DE3887856T2

DE3887856T2 - Methode zur Herstellung von natürlichen, menschlichen Wachstumshormon in reiner Form.

Info

Publication number: DE3887856T2
Application number: DE3887856T
Authority: DE
Inventors: Testori Silvia Astrua; Elisabetta Franchi; Guido Grandi; Federico Maisano
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-21
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2008-12-22
Also published as: EP0321940A2; IT8723148A0; ES2061619T3; DE3887856D1; IT1223577B; EP0321940A3; EP0321940B1; ATE101649T1; US5047333A; JPH022386A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines in reiner Form aus genmanipulierten Zellen erhaltenen Proteins. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von menschlichem Wachstumshormon (hGH) in reiner Form.
hGH ist ein Protein mit 191 Aminosäuren, das im Hypophysenvorderlappen während der gesamten Lebenszeit eines Individuums gebildet wird, besonders in größeren Mengen vor dem Erwachsensein.
Das Wachstumshormon wird in der Form eines Vorläufers synthetisiert und nach der Herstellung aus der Zelle abgesondert.
hGH wurde seit einiger Ueit zur Behandlung von auf einem Mangel an dem Hormon bedingtem Zwergwuchs eingesetzt und kann auch für ein Verheilen von Verbrennungen und Wunden verwendet werden.
Bis vor einigen Jahren war die einzige Quelle für das Hormon die Hypophyse von Toten, aus der es in geringer Ausbeute in einem komplexen und aufwendigen Verfahren extrahiert wurde.
In neuerer Zeit wurden Verfahren zur Herstellung von hGH durch Fermentation unter Einsatz von gentechnologisch transformierten Wirtsorganismen angegeben.
Die WO-A-8604609 lehrt ein Verfahren zur Herstellung von hGH in E.coli über ein Vorläufermolekül mit einer endständigen Amino-Erweiterung am echten hGH. Diese Erweiterung ermöglicht die analytische und präparative Trennung des echten hGH durch eine Ionenaustausch-Chromatographie mittels Selektion der Aminosäuren von der endständigen Erweiterung mit eingesetzten Seitenketten und sichert eine Spaltstelle für DAP I für die enzymatische Spaltung des Vorläufermoleküls unter Bildung von echtem hGH mit einer Reinheit von mehr als 99 % nach der Ionenaustauscher-Chromatographie.
Im GB-Patent 2055982 und EP-Patent 201147 wird ein Verfahren zur Herstellung von hGH beschrieben und beansprucht, bei dem ein behandelter Stamm von Escherichia coli (E.coli) mit einem Gehalt an einem Plasmid verwendet wird, das die DNA-Struktursequenz für die Kodierung des Proteins mit 191 Aminosäuren umfaßt. Die Sequenz ist abwärts von einem Promotor und einer Ribosom-Erkennungsstelle (RBS), die für die Transkriptions- und Translationsvorgänge notwendig sind, angeordnet und grenzt an das ATG-Triplett für die Kodierung vom Methionin an.
Die Anwesenheit von Methionin ist notwendig, weil es das Startsignal für die Translation vom gesamten Protein bedeutet.
Bekannte Verfahren stellen daher ein Produkt her, das von der Aminosäuresequenz des natürlichen hGH mit Methionin (Met) am Aminoende gebildet ist.
Obgleich die Anwesenheit von dieser Aminosäure die Aktivität des Hormons nicht zu beeinflussen scheint (vgl. K.C.Olson et al., Nature, 293 (1981), 408), zeigen immunologische Daten, daß sich bei einem erkennbar hohen Prozentanteil von Patienten, die mit dem Met:hGH behandelt wurden, die Bildung von ausgedehnte therapeutische Behandlungen verhindernden Antikörpern gegen das Hormon zeigen läßt.
Es besteht daher die Notwendigkeit zur Bereitstellung eines Proteins, das mit dem natürlichen identisch ist.
Im Stand der Technik wurden verschiedene Methoden vorgeschlagen für die in vivo- und in vitro-Entfernung vom Methionin aus gentechnologischen Proteinen und besonders aus hGH. Eine der in vivo-Arbeitsweisen beruht im wesentlichen auf der Anwendung der Signalsequenz, die verantwortlich ist für die Aktivierung des Proteintransports durch die Zellenmembran von Escherichia coli (E.coli) oder Bazillus subtilis (B. subtilis).
Im allgemeinen umfaßt diese Methode die Bildung eines Plasmid- Hybrids mit dem Gehalt an der Nukleotidsequenz für die Kodierung vom hGH, angehängt an dem 5'-Ende von einer Sequenz zur Kodierung einer Signalsequenz (Leadersequenz) und Transformation der Gastzellen durch die Hybrid-Plasmide. In geeigneter Weise gezüchtet, bilden die Zellen ein gekoppeltes Protein, das ein aus dem hGH und der Signalsequenz gebildetes Protein ist. Die Sequenz wird dann am Membranrand mittels einer spezifischen Endopeptidase entfernt und das fertige Protein in den Zellplasmaraum oder die äußere Umgebung abgegeben. Insbesondere werden die Leadersequenz vom Protein OmpA (H.M. Hsiung et al., Biotechnology, 4 (1986), 991) und das Endotoxin von E.coli für die Gewinnung von fertigein hGH aus transformierten E.coli-Zellen verwendet ; die Signalsequenz der neutralen Protease von B. amyloliquefaciens wird für die Gewinnung von hGH aus B. subtilis-Zellen eingesetzt.
