JPH06292584A

JPH06292584A - 変異型ピルビン酸脱水素酵素複合体のｅ１蛋白質遺伝子及び変異型ピルビン酸脱水素酵素複合体のｅ１蛋白質

Info

Publication number: JPH06292584A
Application number: JP5082130A
Authority: JP
Inventors: Toshio Ichikawa; 利夫市川; Taiji Koyama; 泰二小山; Hideko Otake; 秀子大竹; Eiichi Nakano; 衛一中野
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1993-04-08
Publication date: 1994-10-21
Anticipated expiration: 2016-03-19
Also published as: JP3148455B2; US5432071A

Abstract

(57)【要約】【構成】野生型ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁蛋
白質のアミノ酸配列において、146位のアルギニンがプ
ロリンに置換されていることを特徴とする高活性の変異
型Ｅ₁蛋白質、当該変異型Ｅ₁蛋白質をコードする遺伝
子、当該変異型Ｅ₁蛋白質をコードする遺伝子をベクタ
ーＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体
ＤＮＡ、及び当該組み換え体ＤＮＡを用いた変異型Ｅ₁
蛋白質の製造方法。【効果】高い活性を有するピルビン酸脱水素酵素複合
体の変異型Ｅ₁蛋白質を効率よく提供することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、変異型ピルビン酸脱水
素酵素複合体のＥ₁蛋白質、そのＥ₁蛋白質遺伝子、組み
換え体ＤＮＡ及びそのＥ₁蛋白質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ピルビン酸脱水素酵素複合体は、ピルビ
ン酸の定量等に利用されているが、ピルビン酸を通る反
応系が多いので用途は広い。ピルビン酸脱水素酵素複合
体は、全体として下記のようなピルビン酸の酸化的脱炭
酸反応を触媒する酵素であり、補酵素としてＴＰＰ（チ
アミンピロリン酸）やリポアミドを必要とする。

【０００３】

【化１】ピルビン酸＋ NAD⁺＋ CoA → アセチル-CoA ＋ CO₂ ＋ NADH ＋ H⁺ また、この酵素は３種の酵素蛋白質（Ｅ₁、Ｅ₂及び
Ｅ₃）からなる分子量数百万の酵素複合体であり、各酵
素蛋白質は各々下記のような反応を触媒する。本発明は
このうちのＥ₁蛋白質（ピルベートデヒドロゲナーゼ）
に関するものである。

【０００４】

【化２】ピルビン酸＋Ｅ₁-TPP → Ｅ₁-TPP-CHOH-CH₃ ＋ CO₂ ｛Ｅ₁：ピルベートデヒドロゲナーゼ｝Ｅ₁-TPP-CHOH-CH₃ ＋Ｅ₂-LipS₂＋ CoA → Ｅ₁-TPP ＋アセチル-CoA ＋Ｅ₂-Lip(SH)₂ ｛Ｅ₂：ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラー
ゼ｝｛Ｅ₃：リポアミドデヒドロゲナーゼ｝｛式中、TPPはチアミンピロリン酸、LipS₂はリポ酸、Li
p(SH)₂はジヒドロリポ酸を示す。｝従来、野生型ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁蛋白質
及びその塩基配列としては、例えば、大腸菌(Ｅ．coli)
Ｋ12由来のものが知られている。 Eur.J.Biochem.、Vol.
133、No.1、p.155-162（1983)、及びBiochem.J.、Vol.28
7、p.611-619、特にp.616 右欄 19-31行(1992)］

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子工学
的手法によってより活性の高い変異型Ｅ₁蛋白質を多量
に提供することを目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、ＰＣＲ法
によって野生型大腸菌1100株由来のＥ₁蛋白質遺伝子を
クローニングする過程でその中の一つのアミノ酸が他の
アミノ酸に置換された変異型Ｅ₁蛋白質が得られ、しか
もこの変異型Ｅ₁蛋白質は、意外にも公知配列の野生型
Ｅ₁蛋白質より極めて高い活性を有することを見いだ
し、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は、野生型ピルビン酸脱水素
酵素複合体のＥ₁蛋白質のアミノ酸配列において、146位
のアルギニンがプロリンに置換されているアミノ酸配列
をコードする変異型ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁
蛋白質遺伝子である。さらに、本発明は、上記の変異型
ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁蛋白質遺伝子をベク
ターＤＮＡに挿入してなる組み換え体ＤＮＡである。

【０００８】さらに、本発明は、上記組み換え体ＤＮＡ
を含むエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養
し、変異型ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁蛋白質を
採取することからなる前記Ｅ₁蛋白質の製造法である。
さらに、本発明は、このようにして得られた変異型ピル
ビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁蛋白質自体である。

【０００９】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明における一アミノ酸の置換による活性の高い変異型
Ｅ₁蛋白質は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法
を用いたＥ₁蛋白質遺伝子のクローニングの過程で得ら
れるものである。従って、先ずその鋳型となる野生型Ｅ
₁蛋白質遺伝子を含む染色体ＤＮＡを調製することが必
要である。

