CN111850008B

CN111850008B - 促进蛋白胞外表达的信号肽

Info

Publication number: CN111850008B
Application number: CN202010749128.3A
Authority: CN
Inventors: 佟毅; 李义; 陶进; 刘松; 徐奎栋; 李江华; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangnan University; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: CN111850008A

Abstract

本发明公开了促进蛋白胞外表达的信号肽，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌为宿主，通过对枯草芽孢杆菌内源信号肽Ggt、YweA、YolA进行同义突变，高通量筛选选择高和低荧光值的单克隆，经测序鉴定后，突变信号肽后，将变体接种到摇瓶发酵验证，得到能使胞外蛋白量显著提高的同义突变序列，在保证蛋白正常翻译的同时，又能提高蛋白的表达量。Ggt、YweA、YolA信号肽的同义突变序列分别能使胞外酶活较野生型提高1.45、0.59、1.04倍，从而为酶的胞外高效表达提供一种新策略。

Description

促进蛋白胞外表达的信号肽

技术领域

本发明涉及促进蛋白胞外表达的信号肽，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)是一种被广泛使用的淀粉脱支酶，它可以水解淀粉多糖如普鲁兰多糖、支链淀粉、α-糊精、β-糊精、糖原和相关多糖中的α-1，6糖苷键。普鲁兰酶已经被广泛的应用于乙醇燃料、环糊精、抗性淀粉、麦芽三糖糖浆等产品的生产中。因为其水解多糖的性质，普鲁兰酶的表达体系最好能在食品级表达系统中构建。

枯草芽孢杆菌在食品工业、抗体生产和畜牧业中均具有重要的应用。但是，目前在枯草芽孢杆菌中普鲁兰酶的表达量很低，而且需要检测细胞生长状态，在合适的时机添加昂贵的蔗糖诱导剂，因此有必要进一步优化普鲁兰酶的产量。在目前的研究中主要是通过添加信号肽或对普鲁兰酶进行突变，以期能够提高酶的胞外表达量。对于普鲁兰酶本身的突变，虽然可以提高其胞外的表达量，但是常会使其本身的催化性质发生改变；而信号肽的添加虽然可提高酶的胞外表达量，但是其提高量仍然有限。

因此，需要提供一种新的方法来保证普鲁兰酶本身性质不发生改变的同时，又可提高其胞外表达量。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明选择了枯草芽孢杆菌中的信号肽Ggt、YweA、YolA，并对这些信号肽N端编码区(NCS)进行同义突变，这样既能够确保蛋白翻译不受影响的情况，又筛选出能显著提高蛋白表达量的信号肽，为蛋白的高效表达提供了一种新方法。

本发明提供了一类信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示任一。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽的核苷酸序列分别是信号肽Ggt、YweA和YolA的同义突变序列。

在本发明的一种实施方式中，信号肽Ggt的野生型序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的一种实施方式中，信号肽YweA的野生型序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，信号肽YolA的野生型序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明提供了含有信号肽Ggt、YweA和YolA的同义突变序列的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒上含有LytR启动子，LytR启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以P43NMK为出发载体。

本发明提供了含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽，或所述重组质粒的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌WB600为宿主。

本发明提供一种提高蛋白表达量的方法，利用所述含有核苷酸序列如SEQ IDNO.1～3所示的信号肽的生产蛋白。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基为TB培养基，在30～40℃、200～250rpm培养20～30小时。

本发明提供一种提高枯草芽孢杆菌胞外蛋白表达量的方法，在编码蛋白的核苷酸序列的N端添加核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽。

在本发明的一种实施方式中，在目的蛋白的N端添加核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽，并构建重组质粒，将重组质粒导入枯草芽孢杆菌获得重组菌，再利用此重组菌生产胞外蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括任意枯草芽孢杆菌分泌至胞外的蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括但不限于普鲁兰酶和/或sfGFP。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶的NCBI登录号为AMQ67157，根据枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优化，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述sfGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供一种提高酶活普鲁兰酶表达量的方法，将核苷酸序列如SEQ IDNO.1～3所示的信号肽添加至普鲁兰酶的N端。

在本发的一种实施方式中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽添加至普鲁兰酶的N端构建得到重组质粒，接着将重组质粒转入宿主中得到重组菌，再将重组菌在培养体系中发酵生产普鲁兰酶。

在本发的一种实施方式中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽插入编码普鲁兰酶的核苷酸序列的起始密码子ATG后。

在本发的一种实施方式中，所述培养体系中含有蛋白胨10～20g/L，酵母提取物20～30g/L，甘油1～5mL/L。

本发明还保护核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽，或所述重组质粒，所述重组菌在提高胞外蛋白表达量中的应用。

