CN115261363A

CN115261363A - Apobec3a的rna脱氨酶活性测定方法及rna高活性的apobec3a变体

Info

Publication number: CN115261363A
Application number: CN202110477071.0A
Authority: CN
Inventors: 李轩; 唐桂月; 荆新云
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2021-04-29
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2041-04-29
Also published as: CN115261363B

Abstract

本发明提供了一种APOBEC3A的RNA脱氨酶活性测定方法及RNA高活性的APOBEC3A变体。本发明人通过设计有效的构建体引入到宿主中，检测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性，该构建体通过操作性排列的荧光标记物以及RNA底物，可灵敏地检测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率。本发明也提供了一系列的APOBEC3A突变体，其RNA脱氨酶活性被增强、DNA脱氨酶活性被弱化或消除从而有利于实现专一性或相对专一性的RNA编辑。

Description

APOBEC3A的RNA脱氨酶活性测定方法及RNA高活性的APOBEC3A 变体

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及APOBEC3A的RNA脱氨酶活性测定方法及RNA高活性的APOBEC3A变体。

背景技术

DNA或RNA编辑机制在人的免疫反应中发挥着重要的作用，可以限制外来入侵者，如病毒，噬菌体，质粒，转座子等。此外，在细菌和高级真核生物中都发现了催化DNA和RNA碱基脱氨的脱氨基酶系统。腺苷和胞苷脱氨酶介导的腺嘌呤和胞苷脱氨是哺乳动物和植物中最常见的碱基编辑机制。其中，腺苷脱氨酶介导RNA中的腺嘌呤(A)脱氨成次黄嘌呤(I)，在转录翻译过程中I被识别成鸟嘌呤(G)，从而实现A>G的转变。胞苷脱氨酶则介导DNA或者RNA中胞嘧啶(C)脱氨成尿嘧啶(U)，尿嘧啶(U)在DNA中被聚合酶识别成胸腺嘧啶(T)，实现C>T的转变。腺苷和胞苷脱氨酶在生物过程中都表现出其生理功能，如免疫，发育，应激反应等。此外，通过与CRISPR效应子融合，CRISPR效应子作为锚，脱氨酶为催化剂创建了单碱基编辑器家族，实现了精准编辑DNA或RNA序列中的特定碱基。例如，将APOBEC1或APOBEC3与Cas9融合，创建了C>T的单碱基DNA编辑器。ADAR脱氨酶家族和已被修饰的ADAR与CRISPR-Cas13s融合，创建了A>I和C>U转换的单碱基RNA编辑器。

胞嘧啶脱氨酶的APOBEC家族对核酸进行C>U编辑。其中，APOBEC3作为其中最大的家族，由七个成员A，B，C，D，F，G和H组成。它们的基因位于人类基因组22号染色体的长臂上。所有APOBEC3蛋白均具有保守的锌依赖性HX₁EX_23–24CX_2-4 C脱氨酶基序。APOBEC3蛋白可以与DNA和RNA底物结合，并对5’-TC(DNA)和5’-UC(RNA)序列的底物具有偏好性。APOBEC3家族参与人类的先天免疫系统，对病毒(如乙型肝炎，HIV-1，HPV)进行编辑抑制病毒的复制发挥重要作用。此外，还通过限制转座因子(如LINE-1)的移动来实现抗病毒生理功能。APOBEC3蛋白也与癌症的发展有关。当过表达时，APOBEC3蛋白可以诱导DNA和RNA上数千个位点发生突变，从而导致癌变。

APOBEC3A作为APOBEC3家族成员中活跃的胞苷脱氨酶，可抑制体内逆转录病毒和内源性逆转座子的活性。据报道，APOBEC3A使ssDNA上的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶脱氨基，导致C至T突变，这与肿瘤的发生有关。APOBEC3A最初在正常外周血单核细胞中发现对琥珀酸脱氢酶B(SDHB)基因转录本(NCBI参考序列NM_003000)c.136处胞苷产生C>U的编辑。此外，还发现APOBEC3A在单核细胞或单核细胞衍生的巨噬细胞中对RNA底物进行编辑。当在293T细胞中过表达时，APOBEC3A会在数千个RNA转录本的诱导位点进行特异性脱氨。序列分析表明，由APOBEC3A编辑的RNA分子具有较长的侧翼反向序列重复序列的特征，该序列形成具有中央AUCG序列基序的茎环结构。

最近，APOBEC3A被用于与CRISPR-Cas9融合以创建单碱基基因编辑器，并成功地应用于β地中海贫血HBB启动子突变基因的纠正。但是，该编辑器显示基于APOBEC3A的基因编辑器同时对RNA分子具有广泛的脱靶效应，其脱靶效应主要是由APOBEC3A的RNA脱氨酶活性而引起。APOBEC3A对DNA和RNA底物的双重活性限制了其在基因编辑工具中的使用。为了检测脱靶的RNA脱氨活性，人们进行了许多努力来改造APOBEC3A从而降低RNA脱靶效应。并且，在测试改造的APOBEC3A的RNA脱氨酶活性中，本领域目前主要是通过转录组测序测试其活性，这大大增加了成本和时间。另一方面，APOBEC3A的RNA脱氨活性是目前开发新的C>U RNA编辑工具方面具有潜在用途。一个具有高RNA脱氨活性的APOBEC3A不仅对于开发C>U RNA编辑工具提供重要的酶而且对于未来解析APOBEC3与RNA结合的结构具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种APOBEC3A的RNA脱氨酶活性测定方法。

