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Die vorliegende Erfindung betrifft einen Plasmid-Vektor zur
Expression im Bazillus und dessen Verwendung zum Klonieren
des Strukturgens, welches das menschliche Wachstumshormon in
Bazillus-Stämme kodiert, ein den Klonierungs-Vektor und das
menschliche Wachstumshormongen enthaltendes Rekombinations-
DNA-Molekül sowie einen durch das Rekombinations-DNA-Molekül
transformierten Mikroorganismus, der zur Expression des
Strukturgens und Herstellung des Wachstumshormons mit hohen
Ausbeuten fähig ist.
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Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung
des menschlichen Wachstumshormons, das das Züchten vom
transformierten Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium
und Gewinnung des so synthetisierten Hormons aus den Zellen
betrifft.
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Das menschliche Wachstumshormon (hGH = human growth hormon)
wird normalerweise gebildet und abgesondert durch den
Hypophysenvorderlappen oder die Adenohypophyse während der
gesamten Lebenszeit des Menschen und in höheren Mengen in der
Zeit vor dem Erwachsensein.
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Das Hormon wird gebildet in der Form eines Vorläufers
(PrehGH) mit der Signal-Sequenz für die Sekretion am Aminoende
und der Sequenz für das hGH-Protein. Während des
Sekretionsvorgangs wird die Signalsequenz im Membranniveau entfernt und
das entwickelte Protein abgesondert.
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Das Wachstumshormon besteht aus 191 Aminosäuren und hat ein
Molekulargewicht von 21500 Dalton.
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Obgleich der Wirkungsmechanismus noch nicht ganz klar ist,
ist bekannt, daß hGH das Skelettwachstum, die Stickstoff-
Retention und Protein-Synthese begünstigt sowie den Lipid-
und Glucid-Metabolismus beeinflußt.
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Eine Reihe von durch einen Hormonmangel bedingten klinischen
Leiden wurden bisher behandelt mit aus der Hypophyse von
Gestorbenen isoliertem menschlichen Wachstumshormon. Indessen
ist die Isolierung und Reinigung des Hormons komplex und
aufwendig.
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Darüber hinaus ist wegen der Knappheit des resultierenden
Hormons die Behandlung mit hGH beschränkt auf die
allerwichtigsten Fälle, so daß ein Bedürfnis nach alternativen
Methoden besteht, die eine gute Ausbeute bei annehmbaren Kosten
ergeben.
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Neuere Entwicklungen auf dem Gebiet der genetischen Technik
erlaubten die Bildung von Hybrid-DNA-Molekülen mit einem
Gehalt an heterologenen Genen und die Herstellung von Proteinen
für die Kodierung der Strukturgene durch Züchten von durch
die Hybridmoleküle transformierten Mikroorganismen.
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Die technische und Patent-Literatur beschreibt eine Anzahl
von Verfahren zur Herstellung des menschlichen
Wachstumshormons durch DNA-Rekombinationsverfahren.
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Die GB-A-2 055 982 betrifft die Expression von
halbsynthetischen Genen, insbesondere vom hGH-Gen, durch Aufbau eines
Plasmid-Hybrid-Vektors und Züchten eines durch den Plasmid-
Hybrid-Vektor transformierten E. coli-Stammes.
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In der EP 20147 werden ein Vektor für das menschliche
Wachstumshormon und ein mit diesem Vektor transformierter E.coli-
Stamm beschrieben und beansprucht. Indessen bilden diese
bekannten Arbeitsweisen hGH unter Verwendung von Vektoren zur
Expression in E.coli ein pathogenes, gramnegatives Bakterium,
das normalerweise im menschlichen oder tierischen
Intestinaltrakt lebt.
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Um die transformierten E.coli-Stämme zu züchten, ist die
Anwendung von überwachten Kultursystemen notwendig, um eine
Kontamination und Infektion zu vermeiden. Dies erhöht die
Produktionskosten.
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Vom industriellen Standpunkt aus wären Bakterien von der
Gattung Bazillus eine den E.coli-Stämmen vorzuziehende
Alternative.
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Der Grund dafür ist, daß die Bazillus-Bakterien nicht
pathogen sind, leicht gezüchtet werden können und lange bei
fermentativen Prozessen verwendbar sind (vgl. Debabow, The
Molecular Biology of the Bacilli, 1, 332 (1982), Dubnau, D.A. ed.
Academic Press).
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Indessen war der Einsatz von Bazillus als Wirtsorganismus bei
der Herstellung von heterologenen Proteinen bisher begrenzt.
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Dies beruht hauptsächlich auf dem Mangel an Vektoren zum
Klonieren der effizienten Expression von heterologenen Genen und
der Größe von deren zu kodierenden Proteinen.
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Nunmehr wurde ein Klonierungs-Vektor gefunden, der in
Bazillus-Zellen stabil gehalten werden kann und mit dem sich daher
die mit den bekannten Arbeitsweisen verbundenen Probleme
verhindern lassen. Insoweit ist also ein Ziel der Erfindung ein
Plasmid-Vektor zur Expression im Bazillus und Verwendung für
das Klonen des das menschliche Wachstumshormon kodierenden
Gens.
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Ein anderes Ziel der Erfindung ist das Molekül einer
rekombinanten DNA zur Expression des menschlichen Wachstumshormons
im Bazillus, das erhalten wird durch Binden des Klonierungs-
Vektors an die das menschliche Wachstumshormon kodierende
Nukleotid-Sequenz.
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Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein
Mikroorganismus von der Gattung Bazillus, der durch das vereinigte
DNA-Molekül transformiert ist und die Expression des
Strukturgens vom menschlichen Wachstumshormon vermitteln kann und
dieses mit hohen Ausbeuten herzustellen vermag.
