CN113699174B

CN113699174B - 一种自诱导表达系统及其在促进基因表达中的应用

Info

Publication number: CN113699174B
Application number: CN202110957797.4A
Authority: CN
Inventors: 刘松; 徐奎栋; 陈坚; 周景文
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2041-08-19
Also published as: CN113699174A

Abstract

本发明公开了一种自诱导表达系统及其在促进基因表达中的应用，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌为宿主，通过对枯草芽孢杆菌内源启动子PS1E进行核心区域的重构以及重要区域的随机突变，然后借助流式细胞仪的高通量筛选选择高荧光值的单克隆，经测序鉴定后，突变启动子后，将变体接种到摇瓶发酵验证，得到能使荧光强度显著提高的信号肽变体序列，在既能保持自诱导特性的同时，也具有强转录特性。使用其驱动普鲁兰酶的胞外表达，可使其胞外酶活提高至对照的5.66倍，从而为基因的过量表达提供一种新的策略。

Description

一种自诱导表达系统及其在促进基因表达中的应用

技术领域

本发明涉及一种自诱导表达系统及其在促进基因表达中的应用，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

启动子作为一种重要的调控元件会显著影响基因的表达水平。目前枯草芽孢杆菌中常用的启动子主要可以有两类：

一类是组成型启动子，常见组成型启动子有的P43、Pveg和PHpaII等。此类启动子能使目的蛋白高效表达，但是其泄露表达较为严重，无法精确的控制基因在特定时机的表达。因此，往往使细胞在生长阶段就参与目标物质的合成，不可避免的带来胜利负担，并最终影响目标物质的产量。

另一类是诱导型启动子，此类启动子在枯草芽孢杆菌表达系统中应用最为广泛。该类启动子在未添加诱导剂时，通常会对基因具有很明显的沉默作用；而通过添加适当浓度的特定诱导剂可以实现调控目的基因的高效表达。然而，额外添加的诱导剂不仅比较昂贵，不适合大规模的工业生产。并且在特定时机添加这一方式，无形中增加了人工监管成本等问题。并且，诱导剂的瞬时过量添加，本身会对宿主生长产生影响。

细菌细胞能够释放一种称为自诱导物的小分子化学物质，自诱导物随着附近环境中的细菌浓度增加而逐渐积累，当其浓度达到某个阈值时会被细菌检测到并产生响应，使得菌体统一产生基因表达的变化，这个过程被称为群体感应。通过这种独特的机制，细菌群体能够完成刺激代谢调控、生物荧光、蛋白分泌、运动、毒力蛋白表达以及生物被膜的产生等等复杂的行为。通过将能感知这种自诱导物的启动子融合在目的基因的上游，便可实现对目的基因表达的动态调控。即可控制目的基因在特定时机表达，有不需添加额外的诱导剂。

然而依据群体感应构建的自诱导表达系统，难以做到像添加诱导剂那样容易精确控制。而诱导起始时间，对于目标蛋白的生产十分重要。因此，构建一种可精准控制表达起始的自诱导系统很有必要。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明通过使用时期启动子来调节枯草芽孢杆菌ComQXPA群体感应系统，从而构建了可精准控制表达起始的自诱导生产系统。

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌自诱导表达系统，所述自诱导表达系统包含启动子、自诱导蛋白ComX、异戊二烯转化酶ComQ和激活蛋白ComA，膜蛋白ComP；所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，利用启动子P_abrB、P_sigW或P_{xyn A}分别启动自诱导蛋白ComX和激活蛋白ComA的表达。

在一种实施方式中，所述启动子P_abrB、P_sigW、P_{xyn A}的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3～5所示。

本发明提供了一种生产目的蛋白的方法，所述方法是利用所述自诱导表达系统启动目的蛋白的表达；所述目的蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白、普鲁兰酶。

在一种实施方式中，将目的蛋白连接至核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子的下游，构建得到重组质粒，将所述重组质粒转入枯草芽孢杆菌中，构建得到重组菌。

在一种实施方式中，将重组菌接种至培养体系中，在35～40℃、震荡培养获得OD₆₀₀为4.5±1的菌液，将菌液按反应体系体积的1～5％比例接种至发酵体系中，在30～35℃、200～250rpm发酵48小时。

