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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen, welche eine Aktivität als Exendin-Agonisten aufweisen.
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Hintergrund
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Die folgende Beschreibung enthält Information, die nützlich zum Verständnis der Erfindung sein kann.
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Exendin
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Die Exendine sind Peptide, welche in dem Gift des Gila-Monsters gefunden werden, einer in Arizona und Nordmexiko heimischen Eidechse. Exendin-3 [SEQ ID NO: 1] liegt in dem Gift von Heloderma horridum vor, und Exendin-4 [SEQ ID NO: 2] liegt in dem Gift von Heloderma suspectum vor (Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 265: 20259–62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267: 7402–05, 1992). Die Aminosäuresequenz von Exendin-3 ist in 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von Exendin-4 ist in 2 gezeigt. Die Exendine weisen einige Sequenzähnlichkeit mit mehreren Mitgliedern der Glucacon-ähnlichen Peptidfamilie auf, wobei die höchste Homologie von 53% zu GLP-1 [7–36] NH2 [SEQ ID. NO: 3] besteht (Goke, et al., J. Biol. Chem., 268: 19650–55, 1993). GLP-1 [7–36] NH2, auch als Proglucagon [78–107] oder einfach, wie hierin am häufigsten benutzt, als ”GLP-1” bekannt, weist einen insulinotrophen Effekt auf, die Insulinsekretion von β-Zellen des Pankreas stimulierend; GLP-1 inhibiert auch die Glucagonsekretion aus α-Zellen des Pankreas (Ørsov, et al., Diabetes, 42: 658–61, 1993; D'Alessio, et al., J. Clin. Invest., 97: 133–38, 1996). Die Aminosäuresequenz von GLP-1 ist in 3 gezeigt. Es wird von GLP-1 berichtet, dass es das Entleeren des Magens (Willms B, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81(1): 327–32, 1996; Wettergren A, et al., Dig Dis Sci 38(4): 665–73, 1993) und die Sekretion von Magensäure inhibiert. Schjoldager BT, et al., Dig. Dis. Sci. 34(5): 7-03-8, 1989; O'Halloran DJ, et al., J. Endocrinol. 126(1): 169–73, 1990; Wettergren A, et al., Dig. Dis. Sci. 38(4): 665–73, 1993). GLP-1 [7–37], welches einen zusätzlichen Glycinrest an seinem Carboxyterminus aufweist, stimuliert auch die Insulinsekretion bei Menschen (Ørsov, et al., Diabetes, 42: 658–61, 1993).
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Es wurde ein Transmembran G-Protein-Adenylatcyclase-gekoppelter Rezeptor aus einer β-Zelllinie geklont, von dem angenommen wird, dass er für den insulinotrophen Effekt von GLP-1 verantwortlich ist (Thorens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8641–45 (1992)), auf den in der Folge als ”klonierter GLP-1 Rezeptor” Bezug genommen wird. Es wird berichtet, dass Exendin-4 an GLP-Rezeptoren auf Insulin-sekretierenden βTC1-Zellen, an verteilten azinösen Zellen des Pankreas von Meerschweinchen und an parietalen Zellen des Magens wirkt; es wird von dem Peptid auch berichtet, dass es die Freisetzung von Somatostatin stimuliert und die Freisetzung von Gastrin in isolierten Mägen inhibiert (Goke, et al., J. Biol. Chem. 268: 19650–55, 1993; Schepp, et al., Eur. J. Pharmacol., 69: 183–91, 1994; Eissele, et al., Life Sci., 55: 629–34, 1994). Es wurde berichtet, dass Exendin-3 und Exendin-4 cAMP-Produktion in und Amylasefreisetzung aus pankreatischen acinösen Zellen stimuliert (Malhotra, R., et al., Regulatory Peptides, 41: 149–56, 1992; Raufman, et al., J. Biol. Chem. 267: 21432–37, 1992; Singh, et al., Regul. Pept. 53: 47–59, 1994). Basierend auf ihren insulinotrophen Aktivitäten wurde die Verwendung von Exendin-3 und Exendin-4 zur Behandlung von Diabetes mellitus und zur Vorsorge gegen Hyperglykämie vorgeschlagen (Eng,
US-Patent Nr. 5,424,286 ).
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Agenzien, welche dazu dienen, die Entleerung des Magens zu verzögern, haben als diagnostische Mittel bei gastrointestinalen radiologischen Untersuchungen einen Platz in der Medizin gefunden. Zum Beispiel ist Glucagon ein Polypeptidhormon, welches von den α-Zellen der Langerhans'schen Inseln des Pankreas produziert wird. Es ist ein hyperglykämisches Agens, welches Glucose durch die Aktivierung von Glycogenolyse in der Leber mobilisiert. Es kann in einem geringeren Ausmaß die Sekretion von Insulin aus dem Pankreas stimulieren. Glucagon wird bei der Behandlung von Insulin-induzierter Hypoglykämie verwendet, z. B., wenn eine Verabreichung von Glucose intravenös nicht möglich ist. Da Glucagon die Motilität des Gastrointestinaltrakts reduziert, wird es jedoch auch als diagnostisches Mittel bei gastrointestinalen radiologischen Untersuchungen genutzt. Glucagon wurde auch in mehreren Studien zur Behandlung verschiedener schmerzhafter gastrointestinaler Störungen, welche mit Krämpfen assoziiert sind, verwendet. Daniel, et al. (Br. Med. J., 3: 720, 1974) berichteten von einem schnelleren Nachlassen von Symptomen akuter Divertikulitis bei mit Glucagon behandelten Patienten, verglichen mit denen, welche mit Analgetika oder Antispasmodika behandelt wurden. Ein Übersichtsartikel von Glauser, et al., (J. Am. Coll. Emergency Physns, 8: 228, 1979) beschrieb ein Nachlassen von akutem ösophagialen Nahrungsmittelverschluss nach Glucagontherapie. In einer anderen Studie befreite Glucagon 21 Patienten mit Gallentrakterkrankung deutlich von Schmerzen und Empfindlichkeit, verglichen mit 22 mit Placebo behandelten Patienten (M. J. Stower, et al., Br. J. Surg., 69: 591–2, 1982).
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Verfahren zur Regulation der gastrointestinalen Motilität unter Verwendung von Amylin-Agonisten sind in der internationalen Anmeldung Nr.
WO 95/07098 , veröffentlicht am 16. März 1995, beschrieben.
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Verfahren zur Regulation der gastrointestinalen Motilität unter Verwendung von Exendin-Agonisten sind in
US 6,858,576 , eingereicht am 8. August 1997, betitelt ”Verfahren zur Regulation der gastrointestinalen Motilität” beschrieben.
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Verfahren zur Reduktion der Nahrungsaufnahme unter Verwendung von Exendin-Agonisten sind in
US 6,956,026 , am 7. Januar 1998 eingereicht, betitelt „Use of Exendin and Agonists thereof for the Reduction of Food Intake”, beschrieben.