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Ein noch anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren
zur Herstellung vom menschlichen Wachstumshormon, das das
Züchten der transformierten Mikroorganismen in einem
geeigneten Kulturmedium und die Gewinnung des synthetisierten
Hormons aus den Zellen betrifft.
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Weitere Vorhaben der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut
der Beschreibung und den nachfolgenden Beispielen.
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Gemäß der Erfindung wird der Klonierungs-Vektor gebildet aus
dem in der IT-19960 A/85 beschriebenen Vektor pSM143 (ATCC
53038) durch Ersetzen des 750-Basenpaar (bp)
XbaI-EcoRI-Fragments durch ein synthetisches bp-Fragment mit der folgenden
Sequenz:
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Das 73 bp-Fragment war so aufgebaut, daß es eine Promotor-
Sequenz und eine Ribosom-Erkennungssequenz (RBS) enthielt,
wobei beide Sequenzen durch die RNA-Polymerase und Bazillus-
Ribosome erkannt werden und die effiziente Expression vom
Strukturgen des menschlichen Wachstumshormons aufgrund der
Steuerung der vorgenannten Sequenzen sichergestellt ist.
Insbesondere wird der Plasmid-Vektor pSM 143, dessen
Restriktionsbild in Fig. 1 gezeigt ist, mit den Restriktionsenzymen
EcoRI und XbaI in einer Pufferlösung bei 37ºC während einer
Stunde behandelt.
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Die enzymatische Reaktion wurde dann durch eine Behandlung
der Reaktionsmischung mit Phenol/Chloroform und
Chloroform/Isoamyl gestoppt; die DNA wurde gefällt, abgetrennt und
mit dem synthetischen 73 bp-Fragment verbunden. Die
Verbindung wurde durchgeführt in einer Pufferlösung in Gegenwart
der T4-DNA-Ligase bei einer Temperatur von 14ºC während 6
Stunden. Die gesamte Ligasemischung wurde dann verwendet zum
Transformieren kompetenter E.coli-Zellen; die transformierten
Zellen wurden auf Ampicillin enthaltenden Platten selektiert.
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Unter den resultierenden positiven Klonen (AmpR) wurden die
Klone ausgewählt, die das Plasmid enthielten, in denen das
750 bp-Fragment EcoRI-XbaI durch das 73 bp-Synthesefragment
ersetzt war.
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Das als pSM 208 bezeichnete Plasmid wurde dann verwendet zum
Klonieren des das menschliche Wachstumshormon kodierenden
Strukturgens und Herstellen des kombinierten DNA-Moleküls.
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Das Strukturgen des menschlichen Wachstumshormons kann
entweder so erhalten werden, wie von Maniatis et al. in Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Seite 135, 140, 143 (Cold
Spring Harbor, 1982) beschrieben oder aber durch eine der
gebräuchlichen Syntheseverfahren (Oligonucleotides Synthesis -
Practical Approach Series IRL Press) oder schließlich auf
halbsynthetischem Weg, so wie von Goeddel et al. in Nature,
281, Seite 544 (1979), beschrieben.
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Wenn auch die Herstellungsmethode des Gens die Erfindung
nicht einschränkt, so wird doch hier das Strukturgen des hGH
gemäß der halbsynthetischen Arbeitsweise gewonnen.
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Insbesondere wird die gesamte RNA aus menschlichem
Hypophysengewebe gewonnen und danach die mRNA (RNA-polyadenylat)
durch Affinitäts-Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose von
der Gesamt-RNA getrennt (Edmonds et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 68, Seite 1336 (1971)). Die resultierende mRNA wird
dann verwendet zur Synthese von cDNA, so wie es von Maniatis
et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S. 217, Cold
Spring Harbor, 1982) beschrieben wurde.
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Die erhaltenen Hypophysen-cDNA-Moleküle werden alsdann an
synthetische HindIII-Linker (Biolabs) gebunden und bei der
HindIII-Restriktionsstelle vom Plasmid pBR 322 eingebaut. Die
resultierenden Plasmid-Hybride (pBR 322-cDNA) werden
verwendet zum Transformieren der für die Resistenz gegen Ampicillin
ausgewählten E. coli-Zellen.
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Die positiven Kolonien werden mittels der
Hybridisierungstechnik analysiert und zwar unter Verwendung einer DNA-Probe,
die komplementär mit einer Region der Nucleotid-Sequenz vom
hGH-Gen ist, wodurch die Klone, in denen der Plasmid-Hybrid
mit pBR 322 und cDNA vom hGH-Gen enthalten ist, festgestellt
werden. Die cDNA vom hGH wird aus einem von diesen Plasmiden
isoliert und in das Plasmid pUC9 (Boehringer) subkloniert
unter Erhalt des Plasmids pWHA 41 (Fig. 2).
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Als nächstes wird ein HindIII-Linker in das Plasmid pWHA 41
an dem das hGH kodierenden Ende der cDNA eingefügt. Das
Plasmid
pWHA 41 wird mittels des SmaI-Restriktionsenzyms
geschnitten, gefällt und von der Reaktionsmischung abgetrennt.
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Das erhaltene DNA-Plasmid wird danach an den synthetischen
HindIII d(GAAGCTTC)-Linker in einer Pufferlösung in Gegenwart
der T4 DNA-Ligase bei einer Temperatur von 23ºC während etwa
14 Stunden gebunden. Die enzymatische Reaktion wurde alsdann
gestoppt durch Extraktion der Reaktionsmischung mit einer
Lösung von Phenol/Chloroform und Chloroform/Isoamyl.
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Die Plasmid-DNA wird gefällt, abgetrennt und mit dem HindIII-
Enzym in einer Pufferlösung digestiert.
