JPH05320200A

JPH05320200A - 新規ヒトインターフェロン−γポリペプチド

Info

Publication number: JPH05320200A
Application number: JP4207840A
Authority: JP
Inventors: Seiga Itou; 菁莪伊藤; Tatsuya Nishi; 達也西; Koreaki Taniguchi; 維紹谷口; Haruo Sugano; 晴夫菅野
Original assignee: Japanese Foundation for Cancer Research; Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: Japanese Foundation for Cancer Research; KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1983-03-14
Filing date: 1992-08-04
Publication date: 1993-12-03
Also published as: JPS59167596A; DK160945C; JPH0740925B2; DK160945B; NO169020B; EP0121157A1; DK155184D0; EP0121157B1; ES8506194A1; AU2561984A; DK155184A; NO169020C; ES530597A0; NO840952L

Abstract

(57)【要約】【構成】新規なヒトインターフェロン−γＤＮＡを組
み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを含む微生
物を用いる新規なヒトインターフェロン−γポリペプチ
ドの製造法および該製造法により製造される新規インタ
ーフェロン−γ。【効果】本発明のヒトインターフェロン−γポリペプ
チドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体微生物を
用いることにより、大量に新規なヒトインターフェロン
−γポリペプチドを生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なヒトインターフェ
ロン−γポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミドおよび該プラ
スミドを含む微生物を用いるヒトインターフェロン−γ
ポリペプチドの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターフェロン（以下ＩＦＮと略記す
る）は、大別してＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ
−γの３種類が知られており、主としてＩＦＮ−αは白
血球細胞、ＩＦＮ−βは線維芽細胞、ＩＦＮ−γはＴ−
リンパ球により生産される。これらのＩＦＮは抗ウイル
ス作用のみならず、ナチュラルキラー細胞やマクロファ
ージの活性化作用、抗腫瘍作用など多くの生物活性を示
す物質として注目を集めている。しかしながら、白血
球、培養細胞から分離する従来の方法では、十分な量を
供給することが困難であった。

【０００３】近年急速に発展している組換えＤＮＡ技術
はＩＦＮのように高等生物の細胞では生産量が少なく分
離が困難な物質を微生物で大量に生産することを可能に
した。例えば、ＩＦＮ−βとＩＦＮ−αに関しては、そ
れぞれのmRNAが細胞より抽出され、これに相補的なＤＮ
Ａ（cDNA) が酵素的に合成され、二重鎖ＤＮＡとして適
当なプラスミドに挿入されて、大腸菌にクローン化され
ている〔谷口ら：Proc. Jap. Acad., 55(B),４６４〜４
６９（1979）；長田ら：Nature 284, ３１６−３２０
（1980）〕。

【０００４】ＩＦＮ−γに関しては、動物細胞実験にお
いて他のＩＦＮより強い細胞増殖阻止作用を有すること
が示され〔B.Y. Rubin and S.L. Gupta ：Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 77 , 5928−5932（1980）〕、最近、
ＩＦＮ−γ DNAの１つを大腸菌にクローン化し、その塩
基配列を決めたことが報告されている〔P.W.Grayら：Na
ture 295, 503(1982) 〕

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なヒト
ＩＦＮ−γＤＮＡを組み込んだプラスミド、該プラスミ
ドを含む微生物を用いる新規なヒトＩＦＮ−γポリペプ
チドの製造法ならびに該ヒトＩＦＮ−γポリペプチド自
体を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、組換えＤ
ＮＡ技術を用い、ヒトＩＦＮ−γポリペプチドを大量に
供給するために研究を重ねた結果、上記既知のＩＦＮ−
γとは異なる塩基配列を有する新規なＩＦＮ−γＤＮＡ
を組み込んだ組換え体を用いることにより、微生物とく
に大腸菌で該ＩＦＮ−γ DNAが発現することを見出し本
発明を完成するに至った。

【０００７】以下本発明を詳細に説明する。本発明の組
換え体プラスミドの造成は以下のとおりに行う。新規な
ヒトＩＦＮ−γ DNAとしては、本発明者らによってクロ
ーン化されたｐＩＦＮγ−Ｇ４を用いることができる。
ｐＩＦＮγ−Ｇ４は大腸菌に挿入され、ＡＴＣＣ３９１
２３として米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションに寄託されている。