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Neue agonistische Exendin-Verbindungen sind in der PCT-Anmeldung
WO 99/07404 , eingereicht am 6. August 1998, betitelt ”Neue agonistische Exendin-Verbindungen”, beschrieben. Andere neue agonistische Exendin-Verbindungen sind in der PCT-Anmeldung
WO 99/25728 , eingereicht am 13. November 1998, betitelt ”Neue agonistische Exendin-Verbindungen”, beschrieben.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neue Peptidverbindungen nach Formel (I) [SEQ ID NO: 4] zur Verfügung, wobei die Peptidverbindungen eine agonistische Exendin-Aktivität zeigen:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 -Z1;
wobei
Xaa1 His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val oder Norleu ist;
Xaa2 Ser, Gly, Ala oder Thr ist;
Xaa3 Ala, Asp oder Glu ist;
Xaa4 Ala, Norval, Val, Norleu oder Gly ist;
Xaa5 Ala oder Thr ist;
Xaa6 Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa7 Thr oder Ser ist;
Xaa8 Ala, Ser oder Thr ist;
Xaa9 Ala, Norval, Val, Norleu, Asp oder Glu ist;
Xaa10 Ala, Leu, Ile, Val, Pentylglycin oder Met ist;
Xaa11 Ala oder Ser ist;
Xaa12 Ala oder Lys ist;
Xaa13 Ala oder Gln ist;
Xaa14 Ala, Leu, Ile, Pentylglycin, Val oder Met ist;
Xaa15 Ala oder Glu ist;
Xaa16 Ala oder Glu ist;
Xaa17 Ala oder Glu ist;
Xaa19 Ala oder Val ist;
Xaa20 Ala oder Arg ist;
Xaa21 Ala oder Leu ist;
Xaa22 Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa23 Ile, Val, Leu, Pentylglycin, Tert-Butylglycin oder Met ist;
Xaa24 Ala, Glu oder Asp ist;
Xaa25 Ala, Trp, Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa26 Ala oder Leu ist;
Xaa27 Ala oder Lys;
Xaa28 Ala oder Asn ist; und
Z1 ist: Gly Gly -Z2,
Gly Gly Xaa31 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 -Z2 oder
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39 -Z2;
wobei Xaa31, Xaa36, Xaa37 und Xaa38 unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Pro, Homoprolin, 3Hyp, 4Hyp, Thioprolin, N-Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin und N-alkylalanin ausgewählt sind; Xaa39 Ser oder Tyr ist; und Z2 -OH oder -NH2 ist;
vorausgesetzt, daß nicht mehr als drei von Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 und Xaa28 Ala sind; und ebenfalls vorausgesetzt, daß wenn Xaa1 His, Arg oder Tyr ist, dann mindestens eins von Xaa3, Xaa4 und Xaa9 Ala ist; und pharmazeutisch verträgliche Salze davon; und wobei Xaa1, Xaa3 oder Xaa9 Ala ist.
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Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung einer solchen Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes mellitus oder zur Behandlung eines hyperglykämischen Zustands in einem Säuger bereit.
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In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Peptidverbindung der Formel (II) [SEQ ID Nr. 94], wobei die Peptidverbindung Exendin-Agonistenaktivität aufweist:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 X1 -Z1;
wobei
Xaa1 His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu oder 4-Imidazopropionyl ist;
Xaa2 Ser, Gly, Ala oder Thr ist;
Xaa3 Ala, Asp oder Glu ist;
Xaa4 Ala, Norval, Val, Norleu oder Gly ist;
Xaa5 Ala oder Thr ist;
Xaa6 Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa7 Thr oder Ser ist;
Xaa8 Ala, Ser oder Thr ist;
Xaa9 Ala, Norval, Val, Norleu, Asp oder Glu ist;
Xaa10 Ala, Leu, Ile, Val, Pentylglycin oder Met ist;
Xaa11 Ala oder Ser ist;
Xaa12 Ala oder Lys ist;
Xaa13 Ala oder Gln ist;
Xaa14 Ala, Leu, Ile, Pentylglycin, Val oder Met ist;
Xaa15 Ala oder Glu ist;
Xaa16 Ala oder Glu ist;
Xaa17 Ala oder Glu ist;
Xaa19 Ala oder Val ist;
Xaa20 Ala oder Arg ist;
Xaa21 Ala, Leu oder Lys-NHε-R ist, wobei R Lys, Arg, C1-C10 geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl oder Cycloalkylkanoyl ist;
Xaa22 Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa23 Ile, Val, Leu, Pentylglycin, Tert-Butylglycin oder Met ist;
Xaa24 Ala, Glu oder Asp ist;
Xaa25 Ala, Trp, Phe, Tyr oder Naphtylalanin ist,
Xaa26 Ala Oder Leu ist;
X1 Lys Asn, Asn Lys, Lys-NHε-R Asn, Asn Lys-NHε-R, Lys-NHε-R Ala, Ala Lys-NHε-R ist, wobei R Lys, Arg, C1-C10 geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl oder Cycloalkylalkanoyl ist; und
Z1 ist: Gly Gly -Z2,
Gly Gly Xaa31 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 -Z2, oder
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 -Z2 ist;
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39 -Z2;
wobei Xaa31, Xaa36, Xaa37 und Xaa38 unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Pro, Homoprolin, 3Hyp, 4Hyp, Thioprolin, N-Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin und N-Alkylalanin ausgewählt sind; Xaa39 Ser oder Tyr ist; und Z2 -OH oder -NH2 ist;
vorausgesetzt, daß nicht mehr als drei von Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 und Xaa28 Ala sind; und ebenfalls vorausgesetzt, daß wenn Xaa1 His, Arg oder Tyr ist, dann mindestens eins von Xaa3, Xaa4, und Xaa9 Ala ist.
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Zusätzlich stehen die folgenden Abkürzungen für das Folgende:
„Norval” bezieht sich auf Norvalin.
„Norleu” bezieht sich auf Norleucin.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Verbindung 1 [SEQ ID NO. 5] auf die Senkung von Blut-Glukose.