本发明还保护所述提高蛋白表达量的方法，或所述提高枯草芽孢杆菌胞外蛋白表达量的方法在提高胞外蛋白表达量中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过同义突变信号肽所得的核苷酸序列，分别将其融合在普鲁兰酶的N端，并转入枯草芽孢杆菌中进行表达，可显著提高和降低普鲁兰酶的胞外酶活产量。在这里，我们对筛选到的三条能促进普鲁兰酶分泌表达的信号肽(Ggt，YweA，YolA)，在N端前十个氨基酸进行同义突变，通过荧光蛋白的表征，在原有基础上，可进一步显著提高普鲁兰酶的胞外酶活，相比优化前提高了145％、59％和104％。

附图说明

图1为信号肽和sfGFP分别融合在普鲁兰酶N端和C端的表达质粒图谱(以Ggt为例)。

图2为信号肽融合在普鲁兰酶N端的表达质粒图谱(以Ggt为例)。

图3为野生型与NCS改造菌株分泌的普鲁兰酶胞外酶活。

具体实施方式

1、培养基

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5；

发酵培养基(TB培养基)：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL；各组分溶解后高压灭菌；冷却到60℃，再加100mL灭菌的0.17mol/L的K₂HPO₄、0.72mol/L的K₂HPO₄溶液(2.31g的K₂HPO₄和12.54g的K₂HPO₄溶在足量的水中，使终体积为100mL；0.22μm的滤膜过滤除菌)。

2、培养方法

种子培养：挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；

发酵培养：按4％的接种量接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，发酵48h。

3、绿色荧光蛋白表达量及生物量测定

在96孔板中假如200μL稀释后的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，绿色荧光激发波长：480nm，绿色荧光发射波长：520nm，细胞生长OD吸收波长：600nm。

4、普鲁兰酶酶活测定方法

将1mL 1mg/100mL的普鲁兰多糖底物和0.9mL 100mM pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液混合均匀，置于60℃水浴锅内预热10min，加入普鲁兰酶液0.1mL，反应10min后，加入3mLDNS显色液，然后于沸水浴中煮7min，置于冰水中终止显色反应，再加10mL去离子水，混匀，在540nm下测定吸光值。

单位时间内生成1μmol还原糖的酶量定义为一个酶活力单位。

实施例1：构建Ggt信号肽NCS同义突变文库

为了促进普鲁兰酶的高效表达，将先前实验室表征过的内源性转录水平最高的枯草芽孢杆菌转录LytR启动子(序列信息见SEQ ID NO.4所示)通过一步克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司公司)连接至P43NMK质粒，构建得到重组质粒，将重组质粒转入E.coli JM109中，将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃培养至长出单克隆，挑取单克隆经培养后提取质粒测序验证，得到质粒P43NMK-LytR；利用相同的一步克隆方法，将普鲁兰酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)通过一步克隆试剂盒融合至LytR的下游，构建得到重组质粒P43NMK-LytR-Pul；利用相同的一步克隆方法，将sfGFP荧光蛋白(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)连接至普鲁兰酶的C端，将Ggt信号肽野生型(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)连接至普鲁兰酶的N端，构建得到重组质粒P43NMK-Ggt-Pul。

以P43NMK-Ggt-Pul为模板，使用简并引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示)，PCR获得Ggt的N端前30位碱基的同义突变文库(同义突变重组质粒)，即前30位氨基酸序列不变，核苷酸序列改变。

实施例2：构建YweA信号肽NCS同义突变文库

具体实施方式同实施例1，区别在于，在得到P43NMK-LytR-Pul后，利用一步克隆法，分别将sfGFP荧光蛋白连接至普鲁兰酶的C端，将YweA信号肽野生型(核苷酸序列如SEQID NO.9所示)连接至普鲁兰酶的N端，构建得到重组质粒P43NMK-YweA-Pul。

以P43NMK-YweA-Pul为模板，使用简并引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.13所示)，PCR获得YweA的N端前30位碱基的同义突变文库(同义突变重组质粒)，即前30位氨基酸序列不变，核苷酸序列改变。

实施例3：构建YolA信号肽NCS同义突变文库

具体实施方式同实施例1，区别在于，在得到P43NMK-LytR-Pul后，利用一步克隆法，分别将sfGFP荧光蛋白连接至普鲁兰酶的C端，将YolA信号肽野生型(核苷酸序列如SEQID NO.10所示)连接至普鲁兰酶的N端，构建得到重组质粒P43NMK-YolA-Pul。

