JPS6371185A - ヒト・インターロイキン−１αの合成遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般にヒトタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列に関し、より詳細にはヒト免疫系の媒介物質であ
るインターロイキン−１α（ＩＬ−１α）をコードする
合成ヌクレオチド配列に関する。

（従来の技術） 細菌またはそれらの生産物への暴露により刺激された半
球からのＩＬ−１のｉｎνｉｖｏ　放出は、感染後の急
性期免疫応答の生起にとって重要である。ＩＬ−１に対
する器官および組織の生理学的・病理学的応答は広く研
究されており、例えばジナレｏ　（Ｄｉｎａ（ｅｌｌｏ
　）、　Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、。

ｖｏｌ、６．ｐ、５１〜９５（１９８４）を参照された
い。免疫学的見地からすると、単球−誘導ＪＬ−１は、
免疫系の体液媒介免疫と細胞媒介免疫の両方がＩＬ−１
の合成に依存して誘発されると考えられるので、宿主の
防御にとってきわめて重要である。ＩＬ−１はインター
ロイキン−２（ＩＬ−２）を放出、させることによる胸
線細胞増殖の刺激、Ｂ　ＩＪンパ球成熟および増殖の刺
激、線維芽細胞生長因子活性、および肝細胞による急性
期タンパク質合成の誘導を含めた広範囲の生物学的活性
を媒介する。ＩＬ−１はまた滑液細胞からのプロスタグ
ランジンおよびコラゲナーゼの放出を刺激し、かつ内因
性発熱物質と同一であることが報告された。クランプシ
ュミット（Ｋｒａｍｐｓａｈｍｉｄｔ　）Ｊ、　Ｌｅｕ
ｋ、　Ｂｉｏｌ、　、　ｖｏｌ、　　３６．　ｐ、　　
３４１〜３５５（１９８４）を参照されたい。

生化学的研究およびｃＤＮＡクローニングの研究により
、類似の活性をもつと思われる２つの関連したＩＬ−１
タンパク質（αおよびβ）が明確にされた。マーチ（Ｍ
ａｒｃｈ　）ら、”２つの別個のヒト・インターロイキ
ン−１相補ＤＮＡのクローニング、配列および発現、’
　Ｎａｔｕｒｅ、　ＶＯＬ　３１５．　ｐ。

６４１〜６４７（１９８５）、およびガプラー（Ｇｕｂ
ｌｅｒ　）ら、２組換えヒト・インターロイキン−１α
：精製および生物学的性状決定″、Ｊ。

Ｉｒｒｍｕｎｏｌ、　、　ｖｏｌ、　１３６．　　ｐ、
２４９２〜２４９７（１９８６）を参照されたい。ＩＬ
−１αｍＲＮＡ−およびＩＬ−１βｍＲＮＡの１次翻訳
産物は、特有のトランスメンブランシグナル配列をコー
ドしないそれぞれ２７１個および２６９個のアミノ酸を
もつタンパク質である（マーチらの上記文献参照）。Ｉ
Ｌ−１はその１次翻訳産物のＣ末端の１７５００ダルト
ン断片であると考えられ、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）によ
るこの断片の発現は天然タンパク質と明らかに同じ性質
をもつタンパク質をもたらす（マーチらおよびガブラー
らの上記文献参照）。

ＩＬ−１は単独でまたは他のリンフ才力イン類との組合
せで臨床上の使用可能性をもつと考えられ、例えばソー
ブ（Ｓｏｒｇ）　　ら編集、リンフ才力ｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ）　（ア
カデミツクプレス、ニューヨーク、１９８５）を参照さ
れたい。

（発明の構成） 合成ヒト・インターロイキン−１α遺伝子（それらのコ
ドンは細菌、特に大腸菌によって好まれるものから選ば
れる）が提供される。天然ＩＬ−１αおよび数種の突然
変異ＩＬ−１αの双方のたメツ大腸菌発現系において高
い発現レベルカ得うれる。突然変異ＩＬ−１αは天然ヒ
）ＩＬ−１αのアミノ酸配列に関して１〜１４アミノ酸
のＮ末端欠失、および１〜１１アミノ酸のＣ末端付加を
含む。（ＩＬ−１αという名称は通常本明細書において
この用語が単独である場合に使用される。。

組合せの場合にはしばしば便宜上区ＩＬ１という名称が
用いられる。） 本発明はさらに本発明の合成遺伝子を使用してＩＬ−１
αの突然変異タンパク質を生産する方法を包含する。合
成ＩＬ−１αの遺伝子は一連のまたは一組の唯一の制限
エンドヌクレアーゼ部位（本明細書では”唯一制限部位
″と称す）によってセグメントに再分割される。唯一制
限部位の数および間隔は、いずれか２つの唯−制限部位
間の遺伝子セグメントが、改変された塩基配列をもつセ
グメントによって都合よく置換され得るように選ばれる
。制限部位は、合成遺伝子およびその遺伝子が挿入され
るベクターがただ１つのこのような制限部位（すなわち
、挿入された合成遺伝子によってもたらされたもの）を
含むという意味で唯一である。好ましくは、唯一制限部
位の数および間隔は、置換用セグメントが例えば市販の
自動ＤＮＡ合成機で標準固相オリゴヌクレオチド合成技
術を用いて確実に合成され得るようなものである。