Indessen haben diese bekannten Verfahren Nachteile, die einerseits mit der Verwendung von für einen Menschen pathogenen E.coli zusammenhängen und andererseits aus der Herstellung von einem hGH mit einem Gehalt an 1 bis 4 zusätzlichen Aminosäuren am Aminoende und der dadurch notwendigen partiellen Bearbeitung des im B.subtilis ausgedrückten Proteins resultieren.
Eine zweite Arbeitsweise zur Entfernung vom Methionin in vitro besteht in der Modifikation des das Protein kodierenden Gens, so daß dessen Syntheseprodukt gebildet wird aus dem natürlichen Protein und einer längeren oder kürzeren Peptidsequenz, die durch eine Enzymbehandlung entfernt werden kann. Im allgemeinen leidet diese Methode an dem Umstand, daß im Falle der Anwesenheit von Restaminosäuren, die von den für die Hydrolyse verwendeten Enzymen angegriffen werden, ein größerer oder kleinerer Prozentanteil vom Protein abgebaut wird, durch die Produktions-Ausbeute verringert wird.
Es ist daher wesentlich, über eine spezifische Behandlung zu verfügen, die die Hydrolyse des gekoppelten Proteins allein an der Stelle zwischen dem interessierenden Produkt und dem aminoendständigen Peptid bewirkt.
Es ist bekannt, daß der Faktor Xa, eine beim Aufbauverfahren mitwirkende Serumalbumin-Protease, die Glycin-Arginin (Gly- Arg) -Sequenz erkennt und insbesondere eine starke Affinität für das Isoleucin-Glutaminsäure-Glycin-Arginin (Ile-Glu-Gly- Arg) -Tetrapeptid aufweist.
In neuerer Zeit haben Nagai und dessen Mitarbeiter (vgl. K. Nagai et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 82 (1985), 7252) gezeigt, daß gekoppelte Produkte, bei denen ein Aminoendteil zum Schutz des interessierenden Proteins gegen die Wirkung von mikrobieller Protease angebracht war, genau und spezifisch bearbeitet werden, sofern sich die Ile-Glu-Gly-Arg-Sequenz an der Verbindungsstelle befindet.
Trotz der Ermöglichung der korrekten Verarbeitung der gekoppelten Proteine und dadurch mögliche Produktion vom hGH in der natürlichen Form weisen diese bekannten Arbeitsvorgänge noch Nachteile auf, die auf der Schwierigkeit der Reinigung des erhaltenen Produkts beruhen.
Tatsächlich ist nämlich der Vorläufer des hGH schwierig zu trennen, sowohl aus der Gesamtheit der durch die genmanipulierten Zellen gebildeten Proteine als auch vom nach der enzymatischen Hydrolyse erhaltenen Hormon.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird daher gebildet durch ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von natürlichem hGH in reiner Form.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen des Textes und der nachfolgenden Beispiele ersichtlich.
Die vorliegende Erfindung beruht im wesentlichen auf der Erkenntnis, daß die Anwesenheit eines Peptids von einer bestimmten Länge und Aminosäure-Zusammensetzung an der aminoendständigen Gruppe des an das N-Ende vom hGH gekoppelten Tetrapeptids Ile-Glu-Gly-Arg die Herstellung des Hormons in der natürlichen Form und mit einem hohen Reinheitsgrad ermöglicht.
In der Tat verleiht das Peptid, das in l-Stellung noch Methionin aufweist und wenigstens eine Säure, d.h. eine Aminosäure (Glutaminsäure, Aspartinsäure), eine basische Aminosäure (Arginin, Lysin) oder Histidin enthält, dem hGH-Vorläufer Eigenschaften, die dessen leichte Trennung sowohl von den gesamten Proteinen als auch vom enzymatischen Hydrolyseprodukt mittels bekannter chromatographischer Techniken erlauben.
Darüber hinaus wurde beobachtet, daß diese Peptidextension die Spezifität des Schneidens durch den Faktor Xa nicht beeinflußt, so daß die genaue Bearbeitung des gekoppelten Proteins und die Herstellung des Hormons mit der korrekten Aminosäuresequenz ermöglicht wird.
Insbesondere umfaßt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die im nachfolgenden Anspruch 1 angeführten Stufen.
Nach der erfindungsgemäßen Arbeitsweise wird das Plasmid-Hybrid hergestellt in der Stufe a) durch eine geeignete Insertion in einen Expressionsvektor von einem synthetischen Gen, das den Vorläufer vom hGH kodiert.
Für diese Zwecke brauchbare Vektoren können aus den zum Stand der Technik gehörenden ausgewählt werden.
Vorzugsweise wird der Vektor pSM 214 ATCC 67320 verwendet, der dadurch charakterisiert ist, daß er in Bazillus subtilis sehr stabil ist und die Fähigkeit zur Induktion der effizienten Expression von heterologen Proteinen aufweist.