在一种实施方式中，当目的蛋白为绿色荧光蛋白时，使用启动子P_{xyn A}分别启动自诱导蛋白ComX和激活蛋白ComA的表达。

在一种实施方式中，当目的蛋白为普鲁兰酶时，分别使用启动子P_sigW和P_{xyn A}启动自诱导蛋白ComX和激活蛋白ComA的表达。

在一种实施方式中，所述普鲁兰酶NCBI登录号为AMQ67157。

在一种实施方式中，将编码所述普鲁兰酶的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

在一种实施方式中，编码所述绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了所述枯草芽孢杆菌自诱导表达系统在蛋白生产中的应用。

在一种实施方式中，所述蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白、普鲁兰酶。

本发明的有益效果：本发明使用了一种自行筛选到的能够提高目的基因表达量的P_S1E启动子，该启动子能够适应ComQXPA群体感应系统并在其中发挥相应的作用。在此基础上，通过使用3类时期启动子来动态调节ComQXPA群体感应系统中自诱导物ComX和激活子ComA的表达，可以使该系统的表达起始时机在1.5小时至9.5小的范围内精细调节。使用这些自诱导表达系统，来表达普鲁兰酶时，可使其胞外酶活提高至1.4倍。

附图说明

图1为ComQXPA系统的原理图；

图2为自诱导启动子P_S1E表达sFGFP时的发酵过程曲线；

图3为使用3种时期启动子调控ComX和ComA；

图4为生成的16种自诱导表达系统的sfGFP的荧光强度情况；

图5为16种自诱导表达系统的比生产速率曲线；

图6为16种自诱导表达系统的自诱导起始时机；

图7为自诱导启动子P_S1E表达Pul的质粒图谱；

图8为16种自诱导表达系统的在表达Pul时的酶活情况。

具体实施方式

1、培养基

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5；

发酵培养基(TB培养基)：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL；各组分溶解后高压灭菌；冷却到60℃，再加100mL灭菌的0.17mol/L的KH₂PO₄、0.72mol/L的K₂HPO₄溶液(2.31g的KH₂PO₄和12.54g的K₂HPO₄溶在足量的水中，使终体积为100mL；0.22μm的滤膜过滤除菌)。

2、培养方法

种子培养：挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；

发酵培养：按4％的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，发酵48h。

3、绿色荧光蛋白表达量及生物量测定

在96孔板中假如200μL稀释后的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，绿色荧光激发波长：480nm，绿色荧光发射波长：520nm，细胞生长OD吸收波长：600nm。

4、利用PDG148质粒敲除抗性片段：具体方法参见Yan,X.；Yu,H.；Hong,Q.；Li,S.J.A.,Cre/lox System and PCR-Based Genome Engineering in Bacillus subtilis.Appl.Environ.Microbiol.2008,74(17),5556-5562。

5、普鲁兰酶酶活测定方法

将1mL 1mg/100mL的普鲁兰多糖底物和0.9mL 100mM pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液混合均匀，置于60℃水浴锅内预热10min，加入普鲁兰酶液0.1mL，反应10min后，加入3mLDNS显色液，然后于沸水浴中煮7min，置于冰水中终止显色反应，再加10mL去离子水，混匀，在540nm下测定吸光值。

单位时间内生成1μmol还原糖的酶量定义为一个酶活力单位。

6、实施例中所使用的引物

7、质粒p7C6记载于文献Nicolas,P.；U.；Dervyn,E.,Condition-dependenttranscriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillussubtilis.Science 2012,335(6072),1103-6.中。

实施例1自诱导表达系统的构建及验证

在自诱导表达系统，ComQXPA群体感应系统的启动子P_SRFA用于基因表达。在ComQXPA群体感应系统中，ComX作为自诱导物，其随着细胞生长不断积累并分泌到胞外；随着细胞密度的增加，ComX到达阈值后，激活膜蛋白ComP的自磷酸化，随后其将磷酸激活转移给胞内蛋白ComA；最后磷酸化的ComA激活启动子P_SRFA的表达。

发明人前期将启动子P_SRFA的-35区为保守序列替换为TTGACA、并对-35和-10区进行饱和突变，筛选得到了一个能够显著提升蛋白表达量的启动子P_S1E(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，验证该启动子是否能够在ComQXPA群体感应系统中响应磷酸化的ComA、并有效启动下游基因的表达。

首先将群体感应启动子P_S1E(序列信息见SEQ ID NO.1所示)进行扩增，扩增所需引物为S1E/S1F。接着使用引物S1E-F-plasmid/S1E-R-plasmid扩增pP43NMK质粒骨架，通过一步克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司公司)替换表达载体P43NMK质粒原有启动子P₄₃，并利用相同的一步克隆方法，将sfGFP荧光蛋白基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)融合至P_S1E的下游作为报告基因，使用引物sfGFP-F和sfGFP-R扩增sfGFP荧光蛋白基因，使用sfGFP-F-plasmid/sfGFP-R-plasmid扩增质粒骨架，得到重组质粒P43NMK-S1E-sfGFP。