【０００８】ｐＩＦＮγ−Ｇ４中のＩＦＮ−γＤＮＡは
マキサム・ギルバート法〔Proc. Natl. Acad. Sci., 7
4，560(1977) 〕により決定された図３に示す塩基配列
を有している。ｐＩＦＮγ−Ｇ４中のヒトＩＦＮ−γｃ
ＤＮＡを公知のＩＦＮ−γｃＤＮＡ〔P.W.Grayら：Natu
re 295，５０３（1982）〕と比較すると成熟ヒトＩＦＮ
−γポリペプチドのＮ末端より９番目のアミノ酸（リジ
ン）をコードしている最初の塩基であるアデニン〔Gray
et al., Nature 295 , 503(1982) 〕がｐＩＦＮ−γＧ
４ｃＤＮＡにおいては対応塩基がシトシンとなっている
ので、このような遺伝子がコードするヒトＩＦＮ−γポ
リペプチドのＮ末端より９番目のアミノ酸はリジンでは
なくグルタミンに置換ることになる。従ってｐＩＦＮγ
−Ｇ４は新規なヒトＩＦＮ−γポリペプチドをコードし
ていることは明白である。

【０００９】さらに、ｐＩＦＮγ−Ｇ４は２５番目の塩
基がＣであるため、制限酵素RsaIに対する制限部位を有
する。すなわち、ｐＩＦＮγ−Ｇ４の５´末端から２２
〜２５番目にＧＴＡＣなる塩基配列があり、RsaIは矢印
で示した部位（ＧＴ↓ＡＣ）で、ＤＮＡを切断する。公
知のＩＦＮ−γ遺伝子のなかで、ＩＦＮ−γポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ領域にRsaI部位を有するものは知
られていないので、ｐＩＦＮγ−Ｇ４は新規なヒトＩＦ
Ｎ−γポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。従って
ｐＩＦＮγ−Ｇ４を用いて造成した組換え体プラスミド
はすべて新規な組換え体である。

【００１０】ＩＦＮ−γＤＮＡを組み込むプラスミドと
しては、大腸菌中で該ＤＮＡが発現できるものならどの
プラスミドでも使うことができる。好ましくは、適当な
プロモーター、例えばtrp 系、lac 系のプロモーターの
下流に外来ＤＮＡを挿入することができ、しかもシャイ
ン−ダルガノ配列（以下ＳＤ配列と略記する）と開始コ
ドン（ＡＴＧ）の間を適当な距離、たとえば６〜18塩基
対に調節したプラスミドを用いることができる。具体的
に好的なプラスミドとしては、本発明者らによって造成
されたｐＫＹＰ−１０，ｐＫＹＰ−１１，ｐＫＹＰ−１
２〔特願昭５６−２１３１９３（特開昭５８−１１０６
００）〕などがあげられる。これら発現ベクターの製造
法は参考例１に示すが、これらはいずれもトリプトファ
ン・プロモーター（以下Ptrpと略記する）を有する発現
ベクターである。

【００１１】図１に示したようにして、ｐＫＹＰ−１１
とｐＩＦＮγ−Ｇ４から組換え体プラスミドｐＧＣ−７
を得る。すなわち、ｐＫＹＰ−１１のHindIII, BamHI部
位に、PvuII およびHindIII で消化し低融点ゲル電気泳
動法〔L. Wieslanader, Analytical Biochemistry 98,
305(1979) 〕で精製したｐＩＦＮγ−Ｇ４の断片を挿入
し、組換え体プラスミドｐＧＣ−７を得る。

【００１２】ついで、図２に示すように、ｐＧＣ−７を
BstNI およびSalIで切断し、ＩＦＮ−γＤＮＡを低融点
ゲル電気泳動法で精製し、合成ＤＮＡを介してPtrpを有
する発現ベクターpKYP−10のHindIII, SalI 部位にクロ
ーン化し、組換え体プラスミドpGKA-2を得る。本発明の
ＩＦＮ−γポリペプチドは以下のとおりに製造できる。