Dieser Vektor, der in der IT-Patentanmeldung 19551 A/87 beschrieben und beansprucht wird, enthält die funktionellen Replikations-Origins von pUB110 und pBR322, die die Replikation der km, Bla und Cat-Gene in B. subtilis und E.coli ermöglichen, welche jeweils die Resistenz gegen Kanamycin, Ampicillin und Chloramphenicol, dem starken synthetischen Promotor für die Lenkung der Transkription von einer diystronischen messenger-RNA (mRNA) einschließlich der Sequenz für die Bla und Cat- Gene, kodieren, sowie schließlich den to-Terminator vom abwärts vom Cat-Gen gelegenen E.coli-Lambdaphagen.
Die Entfernung vom Vektor des Bla-Gens mittels der EcoRI- und HindIII-Restriktions-Enzyme und die anschließende Einbringung von einem heterologen Gen in den Seiten ermöglicht den Aufbau eines Plasmid-Hybrids, in dem die Transkription des Gens durch die Anwesenheit eines einzelnen Promotors mit Auswahl von Chloramphenicol gesichert ist.
Daher ist gemäß der vorliegenden Erfindung das heterologe Gen dasjenige, das den Vorläufer des menschlichen Wachstumshormons kodiert.
Dieses Gen wird insbesondere erhalten durch die Fusion des DNA-Fragments mit 530 Basenpaaren, das die Aminosäuren 17 bis 191 vom hGH kodiert, mit einem synthetischen Oligonukleotid, das ein Polypeptid mit der folgenden Sequenz
(aa)n-Ile-Glu-Gly-Arg-hGH&sub1;&submin;&sub1;&sub6;
kodiert, wobei
(aa)n eine Aminosäuresequenz bedeutet, in der die Aminosäure in der l-Stellung immer Methionin ist und welche mindestens einen basischen Aminosäurerests (Arginin oder Lysin; #Arg, Lys) oder mindestens einen saurem Aminosäurerest (Glutaminsäure oder Aspartinsäure; Glu, Asp) oder Histidin (His) umfaßt, sowie n den Wert von 2 bis 10 hat.
Ile-Glu-Gly-Arg ist das vom Faktor Xa erkannte Tetrapeptid, und hGH1-16 ist die aminoendständige Sequenz von den 16 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons. Demgemäß und zur Bereitstellung eines die vorliegenden Erfindung nicht einschränkenden Beispiels wird ein synthetisches Oligonukleotid für die Kodierung von einem Polypeptid hergestellt, in dem die folgende aa-Sequenz vorliegt:
Met-Glu-Glu-Leu-Met-
Nach der vorliegenden Erfindung wird das DNA-Fragment mit 530 Basenpaaren hergestellt aus dem Plasmid pSM 209
durch Digestieren mit FnuDII- und HindIII-Restriktions-Enzymen und
anschließendes Trennen von der Digestionsmischung durch eine Elektrophorese an einem Polyacrylamidgel.
Das vorgenannte Protein PSM 209 wurde gemäß bekannten Verfahren aus dem im Handel befindlichen Plasmid pUC 9 (Böhringer) erhalten.
Insbesondere wird die DNA vom hGH in das Plasmid pUC 9 subkloniert unter Erhalt des Plasmidzwischenprodukts pWH 441, welches dann wie üblich zur Entfernung der abwärts vom hGH-Gen gelegenen SmaI-Restriktionsstelle behandelt und dafür mit einer HindIII-Stelle substituiert wurde (für die Herstellung vom Plasmid pSM 209 siehe IT-Patentanmeldung 20345-A/86, die hiermit als Referenz eingebracht wird).
Das Fragment wurde dann mit dem zunächst phosphorylierten synthetischen Oligonukleotid und mit dem pSM 214-Vektor ligiert und mit EcoRI und HindIII-Enzymen zur Entfernung des Bla-Gens digeriert.
Die Ligationssreaktion wurde in Gegenwart von dem T&sub4; DNA Ligase-Enzym gemäß allgemein bekannter Technik durchgeführt.
Am Ende der enzymatischen Reaktion wurde die gesamte Mischung verwendet zum Transformieren von E.coli-Zellen, die durch Behandlung mit CaCl&sub2; (vgl. M.Mandel und Higa J.Mol . Biol., 53 (1970), 154) kompetent gemacht worden waren.
Die transformierten und durch Zusatz von Chloramphenicol selektiv gemachten Zellen wurden dann auf einem geeigneten Kulturmedium bei einer Temperatur zwischen 30 und 40 ºC selektiert. Ein Plasmid-Hybrid mit dem Gehalt an dem korrekt eingebauten synthetischen Gen wurde isoliert.
Das Plasmid (pSM 274) wurde dann zum Transformieren von B.subtilis-Zellen eingesetzt, die gemäß der Methode von Contente und Dubnau (vgl. Mol. Gen. Genet. 167 (1979), 258) kompetent gemacht worden waren.
Für diesen Zweck können verschiedene Stämme von B. subtilis mit den folgenden Charakteristiken (hpr, spr) verwendet werden; im vorliegenden Fall wurde bevorzugt angewendet: B. subtilis, SMS 118/rec&spplus;, hpv&supmin;, spr&supmin;, Leu, pyrD1).
Die transformierten Zellen wurden dann in einem VY-Flüssigmedium (Veal Infusion Broth (DIFCO), Yeast extract (DIFCO)) mit Zusatz von Chloramphenicol bei einer Temperatur von 37 ºC oder nahezu 37 ºC gezüchtet.
