
具体步骤如下：
(1)以pBp43-GFP-mcherry(G-mch)质粒为模板(构建方法公开于公开号为CN111662906A的专利申请文本中)，由公司合成的引物insulator-F/R进行全质粒PCR，在gfp和mcherry基因之间插入一段间隔序列(序列为：AATTAACAACTGATTCTGAATTCAAAAAATATCATTTGTGATTTGTTTAAAGAAAACGATTTAAAAATTTAAAA)，使用引物insulator-F/R进行全质粒PCR，得到测定新的终止子终止效率的参照质粒——pBp43-GFP-inRBS-mcherry(简称inRBS)。
(2)将合成的带酶切位点的引物序列经温度梯度退火连接成双链，之后将退火后的DNA双链序列与参照质粒pBp43-GFP-inRBS-mcherry经BamH I和SacⅡ酶切得到的片段用T4连接酶连接，构建携带终止子T5、T24、T31、T42或T52(见表2)的质粒，并进行DNA测序，DNA测序结果表明终止子成功连接到质粒pBp43-GFP-mcherry和pBp43-GFP-inRBS-mcherry的GFP和mcherry之间的酶切位点，证明成功构建了新的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体；分别得到重组质粒：pBp43-GFP-T5-mcherry、pBp43-GFP-T24-mcherry、pBp43-GFP-T31-mcherry、pBp43-GFP-T42-mcherry、pBp43-GFP-T52-mcherry；pBp43-GFP-T5-inRBS-mcherry、pBp43-GFP-T24-inRBS-mcherry、pBp43-GFP-T31-inRBS-mcherry、pBp43-GFP-T42-inRBS-mcherry、pBp43-GFP-T52-inRBS-mcherry。
(3)将得到的测序验证正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌168中，在37℃，静置培养12-14h后，挑取单菌落于5mL LB种子培养基中，37℃进行培养；按终OD600＝0.05转接至含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，200r/min，温度37℃，培养24h。
在终止效率测定平台G-mch中，测定筛选到的终止子的终止效率(图1和表3)、SDS-PAGE蛋白胶检测(图2)和荧光强度(图3、图4；表4、表5)，说明不同终止子GFP和mcherry表达量存在差异，表明不同的终止子具有不同的特征。终止子T42、T52、T5、T24、T31的终止效率逐渐升高，其中，添加T31终止子比不添加终止子时，上游GFP表达量提高了1.98倍，下游mcherry表达量降低了33.9倍；
在终止效率测定平台inRBS中，测定筛选到的终止子的终止效率(图5和表6)、SDS-PAGE蛋白胶检测(图6)和荧光强度(图7、图8；表7、表8)同G-mch平台中检测的一致：其中，添加T31终止子比不添加终止子时，上游GFP表达量提高了3倍，下游mcherry表达量降低了50倍。与对照相比，随着终止子终止效率的增加，下游mcherry的蛋白表达量也随之降低，与荧光测定值保持一致。
本实验说明五个终止子具有较强的兼容性。
表1引物表
表2终止子序列
表3终止子终止效率(G-mch)
| 终止子名称 | 终止效率(TE) |
| T5 | 85.09 |
| T24 | 90.90 |
| T31 | 98.42 |
| T42 | 43.33 |
| T52 | 58.07 |
表4终止子上游GFP荧光强度(G-mch)
| 终止子名称 | 上游GFP荧光强度(FTGFP/OD600) |
| 对照(G-mch) | 10225 |
| T5 | 18047 |
| T24 | 19032 |
| T31 | 20214 |
| T42 | 13400 |
| T52 | 17193 |
表5终止子下游mcherry荧光强度(G-mch)
表6终止子终止效率(inRBS)
| 终止子名称 | 终止效率(TE) |
| T5 | 88.87 |
| T24 | 92.46 |
| T31 | 99.34 |
| T42 | 48.71 |
| T52 | 72.69 |
表7终止子上游GFP荧光强度(inRBS)
| 终止子名称 | 上游GFP荧光强度(FTGFP/OD600) |
| 对照(inRBS) | 6533 |
| T5 | 14350 |
| T24 | 15294 |
| T31 | 19658 |
| T42 | 9346 |
| T52 | 11643 |
表8终止子下游mcherry荧光强度(inRBS)
| 终止子名称 | 下游mcherry荧光强度(FTmcherry/OD600) |
| 对照(inRBS) | 14621 |
| T5 | 3943 |
| T24 | 2600 |
| T31 | 292 |
| T42 | 10770 |
| T52 | 6988 |
