DE69028499T2

DE69028499T2 - Neues Verfahren zur Produktion von nichtfusioniertem Protein in E. coli

Info

Publication number: DE69028499T2
Application number: DE69028499T
Authority: DE
Inventors: Walter Dr Maerki; Albert Dr Schmitz
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1989-11-29
Filing date: 1990-11-20
Publication date: 1997-03-13
Anticipated expiration: 2010-11-21
Also published as: DK0434605T3; EP0434605A2; GR3020993T3; ATE142694T1; CA2030947A1; IE904294A1; JP2001008697A; PT96004A; PT96004B; IE74173B1; US5708148A; JPH03228682A; EP0434605B1; GB8927008D0; DE69028499D1; ES2091237T3; EP0434605A3; US5210028A

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA- Technik und betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten IFG-II (rIGF-II), die Isolierung des rIGF-II aus der Wirtszelle und die Nachfaltung in eine biologisch aktive Form.
Der insulinähnliche Wachstumsfaktor II (IGF-II) ist ein Mitglied der IGf-Familie von Polypeptid-Wachstumsfaktoren mit insulinähnlichen Aktivitäten. Die IGf-Familie umfaßt Insulin, Relaxin, IGf-I, IFG-II und die β-Untereinheit des 75-Nervenwachstumsfaktors (Blundell und Humbel, Nature 287:781-787, 1980; Froesch und Zapf, Diabetologica 28:485- 493, 1985; Froesch et al., Ann. Rev. Physiol. 47:443-467, 1985).
Die physiologische Funktion des Serumproteins IFG-II ist noch nicht vollständig verstanden. Es ist jedoch bekannt, daß IFG-II den Thymidineinbau durch aktivierte T-Zellen fördert (Brown et al., J. Receptor Res. 5:297, 1985), die erythroide Koloniebildung durch Knochenmarkszellen verstärkt (Dainniak und Kreczuko, J. din. Invest. 76:1237, 1985) und an dem durch den transformierenden Wachstumsfaktor β induzierten Wachstum auf Weichagar von normalen Ratten-Nierenzellen beteiligt sein kann (Massague et al., J. Biol. Chem. 260:445, 1985). IFG-II scheint an der Regulation der Embryonalentwicklung beteiligt zu sein und scheint durch einen Plazentafaktor reguliert zu werden (Scheonle et al., Nature 296, 252-253, 1982; Adains et al., Nature 302: 150-153, 1986). Die europäische Patentanmeldung EP-A-0 289 314 offenbart, daß IFG-II der gleiche wie der Skelett- Wachstumsfaktor (SGF) ist, der mitogen auf die Knochenzellen einwirkt (Farley et al., Biochemistry 21: 3509, 1982) und an der Stimulierung der Collagensynthese beteiligt ist (Linkhart et al., J. Cell Physiol. 128: 307, 1986). IFG-II kann zur Behandlung von Knochenstörungen verwendet werden.
Reifer IFG-II im Serum ist von dem zellulären Transiationsprodukt prepro-IGF-II abgeleitet. Prepro-IGF-II wird proteolytisch zu pro-IGF-II während des Transports durch die Membran gespalten, welches dann weiter zu reifem IFG-II prozessiert wird.
IGF-II kann in einem weiten Bereich von Organismen einschließlich Säugetiere und Vögel gefunden werden. Unterschiedliche Tierarten können unterschiedliche IFG-II-Moleküle besitzen, und in einer speziellen Art oder sogar in einem speziellen Individuum können mehrere Varianten von IGF-II synthetisiert werden. Rinderknecht und Humble beschrieben die Aminosäuresequenz von menschlichem IFG-II (huIGF-II) in FEBS Lett. 89: 283-286, 1978. Das Protein besteht aus einer einzelnen Kette, die 67 Aminosäuren besitzt. Die Primärstruktur des Proteins in dem Sequenzprotokoll ist unter SEQ ID Nr. 1 angegeben.
Ein Rattenäquivalent von huIGF-II (ratigf-II) wurde aus dem konditionierten Medium der Ratten-Zellinie BRL-3A isoliert (Dulate und Shing, J. Cell Physiol. 90: 127-138, 1976) und sequenziert (Marquardt et al., J. Biol. Chem. 256: 6859- 6865, 1981). Das US. Patent 4 783 542 offenbart die Aminosäuresequenz von Rinder-IGF-II (boIGF-II). Die Herstellung von IFG-II aus Hühnerknochen ist in der EP-0 289 314 offenbart.
Jansen et al. (FEBS Lett. 179: 243-264, 1985) beschreiben eine Variante von huIGF-II, die das Tetrapeptid Arginin- Leucin-Prolin-Glycin anstelle von Serin in Position 29 besitzt. Eine weitere Variante von huIGF-II, die das Tripeptid Cystein-Glycin-Aspartat anstelle von Serin in Position 33 besitzt, wurde von Zumstein et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3169-72 (1985) beschrieben. Einer weiteren Variante von IFG-II fehlt das N-terminale Alanin, so daß die Aminosäuresequenz mit Tyrosin am N-Terminus beginnt (des- Ala-IGF-II). Des-Ala-IGF-II wurde sowohl im Menschen als auch in der Ratte identifiziert (Rinderknecht und Humbel, FEBS Lett. 89: 283-286, 1978; Marquardt et al., J. Biol. Chem. 256: 6859-6863, 1981).
Das huIGF-II-Gen, das die prepro-Form von huIGF-II codiert, besteht aus mindestens 5 Exons und 4 Introns und umfaßt eine Region von etwa 16 kbp auf dem Chromosom 11 (de Pagter-Holthuizen et al., FEBS Lett. 195: 179-184, 1986).
Wie von Jansen et al. beschrieben (FEBS Lett. 179: 243-264, 1985) wurden zwei eng verwandte, aber unterschiedliche Typen von cDNA, entsprechend zwei unterschiedlichen MRNA- Transkripten, aus der gleichen menschlichen Leber-cDNA-Bank isoliert. Ein cDNA-Typ codiert den huIGF-II mit der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 14 Der zweite cDNA-Typ codiert die vorstehend genannte Variante von huIGF-II, die das Tetrapeptid Arginin-Leucin-Prolin-Glycin anstelle von Serin in Position 29 besitzt. Es wurde entdeckt, daß unterschiedliche MRNA-Transkripte vorwiegend in spezifischen Geweben exprimiert werden. cDNAS, die prepro- oder reifen IFG-II codieren, sind beispielsweise von Jansen et al. (FEBS Lett. 179: 283-286, 1985), von de Pagter-Holthuizen et al. (FEBS Lett. 195: 179-184, 1986), PCT/WO 8600619, U.S. Patent 4 783 524, Jansen et al. (Nature 306: 609-611, (1983)) und in EP-A-0 193 112 beschrieben.
Ob Varianten von IFG-II das Produkt von allelischen IFG-II- Genen mit einer geringfügig modifizierten codierenden Sequenz sind, oder ob Varianten durch alternatives Spleißen des Primärtranskripts eines einzelnen IFG-II-Gens gebildet werden, ist noch nicht klar (de Pagter-Holthuizen et al., a.a.O.).
Große Mengen des IFG-II-Proteins bereitzustellen, ist von wissenschaftlichem und klinischem Interesse. Es sind Verfahren bekannt, IFG-II aus menschlichem Serum (Rinderknecht und Humbel, FEBS Lett. 89: 283-286, 1978), aus Knochen (PCT/WO 8600619) oder einem konditioniertem Nährmedium einer Zellkultur (Dulak und Sling, J. Cell. Physiol. 90: 127- 138, 1976) zu produzieren. Mit diesen Methoden können jedoch nur begrenzte Mengen an IFG-II produziert werden. Die Verfügbarkeit der Aminosäuresequenz und der cDNA ermöglichte es, größere Mengen an IFG-II oder Varianten davon, z.B. eine [Arg&sup5;&sup4;Arg&sup5;&sup5;]-Variante (PCT/WO 85/00831) durch die rekombinante Gentechnik zu produzieren. Nachstehend wird durch die rekombinante Gentechnik produzierter IFG-II als rIGF-II bezeichnet.
Der genetische Code ist degeneriert, d.h. viele Aminosäuren werden durch mehr als ein Codon spezifiziert. Beispielsweise wird Serin durch die Desoxyribonukleotid-Tripletts TCT, TCC, TCA, TCG, AGT und AGC codiert. Somit ist es möglich, Gene mit unterschiedlichen DNA-Sequenzen zu synthetisieren, die die gleiche Aminosäuresequenz codieren. Unterschiedliche synthetische Gene, die menschlichen IFG-II codieren, sind beispielsweise von Furman et al., BIO/TECHNOLOGY 5: 1047-1051 (1987), in PCT/WO 8903423, PCT/WO 8500831, in der EP-0 176 341 und in der EP-0 123 228 beschrieben.
