CN114672449B - 利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用，本发明通过融合PCR的方式构建启动子Ppr和乳铁蛋白的表达框，并利用P43启动子控制阻遏蛋白CI857的表达。进一步优化Ppr启动子上CI857结合位点的序列的间隔长度，通过发酵实验发现，不同长度的间隔序列导致不同的转录水平。其中三个结合位点之间的间隔序列分别为10bp时，与初始启动子相比，乳铁蛋白的转录水平提高了将近5倍，通过western blot发现乳铁蛋白的表达量增加了约3.2倍，达到了80mg/L。本发明能够有效的提高乳铁蛋白的表达量，并避免额外诱导剂的添加。

Description

利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与 应用

技术领域

本发明涉及一种利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种非血红素铁结合蛋白，是转铁蛋白家族中的一员，乳铁蛋白最显着的理化特性是其对铁的高亲和力，可提高铁在肠道细胞中的生物利用度，稳定还原后的铁离子，减少对肠胃的刺激，还具有抗氧化活性、抗菌、抗病毒活性，并具有抗癌和抗炎特性。乳铁蛋白的抗微生物活性已在体外和体内得到广泛证明体内对抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

在过去的十几年中，研究者以细菌、真菌、植物和动物细胞作为宿主进行乳铁蛋白的异源表达。目前，微生物合成乳铁蛋白最多的宿主是毕赤酵母，毕赤酵母表达系统虽然具有各哺乳类细胞的翻译后加工和修饰功能，是真核基因外源表达的理想宿主，但是甲醇氧化酶启动子Paox1是毕赤酵母中最常用的启动子之一。启动子Paox1需要甲醇作为唯一碳源进行诱导，而甲醇应用在食品工业中具有潜在的危害。哺乳动物细胞作为宿主虽然能够为乳铁蛋白进行糖基化修饰，更能模拟在人体中的状态，但是哺乳动物细胞生长周期很长，培养复杂，难以实现大规模的生产。因此，探寻一种即能高效表达乳铁蛋白，又能对减少在食品领域的隐患。

大肠杆菌表达系统经过不断的改进优化，具有生产周期短、效率高、成本低等一系列的优点，但是也存在系统自身的缺陷性，至今人们利用该系统仍无法解决膜蛋白以及一些毒性蛋白表达，严重制约着大肠杆菌表达系统的应用。利用大肠杆菌表达乳铁蛋白，合成的乳铁蛋白能够明显的抑制大肠杆菌的生长。

发明内容

为了解决需要添加额外的诱导剂使乳铁蛋白表达，并避免诱导剂所带来的潜在危害。本发明以大肠杆菌BL21为出发菌株，利用温敏型启动子Ppr表达乳铁蛋白，实现提高乳铁蛋白的表达量，以及无需添加诱导剂的目的，提供了一种增加蛋白表达水平的方法。

本发明的第一个目的是提供一种利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株，所述的菌株以大肠杆菌为宿主异源表达人乳铁蛋白，其中，所述的人乳铁蛋白通过Ppr启动子启动表达。

进一步地，所述的Ppr启动子包括三个阻遏蛋白CI857的结合位点，所述的阻遏蛋白CI857通过P43启动子控制表达。

进一步地，三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的间隔序列长度为10bp。

进一步地，所述的人乳铁蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，三个阻遏蛋白CI857的结合位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

进一步地，三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的间隔序列的氨基酸序列如SEQID NO.9所示。

进一步地，所述的人乳铁蛋白和Ppr启动子整合在质粒peT20b上。

进一步地，所述的宿主为大肠杆菌BL21。

本发明的第二个目的是提供所述的菌株的构建方法，包括如下步骤：

S1、将人乳铁蛋白编码基因和Ppr启动子序列整合至质粒peT20b上；

S2、在Ppr启动子上三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间分别插入间隔序列，获得重组质粒；