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2 zeigt die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Verbindung 1 [SEQ ID NO. 5] auf die Entleerung des Magens.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Peptidverbindungen nach Formel (I) [SEQ ID NO: 4] zur Verfügung gestellt:
wobei die Peptidverbindung eine agonistische Exendin-Aktivität zeigt:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 -Z1;
wobei
Xaa1 His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val oder Norleu ist;
Xaa2 Ser, Gly, Ala oder Thr ist;
Xaa3 Ala, Asp oder Glu ist;
Xaa4 Ala, Norval, Val, Norleu oder Gly ist;
Xaa5 Ala oder Thr ist;
Xaa6 Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa7 Thr oder Ser ist;
Xaa8 Ala, Ser oder Thr ist;
Xaa9 Ala, Norval, Val, Norleu, Asp oder Glu ist;
Xaa10 Ala, Leu, Ile, Val, Pentylglycin oder Met ist;
Xaa11 Ala oder Ser ist;
Xaa12 Ala oder Lys ist;
Xaa13 Ala oder Gln ist;
Xaa14 Ala, Leu, Ile, Pentylglycin, Val oder Met ist;
Xaa15 Ala oder Glu ist;
Xaa16 Ala oder Glu ist;
Xaa17 Ala oder Glu ist;
Xaa19 Ala oder Val ist;
Xaa20 Ala oder Arg ist;
Xaa21 Ala oder Leu ist;
Xaa22 Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa23 Ile, Val, Leu, Pentylglycin, Tert-Butylglycin oder Met ist;
Xaa24 Ala, Glu oder Asp ist;
Xaa25 Ala, Trp, Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa26 Ala oder Leu ist;
Xaa27 Ala oder Lys;
Xaa28 Ala oder Asn ist; und
Z1 ist: Gly Gly -Z2,
Gly Gly Xaa31 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa36 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 -Z2 oder
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39 -Z2;
wobei Xaa31, Xaa36, Xaa37 und Xaa38 unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Pro, Homoprolin, 3Hyp, 4Hyp, Thioprolin, N-Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin und N-alkylalanin ausgewählt sind; Xaa39 Ser oder Tyr ist; und Z2 -OH oder -NH2 ist;
vorausgesetzt, daß nicht mehr als drei von Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 und Xaa28 Ala sind; und ebenfalls vorausgesetzt, daß wenn Xaa1 His, Arg oder Tyr ist, dann mindestens eins von Xaa3, Xaa4 und Xaa9 Ala ist; und pharmazeutisch verträgliche Salze davon; und wobei Xaa1, Xaa3 oder Xaa9 Ala ist.
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Innerhalb der Verbindungen definiert durch die Formel:
kann Xaa2 Gly sein,
kann Xaa4 Ala sein,
kann Xaa14 Leu, Pentylglycin oder Met sein,
kann Xaa25 Trp oder Phe sein,
kann Xaa6 Ala, Phe oder Naphtylalanin sein,
kann Xaa22 Phe oder Naphtylalanin sein,
kann Xaa23 Ile oder Val sein,
können Xaa31, Xaa36, Xaa37 und Xaa38 unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Pro, Homoprolin, Thioprolin und N-alkylalanin ausgewählt sein;
kann Xaa39 Ser sein;
kann Z2 -NH2 sein.
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Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden durch die Verbindungen dargestellt, welche eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 72, 73, 75–78, 80–83, 86, 88–90 und 92–93 aufweisen.
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Die Verbindungen können ferner auch als Zusammensetzung vorliegen, welche diese Verbindungen, wie oben definiert, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
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In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 10 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes mellitus. Die Zusammensetzung kann ferner eine therapeutisch effektive Menge eines Insulins umfassen.
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Nach einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer der oben genannten Verbindungen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines hyperglykämischen Zustands bei einem Säuger.
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In einer alternativen Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Peptidverbindung nach Formel (II) [SEQ ID NO: 94], wobei die Peptidverbindung eine agonistische Exendin-Aktivität aufweist:
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 X1 -Z1;
wobei
Xaa1 His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu oder 4-Imidazopropionyl ist;
Xaa2 Ser, Gly, Ala oder Thr ist;
Xaa3 Ala, Asp oder Glu ist;
Xaa4 Ala, Norval, Val, Norleu oder Gly ist;
Xaa5 Ala oder Thr ist;
Xaa6 Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa7 Thr oder Ser ist;
Xaa8 Ala, Ser oder Thr ist;
Xaa9 Ala, Norval, Val, Norleu, Asp oder Glu ist;
Xaa10 Ala, Leu, Ile, Val, Pentylglycin oder Met ist;
Xaa11 Ala oder Ser ist;
Xaa12 Ala oder Lys ist;
Xaa13 Ala oder Gln ist;
Xaa14 Ala, Leu, Ile, Pentylglycin, Val oder Met ist;
Xaa15 Ala oder Glu ist;
Xaa16 Ala oder Glu ist;
Xaa17 Ala oder Glu ist;
Xaa19 Ala oder Val ist;
Xaa20 Ala oder Arg ist;
Xaa21 Ala, Leu oder Lys-NHε-R ist, wobei R Lys, Arg, C1-C10 geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl oder Cycloalkylkanoyl ist;
Xaa22 Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist;
Xaa23 Ile, Val, Leu, Pentylglycin, Tert-Butylglycin oder Met ist;
Xaa24 Ala, Glu oder Asp ist;
Xaa25 Ala, Trp, Phe, Tyr oder Naphtylalanin ist,
Xaa26 Ala Oder Leu ist;
X1 Lys Asn, Asn Lys, Lys-NHε-R Asn, Asn Lys-NHε-R, Lys-NHε-R Ala, Ala Lys-NHε-R ist, wobei R Lys, Arg, C1-C10 geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl oder Cycloalkylalkanoyl ist; und
Z1 ist: Gly Gly -Z2,
Gly Gly Xaa31 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 -Z2,
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 -Z2, oder
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 -Z2 ist;
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39 -Z2;
wobei Xaa31, Xaa36, Xaa37 und Xaa38 unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Pro, Homoprolin, 3Hyp, 4Hyp, Thioprolin, N-Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin und N-Alkylalanin ausgewählt sind; Xaa39 Ser oder Tyr ist; und Z2 -OH oder -NH2 ist;
vorausgesetzt, daß nicht mehr als drei von Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 und Xaa28 Ala sind; und ebenfalls vorausgesetzt, daß wenn Xaa1 His, Arg oder Tyr ist, dann mindestens eins von Xaa3, Xaa4, und Xaa9 Ala ist; und pharmazeutisch akzeptable Salze davon; und wobei Xaa1, Xaa3 oder Xaa9 Ala ist.
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Innerhalb der Verbindungen definiert durch die Formel:
kann Xaa2 Gly sein,
kann Xaa4 Ala sein,
kann Xaa14 Leu, Pentylglycin oder Met sein,
kann Xaa25 Trp oder Phe sein,
kann Xaa6 Ala, Phe oder Naphtylalanin sein,
kann Xaa22 Phe oder Naphtylalanin sein,
kann Xaa23 Ile oder Val sein,
können Xaa31, Xaa36, Xaa37 und Xaa38 unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Pro, Homoprolin, Thioprolin und N-alkylalanin ausgewählt sein;
kann Xaa39 Ser sein;
kann Z2 -NH2 sein.
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In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf eine dieser Verbindungen gerichtet, wobei X1 Lys, Asn, Lys-NHε-R Asn oder Lys-NHε-R, Ala, sein kann, wobei R Lys, Arg, C1-C10 geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl sein kann.
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Weitere von den Ansprüchen umfasste Verbindungen werden durch die obige Formel charakterisiert, wobei Xaa21 Lys-NHε-R ist, wobei R Lys, Arg, C1-C10 geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl oder Cycloalkylkanoyl ist.
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Die Verbindungen können z. B. eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 105, 106, 103 und 110 aufweisen.