本发明的目的还在于提供一种RNA高活性的APOBEC3A变体。

在本发明的第一方面，提供一种提高APOBEC3A的RNA脱氨酶活性或专一性，或提高其RNA编辑率的方法，包括：改造其氨基酸序列，形成APOBEC3A突变体；该突变体包括选自：(1)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，下列位点发生组合突变的蛋白；第132位和第30位，第132位和第188-190位，第132位和第31位，第132位和第189位；(2)(1)蛋白的保守性变异蛋白，其对应于SEQ ID NO:1中的第132位和第30位，第132位和第188-190位，第132位和第31位，或第132位和第189位的氨基酸，与(1)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同。

在一个优选例中，所述的脱氨酶活性或专一性的提高为具有统计学意义的提高，如提高20％以上、40％以上、60％以上、70％以上或更高。

在本发明的另一方面，提供一种APOBEC3A突变体，包括：(1)氨基酸序列对应于SEQID NO:1，下列位点发生组合突变的蛋白；第132位和第30位，第132位和第188-190位，第132位和第31位，第132位和第189位；(2)(1)蛋白的保守性变异蛋白，其对应于SEQ ID NO:1中的第132位和第30位，第132位和第188-190位，第132位和第31位，或第132位和第189位的氨基酸，与(1)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同。

在一个优选例中，所述位点的突变包括：第132位突变为Gly；第30位突变为Arg；第31位突变为Ala；第188位突变为Ala；第189位突变为Ala；和/或，第190位突变为Ala。

在另一优选例中，所述的保守性变异蛋白包括：(a)将(1)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的蛋白；(b)与(1)蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性，且具有(1)蛋白功能的蛋白；或(c)(1)蛋白的活性片段，其包含APOBEC3A空间结构中发挥RNA脱氨酶活性的结构区，且具有(1)蛋白功能的蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码任一所述的APOBEC3A突变体。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的分离的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述宿主细胞包括：原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；所述真核宿主细胞包括：真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的APOBEC3A突变体的方法，包括：(i)根据所述的APOBEC3A突变体或所述的多核苷酸，人工合成该APOBEC3A突变体或编码其的多核苷酸；或，(ii)通过重组表达的方法进行生产；较佳地包括：培养所述的遗传工程化的宿主细胞，获得培养物；以及，从培养物中分离所述的APOBEC3A突变体。

在本发明的另一方面，提供一种对RNA底物进行脱氨修饰或进行碱基编辑改造的方法，包括以所述的APOBEC3A突变体进行处理。

在本发明的另一方面，提供所述的APOBEC3A突变体的用途，用于对RNA底物进行脱氨修饰或进行碱基编辑改造。

在本发明的另一方面，提供一种用于对RNA底物进行脱氨修饰或进行碱基编辑的组合物，其中含有所述的APOBEC3A突变体；或含有所述的宿主细胞。

在一个优选例中，所述的组合物中，还包括药学上或工业合成上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于对RNA底物进行脱氨修饰或进行碱基编辑的试剂盒，其中含有所述的APOBEC3A突变体；或含有所述的宿主细胞；较佳地，所述的突变体或宿主细胞被置于容器或包装中。

在本发明的另一方面，提供一种检测待测胞苷脱氨酶的酶活性的方法，包括：(1)提供一构建体(包括表达载体)，其包括操作性连接的以下表达盒：上游报告基因-胞苷脱氨酶底物的编码基因-下游报告基因的表达盒，及待测胞苷脱氨酶基因的表达盒；所述底物为可由胞苷脱氨酶编辑、进而表达被减弱或消除的底物；所述上游报告基因和下游报告基因不是同种报告基因(如为有差异的荧光标记)；较佳地，所述底物含有发夹结构；(2)将(1)的构建体引入到宿主细胞中，进行重组表达，根据下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱与否或减弱量(如以荧光的减弱来呈现)来确定待测胞苷脱氨酶的酶活性，若表达减弱显著，则表明待测胞苷脱氨酶具有脱氨酶活性，对胞苷脱氨酶编码基因相应的RNA进行了靶向编辑(较佳地，减弱越显著则胞苷脱氨酶活性越高或RNA编辑效率越高)。

在本发明的另一方面，提供一种检测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率的方法，包括：(1)提供一构建体(包括表达载体)，其包括操作性连接的以下表达盒：上游报告基因-琥珀酸脱氢酶B(SDHB)编码基因-下游报告基因的表达盒，及待测APOBEC3A突变体基因的表达盒；其中上游报告基因和下游报告基因不是同种报告基因(如为有差异的荧光标记)；较佳地，所述底物含有发夹结构；(2)将(1)的构建体引入到宿主细胞中，进行重组表达，根据下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱与否或减弱量(如以荧光的减弱来呈现)，来确定待测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性，表达减弱显著，则表明待测APOBEC3A突变体具有RNA脱氨酶活性，对琥珀酸脱氢酶B编码基因相应的RNA进行了靶向编辑(较佳地，减弱越显著则RNA脱氨酶活性越高或RNA编辑效率越高)。

