JPS62171695A - 発光蛋白アクアリン遺伝子を用いるアクアリン活性を有する蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術の分野］ 本発明は、発光蛋白アクアリン遺伝子を用いるアクアリ
ン活性を有する蛋白質の製造方法に関する。　更に詳し
くは、本発明は、実質的に単離された該遺伝子をプロモ
ーター含有プラスミドに挿入しトランスファーメーショ
ンした菌体を用いる該蛋白質の製造方法に関する。

［従来の技術］ アクアリンは、アメリカ西海岸北部に生育する発光クラ
ゲの発光蛋白質であり、アクアリン１分子が特異的に２
分子のＣａ　２＋と結合する際にエミッターであるセレ
ンテラジンを酸化して発光する。

一方、アクアリンの発光にはＣａ２＋が不可欠なことか
ら７クアリンを用いてＣａ２＋を特異的に定量すること
ができ、１０−７８程度の微量なＣａ２十濃度の測定が
可能である。

現在、生体内においてＣａ　２＋依存性の酵素が多く、
Ｃａ２＋欠乏による甚大な疾病をひきおこす可能性か亀
　ごのア〃７リンｌ＋随中論客に虞ビ田いちれス可能性
もあり、さらに細胞内に注入することにより細胞内Ｃａ
２＋の濃度測定や冷熱光源などへの応用も可能である。

しかしながら、このクラゲは、その生育場所がアメリカ
西海岸北西部に限られること、発生する季節も夏季のみ
であること、１０，０００匹より１ｍｇ程度の収量しか
なく、その生産量は十分でなく、一定の供給が保証され
得ない。

本発明者等は先に前述の問題を解決すべく鋭意研究を行
い、遺伝子工学の技術を用いてアクアリン蛋白の生成を
実質的に特定するアクアリン遺伝子をＯｋａｙａｍａ−
Ｂｅｒｇ法によりｍＲＮＡよりｃＤＮＡクローンとして
単離調製した。

すなわち、組換え型ＤＮＡ手順を用いてクラゲ発光蛋白
アクアリンのｃＤＮＡクローンを作成し、このｃＤＮＡ
クローンをプラスミドｐＡＱ　４４０と名付けた（特願
昭５９−１７８１２５号以下先の発明という）。

先の発明では、また、該発光蛋白アクアリンのデオキシ
リボヌクレオチド配列若しくはこのヌクレオチド配列の
機能的同等物を含有するように修飾された宿主（例えば
大腸菌）を培養することを特徴とする発光蛋白アクアリ
ンの製法についても発明した。

しかしながら、上述のｃＤＮＡクローンプラスミドｐＡ
Ｑ　４４０は、特別なプロモーターを保持しないもので
あるので、上述のようにプラスミドｐＡＱ　４４０を単
に培養することによっては発光蛋白アクアリンの能率的
な製造は、困飄であった。

［発明の目的］ 本発明者等は、先の発明に係る上述の技術問題を解決す
べく研究を継続した結果、プロモーターを含む（発現ベ
クター）にアクアリン遺伝子を挿入することにより得ら
れた菌体（プラスミド含有）を使用するときは、天然型
若しくは融合型の発光蛋白アクアリンの能率的製造が可
能となることを見出し、本発明に到達した。

以上の記述から明らかなように、本発明は、天然型及び
融合型の発光蛋白アクアリンの能率的な生合成法を提供
することを目的とする０本発明の他の目的は、上述の生
合成法を可能にするプロモーターを含有する菌体の製造
法を提供することである。

［発明の構成・効果］ 本発明は、下記の構成と効果を有する。

（１）　　クラゲ発光蛋白アクアリンの生合成を特定す
る（実質的に単離された）遺伝子（ｐＡＱ　４４０）を
プロモーターを含有するプラスミドに挿入しトランスフ
ァーメーションした菌体を用いることを特徴とするアク
アリン活性を有する蛋白質の製造法。

（２）前記第（１）項において、プロモーターとして大
腸菌に由来する臆５匡若しくは■ムを用いる融合型アク
アリン蛋白質若しくは天然型アクアリン蛋白質の製造法
。

（３）前記第（１）項において、プロモーターとしてラ
ムダファージのＰＬプロモーターを用いる融合型アクア
リン蛋白若しくは天然型アクアリン蛋白質の製造法。

本発明の構成と効果につき以下に詳述する。

■プロモーターを有する発現ベクターへのアクアリン遺
伝子の挿入： 本発明においては、アクアリン遺伝子が挿入される発現
ベクターとしてプロモーターがクローニングされたもの
を使用する。