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Die Reaktion wird durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und
Chloroform/Isoamyl abgebrochen und die DNA ausgefällt.
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Das Präzipitat wurde in einer Pufferlösung in Gegenwart der
T4 DNA-Ligase wieder aufgenommen; nach 14 Stunden bei 14ºC
wird die gesamte Ligasemischung verwendet zum Transformieren
kompetenter E. coli JM 101 (BRL-Zellen. Positive Kolonien
(Amp®) werden aus den erhaltenen Rekombinationsprodukten
durch Selektion auf Ampicillin enthaltenden Platten isoliert,
die Plasmid-DNA wird daraus extrahiert und analysiert.
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Es wurde gefunden, daß die DNA aus den vorstehend erwähnten
Kolonien die HindIII-Restriktionsstelle bei der Position von
der SmaI-Stelle enthielten.
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Die enzymatische Digestion von dem Plasmid führte zu zwei
Fragmenten, von denen eines etwa 680 Basenpaare enthielt und
dem Strukturgen vom hGH entsprach. Einer der positiven Klone
wurde als JM101 (pSM209) bezeichnet und die daraus
abgetrennte Plasmid-DNA (pSM209) wurde zum Abtrennen des hGH-Gens
von der Aminosäure 17 bis zur Aminosäure 191 verwendet.
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Das Plasmid pSM209 wurde geschnitten mittels
FnuDII-Restriktionsenzymen, welche die DNA im Bereich zwischen Aminosäure
16 und 17 trennen, und mittels HindIII-Enzym, welches abwärts
von dem Stopcodon trennt (Fig. 2).
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Die Digestionsreaktion wurde gemäß bekannten Arbeitsweisen
durchgeführt: Das 530 bp DNA-Fragment FnudII-HindIII mit der
kodierenden Sequenz der hGH-17 bis 191 wurde aus der
Reaktionsmischung durch Elektrophorese an Acrylamidgel getrennt
und eluiert gemäß der Methode von Maxam& Gilbert (Methods in
Enzymology, 65, Seite 499-560 (1980)).
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Die vollständige Sequenz des menschlichen Wachstumshormon-Gen
wurde danach gebildet durch Verbinden des 530 bp-Fragments an
eine 47 bp-Sequenz, die die ersten 16 Aminosäuren des hGH
kodiert und bei der Rekonstruktion an der
FnuDII-Restriktionsstelle resultieren kann. Das 47 bp-Synthese Fragment,
dessen Sequenz wie folgt ist:
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wurde vor dem Verbinden mit dem 530 bp-Fragment FnuDII-
HindIII phosphoryliert.
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Die in der Gegenwart der T4 DNA-Ligase durchgeführte
Ligasereaktion wurde abgebrochen durch Phenol/Chloroform und
Chloroform/Isoamyl und die DNA nach der Fällung mit dem HindIII-
Enzym behandelt.
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Die gesamte Digestionsmischung wurde dann an Acrylamidgel bei
130 V während 3 Stunden plaziert und ein etwa 580 bp-Strang
mit dem linearen Molekül aus dem linearen FnuDII-HindIII
(530 bp) und dem synthetischen 47 bp-Fragment elektroeluiert.
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Die 47 bp-Sequenz kann an das FnuDII-HindIII (530
bp)-Fragment in zwei Orientierungen gebunden werden. Nur eine davon
führt zur Bildung der FnuDII-Restriktionsstelle und
demzufolge
zum kompletten Strukturgen vom menschlichen
Wachstumshormon.
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Das 580 bp-Fragment wird erfindungsgemäß kloniert mit dem
Plasmid pUC8, welches zuvor mit den HindIII- und EcoRI-
Restriktionsenzymen behandelt und an ein synthetisches
Fragment gebunden wurde, das an seinem 3'-Ende das für Methionin
kodierende Triplett enthielt; die Sequenz desselben ist:
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Dieses synthetische Fragment kann - aufgrund der Anwesenheit
des vorgenannten Plasmids in der komplementären Sequenz an
dem 5'-Ende - nur an das EcoRI-Ende vom pUC8 gebunden werden.
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Die Ligase-Reaktion zwischen dem Plasmid pUC8 und dem 580 bp-
Fragment wird durchgeführt in Gegenwart der T4 DNA-Ligase bei
einer Temperatur von 14ºC während 6 Stunden.
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Nach der Inaktivierung des Enzyms wird die Ligase-Mischung
verwendet zum Transformieren kompetenter Zellen von E.coli
JM101; die transformierenden Substanzen werden für die
Ampicillin-Resistenz selektiert.
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Die Plasmid-DNA wurde aus den positiven Klonen extrahiert,
mit EcoRI- und HindIII-Enzymen digestiert und an Agarosegel
bei 100 V während 2 Stunden analysiert.
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Es wurden Plasmid-Hybride gefunden, die ein 590 bp-Fragment
aus der Gesamtsequenz vom Strukturgen des hGH und der
Methionin-Sequenz enthielt. Die genaue Lage der 47 bp-Sequenz in
Bezug auf das 530 bp-Fragment wurde gemäß der nachfolgenden
Methode geprüft.
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Die wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmid-Hybride
werden mit FnuDII-Enzym bei 37ºC während einer Stunde
behandelt; nach der Inaktivierung des Enzyms wird die
Digestionsmischung an Acrylamidgel bei 110 V während 3 Stunden
überprüft. Es wurde gefunden, daß eines dieser Plasmide, als pSM
210 bezeichnet, von dem Enzym FnuDII innerhalb des
Strukturgens vom hGH geschnitten wurde, was auf die genaue
Orientierung der 47 bp-Sequenz bezüglich des 530 bp-Fragments
hinweist.