S3、将重组质粒转化至大肠杆菌宿主中，获得所述的菌株。

本发明的第三个目的是提供所述的菌株在发酵生产乳铁蛋白中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明通过融合PCR的方式构建启动子Ppr和乳铁蛋白的表达框，并利用P43启动子控制阻遏蛋白CI857的表达。进一步优化Ppr启动子上CI857结合位点的序列的间隔长度，通过发酵实验发现，不同长度的间隔序列导致不同的转录水平。其中三个结合位点之间的间隔序列均为10bp时，与初始启动子相比，乳铁蛋白的转录水平提高了将近5倍，通过western blot发现乳铁蛋白的表达量增加了约3.2倍，达到了80mg/L。本发明能够有效的提高乳铁蛋白的表达量，并避免额外诱导剂的添加。

附图说明：

图1为不同间隔序列对启动子活性的影响。

图2为乳铁蛋白的表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明以大肠杆菌BL21为出发菌株，利用温敏型启动子Ppr表达乳铁蛋白，实现提高乳铁蛋白的表达量，以及无需添加诱导剂的目的，提供了一种增加蛋白表达水平的方法。

本发明首先提供一种利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株，所述的菌株以大肠杆菌为宿主异源表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的人乳铁蛋白，其中，人乳铁蛋白通过Ppr启动子启动表达，Ppr启动子包括三个阻遏蛋白CI857的结合位点，阻遏蛋白CI857通过P43启动子控制表达。

本发明还通过调节三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的间隔序列长度，来调控人乳铁蛋白的转录水平，发现间隔序列长度为10bp时，乳铁蛋白的转录水平提高了将近5倍。本发明三个阻遏蛋白CI857的结合位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的长度为10bp的间隔序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在具体实施例中，本发明的人乳铁蛋白和Ppr启动子通过整合在质粒peT20b上，转化至大肠杆菌BL21宿主中进行表达。

实施例1：通过融合PCR构建温敏型启动子表达乳铁蛋白的开放阅读框

人源乳铁蛋白(HLF)的序列经过密码优化之后，由金唯智合成序列1(如SEQ IDNO.1所示)，并通过引物1和引物2扩增如表1。随后通过Gibson组装的方式将乳铁蛋白基因整合在peT20b质粒上，获得重组质粒peT20b-hlf。

表1扩增乳铁蛋白的引物

引物1(SEQ ID NO.14)	tcgctgcccagccggcgatggccATGAAATTGGTTTTTTTGGTTTTGTTGT
		引物2(SEQ ID NO.15)	gtgctcgagtgcggcTTTTCTCAAAAATTCACAAGCTTCCAACAATG
引物3(SEQ ID NO.16)	gcgtatcggtgattcattctgctaac
		引物4(SEQ ID NO.17)	AGCGACATCACCAGCACCAT

将上述反应液转化JM109感受态，过液培养获得的工程菌。利用引物3和引物4通过菌落PCR的方式验证重组质粒是否构建成功。

实施例2：通过融合PCR构建受温度调控的基因回路

阻遏蛋白CI857的基因序列通过金唯智公司合成序列2(如SEQ ID NO.2所示)，并通过引物5和6扩增如表2。并利用引物7和引物8扩增获得启动子Ppr序列3(如SEQ ID NO.3所示)，随后通过Gibson组装的方式将阻遏蛋白、启动子Ppr整合在实施例1中构建的peT20b-hlf质粒上，获得重组质粒peT20b-hlf-Ppr，构建温度调控基因回路。

表2扩增阻遏蛋白和启动子的引物

引物5(SEQ ID NO.18)	cccaacgctgcccgagatctttagccaaatgtttcttccggcca
		引物6(SEQ ID NO.19)	cttgcggtgatagatttaacgttgataggtggtatgttttcgcttga
引物7(SEQ ID NO.20)	caagcgaaaacataccacctatcaacgttaaatctatcaccgcaaggga
		引物8(SEQ ID NO.21)	gcggtcggcagcaggtatttcatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaatt

启动子Ppr上存在三个阻遏蛋白CI857的结合位点，名称分别为“Or3”、“Os2”、“Or1”。结合位点的序列分别为“CTATCACCGCAAGGGATA”(如SEQ ID NO.4所示)、“TAACACCGTGCGTGTTG”(如SEQ ID NO.5所示)和“TACCTCTGGCGGTGATAA”(如SEQ ID NO.6所示)。为了改变三个结合位点之间的间隔，同样利用Gibson组装的方式将不同长度的随机序列插入到三个结合位点之间(序列长度包括5bp、8bp、10bp、12bp、15bp和20bp)，间隔序列的碱基分别是“ATATC”(如SEQ ID NO.7所示)、“ACTATTTC”(如SEQ ID NO.8所示)、“CACTATTTCT”(如SEQ ID NO.9所示)、“GGTTGCATGTAC”(如SEQ ID NO.10所示)、“TGGTTGCATGTACGC”(如SEQ ID NO.11所示)、“ATTGGTTGCATGTACGCTCG”(如SEQ ID NO.12所示)。然后把重组质粒通过化学转化的方式转化进大肠杆菌中，然后通过发酵检测绿色荧光蛋白荧光的变化(图1)。结果显示，当间隔序列超过12bp时荧光水平随着间隔序列的增加而减弱。当间隔序列为10bp时，与初始启动子相比，荧光水平增加了将近5倍，最终确定Ppr启动子上最终的调控序列为 (如SEQ ID NO.13所示)，并将此重组质粒转化BL21中，获得表达菌株BL21-peT20b-hlf-Ppr^opt。

实施例3：重组菌株中串联启动子转录水平的测定

将菌株BL21-peT20b-hlf-Ppr^opt接种在TB培养基中并30度培养，在培养的过程中吸取500ul样品，检测细胞浓度的变化，随后液氮迅速降温冷冻保存。当细胞浓度达到最高时将温度转换为37度，同样的方式保存样品。最后使用研钵破碎菌体，通过Trizol提取RNA，根据反转录试剂盒说明书获得cDNA，进一步通过荧光定量试剂盒对不同菌体中乳铁蛋白的转录水平进行测定。其中检测乳铁蛋白转录水平的引物序列如表3所示。

表3乳铁蛋白qPCR引物序列

引物9(SEQ ID NO.22)	TTGGCTGTTGCTGTTGTTAGAAGAT
		引物10(SEQ ID NO.23)	CAGAACCAGGAGCACAAGATTGAG

结果显示，当在30度培养时，未检测到乳铁蛋白被转录，温度提升到37度时，乳铁蛋白得以转录。其中，当间隔序列为10bp时，乳铁蛋白的转录水平提高了大约5倍。

实施例4：重组菌株中乳铁蛋白的翻译水平的检测

将上述获得乳铁蛋白转录水平最高的菌株利用TB进行发酵，并且每天添加葡萄糖，保持发酵液中有持续不断的碳源，发酵2天。然后，离心收集上清液，通过离心浓缩，使用SDS-PAGE和western blot对乳铁蛋白进行定量分析。结果如图2所示，随着发酵时间的延长，乳铁蛋白的表达量逐渐增加，产量最终达到80mg/L。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学，白马未来食品研究院