比較的短い置換用セグメントはクローニングの際の挿入
および／または欠失変化の可能性を減少させ、且つそれ
らは小規模のベクターＤＮＡ調製物に対して共通のシー
フェンシングブライマーを利用することができるので塩
基配列解析の作業をより容易にする。好ましくは、唯一
制限部位の数および間隔は、セグメントの長さが４０〜
１８０塩基となるように選ばれる。

概略すると、本発明方法は（ｌｌｌ’ｆｆｉ！ベクター
に関して唯一の制限部位を一組もつ合成ＩＬ−１α遺伝
子を準備しくその唯一制限部位は複数のセグメントを形
成すべ（合成重Ｌ−１αの遺伝子に浴って４０〜１８．
０塩基離れて配置される）、（２）１つまたはそれ以上
のセグメントを、予め定めらバた配列をもつ置換用セグ
メントで置換して、修飾された合成遺伝子を形成し、（
３）その修飾合成遺伝子を含む関連ベクターを宿主内に
組み入れ、そして（４）その修飾合成遺伝子を突然変異
タンパク質へ転写・翻訳するのに適した条件下にその宿
主を維持する諸工程から成っている。

置換用セグメントに関して本明細書で用いられる“予め
定められた配列″なる用語は、その置換用セグメントが
本発明方法を利用する者によって前もって決定された既
知の塩基配列をもつことを意味している。好ましくは、
置換用セグメントは固相オリゴヌクレオチド合成により
製造される。

置換は合成遺伝子を２種の制限エンドヌクレアーゼ（そ
の制限部位間に置換用セグメントが挿入される）で消化
することにより達成される。従って、このような消化の
際に２つのフラグメント：すなわちベクターの大部分を
含むフラグメントおよび１つまたはそれ以上の連結セグ
メントから成るフラグメントが形成される。２つのフラ
グメントを分離し、ベクターフラグメントを置換用セグ
メントと連結させると、修飾合成遺伝子を含むベクター
が形成される。

本発明をさらによ（理解するために、今やその好適な実
施態様が添付の図面を参照しつつ説明されるであろう。

第１Ａ−Ｃ図は本発明の合成ヒ）ＩＬ−１αの遺伝子の
作製において用いられるＤＮＡフラグメントを示す。こ
れらのフラグメントは適当な突出一本鎖末端をもつ二本
鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）として描かれている。関係のあ
る制限部位またはその一部は太字で表され、その部位の
上に制限酵素基を示す。下段のＤＮＡ鎖の大きさは配列
の下に示され、そして小文字の配列はベクター配列、ま
たは最終的に発現されたＩＬ−１α構築物に無関係の配
列である。

第２Ａ−Ｄ図はいろいろな作製工程におけるＣ末端ＩＬ
−１αコード領域を示す。ＤＮＡ配列はトリブレットと
して表され、対応するアミノ酸がその上に表示される。

関係のある制限部位は太字で表され、そのＤＮＡの下に
制限酵素基を示す。

Ｃ末端ＩＬ−１αをコードする０ＣＡ）リプレットの３
１側に存在するそれぞれのベクター配列の種類はその配
列の上に示される。

第３図は完成されかつ発現された合成ヒ）ＩＬ−１α遺
伝子のＤＮＡ配列を示す。コード領域はトリプレットと
して配列され、対応ゴーるアミノ酸を示す。関係のある
制限部位は太字で表され、その配列の上に制限酵素基を
示す。Ｓａｃ　Ｐプロモーター領域およびリポソーム結
合部位（ＲＢＳ）の位置が表示される。配列の下の小文
字は、新しい制限部位の存在および好適なコドンの使用
の両方の結果として、天然ＩＬ−１配列中に見られる中
立塩基変化（ｎｅｕｔｒａｌ　ｂａｓｅ　ｃｈａｎｇｅ
ｓ　）を示す０これら２つのコード領域（塩基対１７１
〜６５０）は８１％相同である。細菌にとって好適でな
い８つのコドンが合成コード領域中に存在し、これらは
アミノ酸２３．３１．　３２．３３．　５５．　６５．
６６および７１に対応する。本発明の特定の形態は第３
図に示したアミノ酸配列の１５４，１５３，１５２゜１
５１．１５０，１４９，１４８，１４７，１４６，１４
５゜１４４．１４３，１４２，１４１および１４０　Ｃ
末端アミノ酸から成る配列を有する突然変異ヒト・イン
ターロイキン−１αポリペプチドである。

第４Ａおよび４−Ｂ図は種々の発現されたＩＬ−１α合
成遺伝子およびＩＬ−１α−β−ガラクトシダーゼ遺伝
子を表す。黒色領域はｔａｃ　Ｐプロモーター、リポソ
ーム結合部位（ＲＢＳ）、オヨヒイニシエーターＡＴＧ
）リブレットを保有する１　７３　ｂｐ　ＴＡＣ−ＲＢ
　Ｓ調節領域を表す。白色領域は合成ＩＬ−１αのコー
ド配列であり、そして灰色領域はその池のコード配列で
ある。関係のある制限部位は矢印で示す。第４Ａ図は７
種の最終発現構築物を示し、それらはすべてｐＭＴ１１
ｈｃベクター中に存在する。第４Ｂ図は４種のＩＬ−１
α−β−ガラクシダーゼ融合発現プラスミドを示し、そ
れらはすべて９ＭＣ１４０３ベクター中に存在する。