Die Expression von Polypeptiden, umfassend IFG-II-Aminosäuresequenzen, in E. coli, ist beispielsweise in den europäischen Patentanmeldungen EP-0 230 869, EP-0 225 860 und EP-176 341 offenbart. Bis jetzt wurden nur rIGF-II-Fusionsproteine in E. coli produziert. Diese Fusionsproteine besitzen den Nachteil, daß sie entweder enzymatisch oder chemisch gespalten werden müssen und dann rIGF-II von den anderen Spaltprodukten abgetrennt werden muß. So ist die Produktion von rIGF-II-Fusionsproteinen bezüglich der Anzahl der Stufen, die durchgeführt werden müssen, um gereinigten rIGF-II zu erhalten, und bezüglich der Modifikationsmöglichkeit des Proteins während der chemischen Spaltung nachteilig.
In E. coli exprimierte Proteine enthalten oft ein Methionin oder ein Methioninderivat, z.B. N-Formylmethionin, in Bin-dung an den N-Terminus, weil in E. coli-Zellen das N-terminale Methionin, das die Starteraminosäure bei der Proteinbiosynthese ist, oft nicht von der Polypeptidkette abgespalten wird.
Die Produktion von heterologen Proteinen, die nicht an eine bakterielle oder bakteriophage Proteineinheit fusioniert sind, in E. coli kann bezüglich der Empfindlichkeit des heterologen Proteins gegenüber dem proteolytischen Abbau durch die Wirtszelle ein Problem sein. Aus diesem Grund wurden Wirtsstämme entwickelt, denen Proteasen fehlen, die heterologe Proteine abbauen. Ein solcher Wirtsstamm ist beispielsweise E. coli LC137, dem das Proteasegen lon und das htpR-Gen fehlen, deren Produkt die Hitzeschock-induzierte Proteinsynthese reguliert.
Fremdproteine, die Disulfidbindungen enthalten, werden in Mikroorganismen oft in einer unlöslichen Form, der die korrekten Disulfidbindungen fehlen, die reduziert ist und eine nichtnative Konfirmation besitzt, produziert. In einer Anzahl von E. coli-Stämmen, beispielsweise in E. coli LC137, werden solche unlöslichen Fremdproteine als Einschlußkörper im Cytoplasma gespeichert. Die falsch gefalteten Proteine sind im wesentlichen inaktiv (Smith et al., Science, 229: 1219, 1985).
Beim Aufbrechen der Zelle in Abwesenheit von Reduktionsmitteln im Aufbrechpuffer können die falsch gefalteten Proteine eine falsche Disulfidpaarung besitzen, wahrscheinlich als Folge der Oxidation der Sulfhyrdylgruppen in dem falsch gefalteten Protein durch den Luftsauerstoff.
Es wurden Versuche unternommen, die biologische Aktivität von falsch gefalteten Proteinen durch ihre erneute Faltung zu der natürlich vorkommenden reifen Form wiederherzustellen. Die Nachfaltungstechniken bestehen im Prinzip aus der Isolierung der Einschlußkörper aus den Zellen, der Solubilisation der Einschlußkörper und der Denaturierung der falsch gefalteten Proteine, gegebenenfalls begleitet von einer Reduktion der falsch gebildeten Disulfidbindungen und dem Bildenlassen der reifen renaturierten Form aus dem Protein und der Oxidation der Sulfhydrylgruppen des Proteins so, daß die korrekten intramolekularen Disultidbrücken, die das reite erneut gefaltete Protein stabilisieren, gebildet werden können.
Nachfaltungsverfahren, umfassend die Reduktion, Solubilisation und Reoxidation, sind auf dem Fachgebiet bekannt (K.J. Doege und J.H. Fessier, J. Biol. Chem. 261, 1986, 8924- 8935; J.G.L. Petersen und K.J. Dorrington, J. Biol. Chem. 249, 1974, 5633-5641; V.P. Saxena und D.B. Wetlaufer, Biochemistry, 2, 1970, 5015-5022; EP 219 874). Für jedes speziehe Protein müssen jedoch die exakten Bedingungen für die Nachfaltung durch Reduktion, Solubilisation und Reoxidation entwickelt werden und sind nicht vorhersagbar. Nicht für alle Proteine waren Versuche, das falsch gefaltete Protein zu einer biologisch aktiven natürlich vorkommenden Form nachzufalten, erfolgreich. In Smith et al. (J. Biol. Chem. 264: 9314-9321, 1989) ist die Nachtaltung eines rekombinanten menschlichen IFG-II, der durch Spaltung eines in E. coli exprimierten Fusionsproteins gebildet worden war, beschrieben. Jedoch wurden bei den Nachtaltungsverfahren ein polymerisierter IFG-II und zwei strukturisomere Monomere gebildet.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in E. coli große Mengen von huIGF-II ohne eine covalent gebundene Fremdproteineinheit und ohne ein N-terminal gebundenes Methionin oder ein Methioninderivat in einer biologisch aktiven Form zu produzieren.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion eines rekombinanten menschlichen IFG-II mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Sequenz in dem E. coli-Stamm LC137, dem das lon-Proteasegen und das htpr-Gen fehlen, umfassend
1) Transformation des E. coli-Stammes mit einem Hybridvektor, umfassend eine Expressionskassette, bestehend aus einem funktionell an eine erste DNA-Sequenz geknüpften Promotor, enthaltend die Mu-ner-Gen-Ribosomen-Bindungsstelle und codierend die Aminosäure Methionin, in Verknüpfung im geeigneten Leseraster an eine zweite DNA-Sequenz, die den IGF-II codiert, wobei die zweite DNA-Sequenz den bevorzugten Codongebrauch von E. coli gemäß SEQ ID Nr. 2 oder den bevorzugten Codongebrauch der Hefe gemäß SEQ ID Nr. 3 besitzt,
2) Züchten des transformierten E. coli-Stammes,
3) Isolation eines rekombinanten IFG-II ohne eine covalent gebundene Fremdproteineinheit und ohne ein N-terminal gebundenes Methionin oder Methioninderivat in einer biologisch aktiven Form, umfassend
a) Aufbrechen der Zellen,
b) Isolieren der Einschlußkörper,
c) Auflösen von rIGF-II in einer Lösung, umfassend
i) ein Reduktionsmittel und Harnstoff oder Guanidin- HCl in einer Konzentration, die zur Entfaltung von rIGF-II ausreicht; oder
ii) eine C&sub2;-C&sub4;-Carbonsäure in einer Konzentration von etwa 0,1% (Vol./Vol.) bis etwa 70% (Vol./Vol.) und einem pH-Wert von etwa 2 bis 41
d) Nachtalten von rIGF-II in eine biologisch aktive Form durch
i) Dialyse der in Stufe c) erhaltenen rIGF-II-Lösung gegen Faltungspuffer, und
ii) Inkubation des rIGF-II in dem Faltungspuffer, umfassend 1 bis 2,5 M einer chaotropen und oxidierenden Substanz unter sauerstofffreien Bedingungen, um eine langsame Oxidation der reduzierten Sulfhydrylreste zu intramolekularen Disulfidbindungen zu erlauben, so daß rIGF-II zu einer biologisch aktiven Form gefaltet wird.
DNA, die huIGF-II codiert, kann nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Bevorzugte Beispiele für eine solche DNA besitzen den bevorzugten Codongebrauch für E. coli bzw. den bevorzugten Codongebrauch für Hefe, wie in dem Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 2 bzw. 3 gezeigt ist.
Geeigneten E. coli-Stämmen fehlt das lon-Proteasegen und das htpR-Gen (U.S. Patent 4 758 512; Buell, G. et al., Nucleic Acids Res. 13: 1923-1938, 1985).
Ein geeigneter Vektor für die Produktion eines erfindungsgemäßen Hybridvektors ist ein Vektor, der in dem E. coli- Stamm LC137 funktionell ist.