将重组质粒转入B.subtilis 600并于96孔细胞培养板中培养。每3h检测一下荧光强度和细胞生长状况。荧光强度定义为sfGFP荧光蛋白检测的吸收值与细胞生长OD₆₀₀的比值。结果显示重组菌株的荧光表达强度在低OD时荧光强度较弱，而随着细胞种群密度的增大，其荧光强度显著增强，如图3所示。

上述结果表明，启动子P_S1E满足自诱导性能。因此P_S1E其转录水平随着细胞种群密度的提高而不断增强，如图1所示。

实施例2不同时期启动子对ComQXPA群体感应系统的调控

由于当前构建的自诱导系统的自诱导起始时机是不可控的，而对与蛋白质表达而言，诱导蛋白的表达时机与蛋白产量息息相关，为了使自诱导系统有一个较宽的调控范围，从对ComQXPA群体感应系统中的自诱导蛋白ComX和激活蛋白ComA进行动态的调控入手，具体而言，使用3种在生长阶段不同时期表达的启动子来控制ComX和ComA的积累时机，以进一步影响自诱导系统中P_S1E启动子的表达时机。通过Cre-lox方法进行枯草芽孢杆菌的基因组编辑，使用生长早期表达启动子P_abrB(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、生长后期表达启动子P_sigW(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)和持续表达启动子P_{xyn A}(核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示)分别替换ComX和ComA的原有启动子，如图3所示，加上ComA和Pre-ComX本身的两个启动子，一共有16种启动子组合。

首先，以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，使用引物对Left homology-comX-F和Left homology-comX-R扩增PcomX的左右同源；接着以基因组为模板，使用Right homologyarm-comX-F和Right homology arm-comX-R扩增PcomX的右同源臂；然后以基因组为模板，使用AbrB-comX-F和AbrB-comX-R、SigW-comX-F和SigW-comX-R、XynA-comX-F和XynA-comX-R分别扩增3个时期启动子；最后以质粒p7C6为模板，使用comX-P7C6-F和comX-P7C6-R扩增抗性敲除框。

采用融合PCR将以上4个片段融合构建敲除框，然后将PCR产物纯化后，转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态中，于含有50μg/mL的氯霉素平板上生长。挑取阳性克隆，待序列鉴定正确后，使用PDG148质粒，敲除抗性片段。ComA启动子的替换同ComX策略一致，首先，以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，使用引物对Left homology arm homology arm-comA-F和Lefthomology arm homology arm-comA-R扩增PcomA的左右同源；接着以基因组为模板，使用Right homology arm homology arm-comA-F和Right homology arm homology arm-comA-R扩增PcomA的右同源臂；然后以基因组为模板，使用AbrB-comA-F和AbrB-comA-R、SigW-comA-F和SigW-comA-R、XynA-comA-F和XynA-comA-R分别扩增3个时期启动子；最后以质粒p7C6为模板，使用comA-P7C6-F和comA-P7C6-R扩增抗性敲除框。

最后，总共获得了16株枯草芽孢杆菌，他们分别具有不同的ComX和ComA启动子的组合，如图4所示。

使用originLab 2018拟合了这16株菌的比生产速率specific production rate，使用一阶动力学模型按照以下方程来计算：

其中X代表菌体生长情况，以OD₆₀₀表示；t代表培养时间(h)，P代表相对荧光强度。以上16株菌的比生产速率过程曲线如图5所示。根据比生产速率的过程曲线，大致可分为3类。第一类比生产速率曲线较为狭窄，在较早时机便开始快速上升，但在15小时后几乎不具有生产能力；第二类比生产速率曲线跨度相比更宽，在15小时后仍具有一定的生产能力；第三类比生产速率曲线有一定延滞型，在较早的时间内呈现较低的生产能力。将自诱导表达开启的时间点定义为：在比生产速率曲线过程中，首次超过比生产速率最大值10％的所对应的时间点。通过测定这16个菌的自诱导开启的时间点，结果如图6所示，这16株菌的自诱导时机在1.5-9.5小时之间。说明本实施例构建的自诱导系统，可以在一个较宽的范围内自动开启目标基因的自诱导。

实施例3：自诱导启动子在提高普鲁兰酶基因表达中的应用

使用引物将AprE信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和Pul(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)一步克隆试剂盒连接至pP43NMK质粒，将反应后的PCR产物转入E.coliJM109中，将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃培养至长出单克隆，挑取单克隆测序验证，得到质粒pP43NMK-Pul。