第５図は大腸菌発現ベクターのＴＡＣ−ＲＢＳ中のイニ
シエーターＡＴＧコドンに隣接したヌクレオチド配列を
示す。この配列はＥｃｏＲＩ制限部位で始まり、Ｈｉｎ
ｄ　■部位で終わる。矢印はその下に示す種々のヌクレ
アーゼでヌクレオチド配列が切断される場所を示す。１
６　Ｓ　ＩＪボソームＲＮＡの３＋末端に対して相補性
を示すリポソーム結合部位は太字で表され、下線が引い
である。ＡＴＧイニシエーターコドンにも下線が施され
ている。

ヒト・インターロイキン−１αのための合成遺伝子（細
菌、特に大腸菌により好まれるコドンから実質的に成る
）が提供される。細菌にとって好適なコドンはドウ・ボ
ア（ｄｅ　Ｂｏｅｒ　）およびカストライン（Ｋａｓｔ
ｅｌｅｉｎ　）、°偏りのあるコドン使用度：翻訳の最
適化におけるその役割の研究″。

８章ｒ　　ｐ、２２５〜２８３　、　　レズニコフ（Ｒ
ｅｚｎｉｋｏｆｆ）およびゴールド（Ｇｏｌｄ　）編集
、　ＢｉｏｔｅｃｌｌｎｏｌｏｇｙＳｅｒｉｅｓ　１９
８５　によって提供される塩基配列が決定された細菌遺
伝子の調査から決定される。下記の表Ｉは本発明に従っ
て使用される細菌にとって好適なコドンを示す。合成Ｉ
Ｌ−１α遺伝子に関して“実質的に成る″という表現は
、合成遺伝子のセグメントの制限エンドヌクレアーゼに
よる操作を促進するために必要な場合に、細菌にとって
好適でない若干のコドンが使用され得ることを意味して
いる。一般に、それは８０〜９０％のコドンが（以下で
より詳しく説明するように）細菌にとって好適であるこ
とを意味する。標準的な略語がヌクレオシド塩基（Ａ＝
アデノノン、Ｇ＝ニブアノシンＣ＝シチジン、Ｔ＝チミ
ジンおよびＵ＝ニラリジンおよびアミノ酸を明示するた
めに使用される；例えばレニンガー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅ
ｒ　）　。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ｐ、７３〜７５（
ワース・パブリッシャーズ、ニューヨーク、１９７５）
を参照されたい。制限エンドヌクレアーゼを明示するた
めの標準命名法が明細書全体にわたって使用される；例
えばロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ　）、　ｐ、　２７〜４
１、ニー（Ｗｕ）編集＋　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏ−ｂ）ｇｙ、　ＶＯｌ、　　６８　（アカデミ
ツクプレス、ニューヨーク、１９７９）を参照されたい
。

Ｌｅｕ　　　　ＣＵＧ　　　　Ｇｌｎ　　　　ＣＡＧＡ
ｒ　ｇ　　　　ＣＧＣＡｓ　ｎ　　　　ＡＡＣＧｌｙ　
　　　ＧＧＵ　　　　ＬｙＳ　　　　　ＡＡＡ■１ｅＡ
ＵｃＧ１ｕＧＡＡ Ｈ１８ｃＡｃＰｈｅＵＵＣ ８ｅｒ　　　ＵＣＵ　　　”ｐＵＵＧ ＵＣＣＭｅｔ　　　　　ＡＵＧ ＡＧＣＡｌａ　　　ＧＣＵ Ｖａ　Ｉ　　　　ＧＵＵ　　　　　　　　　　ＧＣＡＵ
Ａ Ｐ　ｒ　ｏ　　　　ＣＣＧ ＣＣ （実施例）　　、 Ｌ　細菌株、発現ベクターおよび組換えＤＮＡプロトコ
ール クローニングおよび発現は標準細菌系、例えばビエラ（
Ｖｉｅｉｒａ　）およびメッシング（Ｍｅｓｓ　ｉｎｇ
　）＋Ｇｅｎｅ、　ｖｏｌ、　　１９．　　ｐ、　２５
９〜２６８　（１９８２）に記載される大腸菌に一１２
株ＪＭ１０１（市販されている）を用いて実施される。

発現ベクターは（ファーマシア社からｐＵＣ１２を）購
入するかあるいは市販のベクターから作製した。

制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡポリメラーゼ、キ
ナーゼ、リガーゼおよびエキソヌクレアーゼ反応は標準
技術を用いて行った；例えばマニハーパー・ラボラトリ
−、ニューヨーク、１９８２）を参照されたい。酵素は
商業源、例えばニューイングランド・バイオラプズ社ま
たはベーリンガー・マンハイム社から入手可能である。

アルカリ法（マニアチスらの上記文献参照）は小規模の
プラスミド調製物のために使用された。

大規模調製物のためにはアルカリ法の変法が使用され、
その場合、等容量のイソプロパツールを用いて澄明な溶
菌液から核酸を沈澱させた。塩化セシウム−エチジウム
プロミド平衡密度遠心に先立って、冷２．５Ｍ酢酸アン
モニウムによる沈澱を使用してＲＮＡを除去した。。