【００１０】鋳型となる上記染色体ＤＮＡとしては、野
性型のピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁蛋白質の遺伝
子を含むものであれば如何なるものでもよいが、好まし
いものとしては大腸菌の染色体ＤＮＡが挙げられ、例え
ば、大腸菌Ｋ12株、大腸菌1100株(Max-Plank-Institut
e、西独、ハイデルベルグより入手）等由来のものを用い
ることができる。

【００１１】例えば、大腸菌1100株の染色体ＤＮＡは、
該微生物の菌体を遠心分離等により採取し、カレント・
プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー
〔Current Protocols in Molecular Biology、第１巻、
第２項（1987年）〕記載の方法等によって処理すること
により調製される。次に、該染色体ＤＮＡからのＥ₁蛋
白質遺伝子のクローニングの方法としては、該遺伝子の
配列が既に明らかにされている〔ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal o
f Biochemistry）、第133巻、第155〜162頁（1983
年）〕ので、ＰＣＲ法を用いることが可能である。即
ち、Ｅ₁遺伝子のＮ末端配列に基づいた一本鎖のＮ末端
ＤＮＡプライマーとＣ末端配列に基づいた一本鎖のＣ末
端ＤＮＡプライマーを調製し、加熱処理によって一本鎖
とした大腸菌の染色体ＤＮＡ中のＥ₁蛋白質遺伝子に、
それらのＤＮＡプライマーをアニール（水素結合による
２本鎖形成）させる。これにdNTP（式中、NはA、G、C、Tか
ら選ばれる１種のデオキシリボヌクレオチドを示す。）
及びAmpliTaq（商標名）ＤＮＡポリメラーゼ(宝酒造社
製）等を加え、Ｅ₁蛋白質遺伝子を鋳型とするＤＮＡプ
ライマーの伸長反応を行ない、鋳型に相補的なＤＮＡ鎖
を合成する。更に、上記の一連の反応を繰り返し行なう
ことにより、Ｅ₁蛋白質遺伝子のみを大量に増幅するこ
とができる。

【００１２】上記のようにして増幅されたＥ₁蛋白質遺
伝子のＤＮＡ断片末端を、例えばＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ（宝酒造社製）等により平滑化したのち、例えば、プ
ラスミドベクターＤＮＡに組み込むことができる。一
方、本発明において用いることのできるプラスミドベク
ターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、例えば、
pUC119 ＤＮＡ（宝酒造社製）等が挙げられるが、具体
的に例えば、pBR322系のベクターであるpUTE100K'（実
施例項目２記載）等を用いることができる。

【００１３】上記ベクターＤＮＡに、平滑末端を生じさ
せる制限酵素、即ち、HpaＩ（宝酒造社製）等を温度30
℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度10〜1000U／mlで１
時間以上、好ましくは１〜６時間作用させて消化し、切
断されたベクターＤＮＡを得る。次いで、上記のように
して得た大腸菌由来のピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ
₁蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片と、切断され
たベクターＤＮＡを混合し、これに例えば、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ(ベーリンガー・マンハイム社製)を、温度4〜3
7℃、好ましくは4〜16℃、酵素濃度1〜100U／mlで１時
間以上、好ましくは6〜24時間反応させて組み換え体Ｄ
ＮＡを得る。

【００１４】この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大
腸菌Ｋ12、ＸＬ１-Blue、好ましくはＪＭ109（宝酒造社
より入手) 等を形質転換して各々の菌株を得る。この形
質転換は、例えば、ディー・エム・モーリソン（D. M.
Morrison）の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー
（Methods in Enzymology）、第68巻、第326〜331頁（1
979年）〕により行なうことができる。

【００１５】そして、上記菌株よりピルビン酸脱水素酵
素複合体のＥ₁蛋白質活性を有する菌株をスクリーニン
グすることにより、Ｅ₁蛋白質をコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを含むエッシェリシア・コリ（Escherichia co
li）の菌株を得ることができる。このようにして得られ
た菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るに
は、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキ
ュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecul
ar Biology)、第１巻、第１項(1987)記載の方法等によ
り得ることができる。

【００１６】上記Ｅ₁蛋白質遺伝子を含有するＤＮＡに
ついては、その塩基配列の解析を行なうことにより、既
に公表されている配列との同一性を確認することができ
るが、この際、上記したＰＣＲ法における伸長反応の際
に読み違いが起こり、公表配列との塩基配列及びアミノ
酸配列が一部相違する、具体的に例えば、Ｅ₁蛋白質の1
46位のアルギニンがプロリンに置き換えられているアミ
ノ酸配列をコードする変異型ピルビン酸脱水素酵素複合
体のＥ₁蛋白質遺伝子が得られる。

【００１７】次に、上記組み換え体ＤＮＡを含むエッシ
ェリシア・コリの菌株を用いて変異型Ｅ₁蛋白質を生産
するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよ
いが、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。ま
た、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エ
キス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の
窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リ
ン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシ
ウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄あるいは硫酸マンガン等
の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原
料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。な
お、培地の初発pHは、pH7〜9に調節するのが適当であ
る。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で4〜24
時間、好ましくは6〜8時間、通気攪拌深部培養、振盪培
養、静置培養等により実施するのが好ましい。