該ベクターとしては、例えば、ｐｕｃ　９を挙げること
ができる。

プロモーターとしては、例えば、大腸菌由来のＩａｃ、
　ｔａｃ、Ｑ若しくはラムダファージのＰＬを用いるこ
とができる。

該プロモーターは、次のように準備する。すなわち、プ
ロモーターを有するＰＤＲ５４０をＩ旧−旧ｎｄｍ（制
限酵素）消化し、該消化後のプロモーターを含むフラグ
メントを例えば８％アクリルアミドゲル中での電気泳動
により、分離抽出する。

このように抽出されたプロモーターを用い、ベクターの
ＢａｍＨＩ−…ｄｍ部位にクローニングして発現ベクタ
ー　（ｐｉＣ９）を得る。

次に発現ベクター（ｐｉＣ９）のＨｉｎｄｍ部位を次の
ようにして除去する。

すなわち、該ベクターをＨｉｎｄｍ消化後ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰおよびｄＴＴＰの存在下Ｅ、Ｃｏ１
１　ＤＮＡポリメレース（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）
で末端を修復し、両末端を〒４リガーゼで結合して発現
ベクター（ｐｉｃｌｏ）を得る。

次に（ｐｉｅ　１０）中のプロモーターとアクアリンｃ
ＤＮＡ遺伝子を接続するための準備として、リンカ−と
しての合成ヌクレオチドを（ｐｉＣ１０）にクローニン
グする。

すなわち、合成ヌクレオチドＡＲ（５’ＧＡＴＣＧＡＴ
ＧＧＴＣ：Ａ３’）ｅ、ｌ：びＡＱ（５°ＡＧＣＴＴＧ
ＡＣＣＡＴＣ３°）とを公知方法により合成し、これら
を７ニーリングした後ＡＴＰの存在下にＴ４−ヌクレオ
チドキナーゼを用いて５′末端のリン酸化を行う０次に
、該リン酸化合成ヌクレオチドを先に作成したｐｉＣ１
０のＢａｍＨ−…ＲＩ部位にリンカ−が反復する形でク
ローニングしてｐｉＣ１１を作成する。

次に、アクアリンｃＤＮＡクローンｐＡＱ　４４０　（
このものについては、前述の特願昭５９−１７８１２５
号参照）より、Ｈｉｎｄｍ　−ＥｃｏＲＩフラグメント
を分離調製し、該フラグメントを、上述のｐｉＣ１１の
Ｈｉｎｄ　ｍ−…Ｒ１部位に挿入することによりｐｉＱ
　５すなわち、遺伝子ｐＡＱ　４４０をトランスファー
メーションしたプロモーターを含有する菌体を得る。

この　ｐｉＱ　５は、天然型アクオリ蛋白を生産する能
力を有する。

■工プロモーターを有する発現ベクター（ｐＵｃ　９　
、９−１　、９−２）　ヘノ融合型’７’Ｆ７リン蛋白
生産の為の７クアリン遺伝子の挿入：■で述べた方法と
同様にして、ｃＤＮＡクローンｐＡＱ　４４０より匡■
−謹ＲＩおよび肛すｍ−ＥｃｏＲＩフラグメントを分離
精製する。

また、■で述べた方法と同様にして作成された頭のプロ
モーターを有する発現ベクターｐＵｃ９．９−１．９−
２を得る。

そして、これら各のベクターの制限酵素部位に上述の各
フラグメントのクローニングを行うことにより、ｐｉＱ
　９ＰＥ、　９−　ＩＰＥ、　９−２ＰＥ、　９−ＨＥ
および９−２）ＩＥを作成する。

これらは、すべて違プロモーターの下に支配されており
、Ｎ末端に８−アミノ酸残基を有する融合型アクアリン
蛋白質である。

それぞれの構造を第３図に示した。

■大腸菌によるアクアリン活性を有する蛋白質の製造： ■および■で得られる発現ベクターにクローニングした
各プラスミドを例えばＥ、ｃｏｌｉ（Ｉ）　１２１０）
株にトランスファーメーションを行うことによりアクア
リン蛋白を生産させることができる。

すなわち１例えば、適当な濃度（５０＃Ｌｇ／　ｍｆＬ
）のアンピシリンを含む適量（１０ｍＭ　）のＬＢ　ｂ
ｒｏｔｈに例えば１／１００量の１２時間培養した（プ
ラスミドを保持した菌体）を添加して３７℃、２時間培
養し。

つづいて発現誘導試薬　ＩＰＴＧ　（ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｌｒａｎｏｓｉｄ
ｅ）を最終濃度が１ｍＭにな゛るように添加し、ひきつ
づき３７℃で２時間培養する。