フィルターハイブリダイゼーションのためにワットマン
５４０ｐ紙を使用し、その戸紙上にコロニーを移し、次
いで０．５Ｍ　　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣ１；ＩＭ
）リス−ＨｃＩ　　ｐＨ８，０，１，５Ｍ　ＮａＣ１（
それぞれ２分）；および８０℃での加熱（３０分）；に
より順次処理して溶菌し、固定した。ハイブリダイゼー
ションは６ＸＳＳＰＥ、２０％ホルムアミド、０．１％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００　ｐ９／ｍ
ｌ　鳩菌ｔ　ＲＮ　Ａ　、　１００４　／ｒｎｉクーマ
シーブリリアントプルーＧ−２５０（バイオラッド社）
中で３Ｐ−標識（キナーゼ処理）合成りＮＡを用いて４
２℃で行った。（２０ＸＳＳＰＥはＨ＊０８００ｍＪ中
にＮａＣｌ　１７４９　、　ＮａＨ２ＰＯ，・Ｈ２Ｏ２
７，６，９およびＥＤＴＡ７．４．９を溶解して調製す
る。ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整し、容量を１リツト
ルとなし、そしてその−回分をオートクレーブで滅菌す
る。） フィルターは１×５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで２回（１
５分、室温）洗浄した。オートラジオグラフィー（Ｆｕ
ｊｉＲＸフィルム）後、ｉｉコロニーの位置は再増殖コ
ロニーとフィルター上の青色染色コロニーとを整合させ
ることにより定めた。

ＤＮＡの塩基配列はマクサム（Ｍａｘａｍ　）およびギ
ルバート（Ｇ１１ｂｅｒｔ　）の化学分解法（Ｍｅｔｈ
ｏ−ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、　
６５＋　　ｐ、　４９９　　（１９８０）を参照〕、ま
たはサンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）らのジデオキシ法ＣＰ
ｖｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　。

ｖｏｌ、７４．ｐ、５４６３（１９７７）を参照〕によ
り決定した。ジデオキシ反応のためのテンプレートは、
Ｍ　１３　ｍｐベクターに再クローニングした関連領域
の一本鎖ＤＮＡ（例えばメッシング（Ｍｅ−ｓｓｉｎｇ
　）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　
ｖｏｌ、　９．　　ｐ。

３０９　（１９８１）を参照〕、またはミニアルカリ法
によって調製し、０．２Ｍ　ＮａＯＨで変性しく５分、
室温）、次いで２倍容量のエタノールを添加して０．２
Ｍ　ＮａＯＨ，１，４３Ｎ１酢酸アンモニウムから沈澱
させた二本鎖ＤＮＡのいずれかであった。ジデオキシ反
応は４２℃で実施した。

ＴＡＣ−Ｒ，ＢＳベクターはｔａｃＰ含有プラスミドｐ
ＤＲ５４０（ファーマシア社、ＰＬ）の単一のＢａｍ　
ＨＩ部位をＤＮＡポリメラーゼで修復することにより作
製した。その後これは共通のリポソーム結合部位（ＲＢ
Ｓ、ＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＣ）をコードする二
本鎖フラグメントを形成する非ホスホリル化合成オリゴ
ヌクレオチド（クアーマシア社、ＰＬ）に連結させた。

連結後、この混合物をホスホリル化し、そしてＳｓｔ　
Ｉリンカ−ＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴと再連結させた。次い
でこの複合体をＳｓｔ　ＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、
１７５ｂｐフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）で単離し、ＥｃｏＲＩ　−Ｓｓｔ　Ｉ
　？ＷＩＪ限ｐＵＣ１２（ファーマシア社、ＰＬ）にク
ローニングした。正しい配列をもつ１つのクローンを選
択し、１８０　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ　　ｔａ
ｃ　Ｐ　−ＲＢＳフラグメントをｐＭＴｌｌｈｃに再り
ローニンクシタ。ｐＭＴｌ　１ｈｃ　はπＶＸプラスミ
ドＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩポリリンカー領域を含
むｐＢＲ３２２の小さな（２，３Ｋｂ）、高コピー数の
、ＡＭＰＲ１ＴＥＴＳ誘導体である。最終構築物（ＴＡ
Ｃ−ＲＢＳと呼ぶ）のＲＢＳ−ＡＴＧ−ポリリンカー領
域の配列は第５図に示す。

…　ＤＮＡの合成およびクローニング ＤＮＡはアプライド・パイオシステ、ムズ３８０Ａ合成
機を使ってホスホルアミダイト法により合成した。合成
、脱保護基、切断および精製（７Ｍ尿素ＰＡＧＥ、溶出
、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー）は３８０
Ａ合成機のマニュアルに記載のごと（行った。クローニ
ングすべき合成りＮＡの相補鎖（それぞれ４００μｇ）
は混合したのち５０μｌの反応容量中ポリヌクレオチド
キナーゼを用いてホスホリル化した。このＤＮＡは適当
な制限酵素で消化したベクターＤＮＡ１μｓと連結させ
、この連結反応は５０μｌの容量中室部で４〜１２時間
行った。ホスホリル化、制限酵素消化、ポリメラーゼ反
応および連結反応の条件はマニアチスらの上記文献に記
載されている。コロニーはアンピシリン、イソプロピル
−１−チオーβ−Ｄ−ガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ　）　
（０，４ｍＭ　）および５−プロ、モー４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａ
ｌ　）　（４０μＶｍｉ’）を補給したＬ寒天培地上で
培養することにより１ａｃＺ＋について調べた。クロー
ニングにおいて天然ＤＮＡフラグメントを使用した場合
には、２０μｇのプラスミドを消化し、その産物を分離
用６％ＰＡＧＥ（マクサムおよびギルバートの上記文献
参照）で分離し、そしてＤＥＡＥ−セルロースクロマト
グラフィー（マニアチスらの上記文献参照）でさらに精
製した。このフラグメントの暑。を適当な制限酵素で消
化した１μｇのベクターＤＮＡと連結させた。