使用引物srfA-Pul-F和srfA-Pul-R扩增P_S1E启动子片段，接着使用引物srfA-Pul-plasmid-F和srfA-Pul-plasmid-R扩增pP43NMK-Pul的质粒骨架，通过一步克隆的方法将其融合在Apre信号肽与普鲁兰酶融合蛋白的N端，构建重组质粒P43NMK-S1E-Pul(质粒图谱如图7所示)。

将重组质粒P43NMK-S1E-Pul分别转化到实施例2构建的16株具有不同ComX和ComA启动子组合的枯草芽孢杆菌WB 600中，构建得到含有两个质粒的重组菌，并将重组菌接种至含有50μg/mL卡纳霉素抗性的20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、220rpm发酵8小时后，使得OD₆₀₀达到4.5±1，按照4mL/100mL的比例接种到含有50μg/mL卡纳霉素抗性25mL TB培养基的250mL摇瓶中，在30℃、250rpm发酵48小时，发酵结束后测定普鲁兰酶的胞外酶活，结果如图8所示：具有当使用P_sigW启动子来表达ComX、使用P_xynA表达ComA时，普鲁兰酶的酶活最高，达到80.2U/mL，是出发菌株的1.4倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种自诱导表达系统及其在促进基因表达中的应用

<130> BAA210981A

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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tgcctttttt tcggtttttg cgcggtacac atagtcatgt aaagattgta aattgcattc 120

agcaataaaa aaagattgaa cgcagcagtt tggtttaaaa atttttattt ttctgtaaat 180

aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 240

tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg ttgacacccc tgagacgttc 300

atttaaactg aacggtagaa agataaaaaa tattgaaaac aatgaataaa tagccaaaat 360

tggtttctta ttagggtggg gtcttgcggt ctttatccgc ttatgttaaa cgccgcaatg 420

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tttaagtgta gtactttggg ctatttcggc tgttagttca taagaattaa aagctgatat 540

ggataagaaa gagaaaatgc gttgcacatg ttcactgctt ataaagatta ggggaggtat 600

gacaat 606

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<212> DNA

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gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcgc 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcagtttc 300

aaggacgacg gcacatacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

ctggagtaca acttcaacag ccacaacgtc tatatcacgg ccgacaagca gaagaacggc 480

atcaaggcca acttcaagat ccgccacaac gtggaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

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<212> DNA

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ggatctgtac aagttcctgg tatttctatg atgatccttc accaagaagt ttctccagat 2160

cacggtaaaa aa 2172

Claims

1. 一种枯草芽孢杆菌自诱导表达系统，其特征在于，含有启动子P_S1E，枯草芽孢杆菌WB600来源的自诱导蛋白ComX、异戊二烯转化酶ComQ、激活蛋白ComA和膜蛋白ComP；所述自诱导蛋白ComX和激活蛋白ComA由启动子P_{xyn A}启动表达；所述启动子P_S1E的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述启动子P_{xyn A}的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。

2. 一种枯草芽孢杆菌自诱导表达系统，其特征在于，含有启动子P_S1E，枯草芽孢杆菌WB600来源的自诱导蛋白ComX、异戊二烯转化酶ComQ、激活蛋白ComA和膜蛋白ComP；所述启动子P_S1E的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述自诱导蛋白ComX由启动子P_sigW启动表达，所述激活蛋白ComA由启动子P_{xyn A}启动表达；所述启动子P_sigW、P_xynA的核苷酸序列分别如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

3. 一种生产普鲁兰酶的方法，其特征在于，利用权利要求2所述自诱导表达系统启动普鲁兰酶的表达；编码所述普鲁兰酶的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将普鲁兰酶的编码基因连接至核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子的下游，构建得到重组质粒，将所述重组质粒转入枯草芽孢杆菌中，构建得到重组菌。

5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将重组菌接种至培养体系中，在35~40℃、震荡培养获得OD₆₀₀为4.5±1的种子液，将种子液按反应体系体积的1~5%比例接种至发酵体系中，在30~35℃、200~250 rpm进行发酵。

6. 一种生产绿色荧光蛋白的方法，其特征在于，利用权利要求1所述自诱导表达系统启动绿色荧光蛋白的表达；编码所述绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将绿色荧光蛋白的编码基因连接至核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子的下游，构建得到重组质粒，将所述重组质粒转入枯草芽孢杆菌中，构建得到重组菌。