Danach wurden die Zellen von der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt und nach einer der bekannten Mehtoden lysiert; die Lysate wurden schließlich zur Feststellung der Anwesenheit von dem hGH-Vorläufer analysiert. In der Praxis wurden die Zell-Lysate auf ein Polyacrylamidgel gepackt; nach der Elektrophorese wurden die Proteine entweder durch Färbung mit "Coomassie Blue" (vgl. Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach edit. B.D. Hames und D. Rickwood IRL Press Limited) oder durch Immunoblotten (vgl. Towbin et al., P.N.A.S., Vol. 76 (1979) Nr. 9, 4350-4354) ermittelt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten die Anwesenheit eines Proteins mit etwa 23.000 Dalton in der überstehenden Flüssigkeit von der Zell-Lysierung, welches ein wenig langsamer als die natürliche hGH-Kontrollprobe (Calbiochem) migrierte und mit den Anti-hGH-Antikörpern reagierte.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde der hGH-Vorläufer von der überstehenden Flüssigkeit des Zell-Lysats gereinigt.
Zu diesem Zweck wurden bekannte Ionenaustauscher- oder IMAC- Chromatographie-Techniken (vgl. M. Below et al., Analytical Biochemistry 164 (1987), 457) angewendet. Das erstere Verfahren nutzt unter Anwendung von ionischen oder kationischen Harzen die Anwesenheit von positiven oder negativen Ladungen der sauren und/oder basischen Aminosäuren in der Peptidextension zur Bindung des hGH-Vorläufers an die Kolonne aus; beim zweiten Verfahren wird die Affinität von Histidin und anderen Aminosäuren für einige Metallionen ausgenutzt. Bei der praktischen Durchführung wird nach der Zell-Lysierung und Trennung der lysierten Zellen durch Zentrifugieren die überstehende Flüssigkeit in eine chromatographische Kolonne, die mit einem aus DEAE-Cellulose oder Sephadex ausgewählten, den Vorläufer fest bindenden Harz befüllt ist, gegeben.
Die Proteine werden aus der Kolonne mittels eines Eluens mit einem ionischen Gradienten eluiert. Eine Pufferlösung mit einer NaCl-Konzentration von 0,1 bis 0,5 M wird vorzugsweise eingesetzt.
Es war auf diese Weise möglich, den Vorläufer aus der Kolonne mit einer Ausbeute von mehr als 90 % und einer Reinheit von etwa 60 % zu gewinnen.
Nach einer Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Proteinsuspension durch den Zusatz einer bis zu 60 % gesättigten Ammoniumsulfatlösung unter Ausfällung der Proteine vor der Reinigung des hGH-Vorläufers konzentriert werden. Die Proteine werden dann in einem Puffer löslich gemacht und mittels einer Ionen-Austauscher-Chromatographie oder IMAC gereinigt.
Der so gereinigte Vorläufer wird dann erfindungsgemäß wieder in einem Puffer aufgenommen und mit dem Faktor Xa hydrolysiert, und zwar unter Anwendung eines molaren Verhältnisses vom Faktor Xa : hGH-Vorläufer von 1 : 2 bis 1 : 100.
Die Enzymreaktion wird bei Raumtemperatur (20 bis 25 ºC) so lange durchgeführt, wie es zur vollständigen oder nahezu vollständigen Reaktion notwendig ist.
Die Reaktionsmischung wird dann gegen einen Puffer dialysiert, der für die anschließende Chromatographie geeignet ist, die Mischung mit dem Gehalt an fertigem Hormon, jedem nicht hydrolysierten Vorläufer und restlichen verunreinigenden Proteinen wird nochmals durch Ionen-Austauscher-Chromatographie oder IMAC gereinigt.
Restliches Protein und Vorläufer werden dabei an die Kolonne gebunden, während das nicht zurückgehaltene Hormon aus der Kolonne mit einer Ausbeute von mehr als 90 % eluiert wird.
Die Analyse der Aminosäuresequenzen, die entsprechend der Arbeitsweise von F. Sanger et al. (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74 (1977), 5463) durchgeführt wurde, zeigte, daß das so gereinigte Hormon die korrekte Sequenz aufwies.
Darüber hinaus zeigte das Hormon bei der elektrophoretischen Analyse eine Reinheit von 100 % oder nahezu 100 %.
Was die Zeichnungen anbetrifft, so beinhalten in kurzer Darstellung:
Fig. 1 eine schematische Wiedergabe vom Aufbau des Plasmids pSM 274,
Fig. 2 ein SDS-Blatt, gefärbt mit "Coomassie Blue" enthaltend die Gesamtheit der löslichen und unlöslichen Proteine aus B. subtilis-Zellen, wobei entsprechen:
1: SMS 118 (pSM 214) lösliche Proteinfraktion,
2: SMS 118 (pSM 214) unlösliche Proteinfraktion,
3: SMS 118 (pSM 274) lösliche Proteinfraktion,
4: SMS 118 (pSM 274) unlösliche Proteinfraktion
5: met-hGH
6: Standards für Molekulargewichte;
Fig. 3 Western-Blotten der Gesamtheit der löslichen und unlöslichen Proteine von B. subtilis-Zellen, wobei entsprechen:
1: SMS 118 (pSM 214) lösliche Proteinfraktion,
2: SMS 118 (pSM 214) unlösliche Proteinfraktion,
3: SMS 118 (pSM 274) lösliche Proteinfraktion,
4: SMS 118 (pSM 274) unlösliche Proteinfraktion
5: met-hGH.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sollen sie aber nicht einschränken.