単一コロニーは１００μ、ｊ９／ｍｌアンピシリンヲ含
むＬ培地（マニアチスらの上記文献参照）　０．２　ｖ
ｔｌ中に採取し、振とうせずに３７°Ｃで一晩増殖させ
た。培地をさらに２ｍｌ加え、振とうしながら３７０Ｃ
で６時間細胞を増殖させた。ＴＡＣ誘導プラスミドを含
む細胞は、２時間の増殖後に０．４　ｍＭ　ＩＰＴＧ（
シグマ社）を添加することにより誘導した。細胞を遠心
（１３０００ｒｐｍ、２分、パイオフユージＡ）して集
め、１ｒｒＩＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭ
ＳＦ）（シグマ社）ヲ含ムリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、シ
グマ社）Ｉｎ／’中に懸濁し、そしてブランソン細胞破
壊装置２００のミニプローブを使って４０ワツトで４０
パルス（５０％）の間超音波処理した。１０％ＳＤＳ　
（バイオラッド社）１００μｌを添加し、３７℃で１５
分インキュベーションしたのち、試料を遠心した（１３
０００ｒｐｍ、１５分、バイオフユージＡ）。試料の希
釈物はいくつかの利用可能な方法による生物検定にかけ
た。例えば、ＩＬ−１αは胸線細胞共刺激（ｃｏ　−ｓ
ｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　）により検定し得る；ミゼ＃　
（Ｍｉｚｅｌ　）およびミゼ／ｌ／　（Ｍｉｚｅｌ　）
　、　Ｊ、　Ｉｍ−ｍｕｎｏｌ、、　ｖｏｌ、　１２６
１　ｐ、　８３４　（１９８１）を参照されたい。好ま
しくは、ＩＬ−１αはＩＬ−１応答性Ｔ細胞、例えばリ
ンパ腫ＬＢＲＭ３３のＩＡ５クローンを用いて検定され
、このＩＡ５クローンは米国メリーランド州ロックビル
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡ
ＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ８０７９として寄託され、モして
ギリ、：ｘ、　（Ｇ１１ｌｉｓ　）およびミゼ／ｌ／　
（Ｍｉｚｅｌ　）、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ｖｏｌ、　７８
．　ｐ、　　１１３３（１９８１）および米国特許第４
４０４２８０号（この米国特許はバイオアッセイおよび
ｌ）　７パ腫ＬＢＲＭ３３クローンＩＡ５の記載のため
に重要な文献である）に記載されている。この最後の検
定は本明細書において“ＩＡ５変換検定″と呼ばれる。

■６合成ヒ）ＩＬ−１αの遺伝子の作製ヒトＩＬ−１α
の活性Ｃ末端領域の合成８よびクローニングのために用
いられた方法は、８種の合成２本鎖ＤＮＡ　（ｄｓ　Ｄ
ＮＡ　）フラグメントな利用するいくつかの工程で進行
する。工程１では、発現されるべきＩ　Ｔ、　−１α領
域のＮ末端部分をコ−ドする９３ｂｐ合成ｄｓＤＮＡフ
ラグメント（ＩＡ／Ｂ、第１Ａ図参照）が大腸菌発現ベ
クターＴＡＣ−ＲＢＳにクローニングされる。このベク
ターは共通のリポソーム結合部位の上流にｔａｃプロモ
ーターを保有するｐＵＣ１２誘導体である。イニシエー
ターＡＴＧコドンは、３ｓｔＩおよびＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼによる処理がＴＡＣ−ＲＢＳのＡＴＧコドンで平
滑末端を生ずるように、唯一の５ｓｔＩ制限部位と重な
り合う。このＡＴＧコドンの下流にｐＵＣ１２ポリリン
カー配列が続く。合成ＩＡ／Ｂは、上記のように処理し
たのちＩＡ／Ｂの下流末端の重なり合５ＣＧ残基を収容
すべくＡｃｃＩで制限したＴＡＣ−ＲＢＳベクターにク
ローニングした（第１Ａ図参照）。

工程２では、ｄｓＤＮＡ合成フラグメン）７Ａ／Ｂおよ
び８Ａ／Ｂを混合し、この混合物をＳａｌ　ＩおよびＨ
ｉｎｄ［で制限したｐＵｃ１２ベクターＤＮＡにクロー
ニングした。フラグメント７Ａ／Ｂおよび８、Ａ／Ｂは
相補的な９残基一本鎖末端、ならびにＳａｔ　Ｉ−およ
びＨｉｎｄｌｌＩ−制限ＤＮＡとそれぞれ適合する一本
鎖末端を有する（第１Ｃ図参照）。フラグメント７Ａ／
Ｂは、ＩＬ−１αのコード領域の一部であり且つ５ａｌ
Ｉ制限部位を完全なものにするＴＣＧＡＣ配列によって
先行されるＫｐｎＩ部位を３→８位置（第１Ｃ図参照）
にもっている。

