DE3851776T2

DE3851776T2 - Verwendung von IGF-II zur Behandlung von Knochenkrankheiten.

Info

Publication number: DE3851776T2
Application number: DE3851776T
Authority: DE
Inventors: David J Baylink David Baylink
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1987-04-28
Filing date: 1988-04-28
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2008-04-29
Also published as: DE3851776D1; EP0289314A2; EP0289314A3; EP0289314B1; ES2063033T3; ATE112684T1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Insulinähnlichem Wachstumsfaktor II (IGF-II) für pharmakologische Zwecke.
IGF-II gehört zur Familie der Wachstumsfaktoren, die auch Insulin, Relaxin, den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-I (IGF-I) und gegebenenfalls die beta Untereinheit des 7s Nerven Wachstumsfaktors umfassen - siehe Blundell und Humbel, "Nature" 287 781 (1980). IGF- II unterscheidet sich von den anderen Mitgliedern seiner Familie durch das Molekulargewicht, die Aminosäuresequenz und die Länge seines Verbindungspeptids. Die Primärstruktur von human IFG-II wurde erstmals von Rinderknecht und Humbel aufgedeckt (FEBS Letters 89 283 (1978)). Sie geben die Aminosäuresequenz folgendermaßen an:
In der obigen Struktur und in der weiteren Anmeldung kann der Aminosäure Code aus einzelnen Buchstaben folgendermaßen mit der entsprechenden drei-Buchstaben Bezeichnung korreliert werden:
Die physiologische Bedeutung von IGF-II war Gegenstand vieler Spekulationen und weniger Beweise. Brown et al., J. Receptor Res. 5 297 (1985) haben jedoch gezeigt, daß physiologische Konzentrationen von IFG-II den Einbau von Thymidin durch Primärkulturen von aktivierten human T-Lymphozyten stimulieren. Es wurde gezeigt, daß IGF-II die erythroide Koloniebildung durch menschliche Knochenmarkzellen (Dainniak und Kreczuko J. Clin. Invest. 76 1237 (1985)) steigert und eventuell an der beta transformierenden Wachstumsfaktoren-induzierten Transformation von normalen Nierenzellen der Ratte (NRK) in Weichagar beteiligt ist (Massague et al., J. Biol. Chem. 260 455 (1985). Serumkonzentrationen von IGF-II, die durch Radio Immunoassays oder Radiorezeptorassays bestimmt wurden, waren in Akromegalen oder in Patienten mit Wachstumshormonmangel nicht wesentlich verschieden, sind aber im dritten Trimenon der Schwangerschaft signifikant erhöht, gehen aber nach der Entbindung auf niedrigere Konzentrationen zurück (Wilson et al., J. Clin. Endo. Meta. 55 858 (1982)). In normalen Frauen nimmt der IGF-II Spiegel im Serum mit zunehmendem Alter ab (644 ± 136 mg/ml in der achten Dekade im Gegensatz zu 723 ± 217 ng/ml in der dritten Dekade, N = 57).
Trotz dieser Beobachtungen wurden Zumstein et al., (in PNAS 82 3169 (1985)) zu der Aussage veranlaßt, daß obwohl IGF-I anscheinend ein Wachstumsfaktor sei, der Wachstumswirkungen vermittelt und unter der Kontrolle von Wachstumshormon ist, "die Funktion von IGF-II weniger verstanden ist".
Verschiedene Tiere können verschiedene IGF-II Moleküle aufweisen. Desweiteren haben Zumstein et al. (Op. cit.) eine IGF-II Variante identifiziert und sequenziert.
EP-A-0135094 offenbart die Aminosäuresequenz von IGF-I und IGF-II und Nukleotidsequenzen von dafür kodierenden Genen. Verschiedene Hypothesen für deren Verwendbarkeit wurden erstellt, aber zumindest für IGF-II wurde bezüglich der klinisch brauchbaren Aktivität nichts konkretes vorgeschlagen, außer bei der Behandlung von hypophysärem Zwergwuchs.
WO-A-8600619 offenbart präpro-IGF-I und präpro-IGF-II, bietet aber ebenfalls keine klinische Verwendbarkeit für die Endpeptide.
Eine IGF-II-kodierende cDNA wird in EP-A-0193112 offenbart. Für IGF-II wird wiederum keine spezifische klinische Verwendbarkeit offenbart oder vorausgesagt.
Die Herstellung "verschiedener Formen" von humanem IGF und EGF (Epidermal Growth Factor) durch rekombinante DNA Technologie wurde in EP-A-0128733 offenbart. Es gibt keine spezifische Offenbarung der klinischen Verwendbarkeit, außer daß humanes IGF als menschlicher Wachstumsfaktor verwendet werden kann.
E. Schoenle et al. (Acta Endocrinologica 108 (1985) 167- 174) vergleichen die in vivo Wirkung von IGF-I und IGF- II in hypophysektomierten Ratten auf das Knorpelwachstum. Nur IGF-I zeigt einen deutlichen Einfluß auf das Knorpelwachstum, während IGF-II fast keine Wirkung zeigt.
DE-A 33 43 253 beschreibt die Verwendung von Fluorid bei der Behandlung von Osteoporose.
Es wurde nun entdeckt, daß IGF-II bei der Behandlung von Knochenerkrankungen verwendet werden kann.
Seit einigen Jahren wurde vermutet, daß die Differenzierung von knochenbildenden Geweben und das Wachstum von differenziertem Knochen das Ergebnis der Einwirkung von lokalen Gewebsfaktoren ist und daß die Kopplung von Knochenbildung und Resorption einen lokalen Mechanismus zur orts-spezifischen Aufrechterhaltung von endostealem Knochenvolumen darstellt. Erläuternde Veröffentlichungen zu diesem Thema umfassen:
Farley et al., Program and Abstracts of 61st Annual Meeting of the Endocrine Society (1979);
Howard & Baylink, Clinical Research 28 50A (1980);
Howard et al., Calcif. Tissue Int. 31 (Suppl.) 53 (1980);
Baylink & Liu, J. Periodontol. 50 43-49 (1979);
Ivey & Baylink (Editorial) Metab. Bone Dis. Relat. Res. 3 3-7 (1981);
Harris & Haeny, New Engl. J. Med. 280 253-259 (1969);
Howard et al., Metab. Bone Dis. Relat. Res. 2 131- 135 (1980);
Howard et al., PNAS USA 78 3204-3208 (1981);
Drivdhal et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168 143-150 (1981) and
Drivdhal et al., Biochem. Biophys. Acta 714 26-33 (1982).
Die Möglichkeit der Existenz eines örtlich-beschränkten Faktors, der das Knochenwachstum reguliert bietet die Möglichkeit ein Material zu isolieren, daß in den verschiedensten Situationen das Knochenwachstum wirksam stimulieren und therapeutisch kontrollieren könnte. Diese Rolle wird nun für IGF-II vorgeschlagen. IGF-II könnte daher bei Knochenstörungen wirksam sein, die durch Knochenschwunderkrankungen bekannt als Osteopenia insbesondere Osteoporose (ob idiopathisch oder sekundär) hervorgerufen sind.
Unter dem Begriff Osteopenie sind Knochenstörungen wie zum Beispiel Osteogenesis imperfecta, Osteomalazie, Ostitis deformans, Osteoporose, Rachitis, Fibrodysplasie und ähnliche zu verstehen. Osteoporose bedeutet idiopathische Knochenschwunderkrankungen wie zum Beispiel Osteoporose des Alters oder Osteogenesis imperfecta und sekundäre Osteoporose (z. B. sekundär entstanden als Folge von anderen Krankheiten wie Eunuchoidismus, Hyperthyreoidismums, Cushing Syndrom, Hyperparathyreoidismus, Hypopituitarismus, Glutenenteropathie, Postgastrektomie-Syndrom, Glomeruloosteodystrophie, tubuläre Störungen, Vitamin D Vergiftung, Immobilisierung, pulmonale Azidose oder unzureichende Aufnahme von Vitamin C, Kalzium, Phosphor oder Protein durch die Ernährung). Es wird jedoch auch für möglich gehalten, daß der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor II (IGF-II) bei der Behandlung von Knochenwachstumsstörungen oder zur Förderung der Reparatur von traumatischen oder chirurgischen Frakturen verwendet werden könnte, wobei chirurgische Frakturen Knochenimplantate und Verstärkung des Knocheneinbaus in Prothesen einschließen. Weitere Ursachen für Knochenkrankheiten sind Infektionen (wie zum Beispiel Tuberkulose und Syphilis) und Neoplasmen (ob knochenbildende Tumore, chondroide Tumore oder andere Neoplasmen wie z. B. Ewing Sarkom oder Riesenzelltumor).
Es wird daher für möglich gehalten, daß IGF-II bei der Behandlung von (unter anderen Knochenkrankheiten) Osteoporose verwendet werden könnte.
Osteoporose ist eine Knochenschwunderkrankung, die sich durch den Verlust von Knochenmasse auszeichnet, was zu atraumatischer Fraktur führt. Daraus resultiert eine Verdünnung der Knochen, wobei das Skelett geschwächt wird und nicht in der Lage ist, die Belastungen, denen es normalerweise ausgesetzt ist zu tragen. Die Krankheit ist in den Teilen des Skeletts, die Gewicht tragen insbesondere Wirbelsäule, Handgelenk und Hüften besonders weitverbreitet. Die Ätiologie der Krankheit ist multifaktoriel. Eine besonders häufige Form der Krankheit tritt nach der Menopause auf. Allein in den Vereinigten Staaten sind 15 Millionen Frauen von dieser post-menopausischen Osteoporose betroffen; sie stellt daher ein bedeutendes Gesundheitsproblem dar.