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Erfindungsgemäß wird das Molekül der kombinierten DNA
aufgebaut durch Verbinden von dem zuvor durch Restriktionsenzyme
geschnittenen Plasmid-Vektor pSM208 mit dem aus pSM210
isolierten EcoRI-HindIII-Fragment von etwa 590 bp.
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Das Plasmid pSM208 wird vorzugsweise nacheinander geschnitten
mit HindIII und EcoRI in einer Pufferlösung bei 37ºC.
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Die Enzymreaktion wird abgebrochen und die DNA mit Ethanol
gefällt und aus der Reaktionsmischung entfernt.
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Die DNA wird dann an das aus pSM210 isolierte EcoRI-HindIII-
Fragment in Gegenwart von T4 DNA-Ligase gebunden und die
gesamte Ligasemischung verwendet zur Transformierung
kompetenter Bazillus-Zellen.
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Als Beispiele für aus der Gattung Bazillus als
Wirtsmikroorganismen in Frage kommende Bakterien werden genannt: B.
subtilis, B. amyloliquefaciens, B. cereus und B. licheniformis.
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Von diesen wird Bazillus subtilis (B. subtilis) besonders
bevorzugt.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher Gebrauch gemacht
von in unserem Laboratorium isolierten Zellen von B. subtilis
SMS108 (NRRLB 15998) (his, leu, met, recE4,npr&supmin;). Die B.
subtilis-Zellen
wurden kompetent gemacht entsprechend der durch
Contente und Dubnau beschriebenen Methode (Mol. Gen. Genet.,
167,251-258 (1979)); die transformierenden Substanzen wurden
ausgewählt für die Resistenz gegen Kanamycin. Die positiven
Klone wurden alsdann untersucht mittels der Methode der
schnellen Extraktion der Plasmid-DNA, wobei gefunden wurde,
daß einer davon das Plasmid-Hybrid pSM212, gebildet aus
pSM208 und dem 590 bp-Fragment mit dem Strukturgen vom hGH,
enthielt. Der Mikroorganismus B. subtilis SMS 108 (pSM212)
wurde bei dem American Type Culture Collection Centre am
18.4.1986 hinterlegt (ATCC 67 097).
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Gemäß der Erfindung wurde der Stamm B. subtilis (pSM212) in
einem flüssigen Medium gezüchtet und nach der Lysis der
Zellen die Anwesenheit eines Proteins in den lysierten Zellen
festgestellt, das mit dem menschlichen
Wachstumshormon-Protein korrespondiert.
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Der transformierte Bakterienstamm wird insbesondere in einem
mit Kanamycin gemischten VY-Medium (DIFCO) bei einer
Temperatur von 30 bis 40ºC während etwa 20 Stunden gezüchtet.
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Am Ende von dieser Zeit wird die Zell-Suspension
zentrifugiert; die Zellen werden gewonnen, mit einer Pufferlösung
gewaschen und abschließend in bekannter Weise lysiert.
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Die Anwesenheit des Wachstumshormons in den lysierten Zellen
wurde entweder bestimmt durch Elektroblotten (Towbin et al.
PNAS, 1979, 76, 4350-4354) oder durch Anfärben mit "Coomassie
Blue" ("Gel electrophoresis of Proteins: A practical
Approach", ed. B.D.Homes und D. Rickwod-IRL Press Limited).
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Die Ergebnisse belegen in den lysierten Zellen die
Anwesenheit von einem Protein, das ein Molekulargewicht von 21500
aufweist, mit dem natürlichen hGH übereinstimmt und etwa 15
bis 20% der insgesamt anwesenden Proteine ausmacht. Auch
reagierte - wie sich durch Analyse mittels Immunoblotten
ergab
- das Protein in spezifischer Weise mit
anti-hGH-Antikörpern.
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Die Menge an hGH-Hormon, das mit dem Stamm B. subtilis SMS108
(pSM212) durch Züchtung in einem Erlenmeyer-Kolben erhalten
wurde, betrug etwa 200 mg/ml pro 6 g/l der Zellmasse.
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Bei einer Fermentations-Züchtung wurden hGH-Mengen oberhalb
2 g/l erhalten.
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In den Zeichnungen zeigen:
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Fig. 1 Restriktionskarten von pS143, pSM208 und pSM212;
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Fig. 2 ein Schaubild zum Aufzeigen der für die Bildung der
Plasmide pSM209, pSM210 und pSM212 erforderlichen
Transitionen;
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Fig. 3 die Trennung der aus den Zellen von B. subtilis
extrahierten Gesamtproteine an SDS-Acrylamidgel,
wobei bedeuten: A = SMS 108, B = SMS 108 (pSM212),
c = natürliches hGH und D =
Standard-Molekulargewichte;
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Fig. 4 das Immunoblotten, wobei bedeuten: A = SMS 108, B =
SMS 108 (pSM212), c = natürliches hGH, D =
Standard-Molekulargewichte.
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Die nachfolgenden Versuchsbeispiele erläutern die Erfindung,
ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
Bildung vom Plasmid-Vektor pSM208
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1 ug vom Plasmid psM 143 wird mit einer Einheit an EcoRI und
XbaI (Boehringer)-Restriktionsenzymen in 20 ul einer
Pufferlösung, die 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM NaCl und
10 mM MgCl&sub2; enthält, bei 37ºC während einer Stunde
digestiert. Die Enzymreaktion wird unterbrochen durch
Extraktion der Reaktionsmischung mit Phenol/Chloroform (1 : 1,
V/V) und Chloroform/Isoamyl (24/1, V/V); die DNA wird gefällt
durch Zugabe von Natriumacetat in einer Endkonzentration von
0,3 M und 2,5 Volumen Ethanol. Das Präzipitat wird durch
Zentrifugieren abgetrennt, wieder aufgenommen, in 20 ul eines
Puffers mit einem Gehalt an 66 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, lmM
ATP, 10 mM MgCl&sub2; und 15 mM DTT und an 0,2 ug des
nachfolgenden synthetischen Fragments
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in Gegenwart von 1 Einheit der T4 DNA-Ligase während 6
Stunden bei 14ºC gebunden. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf
70ºC während 10 Minuten inaktiviert und verwendet zum
Transformieren von E.coli JM101 (BRL)-Zellen, die gemäß dem
Verfahren von Messing, Methods in Enzymology, Vol. 101, 20-78
(1983) kompetent gemacht wurden.