【００１８】培養終了後、該培養物より変異型Ｅ₁蛋白
質を採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得るこ
とができる。例えば、常法により菌体を、超音波破砕処
理、磨砕処理等するか、または、リゾチーム等の溶菌酵
素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存
在下で振盪もしくは放置して自己消化させ、本酵素を菌
体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾
過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりスト
レプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸マンガ
ン等により核酸を除去した後、これに硫安、アルコー
ル、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、粗
酵素を得る。

【００１９】上記粗酵素より更に精製酵素標品を得るに
は、例えばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバイ
オゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸
着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動
法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密
度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマト法；分
子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜
選択し、またこれらを組み合わせて実施することによ
り、精製酵素標品を得ることができる。

【００２０】上記精製手段により得られる組み換え体由
来の精製された変異型Ｅ₁蛋白質は、同様にして得られ
る公表配列通りのＥ₁蛋白質に比べ、極めて高いピルビ
ン酸脱水素酵素活性を有し、その他の理化学的性質は野
生型のもの(例えば、Methodsin Enzymology、Vol.9、p.24
7-265)と全く同様である。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。ただし、この実施例により本発明の技術的範囲が限
定されるものではない。実施例 (1) 大腸菌1100株の染色体ＤＮＡの調製大腸菌1100株を、Ｔ−Ｙ培地｛１％（W/V）バクト−ト
リプトン（Bacto-trypton）〔ディフコ（Difco）社
製〕、0.5％（W/V）バクト−イースト・エキストラクト
（Bacto-yeast extract）〔ディフコ（Difco）社製〕、
0.5％（W/V）NaCl｝（pH7.2）200mlに接種し、温度37℃
で16時間振盪培養し、培養物を得た。

【００２２】この培養物を5000r.p.m.で10分間常法によ
り遠心分離処理し、湿潤菌体0.5ｇを得た後、該菌体か
らカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バ
イオロジー〔Current Protocols in Molecular Biolog
y、第１巻、第２項（1987年）〕記載の方法により染色
体ＤＮＡを得た。 (2) ＰＣＲ法によるピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁
遺伝子のクローニング上記項目(1)のようにして得られ
た大腸菌1100株の染色体ＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用
いるため、その1μgを0.2N-NaOHに混合し、70℃にて10
分間の加熱変性処理を行ない、更にエタノール沈澱処理
することにより、鋳型ＤＮＡを得た。次に、ＰＣＲの一
本鎖ＤＮＡプライマーとしては、Ｅ₁遺伝子のＮ末端30
残基に基づいたＮ末端プライマーとＣ末端30残基に基づ
いたＣ末端プライマーをＤＮＡ合成機（アプライド・バ
イオシステムズ社製）にて合成した。

【００２３】上記のようにして得た鋳型ＤＮＡ0.1μgと
各ＤＮＡプライマー0.1μMについて、宝酒造社製のジー
ンアンプ(GeneAmp；商標名)ＰＣＲ試薬キット｛アンプ
リターク(AmpliTaq)ＤＮＡポリメラーゼ使用｝を用い、
ＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Thermal Cycler）｛Pe
rkin-Elmer Cetus Instruments社製｝にてＰＣＲを行な
った。反応終了液を常法により0.7％（W/V）アガロース
ゲル（宝酒造社製）電気泳動処理したものより、約2.6
〜2.7Kb（キロ・ベース・ペアー）の大きさのＥ ₁遺伝子
断片のみを、フナコシ社製のジーンクリーンIIキット
〔GENECLEAN II(商標名)KIT〕を用いて精製し、純化さ
れたＥ₁遺伝子断片を得た。

【００２４】このＥ₁遺伝子断片約１μgについて、ＤＮ
Ａブランティングキット（DNA Blunting Kit）｛宝酒造
社製｝を用いて末端平滑化した後、ベクターpUTE100K'
のHpaＩ分解物（約0.1μg）とライゲーション（温度16
℃、16時間）し、ＤＮＡを連結させた。次いで、ディー
・エム・モーリソン（D. M. Morrison）の方法〔メソズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）、第68巻、第326〜331頁（1979年）〕で、塩化カル
シウム処理した大腸菌ＪＭ109（宝酒造社より入手）
を、上記のようにして得た組み換え体プラスミドＤＮＡ
で形質転換した。得られた形質転換株は50μg／mlアン
ピシリン含有のＴ−Ｙ寒天平板培地を用いて温度37℃で
24時間培養し、Ｅ₁遺伝子断片がベクターＤＮＡに正し
く挿入されたプラスミドを有する形質転換株を検索し、
大腸菌ＪＭ109（pACEE１K'）を得た。

【００２５】このようにして得られたピルビン酸脱水素
酵素複合体のＥ₁蛋白生産能を有する形質転換株である
大腸菌(Ｅ．coli)ＪＭ109（pACEE１K'）は、工業技術院
生命工学工業技術研究所にFERM P-13547として寄託され
ている。なお、上記ベクターpUTE100K'は、次のように
作製したものである。プラスミドベクターpBR322（宝酒
造社製）ＤＮＡをEcoRＩ及びNruＩで切断消化し、ＤＮ
Ａ Blunting kit（宝酒造社製）で平滑末端とした後、
常法に従いアガロース電気泳動を行ない、GENECLEAN II
により複製起点を含む約3.4 kbのＤＮＡ断片を取得し
た。得られたＤＮＡ断片はＴ４ＤＮＡリガーゼにより環
状にした後、EcoRＩ切断を行い直鎖にした。次いで、大
腸菌ラクトースオペロン等に由来するプロモーター、オ
ペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現調節領域及
びHpal切断部位を含むＤＮＡ配列（The Operon, p.227,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1980を参照) をＤＮ
Ａ Synthesizer Model 392 (Applied Biosystems社製)
で合成し、上記で得られたEcoRＩ切断断片と連結してpU
TE100 を作製した。