Da die Anfälligkeit für Osteoporose in einer gut definierten Population post-menopausischer Frauen besonders hoch ist und aufgrund der osteoblastischfördernden Aktivität der Arzneimittel der vorliegenden Erfindung, können diese Mittel prophylaktisch eingesetzt werden, um die osteoblastische (knochenbildende) Aktivität in Patienten zu erhöhen oder zu erhalten, wodurch der Ausbruch der vorherrschenden osteoblastischen (knochenresorbierenden) Aktivität, die im Krankheitszustand beobachtet wird, verhindert wird. Neben den post-menopausischen Formen existieren jedoch weitere Formen der Osteoporose, die primäre und viele Formen von sekundären Osteoporosen umfassen. Diese Mittel können auch therapeutisch oder prophylaktisch in der Behandlung von allen Formen der Osteoporose eingesetzt werden, ob primäre oder sekundäre Osteoporose, und in allen Knochenschwunderkrankungen.
Ein Gegenstand der vorliegende Erfindung ist deshalb die Verwendung eines Peptids, welches identisch oder weitgehend homolog zu IGF-II oder einem aktiven Unterfragment davon ist, bei der Herstellung eines Mittels zur Behandlung der Osteoporose beim Menschen.
IGF-II ist besonders bevorzugt humanes IGF-II.
Obwohl es in manchen Fällen bevorzugt ist, ein mit natürlichem humanem IGF-II identisches Peptid zu verwenden, ist es nicht immer notwendig. Die Verwendung von Homologen oder Varianten wird deshalb in Erwägung gezogen, wie auch die Verwendung aktiver Unterfragmente. Posttranskriptionale oder andere Modifikationen (wie z. B. Glykosylierung) werden auch in Erwägung gezogen. Die Sequenz des natürlichen humanen IGF-II ist wie bereits oben angegeben:
und diese Sequenz ist in einigen Ausführungen bevorzugt.
Bei der Behandlung von humaner Osteoporose kann IGF-II parenteral verabreicht werden. Daher wird gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine sterile Zubereitung eines Peptids zur Verfügung gestellt, das mit IGF-II identisch oder weitgehend homolog ist oder eines aktiven Unterfragments davon.
Es wurde ebenfalls gefunden, daß es von Vorteil sein kann IGF-II in Kombination mit einem knochenlokalisierenden Mittel zu verabreichen. Dies kann helfen jegliche unspezifische (extraskeletale) Wirkungen von IGF-II zu vermeiden oder sie zumindest zu mildern.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb eine Zusammensetzung, die aus einem Peptid besteht, das mit IGF-II identisch oder weitgehend homolog ist oder eines aktiven Unterfragments davon, und einem knochenlokalisierenden Mittel. Eine Fluorid Verbindung ist ein bevorzugtes knochenlokalisierendes Mittel.
Natriumfluorid ist besonders bevorzugt. Das knochenlokalisierende Mittel hilft bei der Zuführung von IGF-II zu den Knochenstellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Arzneimittel zur Behandlung von Osteopenie in Menschen, bestehend aus einer therapeutisch wirksamen Menge von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor II oder einer therapeutisch wirksamen Menge eines osteoblaststimulierenden Fragmentes des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors II, bevorzugt in Kombination mit einer potenzierenden Menge von Fluoridionen in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Es ist besonders bevorzugt, wenn das pharmazeutische Mittel in einer parenteralen Einheitsdosierungsform ist oder in einem für intravenöse Injektionen geeigneten wäßrigen pharmazeutischen Träger oder in einer lyophilisierten Form und es dann nach Rehydratisierung zur intramuskulären Verabreichung geeignet ist.
Ein besonders bevorzugtes Arzneimittel ist eines, in dem der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor II die Aminosäuresequenz:
oder eine dazu weitgehend homologe Sequenz aufweist.
Erfindungsgemäß verwendbare Peptide können anscheinend die Knochenzellteilung und Bildung der Knochengrundsubstanz fördern und dadurch eventuell die Knochenbildung stimulieren, um dabei das gesamte Knochenvolumen des Körpers zu erhöhen. Die Peptide können in Kombination mit einem knochenlokalisierenden Mittel synergistisch wirken, um die Knochenbildung zu stimulieren.
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest zum Teil auf der bisher unveröffentlichten Entdeckung, daß IGF-II dem Skelett Wachstumsfaktor (SGF) gleicht. Es wurde insbesondere gefunden, daß humanes IGF-II mit humanem SGF identisch ist. SGF wurde mit der Stimulierung der Kollagen Synthese in Verbindung gebracht (Linkhart et al., J. Cell. Physiol. 128 307 (1986)) und es wurde erkannt, daß es eine mitogene Wirkung auf Knochenzellen aufweist (Farley et al. Biochemistry 21 (14) 3509 (1982)).
Obwohl Canalis & Raisz vor einigen Jahren berichteten (Cacif. Tissue Int. 29 33-39 (1979) daß "Multiplication- Stimulating Factor (MSF)" die DNA-synthese sowie Kollagen- und nicht-Kollagen-Proteinsynthese in Knochenkulturen stimulierte, wird diese Beobachtung alleine als nicht wesentlich erachtet hinsichtlich der sehr großen Anzahl von Substanzen, von denen eine ähnliche Wirkung berichtet wird.
IGF-II kann durch verschiedene Verfahren hergestellt werden. Zum einen kann es extrahiert werden. Die Extraktion kann aus dem Plasma erfolgen wie von Rinderknecht und Humbel beschrieben wurde (Op. Cit.). Eine andere Möglichkeit ist die Isolierung aus menschlichen Knochen wie von Mojan et al., Biochem. Biophys. Acta 884 234 (1986)) beschrieben. Es sollte beachtet werden, daß in der Veröffentlichung von Mojan IGF-II als SGF bezeichnet wird. IGF-II kann auch aus kultivierten Knochenzellen isoliert werden.
Eine zweite Möglichkeit IGF-II herzustellen, ist die Peptidsynthese. Da natürliches humanes IGF-II nur 67 Aminosäuren lang ist, kann es gegebenenfalls recht einfach sein, zumindest kleine Mengen des Peptids auf diese Weise herzustellen.
Das dritte (und letzendlich wahrscheinlich das bevorzugte) Herstellungsverfahren, verwendet jedoch rekombinante DNA Techniken. Der erste Schritt in solchen Techniken wäre es ein Stück DNA zu gewinnen, das für das gewünschte IGF-II codiert. Eine Möglichkeit hierzu wäre mRNA aus IGF-II-produzierenden Zellen zu isolieren und die cDNA die das gewünschte Peptid codiert durch Verwendung von reverser Transkriptase in vitro zu produzieren. Als Alternative kann die DNA chemisch synthetisiert werden. Eine Anzahl von Oligonucleotiden kann synthetisiert werden, aus denen die gewünschte cDNA durch Verwendung von DNA Polymerase und DNA Ligase hergestellt werden kann. Durch Verdauung einer der beiden Enden mit Restriktions Endonukleasen können entsprechende kohäsive Restriktionsstellen zum Einsetzen in ein Plasmid erhalten werden.
Ganz gleich ob die synthetische DNA, cDNA oder chemisch synthetisierte DNA ist, sie kann entweder kohäsive Enden aufweisen, die von einer Restriktions Endonuklease erzeugt werden oder sie kann durch zum Beispiel oligo-dC unter Verwendung von geeigneten Nukleotiden und terminaler Transferase mit einem terminalen Schwanz versehen werden.
Unabhängig von der gewählten "tailing" Methode kann dann ein Plasmid (zum Beispiel pBR322) verwendet werden und an einer singulären Stelle durch eine Restriktions Endonuklease wie z. B. PstI geschnitten werden. PstI schneidet pBR322 in dem Gen, das für Ampizillin Resistenz codiert. Dies ermöglicht die einfache Auswahl von rekombinanten Plasmiden. Gegebenenfalls kann das PstI-verdaute pBR322 mit einem oligo-dG Schwanz versehen werden, um ein oligo-dC Schwanzstück der DNA welches das gewünschte Peptid codiert zu komplementieren. Das geschnittene Plasmid und die DNA, die das Peptid codiert, können hybridisiert und ligiert werden; Wirtszellen (z. B. E. coli) können mit dem geeigneten rekombinanten Plasmid transformiert werden.
Die transformierten E. coli Wirtszellen können unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, um das IGF-II Peptid zu exprimieren.
Es sollte darauf hingewiesen werden, daß die Herstellung durch rekombinante DNA Techniken nicht auf bakterielle Systeme beschränkt werden soll. Eukaryotische Systeme wie z. B. Hefesysteme können auch verwendet werden und werden in der Praxis eventuell bevorzugt.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