Ｋｐｎ　Ｉ制限部位の直前に存在する追加のＣ残基は、
ＩＬ−１αコード領域をｐＵｃ１２のｌａｃ　Ｚα１コ
ード領域と同じフレーム内にもたらす。フラグメン）　
８Ａ／ＢはそのＩＬ−１αのコード領域の、直後であっ
て且つＨｉｎｄｌｌＴ制限部位を完全なものにする配列
の直前に同じフレームでＢｇｌ［制限部位をもっている
（第１Ｃ図参照）。この合成領域はｐＵｃ１２ベクター
中のＰｓｔ　Ｉ制限部位に取って代わるので、非修飾ベ
クターは形質転換に先立って連結生成物をＰｓｔＩで処
理することにより破壊された。

工程３では、合成ｄｓＤＮＡフラグメン）５Ａ／Ｂおよ
び６Ａ／ＢがＸｂａＩ−およびＫｐｎＩ−制限された工
程２の完成りＮＡにクローニングされた（第１Ｂ図参照
）。フラグメン）５Ａ／Ｂは、そのＩＬ−１αのコード
領域の５１末端にあり且つＸｂａＩ−制限ＤＮＡと適合
する配列によって先行されたＭｓｔＩ制限部位、ならび
にＩＬ−１αコード領域をＩａｃＺα１コード領域と同
じフレーム内に維持するための追加の残基を有する。〔
カサダバン（Ｃａ５ａｄａｂａｎ　）およびコーエン（
Ｃｏｈｅｎ　）ｔ　Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、ｖｏｌ、　１３８．　　ｐ、１７
９（１９８０）はいわゆるＩａｃＺＭ１５欠失をもつ大
腸菌株のＦ−エビソーム産生β−ガラクトシダーゼがベ
クターのｌａｃ　Ｚα警によってコードされるβ−ガラ
クトシダーゼのαセグメントによってシストロン間で相
補われることを開示している。フラグメント６Ａ／Ｂは
フラグメント５Ａ／Ｂの突出５１末端に相補的な９残基
突出５１末端、ならびにＫ　ｐｎ　Ｉ−制限ＤＮＡと適
合する突出ＧＴＡＣ３１末端をもっている。この合成り
ＡＮは工程２の完成りＮＡ中のＳａｌ　Ｉ部位に取って
代わるので、連結生成物は非修飾ベクターを除（ために
形質転換に先立ってＳａｌ　Ｉで処理された。

工程４では、合成ｄｓＤＮＡフラグメント３Ａ／Ｂおよ
び４　Ｃ７０（第１Ｂ図参照）がＢａｎ　ＨＩ−および
ＸｂａＩ−制限された工程３の完成りＮＡにクローニン
グされた。フラグメント３Ａ／ＢはそのＩＬ−１αのコ
ード領域の５１末端にあり且つＢａｍＨＩ−制限ＤＮＡ
と適合する５Ｉ突出ＧＡＴＣ配列によって先行されるＣ
１ａ　Ｉ制限部位を有する。そのＣ１ａＩ制限部位の直
前にあるＣ残基は、ＩＬ−１αのリーディングフレーム
を１ａｃＺα１のそれと同じに維持するのに役立つ。フ
ラグメン）　４　Ｃ７０はフラグメン）３Ａ／Ｂの一本
鎖末端と相補的な５１一本領９残基末端をもっている（
第１Ｂ図参照）。フラグメン）４Ｃ／Ｄの下流末端はＸ
ｂａＩ−制限ＤＮＡと適合する突出ＣＴＡＧ５１末端、
ならびにリーディングフレームを維持する非ＩＬ−１α
コード配列の２残基を含む。工程４のクローニングはＸ
ｂａ　Ｉ制限部位を修復しないので、連結生成物は非修
飾ベクターを除くために形質転換に先立ってＸｂａ　Ｉ
で処理された。

工程５では、工程１の完成りＮＡからの２６５ｂｐ　Ｅ
ｃｏ　ＲＩ　−Ｔａｑ　Ｉフラグメント（第１Ａ図参照
）がＥｃｏ　ＲＩ−およびＣ１ａＩ−制限された工程４
の完成りＮＡにクローニングされた。この工程は合成Ｉ
Ｌ−１αＤＮＡの構築を完成させた。

工程６では、工程５の完成りＮＡからの６５６ｂｐ　Ｅ
　ｃｏ　ＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ＩＵフラグメントがＥ　ｃ
ｏ　ＲＩ−およびＨｉｎｄ　１ｆｌ−制限されたベクタ
ーｐＭＴ　１１ｈＣＤ　Ｎ　Ａにクローニングされた。

ベクターはｃｌａＩ。

ＭｓｔＩおよびＫｐｎ　Ｉ部位の唯一性を保つためにＴ
ＡＣ−ＲＢＳからｐＭＴｌｌｈｃに変えられた。異なる
ベクターを選ぶことによりこの工程を排除することがで
きるだろう。ｐＭ　Ｔ　１１　ｈｃはＩＬ−１αのＣ末
端をコードするＧＣＡの１２コドン下流テＩＬ−１αス
ート領域を終わらせる配列をＨｉｎｄｌ［Ｉ制限部位の
下流に有する多コピープラスミドベクターである。工程
６のＤＮＡにおけるＣ末端ＩＬ−１αコード領域の配列
は第２Ｂ図に示す。

