DE69026986T2

DE69026986T2 - Amylin zur Behandlung von Knochenleiden

Info

Publication number: DE69026986T2
Application number: DE69026986T
Authority: DE
Inventors: Iain Macintyre
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1989-07-08
Filing date: 1990-07-09
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2010-07-10
Also published as: EP0408284A2; DE69026986D1; ES2088971T3; EP0408284B1; GB8915712D0; DK40191D0; SG46382A1; GR3020680T3; JPH04500691A; IE902494A1; ATE137975T1; DK40191A; CA2020752A1; DK0408284T3; WO1991000710A1; IE62625B1; EP0408284A3; CA2020752C

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den Einsatz von Amylin und Amylin-Agonisten in der Behandlung von Knochenerkrankungen, insbesondere Osteoporose, Paget- Krankheit und maligne Ablagerungen in den Knochen, Knochenverlust durch Malignität, endokrine Störungen, autoimmune Arthritis, Unbeweglichkeit und Nichtgebrauch sowie andere Störungen oder Zustände, bei denen eine hyperkalzämische Wirkung von Vorteil ist.

HINTERGRUND

Störungen des Knochenhaushalts, bei denen es zu einer übermäßigen Resorption oder Verformung von Knochen und damit gleichzeitig zu einem Ungleichgewicht der Aktivität von Osteoclasten (knochenresorbierende Zellen) und Osteoblasten (knochenbildende Zellen) kommt, sind weitverbreitet und umfassen beispielsweise Osteoporose, Paget-Krankheit und familiengebundene idiopathische Hyperphosphatämie Knochenmetastasen von malignen Tumoren sind zudem ein häufiges Merkmal der meisten Krebsformen und verursachen gravierende Probleme, darunter starke Schmerzen, Frakturen und Hyperkalzämie.
Osteoporose ist eine Erkrankung des Knochengerüsts, verbunden mit dem Verlust von Hydroxyapatit (Kalziumphosphatkomplexe) und Proteinmatrix (Kolloid). Als Folge davon werden die Knochen dünner und schwächer, zudem treten vermehrt Frakturen auf, insbesondere Kompressionsfrakturen der Wirbel und Frakturen der Hüfte und Handgelenke durch minimale Traumata. Bei älteren Patienten spricht man von "seniler Osteoporose", die bei Männern und Frauen gleichermaßen auftritt. Tritt die Erkrankung nach der Menopause auf, wird sie als "postmenopausale Osteoporose" bezeichnet; diese ist bei etwa einem Drittel der Patientinnen zu beobachten. Leider muß es zunächst zu beträchtlichem Knochenverlust kommen, bevor sich die Erkrankung mit den üblichen Röntgenverfahren feststellen läßt.
Es gibt gegenwärtig eine ganze Reihe von Therapien für diese Störungen, von denen keine als hinreichend wirksam akzeptiert wird und von denen einige mit ausgesprochen nachteiligen Nebenwirkungen verbunden sind. Bei den Hormonbehandlungen, die bisweilen gegen Osteoporose eingesetzt werden, kommen Androgene, Östrogene und Calcitonin zur Anwendung.
Es wurden bereits viele verschiedene Behandlungsmethoden mit dern Ziel versucht, die Knochendichte und -substanz zu verbessern. Nach mehreren Monaten Östrogensubstitution bei postmenopausalen Patientinnen reguliert sich beispielsweise der Kalziumhaushalt und die Knochenresorption kann auf ein normales Maß zurückgehen (Thalassinos et al., Clin. Sci., 62, 221-226 (1982)). Die Wirkungen von Östrogenen bei der Vorbeugung gegen postmenopausalen Knochenverlust sind dosisabhängig. Während eine Menge, die 15 µg Ethinylastradiol täglich entspricht, vasomotorische Symptome im Klimaktenum verhindern kann, sind Dosen von 15 bis 25 µg täglich erforderlich, um Knochenverlust zu verhindern, und 25 µg oder mehr pro Tag können zu einer Nettoerhöhung der Knochendichte führen (Horsman et. al., "The effect of estrogen dose on postmenopausal bone loss", N. Engl. J. Med., 309, 1405-1407 (1983)). Die positiven Auswirkungen von Östrogen auf den Kalziumhaushalt und die Knochendichte kehren sich rasch um, wenn die Behandlung eingestellt wird (Alois et. al., "Risk factors for postmenopausal osteoporosis", Am. J. Med., 78, 95-100 (1985)). Die chronische Östrogensubstitutionstherapie wird Frauen nach der Menopause zunehmend empfohlen und kann das Auftreten osteoporotischer Frakturen vermindern. Frühere Befürchtungen, es könne vermehrt zu Brustkrebs kommen, haben zwar mittlerweile abgenommen, doch besteht ein gut dokumentiertes erhöhtes Risiko, an endometrialer Hyperplasie und Gebärmutterkrebs zu erkranken (Martindale, The Extra Pharmacoposia, Ed. James E.F. Reynold, Seite 1366, London, The Pharmaceutical Press, 1989)). Da Osteoporose größtenteils bei Frauen auftritt, sind Androgene mit ihren maskulinisierenden Nebenwirkungen und ihren nachteiligen Auswirkungen auf die Leberfunktion eine wenig zweckmäßige Form der Behandlung. Injektionen oder Nasensprays mit