BEISPIEL 1

Bildung von IGF-II durch Knochenzellen

Menschliche Knochenzellen werden aus Oberschenkelköpfen, die durch Hüftgelenkersatz Chirurgie erhalten wurden isoliert. Sie werden in Monolayerkultur in Platten gezüchtet, die Dulbecco modifiziertes Eagle Medium enthalten unter Zusatz von 10% foetalem Kälberserum. In einem Radiorezeptortest kann dann die Freisetzung von IGF-II in das Kulturmedium kontrolliert werden unter Verwendung von Ratten Hepatomzellen (H35) in Monolayerkultur und es wird beobachtet, daß sich die IGF-II Freisetzung mit zunehmender Kulturzeit erhöht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die Bildung von IGF-II wird durch systemische Mittel moduliert. In dem oben beschriebenen menschlichen Knochenzell-Monolayerkulturmodell stimuliert der Zusatz von Insulin (10 bis 10 000 ng/ml) über 24 Stunden dosisabhängig die IGF-II-Bildung durch die Knochenzellen. Das kann ebenfalls aus Tabelle 1 ersehen werden. TABELLE 1 Wirkung von Insulin auf die Sezernierung von IGF-II durch menschliche Knochenzellen in vitro Insulin IGF-II Spiegel (ng/ml) nach Insulin Behandlung von Stunden
Die IGF-II Produktion erhöht sich um 50% (p < 0,01) durch die Behandlung von kultivierten menschlichen Knochenzellen mit humanem Wachstumshormon (10 ng/ml) über 5 Tage. Außerdem stimuliert humanes Somatostatin (50 ng/ml) die IGF-II Bildung von menschlichen Knochenzellen in Kultur um 148% verglichen mit unbehandelten Kontrollen (p < 0,01).
Humane Knochenzellen produzieren wesentlich mehr IGF-II als IGF-I. Medien, die mit 2 · 10&sup4; Zellen für 24 Stunden konditioniert wurden, enthalten 17,6 ng/ml IGF-II. Im gleichen Zeitraum unter identischen Kulturbedingungen bilden die Zellen nur 1,16 ng/ml IGF-I. Somit zeigt sich, daß menschliche Knochenzellen 15 mal so viel IGF- II produzieren wie IGF-I.