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Die Verbindungen können ferner auch als Zusammensetzung vorliegen, welche eine der obigen Verbindungenen in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
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Die oben in Bezug genommenen Verbindungen bilden Salze mit verschiedenen anorganischen und organischen Säuren und Basen. Solche Salze schließen Salze ein, welche mit organischen und anorganischen Säuren hergestellt wurden, z. B. HCl, HBr, H2SO4, H3PO4, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Methansulfonsäure, Toluensulfonsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure und Camphersulfonsäure. Mit Basen hergestellte Salze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, z. B. Natrium- und Kaliumsalze und Erdalkalisalze, z. B. Calcium- und Magnesiumsalze, ein. Acetat-, Hydrochlorid- und Trifluoressigsäuresalze sind bevorzugt. Die Salze können durch konventionelle Mittel gebildet werden, wie durch ein zur Reaktion Bringen der freien Säure- oder Baseformen des Produkts mit einem oder mehr Äquivalenten der geeigneten Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder in einem Medium, in dem das Salz nicht löslich ist, oder in einem Lösungsmittel wie Wasser, welches dann im Vakuum oder durch Gefriertrocknung entfernt wird, oder durch Austausch der Ionen eines bestehenden Salzes gegen ein anderes Ion mit einem geeigneten Ionenaustauschharz.
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Nützlichkeit
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Die oben beschriebenen Verbindungen sind in Anbetracht ihrer pharmakologischen Eigenschaften nützlich. Insbesondere sind die Verbindungen der Erfindung Exendin-Agonisten und besitzen eine Aktivität als Agenzien, um gastrische Motilität zu regulieren und eine Entleerung des Magens zu verlangsamen, wie durch die Fähigkeit erwiesen wird, die post-prandialen Glucosespiegel in Säugern zu reduzieren.
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Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei wissenschaftlichen in vitro und in vivo Verfahren zur Erforschung von Exendinen und Exendin-Agonisten, z. B. in Verfahren wie denen, die in Beispielen A–E unten beschrieben sind.
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Herstellung der Verbindungen
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Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Standard-Festphasen Peptidsynthese-Techniken und bevorzugt mit einem automatisierten oder semi-automatisierten Peptid-Synthesizer hergestellt werden. Typischerweise werden unter Verwendung solcher Techniken eine α-N-Carbamoyl geschützte Aminosäure und eine Aminosäure, welche mit der wachsenden Peptidkette auf einem Harz verbunden ist, bei Raumtemperatur in einem inerten Lösungsmittel wie Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidinon oder Methylenchlorid in der Anwesenheit von Kopplungsmitteln wie Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol in der Anwesenheit einer Base wie Diisopropylethylamin gekoppelt. Die α-N-Carbamoyl-Schutzgruppe wird von dem sich ergebenden Peptidharz unter Verwendung eines Reagenzes wie Trifluoressigsäure oder Piperidin entfernt, und die Kopplungsreaktion wird mit der nächsten gewünschten N-geschützten Aminosäure wiederholt, welche zu der Peptidkette hinzugefügt werden soll. Geeignete N-Schutzgruppen sind in der Technik gut bekannt, wobei t-Butyloxycarbonyl (tBoc) und Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) hierin bevorzugt sind.
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Die Lösungsmittel, Aminosäurederivate und 4-Methylbenzhydryl-Aminharz, welche in dem Peptid-Synthesizer verwendet werden, können von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) erworben werden. Die folgenden an den Seitenketten geschützten Aminosäuren können von Applied Biosystems, Inc. erworben werden: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(Cl-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt) und Fmoc-Gln(Trt). Boc-His(BOM) kann von Applied Biosystems, Inc. oder Bachem Inc. (Torrance, CA) erworben werden. Anisol, Dimethylsulfid, Phenol, Ethandithiol und Thioanisol können von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI) erhalten werden. Air Products and Chemicals (Allentown, PA) liefert HF. Ethylether, Essigsäure und Methanol können von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) erworben werden.
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Eine Festphasen-Peptidsynthese kann mit einem automatischen Peptid-Synthesizer (Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) unter Verwendung des NMP/HOBt (Option 1) Systems und tBoc- oder Fmoc-Chemie mit Capping durchgeführt werden (siehe Handbuch von Applied Biosystems für den ABI 430A Peptid-Synthesizer, Version 1.3B, 1. Juli 1988, Abschnitt 6, Seiten 49–70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Boc-Peptidharze können mit HF gespalten werden (–5°C bis 0°C, 1 Stunde). Das Peptid kann von dem Harz durch Abwechslung von Wasser und Essigsäure extrahiert werden, und die Filtrate werden lyophilisiert. Die Fmoc-Peptidharze können gemäß Standardverfahren gespalten werden (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, Seiten 6–12). Peptide können auch unter Verwendung eines Advanced Chem Tech Synthesizers (Model MPS 350, Louisville, Kentucky) zusammengesetzt werden.
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Peptide können durch RP-HPLC (präparativ und analytisch) unter Verwendung eines Waters Delta Prep 3000 Systems gereinigt werden. Eine C4, C8 oder C18 präparative Säule (10 μ, 2,2 × 25 cm; Vydac, Hesperia, CA) kann zur Isolation von Peptiden verwendet werden, und Reinheit kann unter Bestimmung einer C4, C8 oder C18 analytischen Säule bestimmt werden (5 μ, 0,46 × 25 cm; Vydac). Lösungsmittel (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/CH3CN) können der analytischen Säule bei einer Flussrate von 1,0 ml/min und der präparativen Säule bei 15 ml/min zugeführt werden. Aminosäureanalysen können mit dem Waters Pico Tag System durchgeführt und unter Verwendung des Maxima Programms prozessiert werden. Peptide können durch Säurehydrolyse in der Dampfphase (115°C, 20–24 h) hydrolysiert werden. Hydrolysate können mit Standardverfahren derivatisiert und analysiert werden (Cohen et al., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, Seiten 11–52, Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). Eine schnelle Atombombardmentanalyse (fast atom bombardment analysis) kann mit M-Scan, Incorporated durchgeführt werden (West Chester, PA). Eine Massenkalibration kann unter Verwendung von Cäsiumiodid oder Cäsiumiodid/Glycerol durchgeführt werden. Eine Plasmadesorptionsionisationsanalyse unter Verwendung eines Nachweises der Flugzeit (time of flight detection) kann mit einem Applied Biosystems Bio-Ion 20 Massenspektrometer durchgeführt werden. Elektrospraymassenspektroskopie kann mit einer VG-Trio-Maschine durchgeführt werden.
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In der Erfindung nützliche Peptidverbindungen können auch unter Verwendung von Gentechnik hergestellt werden, unter Verwendung von nun in der Technik bekannten Methoden. Siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor.