<120> 利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2130

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgaaattgg tttttttggt tttgttgttt ttgggtgctt tgggtttgtg tttggctggt 60

agaaggagat ctgttcaatg gtgtgcagtt tctcaacctg aagctactaa atgttttcaa 120

tggcaaagaa atatgagaaa agttagaggt ccacctgttt cttgtattaa aagagattct 180

ccaattcaat gtattcaagc tattgctgaa aatagagctg atgctgttac attggatggt 240

ggtttcattt atgaagctgg tttggctcca tataaattga gacctgttgc tgctgaagtt 300

tatggtactg aaagacaacc aagaactcat tattatgctg tcgctgttgt taaaaaaggt 360

ggttcttttc aattgaatga attgcaaggt ttgaaatctt gccatactgg attgagaaga 420

actgctggtt ggaatgttcc aattggtact ttgagaccat ttttgaattg gactggtcca 480

cctgaaccaa ttgaagctgc tgttgctaga tttttttctg cttcttgtgt tcctggtgct 540

gataaaggtc aatttccaaa tttgtgtaga ttgtgtgctg gtactggtga aaacaagtgt 600

gcattttctt ctcaagaacc atatttttct tattctggag cttttaaatg tttgagagat 660

ggtgctggtg atgtcgcttt tattagagaa tctactgttt ttgaagattt gtctgatgaa 720

gctgaaagag atgaatatga attgttgtgt cctgataata ctagaaagcc tgttgacaaa 780

tttaaagatt gtcacttggc tagagttcca tctcatgcag ttgttgctag atctgttaat 840

ggtaaagaag atgctatttg gaatttgttg agacaagctc aagaaaaatt tggtaaagat 900

aaatctccaa aatttcaatt gtttggttct ccatctggtc aaaaagattt attatttaaa 960

gattctgcta ttggtttttc tagagttcca ccaagaattg attctggttt gtatttgggt 1020

tctggttatt ttactgctat tcaaaatttg agaaaatctg aagaggaagt tgctgctaga 1080

agagctagag ttgtttggtg tgctgttggt gaacaagaat tgagaaaatg taatcaatgg 1140

tctggtttgt ctgaaggttc tgttacttgt tcttctgctt ctactactga agattgtatt 1200

gctttggttt tgaaaggtga agctgatgct atgtctttgg atggtggtta tgtttatact 1260

gctggtaaat gtggtttggt tcctgtttta gcagaaaatt ataaatctca acaatcttct 1320

gatcctgatc caaattgtgt tgatagacct gttgaaggtt atttggctgt tgctgttgtt 1380

agaagatctg atacttcttt gacttggaat tctgttaaag gtaaaaagtc ttgtcatact 1440

gctgttgata ggactgctgg ttggaatatt ccaatgggtt tgttgtttaa tcaaactggt 1500

tcttgtaaat ttgatgaata tttttctcaa tcttgtgctc ctggttctga tccaagatct 1560

aatttgtgtg ctttgtgtat tggtgatgaa caaggtgaaa ataaatgtgt tccaaattca 1620

aacgaaagat attatggtta tactggtgct ttcagatgtt tggctgaaaa tgctggtgac 1680

gttgcttttg ttaaggatgt tactgttttg caaaatactg atggtaataa caatgaagct 1740

tgggctaaag atttgaaatt ggctgatttt gctttgttgt gtttggatgg taaaagaaaa 1800

cctgttactg aggctagatc ttgtcatttg gcaatggctc caaatcatgc tgtcgtttct 1860

agaatggata aagttgaaag attgaaacaa gttttgttgc atcaacaagc taaatttggt 1920

agaaatggat ctgattgtcc tgataaattc tgtttgttcc aatctgaaac taaaaatttg 1980

ttgtttaatg ataatactga atgtttggct agattgcatg gtaaaactac ttatgaaaaa 2040

tatttgggtc cacaatatgt tgctggtatt actaatttga aaaaatgttc tacttctcca 2100

ttgttggaag cttgtgaatt tttgagaaaa 2130

<210> 2

<211> 714

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgtcaacaa aaaagaaacc gctgacacaa gaacaactgg aagatgcaag aagactgaaa 60