【００２６】このpUTE100 をBgl IIで切断、消化し、こ
れにBamHＩ位置で消化したカナマイシン耐性遺伝子〔フ
ァルマシア(Pharmacia)社製)を連結して発現ベクターpU
TE100K'を作製した。 (3) 組み換え体プラスミドpACEE１K' ＤＮＡの単離１％（W/V）バクト−トリプトン、0.5％（W/V）バクト
−イースト・エキストラクト及び0.5％（W/V）NaClから
なるＴ−Ｙ培地（pH7.2）250mlに12.5mgのアンピシリン
を添加し、これに大腸菌ＪＭ109（pACEE１K'）を接種し
て、温度37℃で20〜24時間振盪培養し、培養液を得た。

【００２７】次いで、この培養液を、常法により5000r.
p.m.で10分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを50
mMグルコース及び10mM ＥＤＴＡを含有する25mMトリス
塩酸緩衝液（pH8.0）５mlに懸濁した後、更に、これに
リゾチーム25mgを添加し、室温で５分間溶菌して溶菌液
を得た。この溶菌液に、１％（W/V）ドデシル硫酸ナト
リウムを含む0.2Ｎ−NaOH溶液10mlを添加し、０℃で10
分間放置してＤＮＡを変性させた。更に、これに、５Ｍ
酢酸カリウム−酢酸緩衝液（pH4.8）7.5mlを加え、０℃
で10〜30分間放置してプラスミドＤＮＡのみを再生さ
せ、常法により9000r.p.m.で20分間遠心分離して抽出液
を得、常法によりクロロホルム抽出処理した後、常法に
よりエタノール沈澱処理し、沈澱物を得た。

【００２８】次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理
したものを１mM ＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩
衝液６ml（pH7.5）に溶解し、これに塩化セシウム６ｇ
及び10mg／mlエチジウム・ブロマイド0.3 mlを添加した
ものを、常法により50000r.p.m.で20時間、超遠心分離
機を用いて平衡密度勾配遠心処理を行ない、組み換え体
プラスミドpACEE１K' ＤＮＡを単離し、更に、ｎ−ブタ
ノールを使用してエチジウム・ブロマイドを抽出除去し
た後、１mM ＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液
（7.5）に対して透析を行ない、純化された組み換え体
プラスミドpACEE１K'ＤＮＡ100μgを得た。

【００２９】(4) ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁遺
伝子の塩基配列の解析前記項目(3)で得られたプラスミドpACEE１K'に組み込ん
だＥ₁遺伝子内の種々の制限酵素切断部位を利用し、Ｅ₁
遺伝子の塩基配列を蛋白質のＮ末端側から解析した。pA
CEE１K'より種々の制限酵素にて切り出した各種ＤＮＡ
断片を、プラスミドpUC118またはpUC119ＤＮＡ（各々、
宝酒造社製）のマルチクローニングサイトにクローニン
グし、得られた組み換え体プラスミドＤＮＡを用いて大
腸菌ＪＭ109（宝酒造社より入手）を形質転換し、各々
の形質転換株を得た。

【００３０】なお、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結及び
形質転換方法、並びにＤＮＡ断片のアガロースゲル電気
泳動による単離・精製法等は、前記項目(2)に記載の方
法に準拠した。このようにして得られた形質転換株に、
ヘルパーファージＭ13Ｋ07（宝酒造社製）を感染させメ
ッシッグ（Messing）の方法〔メソズ・イン・エンザイ
モロジー（Methods in Enzymology）、第101巻、第20〜
78頁（1983年）〕に従い一本鎖ＤＮＡを調製した。

【００３１】得られた一本鎖ＤＮＡによるシーケンシン
グは、ダイ・プライマー・ターク・シーケンシング・キ
ット（Dye Primer Taq Sequencing Kit）〔アプライド
・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製〕を用
い、上記メッシッグの方法に従って行なった。更に、塩
基配列の解析のためのゲル電気泳動は、50％(W/V)の尿
素を含む、６％（W/V）ポリアクリルアミドゲル（Natio
nal Diagnostics社製）を用い、ＤＮＡシーケンサ 370A
（アプライド・バイオシステムズ社製）にて行なった。

【００３２】得られたピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ
₁遺伝子の全塩基配列を配列表の配列番号２に、また、
該遺伝子から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を
配列表の配列番号１に示した。これらを大腸菌Ｋ12株に
おいて既に公表されているＥ₁遺伝子の配列と比較した
ところ、その塩基配列において437位のＧ（グアニン）
がＣ（シトシン）に置換しており、その結果146位のア
ルギニンがプロリンに置き換えられた変異型のＥ₁蛋白
質が得られることが判る。