Geeignete Hybridvektoren enthalten ein vollständiges Replikon und ein Markergen, das die Selektion und Identifikation der durch die Expressionsplasmide transformierten Mikroorganismen mittels einer pHänotypischen Besonderheit ermöglicht. Geeignete Markergene verleihen dem Mikroorganismus beispielsweise eine Resistenz gegenüber Schwermetallen, Antibiotika, wie Ampicillin oder Tetracyclin und dergleichen.
Beispiele für Vektoren, die für die Expression des IFG-II- Gens in dem E. coli-Stamm LC137 geeignet sind, sind Bakteriophagen, beispielsweise Derivate des Bakteriophagen λ, oder Plasmide, beispielsweise pMB9, pSF2124, pBR317, PBR322 oder pPLMu. Bevorzugt ist pPLMu, das in Buell et al., Nucl. Acids Res. 13: 1923-1938 (1985) beschrieben ist. Bevorzugte Hybridvektoren, umfassend eine DNA-Sequenz, die IFG-II codiert, sind pPLMu/BB und pPLMu/IGF-II.
Mehrere Promotoren können zur Regulation der Expression des IGF-II-Gens in E. coli LC137 verwendet werden. Besonders nützlich sind Promotoren von stark exprimierten Genen, die eng reguliert werden können. Geeignete Promotoren sind z.B. die lac-, tac-, trp- oder lpp-Promotoren, ferner der Phage λN- oder der Phage λPL-Promotor. Ein bevorzugter Promotor zur Verwendung in E. coli ist ein eng regulierter Promotor, z.B. der λPL-, λPR-, lac- oder trp-Promotor. Am bevorzugtesten ist der λPL-Promotor. Er ist beispielsweise in dem Vektor pPLMu enthalten.
Eine bevorzugte Ribosomen-Bindungsstelle (Shine-Dalgarno- Sequenz) ist die Phage Mu ner-Gen-Ribosomen-Bindungsstelle, die in der unter SEQ ID Nr. 4 gezeigten DNA-Sequenz gezeigt ist. Die transformierten E. coli-LC-137-Stämme werden in einem Flüssigmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden gezüchtet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der in der Expressionskassette des Hybridvektors enthaltene Promotor durch ein Regulatorprotein reguliert werden und die Produktion von rIGF-II in dem transformierten E. coli LC137 kann induziert werden. Die DNA-Sequenz, die ein Protein, das den Promotor, der in der Expressionskassette des Hybridvektors enthalten ist, reguliert, codiert, kann entweder in dem Genom des E. coli-Stammes LC137 enthalten sein, oder durch einen zusätzlichen Plasmidvektor kann der E. coli-Stamm LC137 mit oder in dem erfindungsgemäßen Hybridvektor transformiert werden. Die Selektion einer geeigneten DNA-Sequenz, die ein Protein, das den in der Expressionskassette des Hybridvektors enthaltenen Promotor reguliert, codiert, hängt von dem Promotor ab. Eine DNA-Sequenz, die ein Protein, das den Promotor reguliert, codiert, ist beispielsweise ein Gen, das ein Repressorprotein codiert, z.B. trpR, lacI, λcro oder λcI, oder eine temperaturempfindliche Mutante davon.
Die Bedingungen für die Induktion der Produktion von rIGF II hängen von dem Promotor und der DNA-Sequenz, die das den Prornotor regulierende Protein codiert, ab. Wenn der thermolabile λCI&sub8;&sub5;&sub7;-Repressor verwendet wird, wird eine Hitzeinduktion bei etwa 42ºC für etwa 1 bis etwa 10 Stunden durchgeführt.
Wenn die Menge an rIGF-II in der E. coli-LC-137-Zelle einen zufriedenstellenden Spiegel erreicht hat, wird die Kultur abgebrochen, und das Polypeptid kann isoliert werden. rIGF- II kann in der Zelle in Einschlußkörpern abgelagert sein.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Produktion von rIGF-II umfaßt die Züchtung von E. coli LC137, der mit dem Plasmid pcI&sub8;&sub5;&sub7; transformiert wurde, das den thermolabilen λCI&sub8;&sub5;&sub7;-Repressor codiert und mit einem Hybridvektor transformiert wurde, bestehend aus pPLMu, umfassend eine Expressionskassette, bestehend aus dem λPL-Promotor in funktioneller Verknüpfung an eine erste DNA-Sequenz, enthaltend die Phage Mu ner-Gen- Ribosomen-Bindungsstelle, deren Sequenz unter SEQ ID Nr. 4 angegeben ist, und codierend die Aminosäure Methionin, in Knüpfung im geeigneten Leseraster an eine DNA mit der SEQ ID Nr. 2 oder 3, die huIGF-II codiert, und Induktion der Expression von rIGF-II durch Hitzeinduktion bei etwa 42ºC. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von mit dem Plasmid pcI&sub8;&sub5;&sub7; und mit dem Plasmid pPLMu/IGF-II oder mit pPLMu/BB transformiertem E. coli LC137.
Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Isolierung von rIGF-II aus den E. coli-LC-137-Zellen und zur Nachtaltung -von rIGF-II in eine biologisch aktive Form durch Reduktion der Disult idbindungen und Solubilisieren des reduzierten Polypeptids unter denaturierenden Bedingungen, wodurch das denaturierte Polypeptid sich in eine natürlich vorkommende Form falten kann, und Reoxidation der Sulfhydrylgruppen unter Bildung von Disuifidbindungen, wie vorstehend definiert.
Sofern erwünscht, ist es möglich, einen so erhaltenen huIGF-II mit freien Carboxyl- und/oder Aminogruppen in ein Salz umzuwandeln oder ein erhaltenes Salz in die freie Verbindung umzuwandeln.
Verfahren zur Aufbrechung von Wirtszellen und zur Isolierung von Einschlußkörpern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Zellen können beispielsweise durch Beschallen mit Ultraschall, alternierendes Gefrieren, z.B. in flüssigem Stickstoff, und Auftauen oder durch mechanische Kräfte, wie Scherkräfte, beispielsweise mittels einer "French-Presse", aufgebrochen werden. Einschlußkörper können durch Zentrifugation der Suspension der aufgebrochenen Zellen, z.B. für etwa 10 bis 30 Minuten bei etwa 4000 g bis zu etwa 15.000 g nach Aufbrechen der Zellen sedimentiert werden.
Eine geeignete Lösung zur Auflösung von rIGF-II umfaßt ein Reduktionsmittel und Harnstoff oder Guanidin-HCI in einer Konzentration, die zur Entfaltung von rIGF-II ausreicht, und gegebenenfalls ein Proteinaseinhibitor.
Für die vorliegende Erfindung nützliche Reduktionsmittel sind Mittel, die Disulfidgruppen zu Sulfhydrylgruppen reduzieren, beispielsweise Reagentien, die Mercaptogruppen enthalten, wie Dithiothreit (DTT), Dithioerythrit (DTE), Mercaptomethanol, Mercaptoethanol, Cystein oder reduziertes Glutathion (GSH).
Bevorzugt ist Guanidin-HCl.
Die Konzentration an Harnstoff oder Guanidin-HCl, die zur Entfaltung von rIGF-II ausreicht, beträgt von etwa 7 M bis etwa 9 M.
Für den erfindungsgemäßen Prozeß nützliche Proteinaseinhibitoren sind beispielsweise Benzamidin, Ethylendiaminotetraessigsäure, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Diisopropylfluorphosphat (DIFP), Tosylphenylalanylchlormethylketon (TPCK), Tosylleucylchlormethylketon (TLCK), o-Phenanthrolin, mikrobielle Proteaseinhibitoren, wie Pepstatin, Leupeptin oder Antipain, oder Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTT) und dergleichen.
Eine weitere geeignete Lösung zur Auflösung von rIGF-II ist eine wäßrige Lösung, umfassend eine C&sub2;-C&sub4;-Carbonsäure. Eine bevorzugte Carbonsäure ist Essigsäure. Die Konzentration der Carbonsäure in dieser Lösung beträgt von etwa 0,1% (Vol./Vol.) bis etwa 70% (Vol./Vol.) der C&sub2;-C&sub4;-Carbonsäure. Eine bevorzugte Konzentration an Essigsäure beträgt von etwa 50% (Vol./Vol.) bis etwa 70% (Vol./Vol.). Wenn die Carbonsäurekonzentration (z.B. die Essigsäurekonzentration) niedrig ist, z.B. etwa 0,1% (Vol./Vol.), muß der pH-Wert auf etwa pH 2 bis 4, bevorzugt pH 3, eingestellt werden. Der pH-Wert kann beispielsweise mit einer Halogenwasserstoffsäure, z.B. HCl, eingestellt werden.