在一个优选例中，步骤(2)中，设置APOBEC3A野生型组作为对照组，通过将待测APOBEC3A突变体组与APOBEC3A野生型组中下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱量的比较，来确定待测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率；若待测APOBEC3A突变体组中下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱更显著，则该待测突变体具有高于野生型的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率。

在另一优选例中，设置失活APOBEC3A组作为对照组，通过将待测APOBEC3A突变体组与失活APOBEC3A组中下游报告基因与上游报告基因相比的表达量(下游报告基因和上游报告基因的表达强度相当)的比较，来确定待测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率；若待测APOBEC3A突变体组中下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱更显著，则其具有高于野生型的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率。

在另一优选例中，所述的琥珀酸脱氢酶B编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；较佳地，所述的APOBEC3A或其突变体靶向于其中第67位碱基，对其RNA进行C→U的编辑。

在另一优选例中，上游报告基因或下游报告基因为表达荧光蛋白的基因；较佳地，所述的荧光蛋白包括(但不限于)：绿色荧光蛋白，增强型绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白，青色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，橙色荧光蛋白，或远红光荧光蛋白；更佳地，所述的荧光蛋白包括：增强型绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白；较佳地通过荧光检测装置(如酶标仪)进行荧光检测。

在另一优选例中，通过抽取RNA，反转录测序来确定编辑具体效率。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括(但不限于)：原核细胞，如大肠杆菌细胞。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测待测胞苷脱氨酶的酶活性的试剂盒，其中包括：(1)构建体(包括表达载体)以及宿主细胞；或(2)重组宿主细胞，其中引入有构建体；其中，所述构建体包括操作性连接的以下表达盒：上游报告基因-胞苷脱氨酶底物的编码基因-下游报告基因的表达盒，及待测胞苷脱氨酶基因的表达盒；所述底物为可由胞苷脱氨酶编辑、进而表达被减弱或消除的底物；所述上游报告基因和下游报告基因不是同种报告基因(如为有差异的荧光标记)，较佳地所述底物含有发夹结构。

在一个优选例中，所述胞苷脱氨酶包括APOBEC3A或其突变体；所述胞苷脱氨酶底物包括琥珀酸脱氢酶B。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、pET28a-mCherry-SDHB-eGFP-APOBEC3A质粒构建流程图

图2、检测APOBEC3A的RNA脱氨酶活性的mCherry-SDHB-eGFP荧光报告系统示意图。

图3、野生型APOBEC3A以及E72A突变体的测序图谱，反映RNA脱氨活性结果。

图4、新型APOBEC3A突变体的测序峰图，反映RNA脱氨活性结果。

图5、体外基于UDG检测APOBEC3A的DNA活性原理示意图。

图6、体外检测APOBEC3A突变体的DNA脱氨活性。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，通过设计有效的构建体引入到宿主中，检测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性；所述构建体通过操作性排列的荧光标记物以及RNA底物，可灵敏地检测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率。本发明也提供了一系列的APOBEC3A突变体，其RNA脱氨酶活性被增强、DNA脱氨酶活性被弱化或消除从而有利于实现专一性或相对专一性的RNA编辑。

术语

如本文所用，“表达盒”在这里是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，这个序列编码荧光蛋白；这个DNA分子还包含转录在体外或体内可操作的连接编码序列所必需的或预期的适合的调控元件。“调控元件”在这里指的是可控制核酸序列表达的核苷酸序列。可作为典范的调控元件包括启动子，转录终止序列或上游调节区，这些调控元件有助于核酸的复制、转录、转录后修饰等。此外，调控元件还可以包括：增强子，内核糖体进入位点(IRES)，复制起点，多腺苷酸化信号等。

如本文所用，所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

如本文所用，所述的“上游报告基因”是指该报告基因位于可形成所述RNA的底物基因的上游。所述的“下游报告基因”是指该报告基因位于可形成所述RNA的底物基因的下游。两者相对同一底物而言，分列于其上游或下游的位置上，它们是操作性连接的。

如本文所用，“外源的”或“异源的”基因或蛋白是指并非天然包含在原生物体基因组中的基因或蛋白。所述的“外源蛋白的编码基因”也称为“异源DNA”，指在所给定的宿主细胞中原本不存在的一种DNA分子，或一个DNA分子群；或指异于特定宿主细胞的DNA分子。

如本文所用，所述的“减弱”与“降低”、“弱化”、“减少”、“下降”等可互换使用，是指具有统计学意义的“减弱”或显著的“减弱”，例如减弱2-99％；具体如减弱5％、10％、20％、30％、50％、60％、80％、90％、95％或98％等。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，除非另外说明，所述的“APOBEC3A突变体”、“突变型APOBEC3A”可互换使用，是指对应于野生型APOBEC3A，在相应于其序列第132位和第30位，第132位和第188-190位，第132位和第31位，第132位和第189位发生组合突变后构成的多肽。

若需要表示野生型的APOBEC3A，其可以为“氨基酸序列如SEQ ID NO:1的蛋白，或者也可以是该蛋白的同功能变体或活性片段。较佳地，所述的野生型APOBEC3A来源于人(Homo Sapiens)；但是应理解，本发明中也涵盖来源于其它物种的与之具有同源性且功能相同的APOBEC3A同源物。