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Formulierung und Verabreichung
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Erfindungsgemäße Verbindungen sind in Anbetracht ihrer Exendin-artigen Effekte nützlich, und können bequemerweise in der Form von Formulierungen zur Verfügung gestellt werden, die zur parenteralen (einschließlich intravenösen, intramuskulären und subkutanen) oder nasalen, sublingualen, buccalen oder oralen Verabreichung geeignet sind. In einigen Fällen wird es bequem sein, ein Exendin und ein anderes Agens gegen Entleerung des Magens, so wie Glucagon, ein Amylin oder einen Amylin-Agonisten, in einer einzigen Zusammensetzung oder Lösung zur gemeinsamen Verabreichung zur Verfügung zu stellen. In anderen Fällen kann es von größerem Vorteil sein, ein anderes Agens gegen die Entleerung getrennt von dem Exendin-Agonisten zu verabreichen. In noch anderen Fällen kann es von Vorteil sein, einen Exendin-Agonisten entweder gemeinsam formuliert oder getrennt von anderen Glucose-senkenden Agenzien wie Insulin zur Verfügung zu stellen. Ein geeignetes Format zur Verabreichung kann am besten für jeden Patienten individuell durch einen medizinischen Praktiker bestimmt werden. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger und ihre Formulierung sind in Standardwerken zur Formulierung beschrieben, z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin. Siehe auch Wang, Y. J. und Hanson, M. A. ”Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers,” Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report Nr. 10, Supp. 42: 2S (1988).
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In der Erfindung nützliche Verbindungen können als parenterale Zusammensetzungen zur Injektion oder Infusion zur Verfügung gestellt werden. Sie können z. B. in einem inerten Öl suspendiert werden, geeigneterweise einem Pflanzenöl wie einem Sesam-, Erdnuss-, Olivenöl oder einem anderem akzeptablen Träger. Bevorzugt sind sie in einem wässrigen Träger suspendiert, z. B. in einer isotonischen Pufferlösung bei einem pH von etwa 5,6 bis 7,4. Diese Zusammensetzungen können durch konventionelle Sterilisierungstechniken sterilisiert werden, oder sie können sterilfiltriert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen enthalten, wie sie benötigt werden, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie z. B. pH-Wert puffernde Agenzien. Nützliche Puffer schließen z. B. Natriumacetat/Essigsäure-Puffer ein. Eine Form von Vorrats- oder „Depot”-Zusammensetzung mit langsamer Freisetzung kann verwendet werden, so dass in den Blutstrom therapeutisch effektive Mengen der Zusammensetzung über mehrere Stunden oder Tage nach transdermaler Injektion oder einer anderen Form der Verabreichung freigesetzt werden.
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Die erwünschte Isotonizität kann unter Verwendung von Natriumchlorid oder anderen pharmazeutisch akzeptablen Agenzien, zum Beispiel Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglykol, Polyolen (zum Beispiel Mannitol und Sorbitol) oder anderen anorganischen oder organischen Soluten erreicht werden. Natriumchlorid ist besonders für Puffer bevorzugt, welche Natriumionen enthalten.
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Die beanspruchten Verbindungen können auch als pharmazeutisch akzeptable Salze (z. B. Säureadditionssalze) und/oder Komplexe davon formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze sind in der Konzentration, in der sie verabreicht werden, nicht-toxische Salze. Die Herstellung solcher Salze kann die pharmakologische Verwendung erleichtern, indem die physikalisch/chemischen Charakteristika der Zusammensetzung verändert werden, ohne dass die Zusammensetzung daran gehindert wird, ihren physiologischen Effekt auszuüben. Beispiele von nützlichen Änderungen bei physikalischen Eigenschaften schließen eine Verringerung des Schmelzpunkts ein, um eine Verabreichung über die Mukosa zu erleichtern, und eine Erhöhung der Löslichkeit, um die Verabreichung von höheren Konzentrationen des Medikaments zu erleichtern.
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Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen Säureadditionssalze ein, zum Beispiel jene, welche Sulfat, Hydrochlorid, Phosphat, Sulfamat, Acetat, Citrat, Lactat, Tartrat, Methansulfonat, Ethansulfonat, Benzensulfonat, p-Toluensulfonat, Cyclohexylsulfamat und Quinat enthalten. Pharmazeutisch akzeptable Salze können mit Säuren wie Hydrochlorsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Sulfaminsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Malonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzensulfonsäure, p-Toluensulfonsäure, Cyclohexylsulfaminsäure, und Chinasäure erhalten werden. Solche Salze können z. B. hergestellt werden, indem man die freien Säure- oder Baseformen des Produkts mit einem oder mehreren Äquivalenten der geeigneten Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder einem Medium zur Reaktion bringt, in dem das Salz unlöslich ist, oder in einem Lösungsmittel wie Wasser, welches dann im Vakuum oder durch Gefriertrocknung entfernt wird, oder durch Austauschen der Ionen eines bestehenden Salzes gegen ein anderes Ion mit einem geeigneten Ionenaustauschharz.
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Auch Träger oder Hilfsstoffe können verwendet werden, um eine Verabreichung der Verbindung zu erleichtern. Beispiele von Trägern oder Hilfsstoffen schließen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker so wie Lactose, Glucose oder Sucrose oder Arten von Stärke, Cellulosederivaten, Gelatine, Pflanzenölen, Polyethylenglykolen und physiologisch kompatiblen Lösungsmitteln ein. Die Zusammensetzungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können über verschiedene Routen verabreicht werden, einschließlich intravenös, intraperitoneal, subkutan und intramuskulär, oral, topisch oder transmukosal.
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Wenn gewünscht, können Lösungen der obigen Zusammensetzungen mit einem Verdickungsmittel wie Methylcellulose verdickt werden. Sie können in Emulsionsform, entweder Wasser-in-Öl oder Öl-in-Wasser, hergestellt werden. Jedes einer großen Vielzahl von pharmazeutisch akzeptablen emulsionsbildenden Agenzien kann genutzt werden, einschließlich z. B. Akazienpuder, ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (so wie ein Tween) oder ein ionisches oberflächenaktives Mittel (so wie Alkalipolyetheralkoholsulfate oder -sulfonate, z. B. ein Triton).
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In der Erfindung nützliche Zusammensetzungen werden hergestellt, indem man die Zutaten nach allgemein akzeptierten Verfahren mischt. Zum Beispiel können die ausgewählten Komponenten einfach in einem Mixer oder einer anderen Standardvorrichtung gemischt werden, um eine konzentrierte Mischung zu bilden, welche dann durch das Hinzufügen von Wasser oder Verdickungsmittel und eventuell eines Puffers zur Kontrolle des pH oder eines zusätzlichen Soluts zur Kontrolle der Tonizität an die Endkonzentration und -viskosität angepasst werden kann.