Die Dialyse einer Lösung des in Stufe c) erhaltenen rIGF-II gegen Faltungspuffer kann bei einer Temperatur von etwa 0ºC bis etwa 10ºC, bevorzugt bei etwa 4ºC, durchgeführt werden. Nach der Dialyse kann der rIGF-II in dem Faltungspuffer für etwa 18 h bis etwa 96 h bei einer Temperatur von etwa 4ºC bis etwa 35ºC in einer Konzentration von etwa 10 µg/ml bis zu etwa 400 µg/ml, bevorzugt etwa 100 µg/ml, inkubiert werden.
Ein für das erfindungsgemäße Verfahren nützlicher Faltungspuffer umfaßt ein chaotropes Reagens, z.B. Guanidin-HCl oder Harnstoff, in einer Konzentration von etwa 1 M bis etwa 2,5 M, bevorzugt in einer Konzentration von etwa 2 M.
Wenn die rIGF-II-Lösung mit einer Protease verunreinigt ist, kann der Faltungspuffer zusätzlich einen Proteinaseinhibitor, wie vorstehend definiert, enthalten.
Sauerstofffreie Bedingungen können durch Entgasen mit einem Inertgas, z.B. Stickstoff, oder einem Edelgas, z.B. Helium oder Argon, erzielt werden.
Ein bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlicher Faltungspuffer umfaßt auch eine oxidierende Substanz. Oxidierende Substanzen gemäß der Erfindung sind Substanzen oder Redoxpaare von Substanzen, die der Lösung ein Redoxpotential unter dem Redoxpaar Sulfhydryl/Disulfid verleihen, so daß die Sulfhydrylgruppen der Proteine zu Disuifidgruppen oxidiert werden.
Oxidierende Substanzen oder Redoxpaare sind z.B. (oxidiertes) Glutathion (GSSG) oder ein Gemisch aus reduziertem und oxidiertem Glutathion, Cystein oder ein Gemisch aus Cystein und Cystin und dergleichen. Die Konzentration der Substanzen oder das Verhältnis der Mitglieder eines Redoxpaares ist so ausgewählt, daß das Redoxpotential des Faltungspuffers niedrig genug ist, um die Sulfhydrylgruppen von rIGF-II zu oxidieren.
rIGF-II kann weiter gereinigt werden. Reinigungsstufen können vor oder nach dem Nachfalten von rIGF-II durchgeführt werden.
Verfahren, die für die weitere Reinigung von rIGF-II vor oder nach dem Nachfalten geeignet sind, sind gut bekannt, z.B. chromatographische Standardverfahren, wie Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Chromatographie auf DEAE-Cellulose, Immunaffinitätschromatographie oder HPLC. Ein Verfahren zur weiteren Reinigung von rIGF-II vor dem Nachfalten ist beispielsweise die Gelt iltration an einer Gelfiltrationssäule, z.B. einer Sephacryl-S-200-Säule, die mit einer Lösung, die zum Auflösen von rIGF-II geeignet ist, wie vorstehend definiert, äquilibriert wurde und eluiert wird.
Der nachgefaltete rIGF-II wird aus dem Faltungspuffer in herkömmlicher Weise, beispielsweise durch Aussalzen, z.B. mit Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Natriumchlorid, oder durch Einengen der Proteinlösung und durch Eindampfen oder Lyophilisation erhalten.
In Abhängigkeit von dem verwendeten Verfahren wird der nachgefaltete rIGF-II auf bekannte Weise in freier Form oder als eines seiner Salze erhalten. Da er freie Aminogruppen in mehreren Aminosäureresten enthält, kann die erfindungsgemäße Verbindung in Form eines Säureadditionssalzes erhalten werden. Geeignete Säureadditionssalze sind insbesondere pharmakologisch verträgliche Salze mit herkömmlichen therapeutisch verträglichen Säuren. Repräsentative anorganische Säuren sind Halogenwasserstoffsäuren (wie Salzsäure) und auch Schwefelsäure, Phosphorsäure und Pyrophosphorsäure Repräsentative organische Säuren sind insbesondere Arensulfonsäuren (wie Benzolsulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure) oder Niedrigalkansulfonsäuren (wie Methansulfonsäure) sowie Carbonsäuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure und Citronensäure. Da jedoch die erfindungsgemäßen Verbindungen auch freie Carboxylgruppen an mehreren Aminosäureresten enthalten, die dem ganzen Peptid einen sauren Charakter verleihen, kann es auch in Form eines Salzes mit anorganischen oder organischen Basen, z.B. Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumsalzen, oder auch Ammoniumsalzen, abgeleitet von Ammoniak, oder einer pharmakologisch verträglichen organischen stickstoffhaltigen Base erhalten werden. Da es jedoch gleichzeitig freie Carboxylund freie Aminogruppen enthält, kann es auch in Form eines inneren Salzes erhalten werden. Die Herstellung von pharmakologisch verträglichen Salzen ist bevorzugt.
Ein pharmakologisch verträgliches Salz kann aus den freien Verbindungen durch Umsetzen mit Säuren, z.B. mit denjenigen Säuren, die die vorstehend genannten Salze bilden, und durch Eindampfen oder Lyophilisation oder durch Einstellen des pH-Werts auf einen geeigneten Neutralpunkt und durch Verdampfen oder Lyophilisation erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Hybridvektoren können nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Verknüpfen der Expressionskassette, bestehend aus einem funktionell mit einer ersten DNA-Sequenz, die die Ribosomen-Bindungsstelle codiert und die die Aminosäure Methionin codiert, verknüpften Promotor, in geeignetem Leseraster mit einer zweiten DNA-Sequenz, die IFG-II codiert, oder durch Verknüpfen der Bestandteile der Expressionskassette mit DNA-Fragmenten, die selektive genetische Marker und Replikations-Origins für den E. coli-Stamm LC137 enthalten, in der vorbestimmten Reihenfolge. Am bevorzugtesten sind pPLMu/BB und pPLMu/IGFII.
Die transformierten Zellen des E. coli-Stamms LC137 können durch die rekombinante DNA-Technik hergestellt werden, welche die Stufen umfaßt:
- Transformation eines mikrobiellen Wirtsstammes mit dem Hybridvektor,
- und Selektion der transformierten mikrobiellen Wirtszellen aus nichttransformierten Wirtszellen.
Die Transformation mit den erfindungsgemäßen Hybridvektoren wird beispielsweise wie in der Literatur für E. coli [M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)] beschrieben, durchgeführt. Die Isolierung der transformierten E. coli LC137-Zellen wird vorteilhafterweise aus einem Selektivnährmedium, dem beispielsweise das Biozid zugesetzt wurde, gegen das das Markergen, das in dem Expressionsplasmid enthalten ist, Resistenz verleiht, durchgeführt. Wenn beispielsweise die Hybridvektoren das amp -Gen enthalten, wird folglich Ampicillin dem Nährmedium zugesetzt. Zellen, die den Hybridvektor nicht enthalten, werden in einem solchen Medium zerstört.
Die bevorzugtesten transformierten Wirtsstämme sind E. coli LC137, transformiert mit pPLMu/IGF-II und pcI&sub8;&sub5;&sub7; und E. coli LC137, transformiert mit pPLMu/BB und pcI&sub8;&sub5;&sub7;&sub4;
Vorstehend und nachstehend wird für die Beschreibung der Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen entweder der Dreibuchstaben-Code oder der Einbuchstaben-Code verwendet, die nachstehend angegeben sind:
A Ala Alanin
R Arg Arginin
N Asn Asparagin
D Asp Asparaginsäure
C Cys Cystein
Q Gln Glutamin
E Glu Glutaminsäure
G Gly Glycin
H His Histidin
I Ile Isoleucin
L Leu Leucin
K Lys Lysin
M Met Methionin
F Phe Phenylalanin
P Pro Prolin
Ser Serin
T Thr Threonin
W Trp Tryptophan
Y Tyr Tyrosin
V Val Valin
B Asx (Asn+Asp)
Z Glx (Gln+Glu)