Beispiel 1

Herstellung des Plasmid-Hybrids pSM 274

A) Gewinnung des synthetischen Gens, das den Vorläufer vom hGH kodiert
Die DNA-Sequenz, die das menschliche Wachtsumshormon (hGH) von den Aminosäuren 17 bis 191 kodiert, wurde aus dem Plasmid pSM 209, das in der IT-Patentanmeldung 20345 A/86 beschrieben ist, durch die Behandlung des Plasmids mit dem FnuDII-Restriktionsenzym, welches die DNA zwischen den Aminosäuren 16 und 17 schneidet, und dem HindIII-Enzym, das abwärts vom Stopkodon schneidet, abgetrennt.
Zu diesem Zweck werden 50 ug von pSM 209 mit 50 Einheiten (Units=U) an FnuDII (Biolabs) in 200 ul einer Reaktionsmischung mit einem Gehalt an 6 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol während 1 Stunde bei 37 ºC geschnitten.
Nach der Deaktivierung des Enzyms bei 70 ºC während 10 Minuten wurde die Lösung auf eine Konzentration von 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) und 50 mM NaCl gebracht und bei 37 ºC während einer Stunde in Anwesenheit von 50 U an HindIII (Böhringer) inkubiert.
Im Anschluß an die Deaktivierung des Enzyms bei 70 ºC während 10 Minuten wurde die DNA durch Beladung der Digestionsmischung auf 6 % Acrylamidgel und Anlegung einer Spannung von 130 V während 3 Stunden abgetrennt. Das Band von etwa 530 Basenpaaren (bp) mit der Sequenz, die das hGH von der Aminosäure 17 bis zur Aminosäure 191 kodiert, wurde dann eluiert gemäß Maxam und Gilbert in "Methods in Enzymology", Vol. 65 (1980), 499-560.
Das DNA-Fragment mit der nachstehenden Sequenz wurde danach mittels eines "System One DNA"-Synthetizers von Beckman synthetisiert:
Dieses DNA-Fragment kodiert die ersten 16 Aminosäuren vom hGH und die Aminosäuren Met- Glu-Leu- Met- Ile- Glu- Gly- Arg, die sich am Ende des kodierten Peptidfragments befinden. 1 ug von diesem DNA-Fragment werden in 10 ul eines Puffers, der 16 mM Tris HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM ATP, 1 mM Spermidin, 10 mM MgCl&sub2;, 15 mM Dithiothreit (DTT), 0,2 mg/ml Rinderserumalbumin und 2 U von T4 Kinase (Biolabs) enthielt, während 1 Stunde bei 37 ºC phosphoryliert; danach wird das Enzym bei 65 ºC während 10 Minuten deaktiviert.
B) Gewinnung von pSM 274 (Fig. 1)
2 ug des Plasmids pSM 214 ATCC 67320 werden in 20 ul eines Puffers, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 6 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und jeweils 2 U von EcoRI und HindIII enthielt, bei 37 ºC während 1 Stunde behandelt. Die Enzyme werden durch Halten der Digestionsmischung während 10 Minuten bei 65 ºC deaktiviert; unmittelbar danach wird die Mischung auf 0,8 % Agarosegel bei 110 Volt während 2 Stunden aufgetragen (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1982)). Das größte Band von etwa 6500 bp wurde dann in bekannter Weise (vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning a.a.O) eluiert.
1,5 ug des 6500 bp-Fragments, 400 ng des 530 bp-Fragments vom pSM 209 und 50 ng des - wie unter A beschriebenen - phosphorysierten synthetischen Fragments werden in 150 u1 eines Puffers, der 66 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 1 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM DTT enthält, vermischt und in Gegenwart von 2 U von T4 DNA -Ligase bei 14 ºC während 18 Stunden ligiert. 5 ul der Ligationsmischung werden zur Transformierung von 200 ul handelsüblicher Escherichia coli E.Coli JM 101 (BRL)-Zellen verwendet, die durch Behandlung mit 50 mM CaCl&sub2; (vgl. M. Mandel und Higa, J.Mol. Biol., 53 (1979), 154) kompetent gemacht worden waren.
Die transformierten Zellen wurden durch Aufsprühen auf Platten von einem 20 ug Chloramphenicol enthaltenden L agar-Medium (10g/L Bacto-Trypton (DIFCO), 5 g/L BACTO YEAST Extract und 5 g/L NaCl) bei 37 ºC während 12 Stunden selektiert.
Aus den Cm-resistenten Kolonien wurde eine isoliert; sie enthielt das gewünschte Plasmid pSM 274 (Fig. 1), dessen Nukleotidsequenz gemäß der Methode von F. Sanger et al. (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463) überprüft wurde.