工程７では、ＩＬ−１αＭｓｔＩ制限部位における１５
ｂｐの同一フレーム内挿入物（第１Ｂ図参照）が、工程
６の完成りＮＡをＭｓｔＩで制限し、次いで再び連結す
ることにより除かれた。

工程８では、ＴＡＡ翻訳終止コドンが工程７の完成りＮ
ＡをＢｇｌ　ＩＩで制限し、ヤエナリ（ｍｕｎｇｂｅａ
ｎ　）ヌクレアーゼで処理し、再連結することによりＣ
末端ＧＣＡコドンの直後に配置された（第２Ｃ図参照）
。完成された合成ＩＬ−１α遺伝子の配列は第３図に示
す。

ＤＮＡの塩基配列分析によって同定された工程１からの
形質転換体のうちで、２つがそのＮ末端コード領域にお
いてそれぞれ６および１４コドンを欠失していることが
わかった。これらの２つのコード領域を欠＜ＤＮＡ配列
は、予期された工程１のＤＮＡと平行して工程６〜８へ
順次送られた。

第４図はＮ末端配列、ＭｓｔＩ挿入物、および１１コド
ンＣ末端付加物の組合せを表す７種類の異なるＩＬ−１
αコード領域構築物を模式図により示す。

第４Ａ図に示す７種類のＩＬ−１α発現プラスミドは大
腸菌株ＪＭＩＯＩに形質転換された。このような細胞の
タンパク質抽出物はＰＡＧＥ〔レムリ（Ｌａｅｒｙｙｎ
ｌｉ）、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　ｖｏｌ、　　２２’Ｌ
　　ｐ。

６８０（１９７０）を参照〕にかけ、クーマシーブルー
染色で視覚化した。各プラスミドは関係のあるＩＬ−１
αポリペプチドを豊富に合成した。

例えば、本発明者らは濃度計スキャニングによって、α
ＩＬＩ−保有株から合成された総タンパク質の６％がＩ
Ｌ−１αポリペプチドであると見積もった。これらの抽
出物の希釈液はマイトジェン刺激クローン化ネズミリン
パ腫細胞株〔ギリア（Ｇｉｌｌｉａ　　）およびミゼル
（Ｍｉｚｅｌ）の上記文献参照〕からＩＬ−２放出を刺
激するＩＬ−１の能力を測定するＩＡ５変換検定を用い
てＩＬ−１活性について試験した。αＩＬＩ　１５ｃｌ
　１プラスミド保有菌株（このプラスミドは工程７でそ
の他のプラスミドからは切除されたＭｓｔＩフラグメン
トを含んでいた）からの抽出物を除いて、すべてのタン
パク質抽出物が高レベルのＩＬ−１活性（１０４〜１０
６単位／ｍ／）を示し、活性抽出物間のレベルは実験誤
差（２倍）内で同一であった。

工程７の完成りＮＡ中のＣ末端ＩＬ−１ａＧＣＡコドン
の直後にあるＢｇｌ［制限部位は、プラスミドｐＭＣ１
４０３のＩａｃ　Ｚ　：’−ド領域のＮ末端にある唯一
のＢａｍ　ＨＩ制限部位と同じフレーム内にある（カサ
ダバンらの上記文献および第２Ｄ図参照）。工程７の完
成りＮＡからの６５１　ｂｐＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　Ｉ
ＩフラグメントはＥｃｏ　ＲＩ−およびＢａｍ　ＨＩ−
制限ＤＮＡにクローニングした。こｔｔは全ＩＬ−１α
のコード領域をＩａｃ　Ｚの末端コード領域の直前に配
置する。合成遺伝子の構築の間のＩＬ−１とｌａｃ　Ｚ
　ＣＬ’のリーディングフレームの同一性は、ＩＬ−１
α−β−ガラクトンダーゼ融合タンパク質を発現する３
種の別のプラスミドの作製を可能にした。ＴＡＣ−ＲＢ
Ｓベクターからの１７６　ｂｐＥｃｏＲＩ−８ｓｔＩ−
ｔａｃＰ−ＤＮＡフラグメント（第１Ａ図参照）は、そ
れぞれ工程２および３の完成り　Ｎ　Ａ１１５　ｂｐ　
Ｍｓｔ　Ｉ挿入物を欠失した工程４の完成り　Ｎ　Ａか
らのＳｓｔ　Ｉ　−ＢｇｌＩＩフラグメント、ならびに
ＥｃｏＲＩ−およびＢａｍＨＩ−制限ｐＭｃ　１４０３
　ＤＮＡと共に連結させた。

この連結からのプラスミドを、１ｉｌＯ１へ形質転換し
、そしてＸ　　ｇａｌ−およびＩＰＴＧ−含有Ｌ−アン
ピシリンプレート上でβ−ガラクトシダーゼのＮ末端の
ＩＬ−１αの配列を既定量発現するプラスミドを検出し
た。本発明者らが作製した４種のこのようなプラスミド
を第４Ｂ図に示す。これらの４種のプラスミドを保有す
る大腸菌株ＪＭ１０１の抽出物はＰＡＧＥによって分析
し、そしてタンパク質をクーマシーブルー染色により視
覚化した。それぞれの菌株は豊富な量のＩＬ−１α−β
−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を合成した。これら
の抽出物はＩＬ＝Ｉ　　ＩＡ５変換検定において不活性
であった。