Calcitonin von Lachsen oder Elcatonin, einer synthetischen Variante von Aalcalcitonin, werden in einigen Ländern häufig bei Osteoporosepatienten eingesetzt, auch wenn die klinischen Daten, die für den Nutzen dieser Therapie sprechen, nicht allgemein anerkannt sind (siehe beispielsweise Taggart, H.M. et al., Lancet, 1, 475 (1962); Tiegs, R.D. et al., New England Journal of Medicine, 312, 1097 (1985)). Ein Symptom der postmenopausalen senilen Osteoporose, das möglicherweise auf die Calcitoninbehandlung anspricht, ist der Knochenschmerz. Zu den Problemen bei der Calcitonintherapie zählen neben der Frage der Wirksamkeit auch Übelkeit, Prickeln, Hitzewallungen, gastromtestinale Störungen und Störungen des Geschmackssinnes (Martindale, Seite 1339, vgl. oben). Auch kommt es zur Bildung von Antikörpern. Bisweilen werden andere Osteoporosetherapien eingesetzt, darunter auch Kalziumersatzstoffe, Vitamin D und Disphosphonate. Ihre Wirksamkeit bei manifester Osteoporose konnte bisher allerdings nicht überzeugend nachgewiesen werden. Lachscalcitonin ist gegenwärtig die Therapie der Wahl bei Paget-Krankheit (Oxford Textbook of Medicine, Hrg. Weatherall, Ledingham & Warrell, Seite 17.22., Oxford Medical Publications, 2. Auflage, 1987). Lachscalcitonin hat sich außerdem bei Knochenmetastasierung als positiv erwiesen (Szanto J. und Sandor J., Clinical Trials J., 20. 266 (1983)), auch wenn noch nicht sicher ist, ob es auf die Knochen oder auf das zentrale Nervensystem wirkt (MacIntyre I., British Medical Bulletin, 42, 343 (1986)). Bei hyperkalzämischen Episoden mit verschiedensten Ursachen können intravenöse oder intramuskuläre Injektionen mit Calcitonin eine wirksame Therapie sein, auch wenn die Wirkung nur relativ kurz anhalten kann (Oxford Textbook of Medicine, Seite 10.68, vgl. oben), möglicherweise, weil sich die Rezeptoren nach unten regulieren.
Daraus dürfte deutlich geworden sein, daß die bestehenden Behandlungsmethoden bei jeder dieser Erkrankungen des Knochen- und Kalziumhaushalts gravierende Nachteile in Hinblick auf Wirksamkeit und/oder Nebenwirkungen mit sich bringen können.
EP-A-289, 287 beschrieb ein neuartiges Peptid mit einer Sequenz:
Das native Molekül enthält eine Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten auf den Positionen 2 und 7 in der Primärstruktur, wird am 3'-Ende amidiert und als Propeptid gebildet. Beide posttranslationalen Modifikationen sind für eine umfassende biologische Tätigkeit erforderlich. Dieses Peptid, das jetzt Amylin genannt wird, wurde erstmals in den Amybidablagerungen im Pancreas von Patienten mit Diabetes vom Typ 2 isoliert (Cooper et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 9628 (1987)). Man entdeckte, daß dieses Peptid neuartige biologische Auswirkungen hervorruft, darunter eine Erhöhung des hepatischen Glukoseausstoßes, eine erhöhte Laktatproduktion des Skelettmuskels und eine geringere Insulinaktivität im Skelettmuskel (siehe beispielsweise Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta. 1014, 247 (1989)). Amylin wird als Reaktion auf Stimulierung durch Glukose und Aminosäuren, d.h. zwei Nährsubstrate, von den Betazellen der Langerhans-Inseln im Pancreas abgesondert. Es heißt, Amylin sei ein eng mit dem Insulin verwandtes anabolisches Hormon, zu dessen Aufgaben die Lagerung und Entsorgung von Nährstoffen wie Kohlehydrate und Fett gehört. Was Aufbau und Gene betrifft, weist Amylin die Merkmale eines Peptidhormons (Cooper et al., ebd.) und Übereinstimmungen mit dem Neurotransmitter CGRP (calcitonin gene-related peptide) und dem Hormon Calcitonin auf (Cooper et al., ebd.; Datta H.K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 162, 876 (1989)).)
Die vorliegende Erfindung baut auf der Feststellung auf, daß Amylin - neben einigen strukturellen Übereinstimmungen - bestimmte biologische Wirkungen mit Calcitonin gemeinsam hat und sich auf Osteoclasten und andere Aspekte des Knochen- und Kalziumhaushalts auswirkt, so daß es für die Behandlung von Knochenerkrankungen und Hyperkalzämie von Nutzen sein kann (MacIntyre, I., Lancet, 1989, 28. Oktober, 1026). Eine Verbindung zwischen Amylin und dem Knochen- und Kalziumhaushalt wurde bisher noch nicht vermutet, und die Verbindung zwischen einem Pancreashormon, das auf Nährsubstrate reagiert, und der Regulierung der Knochenresorption durch Osteoclasten hatte man ebenso wenig erwartet wie die Tatsache, daß Amylin für die Steuerung der Plasma-Kalziumwerte eingesetzt werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung umfaßt die Verwendung von Amylin oder Amylin- Varianten sowie Amylin-Agonisten zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Knochenleiden, die mit übermäßiger Resorption oder Verformung von Knochengewebe verbunden sind, wobei der genannte Amylin-Agonist kein CGRP oder Calcitonin ist. Zu den Erkrankungen gehören insbesondere Osteoporose, Paget-Krankheit und maligne Ablagerungen in Knochen, Knochenverlust durch Malignität, endokrine Störungen, autoimmune Arthritis, oder Unbeweglichkeit und Nichtgebrauch und andere Zustände, bei denen eine hyperkalzämische Wirkung von Vorteil ist. Amylin, oder ein funktionales Peptidfragment von Amylin, oder eine Amylinvariante bzw. ein Amylinfragment wird für die Behandlung von Knochenerkrankungen oder Störungen des Kalziumhaushalts sowohl als lösliches Amylin, Amylinfragment oder Variante davon gegeben als auch als lyophilisiertes Produkt, oder in oral zu verabreichender Form, allein anzuwenden oder in Verbindung mit anderen Substanzen, einschließlich Insulin (oder insulinstimulierender Substanzen, darunter auch Sulfonylcarbamid) und Östrogenen. Methoden zur Arzneizubereitung werden beschrieben.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Patentbeschreibung schließt zwar mit Ansprüchen, mit denen der Gegenstand, der die vorliegende Erfindung ausmacht, im einzelnen beschrieben und klar beansprucht wird, doch wird angenommen, daß sich die Erfindung anhand der folgenden Beschreibung und in Zusammenhang mit den beiliegenden Abbildungen besser verstehen läßt, wobei:
Abb. 1 den Effekt einer intravenösen Injektion von 500 pmol deamidiertem Amylin (DA) (Peninsula), Amylin (A), Asu ¹&supmin;&sup7;- Aalcalcitonin (CT) (ISF) oder menschlichem CGRP-α (Sandoz) oder Trägerstoff (Vehikel) auf die Plasma-Kalziumwerte bei 50 g schweren männlichen Laborratten (Wistar) zeigt (n = 6 pro Gruppe) (Statistik durch T-test von Studenten * p < 0,05, ** p < 0,01; Abkürzung: Con-control).
Abb. 2 zeigt die Wirkung einer kontinuierlichen Infusion von Amylin (Bachem) (500 pmol min&supmin;¹) (offene Kreise) (n = 5) oder von Trägerstoff (Vehikel) (geschlossene Rechtecke) (n = 4) auf die Plasma-Kalziumwerte von ausgewachsenen Kaninchen (Statistik durch T-Test von Studenten, ** p < 0,01).
Abb. 3 zeigt die Log&sub1;&sub0; dosisabhängigen Kurven, die die Wirkung von deamidiertem Amylin (Peninsula) (offene Rechtecke), von Asu¹&supmin;&sup7;-Aalcalcitonin (geschlossene Rechtecke) (ISF) oder von menschlichem CGRP-α (Sandoz) (offene Kreise) (ngl-¹) auf den gesamten Bereich der osteoclastischen Resorption pro Knochenscheibe (ausgedrückt als ein prozentualer Anteil der Kontrollresorption) zeigen.
Amylin ist ein neu entdecktes 37-Aminosäuren-Polypeptid, das von Cooper et al. (1988, vgl. oben) von Amybidablagerungen in Pancreasinseln von Diabetikern vom Typ 2 isoliert und gereinigt worden war. Es wurde berichtet, daß das Amylin-Gen auf Chromosom 12 sitzt und möglicherweise ein Vorläufergen mit den Genen der Calcitonin-Peptid-Familie gemeinsam hat. Die Aminosäurensequenz von Amylin zeigt auch eine strukturelle Übereinstimmung mit CGRP, einem alternativen Spaltprodukt des α-Calcitonin-Gens, und mit Calcitonin. Es wurde gezeigt, daß CGRP sich als schwacher Agonist von Calcitonin verhält; es hemmt die osteoclastische Knochenresorption (Zaidi, M., et al. Quart. J. Exp. Physiol. 73, 471-485 (1988)) und senkt die Plasma-Kalziumkonzentration bei einer höheren Molarität als Calcitonin. Es wurde die Vermutung angestellt, daß Amylin, früher als diabetes- bezogenes Peptid bezeichnet, mit der Entwicklung von Diabetes vom Typ 2 verknüpft ist (Leighton, B., Cooper, G.J.S. (1988) Nature 335, 632-635 (1988); Cooper, et al. Proc. Natl. Acmd. Sci. 85, 7763-7766 (1988)). Die Wirkung dieses Polypeptids auf den Kohlehydrathaushalt und seine Rolle bei der Entwicklung von Insulinresistenz wurde daher Gegenstand intensiver Untersuchungen.
Die Wirkungen von Amylin und deamidiertem Amylin auf den Kalziumhaushalt von Ratten und Kaninchen wurden mit zwei verschiedenen Methoden untersucht. Zum einen wurde die hyperkalzämische Aktivität in vivo durch die Messung der Plasma-Kalziumwerte nach Injektion des Peptids in 50 g schwere Ratten gemessen. Als nächstes wurde die in vitro Resorption von Kortikalknochen durch ausgelöste Osteoclasten von Ratten mit Hilfe des Elektronenmikroskops sowie der Bildanalyse quantifiziert. Es wurde nachgewiesen, daß Amylin und deamidiertes Amylin calcitoninähnliche Wirkung haben. Beide hemmen die osteoclastische Resorption und senken den Plasmakalziumwert bei Ratten und Kaninchen. Im folgenden werden Experimente beschrieben, die die biologische Aktivität von Amylin und deamidiertem Amylin anhand des in vivo Versuchs bezüglich der Hyperkalzämie bei Ratten und eines in vitro Aufbaus zur Knochenresorption zeigen. Darüber hinaus wird die Wirkung von Infusionen hoch dosierten Amylins auf den Plasma-Kalziumwert von Kaninchen beschrieben.