【００１３】すなわち、pGKA-2を用いて大腸菌Ｋ−12 H
B101〔S.N.Cohen ら：Proc. Natl.Acad. Sci., 69, 211
0(1972)〕を形質転換させ、アンピシリン耐性（Ap^R以
下同じ）のコロニーの中からpGKA-2を有する大腸菌を選
び出す。pGKA-2を有する大腸菌を培地に培養することに
より培養物中にＩＦＮ−γポリペプチドを生成させるこ
とができる。

【００１４】ここで用いる培地としては大腸菌の生育な
らびにＩＦＮ−γポリペプチドの生産に好適なものなら
ば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。炭素源と
しては、グルコース、フラクトース、ラクトース、グリ
セロール、マンニトール、ソルビトールなどが、窒素源
としては、NH₄Cl, (NH ₄) ₂SO₄,カザミノ酸、酵母
エキス、ポリペプトン、肉エキス、バクトトリプトン、
コーン・スティープ・リカーなどが、その他の栄養源と
しては、NH₂HPO ₄,K₂HP_4,KH ₂PO_4,NaCl,MgSO ₄,Vit
B _1,MgCl₂などが使用できる。

【００１５】培養はｐＨ5.5 −8.5 ，温度１８−４０℃
で通気攪拌培養により行なわれる。培養５〜９０時間で
培養菌体中にヒトＩＦＮ−γポリペプチドが蓄積するの
で、培養物から菌体を集菌し、菌体をリゾチーム処理
後、凍結、融解を繰返して菌体を破砕し、遠心して得ら
れる上清から通常のポリペプチドの抽出方法に従ってポ
リペプチドを採取する。

【００１６】ヒトＩＦＮ−γの定量はアームストロング
の方法〔J.A.Armstrong ら：Appl.Microbiol. 21 ,723
−725(1971) 〕に従って行なう。以下に本発明の実施例
を示す。

【００１７】

【実施例】実施例1. 発現ベクターｐＫＹＰ−11へのヒトＩＦＮ−γＤＮＡの
組み込み：プラスミドｐＩＦＮγ−Ｇ４〔3.6 キロベー
ス（以下キロベースをＫｂと略記する）〕６μｇを２０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ7.5)、１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１
０ｍＭジチオスレイトールおよび５０ｍＭＮａＣｌを
含む全量５０μｌの溶液に溶かし、制限酵素ＰｖｕII
（宝酒造社製、以下制限酵素については特記しない限り
すべて宝酒造社製）１２単位とＨindIII １２単位を加
え、３７℃で４時間消化反応を行なった。反応液を６５
℃、７分間加熱処理して酵素を失活させ、低融点アガロ
ースゲル電気泳動法にて精製し、1.3Kb のヒトＩＦＮ−
γＤＮＡを含むＤＮＡ断片 1.2μｇを得た。

【００１８】別にｐＫＹＰ−１１の４μｇを２０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ7.5)、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ
ジチオスレイトールおよび５０ｍＭＮａＣｌを含む全
量４０μｌの溶液に溶かし、ＢａｍＨＩを８単位加え、
３７℃で３時間消化反応を行なった。反応液を６５℃、
５分間加熱して酵素を失活させた。これにｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各々３０μＭになるよう
に加え、さらに８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
（Klenow断片、New England Biolabs 社製）１μｌを加
えて１５℃で１時間埋め込み（fill in)反応させた。

【００１９】ＤＮＡポリメラーゼＩを失活させるため６
８℃で１５分間加熱処理後、HindIII １０単位を加え３
７℃でさらに３時間消化反応してから、再び６５℃で５
分間加熱し、HindIII を失活させた。このようにして得
たプラスミドｐＫＹＰ−１１の消化反応液より低融点ア
ガロースゲル電気泳動法にて精製し、Ｐｔｒｐを含む約
4.7Kb のＤＮＡ断片約 2.5μｇを得た。