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Zur Verwendung durch den Arzt werden die Verbindungen in Form von Dosiereinheiten bereitgestellt, welche eine Menge eines Exendin-Agonisten mit oder ohne ein weiteres Agens gegen das Entleeren enthält. Therapeutisch effektive Mengen eines Exendin-Agonisten zur Verwendung bei der Kontrolle der Entleerung des Magens und bei Zuständen, bei denen eine Entleerung des Magens vorteilhafterweise verlangsamt oder reguliert wird, sind solche, die die post-prandialen Blutglucosespiegel verringern, bevorzugt auf nicht mehr als etwa 8 oder 9 mM, oder so, dass die Blutglucosespiegel so wie gewünscht reduziert werden. Bei diabetischen oder glucoseintoleranten Individuen sind Plasmaglucosespiegel höher als bei normalen Individuen. Bei solchen Individuen kann eine vorteilhafte Reduktion oder ein „Glätten” von post-prandialen Blutglucosespiegeln erhalten werden. Wie durch die in dem Gebiet Tätigen erkannt werden wird, wird eine effektive Menge an therapeutischem Agens von vielen Faktoren abhängen, einschließlich des physischen Zustands des Patienten, des Blutzuckerspiegels oder des Niveaus der Inhibition des Entleerens des Magens, welches erhalten werden sollen, und anderer Faktoren.
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Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen sind nützlich beim Bewirken von gastrischer Hypomotilität bei einem Subjekt und können auch bei anderen Störungen verwendet werden, bei denen vorteilhafterweise die gastrische Motilität reduziert wird.
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Die effektive tägliche Dosis der Verbindungen gegen das Entleeren wird typischerweise in dem Bereich von 0,001 oder 0,005 bis etwa 5 mg/Tag liegen, bevorzugt etwa 0,01 oder 0,05 bis 2 mg/Tag oder mehr bevorzugt etwa 0,05 oder 0,1 bis 1 mg/Tag für einen Patienten mit 70 kg. Die exakte zu verabreichende Dosis wird durch den betreuenden Kliniker bestimmt und hängt davon ab, wo die besondere Verbindung in dem oben genannten Bereich liegt, genau wie von dem Alter, Gewicht und Zustand des Individuums. Die Verabreichung sollte bei dem ersten Zeichen von Symptomen oder kurz nach einer Diagnose von Diabetes mellitus beginnen. Eine Verabreichung kann durch Injektion, bevorzugt subkutan oder intramuskulär, durchgeführt werden, oder über andere Routen, z. B. durch orale, buccale oder nasale, Routen, Dosierungen sollten jedoch 5- bis 10-fach gegenüber der Dosierung bei Injektion erhöht werden.
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Allgemein können bei der Behandlung oder der Vorbeugung von erhöhten, unangemessenen oder unerwünschten post-prandialen Blutglucosespiegeln die erfindungsgemäßen Verbindungen Patienten mit Bedarf für eine solche Behandlung in Dosisbereichen ähnlich den oben angegebenen verabreicht werden, die Verbindungen werden jedoch häufiger verabreicht, z. B. einmal, zweimal oder dreimal am Tag.
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Die optimale Formulierung und Art der Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung an einen Patienten hängt von in der Technik bekannten Faktoren wie der bestimmten Erkrankung oder der Störung, dem gewünschten Effekt und der Art des Patienten ab. Während die Verbindungen typischerweise verwendet werden, um menschliche Patienten zu behandelt, können sie auch verwendet werden, um ähnliche oder identische Erkrankungen bei anderen Vertebraten, so wie anderen Primaten, Bauernhoftieren wie Schweinen, Rindern und Geflügel und Sporttieren und Haustieren wie Pferden, Hunden oder Katzen, zu behandeln.
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Um beim Verständnis der vorliegenden Erfindung zu helfen, sind die folgenden Beispiele angefügt, welche die Ergebnisse einer Folge von Experimenten beschreiben. Die sich auf die Erfindung beziehenden Experimente sollten natürlich nicht so ausgelegt werden, als ob sie die Erfindung und solche jetzt bekannten oder später entwickelten Variationen der Erfindung spezifisch begrenzen, die für einen Fachmann greifbar wären und von denen angenommen wird, dass sie in den Rahmen der Erfindung fallen, wie sie hierin beschrieben und hierin beansprucht ist.
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BEISPIEL 1
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Herstellung von Verbindung 68
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- Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro-NH2 [SEQ. ID. NO. 72]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 4033.5.
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BEISPIEL 2
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Herstellung von Verbindung 69
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- His Gly Ala Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro-NH2 [SEQ. ID. NO. 73]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3984.4
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BEISPIEL 3
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Herstellung von Verbindung 71
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- His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Ala Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro-NH2 [SEQ. ID. NO. 75]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3861.3.
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BEISPIEL 4
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Herstellung von Verbindung 72
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- Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Ala Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro-NH2 [SEQ. ID. NO. 76]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3746.1.
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BEISPIEL 5
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Herstellung von Verbindung 73
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- Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala-NH2 [SEQ. ID. NO. 77]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3742.1.
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BEISPIEL 6
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Herstellung von Verbindung 74
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- His Gly Ala Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala-NH2 [SEQ. ID. NO. 78]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylhenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3693.1.
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BEISPIEL 7
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Herstellung von Verbindung 76
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- His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Ala Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser-NH2 [SEQ. ID. NO. 80]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyhenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3634.1.
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BEISPIEL 8
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Herstellung von Verbindung 77
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- Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser-NH2 [SEQ. ID. NO. 81]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3526.9.
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BEISPIEL 9
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Herstellung von Verbindung 78
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- His Gly Ala Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser-NH2 [SEQ. ID. NO. 82]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3477.9.
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BEISPIEL 10
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Herstellung von Verbindung 79
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- His Gly Glu Ala Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro-NH2 [SEQ. ID. NO. 83]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3519.9.
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BEISPIEL 11
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Herstellung von Verbindung 82
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- His Gly Ala Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly tPro Ser Ser Gly Ala tPro tPro tPro-NH2 [SEQ. ID. NO. 86]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Doppelte Kopplungen sind bei Resten 37, 36 und 31 nötig. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 4121.1.
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BEISPIEL 12
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Herstellung von Verbindung 84
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- His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Ala Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly NMeala Ser Ser Gly Ala NMeala Nmeala-NH2 [SEQ. ID. NO. 88]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Doppelte Kopplungen sind an Resten 36 und 31 nötig. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3796.1.
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BEISPIEL 13
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Herstellung von Verbindung 85
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- Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly hPro Ser Ser Gly Ala hPro-NH2 [SEQ. ID. NO. 89]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Eine doppelte Kopplung ist bei Rest 31 nötig. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3871.1.
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BEISPIEL 14
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Herstellung von Verbindung 86
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- His Gly Ala Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala-NH2 [SEQ. ID. NO. 90]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3750.2.
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BEISPIEL 15
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Herstellung von Verbindung 88
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- Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2 [SEQ. ID. NO. 92]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 4120.6
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BEISPIEL 16
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Herstellung von Verbindung 89
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- Ala Gly Ala Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2 [SEQ. ID. NO. 93]
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Das oben identifizierte amidierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 4005.5.
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BEISPIEL 17
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Herstellung von Peptid mit SEQ ID NO: 103
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Verbindung 98, Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys-NHεoctanoyl Asn-NH2 [SEQ. ID. NO. 103], wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Fmoc-Lys-NHεoctanoylsäure wird zur Kopplung in Position 27 verwendet. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3334.6.