Es ist nun nachgewiesen worden, daß sowohl Amylin als auch deamidiertes Amylin hyperkalzämische Wirkung bei Ratten und Kaninchen haben. Beide Peptide hemmen auch die Knochenresorption durch ausgelöste Osteoclasten von Ratten. Es scheint am wahrscheinlichsten, daß Amylin mit dem Calcitoninrezeptor in Wechselwirkung tritt. Die mit Amylin und deamidiertem Amylin beobachteten Reaktionen waren geringer als bei Calcitonin, doch signifikant stärker als bei CGRP. In absteigender Reihenfolge ihrer hyperkalzämischen und antiresorptiven Aktivität können die Peptide wie folgt eingeordnet werden: Asu(1-7)-Aal CT> menschliches CT> Amylin/Amylinamid> CGRP. Sowohl CGRP als auch Calcitonin benötigen zur biologischen Aktivität in vivo ein C- Terminalamid (Breimer, L.H., Zaidi, M., Madlntyre, I., Biochem. J. 255, 377-390 (1988)), doch Amylin bedarf für seine in vivo oder in vitro Wirkung auf Knochen keiner Amidation.
Das Infusionsexperiment bei Kaninchen zeigt, daß Amylin eine hyperkalzämische Wirkung entfaltet, vermutlich aufgrund einer Einwirkung auf osteoclastische Calcitoninrezeptoren. CGRP ist bei geringeren Dosen bei Kaninchen hyperkalzämisch, ruft jedoch bei höheren Dosen bei Kaninchen und Hühnern auch eine parathormonartige, hyperkalzämische Wirkung hervor (Tippins, J.R., et al., Neuropeptides 4, 425-434 (1987).
Die Wirkung von Amylin, Calcitonin und CGRP-Peptiden wird durch verschiedene Potenzen und unterschiedlich wirksame Wechselwirkungen mit mindestens drei Rezeptoren herbeigeführt: der Osteoclast-Calcitonin-Rezeptor, der vaskulare CGRP-Rezeptor und der Amylin-Rezeptor im Muskel. Auch wenn Amylin im Kohlehydrathaushalt bei Gesunden wie auch bei Diabetespatienten eine Schlüsselrolle spielt, gilt ein Einfluß von Amylin auf den Kalzium- und Knochenhaushalt mittlerweile ebenfalls als nachgewiesen.
In Anbetracht dessen sieht die vorliegende Erfindung eine Verwendung von Amylin und Amylin-Agonisten bei der Behandlung von Erkrankungen vor, bei denen eine hemmende Wirkung der osteoclastischen Aktivität und/oder eine hyperkalzämische Wirkung von Vorteil ist. Zu diesen Erkrankungen zählen insbesondere Osteoporose und Paget-Krankheit. Nachdem Amylin zusammen mit Insulin abgesondert wird und bestimmte physiologische und pathologische Zustände (z.B. Fasten, Diabetes vom Typ 1) zu geringeren Werten beider Hormone im Plasma führen können, dürfte es unter gewissen Umständen effektiver sein, sowohl Insulin (oder insulinstimulierende Mittel) als auch Amylin zu verabreichen, um bessere therapeutische Resultate zu erzielen. Nachdem Amylin nachweislich eine Insulinresistenz hervorrufen kann (Cooper et al., 1989 vgl. oben) dürfte die Verabreichung von Insulin mit Amylin darüber hinaus erwartungsgemäß das Risiko mindern, gegebenenfalls einen Zustand von Diabetes oder Prädiabetes zu verursachen. In Anbetracht der bekannten, Protein freisetzenden und anabolischen Wirkungen von Insulin dürfte die Kombination von Insulin und Amylin im Hinblick auf die Wiederherstellung organischer und mineralischer Knochengewebselemente bei den vorstehend beschriebenen Erkrankungen besonders wirkungsvoll sein. Anhand des Verhältnisses von Insulin und Amylin im Pancreas und im Plasma bewegen sich die Insulin- und Amylindosen erwartungsgemäß in einer Größenordnung von etwa 1:10 bis 100:1.
Nach der bevorzugten Erscheinungsform dieser Erfindung umfaßt eine Zusammensetzung, die zur Behandlung von Knochen- oder Kalziumerkrankungen eingesetzt wird, Amylin oder ein funktionales Fragment bzw. eine Variante (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 88303603.6, Veröffentlichung Nr. 0 289 287, europäische Patentanmeldung Nr. 88307927.9, Veröffentlichung Nr. 0 309 100), die durch Injektion, intranasal oder in oraler Form verabreicht wird, was eine, auf dem Fachgebiet bereits bekannte, Form zur Verbesserung der oralen Bioverfügbarkeit von Peptiden oder von Peptiden abgeleiteten Strukturen darstellt. Erzeugnisse gemäß der vorliegenden Erfindung können in der Form von Lösungen zur parenteralen oder nasalen Verabreichung oder als Kapseln oder Suspensionen zur oralen Verabreichung hergestellt werden. In einigen Fällen mag es zweckmäßig sein, Amylin, Amylinfragmente oder -varianten allein oder in einem kombinierten Präparat zusammen mit anderen Wirkstoffen zu geben, darunter auch den oben beschriebenen, die zum Teil wirksame Therapien bei Knochen- und Kalziumerkrankungen darstellen. Die Dosierung dürfte sich erwartungsgemäß zwischen 0,01 mg und 100 mg täglich bewegen; ein Arzt wird das passende Dosierungsschema für jeden Patienten anhand der folgenden Kriterien festlegen: Linderung der Symptome, z.B. Schmerz, biochemische Indikatoren, z.B. Plasma-Kalziumwert, oder Knochendichte und -form anhand von Röntgenbildern oder anderen Messungen. Eine Kontrolle des Plasma-Amylinwerts durch Radioimmunotest oder andere feine Tests ist eine wichtige Voraussetzung für die Therapie und die Kontrolle von mit Hyperamylinämie verbundenen Erkrankungen.