【００３３】(5) 部位特異的変異による公表配列と同じ
アミノ酸配列のＥ₁蛋白質の作製上記のようにして得られた変異型Ｅ₁遺伝子を含むプラ
スミドpACEE１K'を保有し、変異型Ｅ₁蛋白質生産能を有
する組み換え体より、アミノ酸配列が公表されているも
のと同じ野生型のＥ₁蛋白質を生産する組み換え体を得
るために、部位特異的変異を行なった。即ち、上記項目
(3)で得られたプラスミドpACEE１K'より、Ｅ₁遺伝子の4
37位の変異部分を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素を用
いて切り出し、これをpUC119ＤＮＡ（宝酒造社製）のマ
ルチクローニングサイトに連結し、得られた組み換え体
プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＸＬ1-Blue（宝酒造社
より入手）を形質転換し、その形質転換株を得た。この
ようにして得られた形質転換株に、ヘルパーファージＭ
13Ｋ07（宝酒造社製）を感染させメッシッグ（Messin
g）の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー（Methods
in Enzymology）、第101巻、第20〜78頁（1983年）〕
に従い一本鎖ＤＮＡを調製した。次に、部位特異的変異
を行なうための一本鎖ＤＮＡプライマーとしては、Ｅ₁
遺伝子の437位を含む34残基のプライマーをＤＮＡ合成
機（アプライド・バイオシステムズ社製）にて合成した
が、その際、437位に相当する塩基は変異型のＣではな
く野生型のＧとして合成した。上記のようにして得た一
本鎖ＤＮＡとプライマーを用い、アマシャム（Amersha
m）社製のオリゴヌクレオチド−ダイレクテッドインビ
トロミュータジェネシスシステム（Oligonucleotide-d
irected in vitro mutagenesis system）によって変異
部分の部位特異的変異を行なった。このようにして得ら
れたプラスミドより、437位のＧに相当する部分を含む
ＤＮＡ断片を適当な制限酵素を用いて切り出し、これを
再び元のプラスミドpACEE１K'中の相当する部分に置換
する形で挿入し、野生型のアミノ酸配列のＥ₁蛋白質生
産能を有する組み換え体を得た。

【００３４】(6) 変異型Ｅ₁蛋白質と野生型Ｅ₁蛋白質の
活性の比較１％（W/V）バクト−トリプトン、0.5％（W/V）バクト
−イースト・エキストラクト、１mMイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド及び0.5％（W/V）NaClからなる培
地を150ml容の三角フラスコに10mlずつ分注し、常法に
より高圧滅菌処理したものに、上記と同一組成の培地で
予め温度37℃で14時間振盪培養した変異型及び野生型の
Ｅ₁蛋白質生産能を有する組み換え体の培養液200μlを
各々接種し、温度37℃で約８時間振盪培養する。次に、
その培養液３mlを、4,000r.p.m.で10分間の遠心分離処
理し、得られた湿潤菌体を0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）
３mlに懸濁し、常法により超音波破砕処理した後、1200
0r.p.m.で５分間通常の遠心分離処理し、Ｅ₁の粗酵素液
各々３mlを得た。

【００３５】一方、Ｅ₁と同様にクローニングしたピル
ビン酸脱水素酵素複合体のＥ₂及びＥ ₃の生産株を各々別
に培養し、Ｅ₁と同様にして各々の粗酵素液３mlを取得
した。そして、上記のようにして得られた変異型及び野
生型Ｅ₁の粗酵素液に対して、充分量のＥ₂及びＥ₃を添
加し、そのＥ₁活性をピルビン酸脱水素酵素複合体の活
性として測定した。その結果、変異型及び野生型の活性
は、各々0.9U/ml 及び0.15U/ml であった。

【００３６】このデータから変異型のＥ₁蛋白質の酵素
活性は野生型のＥ₁蛋白質のそれの約６倍であることが
判る。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、野生型のものに比し極め
て高いＥ₁活性を有する、一アミノ酸が置換された変異
型Ｅ₁蛋白質が提供され、更に、この変異型Ｅ₁蛋白質遺
伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡを含むエッシェリ
シア・コリの菌株を培地に培養することにより、前記変
異型Ｅ₁蛋白質を効率よく得ることができた。従って、
本発明は産業上極めて有用である。