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1: Schema der Clonierungsstrategie zur Konstruktion des Plasmids PLMu/IGF-II.
Figur 2A: Mit Coomassie-Brillantblau gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel, das die Expression von rekombinantem huIGF-II in E. coli LC137 zeigt. Bahn 1: 10 µl Rohextrakt, Zellen nicht induziert, Bahn 2: 10 µl Rohextrakt, Zellen hitzeinduziert für 1 h, Bahn 3: 10 µl Rohextrakt, Zellen hitzeinduziert für 2 h, Bahn 4: Molekulargewichtsgrößenmarker, Bahn 5: 20 µl Rohextrakt, Zellen nicht induziert, Bahn 6: 20 µl Rohextrakt, Zellen hitzeinduziert für 1 h, Bahn 7: 20 µl Rohextrakt, Zellen hitzeinduziert für 2 h.
Ficrur 2B: "Western-Analyse" der Gesamtzellproteine nach Hitzeinduktion des E. coli-Stamms LC137, der die Plasmide pPLMu/IGF-II und pcI&sub8;&sub5;&sub7; trägt. Kaninchen-anti-huIGF-I 1-Antikörper wurden verwendet. Bahn 1: 10 µl Gesamtzellproteine, Zellen nicht induziert, Bahn 2: 10 µl Gesamtzellproteine, Zellen hitzeinduziert für 1 h, Bahn 3: 10 µl Gesamtzellproteine, Zellen hitzeinduziert für 2 h, Bahn 4: 10 µl Gesamtzellproteine, Zellen hitzeinduziert für 3 h, Bahn 5: gereinigter rekombinanter huIGF-I-Standard.
Figur 3: Schema der Clonierungsstrategie für die Konstruktiqn des Plasmids PLMu/BB.
Figur 4: Elutionsprofile der HPLC-Analyse von rekombinantem huIGF-II vor (A) und nach (B) der Nachtaltung.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, jedoch, ohne sie zu beschränken.