Die Herstellung von Amylin, Amylinfragmenten oder -varianten kann durch, auf dem Fachgebiet bereits bekannte, Methoden der chemischen Synthese von Polypeptiden (wie bei Datta et al., vgl. oben) oder durch Fermentierungs-Rekombinationstechnik geschehen, wie z.B. bei E.coli, Hefe, baculovirus expression vector, oder Eizellen chinesischer Hamster, durch bekannte Methoden, einschließlich Kombinationen von Rekombinationsfermentierung und chemischer oder enzymatischer Modifikation.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich zwar mit den hier beschriebenen und beanspruchten Gegenständen, doch sind folgende Zusatzerklärungen und Hintergrundinformationen von Interesse. Diabetes vom Typ 1, die durch Amylin- und Insulinmangel gekennzeichnet ist (z.B. Prager et al., Diabetes, 1990, 391 Seite 116A) ist mit "Osteopenie" verbunden (MacIntyre I., Lancet, 1989, vgl. oben: Molecular & Cellular Biology of Diabetes Mellitus, Band III. Alan R. Liss, New York, 1989, Seite 123). Darüber hinaus trat Knochenverlust bei postmenopausalen Diabetikerinnen vom Typ 2 nur etwa halb so häufig auf wie bei Kontrollpersonen (Molecular & Cellular Biology of Diabetes, Band III, ebd. Seite 118), und es wird angenommen, daß Amylinüberschuß ein zentrales Element der Etiopathologie bei Diabetes vom Typ 2 ist (Cooper et al., 1989, ebd). Bei Erkrankungen, bei denen es zu Amylinmangel oder Amylinüberschuß kommt, besteht ein Zusammenhang mit Osteoporose bzw. mit einem Schutz vor Osteoporose, so daß aufgrund dieser festgestellten Wechselbeziehung das zugrundeliegende Konzept der Erfindung gestützt wird.
Amylininfusionen in junge Laborratten (Wistar) oder ausgewachsene Kaninchen ließen die Plasma-Kalziumwerte von 2,5 nM auf 2,05 nM bzw. von 2,8 auf 2,4 nM sinken (Datta et al., 1989 vgl. oben), siehe Abbildungen 1 und 2. Amylin sorgte auch für einen dosisabhängigen Rückgang der osteoclastischen Knochenresorption in einem Aufbau, bei dem Rattenosteoclasten isoliert und auf Scheiben von menschlichem Kortikalknochen plaziert wurden (Datta et al., 1989 ebd.), siehe Abbildung 3. Ferner reduzierten einstündige intravenöse Infusionen von 150 pmol/Kg/min Amylin bei vier Patienten mit Paget-Krankheit den Plasma-Kalziumwert um 0,05 bis 0,37 nM.
Durch eine Untersuchung der intrazellulären Signalübertragungswege (second messenger pathways) und detaillierten funktionalen Reaktionen isolierter Osteoclasten wurde vor kurzem ein Unterschied zwischen den Zellwirkungen von Amylin und Calcitonin entdeckt. Amylin hemmte die Osteoclastenmotilität ebenso wie Calcitonin. Während Calcitonin jedoch auch den zytosolischen Kalziumwert erhöhte und zu Zellretraktion führte, rief Amylin keine dieser beiden Reaktionen hervor (MacIntyre und Zaidi, unveröffentlichte Ergebnisse). Es scheint daher, daß die Osteoclastenaktivität möglicherweise über zwei Rezeptortypen beschränkt wird: Calcitonin wirkt bei beiden, während Amylin hauptsächlich über nur einen wirkt und dabei Motilität reduziert, Resorption reduziert und wahrscheinlich über den zweiten Messenger cAMP wirkt (Zaidi et al., 1990, J. Endocrinol 126, 473-481).
Während Amylin in Studien mit Rattenosteoclasten um das 10- 30fache weniger wirksam war (d.h. bei höheren Konzentrationen wirkt) als menschliches Calcitonin, wirkte es bei Studien mit an Paget-Krankheit erkrankten Patienten ähnlich stark wie menschliches Calcitonin. Das unterschiedliche Wirkungsprofil von Amylin und Calcitonin auf Osteoclasten und die anabolischen Wirkungen von Amylin bei anderen Geweben sorgen für ein günstiges Profil von Amylin im Vergleich zu Calcitonin, was die Behandlung verschiedener, oben beschriebener Knochenerkrankungen angeht, vor allem bei schlanken älteren Patienten, die häufig an Amylinmangel leiden, da Amylin durch Nährsubstrate stimuliert wird und solche Patienten sich häufig schlecht oder sparsam ernähren; Amylinüberschuß wird dagegen mit Fettsucht in Verbindung gebracht (Prager et al., 1990, vgl. oben).

