CN116947980B - 温度控制表达系统及其构建方法 - Google Patents
温度控制表达系统及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116947980B CN116947980B CN202310922344.7A CN202310922344A CN116947980B CN 116947980 B CN116947980 B CN 116947980B CN 202310922344 A CN202310922344 A CN 202310922344A CN 116947980 B CN116947980 B CN 116947980B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- promoter
- mci
- temperature
- pseva321
- prm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000007739 porin activity proteins Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 abstract description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 abstract description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 abstract description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 abstract description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 102220547369 Protein APCDD1_L65S_mutation Human genes 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 102220198147 rs1057519886 Human genes 0.000 description 3
- 102220042944 rs117812409 Human genes 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000544058 Halophila Species 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000206596 Halomonas Species 0.000 description 1
- 241001653918 Halomonas sp. Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102220490868 Myeloid cell nuclear differentiation antigen_K6N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101710126766 Repressor protein C Proteins 0.000 description 1
- 101710155259 Repressor protein CI Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000009125 negative feedback regulation Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 102200129085 rs118203931 Human genes 0.000 description 1
- 102220000257 rs62514891 Human genes 0.000 description 1
- 102220095092 rs777845808 Human genes 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10311—Siphoviridae
- C12N2795/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种温敏阻遏蛋白突变体mCI39，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，该突变体相较于CⅠ857而言，具有更强的动态范围。并且公开了采用该突变体所构建的温度控制表达系统。该温度控制表达系统在低温时阻遏目的基因的表达，高温时激活目的基因的表达，可用于蛋白质(胶原蛋白、纤连蛋白等)生产、小分子化合物(羟脯氨酸)合成等多方面，通过调控温度从而实验不同目标产物的合成与生产。本发明选用porin启动子来控制温敏阻遏蛋白的表达，可以明显提高目标蛋白的表达量。
Description
技术领域
本发明涉及温度控制表达系统及其构建方法，属于蛋白表达技术领域。
背景技术
工业菌株开发需要代谢工程策略，微生物则是代谢工程中改造的主要对象，以大规模合成所需产品。但传统的代谢工程手段大多是静态调控，通过设计和改造遗传编码元件对目标产物的代谢途径进行静态优化，这种调控方式是定向不可逆的，不具备灵活性，在大规模生产活动中对发酵表达的外在调节条件(温度、pH、溶氧等)要求较高；随着生物技术的发展，新的代谢工程改造技术也不断发展，出现了动态调控手段，相比于静态调控，动态调控具备可逆、灵活、能根据不断变化的环境做出相应的反应，包括温度控制表达系统。温度控制表达系统由于其快速感应温度变化以及外在条件操控的可控性，在微生物合成中具有极大的优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种温度控制表达系统，可以高效表达异源蛋白。
本发明采用的技术方案：
一种温敏阻遏蛋白突变体mCI39，是在温敏阻遏蛋白CⅠ857的基础具有如下突变位点：M1V、K6N、S33T、L65S、K68R、S108Y、K118E、D188G，其中温敏阻遏蛋白CⅠ857的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，突变体mCI39的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述的温敏阻遏蛋白突变体mCI39的编码基因，其DNA序列如SEQ ID No.3所示。
含有上述的温敏阻遏蛋白突变体mCI39的温度控制表达系统。
所述的温度控制表达系统用于表达目标蛋白，使用能与温敏阻遏蛋白mCI39结合的温敏启动子来控制目标蛋白编码基因的表达，通过温度变化控制目标蛋白编码基因转录表达，温敏阻遏蛋白mCI39采用组成型启动子来进行控制表达。
优选的，所述组成型启动子为porin启动子或pRM启动子。