如本文所用，“分离的”是指APOBEC3A突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化APOBEC3A突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

检测方法

本发明人在深入研究基础上，利用琥珀酸脱氢酶复合物铁硫亚基B(SDHB)mRNA作为检测APOBEC3A突变体的RNA活性的底物。该编辑位点在合适的范围内，并且SDHB片段保留了有效RNA编辑所必需的发夹结构。其作为底物效果优异，灵敏度理想。

本发明中，构建检测用构建体时，在用于形成SDHB mRNA的SDHB片段的两端，分别设置上游报告基因和下游报告基因，两种报告基因与所述SDHB片段操作性连接，形成表达盒。所述的表达盒的5’端，设置有启动子以驱动这些元件的表达。多种适合的启动子可被应用于本发明中，如但不限于T7启动子、CMV启动子。

作为本发明的优选方式，所述的上游报告基因和下游报告基因能够编码两种不同的荧光蛋白，从而方便地实现检测。荧光蛋白是一类在适当条件下能发光的蛋白，其生色基团是由组成其蛋白序列的氨基酸残基构成。

应理解，本发明的方法通过利用荧光蛋白来转换吸收光的波长或光谱能量来实现技术效果，多种具有特定荧光的蛋白可被涵盖于本发明中。例如所述的荧光蛋白可以是：蓝色荧光蛋白，青色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，橙色荧光蛋白，红色荧光蛋白，或远红色荧光蛋白等。

将本发明人设计的构建体转化宿主并表达后，当APOBEC3A或者改造的APOBEC3A编辑SDHB时，可以把其中CGA密码子转换为UGA终止子，下游报告基因(如绿色荧光蛋白eGFP等)的表达将会较少或不表达(图2)、而上游报告基因(如mCherry等有别于下游报告基因的报告基因)的表达则不受此影响而保持稳定。

在本发明的优选实施例中，通过将红色荧光蛋白mCherry序列，102bp片段的SDHB序列以及绿色荧光蛋白eGFP编码序列框内连接来构建报告系统。

在本发明的优选实施例中，还提供了APOBEC3A失活突变体E72A，以其为对照，该突变体完全失去脱氨活性，当共表达时SDHB不会被编辑，eGFP荧光强度正常表达，通过与失活突变体进行比对即可知道APOBEC3A或者改造的APOBEC3A的RNA编辑活性。

本发明的方法，可实现快速检测APOBEC3A及突变体胞苷脱氨酶活性以为减少其在基因编辑器的应用脱靶效应。同时，本发明利用该检测技术获得了具有较高RNA活性的APOBEC3A突变体，为开发RNA C>U编辑提供编辑酶。此外，该技术也可应用于不同的胞苷脱氨酶，将报告系统中的编辑底物换成相应胞苷酶底物即可快速确定其脱氨活性。为鉴定胞苷脱氨酶活性提供更快捷方法。

本发明能快速检测改造的APOBEC3A的RNA脱氨活性是否存在，只需要通过在APOBEC3A上进行点突变后，通过酶标仪检测荧光就可以初步确定是否有活性。之前测试APOBEC3A需要通过全转录本测序需要花费很大的财力与时间，有效节省成本。

本发明的技术方案，不仅可以确定改造后的APOBEC3A是否有RNA脱氨活性，还可以通过反转录RT-PCR可以获知其编辑水平；不仅可实现定性检测，还可以实现定量检测。

本发明的技术方案，还可以快速检测其他胞苷脱氨酶活性，只需要将报告系统中的编辑底物换成相应的底物即可快速检测脱氨活性。

在本发明的具体实施例中，提供了一种检测APOBEC3A及突变体脱氨酶活性的技术，其具体操作方法如下：

1、构建pET28a-mCherry-SDHB-eGFP-APOBEC3A检测与报告为一体的单质粒报告系统。

(1)本发明选用人源的APOBEC3A蛋白，该蛋白可在细菌以及哺乳动物细胞中发挥脱氨酶活性，可对内源或者外源性的DNA或者RNA进行脱氨实现C>U的转变。

(2)102bp的SDHB序列在铂尚公司合成而得，序列如下(SEQ ID NO:3)：

5’-atggcctcccgaggagcccagacagctgcagccacagctccccgtatcaagaaatttgccatctatcgatgg gacccagacaaggctggagacaaacctcat-3’；

(3)该报告系统以诱导型T7启动子，红色荧光蛋白mCherry、102bp的APOBEC3A原始底物SDHB序列以及绿色荧光蛋白eGFP按照此顺序插入pET28a载体的HindIII与NdeI的酶切位点之间。在这之后为T7启动子序列以及APOBEC3A序列。

(4)构建表达mCherry-SDHB-eGFP融合蛋白的载体pET28a-mCherry-SDHB-eGFP-APOBEC3A。较佳地，本发明所用到的mCherry、eGFP通过扩增获得。通过同源重组将mCherry、SDHB以及eGFP片段插入到HindIII与NdeI的酶切位点之间。

(5)将人源APOBEC3A连着T7启动子插入到pET28a-mCherry-SDHB-eGFP质粒的SacI与HindIII酶切位点之间。APOBEC3A通过扩增获得。