Beispiel 1

Synthese und Reinigung von Amylin: Die Festphasen-Synthese von Amylin wurde in einem Peptid-Synthesizer von Applied Biosystems Inc. (Modell 430A) unter Verwendung von T- Butoxcarbonyl (BOC) Chemie vorgenommen. Die Synthese wurde im Maßstab 0,5 mmol unter Verwendung eines vierfachen molaren Überschusses von vorgeformten symmetrischen Anhydriden geschützter Aminosäuren durchgeführt. Jeder Arginin-, Glutamin- und Asparaginrest wurde in N-Dimethylformamid doppelt gekuppelt. Die BOC-Gruppe gab allen Aminosäuren Schutz. Alle Seitenketten-Schutzgruppen waren empfindlich auf Trifluormethansulfonsäure (TFMSA) (z.B. Mesitylen-2-Sulfon bei Arginin, Mob bei Cystein, Benzyläther bei Asparaginsäure, Glutaminsäurebenzyläther bei Serin und Threonin und Tos bei Histidin). Bei Abschluß der Synthese wurde das geschützte Peptidharz mit TFMSA geklärt und durch Umkehrphasen- Hochleistungs-Flüssigchromatografie gereinigt. Die Aminosäurensequenz des synthetischen Materials Amylin wurde durch Gasphasen-Sequenzanalyse bestätigt.