实施例2：利用终止子构建纳豆激酶蛋白重组表达系统
(1)由公司合成引物序列(见表9)。
(2)纳豆激酶蛋白重组表达系统的构建：以PBP43-GFP-mcherry为模板，引物temp-NK-F/R，PCR扩增得到骨架；以pBS04-pro-NK为模板，NK-F/R为引物，通过PCR扩增方法得到PUT片段；将片段NK和骨架进行双片段组装(infusion组装)，接下来转化JM109，最后得到新的质粒并进行DNA测序，DNA测序结果表明成功得到了质粒PBP43-NK-0term(未连接本发明的终止子)，新的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体构建成功。
(3)以PBP43-NK-0term为模板，使用带有不同终止子的引物，见表1，通过全质粒PCR得到质粒并进行DNA测序，DNA测序结果表明成功得到了质粒PBP43-NK-5term，PBP43-NK-24term，PBP43-NK-31term，PBP43-NK-42term，PBP43-NK-52term。
(4)将得到的测序验证正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌168中，在37℃，静置培养12-14h后，挑取单菌落于5mL TB种子培养基中，37℃进行培养；按照初始细胞密度OD600＝0.05转接至含50mL TB培养基的250mL三角瓶中，200r/min，温度37℃，培养24h。
(5)取发酵液上清，通过SDS-PAGE验证其表达量(见图9)；添加终止子NK-24和NK-42较未添加终止子的表达量略微有所提升。
表9终止子引物表
实施例3：利用终止子构建天冬氨酸酶重组表达系统
(1)由公司合成引物序列(见表9)。
(2)天冬氨酸酶重组表达系统的构建：以PBP43-GFP-mcherry为模板，引物AspA-v-F/R，通过PCR扩增得到骨架；以pBp43-ECAspA为模板，AspA-i-F/R为引物，通过PCR扩增方法得到AspA片段。将片段AspA和骨架进行双片段组装(infusion组装)，接下来转化JM109，最后得到新的质粒并进行DNA测序，DNA测序结果表明成功得到了质粒PBP43-AspA-0term(未连接本发明的终止子)，新的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体构建成功。
(3)以PBP43-AspA-0term为模板，使用带有不同终止子的引物，通过全质粒PCR得到质粒并进行DNA测序，DNA测序结果表明成功得到了质粒PBP43-AspA-5term，PBP43-AspA-24term，PBP43-AspA-31term，PBP43-AspA-42term，PBP43-AspA-52term。
(4)将得到的测序验证正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌168中，在37℃，静置培养12-14h后，挑取单菌落于5mL TB种子培养基中，37℃进行培养；按照初始细胞密度OD600＝0.05转接至含50mL TB培养基的250mL三角瓶中，200r/min，温度37℃，培养24h。
(5)取一定量的发酵液，通过SDS-PAGE验证其表达量(见图10)；与未添加终止子的AspA-0比较，AspA-5和AspA-31的表达量有明显的提升，约为其2-3倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种调控基因表达的元件，其特征在于，所述元件为T31终止子，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的终止子在基因表达中的应用，其特征在于，将终止子置于需表达的基因的下游，与基因共表达。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因为编码纳豆激酶的基因，或编码天冬氨酸裂解酶的基因。
4.含有权利要求1所述元件的载体。
5.表达权利要求4所述载体的基因工程菌。
6.一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法，其特征在于，将权利要求1所述的元件与目的蛋白基因共表达。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis168、Bacillus subtilis WB400、Bacillus subtilis WB600或Bacillus subtilis WB800。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白为酶。
9.权利要求1所述的元件或权利要求5所述的基因工程菌在制备目的蛋白中的应用。
10.权利要求1所述的元件或权利要求5所述的基因工程菌在食品、制药或化工领域的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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