以P43NMK-YolA-Pul为模板，使用简并引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.14所示)，PCR获得YolA的N端前30位碱基的同义突变文库(同义突变重组质粒)，即前30位氨基酸序列不变，核苷酸序列改变。

实施例4：NCS同义突变文库的筛选

将实施例1～3中构建得到的同义突变重组质粒分别转化至表达宿主枯草芽孢杆菌WB600中，将转化液涂布于50μg/mL卡纳霉素抗性的LB平板，在37℃下培养至长出单克隆，挑取单克隆至含有200μL LB培养基的96浅孔板，培养种子液8小时；

接着，按照4mL/100mL的接种量接种至含有50μg/mL卡纳霉素抗性的800μL TB培养基的96深孔板，培养24小时，得到发酵液；

然后将发酵液迅速置于冰上冷冻，离心后，去除上清，将100mM的PBS缓冲液(pH7.2)稀释至合适倍数后，通过酶标仪测定荧光值(激发光480，吸收光520)以及OD₆₀₀。

定义相对荧光强度RFI＝荧光值/OD，根据RFI值的高低，选择相对荧光强度最高的细胞送至上海生工公司测序。

经测序鉴定后，Ggt信号肽在N端成功实现同义突变，突变的RFI值最高的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；YweA信号肽在N端成功实现同义突变，突变的RFI值最高核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；YolA信号肽在N端成功实现同义突变，突变的RFI最高的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。

实施例5：同义突变信号肽在生产普鲁兰酶中的应用

分别选择Ggt、YweA、YolA经序列鉴定无误后的RFI值最高的变体质粒，使用引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.15和16所示)通过PCR去除sfGFP荧光蛋白，以减少质粒片段大小从而增强质粒稳定性。将去除了sfGFP荧光蛋白后得到的质粒分别转化到枯草芽孢杆菌WB600中，并将其接种至含有50μg/mL卡纳霉素抗性的20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、220rpm发酵8小时后，使得OD₆₀₀达到4以上，按照4mL/100mL的比例接种到含有50μg/mL卡纳霉素抗性25mL TB培养基的250mL摇瓶中，在37℃、250rpm发酵30小时，发酵结束后测定普鲁兰酶的胞外酶活，结果如图3和表1所示：在通过NCS改造之后，由信号肽Ggt，YweA，YolA诱导的的普鲁兰酶酶活显著得到提高，分别较野生型提高了145％、59％和104％。

表1普鲁兰酶胞外酶活(U/mL)

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林中粮生化有限公司

江南大学

<120> 促进蛋白胞外表达的信号肽

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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ttacttcctt cgggccaagc tcatgca 87

<210> 3

<211> 81

<212> DNA

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<400> 3

aaaaaaagaa ttacttattc tctacttgct cttctagcag ttgttgcttt cgctttcact 60

gattcatcaa aagcaaaagc g 81

<210> 4

<211> 320

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 724

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn

1 5 10 15

Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala

20 25 30

Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val

35 40 45

Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly Gln Val Glu Ser Gly Val Lys

50 55 60

Thr Asp Leu Val Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His

65 70 75 80

Thr Leu Ser Ile Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro

85 90 95

Arg Asn Val Leu Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu

100 105 110

Gly Asn Thr Tyr Thr Gln Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro

115 120 125

Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser

130 135 140

Val Thr Lys Ile Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu

145 150 155 160

Ala Thr Val Asn Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val

165 170 175

Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala

180 185 190

Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr

195 200 205

Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile

210 215 220

Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp

225 230 235 240

Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu

245 250 255

Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu

260 265 270

Lys Gln Leu Gly Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser

275 280 285

Asn Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro Thr Gln Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp

290 295 300

Pro Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn

305 310 315 320

Gly Asn Ala Arg Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His

325 330 335

Arg Glu His Ile Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe

340 345 350

Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr

355 360 365

Arg Thr Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn

370 375 380

Glu Ile Ala Ala Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser

385 390 395 400

Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp

405 410 415

Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu

420 425 430

Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr

435 440 445

Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala

450 455 460

Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala

465 470 475 480

Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly

485 490 495

Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile

500 505 510

Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser

515 520 525

His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn

530 535 540

Asp Ser Glu Ala Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val

545 550 555 560

Val Met Thr Ser Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met

565 570 575

Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala

580 585 590

Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe

595 600 605

Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe

610 615 620

Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn

625 630 635 640

Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys

645 650 655

Asp Lys Trp Gly Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val

660 665 670

Ala Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser

675 680 685

Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln

690 695 700

Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp

705 710 715 720

His Gly Lys Lys

<210> 6

<211> 2172

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatgctgcta aaccagcagt ttctaacgct taccttgacg cttctaacca agttttagtt 60

aaattatctc aaccattaac attaggtgaa ggtgcttctg gtttcactgt acatgatgac 120

actgctaaca aagacatccc agtaacatct gtaaaagacg cttctttagg tcaagttgaa 180

tcaggtgtaa aaactgacct tgttactgtt actttaggcg aagatccaga tgtatctcac 240

actttatcta tccaaacaga cggttaccaa gctaaacaag taatcccacg taacgtactt 300

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gctactgtta accaaaactt agaaaactgg tactacatgt acgaagtaac tggtcaaggt 540