本発明の好適な態様および実施例の上記記載は、本発明
の詳細な説明のために、および本発明のよりよき理解の
ために提供された。それらは本発明のすべてを網羅する
ものではなく、また開示された明確な形態に本発明を制
限するものでもない。

明らかに、多くの１６飾および変更が上記の教示に鑑み
て可能であるだろう。特定の実施例は本発明の原理およ
びその実際的な応用を最もよ（説明するために選ばれか
つ詳述されたものであり、それにより当業者は特定用途
に適するようにいろいろな修飾を加えた様々な態様の本
発明を最もよ（利用することができるだろう。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ−Ｃ図は本発明の合成ヒ）ＩＬ−１α遺伝子の作
製において用いられるＤＮＡフラグメントを示し； 第２Ａ−Ｄ図はいろいろな作製工程におけるＣ末端ＩＬ
−１αコード領域を示し； 第３図は完成されて発現された合成ヒ）ＩＬ−１α遺伝
子のＤＮＡ配列を示し； 第４Ａ−Ｂ図は種々の発現されたＩＬ−１α合成遺伝子
およびＩＬ−１α−β−ガラクトシダーゼ遺伝子を示し
；そして 第５図は大腸菌発現ベクターのＴ　Ａ　Ｃ−ＲＢ　Ｓ中
のイニシエーターＡＴＧコドンに隣接したヌクレオチド
配列を示す。 仁（ｊ　　　　　　ｃ（ｊ　　　　　　　ζΦ　　　　
　　Ｃ（５−（−＜　　　　　　、−（、−（ φＱ　　　　ロ（Ｊ　　　　　　ｕｌ（Ｊ　　　　　　
ロＱフ（ｊ　　　　　　　：５　（ｊ　　　　　　　　
：ｌ　（ｊ　　　　　　　　コロΦｌ−（Ｌｌｌ−Φト
　　　　　　　ΦＨ−（Ｊ　　　　　−（Ｊ　　　　　
　−ｕ　　　　　　−（Ｊａｌｕ　　　　　φＱ　　　
　　ΦＱ　　　　　の０・　−＋　　９−ト　　命　　
−←　　噂　　−トく　−ぐ　　ω　−く　　Ｑ　　−
く　　ロ　　−くく　　Ｑ　　　Φ　　　　　　−ご Ｃ←Ｌ＋Ｊ　　　　ＣＪ　　　　　　　＜　　　　　　
　ヒＣＣ！１ｆｆｉ　　　Ｏｔ！ｌｕ　　　　コ＜　　
　　ｌ１ｌＣＪ４１　　Ｌｌ−Ｐ−（Ｌ　（Ｊ ｃ！５ＱｃＬ（Ｊ　　　　宕３　　　”：：’２　　４
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く　　：Ｑ　　−く　　−←

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）細菌にとって好適なコドンから実質的に成るヒト
   ・インターロイキン−１αの遺伝子。
2. （２）細菌にとって好適なコドンは第３図のヌクレオチ
   ド位置１７１〜６５０に示したコドンの配列である、特
   許請求の範囲第１項記載のヒト・インターロイキン−１
   α遺伝子。
3. （３）第３図に示したアミノ酸配列の１５４、１５３、
   １５２、１５１、１５０、１４９、１４８、１４７、１
   ４６、１４５、１４４、１４３、１４２、１４１および
   １４０Ｃ末端アミノ酸から成る配列を有するポリペプチ
   ド群から選ばれる突然変異ヒト・インターロイキン−１
   αのポリペプチド。
4. （４）関連ベクターに関して唯一の制限部位を一組有す
   る合成ヒト・インターロイキン−１αの遺伝子を準備し
   、その唯一の制限部位は複数のセグメントを形成すべく
   合成ヒト・インターロイキン−α１遺伝子に沿って４０
   〜１８０塩基離れて配置されており； １つまたはそれ以上のセグメントを、予め定められたヌ
   クレオチド配列をもつ置換用セグメントで置換して、修
   飾された合成ヒト・インターロイキン−１αの遺伝子を
   形成し； その修飾合成ヒト・インターロイキン−１αの遺伝子を
   含む上記の関連ベクターを宿主内に組み入れ；そして その修飾合成ヒト・インターロイキン−１α遺伝子をヒ
   ト・インターロイキン−１α突然変異タンパク質へ転写
   ・翻訳するのに適した条件下にその宿主を維持する；諸
   工程から成るヒト・インターロイキン−１αの突然変異
   タンパク質の生産方法。
5. （５）一組の唯一の制限部位は２〜５種、好ましくは３
   〜５種の唯一制限部位から成る、特許請求の範囲第４項
   記載の方法。
6. （６）一組の唯一の制限部位はＣｌａ I 部位、Ｍｓｔ
   I 部位およびＫｐｎ I 部位を含み、上記の関連ベクタ
   ーはＭ１３プラスミドである、特許請求の範囲第５項記
   載の方法。
7. （７）修飾された合成ヒト・インターロイキン−α遺伝
   子は細菌にとって好適なコドンから実質的に成る、特許
   請求の範囲第５項記載の方法。