【００３８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：８８７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列： Met Ser Glu Arg Phe Pro Asn Asp Val Asp 10 Pro Ile Glu Thr Arg Asp Trp Leu Gln Ala 20 Ile Glu Ser Val Ile Arg Glu Glu Gly Val 30 Glu Arg Ala Gln Tyr Leu Ile Asp Gln Leu 40 Leu Ala Glu Ala Arg Lys Gly Gly Val Asn 50 Val Ala Ala Gly Thr Gly Ile Ser Asn Tyr 60 Ile Asn Thr Ile Pro Val Glu Glu Gln Pro 70 Glu Tyr Pro Gly Asn Leu Glu Leu Glu Arg 80 Arg Ile Arg Ser Ala Ile Arg Trp Asn Ala 90 Ile Met Thr Val Leu Arg Ala Ser Lys Lys 100 Asp Leu Glu Leu Gly Gly His Met Ala Ser 110 Phe Gln Ser Ser Ala Thr Ile Tyr Asp Val 120 Cys Phe Asn His Phe Phe Arg Ala Arg Asn 130 Glu Gln Asp Gly Gly Asp Leu Val Tyr Phe 140 Gln Gly His Ile Ser Pro Gly Val Tyr Ala 150 Arg Ala Phe Leu Glu Gly Arg Leu Thr Gln 160 Glu Gln Leu Asp Asn Phe Arg Gln Glu Val 170 His Gly Asn Gly Leu Ser Ser Tyr Pro His 180 Pro Lys Leu Met Pro Glu Phe Trp Gln Phe 190 Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Ile 200 Gly Ala Ile Tyr Gln Ala Lys Phe Leu Lys 210 Tyr Leu Glu His Arg Gly Leu Lys Asp Thr 220 Ser Lys Gln Thr Val Tyr Ala Phe Leu Gly 230 Asp Gly Glu Met Asp Glu Pro Glu Ser Lys 240 Gly Ala Ile Thr Ile Ala Thr Arg Glu Lys 250 Leu Asp Asn Leu Val Phe Val Ile Asn Cys 260 Asn Leu Gln Arg Leu Asp Gly Pro Val Thr 270 Gly Asn Gly Lys Ile Ile Asn Glu Leu Glu 280 Gly Ile Phe Glu Gly Ala Gly Trp Asn Val 290 Ile Lys Val Met Trp Gly Ser Arg Trp Asp 300 Glu Leu Leu Arg Lys Asp Thr Ser Gly Lys 310 Leu Ile Gln Leu Met Asn Glu Thr Val Asp 320 Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ser Lys Asp 330 Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly 340 Lys Tyr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Val Ala 350 Asp Trp Thr Asp Glu Gln Ile Trp Ala Leu 360 Asn Arg Gly Gly His Asp Pro Lys Lys Ile 370 Tyr Ala Ala Phe Lys Lys Ala Gln Glu Thr 380 Lys Gly Lys Ala Thr Val Ile Leu Ala His 390 Thr Ile Lys Gly Tyr Gly Met Gly Asp Ala 400 Ala Glu Gly Lys Asn Ile Ala His Gln Val 410 Lys Lys Met Asn Met Asp Gly Val Arg His 420 Ile Arg Asp Arg Phe Asn Val Pro Val Ser 430 Asp Ala Asp Ile Glu Lys Leu Pro Tyr Ile 440 Thr Phe Pro Glu Gly Ser Glu Glu His Thr 450 Tyr Leu His Ala Gln Arg Gln Lys Leu His 460 Gly Tyr Leu Pro Ser Arg Gln Pro Asn Phe 470 Thr Glu Lys Leu Glu Leu Pro Ser Leu Gln 480 Asp Phe Gly Ala Leu Leu Glu Glu Gln Ser 490 Lys Glu Ile Ser Thr Thr Ile Ala Phe Val 500 Arg Ala Leu Asn Val Met Leu Lys Asn Lys 510 Ser Ile Lys Asp Arg Leu Val Pro Ile Ile 520 Ala Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Met Glu 530 Gly Leu Phe Arg Gln Ile Gly Ile Tyr Ser 540 Pro Asn Gly Gln Gln Tyr Thr Pro Gln Asp 550 Arg Glu Gln Val Ala Tyr Tyr Lys Glu Asp 560 Glu Lys Gly Gln Ile Leu Gln Glu Gly Ile 570 Asn Glu Leu Gly Ala Gly Cys Ser Trp Leu 580 Ala Ala Ala Thr Ser Tyr Ser Thr Asn Asn 590 Leu Pro Met Ile Pro Phe Tyr Ile Tyr Tyr 600 Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Ile Gly Asp 610 Leu Cys Trp Ala Ala Gly Asp Gln Gln Ala 620 Arg Gly Phe Leu Ile Gly Gly Thr Ser Gly 630 Arg Thr Thr Leu Asn Gly Glu Gly Leu Gln 640 His Glu Asp Gly His Ser His Ile Gln Ser 650 Leu Thr Ile Pro Asn Cys Ile Ser Tyr Asp 660 Pro Ala Tyr Ala Tyr Glu Val Ala Val Ile 670 Met His Asp Gly Leu Glu Arg Met Tyr Gly 680 Glu Lys Gln Glu Asn Val Tyr Tyr Tyr Ile 690 Thr Thr Leu Asn Glu Asn Tyr His Met Pro 700 Ala Met Pro Glu Gly Ala Glu Glu Gly Ile 710 Arg Lys Gly Ile Tyr Lys Leu Glu Thr Ile 720 Glu Gly Ser Lys Gly Lys Val Gln Leu Leu 730 Gly Ser Gly Ser Ile Leu Arg His Val Arg 740 Glu Ala Ala Glu Ile Leu Ala Lys Asp Tyr 750 Gly Val Gly Ser Asp Val Tyr Ser Val Thr 760 Ser Phe Thr Glu Leu Ala Arg Asp Gly Gln 770 Asp Cys Glu Arg Trp Asn Met Leu His Pro 780 Leu Glu Thr Pro Arg Val Pro Tyr Ile Ala 790 Gln Val Met Asn Asp Ala Pro Ala Val Ala 800 Ser Thr Asp Tyr Met Lys Leu Phe Ala Glu 810 Gln Val Arg Thr Tyr Val Pro Ala Asp Asp 820 Tyr Arg Val Leu Gly Thr Asp Gly Phe Gly 830 Arg Ser Asp Ser Arg Glu Asn Leu Arg His 840 His Phe Glu Val Asp Ala Ser Tyr Val Val 850 Val Ala Ala Leu Gly Glu Leu Ala Lys Arg 860 Gly Glu Ile Asp Lys Lys Val Val Ala Asp 870 Ala Ile Ala Lys Phe Asn Ile Asp Ala Asp 880 Lys Val Asn Pro