【００２０】ヒトＩＦＮ−γＤＮＡを含むＤＮＡ断片
（1.3Kb)0.5 μｇとプラスミドｐＫＹＰ−11より得たＰ
ｔｒｐを含む約 4.7KbのＤＮＡ断片 1.0μｇを２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5)、６mM ＭｇＣｌ₂、５mMジ
チオスレイトールおよび５００μＭＡＴＰを含む溶液
２０μｌに溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New EnglandB
iolabs 社製）４単位を加え、４℃で１８時間結合反応
を行った。得られた組換え体プラスミドの混合物を用い
て常法通り大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａｐ^Rの
コロニーを得た。このコロニーの培養液よりプラスミド
を分離し、図１に示したｐＧＣ−７を得た。ｐＧＣ−７
の構造は、HindIII 、BamHI 、HpaI、SalI、EcoRI およ
びClaIで消化後、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。ｐＧＣ−７を含む大腸菌菌株は工業技術院微生物工
業技術研究所（以下微工研と略記する）に Escherichia
coli ＩＧＣ−７(FERM BP-497)として寄託されてい
る。

【００２１】実施例2. 組換え体プラスミドｐＧＫＡ−２の造成：実施例１によ
り得られたｐＧＣ−７ＤＮＡ６μｇを２０mMトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ7.5)、１０mM ＭｇＣｌ₂、１０mMジチオス
レイトールおよび１０mM ＮａＣｌを含む全量５０μｌ
の溶解に溶かし、制限酵素 BatNI（New England Biolab
s社製）１２単位を加え、６０℃で３時間反応させた。
次いでＮａｃｌを１５０mMとなるように加え、SalI ８
単位を加えて３７℃でさらに３時間消化反応を行った。
再び６５℃で５分間加熱してSalIを失活させ、低融点ア
ガロースゲル電気泳動法にて精製し、ヒトＩＦＮ−γＤ
ＮＡの大部分を含む約1125塩基対（以下ｂｐと略記す
る）のＤＮＡ断片約 0.8μｇを得た。

【００２２】別にｐＫＹＰ−１０の３μｇを２０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5)、１０mM ＭｇＣｌ₂、１０mMジ
チオスレイトールおよび１００mM ＮａＣｌを含む全量
４０μｌの溶液に溶かし、制限酵素HindIII とSalIを各
々６単位ずつ加え、３７℃で３時間消化反応を行った。
６５℃で５分間加熱してHindIII とSalIを失活させた。
この消化反応液を低融点アガロースゲル電気泳動法にて
精製し、Ｐｔｒｐを含む約4.1Kb のＤＮＡ断片約 1.8μ
ｇを得た。

【００２３】一方、成熟ヒトＩＦＮ−γポリペプチドの
Ｎ末端は Cysであるので、成熟ＩＦＮ−γＤＮＡを発現
させるためには、５´末端のＴＧＴ(Cys) の直前に開始
コドン(ATG) を付与する必要があること、またＰｔｒｐ
の下流のＳＤ配列とＡＴＧとの距離は、６〜１８ｂｐの
間の適当な長さが必要であることなどの理由から、下記
のＤＮＡリンカーを合成した。

【００２４】

【化１】

【００２５】まず、１本鎖ＤＮＡ、１８-merと１５-mer
を通常のトリエステル法〔R. Creaら：Proc. Natl. Aca
d. Sci., 75, 5765(1978)〕により合成した。１８-mer
および１５-merの各々２μｇを５０mMトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ7.5)、１０mM ＭｇＣｌ ₂、５mMジチオスレイト
ール、0.1mM ＥＤＴＡおよび１mM ＡＴＰを含む全量20
μｌの溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３
０単位（ベーリンガー・マンハイム社製）を加えて、３
７℃で６０分間リン酸化反応を行った。