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Die transformierten Zellen wurden zur Ampicillin-Resistenz
selektiert auf Lb (DIFCO)-Platten mit einem Gehalt an
50 ug/ml an Ampicillin.
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Das Plasmid pSM 208, das aus einer der ampicillin-resistenten
(AmpR) Kolonien isoliert wurde, wies die in Fig. 1 gezeigte
Karte auf, wobei das EcoRI-XbaI-Fragment vom pSM 43 ersetzt
worden war durch das 73 bp-Synthesefragment.
Beispiel 2
Insertion von HindIII in das Plasmid WHA41
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0,4 ug des Plasmids pwHA41 werden durch eine Einheit von SmaI
(Boehringer) während einer Stunde bei 25ºC in einem Puffer
geschnitten, der 15 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 15 mM KCl,
6 mM MgCl&sub2; und 6 mM Mercaptoethanol enthielt. Die Reaktion
wurde abgebrochen durch Zugabe von EDTA (pH-Wert 8) bis zu
einer Endkonzentration von 20 mM und Extraktion mit
Phenol/Chloroform (1 : 1; (V,V)) und Chloroform/Isoamyl (24 : 1
(V/V)). Die DNA wird gefällt durch Zugabe von Natriumacetat
zu der Reaktionsmischung bis zu einer Endkonzentration von
0,3 M und 2,5 Volumen an Ethanol bei einer Temperatur von
-80ºC während 15 Minuten. Nach dem Zentrifugieren in einer
Eppendorf-Zentrifuge, Modell 5450, wird das Präzipitat
abgetrennt, im Vakuum getrocknet und wiederaufgenommen in einem
Puffer, der 66 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 1 mM ATP, 1 mM
Spermidin, 10 mM MgCl&sub2;, 15 mM Dithiotreith (DTT) und 0,2 mg/ml an
Kälberserumalbumin (BSA) enthielt.
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1 ug vom HindIII d(GAAGCTTC) (Boehringer)-Linker werden
phosphoryliert in 10 ul eines Puffers, der 66 mM Tris-HCl (pH-
Wert 7,6), 1 mM ATP, 1 mM Spermidin, 10 mM MgCl&sub2;, 15 mM DTT,
0,2 mg/ml BSA und 2 Einheiten an T4 DNA-Kinase (Biolaps)
enthielt, und inkubiert während 1 Stunde bei 37ºC. Die
Reaktionsmischung wurde alsdann zu 10 ul von derselben Lösung mit
dem Gehalt an der mit SmaI geschnittenen pWHA41 zugegeben und
in Gegenwart von einer Einheit an T4 DNA-Ligase während 14
Stunden bei 23ºC inkubiert. Die Reaktion wurde beendet durch
Zugabe von 1 ul an einer 0,5 M EDTA enthaltenden Lösung (pH-
Wert 8); danach wurde einmal mit Phenol/Chloroform und einmal
mit Chloroform/Isoamyl extrahiert und mit 2,5 Volumen an
Ethanol nach der Zugabe von Natriumacetat zu der Lösung bis
zu einer Endkonzentration von 0,3 M gefällt. Die Lösung wurde
während 15 Minuten bei 80ºC belassen und während 15 Minuten
zentrifugiert. Die auf diese Weise abgetrennte DNA wurde
wiederaufgenommen in 100 ul eines Puffers, der 50 mM Tris-HCl
(pH-Wert 8), 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 20 Einheiten an
HindIII (Boehringer)-Enzym enthielt, und während 2 1/2
Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde abgebrochen
durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und Chloroform/Isoamyl
und die DNA durch Zugabe von 2,5 Volumen an Ethanol im
Anschluß an die Zugabe von Natriumacetat zur Lösung bis zu
einer Endkonzentration von 3 M gefällt. Nach dem
Zentrifugieren wurde die DNA wieder aufgenommen in 50 ul einer Lösung,
die 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8), 1 mM EDTA und 100 mM NaCl
enthielt, und an eine Sephadex G 50 ( 2ml-Kolonne nach
Herstellung des Gleichgewichts zu demselben Puffer, plaziert.
Die eluierte DNA wurde - wie weiter oben beschrieben -
gefällt in 20 ul eines Puffers, der 50 mM Tris-HCl (PH-Wert
7,6) 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 MM ATF und 1 Einheit an T4
DNA-Ligase (Boehringer) enthielt, wiederaufgenommen und
während 14 Stunden bei 14ºC inkubiert. Die Reaktion wurde
inaktiviert durch Erhitzen auf 70ºC während 10 Minuten und
verwendet (1 ng an DNA) zum Transformieren von 0,3 ml an
kompetenten Zellen von E. coli JM101 (BRL). 12 weiße Amp®-Kolonien
wurden aus den Rekombinations-Substanzen isoliert, die durch
Selektion auf LB (DIFCO)-Platten bei einem Gehalt von
50 ug/ml an Ampicillin erhalten wurden.