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BEISPIEL 18
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Herstellung von Peptid mit SEQ ID NO: 105
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Verbindung Nr. 100, Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys-NHεoctanoyl Asn Gly Gly-NH2 [SEQ ID NO: 105] wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Fmoc-Lys-NHεoctanoylsäure wird zur Kopplung in Position 27 verwendet. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3442.8.
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BEISPIEL 19
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Herstellung von Peptid mit SEQ ID NO: 106
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Verbindung Nr. 101, Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys-NHεoctanoyl Asn Gly Gly-NH2 [SEQ ID NO: 106] wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Fmoc-Lys-NHεoctanoylsäure wird zur Kopplung in Position 27 verwendet. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3391.7.
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BEISPIEL 20
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Herstellung von Peptid mit SEQ ID NO: 110
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Verbindung Nr. 105, Ala Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Asn Lys-NHεoctanoyl Gly Gly-NH2 [SEQ ID NO: 110] wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt, und auf eine ähnlich Art wie Verbindung 1 gereinigt. Fmoc-Lys-NHεoctanoylsäure wird zur Kopplung in Position 28 verwendet. Bei der Analyse werden Lösungsmittel (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann ausgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 3391.7.
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BEISPIELE A BIS D
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Verwendete Reagenzien
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GLP-1 wurde von Bachem (Torrance, CA) erworben, alle anderen Peptide wurden unter Verwendung von Synthesemethoden wie den hierin beschriebenen hergestellt. Alle Chemikalien waren vom höchsten kommerziellen Grad. Der cAMP SPA Immunoassay wurde von Amersham erworben. Die Radioliganden wurden von New England Nuclear (Boston, MA) erworben. RINm5f-Zellen (American Type Tissue Collection, Rockville, MD) wurden in DME/F12-Medium, welches 10% fötales bovines Serum und 2 mM L-Glutamin enthielt, wachsen gelassen. Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2/95% befeuchteter Luft wachsen gelassen, und Medium wurde alle 2 bis 3 Tage ersetzt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen, dann geerntet und unter Verwendung eines Polytron-Homogenisierers homogenisiert. Zellhomogenate wurden bis zur Verwendung gefroren bei –70°C gelagert.
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Beispiel A
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GLP-1 Rezeptorbindungsstudien
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Die Rezeptorbindung wurde durch Messung der Verdrängung von [125I] humanen GLP-1 (7–36) oder [125I] Exendin (9–39) von RINm5f Membranen beurteilt. Der Testpuffer enthielt 5 μg/ml Bestatin, 1 μg/ml Phosphoramidon, 1 mg/ml bovines Serumalbumin (Fraktion V), 1 mg/ml Bacitracin und 1 mM MgCl2 in 20 mM HEPES, pH 7,4. Um die Bindung zu messen, wurden 30 μg Membranprotein (Bradford protein assay) in 200 μl Testpuffer resuspendiert und mit 60 pM [125I] GLP-1 oder [125I] Exendin (9–39) und unmarkierten Peptiden für 120 Minuten bei 23°C in 96 Well-Platten (Nagle Nunc, Rochester, NY) inkubiert. Die Inkubationen wurden durch schnelle Filtration mit kalter, mit Phosphat gepufferter Salzlösung, pH 7,4, durch mit Polyethylenimin behandelte GF/B-Glasfiberfilter (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) unter Verwendung eines Tomtec Mach II Plattenerntegeräts (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) beendet. Die Filter wurden getrocknet, mit Szintillationsflüssigkeit kombiniert und die Radioaktivität in einem Betaplate flüssigen Szintillationszähler (Wallac Inc.) bestimmt.
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Peptidproben wurden in dem Test als duplikate Punkte bei 6 Verdünnungen über einen Konzentrationsbereich von 10
–6 M bis 10
–12 M laufen gelassen, um Antwortkurven zu bestimmen. Die biologische Aktivität einer Probe wird als ein IC
50-Wert angegeben, berechnet aus den Rohdaten unter Verwendung eines iterativen Kurvenanpassungsprogramms unter Verwendung einer logischen Gleichung mit 4 Parametern (Prism, GraphPAD Software). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE I
Verbindung | | IC50 (nM) |
Exendin-4 | [SEQ ID NO. 2] | 0,70 |
Verbindung 1 | [SEQ ID NO. 5] | 26,1 |
Verbindung 2 | [SEQ ID NO. 6] | 14,42 |
Verbindung 3 | [SEQ ID NO. 7] | 41,65 |
Verbindung 4 | [SEQ ID NO. 8] | 4,96 |
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BEISPIEL B
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Cyclase-Aktivierungsstudie
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Der Testpuffer enthielt 10 μM GTP, 0,75 mM ATP, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM Phosphocreatin, 12,5 U/ml Creatinkinase, 0,4 mg/ml Aprotinin, 1 μM IBMX in 50 mM HEPES, pH 7,4. Membranen und Peptide wurden in 100 ml Testpuffer in 96 Well-Platten mit Filterunterseite (Millipore Corp., Bedford, MA) zusammengegeben. Nach 20 Minuten der Inkubation bei 37°C wurde der Test durch Transfer des Überstands durch Filtration in eine frische 96 Well-Platte unter Verwendung eines Millipore Vakuum-Mehrfachverteilers beendet. Der Gehalt an cAMP in den Überständen wurde durch einen SPA-Immunassay quantifiziert.
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Peptidproben wurden in dem Test als triplikate Punkte bei 7 Verdünnungen über einen Konzentrationsbereich von 10
–6 M bis 10
–12 M gemessen, um Antwortkurven herzustellen. Die biologische Aktivität einer bestimmten Probe wurde als ein EC
50-Wert angegeben, wie oben beschrieben berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II tabelliert. TABELLE II
Verbindung | | EC50 (nM) |
Exendin-4 | [SEQ ID NO. 2] | 0,23 |
Verbindung 1 | [SEQ ID NO. 5] | > 1000 |
Verbindung 2 | [SEQ ID NO. 6] | > 10000 |
Verbindung 3 | [SEQ ID NO. 7] | > 10000 |
Verbindung 4 | [SEQ ID NO. 8] | > 10000 |
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Beispiel C
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Bestimmung des Blutglucosespiegels in db/db Mäusen
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C57BLKS/J-m-db Mäuse mit mindestens 3 Monaten Alter wurden für die Studie verwendet. Die Mäuse wurden von dem Jackson Laboratory erhalten und sie durften sich für mindestens 1 Woche in dem Vivarium aklimatisieren. Die Mäuse wurden in Gruppen von 10 bei 22° ± 1°C bei einem 12:12 Hell:Dunkelzyklus beherbergt, wobei die Lichter um 6:00 Uhr morgens angingen.