BEISPIEL 2

Isolierung von IGF-II aus Knochengrundsubstanz

Menschliche Oberschenkelköpfe wurden von Hüftgelenkersatz Operationen in ortsansässigen Krankenhäusern erhalten. Sie wurden mit einem Messer gereinigt, um anhaftendes Weichgewebe zu entfernen. Die Knochen wurden dann mit einer Bandsäge in kleine Stücke zerschnitten (ungefähr 2 cm³) und mit kaltem Leitungswasser gewaschen, um das Blut und Knochenmark zu entfernen. Die Knochenstücke wurden in Flüssigstickstoff gefroren und in einer Wiley Mühle mit festem CO&sub2; gemahlen. Das entstehende Knochenpulver (2 mm³) wurde durch kontinuierliches Mischen mit entionisiertem Wasser, das Proteinase Hemmstoffe enthält (5 mM Benzamidin, 100 mM &epsi;-Aminokapronsäure und 1 mM Phenylmethylsulphonylfluorid) über Nacht gewaschen. Nach Waschung mit entionisiertem Wasser wurde der Rückstand durch kontinuierliches Rühren mit einem Überschuß (5 Vol.) von 30 mM Tris-Acetat/4 M Guanidin-HCl (pH 7,4), der Proteinase Inhibitoren enthielt über 72 bis 96 Stunden extrahiert. Serumproteine (Albumin, Immunoglobuline etc.) und andere lose-gebundenen Proteine wurden durch diese Extraktion extrahiert. Der Überstand wurde abgegossen und der Rückstand wurde nochmals für weitere 24 Stunden mit einer 4 M Guanidin Lösung extrahiert. Nach der Guanidin Extraktion wurde der Rückstand 7 Tage lang durch kontinuierliches Rühren mit 10% EDTA/4 M Guanidin-HCl, welches Proteinase Inhibitoren enthielt (pH 7,4) demineralisiert. Der Überstand wurde abgegossen, zentrifugiert (10 000 UpM für 20 Minuten), filtriert und durch Amicon Membranfiltration konzentriert. Um EDTA vollständig zu entfernen wurde das Konzentrat (Guanidin-EDTA Extrakt) mit einem Überschuß an 4 M Guanidin-HCl gewaschen. Der Guanidin-EDTA Extrakt wurde unter dissoziativen Bedingungen zur weiteren Reinigung von menschlichem IGF-II benutzt. Der Guanidin- EDTA Extrakt wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert unter Verwendung von Spectrapor Membranschläuchen (Ausschluß Grenze des Molekulargewichtes 3500), die Protein Konzentration wurde bestimmt und die mitogene Aktivität geprüft.
Die IGF-II Aktivität in dem Guanidin-EDTA Extrakt wurde durch Hydroxyapatit- und Gelfiltrationschromatographie gereinigt wie im folgenden beschrieben.
Hydroxyapatit (Fast Flow, Bio-Rad) wurde mit 30 mM Tris- Acetat/4 M Guanidin-HCl/10 mM Kaliumphosphat (pH 7,4) equilibriert. Die Phosphatkonzentration des Guanidin- EDTA Extraktes wurde auf 10 mM eingestellt und die Probe wurde auf eine Hydroxyapatit Säule (15 · 5 cm) aufgetragen. Ungebundene Proteine wurden mit 10 mM Phosphat in 30 mM Tris-Acetat/4 M Guanidin-HCl (pH 7,4) eluiert. Gebundene Proteine wurden in einem einzigen Schritt durch Erhöhung der Phosphatkonzentration auf 400 mM im gleichen Puffer eluiert. Aliquoten der ungebundenen und durch 400 mM phosphat-eluierten Fraktionen wurden durch Dialyse entsalzen und auf Proteinkonzentration und mitogene Aktivität untersucht.
Die ungebundene Fraktion aus der Hydroxyapatit Chromatographie (welche 90% der mitogenen Aktivität enthielt) wurde konzentriert und die Proteine wurden durch HPLC Gelfiltrationschromatographie auf einer präparativen TSK-G3000 SWG Säule (21.5 · 600 mm, LKB Produkte) getrennt. Die Chromatographie wurde an einem Beckman Model 344 Gradienten Flüssigchromatographischen System durchgeführt, welches aus zwei Typ 112 Pumpen gesteuert von einem Typ 421 Steuerprogrammiergerät besteht. Zwei ml Proben wurden mit einem Altex Typ 210 Injektionsventil auf die Säule gegeben und die Proteine wurden bei 2 ml/min mit 30 mM Tris-Acetat/4 M Guanidin- HCl (pH 7,4) eluiert. Die Extinktion wurde bei 280 nm (Beckman Modell 160 Detektor) gemessen und das Elutionsprofil wurde mit Hilfe eines Hewlett Packard Integrator Typs 3390A aufgezeichnet. 2-Min Fraktionen wurden gesammelt und die Fraktionen wurden entsprechend der Protein Peaks vereinigt und konzentriert. Um Guanidin zu entfernen wurden Aliquoten der vereinigten Fraktionen gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf den Proteingehalt und mitogene Aktivität getestet.
Die durch Gelfiltration erhaltene aktive vereinigte Fraktion (6 bis 17,5 kDa) wurde gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, das 100 mM NaCl enthielt dialysiert und in 10 ml desselben Puffers in eine 0,5 · 10 cm Heparin-Sepharose Affinitätssäule (Pharmacia FPLC System) geladen. Die ungebundenen Proteine wurden mit Startpuffer (20 Minuten, Flußrate 1 ml/min, 2 Minuten-Fraktionen) eluiert und die gebundenen Proteine wurden mit einem Gradienten von 0,1 bis 3,0 M Natriumchlorid über 10 Minuten eluiert. Die Fraktionen wurden in 1 mg Rinderserum Albumin pro ml DMEM verdünnt und auf biologische Aktivität geprüft mit Hilfe von [³H] Thymidin Einbau in die DNA von Hühnerembryonalen Knochenzellen in serum-freier Monolayerkultur wie von Linkhart et al. Bone 7 479-487 (1986) beschrieben.
Die aktiven Fraktionen der Heparin-Sepharose Chromatographie (Fraktionen 15 bis 30, 0,2 bis 0,6 M NaCl) wurden vereinigt und unter Verwendung des gleichen Gradienten auf die gleiche Heparin-Sepharose Säule rechromatographiert. Die aktiven Fraktionen des zweiten Heparin-Sepharose Schritts (Fraktionen 17 bis 22) wurden vereinigt, konzentriert und dann zwei sequentiellen Trennungen durch Umkehr Phase Chromatographie in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), mit Hilfe einer 4,6 · 250 mm C4 Säule (Bio-Rad RP 304), unterworfen. Bei der ersten Trennung wurde ein 10 bis 60% Acetonitril Gradient in 50 Minuten verwendet und bei der zweiten Trennung ein 25 bis 45% Acetonitril Gradient in 100 Minuten. Die Endreinigung des humanen IGF-II wurde durch HPLC Umkehr Phase Chromatographie in 0,1% TFA mit einer 3,9 · 150 mm Microbondapak CN Säule (Waters Corporation) und einem 1-Propanol Gradienten (20 bis 40% in 100 Minuten) erreicht. HPLC Umkehr Phase Chromatographie wurde mit Hilfe eines Beckman Typ 344 Gradienten Flüssigchromatographie Systems mit einem 214 NM Detektor durchgeführt. Die Fraktionen wurden durch Speed Vac Verdampfung (Savant Instruments) konzentriert.