优选的，所述组成型启动子为porin141启动子，其序列如SEQ ID No.7所示。
优选的，所述温敏启动子为pR启动子，其序列如SEQ ID No.8所示。
优选的，表达目标蛋白的载体结构为pSEVA321-porin-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因，或者载体结构为pSEVA321-pRM-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因。
优选的，还包括宿主菌，所述载体转化到宿主菌中。
本发明还公开了上述的温度控制表达系统的构建方法，其步骤包括：
(1)将λ噬菌体编码的温敏阻遏蛋白mCI39，连接到带有porin启动子的载体上得到pSEVA321-porin-mCI39；
(2)将温敏启动子-目标蛋白编码基因片段连接到pSEVA321-porin-mCI39载体上，最终得到载体pSEVA321-porin-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因；
(3)将载体pSEVA321-porin-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因转化到宿主菌，
完成温度控制表达系统的构建。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌和盐单胞菌。
本发明还公开了上述的温度控制表达系统的构建方法，其步骤包括：
(1)将λ噬菌体编码的温敏阻遏蛋白mCI39，连接到带有RM启动子的载体上得到pSEVA321-pRM-mCI39；
(2)将温敏启动子-目标蛋白编码基因片段连接到pSEVA321-pRM-mCI39载体上，最终得到载体pSEVA321-pRM-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因；
(3)将载体pSEVA321-pRM-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因中的RM启动子替换为porin启动子，得到载体pSEVA321-porin-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因；
(4)将载体pSEVA321-porin-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因转化到宿主菌，
完成温度控制表达系统的构建。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌或盐单胞菌。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种温敏阻遏蛋白突变体mCI39，在CⅠ857的基础上做如下突变：M1V+K6N+S33T+L65S+K68R+S108Y+K118E+D188G，该突变体相较于CⅠ857而言，具有更强的动态范围。采用该突变体所构建的温度控制系统在低温时阻遏目的基因的表达，高温时激活目的基因的表达，可用于蛋白质(胶原蛋白、纤连蛋白等)生产、小分子化合物(羟脯氨酸)合成等多方面，通过调控温度从而实验不同目标产物的合成与生产。本发明选用porin启动子，尤其是porin141启动子来控制温敏阻遏蛋白的表达，可以明显提高目标蛋白的表达量。
附图说明
图1为pSEVA321-pRM-CI857-pR-GFP的质粒图谱。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.温控系统的构建及表征
(1)pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP质粒的构建
λ噬菌体编码的温敏阻遏蛋白CⅠ857，其编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，中国专利文献CN112522285A已经公开了该蛋白，通过Snapgene软件设计引物，以PCR技术扩增出CⅠ857与载体pSEVA321骨架的基因片段后回收PCR产物，并利用同源臂引物，采用Gibson连接技术将CⅠ857与骨架片段连接，构建表达载体pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP，质粒图谱如图1所示。其中pR是温敏阻遏蛋白相对应的温控启动子，其序列如SEQ ID No.8所示，pRM的序列如SEQ ID No.9所示。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，以氯霉抗性筛选阳性转化子，挑选转化子进行琼脂凝胶电泳验证，选择阳性转化子进行测序验证及质粒抽提。
转化大肠杆菌S17-1、DH5α、BL21(DE3)、MG1655和JM109感受态细胞：在冰上缓慢融解感受态细菌(对于新鲜制备的感受态可以直接使用)，加入3-5ul连接产物，轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和质粒连接产物，冰浴放置30min，结束后42℃水浴热激1.5min后冰浴2min，加入500ul LB，于37℃、220rpm恒温摇床培养1小时，培养后2000-3000g离心1min使菌体沉淀，留下约50-100ul上清重悬沉淀，然后全部涂布到含有氨苄素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜。选择阳性转化子送测，以带有测序结果正确质粒的菌株进行后续测试。
(2)温控系统在不同类型大肠杆菌中的测试
挑取带有pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP表达系统的E.coli菌株单克隆，接种到含有1mlLB培养基的深孔板中，分别以LB培养基与野生型S17-1、DH5-、BL21(DE3)、MG1655和JM109菌株为对照，在30℃与37℃分别培养12h后转接1％量到1ml新的LB培养基中，分别在12h培养后使用酶标仪测试荧光强度，检测该系统的可行性。
将带有pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP表达系统的E.coli菌株单克隆的酶标仪数据减去野生型菌株的酶标仪数据，得到不同类型大肠杆菌中的酶标仪分析数据如表1所示。
表1：pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP表达质粒在不同类型大肠杆菌中的表达水平
| FI/OD | 30℃ | 37℃ |
| pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP-S17-1 | 0.95 | 54.72 |
| pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP-DH5α | 1.16 | 58.61 |
| pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP-BL21(DE3) | 1.32 | 69.94 |
| pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP-MG1655 | 1.27 | 82.43 |
| pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP-JM109 | 1.50 | 168.38 |
由表1可知，当该系统在JM109中表达时，其荧光值最高，故后续温敏阻遏蛋白的突变体筛选均在JM109中进行。
实施例2.温控系统的优化——温敏阻遏蛋白CⅠ857突变体筛选
(1)使用易错PCR对编码CI857阻遏蛋白的基因进行随机突变，得到一系列mCI857基因片段，以此在体外构建突变库；
(2)将一系列突变基因mCI857插入到pSEVA321骨架得到系列载体
pSEVA321-pRM-mCⅠ857-pR-GFP，将以上系列载体转化E.coli JM109，获得表达阻遏蛋白突变基因的表达系统；
(3)理想情况下，CI857阻遏蛋白在低于30℃能与PR启动子的操纵区域OR结合，从而抑制绿色荧光蛋白基因的转录表达；当温度高于37℃时，阻遏蛋白从OR解离下来，RNA聚合酶得以进行转录，从而表达绿色荧光蛋白；采用流式细胞仪初步分选出在不同温度培养条件下荧光强度较高的细胞，得到不同温度敏感的mCI39变异体，在39℃以及42℃下能使荧光蛋白发光，其中mCI39变异体相较于CI857阻遏蛋白的突变位点为M1V+K6N+S33T+L65S+K68R+S108Y+K118E+D188G；
(4)分别对以上变体进行酶标仪验证不同温度敏感的mCI突变体的荧光表达效果，其结果如表2所示。
表2：温敏阻遏蛋白CⅠ857及其mCI39突变体在不同温度下的荧光表达效果：
实施例3.温控系统的优化——温敏蛋白启动子优化
通过Snapgene软件设计引物，使用T4连接酶将控制CI857阻遏蛋白表达的启动子pRM替换为不同表达强度的porin(porin141>porin140>porin58)启动子，其中porin58启动子的序列如SEQ ID No.5所示，porin140启动子的序列如SEQ ID No.6所示，porin141启动子的序列如SEQ ID No.7所示，具体步骤为：
S1、在pRM两侧位点设计引物，将启动子序列作为同源臂，其中porin58的引物序列如SEQ ID No.10-11所示，porin140的引物序列如SEQ ID No.12-13所示，porin141的引物序列如SEQ ID No.14-15所示；
S2、使用引物对pSEVA321-pRM-CⅠ857-pR-GFP进行基因片段扩增，扩增出的片段为环p产物；
S3、使用T4 DNA Ligase将环p产物进行连接，反应总体系为10ul，在0.2ml的PCR小管中依次加入表3所示的下列成分：
表3连接反应体系
将以上成分混匀后，瞬时离心，16℃过夜连接(或25℃1小时)，获得连接产物；
S4、将S3反应后的产物转入JM109感受态，从反应体系取出3-5ul于冰上与感受态混合均匀，并冰浴30min，其后水浴锅中42℃热激90s，然后立即置于冰上2min，再加入500ulLB培养基，37℃摇床中振荡培养1小时后涂布于相应抗性的平板上，在37℃摇床中倒置培养12-14小时；
S5、挑取S4中培养板的单克隆菌落进行PCR，选择阳性克隆进行测序，将测序结果与原始目的基因序列进行比对，确认是否成功将启动子进行更换，若成功更换，则进行质粒提取以及菌液保藏。
按实施例1的方法测量不同启动子的荧光表达效果，其结果如表4所示。
表4：不同启动子的荧光表达效果
从上表可知，在37℃时，选用porin 141启动子，荧光值最强，说明porin 141启动子更有利于目的基因的表达。
实施例4.温控系统与阻遏蛋白lacI的偶联
为了开发一个温度依赖的双功能控制开关，在此构建两个模块——其中一个是由温敏阻遏蛋白CI857突变体基因编码的CI857突变体，另一个是由phIF编码的抑制因子phIF。并在PphIF启动子控制下引入LacI抑制子和相关操作子LacO来实现对pR启动子转录活性的负反馈调控(参考文献DOI为：https://doi.org/10.1038/s41467-021-21654-x)。以绿色荧光蛋白GFP与红色荧光蛋白mRFP为报告蛋白，将突变体mCI39构建到pSC101载体上得到pSC101-pRM-mCI39-pR-GFP,结合LacI/LacO进行调控。
GFP与mRFP在CI857与mCI39中以37℃培养不同时间点的荧光强度如下表所示：
表5 GFP与mRFP在CI857与mCI39中以37℃培养不同时间点的荧光强度
实施例5.温控系统在嗜盐单胞菌中的应用
将CI857与上述实施例3中的阻遏蛋白变体mCI39构建到载体上pSEVA321上，以绿色和红色荧光蛋白作为指示蛋白，生成pSEVA321-pRM-CI857-pR-GFP及pSEVA321-pRM-mCI39-pR-mRFP，将前述两质粒共转接合到嗜盐单胞菌Halomonas sp.TD1.0中，分别在37℃和39℃下培养12h后测试该系统在37℃(改造前)和39℃(改造后)的表达情况，表达结果如表6所示。
表6改造前后的荧光表达效果
| FI/OD | GFP | mRFP |
| 37℃(改造前) | 398.04 | 1.04 |
| 39℃(改造后) | 1.73 | 479.63 |
表明该温控系统在窄温范围内能起到很好的调控效果，从而可以使该系统在盐单胞菌中有更广泛的应用。
实施例6.温控系统在异源蛋白表达中的应用
目前用基因重组技术构建工程菌来获得大量外源基因产物，但外援基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的关系，还与其所处的环境条件息息相关。温度是影响工程菌生长、质粒稳定性和重组产物形成的重要因素。大多数蛋白在低温时有较好的表达，但低温时菌体的生长会受限，为了在有较多的菌体密度的条件下更多表达外源蛋白，在此设计温度控制系统应用于不限胶原蛋白的其他蛋白生产表达。所述宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜盐单胞菌等；
以胶原蛋白(Col)生产为例，具体步骤如下：
S1.将胶原目的基因Col连接到pSEVA321-pRM-mCI39-pR骨架或pSEVA321-pRM-CI857-pR骨架上，通过Gibson后获得pSEVA321-pRM-mCI39-pR-Col质粒、pSEVA321-pRM-CI857-pR-Col质粒；
S2.将构建完成的质粒通过热激转化的方式转化到E.coli BL21(DE3)感受态菌株中即为表达菌株；
S3.挑取上述表达菌株的单菌落，转接到接有5ml LB培养液的摇菌管中(一级培养液)，37℃过夜培养，再以1％的一级培养液接入20mlLB培养液中(二级培养液)，37℃培养12h后取5％二级培养液接到50ml LB培养液中，并且将温度设定在37℃，220rpm震荡培养至OD为0.6-0.8左右时，加入IPTG诱导胶原蛋白的产生，同时将温度提高到42℃诱导胶原蛋白的产生，诱导时间为3h，再将温度降低到39℃，继续诱导5小时以实现胶原的高水平生产，胶原按常规方法纯化，得到的产量数据如表7所示。