Beispiel 2

Expression des den Vorläufer vom hGH Kodierenden synthetischen Gens in Bazillus subtilis.
SMS B. subtilis-Zellen (rec&spplus;, npr&supmin;, spr&supmin;, leu, pyrD1), die - wie von Contente und Dubnau in Mol. Gen. Genet., 167 (1979), 251-259, beschrieben - kompetent gemacht worden waren, wurden das das Plasmid pSM 274 transformiert; die transformieten Zellen wurden auf TBAB Agar (Tryptose Blood Agar Base) - Platten mit einem Chloramphenicol-Gehalt von 5 ug/ml selektiert.
Von 12 analysierten transformierten Zellen waren nur 7 positiv in bezug auf die Anwesenheit von dem Plasmid pSM 274.
Um die Expression des synthetischen hGH-Gens in dem SmS 118 (pSM 274) B. subtilis-Stamm zu verifizieren, erfolgte eine Züchtung in 10 ml eines vY-Mediums (Veal Infusion Broth (DIFCO) 25 g/l, Yeast Extract (DIFCO)5 g/l) mit einem Chloramphenicol-Gehalt von 5 ug/l bei 37 ºC während 20 Stunden. 1 ml dieser Kultur wurde zentrifugiert (12000 upm, 15 Min.); die Zellen wurden gesammelt, zweimal mit einem Puffer, der 30 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 50 mM NaCl enthielt, gewaschen und dann in 100 ul eines ET-Puffers (20 % Sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 50 mM EDTA) wiederaufgenommen. 20 ul von einer Lösung mit 5 mg/ml an Lysozym wurden zu der erhaltenen Suspension zugegeben; die Mischung wurde 15 Minuten bei 37 ºC gehalten. Danach wurden 130 ul eines Puffers, der 125 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,8), 3 % Na-Dodecylsulfat SDA), 3 % ß-Mercaptoethanol und 20 % Glycerin enthielt, zugegeben; die erhaltene Mischung wurde während 3 Minuten bei 95 ºC gehalten. 20 ul des Zell-Lysats wurden auf 12,5 % SDS-Acrylamidgel (vgl. Lämmli in Nature, 277 (1970, 680) gebracht. Nach der Elektrophorese bei 25 mA während 2 Stunden wurden die Proteine entweder durch Färben mit "Coomassie Blue" (vgl. Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach, edit. B.D. Hames und D. Rickwood, IRL Press Limited) oder durch Übertragen auf ein Nitrocellulose-Filter (Sleiher und Shull; 45 um Porengröße-Towbin) geprüft.
Die Anwesenheit von hGH wurde durch Behandlung des Filters gemäß den Angaben von Towbin et al. (P.N.A.S., Vol. 76 (1979), Nr. 6, 4350-4356) unter Verwendung von Kaninchen-anti hGH-Antikörpern (Miles) und Ziegen-anti Kaninchen-IgG-Antikörpern (Miles) zusammen mit Peroxidase nachgewiesen.
Nach dem Färben mit "Coomassie Blue" wurde ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 23000 Dalton aufgezeigt, welches etwas langsamer als die natürlich hGH-Kontrollprobe (Calbiochem) migrierte; es entsprach etwa 6,2 % der Gesamtheit von den löslichen Proteinen (vgl. Fig. 2).
Die Proteine reagierten mit anti-hGH-Antikörpern, wie es durch das Irnmunoblotten gezeigt wird (vgl. Fig. 3). Die Menge des hergestellten hGH-Vorläufers wird auf etwa 18 mg/l geschätzt, sofern der Fleck unter Labor-Bedingungen bei Erhalt von etwa 4 g nasser Zellpaste je Liter der Kultur gezüchtet wird.