BEISPIEL 3

IGF-II wirkt auf Knochenzellen

IGF-II wie nach Beispiel 1 oder 2 erhalten, stimuliert die Teilung der Knochenzellen in Monolayerkultur und ist daher ein Knochenzellmitogen. Dies wurde durch Verwendung von embryonalen Hühnerschädeldeckenzellen in Monolayerkulturen gezeigt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

TABELLE 2A

Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen von sechs Wiederholungen (basal Impulse = 351 ± 46, n=6)

IGF-II (ng/ml) 3H-TDR EINBAU (% der unstimulierten Kontrolle)
0 100 ± 13
0,3 202 ± 32
1,0 269 ± 46
3,0 338 ± 39
10,0 403 ± 54
30,0 412 ± 20
In einem ähnlichen Experiment, das an menschlichen Knochenzellen durchgeführt wurde, stimulierte gereinigtes human IGF-II in einer Konzentration von 2 ng/ml die Proliferation von menschlichen Knochenzellen um 362% des Kontrollwertes (Tabelle 2B). Tabelle 2B Wirkung von humanem IGF-II auf die Proliferation von humanen Knochenzellen Behandlung Konzentration IPM % der Signifikanz Kontrolle humanes IGF-II Serum
Daten sind dargestellt als Mittelwert + 1 SD von sechs Proben, Signifikanz wird ausgedrückt als Vergleich zur Kontrolle (Student t Test) · a = partiell gereinigtes human IGF-II
Diese erhöhte mitogene Aktivität in den Hühner- und menschlichen Knochenzellkulturen, die durch IGF-II stimuliert wurde, ist direkt übertragbar in erhöhte osteoblastische (knochenbildende) Aktivität innerhalb des Knochens. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß wenn gereinigtes human IGF-II den Kulturen von embryonalen Mausschädeldecken hinzugefügt wurde, die mit dem Isotop &sup4;&sup5;Kalzium vormarkiert waren, IGF-II keine wesentliche Wirkung auf die Freisetzung von &sup4;&sup5;Kalzium aus diesen Knochen hatte, was auf die Abwesenheit jeglicher stimulierender Wirkung auf die Knochenresorption hinweist.
Durch die Verwendung von IGF-II in therapeutisch wirksamen Mengen, ist es daher möglich die osteoblastische Aktivität innerhalb des Knochens so weit zu erhöhen, daß sie die jeweilige osteoklastische Aktivität übertrifft und dadurch eine Heilung in einem Patienten, der an Osteopenie leidet bewirkt.
In ähnlicher Weise kann IGF-II einem Patienten, der für Osteopenie anfällig ist, in einer prophylaktisch wirksamen Menge verabreicht werden, um das Gleichgewicht zwischen osteoblasticher und osteoklastischer Aktivität in besagtem Patienten aufrechtzuerhalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung ist die zu behandelnde oder vorzubeugende Osteopenie eine Osteoporose.

BEISPIEL 4

IGF-II ist in Kombination mit Fluorid, auf Knochen gezielt

IGF-II ist in seiner Wirkung knochenspezifisch, wenn es mit Fluorid markiert ist. Außerdem hat IGF-II in Kombination mit Natriumfluorid eine synergistische Wirkung mit diesem Arzneimittel, um die Knochenzellteilung und die Bildung der Knochengrundsubstanz in Bereiche zu stimulieren, die über denen der einzelnen Mittel liegen. Insbesondere wird durch die Arzneimittelkombination der Thymidin Einbau in DNA erhöht, Prolin Einbau in Kollagen stimuliert und zelluläre alkalische Phosphatase erhöht.
Während sowohl, IGF-II als auch Fluoridionen die Proliferation von humanen Knochenzellen erhöhen (Tabelle 2C), wie durch den Einbau von Tritium-markiertem Thymidin in DNA bestimmt, erzielt die Kombination von IGF-II und Fluoridionen eine unerwartete erhöhte Wirkung auf die Proliferation von Knochenzellen, wobei das genannte Fluoridion die osteoblastisch stimulierende Aktivität von IGF-II (Tabelle 2C) potenziert. Zusätzlich ist Fluorid das alleinige wirksamste Mittel, um die Knochensubstanz wiederherzustellen, die aufgrund von Osteoporose verloren wurde und in Konzentrationen, die die Knochenbildung wirksam stimulieren hat Fluorid besonders als ein Retardpräparat keine nennenswerten Nebenwirkungen auf andere Organsysteme. Tabelle 2C Wirkung von IGF-II und Fluorid auf den Einbau von Thymidin in DNA durch kultivierte menschliche Knochenzellen und menschliche Haut Fibroblasten Zell Typ Prozent der Kontrolle Rinder IGF-II Fluorid menschl. Knochen Hühner Knochen Haut
Daten sind dargestellt als Mittelwert ± 1 SD, Kontroleinbauraten in Ipm waren 430 ± 400 (menschliche Knochen), 315 + 50 (Hühnerknochen) und 1019 ± 485 (human Haut).
Demgemäß würde die Kombination von IGF-II und Fluoridion, in dem das Fluoridion (in einer physiologisch verträglichen Form wie z. B. MFP, NaF oder anderen) mit einem pharmazeutisch verträglichen Kation assoziiert ist, ein besonders wirksames Arzneimittel für die Behandlung von Osteopenien, insbesondere Osteoporose darstellen.
Solche pharmazeutisch verträglichen Kationen umfassen Natrium, Kalium, Lithium, Kalzium, Magnesium, Eisen (II), Zink, Kupfer, Mangan (II), Aluminium, Eisen (III), Mangan (III) und dergleichen. Besonders bevorzugt sind die Ammoniak, Kalium, Natrium, Kalzium und Magnesium Salze.
Vom Stand der Technik ist wohlbekannt, daß Fragmente von biologisch aktiven Polypeptiden, entweder allein oder an nicht störende Peptide, Polysaccharide, Aldosen und ähnliche Moleküle gebunden, weitgehend die gleiche biologische Aktivität wie das intakte Ausgangspolypeptid aufweisen können. Daher beinhaltet diese Erfindung auch Fragmente von IGF-II, die auch eine osteoblastisch-stimulierende Wirkung aufweisen, und entweder aus einem intakten Molekül oder synthetisch durch zum Beispiel chemische Verfahren oder durch rekombinante DNA Techniken hergestellt werden.
Im Rahmen dieser Erfindung werden auch die genannten osteoblastisch-stimulierenden Fragmente, entweder alleine oder in Kombination mit einem Fluoridion eingesetzt, um Osteopenien insbesondere Osteoporose, in Patienten die diese Krankheiten haben oder dafür anfällig sind zu behandeln oder ihr vorzubeugen.
Ein Tierarzt oder Arzt mit üblichem Fachwissen kann einfach bestimmen, ob ein Patient einen Knochenschwund- Zustand wie Osteopenie aufweist.
Die Verbindungen dieser Erfindung können parenteral (außer durch den Mund) verabreicht werden, wie zum Beispiel intravaskulär, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär oder in Form von Zäpfchen unter Verwendung von in der pharmazeutischen Technik bekannten Formen oder auf transdermalem Weg (Darreichung durch Luftpistole oder Hautlappen). Im Fall von Frakturen gönnen die Verbindungen zusätzlich zu den oben genannten Methoden lokal in, am oder nahe der Frakturstelle verabreicht werden.
Zur intravaskulären, interperitonealen, subkutanen oder intramuskulären Verabreichung können die aktiven Arzneimittelbestandteile der vorliegenden Erfindung in flüssiger, pulverisierter oder lyophilisierter Form mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Trägerstoff (insgesamt desweiteren als Trägerstoffe bezeichnet) wie Wasser, Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose, wäßriger Puffer und dergleichen kombiniert werden. Konservierungsmittel können auch zugesetzt werden.
Unabhängig des gewählten Applikationsweges, werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch verträglichen Dosierformen durch von einem Fachmann bekannte konventionellen Methoden zubereitet. Die Verbindungen können auch mit Hilfe von pharmakologisch verträglichen Additionssalzen von Säuren oder Basen zubereitet werden. Ferner können die Verbindungen oder deren Salze in einer für sie geeigneten hydrierten Form verwendet werden.
Unabhängig des gewählten Applikationsweges, wird in jeglicher Behandlung eine nicht-toxische aber therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Verbindungen angewendet. Das Dosierschema zur Vorbeugung oder Behandlung eines Knochenschwundzustandes mit den erfindungsgemäßen Verbindungen richtet sich nach verschiedenen Faktoren, unter anderem nach dem Typ, Alter, Gewicht, Geschlecht und Krankheitszustand des Patienten, dem Schweregrad des Entzündungszustandes, dem Applikationsweg und der bei der Behandlung jeweils verwendeten Verbindung. Ein Arzt oder Tierarzt mit üblichen Fachkenntnissen kann die wirksame Arzneimenge, die erforderlich ist, um das Fortschreiten des Krankheitszustandes zu verhindern oder einzustellen leicht bestimmen. Bei dieser Verfahrensweise kann der Arzt oder Tierarzt zunächst relativ niedrige Dosen einsetzen und anschließend die Dosis erhöhen bis eine maximale Wirkung erreicht wird.