Beispiel 2

Tierversuche: 50 g schwere, männliche Laborratten (Wistar, Durchschnittsgewicht ± SEM, 51 ± 1,2 g, Charles Rivers, Margate, Kent) erhielten über Nacht keine Nahrung, aber freien Zugang zu Wasser, und wurden für Versuche verwendet. Gruppen von Ratten (n = 6 pro Gruppe) wurde Trägerstoff (Vehikel) oder jeweils 500 pmol Amylin, deamidiertes Amylin (Bachem Pharmaceuticals, Ltd.), Asu¹&supmin;&sup7;-Aalcalcitonin (CT) oder menschliches CGRP-Q injiziert. Nach der Injektion wurden die Tiere unter leichter Ätheranästhesie in heparinisierte Spritzen über die dorsale Aorta ausgeblutet. Bei einer weiteren Versuchsreihe wurden Kaninchen (Durchschnittsgewicht ± SEM, 3,2 ± 0,3 kg) in Holzkäfige gesperrt und mit Hypnorm (1 ml) sediert (Janssen, Dänemark). Über eine 21-G-Nadel, die in die laterale Ohrvene eingeführt wurde, erhielten die Tiere 90 Minuten lang eine Infusion mit Salzlösung oder Amylin (500 pmol min &supmin;¹). Die Nadel wurde über eine Polythenkanüle (Portex, 00, Hythe, Kent) mit einer Pumpe verbunden. Vor und nach Beginn der Infusion wurden in festen Abständen Blutproben genommen. Das Plasma wurde getrennt und die Kalziumwerte wurden durch DC Plasma Emission Spectrophotometrie gemessen.
Auswirkungen auf Plasma-Kalziumwert: Sowohl Amylin als auch deamidiertes Amylin führten nach intravenöser Injektion bei 50 g schweren Ratten zu einer ausgeprägten Hyperkalzämie. Die in Abbildung 1 aufgeführten Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Reaktion ähnlich war wie die bei Calcitonin und CGRP, auch wenn relative Potenzen nicht von ihren annähernd maximalen Wirkungen abgeleitet werden konnten. Wie aus Abbildung 2 hervorgeht führte die Infusion von Amylin in Ratten bei einer Dosis von 500 pmol pro Minute über 90 Minuten zu einer deutlichen Senkung des Plasma-Kalziumwerts; eine entsprechende Tendenz war nach 30 Minuten festzustellen.
Die Kalziumwerte gingen nach dem Ende der Infusion 30 Minuten lang weiter zurück (Abbildung 2).