(6)在大肠杆菌DH5α中构建载体后，将得到的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，表达条件为：从含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上挑取单菌落接入20ml的LB培养液中，37℃，220rpm/s的转速培养至OD为0.4后，将菌液换入到28℃的培养条件中使其生长至OD为0.6后，加入8ul的1M IPTG诱导使其最终的诱导浓度为0.4mM，诱导条件为28℃，220rpm/s的转速，20小时。

2、检测报告系统APOBEC3A的RNA编辑活性

作为本发明的一种优选方式，利用酶标仪进行荧光检测，较佳地例如包括下：将诱导20h后的菌液稀释至OD 0.5，使用酶标仪测量荧光强度。红色荧光(mCherry)的激发和发射波长分别为580nm和610nm，绿色荧光(eGFP)的激发和发射波长分别为485nm和520nm。利用红色荧光强度与绿色荧光强队进行比值，这个比值结果与失活突变体E72A的比值结果进行比较，如若比E72A高，则表明有RNA编辑活性，反之则没有活性。

作为本发明的另一优选方式，通过抽取RNA，反转录测序来确定编辑具体效率，例如包括：RNA提取方式可采用Trizol法提取，通过利用Super-Script IV First StrandcDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)试剂盒反转录成cDNA后进行测序，通过峰图确认编辑效率。编辑效率依据测序峰图进行计算，计算方式为％(T的峰高/(C峰高+T的峰高))。

APOBEC3A蛋白突变体及其应用

本发明人利用本发明建立的质粒，通过点突变PCR方式对APOBEC3A进行突变，进一步获得了一些性能与野生型相比有变化的APOBEC3A突变体。包括Y132G/K30R、Y132G/T31A、Y132G/R189A以及Y132G/G188A/R189A/L190A等。这些突变体的RNA脱氨活性得到了显著提升，更特别地，其DNA脱氨活性被弱化或消除。通过在体外对这些新的APOBEC3A的DNA进行检测发现，两个多点突变体Y132G/K30R和Y132G/G188A/R189A/L190A成功地保留了RNA底物上的高脱氨酶活性，同时消除了DNA上的脱氨酶活性。

本发明的突变体蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述APOBEC3A突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然APOBEC3A突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的APOBEC3A突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，肯定存在本发明上面所述的突变，也即该突变为对应于SEQID NO:1中的第132位和第30位，第132位和第188-190位，第132位和第31位，第132位和第189位的突变。

在本发明中，术语“APOBEC3A突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括APOBEC3A突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本发明上面所述的突变。

在本发明中，术语“APOBEC3A突变体”还包括(但并不限于)：与所述的APOBEC3A突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本发明上面所述的突变。

本发明还提供了编码本发明APOBEC3A突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或APOBEC3A突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的APOBEC3A突变体。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码APOBEC3A突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，APOBEC3A突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含APOBEC3A突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达所述突变体蛋白质。所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的优选实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞。

本领域一般技术人员可以选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

在获得了本发明所述的突变型APOBEC3A后，本领域人员清楚如何运用该突变体来对RNA底物进行脱氨修饰或进行碱基编辑改造。

本发明提供了新的突变体具有很高的RNA酶活性，为开发新的RNA的C>U的编辑器提供了基础。同时在体外对这些突变体进行DNA检测发现有两个突变体几乎消除了DNA活性，这为开发特异的C>U的RNA编辑器提供重要的编辑酶。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、快速检测APOBEC3A及突变头脱氨酶活性的体系的建立

本实施例中，提供一种快速检测APOBEC3A及突变头脱氨酶活性的技术，具体步骤如下：

1、在大肠杆菌细胞中表达pET28a-mCherry-SDHB-eGFP-APOBEC3A报告系统

SDHB序列通过人工合成而得，序列如下(SEQ ID NO:3；102bp)：

5’-atggcctcccgaggagcccagacagctgcagccacagctccccgtatcaagaaatttgccatctatcgatgggacccagacaaggctggagacaaacctcat-3’

首先，本发明人构建表达报告系统与APOBEC3A蛋白为一体的载体pET28a-mCherry-SDHB-eGFP-APOBEC3A。其建立过程如图1。具体如下：

以pET28a为骨架质粒，对其进行HindIII/NdeI酶切。

以5’-aagcttgagctcgaattcggatctttatccggacttgtacagctc(SEQ ID NO:4)/5’-gcaagcttgctagcttatccggacttgtacagctcg(SEQ ID NO:5)为引物，以pEGFP mCherry-SDHB-EGFP质粒(购自铂尚)为模板进行扩增，获得扩增产物；对该扩增产物以HindIII/NdeI酶切，获得mCherry-SDHB-eGFP融合基因，插入到经过HindIII/NdeI酶切的pET28a中，获得重组质粒pET28a-mCherry-SDHB-eGFP。对其进行HindIII/SacI酶切。

以5’-gataaagatccgaattcgagctccgtcgactaatacgactcactataggggaattgtgagcgga(SEQ ID NO:6)/5’-gagtgcggccgcaagcttgctagcctagtttccctg(SEQ ID NO:7)为引物，以pET28a-APOBEC3A质粒(购自铂尚)为模板进行扩增，获得扩增产物；对该扩增产物以HindIII/SacI酶切，获得T7-APOBEC3A融合基因，插入到经过HindIII/SacI酶切的pET28a-mCherry-SDHB-eGFP中，获得重组质粒pET28a-mCherry-SDHB-eGFP-APOBEC3A。