以上のようにして得られた培養物を５，０００ｒｐ■テ
１０分間（ＨｉｔａｃｈＲＰ２０）ｊ＆理して集菌し、
得られた菌体を５　膳立のＮ９培地で洗浄する。

被洗浄物は、次のように処理して、測定酵素液を収得す
る。

すなわち、集菌々体を先づ１ｈＭ　ＥＤＴＡを含む２．
５ｍｆｌ　（０２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバー／　７
　ｙ　　（Ｐ）１７．８）　ニ溶解した後、超音波処理
（８０秒）を行って、菌体を破壊する。ひきつづき　１
０，０００ｒｐ■で１ｏ分間遠心処理して得られた上清
を測定酵素液とする。

アクアリン活性の測定方法は、例えば、次のように行う
。

すなわち、上述の酵素液ｌ■見に基質セレンチラシン６
ＩＬｇ、２−メルヵプトエタ／−ル１０ＩＬｆＬを添加
後、氷上で２〜３時間放置した後、光電管測定装置中の
反応セル中に移し、さらに２０ｍＭ　ＣａＣｌ２を１．
５　ｍＪ１注入することにより生成する発光を測定する
。

測定例を後述の実施例３に係る表１に示した。

同表に明らかなように、測定液への誘導試薬ＩＰＴＧ添
加の有無に拘らず上述した各発現ベクターには、発光能
力が極めて低いが、本発明に係るアクアリン遺伝子がプ
ロモーター下流にクローニングされた各プラスミドを用
いて得られた培養物は、ｐｉＱ９−ＨＥを除き発光能力
を増し、該能力は、ＩＰＴＧの添加により、飛躍的に増
加する。

本発明の方法は、発光蛋白アクアリンの遺伝子をプロモ
ーターを含有せしめたプラスミドに挿入し菌体にトラン
スファーメーションして用いるので、短時間の培養によ
り大量の融合型若しくは天然型発光蛋白アクアリンを能
率的に製造できる。

以下、本発明を実施例によって説明する。

実施例　１ ｔａｃプロモーターを有する発現ベクター（ｐｉｃ９）
へのアクアリン遺伝子の挿入（第１図）： イ、　ｐｉＣｌｏの作成： 匡プロモーターを有するｐＤＲ５４０（ＰＬ　Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）より、制限酵素Ｒａｍ　ＨＩ−Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩ消化後、９２ｂｐの匡プロモーターを含むフ
ラグメントを８％アクリルアミド電気泳動により分離抽
出した。ついでベクターｐＵＣ９のＢａｇ旧−旧ｎｄ■
部位にクローニングを行いｐｉＣ９を作成した。ついで
、該発現ベクターｐｉｃ９の旧ｎｄｍ部位を除去するた
めに、先づ旧ｎｄｍ消化を行い、つづイテｄＡＴＰ、　
ｄＧＴＰ、　ｄｃＴＰ　ｔ−ＪヨびｄＴＴＰ　（７）存
在下にＥ、ＣｏＲ１ＤＮＡボリメレース　（Ｋｌｅｎｏ
ｗフラグメント）で末端を修復後、両末端を　丁４　リ
ガーゼで結合してｐｉｃ　１０を作成した。

口、ｐｉＣ１１の作成ニ 一方、アクアリンｃＤＮＡ遺伝子とプロモーターの間を
接続する為に、リンカ−として合成ヌクレオチドＡＲ（
５°ＧＡＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡ　３°）とＡＱ（５°Ａ
ＧＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣ３’）を合成し、アニーリング
後ＡＴＰの存在下に　Ｔ４　ヌクレオチドキナーゼを用
いて５′末端のリン酸化を行い、先に作成したｐｉｅ　
１０のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位にリンカ−が反復す
る型でクローニングしてｐｉｅ　１１を作成した。

ハ、ｐｉＱ５の作成： アクアリン　ｃＤＮＡクローンｐＡＱ　４４０よりＨｉ
ｎｄ　ｍ−…Ｒ１フラグメント分離調製後、前述のｐｉ
Ｃ１１のＨｉｎｄ　ｍ−…Ｒ１部位に挿入することによ
り、ｐｉＱ　５を作成した。

上記の方法で作成したｐｉＱ　５は、天然型アクオリ蛋
白を生産することができる。

第２図に、匡プロモーターとアクアリン遺伝子の近傍の
構造を示す。図において、−３５領域は、ＲＮＡポリメ
ラーゼの認識部位であり、Ｐｒ１ｂｎｏ賛ｂｏｘは、Ｒ
ＮＡポリメラーゼの吸着部位である。また、ＳＤは、リ
ポソームの吸着部位を云す一 実施例　２ 工プロモーターを有する発現ベクター （ｐＵｃ９　、９−１　、９−２）への融合型アクアリ
ン蛋白生産の為のアクアリン遺伝子の挿入：ＣＤＮＡク
ローン　ｐＡＱ　４４０より、　匡■−諺Ｒ１，山ｄｍ
−ＥｃｏＲＩフラグメントを分離精製後、匡のプロモー
ターを有するｐｔ１０９．９−１．９−２の各の制限酵
素部位にクローニングを行い、ｐｉＱ　９ＰＥ。