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Die 12 Kolonien wurden geprüft durch rasche Extraktion der
Plasmid-DNA nach der Methode von Rodriguez und Tait (in
"Recombinant DNA Techniques: An Introduction", Seiten 50/51,
Addison-Wesley Publishing Company). 1/20 der erhaltenen DNA
wurde mit einer Einheit an HindTII-Restriktionsenzym in 10 ul
der zuvor beschriebenen Reaktionsmischung geschnitten und
während 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach dem Inaktivieren
des Enzyms bei 70ºC während 10 Minuten wurde die DNA an
0,8% Agarosegel plaziert und 100 V während 2 Stunden
unterworfen. Alle 12 Kolonien enthielten die
HindIII-Restriktionsstelle an der Position von der SmaI-Stelle. Wie erwartet,
führte die Digestion der DNA zu zwei Fragmenten, von denen
eine etwa 690 Basenpaare enthielt und dem hGH-Gen entsprach.
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Einer der Klone, als JM101 (pSM209) bezeichnet, wurde für
weitere Analysezwecke herangezogen; die daraus isolierte
Plasmid-DNA, bezeichnet als pSM209, wurde nach der von
Maniatis et al. beschriebenen Arbeitsweise (vgl. Molecular
Cloning, A Laboratory Manual - Cold Spring Harbor (1982))
extrahiert.
Beispiel 3
Isolierung des menschlichen hGH-Strukturgens
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Die DNA-Sequenz, die das Wachstumshormon von der Aminosäure
17 bis zur Aminosäure 191 kodiert, wurde aus dem Plasmid psM
209 durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym FnuDII
(welches die DNA zwischen Aminosäure 16 und 17 schneidet) und
dem Enzym HindIII (welches abwärts von dem Stopcodon
schneidet), isoliert (vgl. Fig. 2).
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Danach werden 50 ug vom Plasmid pSM209 mit 50 Einheiten
FnuDII (Biolabs) in 200 ul der Reaktionsmischung mit einem
Gehalt an 6 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 6 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;
und 6 mM β-Mercaptoethanol während 1 Stunde bei 37ºC
geschnitten. Nach der Inaktivierung der Reaktion bei 70ºC
während 10 Minuten wird die Lösung auf eine Konzentration von
50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8), 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl
gebracht und während einer weiteren Stunde bei 37ºC in
Gegenwart von 50 Einheiten an HindIII (Boehringer) inkubiert. Die
Reaktion wird gestoppt durch Extraktion mit Phenol/Chloroform
und Chloroform/Isoamyl; nach der Zugabe von Natriumacetat auf
eine Endkonzentration von 0,3 M wird die DNA mit 2,5 Volumen
Ethanol ausgefällt. Nach der Inkubation bei -80ºC während 15
Minuten und einem Zentrifugieren in einer
Eppendorf-Zentrifuge wird das Präzipitat wieder aufgenommen in 50 ul von TE
(10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8) und 1 mM EDTA) und an
Acrylamidgel plaziert. ,Nach dem Separieren der DNA durch Anlegung
einer Spannung von 110 V während 3 Stunden wurde das etwa
530 bp-Band eluiert entsprechend der von Maxam und Gilbert
beschriebenen Methode (Vgl. Methods in Enzymology, Vol. 65,
Seiten 499-540, 1980). Der Strang enthielt das Fragment, das
die das hGH von den Aminosäuren 17 bis 191 kodierende Sequenz
aufweist.
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Die vollständige Sequenz des menschlichen Wachstumshormons
wurde dann aufgebaut unter Verwendung eines synthetischen
47 bp-Fragments, das die ersten 16 Aminosäuren vom hGH
kodiert und die FnuDII-Seite bilden kann, die Sequenz ist:
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Die beiden komplementären 47-Basen DNA-Stränge werden
synthetisiert unter Verwendung eines "DNA Synthesizer System One"
von Beckman.
-
1,25 ug des synthetisierten 47 bp-Fragments werden in 20 ul
eines Puffers, der 66 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 1 mM ATP,
1 mM Spermidin, 10 mM MgCl&sub2;, 15 mM DTT, 0,2 mg/ml BSA und 2
Einheiten an T4 DNA-Kinase (Biolabs) enthielt, während einer
Stunde bei 37ºC phosphoryliert. Das synthetische Fragment
wurde dann an 3 ug des vorher aus pSM209 isolierten 530 bp-
Fragments DNA FnuDII-HindIII in 250 ul von dem bei der
Kinasereaktion verwendeten Puffer in Gegenwart von 5
Einheiten an T4 DNA-Ligase(Boehringer) gebunden. Die Reaktion
erfolgte bei 14ºC während 14 Stunden; das Enzym wurde
inaktiviert durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und
Chloroform/Isoamyl. Die DNA wurde aus der wäßrigen Phase nach
Zugabe von Natriumacetat und Ethanol in der schon
beschriebenen Weise gefällt.
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Das Präzipitat wurde in 50 ul eines Puffers, der 50 mM Tris
HCl (pH-Wert 8), 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl enthielt, wieder
aufgenommen und mit 5 Einheiten vom HindIII-Enzym während 30
Minuten bei 37ºC digestiert. Die Reaktion wurde durch
Erhitzen auf 70ºC während 10 Minuten inaktiviert und dann auf 6%
Acrylamidgel gebracht. Nach der elektrophoretischen
Behandlung
(130 V während 3 Stunden) wurde ein Strang mit etwa 580
Basenpaaren isoliert und eluiert, welcher das lineare Molekül
mit dem FnuDII-HindIII-Fragment und dem synthetischen 47 bp-
Fragment umfaßte. Dieses Molekül, in einer der zwei möglichen
Orientierungen für die Bindung des synthetischen Fragments an
das FnuDII-HindIII-Fragment, bildet das gesamte Strukturgen
vom menschlichen Wachstumshormon und wurde in E.coli-Plasmid
pUC8(BRL) geklont.