BEISPIEL 5

Extraktion von IGF-II aus der Knochengrundsubstanz mit Hilfe von Antikörpern

IGF-II Antikörper (monoklonale oder polyklonale) können verwendet werden, um IGF-II aus der Knochengrundsubstanz mit einer Affinitätssäule zu extrahieren. Als Alternative kann IGF-I verwendet werden. Die Gründe für das Funktionieren von IGF-I Antikörpern sind (a) daß IGF-II in relativ hoher Konzentration im Vergleich zu IGF-I in Knochen vorhanden ist und (b) IGF-II an IGF-I Antikörper bindet.

BEISPIEL 6

Reinigung von IGF-II aus Serum

Aus Knochenzellen stammendes IGF-II kann auch nach konventionellen Techniken aus Tierserum aufgereinigt werden. Säugerserum, einschließlich Human-, Rinder-, Hühner-, Schweine- oder Pferdeserum kann verwendet werden.

BEISPIEL 7

Herstellung von Rinder Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor II (bIGF-II) aus Extrakt

Die Hüftknochen von frisch geschlachteten Kühen werden mechanisch von Weichgewebe freigeschabt und in 2 cm³ Schnitte geschnitten. Die Knochenschnitte werden in Flüssigstickstoff gefroren und in einer Wiley Mühle gemahlen, um Knochenpulver zu erhalten, das mit warmem Wasser gewaschen wird, um Fett und Serumprotein zu entfernen, es wird entsalzen und unter Verwendung von 20% EDTA, 0,04% Natriumazid wie oben beschrieben extrahiert. Die EDTA Extrakte werden konzentriert und durch Amicon Ultrafiltration partiell entsalzen. Das verbleibende EDTA wird durch Entsalzen mit Sephadex G-25 entfernt. Drei Verfahrensvariationen können für die weitere Aufreinigung der entsalzten Rohextrakte verwendet werden.
1. Gelfiltration auf Agarose ergibt eine aktive bIGF- II Fraktion in einem Molekulargewichtsbereich von 150 bis 200 kDal, die wahrscheinlich aus bIGF-II gebunden an sein Bindeprotein oder prä-IGF-II besteht.
2. Direkte Reinigung des Rohextraktes auf DEAE Sephacel liefert eine große bIGF-II Fraktion die nur mäßig gebunden ist. Darüberhinaus werden aktive bIGF-II Fraktionen im Bereich von 10 bis 20 kDal erhalten, die entweder ungebunden oder schwach an DEAE Sephacel gebunden sind.
3. Reinigung des entsalzenen Rohextrakts auf Hydroxyapatit ergibt eine nicht-aktive Fraktion, die mit 0,15 M Phosphat eluiert wird und eine aktive Fraktion, die durch Auflösung des Hydroxyapatit Trägers gewonnen wird. Die fest-gebundene Fraktion ergibt ungefähr gleiche Mengen von groß bIGF-II und klein bIGF-II.
Bei weiterer Bearbeitung hat das große partiell gereinigte bIGF-II eine Neigung dazu kleiner zu werden. Ergebnisse deuten darauf hin, daß in den Knochenextrakten eine endogene Knochenprotease vorhanden ist, die während des Reinigungsvorganges aktiviert wird. Diese Protease ist offensichtlich in den Rinderknochenextrakten vorhanden, wie anschließend auch in Hühnerknochenextrakten nachgewiesen wird, wird aber bei der Reinigung von Humanextrakten nicht beobachtet.