表7 CI857与mCI39表达胶原蛋白的产量比对
| pSEVA321-pRM-CI857-pR-Col | pSEVA321-pRM-mCI39-pR39-Col | |
| 蛋白产量(g/L) | 1.53 | 3.60 |
Claims (12)
1.一种温敏阻遏蛋白突变体mCI39，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.权利要求1所述的温敏阻遏蛋白突变体mCI39的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其DNA序列如SEQ ID No.3所示。
4.含有权利要求1所述的温敏阻遏蛋白突变体mCI39的温度控制表达系统；其中温度控制表达系统用于表达目标蛋白，其特征在于使用能与温敏阻遏蛋白突变体mCI39结合的温敏启动子来控制目标蛋白编码基因的表达，通过温度变化控制目标蛋白编码基因转录表达，温敏阻遏蛋白突变体mCI39采用组成型启动子来进行控制表达。
5.根据权利要求4所述的温度控制表达系统，其特征在于所述组成型启动子为porin启动子或pRM启动子；所述组成型启动子为porin141启动子，其序列如SEQ ID No.7所示。
6.根据权利要求4所述的温度控制表达系统，其特征在于所述温敏启动子为pR启动子，其序列如SEQ ID No.8所示。
7.根据权利要求4所述的温度控制表达系统，其特征在于表达目标蛋白的载体结构为pSEVA321-porin- mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因，或者载体结构为pSEVA321-pRM-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因。
8.根据权利要求7所述的温度控制表达系统，其特征在于还包括宿主菌，所述载体转化到宿主菌中。
9.权利要求4-8中任一项所述的温度控制表达系统的构建方法，其特征在于其步骤包括：
（1）将λ噬菌体编码的温敏阻遏蛋白突变体mCI39，连接到带有porin或pRM 启动子的载体上，得到pSEVA321- porin - mCI39或者pSEVA321- pRM - mCI39载体；
（2）将温敏启动子-目标蛋白编码基因片段连接到pSEVA321- porin - mCI39或者pSEVA321- pRM - mCI39载体上，最终得到载体pSEVA321- porin - mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因或pSEVA321-pRM - mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因；
（3）将载体pSEVA321- porin - mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因或pSEVA321-pRM- mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因转化到宿主菌，完成温度控制表达系统的构建。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌和盐单胞菌。
11.权利要求4-8中任一项所述的温度控制表达系统的构建方法，其特征在于其步骤包括：
（1）将λ噬菌体编码的温敏阻遏蛋白突变体mCI39，连接到带有pRM启动子的载体上得到pSEVA321- pRM - mCI39；
（2）将温敏启动子-目标蛋白编码基因片段连接到pSEVA321- pRM - mCI39载体上，最终得到载体pSEVA321- pRM - mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因；
（3）将载体pSEVA321- pRM - mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因中的pRM启动子替换为porin启动子，得到载体pSEVA321-porin- mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因；
（4）将载体pSEVA321-porin-mCI39-温敏启动子-目标蛋白编码基因转化到宿主菌，完成温度控制表达系统的构建。
12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌或盐单胞菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310922344.7A CN116947980B (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 温度控制表达系统及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310922344.7A CN116947980B (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 温度控制表达系统及其构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116947980A CN116947980A (zh) | 2023-10-27 |
| CN116947980B true CN116947980B (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=88448602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310922344.7A Active CN116947980B (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 温度控制表达系统及其构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116947980B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522285A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-03-19 | 江南大学 | 一种温度控制表达系统与应用 |
| CN114672449A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-06-28 | 江南大学 | 利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10975420B2 (en) * | 2015-12-18 | 2021-04-13 | California Institute Of Technology | Thermal bioswitches and related genetic circuits, vectors, cells, compositions, methods and systems |