Materialien und Methoden

Bakterielle Stämme (E. coli K12)

LC137: htpRam, lonRg, lacam, malam, trpam, Phoam rpsL, tsx::TN10, supCts-Stamm, erhalten von HARVARD UNIVERSITY; Goft, S.A. et al., PNAS (1984) 81 , 6647-6651.
W 3110: λlysogen, hsdr
Plasmide:
pPLMu: Erhalten von BIOGEN (Buell, G. et al., Nucl. Acids Res. (1985) 13, 1923-1938). Dieses Plasmid trägt den Bakteriophagen λPL-Promotor mit der Phage Mu ner-Gen-Ribosomen-Bindungsstelle (Van Leerdam., E. et al., Virology (1982) 123 19-28; vergleiche auch SEQ ID Nr. 4).
pcI&sub8;&sub5;&sub7;: Plasmid, das einen thermolabilen λCI&sub8;&sub5;&sub7;-Repressor codiert (Remaut, E. et al. Gene (1983) 22, 103-113). Es verleiht Kanamycinresistenz.
pIGFII/3: PBR325 mit dem synthetischen huIGF-II-Gen, wie in der europäischen Patentanmeldung 0 123 228 offenbart, doniert in die einzelne EcoRI-Spaltstelle (vergleiche auch SEQ ID Nr. 3).
PBBGB/IGFII: Plamsmid puclB mit dem synthetischen huIGF- Il-Gen, offenbart in der PCT-Patentanmeldung WO 89/03423 (SEQ ID Nr. 2 einschließlich der Sequenz für das N-terminale Methionin), cloniert zwischen die Sphi- und BamHI-Spaltstelle.

SDS-Gelelektrophorese

Die SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wird wie vorstehend beschrieben durchgeführt (Laemmli, U.K. Nature (1970) 227, 680-685), wobei die Miniprotean-II-Zelle von BIORAD und 1 mm dicke 18%ige Polyacrylamidgele verwendet werden.

Hitzeinduktion

7 ml LB in einem Kulturröhrchen, das 40 µg Ampicillin und Kanamycin (LB/amp/kan) enthält, werden mit einer einzelnen Kolonie inokuliert und unter Schütteln über Nacht bei 30ºC inkubiert. 5 ml dieser Über-Nacht-Schüttelkultur werden zu 15 ml LB/amp/kan in einen 100-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, und der Kolben wird in 42ºC warmes geschütteltes Wasserbad überführt. 2-ml-Proben werden vor dem Transfer entnommen, und dann werden l-ml-Proben in istündigen Intervallen bis zu 5 h entnommen. Die Zellen werden durch Zentrifugation (5 min bei 10.000 UPM in Eppendor -Röhrchen und in einer Eppendor -Zentrifuge, Modell 5415) pelletiert, der Überstand wird verworfen, das Pellet wird dann in 100-µl-Probenpuffer für SDS-Gele resuspendiert und 10 min lang auf 95ºC erhitzt. 10-µl-Aliquote werden für die SDS-PAGE geladen.

"Western-Analyse"

Die Proteine werden elektrophoretisch (Miniprotean-Il-Zellen von BIORAD) auf eine Membran ('Immobilon' von MILLI- PORE), unter Verwendung von 0,7 A für 30 min in Transferpuffer (25 mM Tris-Base/192 mM Glycin, 15% Methanol) bei Raumtemperatur überführt. Die Blockierung wird 1 h lang bei Raumtemperatur unter Schütteln in TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,2, bei Raumtemperatur, 0,15 M NaCl), enthaltend 20% inaktiviertes Ziegenserum (GIBCO, Katalog-Nr. 063-6210; das Serum wird durch lstündige Inkubation in einem 57ºC warmem Wasserbad hitzeinaktiviert) durchgeführt. Die Membran wird dann 3mal mit 50 ml TBS gewaschen und über Nacht bei 4ºC mit einer 1:2000-Verdünnung in TBS von Kaninchen-antihuIGF-II-Antiserum inkubiert. Die folgenden Manipulationen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Membran wird dann mit 50 ml TBS 15 min lang gewaschen (das Waschen wird noch zwei weitere Male wiederholt). Immunreaktive Proteine werden unter Verwendung eines BIORAD-Kits (Katalog-Nr. 170- 6509) sichtbar gemacht. Die Membran wird 1 h lang in 20 ml TBS mit einer 1:2000-Verdünnung von alkalischer Phosphatase in Konjugation an Ziege-anti-Kaninchen-IGG inkubiert, dann 3mal, wie vorstehend beschrieben, gewaschen. Für die folgende Reaktion wird die Membran in 15 ml einer Lösung, enthaltend 66 µl NBT (BIORAD, Katalog-Nr. 170-6539, 75 mg/ml in 70% Dimethylformamid) und 50 µl BCIP (BIORAD, Katalog- Nr. 170-6532, 50 mg/ml in destilliertem Wasser) inkubiert.
Die Entwicklung sichtbarer Banden wird verfolgt, und die Reaktion wird durch Inkubation der Membran in 50 ml einer mM Ethylendiamintetraessigsäure(EDTA) -Lösung gestoppt (Wiederholung 2mal).

Reinigung der DNA-Fragmente und der Vektor-DNA

5 µg Plasmid-DNA werden vollständig mit dem Restriktionsenzym/den Restriktionsenzymen gemäß den Empfehlungen des Herstellers in 50 µl Puffer herausgeschnitten. Die DNA wird dann durch Zugabe von 5 µl 3 M Natriumacetat, 100 mM MgCl&sub2;, 5 mM EDTA und 150 µl Ethanol ausgefällt. Nach lsminütiger Inkubation bei -70ºC wird die DNA durch Zentrifugation bei 13.000 g 15 min pelletiert. Der Überstand wird verworfen, und das DNA-Pellet wird in 80 µl 0,089 M Tris-Borat, 0,089 M Borsäure und 0,002 M EDTA (TBE-Puffer), enthaltend 0,25% Bromphenol-Blau und 0,25% xylolcyanol, resuspendiert. 4mal 20-µl-Proben werden über ein 1%iges Agarosegel in TBS, enthaltend 0,5 µg/ml Ethidiumbromid, bei 50 V elektrophoretisch laufengelassen, bis der Bromphenol-Blau-Marker den Boden des 10 cm langen und 0,8 cm dicken Gels erreicht. Die DNA-Bande wird unter kurzwelligem UV-Licht sichtbar gemacht, mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und aus dem Gelstück in der SCHLEICHER & SCHUELL 'BIOTRAP'-Vorrichtung mit 200 A für 1,5 h lang elektroeluiert. Die eluierte DNA wird ausgefällt (siehe vorstehend), in 20 µl TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, bei Raumtemperatur, 1 mM EDTA) resuspendiert und für die weiteren Versuche verwendet.