BEISPIEL 8

Gewinnung von Hühner Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor (II) (cIGF-II) aus Extrakt

Die Tibia- und Femurknochen von ausgewachsenen Hühnern werden mechanisch von Weichgewebe freigeschabt. Die Knorpelenden werden abgeschnitten und die Knochen werden in Trockeneis gefroren und in 3 mm³ Stücke zertrümmert. Durch ausgiebiges Waschen in 0,03 M Tris(Acetat), 0,15 M NaCl, (pH 7,4) unter kräftigem Schütteln werden Serumproteine und Fett von den Knochenstücken entfernt. Der Knochen wird dann einer Entmineralisierung und Extraktion mit 10% EDTA, 0,04% Natriumazid unterworfen. Die EDTA Extrakte werden konzentriert und durch Amicon Ultrafiltration partiell entsalzen und das verbleibende EDTA wird durch Chromatographie an Sephadex G-25 entfernt. Zur weiteren Reinigung des cIGF-II werden zwei Methoden angewendet.
1. Gelfiltration des entsalzenen Rohextraktes über Agarose 0,05 M ergibt vorwiegend eine große Form von cIGF-II (100 bis 200 kDal), sowie kleine Mengen des kleinen cIGF-II im Bereich von 10 bis 20 kDal.
2. DE-52 Chromatographie des entsalzenen Knochenrohextraktes ergibt eine cIGF-II Fraktion, die schwach an die Grundsubstanz gebunden ist. Die schwach gebundene Fraktion verhält sich wie großes cIGF-II, wenn es kurz nach der Isolierung über eine TSK 3000 HPLC Gelfiltrationssäule chromatographiert wird. Vorinkubation der schwach gebundenen Fraktion vor HPLC Gelfiltration ergibt eine Verschiebung von großem cIGF- II zu kleinerem cIGF-II. Es wird angenommen, daß diese Veränderung in der scheinbaren Größe durch das Vorhandensein einer Protease verursacht wird, die in der an DE-52 schwach gebundenen Fraktion nachgewiesen wird. Die cIGF-II Aktivität in den entsalzenen Rohextrakten bindet an Hydroxyapatit, QAE Zellulose und DE-52, bindet aber nicht an Agarose, das mit Kollagen gekoppelt ist oder an Carboxymethyl-Sepharose.

BEISPIEL 9

Herstellung von humanem Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor II aus Knochenzellen in Kultur

Menschliche Knochenzellen wurden mit Kollagenase dissoziert und in Monolayerkultur in 24-Napf Platten, die Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM) mit Zusatz von 10% foetalem Rinderserum (FBS) enthielten kultiviert. HIGF-II wird während des Knochenzellenwachstums in das Kulturmedium freigesetzt.
Wie in der detaillierten Ausführung (Tabelle 1) angegeben, kann Insulin in verschiedenen Mengen zugefügt werden, um die Menge an gebildetem hIGF-II zu erhöhen. Analog können menschliche Wachstumshormone (10 ng/ml) oder Somatostatin (50 ng/ml) eingesetzt werden, um die hIGF-II Produktion zu erhöhen (siehe die detaillierte Ausführung).
Extraktion und Reinigung werden wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Zwei getrennte in vivo Versuche wurden an Ratten durchgeführt. In beiden Versuchen wurde den Ratten in der behandelten Gruppe parenteral ein Rinderknochen IGF- II Extrakt verabreicht. Den Ratten der Kontrollgruppe wurde ein Placebo verabreicht. Die Daten aus Versuch 1 sind in den Tabellen 3 und 4 dargestellt, die aus Versuch 2 in den Tabellen 5 bis 7.

Versuch 1

Versuch 1 bestand aus 5 Ratten in der Kontrollgruppe und aus 3 Ratten in der behandelten Gruppe.
In Tabelle 3 setzen sich die gemessenen Werte in der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe folgendermaßen zusammen: (1) Serum-Kalzium; (2) Körpergewicht am Beginn des Versuches; (3) Körpergewicht am Ende des Versuches; (4) alkalische Phosphataseaktivität des Femurs und (5) saure Phosphataseaktivität des Femurs. Bezüglich der ersten drei Parameter zeigte sich kein signifikanter (N.S.) Unterschied zwischen der Kontrollgruppe, die kein IGF-II erhielt und der behandelten Gruppe, die IGF-II Extrakt aus Rinderknochen erhielt.
Bezüglich des 4. Parameters, alkalische Phosphatase des Femurs, gab es jedoch einen signifikanten Unterschied zwischen der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe. Im Einzelnen erhöhte sich die alkalische Phosphatase des Femurs in der behandelten Gruppe um 136% gegenüber der Phosphatase der Kontrollgruppe. Eine erhöhte alkalische Phosphataseaktivität in Knochen an sich weist auf eine erhöhte osteoblastische (knochenbildende) Aktivität hin. In Verbindung mit den Ergebnissen aus Tabelle 4, die die Resultate der histomorphometrischen Beurteilung von Rattenknochen wiedergibt, ist das Ergebnis jedoch ein Hinweis für eine erhöhte osteoblastische Aktivität innerhalb der Knochen. Tabelle 3 In vivo Wirkung von Rinderknochen IGF-II Extrakt auf Ratten (Versuch 1) Parameter Kontrolle Behandelt Serum-Kalzium Körpergewicht Femur alkalische Phosphatase Femur saure Phosphatase Tatrat-unempfindlich Protein
a Alle angegeben Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. und basieren auf Beobachtungen der 5 Ratten der Kontrollgruppe und den 3 Ratten der behandelten Gruppe.
b Vergleiche zwischen der behandelten und der Kontrollgruppe wurden mit Hilfe des Student T Tests durchgeführt.
c Nicht signifikant mit p < 0,05 Student T Test.
d in Gramm Tabelle 4 Histologische Bewertung der in vivo Wirkung von Rinderknochen IGF-II Extrakt auf Ratten (Versuch 1) Parameter Kontrolle Behandelt Tibiae periostal Knochenbildung Knochen Höhle Bildende Oberfläche der Vertebrae Markierung Gesamtoberfläche Neutrale Oberfläche Gesamtoberfläche BOV
a Alle angegeben Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. und basieren auf Beobachtungen der 5 Ratten der Kontrollgruppe und den 3 Ratten der behandelten Gruppe.
b Vergleiche der behandelten mit der Kontrollgruppe wurden mit Hilfe des Student T Tests durchgeführt.
c Nicht signifikant mit p < 0,05 Student T Test.
d Prozent der Gesamtoberfläche
Die dramatischste Wirkung der IGF-II Extrakte auf Knochen ist aus den Daten in Tabelle 4 ersichtlich. Tabelle 4 gibt die histologischen Vergleiche zwischen Tibiae und Vertebrae (Knochen) der behandelten und der Kontrollgruppe der Ratten aus Versuch 1 nach Tötung wieder. Die mit IGF-II Extrakt behandelte Gruppe zeigte bei Meßwerten, die mit Knochenwachstum verbunden sind im Vergleich zur Kontrollgruppe einen deutlichen Anstieg des Knochenwachstums. Im Einzelnen zeigte die behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe eine um 73,9% höhere periostale Knochenbildung der Tibiae (das Volumen des im äußeren Bindegewebe gebildeten neuen Knochen, periosteum, das den Knochen ummantelt); und eine um 27,4% höhere periostale Anlagerungsgeschwindigkeit (die Geschwindigkeit mit der neuer Knochen aufgelegt wird)
- Parameter 1 und 2 in Tabelle 4.
Außerdem zeigte die mit IGF-II Extrakt behandelte Gruppe auch einem 55%igen Anstieg in der knochenbildenden Oberfläche im Gegensatz zu der unbehandelten Kontrollgruppe, wie es durch die Fähigkeit der knochenbildenden Oberfläche eine Markierung aufzunehmen bewiesen wird - Parameter 4 in Tabelle 4. Wenn die gleichen Ergebnisse im Hinblick auf die inaktive knochenbildende Oberfläche betrachtet werden, wird andererseits aus den Daten deutlich, daß die Kontrollgruppe im Vergleich zur behandelten Gruppe eine um 339% höhere inaktive knochenbildende Oberfläche aufweist - Parameter 5 in Tabelle 4.
Daher zeigt Versuch 1, daß die parenterale Verabreichung von IGF-II Extrakten die osteoblastische Aktivität in vivo signifikant stimuliert.
Die Daten in den Tabellen 3 und 4 suggerieren auch, daß zusätzliche Aktivität innerhalb der Knochen auch stimuliert werden kann. Der Anstieg der Tartratunempfindlichen sauren Phosphatase-Aktivität, die bei der behandelten Gruppe beobachtet wurde, ist wahrscheinlich auf die erhöhte osteoklastische (knochenresorbierende) Aktivität zurückzuführen. Dies wurde durch histologische Färbung jedoch nicht bestätigt. Der Anstieg der medullären Höhlen in den Tibien um 21%, Parameter 3 in Tabelle 4, weist auf eine teilweise erhöhte osteoklastische (knochenresorbierende) Aktivität hin.
Dieser Anstieg in der osteoklastischen Aktivität liegt jedoch an dem Vorhandensein von kleinen Mengen an transformierendem Wachstumsfaktor (TGF) im Rinderknochenextrakt. Spätere Studien, die reines IGF-II verwenden, um Knochenzellen in Kultur zu behandeln weisen diese osteoklastische Wirkung nicht auf. Außerdem wird TGF als ein starker Stimulant der osteoklastischen (knochenresorbierenden) Aktivität angesehen.