９−　ＩＰＥ、　９−２ＰＥ、　９−ＨＥおよび９−２
１（Ｅを作成した。これらは、すべて匡プロモーター下
に支配されており、Ｎ末端に８−アミノ酸残基を有する
融合型アクアリンタンパク質である。

上述の各作成物の構造を第３図に示した。

同図において、■はプロモーターをＢはＩ旧をＥは…Ｒ
Ｉを示す。

実施例　３ 大腸菌での生産方法： 前述の（１）および（２）において、発現ベクターにク
ローニングして作成したプラスミドをＥ−ｃｏｌｉ（０
１２１０）株にトランス７　＊　−メ−シ、　ｙを行い
、アクアリン蛋白を生産させた。

すなわち、５０　ＪＬｇｕｙｓ　ｌの濃度のアンビミリ
ンを含むＬＢｂｒｏｔｈ　１０ｍ１にｌ／１００最の　
１２時間培養後の上記菌体（註、プラスミドを保持した
菌体）を添加後３７℃で２時間培養し、該培養物に発現
誘導試薬ＩＰＴＧ　（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉ
ｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎ。

５ｉｄｅ）を最終濃度１鵬にになるように添加し、さら
に３７℃で２時間培養した。

該培養物を５．００Ｏｒｐｍ、　１０分間（Ｈｉｔａｃ
ｈ　ＲＰ　２０）で集菌後、該菌体を５　膳立のＮ９培
地で洗浄する。　被洗浄物を　１０−Ｍ　ＥＤＴＡを含
む２．５ｍＪＬの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＬバー／　
７７−　（ｐＨ７，ｆｌ）に溶解させた後超音波処理（
８０秒）で菌体を破壊し、１０．０００ｒｐ層で１０分
間遠心分離処理し、上清を測定酵素液として用いた。

測定方法としては、該酵素液ｌ　■見に基質セレンテラ
ジン６涛８および？−メルカプトエタノール１０ＪＬＩ
Ｌを添加後氷上で２〜３時間放置し、次に光電管測定装
置中の反応セル中に移し、さらに２０ｍＭ　ＣａＣｌ２
　、１．５．ｍｕを注入することにより、生成する発光
を測定した。

測定結果を表１示した。

同表によると発光誘導試薬　ＩＰＴＧ誘導で、天然の７
クアリン蛋白１０１５ｑｕａｎｔａ／ｍｇから算出する
と、本実施例の培養液１　　ｓＪ１中に約組皿のアクア
リン蛋白が生産されている。

１、　　菌でのアクアリン　　の ＩＰＴＧ　（１ｍＷ） ｐＵＣ９−２００ ｐｉｃ１１　　　　　０　　　　　　０ｐｉＱ９−２Ｐ
Ｅ　　　Ｏ，５５１，２ｐｉＱ９−ＨＥＯＯ ｐｉＱ９−２ＨＥ　　　Ｏ，７２５０，８ｉ　Ｑ　５　
　　　　１０　、５　　３２５　、８Ｘ　１０８　ｑｕ
ａｎｔａ　／５ｅｃｏｎｄ

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は、本発明の詳細な説明図である。 ′第１図は、匡発現ベクターの構築と７クアリンｃ［）
ＨＡの発現ベクターへの挿入方法を示すフローシートで
ある 第２図は、天然型アクアリン合成ベクターｐｉＱ　５の
プロモーター領域の構造図を示す説明図である。 第３図は、匡プロモーター発現ベクターへのアクアリン
ｃＤＮ轟遺伝子の挿入クローンの構造を示す説明図であ
る。 以　　上

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）クラゲ発光蛋白アクアリンの生合成を特定する（
   実質的に単離された）遺伝子（ｐＡＱ４４０）をプロモ
   ーターを含有するプラスミドに挿入しトランスファーメ
   ーションした菌体を用いることを特徴とするアクアリン
   活性を有する蛋白質の製造法。
2. （２）特許請求の範囲第（１）項において、プロモータ
   ーとして大腸菌に由来する￥ｌａｃ、￥￥ｔａｃ￥若し
   くは￥ｔｒｐ￥を用いる融合型アクアリン蛋白質若しく
   は天然型アクアリン蛋白質の製造法。
3. （３）特許請求の範囲第（１）項において、プロモータ
   ーとしてラムダファージのＰＬプロモーターを用いる融
   合型アクアリン蛋白若しくは天然型アクアリン蛋白質の
   製造法。