-
2023
- 2023-07-26 CN CN202310922344.7A patent/CN116947980B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522285A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-03-19 | 江南大学 | 一种温度控制表达系统与应用 |
| CN114672449A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-06-28 | 江南大学 | 利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116947980A (zh) | 2023-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mertens et al. | Tight transcriptional control mechanism ensures stable high-level expression from T7 promoter-based expression plasmids | |
| CN109486847B (zh) | 基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统 | |
| CN112522285B (zh) | 一种温度控制表达系统与应用 | |
| CN116947980B (zh) | 温度控制表达系统及其构建方法 | |
| CN107723287B (zh) | 一种增强丝蛋白生产制备的表达系统 | |
| CN107541482B (zh) | 一种构建大肠杆菌高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法 | |
| CN108866057B (zh) | 一种大肠杆菌压力响应型启动子及其制备方法 | |
| CN111621854A (zh) | Trc启动子突变文库及其应用 | |
| CN114774419B (zh) | 一种温敏型基因回路系统及其构建方法与应用 | |
| CN112608911B (zh) | 一种rna聚合酶突变体及其应用 | |
| Beshay et al. | Increasing the secretion ability of the kil gene for recombinant proteins in Escherichia coli by using a strong stationary-phase promoter | |
| Parrilli et al. | Heterologous protein expression in psychrophilic hosts | |
| Ben et al. | An auto-inducible expression system based on the RhlI-RhlR quorum-sensing regulon for recombinant protein production in E. coli | |
| US20220411807A1 (en) | Auto-induction regulatory system based on quorum sensing and application thereof | |
| CN105695472B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌发酵生产启动子及其应用方法 | |
| CN116286926B (zh) | 一种双荧光报告质粒的构建及其在检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平中的应用 | |
| Gupta et al. | Strategies for enhancing product yield: design of experiments (DOE) for Escherichia coli cultivation | |
| US20230058740A1 (en) | Robust Protein Expression Enabled by Dynamic Control over Host Proteases | |
| CN115838712B (zh) | 具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在l-肌肽合成中的应用 | |
| CN113699174B (zh) | 一种自诱导表达系统及其在促进基因表达中的应用 | |
| CA2705077C (en) | Inducible/regulated gene expression system in e. coli | |
| CN110607317A (zh) | 一种利用新型dCas9调控基因表达的方法 | |
| CN115124605B (zh) | 耐高温元件突变体及其在生产氨基酸中的应用 | |
| CN117210486A (zh) | 一种蛋白互作检测系统及其应用与检测蛋白互作的方法 | |
| CN117106812A (zh) | 一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸fpp的报告系统、构建方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Country or region after: China Address after: Room 302, 3rd Floor, Building A8, No.12 Biotech Valley Avenue, Torch Development Zone, Zhongshan City, Guangdong Province, 528437 Applicant after: Guangdong Puyan Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 2308B, 23/F, No. 28 Longkou Heng Street, Tianhe District, Guangzhou City, Guangdong Province, 510630 Applicant before: Guangzhou Puyan Biotechnology Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| CB02 | Change of applicant information |