其中，该APOBEC3A基因为人源的野生型基因，其基因序列如下(SEQ ID NO:2)：

atggaagccagcccagcatccgggcccagacacttgatggatccacacatattcacttccaactttaacaatggcattggaaggcataagacctacctgtgctacgaagtggagcgcctggacaatggcacctcggtcaagatggaccagcacaggggctttctacacaaccaggctaagaatcttctctgtggcttttacggccgccatgcggagctgcgcttcttggacctggttccttctttgcagttggacccggcccagatctacagggtcacttggttcatctcctggagcccctgcttctcctggggctgtgccggggaagtgcgtgcgttccttcaggagaacacacacgtgagactgcgtatcttcgctgcccgcatctatgattacgaccccctatataaggaggcactgcaaatgctgcgggatgctggggcccaagtctccatcatgacctacgatgaatttaagcactgctgggacacctttgtggaccaccagggatgtcccttccagccctgggatggactagatgagcacagccaagccctgagtgggaggctgcgggccattctccagaatcagggaaactga

其蛋白序列如下(SEQ ID NO:1)：

MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN*

之后，本发明人将单质粒pET28a-mCherry-SDHB-eGFP-APOBEC3A转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组的菌株。

实施例2、利用野生型APOBEC3A确认检测报告系统的可应用性

除了建立含有野生型APOBEC3A的重组质粒并转化大肠杆菌，本发明也建立了含有突变型APOBEC3A的重组质粒以用于转化大肠杆菌。基于野生型APOBEC3A基因的序列，突变发生在第72位，从氨基酸Glu突变为Ala，从而使得APOBEC3A蛋白的第72位发生E72A的突变。所述突变采用常规的定点突变技术进行。

将构建后的单质粒pET28a-mCherry-SDHB-eGFP-APOBEC3A以及点PCR突变失活突变E72A转化至大肠杆菌BL21(DE3)。加入0.4mM IPTG诱导将诱导20h后的菌液稀释至OD0.5，利用酶标仪测试荧光强度，红色荧光(mCherry)的激发和发射波长分别为580nm和610nm，绿色荧光(eGFP)的激发和发射波长分别为485nm和520nm。

将荧光比值与无活性的E72A突变体比对确认有活性后，收集等体积菌液，抽提RNA，通过RT-PCR进一步确认编辑效率，编辑效率依据测序峰图进行计算，计算方式为％(T的峰高/(C峰高+T的峰高))。

野生型与突变体的荧光强度比值以及RNA编辑率的检测结果如表1和图3所示。

表1

根据表1荧光检测结果，E72A的荧光强度比值(mCherry/eGFP)反而低于野生型，其为一种失活突变体。

实施例3、利用实施例1的系统进行新突变并测试

本发明人基于APOBEC3A的一级结构以及三级结构，对很多位点进行突变改造，以期确定有意义的位点。经过大量分析，将突变范围缩小到一部分感兴趣的位点，包括：第30位、第31位、第132位、第188位、第189位、第190位，或它们的组合突变。所用突变体引物如表2。

表2

在将表2的APOBEC3A突变形式引入到实施例1建立的重组质粒pET28a-mCherry-SDHB-eGFP-APOBEC3A后。利用实施例2中所描述的相同的检测方法，在大肠杆菌中检测其RNA活性，结果如表3和图4。

表3

这些新设计的突变体，均显示出了比失活突变体E72A的荧光值大，表明这些突变体具有RNA活性。由此，荧光比值检测法尤其适于作为一种灵敏的定性检测工具；在降低背景值的情况下其也能作为定量检测的工具。

进一步地，本发明人通过RT-PCR测序再次确定经改造的APOBEC3A突变体的编辑效率。RT-PCR测序具有准确的定量检测效果。

RT-PCR的结果显示，这些的RNA脱氨酶活性均比野生型APOBEC3A高。

实施例4、体外检测APOBEC3A突变体的DNA脱氨活性

1、蛋白质制备和纯化

(a)常规方法构建纯化蛋白质粒pET28a-APOBEC3A(A3A)，以T7启动子驱动A3A片段的表达，并在C端连接着6×His标签。

(b)通过将蛋白过镍柱纯化蛋白。

2、体外检测APOBEC3A突变体的DNA脱氨活性

将上述表达的APOBEC3A突变体在体外检测DNA活性。DNA活性采用基于尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)方法，体外基于UDG检测APOBEC3A的DNA活性原理示意图如图5。具体地，该方法包括：

(a)荧光标记的ssDNA通过人工合成。ssDNA在5’端带上FAM荧光标记：5’-(6-FAM)-taagaaagaattcggaagaggaa(SEQ ID NO:18)。

(b)用底物稀释液溶解ssDNA使其浓度为100μM，置于-20℃保存。底物稀释液成份包含：20mM磷酸二氢钠(PH＝7.5)，50mM氯化钠以及0.1mM TCEP。

(c)取0.5μL的b)的底物稀释液加入3μg的APOBEC3A或其突变体的纯化蛋白，加入反应Buffer至30uL。37℃反应不同时间后，95℃、5min停止反应。反应Buffer成份包含：20mMNaH₂PO₄(PH＝6.0)，50mM NaCl，0.1mM TCEP以及0.1％Tritonx-100。