【００２６】リン酸化した１８-merと１５-merを２μｇ
ずつ混合し、７０℃で５分間加熱後室温に放置してアニ
ーリングを行うことにより上記構造を有するＤＮＡリン
カーを得た。上記で得たＰＧＣ−７由来の BatNI−SalI
断片（1125bp) 0.4 μｇと発現ベクターpKYP−10を Hin
dIIIとSalIで消化して得たＤＮＡ断片（4.1Kb) 1.0μｇ
を20mMトリス−ＨＣｌ（pH7.5)、６mM ＭｇＣｌ₂、５
mM ジチオスレイトールおよび５００μＭＡＴＰを含む
全量２５μｌの溶液に溶かし、この混合溶液に上記ＤＮ
Ａリンカーを約 0.1μｇ加えた。この混合液にさらにＴ
４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１７時間結合反
応を行った。得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて、常法通り、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、Ａｐ
^Rのコロニーを得た。このコロニーの培養液よりプラス
ミドを分離し、図２に示したＰＧＫＡ−２を得た。ＰＧ
ＫＡ−２の構造は、EcoRI 、ClaI、HindIII 、BatNI 、
SalIで消化後、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。プラスミドｐＧＫＡ−２のＳＤ配列（ＡＡＧＧ）か
ら開始コドン（ＡＴＧ）までの塩基配列はＡＡＧＧＧＴ
ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧであることを、マキサ
ム・ギルバートの方法〔A.M.Maxam ら： Proc. Natl. A
cad. Sci, 74, 560(1977) 〕で確認した。

【００２７】ＰＧＫＡ−２のヒトＩＦＮ−γＤＮＡはＲ
ｓａＩ部位を有すること、このＤＮＡがコードするヒト
ＩＦＮ−γポリペプチドは９番目のアミノ酸がグルタミ
ン（Ｇｌｎ）である点で公知のものとは異なる。さらに
上記で用いた合成ＤＮＡは、P.W.Grayらが用いた合成Ｄ
ＮＡ

【００２８】

【化２】

【００２９】とは下線の部分で異なる。このようにＰＧ
ＫＡ−２にはヒトＩＦＮ−γをコードするＤＮＡ領域内
に〔ＣＣＡＧＧ〕なるBatNI に対する制限酵素部位が存
在し、ＰＧＫＡ−２はこの点でも公知のものと異なる。
またＳＤ配列とＡＴＧ間の距離と構造は、大腸菌での蛋
白質の発現に大きく影響するので重要であるが、ＰＧＫ
Ａ−２のＳＤ配列とＡＴＧ間の塩基配列は公知の組換え
体プラスミドｐＩＦＮ−γｔｒｐ４８（P.W.Grayら）の
それとは明らかに異なるものである。

【００３０】ＰＧＫＡ−２を含む大腸菌は微工研に Esc
herichia coli IGKA−２（ＦＥＲＭＢＰ−４９６）
として寄託されている。実施例3.Escherichia coli ＩＧＣ−７および同ＩＧＫＡ−２
によるインターフェロンの生産：実施例１〜２で得た組
換え体プラスミドｐＧＣ−７およびｐＧＫＡ−２をもつ
大腸菌ＨＢ１０１株（それぞれＩＧＣ−７、ＩＧＫＡ−
２）をＬＧ培地〔トリプトン１０ｇ、酵母エキス５
ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２ｇを水１リットル
に溶かしＮａＯＨにてｐＨを 7.0とする。〕で３７℃、
１８時間培養し、この培養液 0.2mlを１０mlのＭＣＧ培
地〔Na₂HP₄0.6 ％、KH₂PO₄ 0.3％、NaCl0.5％、NH
₄Cl 0.1％、グルコース 0.5％、カザミノ酸 0.5％、Mg
SO₄１mM、ビタミンＢ₁４μｇ／ml pH7.2 〕に接種
し、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファン遺伝子
のインデューサーであるインドールアクリル酸（以下Ｉ
ＡＡと略す）を１０μｇ／ml加え、さらに２〜１２時間
培養を続ける。培養液を8000rpm、１０分間遠心して集
菌し、３０mM ＮａＣｌ、３０mM Ｔris −ＨＣｌ(pH
7.5)緩衝液で洗浄する。洗浄菌体を上記緩衝液１mlに懸
濁し、２００μｇのリゾチーム、0.25ＭＥＤＴＡ（エ
チレンジアミンテトラ酢酸）を５μｌ加えて３０分間０
℃に放置した後、凍結・融解を３回くり返して菌体をこ
わす。これを15,000rpm 、３０分間遠心して上清を得、
上清中のインターフェロンの量をアームストロングの方
法に従って定量する〔アームストロング（J.A.Armstron
g)ら：アプライド・マイクロバイオロジー(Appl. Micro
biol.)21巻７２３−７２５頁（1971) 〕〔但し、ウイ
ルスとしては Sindvis virus, 動物細胞としてはヒト羊
膜細胞由来のエフエル・セル（FL cell)を用いた。〕結
果を第１表に示す。