Beispiel 4
Klonen des Strukturgens vom Wachstumshormon in pUC8
-
2,5 ug vom Plasmid pUC8 werden mit 2,5 Einheiten HindIII
während 30 Minuten bei 37 ºC in einer Lösung digestiert, die
50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8), 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl
enthielt. Die Enzymreaktion wurde inaktiviert und danach
während weiterer 30 Minuten bei 37ºC mit 2,5 Einheiten EcoRI
nach Zugabe von Tris-HCl (pH-Wert 8) bis zu einer
Endkonzentration von 100 mM inkubiert.
-
Die Inaktivierung erfolgte mit Phenol/Chloroform; die
gefällte und danach abgetrennte DNA wurde wieder aufgenommen in
50 ul eines Puffers, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8), 1 mM
EDTA und 1 mM Natriumperchlorat enthielt, alsdann wieder
gefällt durch Zugabe von 25 ul Isopropanol. Das in dieser Weise
behandelte pUC8 wurde danach an das synthetische Fragment mit
der folgenden Sequenz:
-
gebunden.
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Dieses Fragment, das mittels eines Beckman'schen
DNA-Synthesizers synthetisiert wurde, kann nur am EcoRI-Ende von pUC8
gebunden werden, und zwar aufgrund der Anwesenheit der
komplementären Sequenz an deren 5'-Ende.
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0,185 ug von dem synthetischen Fragment werden an 2,5 ug
vom - wie zuvor beschrieben - mit EcoRI und HindIII behandeltem
pUC8 in 125 ul einer Reaktionsmischung, die 66 mM Tris-HCl
(pH-Wert 7,6), 1 mM ATP, 1 mM Spermidin, 10 mM MgCl&sub2;, 15 mM
DTT, 0,2 mg/ml BSA und 1 Einheit an T4 DNA-Ligase enthielt,
gebunden und während 6 Stunden bei 14ºC inkubiert. Die bei
70ºC während 10 Minuten inaktivierte Reaktionsmischung wurde
mit 2 Einheiten an Kinase vermischt und danach während einer
weiteren Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde
abgebrochen durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und
Chloroform/Isoamyl; nach der Zugabe von 1/5 Volumen an 5 M NaClO&sub4;
wurde die DNA mit 0,5 Volumen Isopropanol gefällt. Im
Anschluß an ein Zentrifugieren wurde das Präzipitat wieder
aufgenommen in 25 ul eines Puffers, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert
8), 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl enthielt, und mit 5 Einheiten
an HindIII während 1 Stunde bei 37ºC behandelt. Die Reaktion
wurde abgebrochen durch eine Extraktion mit Phenol/Chloroform
und Chloroform/Isoamyl und die DNA mit Natriumacetat und
Ethanol ausgefällt. 1 ug des linearen Moleküls vom E.coli-
Plasmid pUC8, in das das synthetische Fragment, wie zuvor
beschrieben, eingefügt worden war, wurden an 0,8 ug des
linearen, das gesamte hGH-Strukturgen bildenden Moleküls
gebunden, und zwar in 50 ul eines Puffers, der 66 mM Tris-HCl (pH-
Wert 7,6), 1 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2;, 15 mM DTT und 1 Einheit an
T4 DNA-Ligase enthielt, während 6 Stunden bei 14ºC. Nach
der Inaktivierung des Enzyms wurde die Reaktionsmischung
verwendet zum Transformieren kompetenter E. coli-JM101-Zellen.
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Von den durch Selektion auf Platten mit einem Gehalt an
Ampicillin (50 ug/ml) erhaltenen Transformersubstanzen wurden 12
weiße Kolonie (Amp®) durch rasche Extraktion der Plasmid-DNA
untersucht. 1/20 der resultierenden DNA wurden mit 1 Einheit
EcoRI und 1 Einheit HindIII in 20 ul eines Puffers, der 50 mM
Tris-HCl (pH-Wert 8), 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl enthielt,
während 30 Minuten bei 37ºC digestiert. Die DNA wurde an
0,8% Agarosegel plaziert und durch Anwendung einer
Potentialdifferenz von 100 V während 2 Stunden separiert. Die
Plasmid-DNA aus den 12 Kolonien ergab den Gehalt an dem 590
bp-Fragment, welches das 530 bp-Fragment, die synthetische
Sequenz mit 47 Nucleotiden und die ebenfalls synthetische
Sequenz mit dem Metheonin kodierenden Triplett umfaßt.
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Um die genaue Lage der 47 bp-Sequenz in Bezug auf das 530 bp-
Fragment zu prüfen, wurden 0,2 ug der Plasmid-DNA mit 1
Einheit FnuDII-Enzym in 20 ul eines Puffers, der 50 mM Tris-HCl
(pH-Wert 8), 10 mM MgCl&sub2;und 50 mM NaCl enthielt, bei 37ºC
während einer Stunde geschnitten. Nach der Inaktivierung des
Enzyms wurde die DNA auf 6% Acrylamidgel gebracht und
während drei Stunden bei 110 V behandelt. Fünf von den 12
Plasmiden wurden mit FnuDII-Enzym innerhalb vom hGH-Strukturgen
geschnitten, wodurch die exakte Orientierung vom 47
bp-Fragment gegenüber dem 530 bp-Fragment gezeigt ist. Eines dieser
Plasmide wurde als pSM210 bezeichnet.
Beispiel 5
Klonen des hGH in pSM208
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2 ug vom Plasmid 208 werden mit 2 Einheiten HindIII während
30 Minuten bei 37ºC in einer Lösung behandelt, die 50 mM
Tris-HCl (pH-Wert 8), 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl enthielt.