Arg Leu Ala 配列番号：２配列の長さ：２６６４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：線状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：エッシェリシア・コリ（Escherichia coli ）株名：1100株配列： ATG TCA GAA CGT TTC CCA AAT GAC GTG GAT 30 CCG ATC GAA ACT CGC GAC TGG CTC CAG GCG 60 ATC GAA TCG GTC ATC CGT GAA GAA GGT GTT 90 GAG CGT GCT CAG TAT CTG ATC GAC CAA CTG 120 CTT GCT GAA GCC CGC AAA GGC GGT GTA AAC 150 GTA GCC GCA GGC ACA GGT ATC AGC AAC TAC 180 ATC AAC ACC ATC CCC GTT GAA GAA CAA CCG 210 GAG TAT CCG GGT AAT CTG GAA CTG GAA CGC 240 CGT ATT CGT TCA GCT ATC CGC TGG AAC GCC 270 ATC ATG ACG GTG CTG CGT GCG TCG AAA AAA 300 GAC CTC GAA CTG GGC GGC CAT ATG GCG TCC 330 TTC CAG TCT TCC GCA ACC ATT TAT GAT GTG 360 TGC TTT AAC CAC TTC TTC CGT GCA CGC AAC 390 GAG CAG GAT GGC GGC GAC CTG GTT TAC TTC 420 CAG GGC CAC ATC TCC CCG GGC GTG TAC GCT 450 CGT GCT TTC CTG GAA GGT CGT CTG ACT CAG 480 GAG CAG CTG GAT AAC TTC CGT CAG GAA GTT 510 CAC GGC AAT GGC CTC TCT TCC TAT CCG CAC 540 CCG AAA CTG ATG CCG GAA TTC TGG CAG TTC 570 CCG ACC GTA TCT ATG GGT CTG GGT CCG ATT 600 GGT GCT ATT TAC CAG GCT AAA TTC CTG AAA 630 TAT CTG GAA CAC CGT GGC CTG AAA GAT ACC 660 TCT AAA CAA ACC GTT TAC GCG TTC CTC GGT 690 GAC GGT GAA ATG GAC GAA CCG GAA TCC AAA 720 GGT GCG ATC ACC ATC GCT ACC CGT GAA AAA 750 CTG GAT AAC CTG GTC TTC GTT ATC AAC TGT 780 AAC CTG CAG CGT CTT GAC GGC CCG GTC ACC 810 GGT AAC GGC AAG ATC ATC AAC GAA CTG GAA 840 GGC ATC TTC GAA GGT GCT GGC TGG AAC GTG 870 ATC AAA GTG ATG TGG GGT AGC CGT TGG GAT 900 GAA CTG CTG CGT AAG GAT ACC AGC GGT AAA 930 CTG ATC CAG CTG ATG AAC GAA ACC GTT GAC 960 GGC GAC TAC CAG ACC TTC AAA TCG AAA GAT 990 GGT GCG TAC GTT CGT GAA CAC TTC TTC GGT 1020 AAA TAT CCT GAA ACC GCA GCA CTG GTT GCA 1050 GAC TGG ACT GAC GAG CAG ATC TGG GCA CTG 1080 AAC CGT GGT GGT CAC GAT CCG AAG AAA ATC 1110 TAC GCT GCA TTC AAG AAA GCG CAG GAA ACC 1140 AAA GGC AAA GCG ACA GTA ATC CTT GCT CAT 1170 ACC ATT AAA GGT TAC GGC ATG GGC GAC GCG I200 GCT GAA GGT AAA AAC ATC GCG CAC CAG GTT 1230 AAG AAA ATG AAC ATG GAC GGT GTG CGT CAT 1260 ATC CGC GAC CGT TTC AAT GTG CCG GTG TCT 1290 GAT GCA GAT ATC GAA AAA CTG CCG TAC ATC 1320 ACC TTC CCG GAA GGT TCT GAA GAG CAT ACC 1350 TAT CTG CAC GCT CAG CGT CAG AAA CTG CAC 1380 GGT TAT CTG CCA AGC CGT CAG CCG AAC TTC 1410 ACC GAG AAG CTT GAG CTG CCG AGC CTG CAA 1440 GAC TTC GGC GCG CTG TTG GAA GAG CAG AGC 1470 AAA GAG ATC TCT ACC ACT ATC GCT TTC GTT 1500 CGT GCT CTG AAC GTG ATG CTG AAG AAC AAG 1530 TCG ATC AAA GAT CGT CTG GTA CCG ATC ATC 1560 GCC GAC GAA GCG CGT ACT TTC GGT ATG GAA 1590 GGT CTG TTC CGT CAG ATT GGT ATT TAC AGC 1620 CCG AAC GGT CAG CAG TAC ACC CCG CAG GAC 1650 CGC GAG CAG GTT GCT TAC TAT AAA GAA GAC 1680 GAG AAA GGT CAG ATT CTG CAG GAA GGG ATC 1710 AAC GAG CTG GGC GCA GGT TGT TCC TGG CTG 1740 GCA GCG GCG ACC TCT TAC AGC ACC AAC AAT 1770 CTG CCG ATG ATC CCG TTC TAC ATC TAT TAC 1800 TCG ATG TTC GGC TTC CAG CGT ATT GGC GAT 1830 CTG TGC TGG GCG GCT GGC GAC CAG CAA GCG 1860 CGT GGC TTC CTG ATC GGC GGT ACT TCC GGT 1890 CGT ACC ACC CTG AAC GGC GAA GGT CTG CAG 1920 CAC GAA GAT GGT CAC AGC CAC ATT CAG TCG 1950 CTG ACT ATC CCG AAC TGT ATC TCT TAC GAC 1980 CCG GCT TAC GCT TAC GAA GTT GCT GTC ATC 2010 ATG CAT GAC GGT CTG GAG CGT ATG TAC GGT 2040 GAA AAA CAA GAG AAC GTT TAC TAC TAC ATC 2070 ACT ACG CTG AAC GAA AAC TAC CAC ATG CCG 2100 GCA ATG CCG GAA GGT GCT GAG GAA GGT ATC 2130 CGT AAA GGT ATC TAC AAA CTC GAA ACT ATT 2160 GAA GGT AGC AAA GGT AAA GTT CAG CTG CTC 2190 GGC TCC GGT TCT ATC CTG CGT CAC GTC CGT 2220 GAA GCA GCT GAG ATC CTG GCG AAA GAT TAC 2250 GGC GTA GGT TCT GAC GTT TAT AGC GTG ACC 2280 TCC TTC ACC GAG CTG GCG CGT GAT GGT CAG 2310 GAT TGT GAA CGC TGG AAC ATG CTG CAC CCG 2340 CTG GAA ACT CCG CGC GTT CCG TAT ATC GCT 2370 CAG GTG ATG AAC GAC GCT CCG GCA GTG GCA 2400 TCT ACC GAC TAT ATG AAA CTG TTC GCT GAG 2430 CAG GTC CGT ACT TAC GTA CCG GCT GAC GAC 2460 TAC CGC GTA CTG GGT ACT GAT GGC TTC GGT 2490 CGT TCC GAC AGC CGT GAG AAC CTG CGT CAC 2520 CAC TTC GAA GTT GAT GCT TCT TAT GTC GTG 2550 GTT GCG GCG CTG GGC GAA CTG GCT AAA CGT 2580 GGC GAA ATC GAT AAG AAA GTG GTT GCT GAC 2610 GCA ATC GCC AAA TTC AAC ATC GAT GCA GAT 2640 AAA GTT AAC CCG CGT CTG GCG TAA