Beispiel 3

Versuch zur Knochenresorption: Menschliche Kortikalknochenscheiben wurden wie oben beschrieben präpariert (Zaidi et al., Quart. J. Exp. Physiol. 73, Seite 471 (1988)). Die Scheiben wurden dann in Stücke von jeweils etwa 3 mm² geschnitten. Neugeborene Laborratten (Wistar) wurden durch Dekapitierung getötet, anschließend wurden Oberschenkelknochen und Schienbein entfernt. Die Knochen wurden von anhängendem weichem Gewebe befreit und an der Epiphyse in Medium 199 mit fetalem Kalbsserum (FCS, 10%, v/v) und Antibiotika (Flow Laboratories, UK, Ltd.) durchgeschnitten. Die Osteoclasten wurden mechanisch ausgelöst, indem die Knochen jeder Ratte mit einer Skalpellklinge in Medium 199 (1 ml) ausgekratzt wurden und die Suspension mit einer Pipette umgerührt wurde. Große Fragmente ließ man sich 10 Sekunden setzen, bevor die überstehende Flüssigkeit auf 30 bis 35 Knochenscheiben getropft wurde, die in den Vertiefungen von Gewebekulturplatten (18 mm, Sterilin 100) lagen. Nach der Inkubation (37º C, 15 min.) wurden die Knochenscheiben entfernt, vorsichtig in Minimal Essential Medium mit FCS (10%, v/v) gewaschen (MEM/FCS) und in verschiedene Schälchen gelegt (jedes Schälchen enthielt 5-6 Scheiben und 900 µl MEM/FCS). Für jedes Experiment wurden entweder ein oder zwei homogene Suspensionen von Osteoclasten verwendet. Wenn zwei Supensionen verwendet wurden, wurde das Experiment in zwei Blöcke aufgeteilt, die jeweils sämtliche Behandlungen und eine Suspension beinhalteten. Nach weiterer Inkubation (37º C, 10% angefeuchtetes CO&sub2;, 10 min.) wurden 100 µl MEM/FCS, in denen die Testsubstanz enthalten war, zugefügt. Schließlich wurden die Knochenscheiben über Nacht inkubiert (37º C, 10% angefeuchtetes CO&sub2;, 18 Std.) und im Hinblick auf Zellanzahl und Knochenresorption quantifiziert. Nach Fixierung in Glutaraldehyd wurden die Zellen mit Toluidinblau gefärbt und durch Durchlichtmikroskopie untersucht. Um toxische Wirkungen ausschließen zu können, wurden für jede Variable die Osteoclasten auf drei Scheiben gezählt und die Zahlen dann mit denen von hormonbehandelten Knochenscheiben und von Kontrollknochenscheiben verglichen. Die Scheiben wurden durch 3ominütiges Eintauchen in eine Natriumhypochloritlösung (10% v/v) gebleicht und in wässrigem Ethanol (80% v/v) dehydriert. Anschließend wurden die Scheiben durch Vakuumzerstäubung mit Gold überzogen, randomisiert und in einem Cambridge-360- Elektronenmikroskop (Cambridge Instruments, Cambridgeshire) untersucht. Die osteoclastischen Aushöhlungen, jeweils durch eine kontinuierliche Grenzlinie innerhalb eines Bereichs von nicht resorbiertem Knochen definiert, wurden gezählt. Die Größe der resorbierten Knochenfläche wurde berechnet, indem die Umrisse der ausgehöhlten Stellen mit Hilfe eines Bildverarbeitungsgeräts (Sight Systems, Newbury, Berks) nachgezogen wurden.
Wirkungen auf osteoclastische Knochenresorption: Die beschriebenen hyperkalzämischen Wirkungen waren eindeutig auf eine direkte Einwirkung auf die Osteoclasten zurückzuführen, nachdem sowohl Amylin als auch deamidiertes Amylin einen deutlichen Rückgang der von isolierten Osteoclasten resorbierten Knochenfläche verursachten, ohne Anzahl oder Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen, wie Abbildung 3 zeigt. Die Wirkungen waren konzentrationsabhängig und ähnlich den durch Calcitonin und CGRP hervorgerufenen Wirkungen, doch da die Peptide nicht alle im gleichen Versuch verglichen wurden, liegen keine präzisen Potenzverhältnisse vor. Amylin und deamidiertes Amylin wiesen jedoch keine signifikanten Unterschiede auf. Beide sind um etwa eine Größenordnung weniger wirksam als menschliches Calcitonin (Madlntyre, Lancet 1989, vgl. oben), aber wirksamer als CGRP.

Claims

1. Verwendung von Amylin oder einem Amylin-Agonist fur die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mit übermäßiger Resorption oder Wiederaufbau von Knochengewebe zusammenhängenden Knochenerkrankungen, worin dieser Amylin- Agonist kein CGRP oder Calcitonin ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Knochenerkrankung Osteoporose oder Paget-Krankheit ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Knochenerkrankung Knochenverlust durch Malignität, endokrine Störungen, autoimmune Arthritis, Splittern und Fraktur oder Unbeweglichkeit und Nichtgebrauch ist.

4. Verwendung von Amylin oder einem Amylin-Agonist für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mit Hyperkalzämie zusammenhängenden Knochenerkrankungen, worin dieser Amylin-Agonist kein CGRP oder Calcitonin ist.

5. Verwendung von Amylin oder einem Amylin-Agonist für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mit relativer oder absoluter Hypoamylinämie zusammenhängenden Knochenerkrankungen, worin dieser Amylin-Agonist kein CGRP oder Calcitonin ist.

6. Verwendung nach Anspruch 5, welche den Gebrauch einer Ersetzung oder therapeutisch wirksamen Menge an Amylin oder Amylin-Agonist umfaßt.

7. Verwendung von Amylin oder einem Amylin-Agonist nach einem der vorangegangenen Anspruche in Verbindung mit Insulin.

8. Verwendung nach einem der vorangegangenen Anspruche 1 bis 7, worin der Amylin-Agonist desamidiertes Amylin ist.

9. Methode des Monitoring eines Patienten, der sich einer der Therapiemaßnahmen zur Behandlung eines der in Anspruchen 1 bis 5 definierten Zustände unterzieht, welche Methode die Bestimmung des Gehalts an Amylin in Blut, Serum, Plasma oder Urin in einer von diesem Patienten erhaltenen Probe umfaßt.

10. Methode nach Anspruch 9 zum Monitoring des Verlaufs einer mit relativer oder absoluter Hypoamylinämie zusammenhängender Knochenerkrankung.