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Allen Tieren wurden 2 Stunden vor der Entnahme von Blutproben für die Basislinie das Essen weggenommen. Etwa 70 μl Blut wurden von jeder Maus über Einstich ins Auge nach leichter Anästhesie mit Methophan entnommen. Nach der Entnahme der Blutproben für die Basislinie zur Messung von Plasmaglucosekonzentrationen erhielten alle Tiere subkutane Injektionen entweder von Träger (10,9% NaCl), von Exendin-4 oder von Testverbindung (1 μg) in Träger. Genau 1 Stunde nach den Injektionen wurden unter Verwendung der gleichen Prozedur wieder Blutproben entnommen, und Plasmaglucosekonzentrationen wurden gemessen.
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Bei jedem Tier wurde die prozentuale Veränderung in dem Plasmawert gegenüber dem Basislinien-Wert berechnet. Die prozentuale Abnahme der Plasmaglucose nach einer Stunde ist in Tabelle III dargestellt. TABELLE III
Test-Verbindung | | % Abnahme der Glucose | |
Exendin-4 | [SEQ ID NO. 2] | 39% | (n = 78) |
Verbindung 1 | [SEQ ID NO. 5] | 40% | (n = 4) |
Verbindung 2 | [SEQ ID NO. 6] | 41% | (n = 5) |
Verbindung 3 | [SEQ ID NO. 7] | 32% | (n = 5) |
Verbindung 4 | [SEQ ID NO. 8] | 42% | (n = 5) |
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Beispiel D
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Bestimmung der Dosis-Antwort von Blutglucosespiegeln in db/db Mäusen
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C57BLKS/J-m-db/db Mäuse mit mindestens 3 Monaten Alter wurden für die Studie verwendet. Die Mäuse wurden von dem Jackson Laboratory erhalten und sie durften sich für mindestens 1 Woche aklimatisieren, bevor sie verwendet wurden. Die Mäuse wurden in Gruppen von 10 bei 22° ± 1°C bei einem 12:12 Hell:Dunkelzyklus beherbergt, wobei die Lichter um 6:00 Uhr morgens angingen.
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Allen Tieren wurden 2 Stunden vor der Entnahme von Blutproben für die Basislinie das Essen weggenommen. Etwa 70 μl Blut wurden von jeder Maus über Einstich ins Auge nach leichter Anästhesie mit Methophan entnommen. Nach der Entnahme der Blutproben für die Basislinie zur Messung von Plasmaglucosekonzentrationen erhielten alle Tiere subkutane Injektionen entweder von Träger, von Exendin-4 oder von Testverbindung in den angegebenen Konzentrationen. Genau 1 Stunde nach den Injektionen wurden unter Verwendung der gleichen Prozedur wieder Blutproben entnommen, und Plasmaglucosekonzentrationen wurden gemessen.
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Bei jedem Tier wurde die prozentuale Veränderung in dem Plasmawert gegenüber dem Basislinien-Wert berechnet und eine dosisabhängige Beziehung wurde unter Verwendung von Graphpad PrizmTM Software evaluiert.
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1 zeigt die Wirkungen von unterschiedlichen Dosen von Exendin-4 [SEQ ID NO. 2] und Verbindung 1 [SEQ ID NO. 5] auf Plasmaglucosespiegel. Exendin-4 hat einen ED50 von 0,01 μg pro Maus und Verbindung 1 hat einen ED50 von 0,042 μg pro Maus.
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Beispiel E
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Magen-Entleerung
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Die folgende Studie wurde ausgeführt, um die Effekte von Exendin-4 und einer erfindungsgemäßen agonistischen Exendin-Verbindung auf die Entleerung des Magens bei Ratten zu untersuchen. Dieses Experiment folgte einer Modifikation des Verfahrens von Scarpignato, et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 246: 286–94 (1980).
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Es wurden männliche Harlan Sprague Dawley (HSD) Ratten verwendet. Alle Tiere wurden bei 22,7 ± 0,8°C in einem 12:12 Stunden Hell:Dunkelzyklus beherbergt (wobei Experimente während des hellen Zyklus durchgeführt wurden), und wurden ad libitum gefüttert und mit Wasser versorgt (Diät LM-485, Teklad, Madison, WI). Exendin-4 wurde nach Standardpeptidsyntheseverfahren synthetisiert. Die Herstellung von Verbindung 1 [SEQ ID No: 5] ist in Beispiel 1 beschrieben.
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Die Bestimmung des Entleerens des Magens durch das unten beschriebene Verfahren wurde nach einem Fasten von ~20 Stunden durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Magen keinen Speisebrei enthalten würde, der mit spektrophotometrischen Absorptionsmessungen wechselwirken könnte.
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Ratten bei Bewusstsein erhielten über eine Magensonde 1,5 ml eines akalorischen Gels, welches 1,5% Methylcellulose (M-0262, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) und 0,05% Phenolrot-Indikator enthielt. 20 Minuten nach der Magensondierung wurden die Ratten unter Verwendung von 5% Halothan anästhesiert, der Magen freigelegt und unter Verwendung von Arterienzangen an den pylorischen und unteren Speiseröhrenschließmuskeln verschlossen, entfernt und in eine alkalische Lösung geöffnet, welche auf ein festes Volumen eingestellt wurde. Der Mageninhalt ergab sich aus der Intensität des Phenolrots in der alkalischen Lösung, gemessen durch Absorption bei einer Wellenlänge von 560 nm. Bei getrennten Experimenten bei 7 Ratten wurden der Magen und der Dünndarm beide ausgeschnitten und in eine alkalische Lösung geöffnet. Die Menge an Phenolrot, welches aus dem oberen Gastrointestinaltrakt innerhalb von 20 Minuten nach Sondierung wiedergewonnen werden konnte, war 89 ± 4%; Farbstoff, welcher unwiderruflich an die luminale Oberfläche des Eingeweides zu binden schien, könnte den Rest ausgemacht haben. Um eine maximale Wiedergewinnung von weniger als 100% Farbstoff zu berücksichtigen, wurde der Prozentsatz von Mageninhalt, der nach 20 Minuten verblieb, als ein Anteil des Mageninhalts ausgedrückt, der von Kontrollratten wiedergewonnen wurde, die in dem gleichen Experiment direkt nach der Sondierung geopfert wurden. Prozent Restmageninhalt = (Absorption nach 20 min)/(Absorption bei 0 min) × 100.
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In Studien zur Basislinie ohne medikamentöse Behandlung wurde die Entleerung des Magens über 20 Minuten bestimmt. In Dosis-Antwortstudien wurden Ratten mit 0,01, 0,1, 0,3, 1, 10 und 100 μg Exendin-4, 0,1, 0,3, 1, 10 und 100 der Verbindung 1 [SEQ ID No: 5] behandelt.
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Die Ergebnisse, gezeigt in
2, zeigen, dass die Exendin-Agonisten, Exendin-4 und Verbindung 1, starke Inhibitoren des Entleerens des Magens sind. Der E
50 von Exendin-4 war 0,27 μg. Der EC
50 von Verbindung 1 war 55,9 μg. SEQUENZPROTOKOLL