gcaatttatg aaaaaaagaa aaatgaactg ggcctgtcac aagaatcagt tgcagataaa 120

atgggcatgg gccaaagcgg cgttggcgca ctgtttaatg gcattaatgc actgaatgca 180

tataatgcag cactgctgac aaaaattctg aaagtttcag ttgaagaatt ttcaccgtca 240

attgcaagag aaatttatga aatgtatgaa gcagtttcaa tgcaaccgtc actgagatca 300

gaatatgaat atccggtttt ttcacatgtt caagcgggca tgttttcacc gaaactgaga 360

acatttacaa aaggcgatgc agaaagatgg gtttcaacaa caaaaaaagc atcagattca 420

gcattttggc tggaagttga aggcaattca atgacagcac cgacgggctc aaaaccgtca 480

tttccggatg gcatgctgat tctggttgat ccggaacaag cagttgaacc gggcgatttt 540

tgcattgcaa gactgggcgg cgatgaattt acatttaaaa aactgattag agatagcggc 600

caagtttttc tgcaaccgct gaatccgcaa tatccgatga ttccgtgcaa tgaatcatgc 660

tcagttgttg gcaaagttat tgcatcacaa tggccggaag aaacatttgg ctaa 714

<210> 3

<211> 141

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

acgttaaatc tatcaccgca agggataaat atctaacacc gtgcgtgttg actattttac 60

ctctggcggt gataatggtt gcatgtacta aggaggttgt ctagaaataa ttttgtttaa 120

ctttaagaag gagatataca t 141

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

ctatcaccgc aagggata 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

taacaccgtg cgtgttg 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

tacctctggc ggtgataa 18

<210> 7

<211> 5

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

atatc 5

<210> 8

<211> 8

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

actatttc 8

<210> 9

<211> 10

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

cactatttct 10

<210> 10

<211> 12

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

ggttgcatgt ac 12

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 11

tggttgcatg tacgc 15

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 12

attggttgca tgtacgctcg 20

<210> 13

<211> 73

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 13

ctatcaccgc aagggataca ctatttctta acaccgtgcg tgttgcacta tttcttacct 60

ctggcggtga taa 73

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 14

tcgctgccca gccggcgatg gccatgaaat tggttttttt ggttttgttg t 51

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 15

gtgctcgagt gcggcttttc tcaaaaattc acaagcttcc aacaatg 47

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 16

gcgtatcggt gattcattct gctaac 26

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 17

agcgacatca ccagcaccat 20

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 18

cccaacgctg cccgagatct ttagccaaat gtttcttccg gcca 44

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 19

cttgcggtga tagatttaac gttgataggt ggtatgtttt cgcttga 47

<210> 20

<211> 49

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 20

caagcgaaaa cataccacct atcaacgtta aatctatcac cgcaaggga 49

<210> 21

<211> 56

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 21

gcggtcggca gcaggtattt catatgtata tctccttctt aaagttaaac aaaatt 56

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 22

ttggctgttg ctgttgttag aagat 25

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 23

cagaaccagg agcacaagat tgag 24

Claims (5)

1.一种利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株，其特征在于，所述的菌株以大肠杆菌为宿主异源表达人乳铁蛋白和阻遏蛋白CI857，其中，所述的人乳铁蛋白通过改造后的Ppr启动子启动表达：

所述改造为，对SEQ ID NO.3所示的Ppr启动子进行改造，将其中SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的间隔序列替换为SEQ IDNO.9所示的核苷酸序列；

所述的阻遏蛋白CI857的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该阻遏蛋白CI857通过P43启动子控制表达；

所述的人乳铁蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述的人乳铁蛋白和改造后的Ppr启动子整合在质粒peT20b上。

3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述的宿主为大肠杆菌BL21。

4.一种权利要求1~3任一项所述的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将人乳铁蛋白编码基因和Ppr启动子序列、阻遏蛋白CI857和P43启动子整合至质粒peT20b上；

S2、在Ppr启动子上三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间分别插入间隔序列，获得重组质粒；

S3、将重组质粒转化至大肠杆菌宿主中，获得所述的菌株。

5.权利要求1~3任一项所述的菌株在发酵生产乳铁蛋白中的应用。