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年２月７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】このようにして得られたピルビン酸脱水素
酵素複合体のＥ₁蛋白生産能を有する形質転換株である
大腸菌 (Ｅ. coli) ＪＭ109 (pACEE 1K') は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に FERM BP-4486 (FERM P-13
547号より移管）として寄託されている。なお、上記ベ
クターpUTE100K'は、次のように作製したものである。
プラスミドベクターpBR322（宝酒造社製）ＤＮＡをEcoR
Ｉ及びNruＩで切断消化し、ＤＮＡ Blunting kit（宝酒
造社製）で平滑末端とした後、常法に従いアガロース電
気泳動を行ない、GENECLEAN IIにより複製起点を含む約
3.4kbのＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片は
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより環状にした後、EcoRＩ切断を
行い直鎖にした。次いで、大腸菌ラクトースオペロン等
に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム
結合部位等の発現調節領域及びHpal切断部位を含むＤＮ
Ａ配列 (The Operon, p.227, Cold Spring Harbor Labo
ratory, 1980を参照) をＤＮＡ Synthesizer Model 392
(Applied Biosystems社製）で合成し、上記で得られた

【書類名】受託番号変更届

【提出日】平成６年２月７日

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者中野衛一千葉県野田市野田339番地キッコーマン株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】野生型ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ
₁蛋白質のアミノ酸配列において、146位のアルギニンが
プロリンに置換されているアミノ酸配列をコードする変
異型ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁蛋白質遺伝子。
【請求項２】請求項１記載の変異型ピルビン酸脱水素
酵素複合体のＥ₁蛋白質遺伝子をベクターＤＮＡに挿入
してなることを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
【請求項３】請求項２記載の組み換え体ＤＮＡを含む
エッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、変異
型ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ₁蛋白質を採取する
ことを特徴とする前記変異型ピルビン酸脱水素酵素複合
体のＥ₁蛋白質の製造法。
【請求項４】野生型ピルビン酸脱水素酵素複合体のＥ
₁蛋白質のアミノ酸配列において、146位のアルギニンが
プロリンに置換された変異型ピルビン酸脱水素酵素複合
体のＥ₁蛋白質。