Ligierung der DNA-Fragmente

10 ng linearisierte und gereinigte Vektor-DNA und 3mal das molare Äquivalent des gereinigten DNA-Fragments werden 15 h lang bei 4ºC in 20 µl Ligierungspuffer (70 mM Tris-HCl, pH 7,5, bei 24ºC, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 0,1 mM Ade nosintriphosphat), enthaltend 1 Einheit DNA-Ligase (Boehringer) inkubiert

Transformation

10 µl des bei der Ligierung der DNA-Fragmente (siehe vorstehend) erhaltenen Ligierungsgemisches werden zu 200 µl kalten (4ºC) kompeteten E. coli-Zellen (siehe nachstehend) gegeben. Nach 30minütiger Inkubation werden die Zellen durch l,sminütige Inkubation in einem 42ºC warmem Wasserbad hitzegeschockt. 2 ml LB werden zugesetzt, und die Kultur wird 40 Minuten lang in einem 37ºC warmen Schüttler in Kulturröhrchen geschüttelt. 200 µl Aliquote werden dann auf LB-Platten, die 40 µg/ml der geeigneten Antibiotika zur Selektion enthalten, plattiert.

Plasmidherstellung

Die Plasmid-DNA wird nach dem Verfahren von Bimboim, H.C. und Doly, J. (1979), Nucleic Acids Res. Z, 1513, hergestellt.

Herstellung von kompetenten Zellen

Kompetente E. coli-Zellen werden durch das in Maniatis, T. Fritsch, E.F. und Sambrook, J. 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, New York), Seiten 250-251 beschriebene Calciumchloridverfahren hergestellt.

Beispiele

1. Herstellung des Plasmids PLMu/IGFII und Expression eines huIGF-II-Gens in E. coli

Das huIGF-II-Gen, das in pIGFII/3 (SEQ ID Nr. 3) enthalten ist, wird in pPLMu, wie in Figur 1 gezeigt, doniert. Dem IGF-II-Gen in pPLMu/3 fehlt ein Stoppcodon. Dies wird in pPLMu/IGFII durch Einbringen des SalI-BaHI-Fragments ('eingefüllt') in pPLMu/3 durch das Sali-PvuII-Fragment aus pIGFII/3 rekonstruiert.
Für die Expressionsstudien wird das Plasmid PLMu/IGFII in den E. coli-Stamm LC137, der das kompatible Plasmid pcI&sub8;&sub5;&sub7; trägt, transformiert und auf LB-Platten, die 40 µg/ml Ampicillin und Kanamycin enthalten, plattiert. Einzelkolonien der frischen Transformanten werden zur Hitzeinduktion verwendet. Die Analyse mittels SDS-PAGE und die Anfärbung mit Coomassie-Brilliantblau ist in Figur 2A gezeigt. Rekombinanter huIGF-II häuft sich als Einschlußkörper in den E. coli-Zellen während Hitzeinduktion an, die, wie vorstehend beschrieben, bis zu etwa 5 bis 8% Gesamtzellprotein durchgeführt wurde. Die Identität von rIGF-II wird durch eine 'Western'-Analyse mit Kaninchen-anti-huIGF-II-Antikörpern, wie in Figur 2B gezeigt, gezeigt. Ferner wird die hitzeinduzierte Proteinbande mit offensichtlichem Molekulargewicht von 7500 D aus dem Gel ausgeschnitten und bezüglich der N- terminalen Aminosäure analysiert. Die so erhaltene Sequenz lautet: A-Y-R-P-S-E-T-L-? -G-G-E-L-V-D-T-L-Q (in Position "?" ist die Aminosäure nicht bestimmt) und entspricht einer des natürlichen huIGF-II. Die Bedeutung des Einbuchstaben- Codes für die Aminosäuren ist vorstehend angegeben.

2. Herstellung des Plasmids PLMu/BB und Expression eines huIGF-II-Gens in E. coli

Das huIGF-II-Gen mit der DNA-Sequenz mit SEQ ID Nr. 2 wurde in den Expressionsvektor pPLMu/Nde, wie in Figur 3 gezeigt, doniert. Das Plasmid pPLMu/Nde wurde wie folgt hergestellt:
Das Plasmid pPLMu wurde an der einzelnen Spaltstelle mit der Restriktionsendonuklease Ndei herausgeschnitten. Die 5'-überstehenden Enden wurden unter Verwendung von "Klenow"-DNA-Polymerase, 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat und Thymidin-5'-triphosphat glattendig gemacht und wie von T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook (1982) in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben, ligiert, wodurch das Plasmid pPLMu/Nonde erhalten wurde. Die Ncoi-Spaltstelle in pPLMu/Nonde wurde in eine NdeI-Spaltstelle unter Verwendung eines handelsüblichen Kits für die Oligonukleotid-gesteuerte in-vitro-Mutagenese (Amersham, Code RPN. 2322) und des Primers 5'- CGTAACCATATGAAAAACCC umgewandelt, wodurch das Plasmid pPLMu/Nde erhalten wurde. Expressionsstudien mit dem Plasmid PLMu/BB in E. coli LC137/pcI&sub8;&sub5;&sub7; zeigten ähnliche Expressionshöhen an rekombinantem huIGF-II wie bei pPLMu/IGFII.

3. Isolierung von Einschlußkörpern, umfassend rekombinanten huIGF-II aus mit dem Plasmid PLMuIIGFII transformiertem E. coli LC137

Die gemäß Beispiel 1 induzierten Zellen werden getrennt und zweimal in Aufbrechpuffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,0) gewaschen und 10 min lang beschallt und zentrifugiert (30 min, 13.000 g, 4ºC). Das Pellet umfaßt die Einschlußkörper.

4. Solubilisation der Einschlußkörper mit hamstoffhaltigem Puffer

Die gemäß Beispiel 3 erhaltenen Einschlußkörper werden in einem Solubilisierungspuffer (8 M Hamstoff, 100 mM Tris- HCl, 8 mM EDTA, 5 mM Benzamidin, 5 mM DTT, pH 6,5) resuspendiert, 2 bis 5 min lang beschallt und zentrifugiert (30 min, 13.000, 4ºC). Der Überstand umfaßt entfalteten rekombinanten huIGF-II.

5. Solubilisation der Einschlußkörper mit Essigsäure

Die gemäß Beispiel 3 erhaltenen Einschlußkörper werden in einer 70%igen (Vol./Vol.) wäßrigen Essigsäure solubilisiert.

6. Reinigung von rekombinantern huIGF-II vor dem Nachfalten

Der gemäß Beispiel 4 erhaltene Überstand wird auf eine Gelfiltrationssäule (Sephacryl S-200) vor dem Falten aufgebracht. Der Äquilibrier- und Elutionspuffer enthält 8 M Harnstoff, 100 mM Tris-HCl, 10 mM DTT bei pH 6,5.
Fraktionen, die aus der Sephacryl-S-200-Säule eluieren, werden auf SDS-PAGE analysiert, und die Fraktionen, die den rekombinanten huIGF-II enthalten, werden für die weitere Verarbeitung vereinigt

7. Nachtaltem von rekombinantem huIGF-II

Nachgefalteter rekombinanter huIGF-II wird aus den gemäß Beispiel 6 erhaltenen Vereinigungsfraktionen oder aus dem gemäß Beispiel 4 erhaltenen Überstand durch Dialyse gegen Faltungspuffer (50 mM Tris-HCl, 4 mM DTT, 1,5 mM L-Cystin, 4,5 mM L-Cystein, pH 8,5) bei 4ºC unter sauerstoff freien Bedingungen, die durch Entgasen mit Argon erhalten wurden, bis zu einer Harnstoffkonzentration von 2 M und durch anschließende Inkubation dieses Reaktionsgemisches für 24 h bei 30ºC erhalten. Dieses Nachtalten wird durch Umkehrpasen-HPLC der Proben des Reaktionsgemisches, die zu Beginn der Inkubation 30ºC (Figur 4A) und nach 18 h (Figur 4B) entnommen worden waren, überwacht.