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atgatcgtag atttagctaa aactgaccca gcaggttgga actctgataa acacattact 660

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caattaatgc cagttttcgc atctaactca gttgacgaaa ctgatccaac acaatacaac 900

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ggtaacgcac gtattaaaga attcaaagaa atggttttat cactacaccg tgagcacatc 1020

ggtgttaaca tggacgttgt ttacaaccac acgttcgcta ctcaaatctc tgacttcgat 1080

aaaattgttc cagagtacta ttaccgcact gacgacgcag gtaactacac taacggttct 1140

ggtactggta acgaaattgc tgcagaacgt cctatggtgc aaaaattcat catcgatagc 1200

cttaaatact gggttaacga ataccacatt gacggcttcc gtttcgactt aatggcttta 1260

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actaaaggtg cacaaaaagg catgggagta gctgtattca acgataacct tcgtaacgca 1440

ttagacggaa acgttttcga ttcttctgct caaggattcg caacaggagc tacaggtctg 1500

actgatgcta ttaaaaacgg agttgaagga tcaatcaacg atttcacttc ttctcctggc 1560

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gttatgactt ctcaaggtgt acctttcatg caaggtggtg aagaaatgtt acgcactaaa 1740

ggtggtaacg ataacagcta taacgcgggt gatgctgtaa acgaattcga ctggtctcgt 1800

aaagctcaat accctgacgt tttcaactac tactcaggtt taatccacct tcgtcttgac 1860

catccagctt tccgtatgac aacagctaac gaaatcaact ctcaccttca attccttaac 1920

tcacctgaaa acacagtagc ttacgaactt actgaccacg taaacaaaga taaatggggt 1980

aacattatcg ttgtttacaa ccctaacaag actgtagcaa ctatcaactt accatctggt 2040

aaatgggcta tcaacgcaac tagcggtaaa gtaggtgaat ctacattagg tcaagctgaa 2100

ggatctgtac aagttcctgg tatttctatg atgatccttc accaagaagt ttctccagat 2160

cacggtaaaa aa 2172

<210> 7

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgaga ggcgagggcg agggcgatgc caccaatggc 120

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcgc 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcagtttc 300

aaggacgacg gcacatacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

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atcaaggcca acttcaagat ccgccacaac gtggaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

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ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact cacggcatgg acgagctgta caagtaa 717

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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gtcccttttc acgcggaagc t 81

<210> 9

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctaaaaagaa cttcattcgt atcttcatta ttcatcagtt cagctgtttt actatcaatc 60

ttacttcctt cgggccaagc tcatgca 87

<210> 10

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aagaagagaa ttacatattc actgcttgct cttctagcag ttgttgcttt cgctttcact 60

gattcatcaa aagcaaaagc g 81

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgtacattt cacctccttt aaattacttt cattat 36

<210> 12

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 12

atgaaragra cntggaaygt ntgyttracn gcnctgctta gtgttctgtt agtcgctgga 60

agtg 64

<210> 13

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 13

atgcgnaayt tracnaarac ntcnctnttr ctngccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60

g 61

<210> 14

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 14

atgaayatha araarttygc naarcargcn acngtattaa cctttactac cgcactgctg 60

g 61

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cggtaaaaaa taatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agat 44

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gataatctca ttatttttta ccgtgatctg gagaaacttc 40

Claims

1. 信号肽，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1~3任一所示。

2. 一种提高枯草芽孢杆菌胞外蛋白表达量的方法，其特征在于，在编码蛋白的核苷酸序列的N端添加SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示信号肽；所述蛋白为普鲁兰酶；所述普鲁兰酶的NCBI登录号为AMQ67157。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在普鲁兰酶的N端添加所述信号肽，并构建重组质粒，将重组质粒导入枯草芽孢杆菌。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述信号肽添加至普鲁兰酶的N端构建得到重组质粒，接着将重组质粒转入宿主中得到重组菌，再将重组菌在培养体系中发酵生产普鲁兰酶。

5.一种重组质粒，其特征在于，连接有权利要求1所述的信号肽。

6.一种重组菌，其特征在于，在菌体细胞中含有权利要求5所述的重组质粒。