(d)取出冷却至室温后加入3μL的UDG buffer以及1μL的UDG酶，充分混匀；37℃反应1h。

(e)加入1μL的1M的氢氧化钠溶液，37℃反应30min。

(f)加入10μL的1M Tris-HCl(PH＝8.0)中和。

(g)加入等体积的Loading Buffer，形成上样缓冲液，95℃，5min处理冰上放置。

(h)取10μL处理液上样20％TBE-尿素凝胶，200V，50min。在Typhoon同位素扫描仪上对荧光扫描。FAM激发光及发射光分别为：494nm，522nm。

结果如图6。根据电泳条带分析可知，Y132G的DNA活性与野生型WT活性相当，说明该单位点的突变体没有专一性的针对RNA的高脱氨酶活性。Y132G/R189A以及Y132G/T31A仅残留很低的DNA脱氨酶活性，Y132G/K30R以及Y132G/G188A/R189A/L190A的DNA脱氨酶活性则已经完全消除，说明这些突变体具有高效且专一性的RNA脱氨酶活性，或以高效的RNA脱氨酶活性为主导。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> APOBEC3A的RNA脱氨酶活性测定方法及RNA高活性的APOBEC3A变体

<130> 212987

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggaagcca gcccagcatc cgggcccaga cacttgatgg atccacacat attcacttcc 60

aactttaaca atggcattgg aaggcataag acctacctgt gctacgaagt ggagcgcctg 120

gacaatggca cctcggtcaa gatggaccag cacaggggct ttctacacaa ccaggctaag 180

aatcttctct gtggctttta cggccgccat gcggagctgc gcttcttgga cctggttcct 240

tctttgcagt tggacccggc ccagatctac agggtcactt ggttcatctc ctggagcccc 300

tgcttctcct ggggctgtgc cggggaagtg cgtgcgttcc ttcaggagaa cacacacgtg 360

agactgcgta tcttcgctgc ccgcatctat gattacgacc ccctatataa ggaggcactg 420

caaatgctgc gggatgctgg ggcccaagtc tccatcatga cctacgatga atttaagcac 480

tgctgggaca cctttgtgga ccaccaggga tgtcccttcc agccctggga tggactagat 540

gagcacagcc aagccctgag tgggaggctg cgggccattc tccagaatca gggaaactga 600

<210> 2

<211> 199

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His

1 5 10 15

Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr

20 25 30

Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met

35 40 45

Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys

50 55 60

Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro

65 70 75 80

Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile

85 90 95

Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala

100 105 110

Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg

115 120 125

Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg

130 135 140

Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His

145 150 155 160

Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp

165 170 175

Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala

180 185 190

Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn

195

<210> 3

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcctccc gaggagccca gacagctgca gccacagctc cccgtatcaa gaaatttgcc 60

atctatcgat gggacccaga caaggctgga gacaaacctc at 102

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> Primer

<400> 4

aagcttgagc tcgaattcgg atctttatcc ggacttgtac agctc 45

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> Primer

<400> 6

gcaagcttgc tagcttatcc ggacttgtac agctcg 36

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> Primer

<400> 6

gataaagatc cgaattcgag ctccgtcgac taatacgact cactataggg gaattgtgag 60

cgga 64

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> Primer

<400> 7

gagtgcggcc gcaagcttgc tagcctagtt tccctg 36

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Primer

<400> 8

atataggggg tcgccatcat agatgcgggc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Primer

<400> 9

gcccgcatct atgatggcga ccccctatat 30

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Primer

<400> 10

gtagcacagg taggtcgcat aggttccaat gcc 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> Primer

<400> 11

ggcattggaa cctatgcgac ctacctgtgc tac 33

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> Primer

<400> 12

ttcgtagcac aggtaggcct tatgccttcc aatgccattg 40

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> Primer

<400> 13

cattggaagg cataaggcct acctgtgcta cgaagtgg 38

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> Primer

<400> 14

ggcccgcagc tccccactca gggcttggct gtgc 34

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> Primer

<400> 15

gccctgagtg gggcgctgcg ggccattctc cag 33

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> Primer

<400> 16

ggagaatggc ccgcgccgcc gcactcaggg cttggc 36

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> Primer

<400> 17

gccctgagtg cggcggcgcg ggccattctc cagaatc 37

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> ssDNA

<400> 18

taagaaagaa ttcggaagag gaa 23

Claims

1.一种提高APOBEC3A的RNA脱氨酶活性或专一性，或提高其RNA编辑率的方法，包括：改造其氨基酸序列，形成APOBEC3A突变体；该突变体包括选自：

(1)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，下列位点发生组合突变的蛋白；第132位和第30位，第132位和第188-190位，第132位和第31位，第132位和第189位；

(2)(1)蛋白的保守性变异蛋白，其对应于SEQ ID NO:1中的第132位和第30位，第132位和第188-190位，第132位和第31位，或第132位和第189位的氨基酸，与(1)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同。

2.一种APOBEC3A突变体，包括：

3.如权利要求1或2所述，其特征在于，所述位点的突变包括：第132位突变为Gly；第30位突变为Arg；第31位突变为Ala；第188位突变为Ala；第189位突变为Ala；和/或，第190位突变为Ala。