【００３１】

【表１】

【００３２】参考例１ trp プロモーターを有するプラ
スミドベクターの造成：（ａ）トリプトファン形質導入ファージＤＮＡの精製 λｐｔｒｐファージであるλｃＩ８５７trpED １０〔以
下、λｔｒｐＥＤと略す G.F.Miazzari ら：J.Bacterio
l. 133巻、１４５７頁（1978）〕を大腸菌ＪＡ１９４株
〔Ｆ^-, λ^-, r _K ^-, m _K ^-，△trpE５，leu6, J.Ca
rbonら Recombinant Molecules p.355(1977) Ravenpres
s 〕に溶原化させることによって得られる菌株、ＪＡ１
９４（λtrpED)を４２℃で３０分培養することによって
λtrpEDファージを誘発し、ファージ溶菌液を調製す
る。このファージ液より塩化セシウム平衡密度勾配遠心
法〔山川ら「核酸の化学Ｉ」東京化学同人社 p.54 −6
1, 1974〕によってλファージを精製する。

【００３３】次いでこのλファージより、山川らの方法
〔核酸の化学Ｉ、東京化学同人社、ｐ62−65、1974〕に
従いフェノール処理とクロロホルム処理をして精製す
る。

【００３４】（ｂ）ｔｒｐプロモーターのプラスミド
ヘのクローニング λtrp EDファージＤＮＡからｔｒｐオペロンのクローン
化は以下のごとく行う。

【００３５】すなわち、８μｇのλtrpED ＤＮＡを２０
mMトリス−ＨＣｌ（pH 7.5) 、75mMNaCl 、10mM MgCl
₂、５mMジチオスレイトール中で１６単位のEcoRI と１
６単位のHindIII を加えて３７℃、２時間消化する。一
方プラスミドpBR325ＤＮＡ１μｇも同様に２単位の Eco
RIと２単位の HindIIIで消化する（最終容量３０μ
ｌ）。次いで、６５℃、５分間加熱処理して反応を停止
し、それぞれの消化したＤＮＡ溶液１５μｌずつを混合
し、終濃度５００μＭのＡＴＰと、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
５単位（New England Biolabs 社製）を加え４℃、１８
時間結合反応を行う。このようにして得られるプラスミ
ドの混合物を用い大腸菌Ｃ６００ＳＦ株〔キャメロン
ら：プロシーティングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス７２巻、3416頁（1975年）〕
を公知の方法〔S.N.コーエンら；プロシーディングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
６９巻 2110頁（1972年）〕に従って形質転換し、ア
ンピシリン耐性（Ap^R) 、テトラサイクリン耐性（T
c^R）およびクロラムフェニコール感受性（Cm^S) を有
する形質転換株を得る。このようにして得られる大腸菌
の形質転換株よりプラスミドＤＮＡを分離し、制限酵素
EcoRI、HindIII 、HpaIで切断した結果、図４（Ａ）に
示す構造をもつことを確認し、pKYP−１と命名した。