Versuch 2

Ein zweiter ausführlicherer Versuch der in vivo Wirkung von parenteral verabreichtem IGF-II Extrakt aus Rinderknochen zeigt auch, daß die osteoblastische Aktivität innerhalb der Knochen durch IGF-II signifikant erhöht wird (Tabellen 5-7).
In diesem zweiten Versuch, Versuch 2, wurden jeweils 10 Ratten in der behandelten und der Kontrollgruppe verwendet. Wie in Versuch 1, blieben der Serum- Kalziumspiegel und das Körpergewicht nach Behandlung unverändert (Tabelle 5).
In Versuch 2 wurden die Konzentrationen der Knochen alkalischen Phosphatase umfassender analysiert. Die behandelte Gruppe zeigte wieder signifikant erhöhte alkalische Phosphatase Werte in den Femur-, Schädel- und Sternumknochen um 83%, 165% bzw. 102% im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe, - Parameter 1, 2 und 3 in Tabelle 6. Die Konzentrationen der sauren Phosphatase, obwohl erhöht, waren nur in den Femur und Schädelknochen der behandelten Gruppe um 93% bzw. 71% signifikant erhöht (p < 0,001).
Die Ergebnisse der alkalischen Phosphatase Analyse des Femurs, Schädels und Sternums stehen in Einklang mit einem Anstieg in der Anzahl der Osteoblasten und der Knochenbildung. Die Werte der alkalischen Phosphatase stimmen auch sehr gut mit der quantitativen Histologie der Tibien der behandelten Ratten überein, in denen ein 60% Anstieg (p < 0,001) der periostalen Knochenbildung (mm³) und ein 40% Anstieg der Anlagerungsrate der Grundsubstanz ( /Tag) beobachtet wurde. (Tabelle 7).
Wie in Versuch 1 ist der Anstieg der Tartratempfindlichen sauren Phosphatase im Femur und Schädel mit einem Anstieg in der Menge der osteoblastischen sauren Phosphatase vereinbar, bedingt durch die erhöhte Anzahl der Osteoblasten. Es steht auch im Einklang mit dem Vorhandensein eines osteoklast-stimulierenden Faktors, beta transformierenden Wachstumsfaktor (TGF) im Knochenextrakt. Tabelle 5 In vivo Wirkung von Rinderknochen IGF-II Extrakt auf Ratten (Versuch 2) Parameter Kontrolle Behandelt Serum-Kalzium Serum Phosphat Serum alkalische Phosphatase Protein Körpergewicht Beginn
a Alle angegeben Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. und basieren auf Beobachtungen von mindestens 10 Ratten in jeder Gruppe.
b Vergleiche der behandelten mit der Kontrollgruppe wurden mit Hilfe des Student T Tests durchgeführt.
c Nicht signifikant mit p < 0,05.
d in Gramm Tabelle 6 Wirkung des Rinderknochen IGF-II Extraktes auf die Enzymaktivität innerhalb der Knochen von Ratten. (Versuch 2) alkalische Phosphatase Knochennaßgewicht saure Phosphatase Tartrat-unempfindlich Kontrolle behandelt Femur Schädel Sternum
a Alle angegeben Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. und basieren auf Beobachtungen von mindestens 10 Ratten in jeder Gruppe.
b Vergleiche der behandelten mit der Kontrollgruppe wurden mit Hilfe des Student T Tests durchgeführt.
c Nicht signifikant mit p < 0,005. Tabelle 7 In vivo Wirkung von Rinderknochen IGF-II Extrakt auf die Tibiae von Ratten (Versuch 2) Parameter Kontrolle Behandelt Tibiae periostale Knochenbildung Anlagerungsgeschwindigkeit Tag
a Alle angegeben Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. und basieren auf Beobachtungen von mindestens 10 Ratten in jeder Gruppe.
b Vergleiche der behandelten mit der Kontrollgruppe wurden mit Hilfe des Student T Tests durchgeführt.

Claims

1. Verwendung eines Peptids welches mit IGF-II identisch oder weitgehend homolog ist oder eines aktiven Unterfragmentes davon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Osteopenien in Menschen durch Stimulierung der Knochenbildung.

2. Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Osteoporose beim Menschen.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid IGF-II ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3 dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid

5. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem knochenlokalisierenden Mittel.

6. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Osteopenia beim Menschen durch die Stimulierung der Knochenbildung, welches nach Anspruch 5 verwendet werden kann dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren das Mischen einer therapeutisch wirksamem Menge von IGF-II, eines Peptids welches weitgehend homolog zu IGF-II ist oder eines aktiven Unterfragmentes davon umfaßt, wobei das Verfahren die Mischung des Peptids mit einem knochenlokalisierenden Mittel beinhaltet.

7. Verfahren nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel eine parenterale Einheitsdosierform in einem wäßrigen pharmazeutischen Träger ist oder in einer Form, die für intravenöse Darreichung geeignet ist oder in lyophilisierter Form und nach Rehydrierung zur intramuskulären Darreichung geeignet ist.