4.如权利要求1或2所述，其特征在于，所述的保守性变异蛋白包括：

(a)将(1)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的蛋白；

(b)与(1)蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性，且具有(1)蛋白功能的蛋白；或(c)(1)蛋白的活性片段，其包含APOBEC3A空间结构中发挥RNA脱氨酶活性的结构区，且具有(1)蛋白功能的蛋白。

5.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求2-4任一所述的APOBEC3A突变体。

6.一种载体，它含有权利要求5所述的分离的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。

8.一种制备所述的APOBEC3A突变体的方法，包括：

(i)根据权利要求2-4任一所述的APOBEC3A突变体或权利要求5所述的多核苷酸，人工合成该APOBEC3A突变体或编码其的多核苷酸；或

(ii)通过重组表达的方法进行生产；较佳地包括：培养权利要求7所述的遗传工程化的宿主细胞，获得培养物；以及，从培养物中分离所述的APOBEC3A突变体。

9.一种对RNA底物进行脱氨修饰或进行碱基编辑改造的方法，包括以权利要求2-4任一所述的APOBEC3A突变体进行处理。

10.权利要求2-4任一所述的APOBEC3A突变体的用途，用于对RNA底物进行脱氨修饰或进行碱基编辑改造。

11.一种用于对RNA底物进行脱氨修饰或进行碱基编辑的组合物，其中含有：权利要求2-4任一所述的APOBEC3A突变体；或含有权利要求7所述的宿主细胞。

12.一种用于对RNA底物进行脱氨修饰或进行碱基编辑的试剂盒，其中含有：权利要求2-4任一所述的APOBEC3A突变体；或含有权利要求7所述的宿主细胞；较佳地，所述的突变体或宿主细胞被置于容器或包装中。

13.一种检测待测胞苷脱氨酶的酶活性的方法，包括：

(1)提供一构建体，其包括操作性连接的以下表达盒：上游报告基因-胞苷脱氨酶底物的编码基因-下游报告基因的表达盒，及待测胞苷脱氨酶基因的表达盒；所述底物为可由胞苷脱氨酶编辑、进而表达被减弱或消除的底物；所述上游报告基因和下游报告基因不是同种报告基因；较佳地，所述底物含有发夹结构；

(2)将(1)的构建体引入到宿主细胞中，进行重组表达，根据下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱与否或减弱量来确定待测胞苷脱氨酶的酶活性，若表达减弱显著，则表明待测胞苷脱氨酶具有脱氨酶活性，对胞苷脱氨酶编码基因相应的RNA进行了靶向编辑。

14.一种检测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率的方法，包括：

(1)提供一构建体，其包括操作性连接的以下表达盒：上游报告基因-琥珀酸脱氢酶B编码基因-下游报告基因的表达盒，及待测APOBEC3A突变体基因的表达盒；

其中上游报告基因和下游报告基因不是同种报告基因；较佳地，所述底物含有发夹结构；

(2)将(1)的构建体引入到宿主细胞中，进行重组表达，根据下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱与否或减弱量，来确定待测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性，表达减弱显著，则表明待测APOBEC3A突变体具有RNA脱氨酶活性，对琥珀酸脱氢酶B编码基因相应的RNA进行了靶向编辑。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，设置APOBEC3A野生型组作为对照组，通过将待测APOBEC3A突变体组与APOBEC3A野生型组中下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱量的比较，来确定待测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率；若待测APOBEC3A突变体组中下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱更显著，则该待测突变体具有高于野生型的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率；和/或

设置失活APOBEC3A组作为对照组，通过将待测APOBEC3A突变体组与失活APOBEC3A组中下游报告基因与上游报告基因相比的表达量的比较，来确定待测APOBEC3A突变体的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率；若待测APOBEC3A突变体组中下游报告基因与上游报告基因相比的表达减弱更显著，则其具有高于野生型的RNA脱氨酶活性或RNA编辑效率。

16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述的琥珀酸脱氢酶B编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；较佳地，所述的APOBEC3A或其突变体靶向于其中第67位碱基，对其RNA进行C→U的编辑；或

上游报告基因或下游报告基因为表达荧光蛋白的基因；较佳地，所述的荧光蛋白包括：绿色荧光蛋白，增强型绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白，青色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，橙色荧光蛋白，或远红光荧光蛋白；更佳地，所述的荧光蛋白包括：增强型绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白；较佳地通过荧光检测装置进行荧光检测；或

通过抽取RNA，反转录测序来确定编辑具体效率；或

所述的宿主细胞包括：原核细胞，如大肠杆菌细胞。

17.一种用于检测待测胞苷脱氨酶的酶活性的试剂盒，其中包括：

(1)构建体以及宿主细胞；或

(2)重组宿主细胞，其中引入有构建体；

其中，所述构建体包括操作性连接的以下表达盒：上游报告基因-胞苷脱氨酶底物的编码基因-下游报告基因的表达盒，及待测胞苷脱氨酶基因的表达盒；所述底物为可由胞苷脱氨酶编辑、进而表达被减弱或消除的底物；所述上游报告基因和下游报告基因不是同种报告基因，较佳地所述底物含有发夹结构；

较佳地，所述胞苷脱氨酶包括APOBEC3A或其突变体；所述胞苷脱氨酶底物包括琥珀酸脱氢酶B。