【００３６】トリプトファンプロモーターの下流にある
ＳＤ配列（AAGG) の４塩基下流に制限酵素 TaqI で切断
される部位がある。この事実を利用し、上記のプラスミ
ドpKYP−１よりTaqIとEcoRI で消化しトリプトファンプ
ロモーターとＳＤ配列を含む2.6KbのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動法により精製する。この2.6Kb のＤ
ＮＡ断片を図５に示した方法により既知ベクターである
pBR322 にクローン化する。すなわち、８μｇの pBR32
2 に２単位の TaqI を加え、１０mM Tris −HCl(pH8.
4)、６mM ＭｇＣｌ₂、１００mM ＮａＣｌ、６mM ２
−メルカプトエタノールを含む全量１００μｌの反応液
中４５℃で６０分間反応させる。TaqIによる部分消化
後、低融点アガロースゲル電気泳動法〔L.ウイスランダ
ー（Lars Wieslander)：アナリティカル・バイオケミス
トリー98巻３０５ページ（1979年）〕により4.36Kbの
ＤＮＡ断片を精製し、さらにこのＤＮＡ（約1.5 μｇ）
を３単位のEcoRI を加えて、３７℃、３時間反応させて
完全に消化した後、上と同様に低融点アガロースゲル電
気泳動により、約4.33KbのＤＮＡ断片（約1.0 μｇ）を
得る。

【００３７】次に１２μｇのｐＫＹＰ−１ＤＮＡを上
と同様に３単位のＴａｑＩを加えて部分消化し、低融点
アガロース・ゲル電気泳動法で8.5Kb のＤＮＡ断片（約
２μｇ）を精製し、さらにこのＤＮＡをEcoRI で完全消
化することにより、2.6Kb のＤＮＡ断片、約0.5 μｇを
精製する。このようにして得た pBR322 の4.33Kb ＤＮ
Ａ（0.4 μｇ）と pKYP −１の 2.6Kb ＤＮＡ断片（0.
25μｇ）を20mM Tris−ＨＣｌ（pH7.6)、１０mM Ｍｇ
Ｃｌ₂、１０mMジチオスレイトールを含む全量２０μｌ
の反応液中で、0.5mM のＡＴＰとＴ４ＤＮＡリガーゼ４
単位を加え、４℃で１８時間、結合反応を行う。このよ
うにして得られる組換えプラスミドＤＮＡを用い、大腸
菌Ｃ６００ＳＦ８株を形質転換し、得られるAp^R、Tc
^Rの形質転換株がもつプラスミドを分離精製する。この
プラスミドＤＮＡを６種の制限酵素、EcoRI 、HindIII
、ClaI（ベーリンガー・マンハイム社製）、HpaI、Hin
cII、BamHI によって消化して、プラスミドの構造解析
を行った結果、図４（Ｂ）に示した構造をもつことを確
認し、これをpKYP−５と命名した。

【００３８】（ｃ）trp プロモーターのポータブル化上記のプラスミドベクターpKYP−５はＳＤ配列の下流
（１〜２０塩基以内）にCLaI部位とHindIII 部位を有す
るのでＤＮＡ導入ベクターとして充分使用可能である。
しかし、pKYP−５ＤＮＡ中にＳＤ配列の直後のClaI部
位以外にもう１ヶ所ClaI部位があること、およびpKYP−
５ＤＮＡからEcoRI とHindIII で切り出したtrp プロ
モーターを含む断片が2.65Kbとやや大きいのでより使い
やすいようにするため図６のようにしてさらに小さいト
リプトファンプロモーターを含むＤＮＡ断片を有するプ
ラスミドを造成する。すなわちpKYP−５ＤＮＡをHpaI
I とHindIII で消化して約３４０ｂｐ（ベースペアー）
のＤＮＡ断片を精製し、これをClaIとHindIII で消化し
た pBR322 に図６のように挿入し、pKYP−10を得る。pK
YP−10の構造は制限酵素EcoRI 、ClaI、HindIII 、HpaI
で消化した後、アガロースゲル電気泳動で確認する。

【００３９】（ｄ）２個以上の trpプロモーターの連結次にさらに強いプロモーター活性を有するプラスミドベ
クターの造成を目指して、trp プロモーターを２個連結
することを試みる。すなわち、図７（Ａ）に示したよう
に前項（ｃ）でのべたtrp プロモーターを含む約３４０
ｂｐのＤＮＡ断片をClaIとHindIII で消化したpKYP−10
に挿入し、pKYP−11を得る。同様の方法でtrp プロモー
ター３個を同一方向に連結したpKYP−12〔図７（Ｂ）〕
も造成し、EcoRI 、ClaI、HindIII 、HpaIで消化し構造
を確認する。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、新規なヒトＩＦＮ−γＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを
含む微生物を用いる新規なヒトＩＦＮ−γポリペプチド
の製造法および新規なヒトＩＦＮ−γポリペプチド自体
が提供される。