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Die Reaktionsmischung wurde inaktiviert und danach während
weiteren 30 Minuten bei 37ºC mit 2 Einheiten EcoRI nach
Zugabe von Tris-HCl (pH-Wert 8) bis zur Endkonzentration von
100 mM inkubiert. Die Reaktion wurde beendet durch Extraktion
mit Phenol/Chloroform und Chloroform/Isoamyl und danach die
DNA mit Ethanol gefällt.
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3 ug vom Plasmid pSM 210 werden mit den HindIII- und EcoRI-
Restriktionsenzymen - wie beim Plasmid 208 beschrieben -
behandelt (digestiert).
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Nach der Fällung mit Ethanol wird die DNA wieder aufgenommen
in 20 ul TE und an 6% Acrylamidgel plaziert. Im Anschluß an
die elektrophoretische Behandlung (130 V während 3 Stunden)
wurde der etwa 590 bp-Strang mit dem Gehalt an dem gesamten
Strukturgen vom hGH isoliert und eluiert. 0,5 ug vom
Strukturgen des hGH werden an 2 ug vom mit EcoRI-HindIII
behandelten Plasmid pSM 208 gebunden in 20 ul einer
Reaktionsmischung, die 66 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6) 1 mM ATP, 10 mM
Mgcl&sub2;, 15 mM DTT und 1 Einheit T4 DNA-Ligase enthielt, und
zwar während 14 Stunden bei 14ºC 1 ug der Mischung wurde
dann zur Umformung von Zellen von B. subtilis SMS108
verwendet, die wie von Contente und Dubnau in Mol. Gen. Genet.,
167, 251-258 (1979) beschrieben, kompetent gemacht worden
waren.
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Der Stamm SMS108, der in unseren Laboratorien gebildet wurde,
ist bei dem Northern Regional Research Centre (Peoria,
Illinois), unter NRRL B-15898 hinterlegt worden.
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Die transformierten Zellen wurden auf VY-Platten mit einem
Gehalt an 5 ug/ml Kanamycin selektiert.
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12 positive, gegen Kanamycin resistente Kolonien wurden
untersucht durch eine rasche Extraktion der Plasmid-DNA. Eine
der Kolonie mit dem Gehalt an dem Plasmid-Hybrid mit dem das
Strukturgen vom hGH (pSM 212) tragenden Fragment wurde als
SMS108 (psM212) bezeichnet.
Beispiel 6
Expression vom hGH in Bazillus subtilis SMS108 (pSM212)
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Um die Expression von dem hGH-Gen in dem SMS108 (pSM212)-
Stamm von B. subtilis zu prüfen, wurde der Stamm in einem
flüssigen Medium gezüchtet; nach der Zell-Lysierung wurde die
Anwesenheit eines dem kompletten Wachstumshormon
entsprechenden Proteins durch Immunoblotten gefunden (vgl. Towbin et
al., PNAS, 1979, Vol. 76, Nr. 9, Seiten 4350-4354).
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Eine Kultur von SMS108 (SM212) wurde bei 37ºC während 20
Stunden in einem VY-Medium (25 g/l "DIFCO veal infusion
broth", 5 g/l "DIFCO yeast extract") mit einem Gehalt an
Kanamycin in einer Konzentration von 5 ug/l gezüchtet.
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10 ml der Kultur wurden in einer Sorvall-Zentrifuge bei 5000
Umdrehungen pro Minute während 10 Minuten zentrifugiert; die
Zellen wurden zweimal gewaschen mit einem Puffer, der 10 mM
Tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 50 mM NaCl enthielt, und danach
wieder aufgenommen in 10 ml von einer Lösung mit einem Gehalt
an 8 M Harnstoff, 1% SDS, 1% β-Mercaptoethanol und 62,5 mM
Tris-HCl (pH-Wert 6,8). Die Zellen wurden lysiert unter
Verwendung einer "French Pressure Cell" (AMINCO) bei 2480 bar
(36000 psi).
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20 ul vom Lysat wurden an 12,5% Polyacrylamid STS-Gel
(Laenmli, Nature, 1970, Vol. 277, 680) gelegt; nach der
elektrophoretischen Behandlung bei 25 mA während drei Stunden
wurden die Proteine entweder bestimmt mit "Coomassie Blue"
(vgl. Gel electrophoresis of proteins: A practical approach",
ed. von B.D.Hames und D. Rickwod, IRL Press Limited) oder
nach Towbin durch Transfer auf Nitrocellulosefilter
(Schleicher& Schull, 45 um Porengröße).
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Die Anwesenheit von hGH wurde durch die Behandlung der Filter
gemäß der von Towbin beschriebenen Methode unter Verwendung
von Kaninchen-anti-hGH-Antikörpern (Miles) und
Kaninchenanti-IgG-Ziegen-Antikörpern konjugiert mit Peroxydase (Miles)
nachgewiesen.
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Die Färbung mit "Coomassie Blue" ergab ein Protein mit einem
Molekulargewicht von 21500, das mit dem natürliche
hGH-Standard (Calbiochem) übereinstimmte und etwa 15 bis 20% von den
Gesamtproteinen ausmachte (Fig. 3).
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Das Protein reagierte in spezifischer Weise mit den anti-hGH-
Antikörpern, wie durch die Immunoelektroblott-Analyse
demonstriert wird (vgl. Fig. 4). Die Menge an aus dem B. Subtilis
SMS(pSM212)-Stamm gewonnenem hGH wird mit etwa 200 mg/l im
Falle der Fermentation in einem Erlenmeyer-Kolben unter
Laboratoriumsbedingungen (6 g des Zellbreis je Liter der Kultur)
veranschlagt. Bei einer Züchtung in einem 10 Liter-Fermenter
war es möglich, mehr als 2 g hGH pro Liter zu erhalten.