8. Umkehrphasen-HPLC des rekombinanten huIGF-II

Die Trennung von entfaltetem (reduziertem) I metastabilem und nachgefaltetem (oxidiertem) rekombinantem huIGF-II wird durch Behandlung mit Essigsäure bei pH 3 und begleitende Chromatographie des Überstands auf eine Umkehrphasen-HPLC erhalten. Die Ergebnisse sind in Figur 8 gezeigt. Versuchsbedingungen:Ausrüstung:Kontron. Säule: Vydac C18 5 µm. Stationäre Phase: 218 TP 5415. Aliquotanteile: 600 µl. Fließgeschwindigkeit: 1,2 ml/min. Eluent A: 0,1% Trifluoressigsäure. Eluent B: Acetonitril/Wasser 8:2 + 0,08% Trifluoressigsäure. Druck: ca. 100 bar. Absorption bei 216 nm.

9. Charakterisierung von rekombinantem huIGF-II

Fraktion 1 bei 20,66 (Figur 4A) oder 20,51 (Figur 4B) (der Peak ist in Figur 4 als "oxidiert nachgefaltet" angegeben) isoliert mittels HPLC gemäß Beispiel 8 ist wie folgt charakterisiert:

a) Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung von rekombinantem huIGF-II

Aus Fraktion 1 des HPLC-Eluats isolierter rekombinanter huIGF-II wird mit HCl hydrolysiert und dann wie von Chang et al. in Methods in Enzymology 91:41 (1983) beschrieben, analysiert. Das Hydrolysat besitzt die in Tabelle 1 angegebene Aminosäurezusammensetzung.

Tabelle 1: Aminosäurezusammensetzung des rekombinanten huIGF-II aus E. coli

Die Werte in Klammern geben die Anzahlen der Aminosäuren in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 an.

b) Teilseguenzanalvse

Etwa 35 µg an rekombinantem huIGF-II, isoliert aus Fraktion 1 des HPLC-Eluats, werden einer herkömmlichen Sequenzanalyse nach Edman unterworfen, und die N-terminalen Phenylthiohydantoinsäuren werden mittels Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Die Ergebnisse von 35 Zyklen sind

c) Offensichtliches Molekulargewicht von rekombinantem huIGF-II

Rekombinanter huIGF-II wird auf einem SDS-Polyacrylamidgel gemäß Laemmli et al., Nature 227:: 680-685 (1970) unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen analysiert. Unter beiden Bedingungen wird ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 7500 D für den rekombinanten huIGF-II bestimmt.

d) Molekulargewichtsbestimmung durch ²&sup5;²Cf-PD-Massenspektrometrie

5 µg rIGF-II werden in 10 µl eines 1:1-Gemisches (Vol./Vol.) aus Wasser und Essigsäure aufgelöst. Das Protein wird auf einen mit Nitrocellulose beschichteten Probenhalter gegeben, und das Massenspektrum wird mit einer ²&sup5;²Cf-Plasma-Desorptionszeit des "flight mass spectrometer", Modell Bioion 20 (BIO ION Nordic AB, Uppsala, Schweden) mit einer Gasrohrlänge von 13 cm aufgezeichnet.
Das Spektrum wird bei einem Beschleunigungspotential von +19 kV aufgenommen&sub4; Das bestimmte Massengewicht des m+ H&spplus;Ions beträgt 7469. Das berechnete Molekulargewicht beträgt 7469,5.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen wurden am 14. November 1989 gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig, hinterlegt:
Mit pcI&sub8;&sub5;&sub7; und pPLMu/BB transformierter Escherichia coli LC137 wurde als LC137/BB unter der Nr. DSM5641 hinterlegt.
Mit pcI&sub8;&sub5;&sub7; und pPLMu/IGFII transformierter Escherichia coli LC137 wurde als LC137/IGFII unter der Nr. DSM5642 hinterlegt.

Claims

1. Verfahren zur Produktion eines rekombinanten menschlichen IFG-II mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 in dem E. coli-Stamm LC 137, dem das lon-Proteasegen und das htpr-Gen fehlen, umfassend

1) Transformation des E. coli -Stammes mit einem Hybridvektor, umfassend eine Expressionskassette, bestehend aus einem Promotor in funktioneller Verknüpfung an eine erste DNA-Sequenz, enthaltend die Mu-ner-Gen-Ribosomen-Bindungsstelle und codierend die Aminosäure Methionin, in Knüpfung in dem geeigneten Leseraster an eine zweite DNA-Sequenz, codierend den IFG-II, wobei die zweite DNA-Sequenz den bevorzugten Codongebrauch für E. coli gemäß SEQ ID Nr. 2 oder den bevorzugten Codongebrauch für Hefe gemäß SEQ ID Nr. 3 besitzt,

2) Züchten des transformierten E. coli-Stammes,

3) Isolieren eines rekombinanten IFG-II ohne eine covalent gebundene Fremdproteineinheit und ohne ein N-terminal gebundenes Methionin oder Methioninderivat in einer biologisch aktiven Form, umfassend

a) Aufbrechen der Zellen,

b) Isolieren der Einschlußkörper,

c) Auflösen von rIGF-II in einer Lösung, umfassend

i) ein Reduktionsmittel und Harnstoff oder Guanidin-HCI in einer Konzentration, die zur Entfaltung von rIGF-II ausreicht; oder

ii) eine C&sub2;-C&sub4;-Carbonsäure in einer Konzentration von etwa 0,1% (Vol./Vol.) bis etwa 70% (Vol./Vol.) und einem pH-Wert von etwa 2 bis 4,

d) Nachfalten von rIGF-II in eine biologisch aktive Form durch

i) Dialyse der in Stufe c) erhaltenen rIGF-II- Lösung gegen Faltungspuffer und

ii) Inkubation des rIGF-II in Faltungspuffer, umfassend 1 bis 2,5 M eines chaotropen Mittels und einer oxidierenden Substanz unter sauerstoff freien Bedingungen, wodurch eine langsame Oxidation der reduzierten Sulfhydrylreste zu intramolekularen Disulfidbindungen erlaubt wird, so daß rIGF-II zu einer biologisch aktiven Form gefaltet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Promotor der Expressionskassette eng reguliert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Promotor der Expressionskassette der IPL-Promotor ist, die DNA-Sequenz, die ein Protein, das den Promotor reguliert, codiert, das IcI&sub8;&sub5;&sub7;-Repressorgen ist, und die Produktion von rIGF-II hitzeinduziert wird.

4. Verfahren nach Anspruch lj worin die Ribosomen-Bindungsstelle die Phage Mu-ner-Gen-Ribosomen-Bindungsstelle in der DNA-Sequenz mit SEQ ID Nr. 4 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hybridvektor pPLMu/BB ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Hybridvektor pPLMu/IGFII ist.