【００４１】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：166 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：ヒト細胞の種類：末梢血リンパ球配列の特徴配列： Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Gln Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln TER 165 166

【００４２】配列番号：2 配列の長さ：994 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：ヒト細胞の種類：末梢血リンパ球配列： CACATTGTTC TGATCATCTG AAGATCAGCT ATTAGAAGAG AAAGATCAGT TAAGTCCTTT 60 GGACCTGATC AGCTTGATAC AAGAACTACT GATTTCAACT TCTTTGGCTT AATTCTCTCG 120 GAAACG ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC TGC ATC 168 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile 1 5 10 GTT TTG GGT TCT CTT GGC TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA CAA GAA 216 Val Leu Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Gln Glu 15 20 25 30 GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG 264 Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala 35 40 45 GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG 312 Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu 50 55 60 AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA 360 Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys 65 70 75 CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG 408 Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu 80 85 90 ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG 456 Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys 95 100 105 110 AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG 504 Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu 115 120 125 AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG GCT GAA 552 Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu 130 135 140 CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG 600 Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu 145 150 155 TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG TAA TGGTTGTCCT GCCTGCAATA 647 Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln TER 160 165 TTTGAATTTT AAATCTAAAT CTATTTATTA ATATTTAACA TTATTTATAT GGGGAATATA 707 TTTTTAGACT CATCAATCAA ATAAGTATTT ATAATAGCAA CTTTTGTGTA ATGAAAATGA 767 ATATCTATTA ATATATGTAT TATTTATAAT TCCTATATCC TGTGACTGTC TCACTTAATC 827 CTTTGTTTTC TGACTAATTA GGCAAGGCTA TGTGATTACA AGGCTTTATC TCAGGGGCCA 887 ACTAGGCAGC CAACCTAAGC AAGATCCCAT GGGTTGTGTG TTTATTTCAC TTGATGATAC 947 AATGAACACT TATAAGTGAA GTGATACTAT CCAGTTACTA CCCCCCC 994

【図面の簡単な説明】

【図１】は、プラスミドｐＧＣ−７の造成のフロー・シ
ートを示す。

【図２】は、プラスミドｐＧＫＡ−２の造成のフロー・
シートを示す。

【図３】は、プラスミドｐＧＫＡ−２中のヒトＩＦＮ−
γＤＮＡ近傍の塩基配列を示す。

【図４】（Ａ）は、プラスミドｐＫＹＰ−１の構造を、
（Ｂ）はｐＫＹＰ−５の構造を示す。

【図５】は、ｐＫＹＰ−５の造成のフロー・シートを示
す。

【図６】は、ｐＫＹＰ−10の造成のフロー・シートを示
す。

【図７】（Ａ）は、ｐＫＹＰ−11の造成のフロー・シー
トを、（Ｂ）はｐＫＹＰ−12の構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/66 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者菅野晴夫東京都杉並区南荻窪４−８−13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
ヒトインターフェロン−γポリペプチド。
【請求項２】トリプトファンプロモーターの下流に請
求項１記載のヒトインターフェロン−γポリペプチドを
コードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミ
ド。
【請求項３】該ＤＮＡ断片が配列番号２に記載の塩基
配列を有することを特徴とする請求項２記載の組換え体
プラスミド。
【請求項４】ｐＧＣ−７またはｐＧＫＡ−２と称する
請求項３記載の組換え体プラスミド。
【請求項５】トリプトファンプロモーターの下流に請
求項１記載のヒトインターフェロン−γポリペプチドを
コードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミ
ドを用い形質転換した微生物を培地に培養し、培養物中
に請求項１記載のヒトインターフェロン−γポリペプチ
ドを生成蓄積せしめ、該培養物から該ヒトインターフェ
ロン−γポリペプチドを採取することを特徴とする請求
項１記載のヒトインターフェロン−γポリペプチドの製
造法。
【請求項６】該微生物が大腸菌に属することを特徴と
する請求項５記載の製造法。