Beispiel 3

Reinigung vom entwickelten hGH

A) Eine Kultur des SMS 118 (PSM 274) B. subtilis-Stammes der glyceriniert und bei -80 ºC gehalten worden war, wurde zur Herstellung individueller Kolonien auf L agar-Platten, die 5 ug/ml an Chloramphenicol enthielten, verwendet.
Eine Kolonie wurde dann eingesetzt zum Inokulieren von 1 l eines VY-Mediums mit 5 ug/ml an Chloramphenicol.
Die Kultur wurde bei 37 ºC während 18 Stunden unter Rühren wachsen gelassen und danach bei 7100 g während 10 Minuten in einer Sorvall-Zentrifuge (GS3-Rotor; 6500 upm) bei 14 ºC zentrifugiert.
Die so gewonnenen Zellen wurden in 12 ml eines Puffers aus 10 mM Tris HCl (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA und 25 % Sucrose wieder aufgenommen und mit 3,2 ml von 0,5 EDTA (pH- Wert 8,0) und 1 ml einer TE-Lösung (10 mM Tris-HCl (pH- Wert 8,0), 1 mM EDTA) mit einem Gehalt von 40 mg/ml an Lysozym versetzt. Die Suspension wurde während 45 Minuten bei 37 ºC inkubiert und dann - nach der Übertragung in ein Eisbad und Zusatz von Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM - solange beschallt, bis eine homogene Suspension erhalten wurde. Die Suspension wurde danach bei 12000 upm während 30 Minuten bei 4 ºC (Sorvall-Zentrifuge, SS-34-Rotor) zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen und gegen eine Lösung von 20 mM Tris HCl(pM-Wert 7,5) und 1 mM PMSF dialysiert.
B) Ionenaustauscher-Chromatographie
Eine 20 x 1,6 cm-Kolonne mit DEAE-Cellulose (Whatman DE 52) wurde mit 30 mM Tris-HCl und 1 mM PMSF (PH-Wert 7,5) bei 4 ºC (Fließrate 30 ml/Stunde) ins Gleichgewicht gebracht und dann mit der gemäß Stufe A erhaltenend Proteinlösung beladen.
Nach dem Waschen der Kolonne mit drei Volumen des Äquilibrierungspuffers erfolgte eine Elution mit 200 ml eins Puffers aus 0,1 mM NaCl und 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5).
Die Salzkonzentration genügt für die Elution von etwa 90 % des kombinierten Proteins.
Ein nachfolgendes Waschen mit 20 mM Tris-HCl und 0,5 M NaCl entfernte die restlichen Proteine.
C) Ionenaustauscher-Chromatographie
Die Fraktionen mit dem Gehalt an den kombinierten Proteinen wurden vereinigt, gegen einen Puffer aus 20 mM NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4; (pH-Wert 6,7) dialysiert und dann in einer 15 x 1 cm-Kolonne an DEAE-Cellulose, die mit demselben Puffer ins Gleichgewicht worden war, geladen. Nachdem die nicht zurückgehaltenen Proteine ausgewaschen worden waren, wurde das kombinierte Protein mit 0,1 M NaCl im Äquilibrierungspuffer eluiert.
Die Fraktionen mit dem Gehalt an dem hGH-Vorläufer wurden gewonnen und mit Ammoniumsulfat (60 % gesättigt) zur Ausfällung der gesamten vorhandenen Proteine versetzt. Das Präzipitat wurde aufgenommen und in 6 ml einer Lösung aus 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 100 mM NaCl und 1 mM CaCl&sub2; gelöst. Blutfaktor Xa-Protease, hergestellt und gereinigt gemäß der Arbeitsweise von H.C. Theogersen, Biochem. J., 175 (1978), 613, wurde zu der Lösung zugesetzt in einem molaren Verhältnis vom Faktor Xa : hGH-Vorläufer von 1 : 10.
Die Enzymreaktion wurde durchgeführt, während die Mischung 24 Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 25ºC) gehalten wurde.
90 % vom hGH-Vorläufer wurden so digeriert und in das Hormon mit der natürlichen Sequenz überführt, was durch eine Analyse der ersten 10 Aminosäuren, die mit einem System 80-Sequenzer (Beckman) erfolgte, nachgewiesen wurde. Zur Entfernung der überschüssigen Salze wurde die Probe extensiv gegen einen Puffer aus 20 mM NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4; (pH-Wert 6,7) dialysiert.
D) Reinigung von dem natürlichen hGH
Es wurde die unter C) beschriebene Methode angewendet. Unter diesen Bedingungen wurde das natürliche menschliche Wachstumshormon - anders als die verunreinigenden Proteine und jeder nicht vom Fakto Xa digerierte Vorläufer, die durch eine Erhöhung der NaCl-Konzentration in dem Elutionspuffer auf 100 mM eluiert werden können - von der Kolonne nicht festgehalten.
Das so erhaltene hGH hatte eine Reinheit von 98 %.
Die Reinheit des hGH kann auf 100 % oder Werte nahe bei 100 % erhöht werden durch eine nachfolgende Hindurchführung durch eine RP-HPLC(C&sub3;)-Kolonne und Elution mit einem Acetonitrilgradienten. Die genaue Zusammensetzung des hGH wurde nachgewiesen durch die Bestimmung der Aminoendgruppen-Sequenz unter Verwendung von 50 ug des reinen hGH und einem automatischen Beckman-Sequenzer Modell 890A. Die PTH-Aminosäuren wurden nach der Methode, wie sie D. Hawke et al., Anal.Biochem. 120 (1982), 302, beschrieben und von den Erfindern gering modifiziert worden ist, untersucht. Wie erwartet, war die Sequenz der ersten 10 Aminosäuren:
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen reinem, natürlichen menschlichen Wachstumshormon umfassend die folgenden Stufen:

(A) Transformieren von Bazillus subtilis-Zellen mit einem Plasmid-Hybrid, das ein Gen zum Einkodieren eines Vorläufers des menschlichen Wachstumshormons aufweist, der seinerseits an dem N-Ende vom natürlichen menschlichen Wachstumshormon die folgende Aminosäuresequenz

(aa)n-Ile-Glu-Gly-Arg

aufweist,

wobei (aa)n eine Aminosäuresequenz mit 2 bis 10 Aminosäuren bedeutet, die Aminosäure in Position 1 Metheonin (Met) ist und mindestens eine der restlichen Aminosäuren aus sauren oder basisschen Aminosäureresten und/oder Histidin ausgewählt ist, sowie Ile-Glu-Gly-Arg- das vom Faktor Xa erkannte Tetrapeptid darstellt,

(B) Züchten der erhaltenen transformierten Zellen aus der Stufe (A), derart, daß der besagte Vorläufer des menschlichen Wachstumshormons synthetisiert wird,

(C) Lysieren der erhaltenen gezüchteten transformierten Zellen der Stufe (B) und Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit mit dem Vorläufer des menschlichen Wachstumshormons,

(D) Reinigen des in der Stufe (C) erhaltenen Vorläufers vom menschlichen Wachstumshormon aus der überstehenden flüssigkeit durch Chromatographie,

(E) Hydrolysieren des in der Stufe (D) erhaltenen Vorläufers vom menschlichen Wachstumshormon durch Behandlung mit dem Faktor Xa zur Herstellung des menschlichen Wachstumshormons und

(F) Reinigen des in der Stufe (E) erhaltenen menschlichen Wachstumshormons aus der angefallenen Hydrolysemischung durch Chromatographie unter Erhalt des natürlichen menschlichen Wachstumshormons.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Bazillus subtilis-Stamm in Stufe (A) um Bazillus subtilis SMS118 handelt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß das Plasmid-Hybrid der Stufe (A) erhalten ist durch:

(i) Digestieren der Expression vom Vektor pSM 214 (ATCC Nummer 67320) mit EcoRI und HindIII,

(ii) Ligatieren der durch die EcoRI- und HindIII-Digestion erhaltenen Vektorexpression mit dem Gen, das den Vorläufer vom menschlichen Wachstumshormon kodiert.

4. Verfahraen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen die das menschliche Wachstumshormon kodierende Nukleotid-Sequenz umfaßt, welche am 5'-Ende die Nukleotid-Sequenz zum Kodieren des vom Faktor Xa erkannten Tetrapeptids und am 5'-Ende die Nukleotid-Sequenz zum Kodieren der Aminosäuren-Sequenz (aa)n aufweist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure-Sequenz (aa)n aus Met-Glu-Glu-Leu-Met besteht.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigungsstufen (D) und (F) durch eine Ionenaustausch-Chromatographie oder immobilisierte Metallaffinitäts-Chromatographie durchgeführt werden.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse in Stufe (E) bei 20 bis 25 ºC unter Verwendung von einem Molverhältnis von Faktor Xa/Vorläufer von 1/2 bis 1/100 durchgeführt wird.